POR Candida guilliermondii. - USPsistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2001/BID01008OCR.pdf · muito para a realização deste trabalho. A sua família, sua esposa Marta e filhas

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

AVALIAÇÃO DE TRATAMENTOS DO HIDROLISADO DE EUCALIPTO PARA A PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE XILITOL

POR Candida guilliermondii.

Yovanka Pérez Ginoris

Lorena - SP - Brasil 2001

Universidade de São Paulo USP ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA- EEL

Biblioteca "Cel. Luiz Sylvio Teixeira Leite"

.)

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA Pós-graduação em Biotecnologia Industrial


POR Candida guil/iermondii.

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora Dr. João Batista de Almeida e Silva Dr. Everson Alves de Miranda Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe

Estudante: Yovanka Pérez Ginoris


FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA Pós-graduação em Biotecnologia Industrial


POR Candida guil/iermondii.

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora

·7 /

/e--"\ 17,5 YS , ~ . ) ;.

( Dr. João~ de Almeida e Silva


"Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma

oportunidade invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da

beleza do reino do Espirita, para seu próprio prazer pessoal e para proveito da

comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer."

Albert Einstein

Dedico este trabalho a toda minha família,

especialmente aos meus país, irmãos e avós

que, apesar da distância, sempre me incentivaram

e apoiaram com todo amor em todos

meus sonhos e projetos.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela Fé e o Amor Infinito

Ao Professor Dr. João Batista de Almeida e Silva pela brilhante orientação. a

amizade, a confiança. os ensinamentos e sugestões transmitidas as quais contribuíram

muito para a realização deste trabalho. A sua família, sua esposa Marta e filhas que me

acolheram como membro da família. Muito obrigada.

À Professora Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe, pelas valiosas sugestões e

os ensinamentos transmitidos durante a realização deste trabalho, pelo seu grande

potencial como pesquisadora. Muito obrigada

À Ora. Georgina Michelena por me dar asas para voar no maravilhoso mundo da

biotecnologia.

Aos Professores e Pesquisadores do DEBIO-FAENOUIL, pelos ensinamentos e

amizade, em especial, aos Professores Arnaldo Márcio e George, pela amizade, o

carinho, os ensinamentos e as sugestões

Às queridas amigas Oras. Maria Antonieta Brizuela e Paulina Serrano, que com sua

amizade, valiosos ensinamentos e conselhos despertaram em mim o amor à pesquisa.

Às amigas Cristina e Ludmila, pelo carinho, amizade e auxílio na busca das

referências bibliográficas e a Maria Eunice, pelo auxílio na tradução dos textos.

A Paulinho ,"PRS", que desde os primeiros momentos se tornou um amigo

inseparável compartilhando momentos felizes e ruins e pela sua grande ajuda no

laboratório.

Aos amigos queridos Rita, Denise, Zéa, Luanni, Waltinho (W1 ), Waltinho (W2),

Júlio, Larissa, Elí, Marcelo, Solange, Giuliano, Daniel, Tihany, Andrea, Robertinho,

Eliana, e a todos os colegas pela amizade, pelo carinho e ajuda desinteressada nos

momentos precisos.

Aos alunos de Iniciação Científica Wagner, Larissa. Lili. Fernando e, em especial a

Giovanni, pela ajuda incondicional durante o trabalho no laboratório. pela amizade. o

carinho e a força. A todos eles muito obrigada.

Ao Departamento de Biotecnologia - FAENOUIL, pela oportunidade da realização

do Mestrado.

Aos funcionários do DEBIQ-FAENQUIL, Walkiria, Terezinha lsnaldi, Renato. José

Carlos. Jussara, Nicamor. Lucinha, Márcia e André Prado. que colaboraram com

grande carinho na realização deste trabalho.

Aos funcionários da FAENQUIL, pela ajuda e o carinho que demostraram durante a

minha estância na Instituição.

Ao Instituto de lnvestigaciones de los Derivados de la Caria de Azúcar - ICIDCA.

pela oportunidade dada e a confiança depositada.

A todos os funcionários e Pesquisadores do ICIDCA, pelo carinho e os

ensinamentos transmitidos.

À minha querida amiga Lourdes. que desde minha chegada a Lorena me brindou a

sua amizade. seu carinho, seus conselhos e sua ajuda incondicional e a quem hoje

tenho o orgulho de considerar como irmã.

Ao meu grande amigo Ernesto, que nos últimos momentos felizmente chegou para

me dar força e coragem para o término deste trabalho. Pela sua amizade e carinho.

enfim, muito obrigada.

Aos amigos Marcelo e Osmair, pela ajuda, o carinho e o respeito.

À CAPES, pela bolsa de Mestrado concedida.

A todas aquelas pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a

realização deste trabalho e que me acolheram com todo carinho durante minha estada

no Brasil.

BIOGRAFIA

Yovanka Pérez Ginoris, filha de José Manuel Pérez Cruz e Aleida Ginoris Álvares.

nasceu em Havana. Cuba, em 09 de maio de 1971.

Graduou-se em Engenharia Química pelo Instituto Superior Politécnico José Antonio

Echevarría (ISPJAE), Havana, em julho de 1995.

Em setembro de 1995 foi contratada como Reserva Científica no Instituto Cubano de

lnvestigaciones de los Derivados de la Caria de Açúcar (ICIDCA), Havana.

Em fevereiro de 1999, iniciou o curso de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial,

em nível de Mestrado, no Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia

Química de Lorena (FAENQUIL), Lorena, São Paulo, Brasil.

RESUMO

Avaliação de Tratamentos do Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto para a Produção Biotecnológica de Xilitol por Candida guilliermondii. Yovanka Pérez Ginoris. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. João Batista de Almeida e Silva (Departamento de Biotecnologia. FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca Examinadora: Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe e Dr. Everson Alves de Miranda. Junho de 2001.

Diversas pesquisas têm demonstrado que a obtenção de xilitol através da fermentação de hidrolisados de materiais lignocelulósicos apresenta limitações devido a presença de compostos inibidores do metabolismo microbiano, resultantes do procedimento de hidrólise da estrutura lignocelulósica. Vários tratamentos físico- químicos têm sido propostos para reduzir as concentrações desses compostos nos hidrolisados, sendo a combinação da alteração de pH com a adsorção em carvão ativado um dos tratamentos mais promissores e economicamente viáveis.

Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia de tratamento do hidrolisado hemicelulósico de Eucalyptus grandis a fim de melhorar a eficiência de conversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii. Foram estudadas diferentes combinações de tratamento baseadas na variação do pH do hidrolisado e no uso de carvão ativo. Foi ainda estudada a influência do fator de concentração, bem como os parâmetros operacionais de tratamento do hidrolisado com carvão ativado (porcentagem de carvão ativo, temperatura e tempo de adsorção).

Os ensaios foram realizados baseado em conceitos de estatística multivariada, aplicando-se técnicas de planejamento fatorial fracionário, para identificar os fatores importantes para o processo. A seguir foram quantificados os níveis dos fatores significativos, utilizando-se metodologia de superfície de resposta.

O estudo resultou em um modelo matemático que representa os parâmetros envolvidos no processo:

Y1 = 0,53 - 0,03 X3 - 0,07 X5 - 0,05 X/ - 0,05 Xi

onde Y1 representa o fator de rendimento em xilitol, em função da concentração de carvão ativado (XJ) e do tempo de adsorção (X5).

A metodologia desenvolvida permitiu estabelecer, entre as condições avaliadas, o melhor tratamento com o qual foi possível obter o máximo fator de rendimento em xilitol (0,56 g xilitol/g xilose). As melhores condições para se alcançar esse valor, no intervalo estudado, foram obtidas efetuando a fermentação com o hidrolisado 4,5 vezes concentrado, tratado pela elevação do seu pH inicial para 3,5 e adsorção com 2,4% de carvão ativado, a 30ºC por 34,5 minutos.

ABSTRACT

Severa! researches have shown that the process of fermenting lignocellulosic hydrolysates to produce xylitol presents limitations, due to the generation of toxic compounds that inhibit the microbial metabolism. Severa! physicochemical treatments have been proposed to reduce the concentration of these compounds in the hydrolysates, pH change combined with adsorption on activated charcoal being one of the most promising and economical treatments.

ln this way, the objective of this work was to develop a methodology for treating Eucalyptus grandis hydrolysate, in arder to improve the xylose-xylitol bioconversion by the yeast Candida guilliermondii. Different treatment combinations based on pH alteration and on the use of activated charcoal were studied. The influence of the concentration factor and operational parameters of adsorption on activated charcoal (charcoal percentage, temperature and time) were also studied ..

The assays were based on multivariate statistical - concepts applying factorial fractional design techniques to identify the factors important to the process. The leveis of significant factors were quantified using the response suriace methodology.

The study resulted in a mathematical model that represents the parameters involved in the process:

Y1 = 0.53 - 0.03 X3 - 0.07 Xs - 0.05 X/ - 0.05 X/ where Y1 represents the xylitol yield factor as a function of the activated charcoal

concentration (XJ) and the adsorption time (X5). The methodology developed permitted us to establish the best treatment procedure,

which resulted in a maximum xylitol. yield (0.56 g xylitol/g xylose). That _yalue was achieved with the hydrolysate 4.5 times concentrated treated by changing the pH to 3.5 and using adsorption process with 2.4% of activated charcoal, at 30ºC for 34.5 minutes.

,. -· -

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO Pg.

1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

3 3

2.1.1 Madeira de eucalipto 2.2. XILITOL

2.2.1. Propriedades e aplicações 2.2.2. Vias de obtenção

2.2.2. 1. Via química

2. 2. 2. 2. Via biotecnológica

2.2.2.3. Toxicidade dos hidrolisados hemicelulósicos e suas influências na bioconversão de xilose em xilitol

2. 2. 2. 4. Tratamentos dos hidrolisados hemicefulósicos

5 7 7

10

10

13

16

23

3. MATERIAL E MÉTODOS 26

3.1. OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO DE EUCALIPTO 26 3.1.1. Matéria prima 26 3.1.2. Hidrólise ácida dos cavacos de eucalipto 26 3.1.3. Concentração 26 3.1.4. Tratamento 27

3.2. MICRORGANISMO E PREPARO DE INÓCULO 27 3.2.1. Microrganismo 27 3.2.2. Preparo do inóculo 27

3.3. MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO 28

3.4. MÉTODOS ANALÍTICOS 29 3.4.1. Determinação do teor de umidade dos cavacos de 29

eucalipto 3.4.2. Viabilidade e pureza da cultura 3.4.3. Determinação da concentração celular 3.4.4. Determinação de pH 3.4.5. Determinação das concentrações de

acético e xilitol 3.4.6. Determinação das concentrações

hidroximeti lfurfural

açúcares, ácido

29 29 29 30

de furfural e 30

3.4. 7. Determinação de compostos aromáticos na forma de 30 lignina solúvel

3.5. METODOLOGIA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS 32 3.5.1. Determinação das porcentagens de redução das 31

concentrações dos compostos inibidores e dos açúcares

3.5.2. Determinação dos parâmetros fermentativos 33 3.5.3. Análise estatística e modelagem matemática 33

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 37

4.1 OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO 37 4.2. TRATAMENTO DOS HIDROLISADOS CONCENTRADOS 41

4.3. FERMENTAÇÕES DOS HIDROLISADOS SUBMETIDOS A 45 DIFERENTES COMBINAÇÕES DE TRATAMENTOS.

4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA E MODELAGEM MATEMÁTICA 50

4.4.1. Análise estatística e modelagem matemática para o fator 50 de rendimento em xilitol

4.4.2. Análise estatística e modelagem matemática para a 61 remoção dos inibiàores

4.4. 2 1. Análise estatística e modelagem matemática 62 para a remoção de ácido acético

4. 4. 2. 2. Análise estatística e modelagem matemática 67 para a remoção de hidroximetilfurfural

4. 4. 2. 3. Análise estatística e modelagem matemática 72 para a remoção dos compostos aromáticos

4.5. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS DE 77 TRATAMENTO DO HIDROLISADO

4.6. TESTE DOS MODELOS 79

5. CONCLUSÕES 81

6. RECOMENDAÇÕES 83

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84

8. APÊNDICE 99

LISTA DE TABELAS

Pg.

TABELA 11.1 Plantações florestais no Brasil em 2000 6

TABELA 11.2 Conteúdo de xilitol de algumas frutas e vegetais (EMODI, 7

1978).

TABELA 11.3 Propriedades físico-químicas do xilitol (MANZ et ai .. 1973. 8

HYVÔNEN et ai., 1982, BAR, 1991 ).

TABELA 111.1 Fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 34

fracionário 25-2.

TABELA 111.2 Matriz de planejamento composta pelos valores dos fatores 34

originais e codificados· no projeto fatorial fracionário 25-2.

TABELA 111.3 Fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 35

fracionário 241 com três repetições no ponto central.

TABELA 111.4 Matriz de planejamento fatorial fracionário 241 com face 36

centrada e três repetições no ponto central.

TABELA IV.1 Composição parcial, em g/L, do hidrolisado hemicelulósico 37

de eucalipto obtido por hidrólise ácida, em sua forma original

e após ser submetido ao processo de concentração.

TABELA IV.2 Matriz de planejamento para o projeto fatorial 241 face 41

centrada com triplicata no ponto central e composição

parcial em g/L dos açúcares e inibidores presentes nos

hidrolisados tratados.

TABELA IV.3 Redução da concentração de açúcares e inibidores do 42

hidrolisado de eucalipto submetido às diferentes

combinações de tratamentos (em porcentagens).

TABELA IV.4 Consumo de xilose. ácido acético, produção de biomassa e 46

xilitol no cultivo de C guilliermondii nos hidrolisados de

eucalipto submetidos às diferentes combinações de

tratamento.

TABELA IV.5 Parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose a xilitol 50

por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto submetido às diferentes combinações de

tratamentos.

TABELA IV.6 Análise de variância da estimativa de ummodelo linear para 53

o fator de rendimento em xilitol por C. guifliermondii cultivada

em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV. 7 Análise de variância da estimativa de um modelo quadrático 54

para o fator de rendimento em xilitol por C. guifliermondii

cultivada em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.8 Estimativas dos efeitos erros-padrão, teste t de "Student" e 55

níveis de significância para o fator de rendimento em xilitol

por C. guilliermondii seguindo um planejamento fatorial 24-1

com face centrada e três repetições no ponto central para

cada variável estudada no tratamento do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.9 Coeficientes de regressão. erros-padrão. teste t de "Student" 56

e nível de significância do planejamento fatorial face

centrada para o modelo que representa o fator de

rendimento em xilitol em hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto.

TABELA IV.1 O Análise de variância da regressão do modelo que representa 57

o fator de rendimento em xilitol por C. guilliermondii em

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.11 Estimativas dos efeitos erros-padrão, teste t de "Student" e 62

níveis de significância para a remoção de ácido acético seguindo um planejamento fatorial 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.12 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" 63

e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa a remoção de ácido acético no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.13 Análise de variância da regressão do modelo que representa 65

a remoção de ácido acético no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.14 Estimativas dos efeitos erros-padrão, teste t de "Student" e 67 níveis de significância· para a remoção de hidroximetilfurfural seguindo um planejamento fatorial 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.15 Análise de variância da regressão do modelo que representa 68 a remoção de hidroximetilfurfural no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.16 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" 68 e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa a remoção de hidroximetilfurfural no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.17 Estimativas dos efeitos, erros-padrão, teste t de "Student" e 72 níveis de significância para a remoção dos compostos

~ aromáticos seguindo um planejamento fatorial 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV 18 Análise de variância da regressão do modelo que representa 72

a remoção dos compostos aromáticos no tratamento do


TABELA IV 19 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" 73

e nível de significância do planejamento fatorial face

centrada para o modelo que representa a remoção dos

compostos aromáticos no tratamento do hidrolisado


TABELA IV20 Respostas obtidas no teste dos modelos para o fator de 79

rendimento em xilitol e a remoção dos inibidores do


LISTA DE FIGURAS

Pg.

FIGURA 2.1 Estrutura química da molécula de xilitol. 7

FIGURA 2.2 Tecnologias disponíveis para a produção de xilitol, (PARAJÓ 11

et ai .. 1998a).

FIGURA 2.3 Esquema genérico do processo de produção de xilose e 12

xilitol (HYVONEN et st., 1982)

FIGURA 2.4 Met_abolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras 14

de xilose (HAHN-HAGERDAL et et., 1994)

FIGURA 2.5 Degradação dos carboidratos durante a hidrólise ácida 18

realizada a elevadas temperaturas (CLARK, MACKIE, 1984).

FIGURA 4.1 Gráfico de probabilidade normal para os efeitos referentes 52

ao rendimento em xilitol por C. guilliermondii , cultivada em

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto submetido a

diferentes combinações de tratamento segundo o

planejamento fatorial fracionário 25-2_

FIGURA 4.2 Superfície de resposta descrita pelo modelo quadrático para 58

o fator de rendimento em xilitol por C. guilliermondii cultivada

em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

FIGURA 4.3 Distribuição de resíduos do modelo proposto para o 60

tratamento do hidrolisado visando maior fator de rendimento

em xilitol por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado


FIGURA 4.4 Distribuição de resíduos do modelo proposto para o 64 tratamento do hidrolisado visando maior remoção de ácido

acético do hidrolisado de eucalipto.

FIGURA 4.5

FIGURA 4.6

FIGURA 4.7

FIGURA 4.8

FIGURA 4.9

Superfície de resposta descrita pelo modelo quadrático

representativo da remoção de ácido acético do hidrolisado


Superfície de resposta e curvas de nível descritas pelo

modelo matemático representativo da remoção de

hidroximetilfurfural do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto.

Distribuição de resíduos do modelo proposto para o

tratamento do hidrolisado visando maior remoção de

hidroximetilfurfural do hidrolisado de eucalipto.

Distribuição de resíduos do modelo proposto para o

tratamento do hidrolisado visando maior remoção dos

compostos aromáticos do hidrolisado de eucalipto.

Superfície de resposta e curvas de nível descritas pelo

modelo proposto que representa a remoção dos compostos

aromáticos do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

66

70

71

74

76

FIGURA 4.1 O Superposição das curvas de nível referentes aos modelos 78

que descrevem as variações de remoção de ácido acético e

compostos aromáticos do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto.

=ircaucso

1. INTRODUÇÃO

O presente trabalho é parte de um Convênio de Cooperação Técnico Científico

entre o Instituto de lnvestigaciones de los Derivados de la Cana de Azúcar (ICIDCA),

de Havana, Cuba, e a Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL) Um

dos objetivos principais desta cooperação científica, além da formação de recursos

humanos. é o desenvolvimento de uma tecnologia econômica de produção de xilitol por

via fermentativa a partir dos materiais lignocelulósicos.

O aproveitamento desses materiais nos processos fermentativos tem sido. nos últimos anos. objeto de pesquisas cada vez mais numerosas. em decorrência do impacto ambiental negativo causado, principalmente, pelos que se apresentam como resíduos agro-industriais e florestais

Em conseqüência do desenvolvimento da indústria madeireira e de papel e celulose, os resíduos de eucalipto no Brasil constituem, atualmente. uma das principais fontes renováveis e abundantes de carboidratos a serem utilizados nos processos de bioconversão para a obtenção de produtos de interesse econômico e social. como por

exemplo o xilitol. O xilitol é um poliálcool, com poder adoçante semelhante ao da sacarose e que

pode ser utilizado em alimentos destinados a pacientes diabéticos. obesos e

deficientes da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase. Possui propriedade anti/não cariogênica e pode ser utilizado em vários segmentos da indústria alimentícia e

farmacêutica para obtenção de uma grande variedade de produtos de interesse econômico e social.

A produção comercial desse adoçante ocorre por via química. através da hidrogenação catalítica da xilose presente nos hidrolisados obtidos dos materiais lignocelulósicos. Este processo resulta em uma mistura de açúcares e polióis. o que torna complexa a etapa de purificação do xilitol. Adicionalmente, o rendimento e a qualidade do xilitol obtido dependem da pureza da solução inicial de xilose, sendo

necessárias extensivas etapas de purificação do hidrolisado hemicelulósico. A

1

lnrroduçào

descoberta de microrganismos capazes de converter xilose em xilitol torna o processo

microbiológico alternativa promissora para obtenção comercial deste adoçante. Projetos voltados para o desenvolvimento dessa tecnologia estão sendo

desenvolvidos pelo Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de

Biotecnologia da FAENQUIL. Os trabalhos concentram-se no aproveitamento de materiais lignocelulósicos, principalmente de bagaço de cana-de-açúcar. de palha de arroz. de cavacos de eucalipto e mais recentemente de palha de trigo.

Estudos realizados até o presente momento mostram que os teores de xilitol obtidos em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar e de palha de arroz são muito superiores ao que foi obtido em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Presume-se que tal comportamento se deva ao fato de que este hidrolisado apresenta

maior teor de compostos tóxicos que os outros. Esses compostos são oriundos do procedimento de hidrólise da estrutura lignocelulósica, como ácido acético, furfural,

hidroximetilfurfural e compostos aromáticos derivados da lignina solúvel em meio ácido. Desta forma torna-se necessária a realização de estudos do tratamento deste

hidrolisado com vista a remover ou minimizar as concentrações dos compostos tóxicos,

para que melhor eficiência desta bioconversão possa ser alcançada empregando-se

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Tratamentos baseados no uso de carvão ativado só ou em combinação com a

alteração do pH inicial com álcalis e ácidos têm sido relatados na literatura

especializada como adequados para destoxificar os hidrolisados hemicelulósicos, incluindo os hidrolisados de várias espécies de eucalipto. Estes tratamentos apresentam-se promissores tendo em vista os resultados obtidos em vários processos fermentativos tais como a fermentação alcoólica e a própria produção de xilitol bem

como por ser economicamente viáveis. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do fator de

concentração bem como diferentes combinações de tratamentos sobre a remoção dos

compostos tóxicos do hidrolisado hemicelulósicode eucalipto, visando melhorar a bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii a partir deste hidrolisado.

Os tratamentos consistiram da alteração ou não do pH original dos hidrolisados com álcali e ácido em combinação com adsorção em carvão ativado, avaliando-se também a influência dos parâmetros operacionais temperatura e tempo de contato do processo

~ de adsorção.

2

Revisêo B1bi1ográfica

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

O reconhecimento da natureza finita dos combustíveis energéticos convencionais. a necessidade de se controlar a poluição ambiental e a mudança dos valores sociais e culturais têm incentivado a comunidade científica internacional a examinar fontes

alternativas de materiais e energia (KUHAD, SINGH. 1993). Uma solução prática para estes problemas é o desenvolvimento de tecnologias que permitam o uso de fontes renováveis de energia existentes na natureza, como a biomassa lignocelulósica (EUREC Agency, 1996)

A biomassa lignocelulósica é constituída pelas árvores, plantas. gramíneas e algas, sendo considerada atualmente como a quarta fonte renovável de energia mais abundante do planeta (EUREC Agency, 1996). Os produtos florestais e agrícolas representam mais de 60% da biomassa total, sendo estimada a produtividade de

biomassa seca em 155 bilhões de t/ano (SING, MISHRA. 1995). Como conseqüência do desenvolvimento da agricultura e da indústria florestal são

gerados. a cada ano. milhões de toneladas de resíduos lignocelulósicos, os quais constituem fontes potenciais de energia e matérias-primas de baixo custo. Estes materiais podem ser utilizados em diversos processos de bioconversão, com a finalidade de obter vários produtos de elevado valor agregado tais como combustíveis.

compostos químicos de interesse industrial, alimentos, entre outros (OLIVEIRA. 1980, SADO LER et ai. 1983, RIPOU et ai. 1990, FULLER et el., 1996). Existe ainda um benefício ambiental no aproveitamento desses resíduos. tendo em vista que os mesmos representam poluentes ambientais potenciais (EUREC Agency, 1996).

O potencial de aproveitamento da biomassa lignocelulósica baseia-se em sua ~

composição química. Independente de sua origem, os materiais lignocelulósicos

contêm celulose, hemicelulose e lignina como principais componentes, em proporções

3

Revisão 51btlográflca

que variam de 40 a 50%. 25 a 35% e 15 a 25%. respectivamente (WYMAN WOODMAN, 1993).

A celulose, substância orgânica mais abundante na natureza, é um homopolímero

regular de unidades de anidroglicose unidas por ligações P-1,4, apresentando uma

estrutura cristalina altamente ordenada, enquanto que a lignina é uma macromolécula polifenólica constituída basicamente dos álcoois cumarílico. coniferílico e sinapílico As

hemiceluloses mostram variabilidade em estrutura e composição. Elas são polímeros heterogêneos compostos principalmente de pentases (xilose e arabinose) e hexases

(glicose. manose e galactose), sendo classificadas como xilanas, mananas. galactomananas, glucomananas, etc. As cadeias poliméricas apresentam ramificações constituídas principalmente por ácido acético e ácidos urônicos (FULLER et et.. 1996) Além das substâncias macromoleculares, os materiais lignocelulósicos contêm outros compostos, incluindo extrativos e não extrativos. A madeira contem de 1 a 8% de extrativos em massa seca, os resíduos agrícolas contêm uma porcentagem ainda

maior desses compostos Estes incluem gorduras, gomas, alcalóides, resinas. taninos, óleos essenciais e outros constituintes citoplasmáticos. Os materiais não extrativos

constituem de 0,2 a 0,8% da massa seca e incluem compostos inorgânicos tais como sílica, carbonatos, oxalatos, etc. (SINGH, MISHRA, 1995)

Conforme relatado por DEKKER (1985}, os materiais lignocelulósicos não podem ser utilizados "in natura" na maioria dos processos de bioconversão, pois não podem ser diretamente utilizados pelos microrganismos produtores das substâncias de interesse industrial, sendo o fracionamento das principiais frações poliméricas um pré-

requisito para a utilização integrada desses materiais. A hidrólise dos materiais lignocelulósicos é efetuada por processos físicos, químicos e biológicos e pela combinação destes. Dentre estes métodos se incluem a hidrólise ácida (PESSOA Jr.,

1991 }, hidrólise enzimática (TSAO, 1978), explosão a vapor (CONVERTI et et.. 2000a) e extração com soluções alcalinas (do TOIT et ai .. 1984).

A principal dificuldade encontrada no aproveitamento destes hidrolisados é que além da fração hemicelulósica podem ser encontrados outros compostos provenientes do processo de hidrólise tais como ácido acético, furfural. hidroximetilfurfural. ácido fórmico, ácido levulínico e ácido acético, assim como compostos aromáticos oriundos da degradação da lignina e dos extrativos da madeira. os quais possuem grande ~ potencial inibitório na atividade fermentativa dos microrganismos, sendo necessária a remoção ou redução de suas concentrações para que os hidrolisados possam ser

empregados efetivamente nos processos de bioconversão (PARAJÓ et ai., 1998b). 4

Revisão Bicuoqretice

2.1.1. Madeira de eucalipto

Atualmente o Brasil possui a maior área de selva tropical do mundo e conta com

aproximadamente 5 milhões de hectares de plantações florestais. que devem ser incrementados nos próximos anos com uma taxa de crescimento de 135.000 ha/ano (FAO, 2000). Segundo relatado por FEARNSIDE (1998), somente no estado de São Paulo o governo planeja aumentar a área de plantações florestais de 750.000 ha em

1990 para 1,5 a 2,8x106 ha em 2005. Conforme estatísticas da FAO em 2000, o Brasil é considerado o quinto produtor

de madeira de uso industrial e o maior produtor de madeiras tropicais em nível mundial. Quase a metade de sua produção de madeira é processada para uso industrial destinando-se o restante à elaboração de polpa e papel. Por outro lado, o Brasil aproveita uma proporção relativamente elevada de sua produção madeireira: ainda assim, continua a ser um dos dez maiores exportadores de produtos florestais e um dos três maiores produtores e consumidores de lenha do mundo.

Nas últimas décadas no Brasil, o eucalipto vem sendo o gênero florestal mais

utilizado para aumentar a área de plantações utilizadas para fins industriais. contribuindo assim para o desenvolvimento vertiginoso das indústrias madeireira e de

polpa e papel. Somente em 2000 foram plantados 2.964.000 ha, o que representa 59,5% da área total de plantações florestais no país (Tabela 11.1 ).

O eucalipto é uma angiosperma do gênero Eucalyptus, abrangendo mais de 600 espécies. A sua distribuição natural ocorre na Austrália, Tasmânia e Indonésia. Foi introduzido em outros continentes, inicialmente como planta ornamental e medicinal,

passando posteriormente a ser utilizado para reflorestamento em geral (CÔRREA, 1978).

Dentre as poucas espécies de eucalipto consideradas como excelentes do ponto de vista comercial, Eucalyptus grandis destaca-se por ser a espécie dominante no

Brasil. Os projetos de reflorestamento econômicos com esta espécie tiveram início após a introdução do eucalipto da Austrália, por Edmundo Navarro de Andrade. a partir

de 1904, para cobrir as necessidades de dormentes das companhias de estradas de ferro (CORRÊA, 1978).

5

Pe 11sáo 81b,1ográfica

TABELA 11.1 Plantações florestais no Brasil em 2000.

Grupo de espécies Área plantada Industrial Não industrial

ha % % %

Eucaliptos 2.964.000 59,5 100

Seringueira 180.000 3,6 100

Teca 13.500 0,3 100

Pinhos 1.769 300 35,5 100

Outras coníferas 54.000 1,1 100

Total 4.981.500 100

Fonte: FAO (2000)

Atualmente sua produtividade se encontra entre as maiores do mundo e os rendimentos em matéria seca são estimados em torno de 501/ha/ano (EL BASSAM, 1998). As características que tornam esta espécie parte definitiva da produção florestal no Brasil são sua precocidade, produtividade, rentabilidade e qualidade dos produtos

finais obtidos (COUTO et ai., 1998). Segundo estudos realizados por BRITO et ai. (1979) somente 51,7% do massa

seca total do eucalipto é aproveitado pela indústria brasileira, permanecendo o restante

no campo na forma de folhas. galhos. copas e madeiras finas que constituem resíduos com grande potencial para serem utilizados em processos biotecnológicos. em função da facilidade da hidrólise da sua fração hemicelulósica, obtendo-se um hidrolisado rico

em açúcares fermentescíveis. em particular a xilose. A descoberta de microrganismos capazes de fermentar xilose (ONISHI & SUZUKI.

1966: BARBOSA et et., 1988; SIRISANSANEEYAKUL et ai., 1995) propiciou o desenvolvimento de uma série de pesquisas visando o aproveitamento biotecnológico desses resíduos, com a finalidade de obter produtos de elevado valor agregado como butanol, ácido butírico (SADDLER et ai, 1983) ácido cítrico (PRATA, 1989), 2,3- butanodiol (PRATA, 1997), proteína microbiana (ALMEIDA e SILVA, 1991, 1996).e

xiltol (FELIPE et ai., 1996a).

6

Revisão Bibliográfica

2.2. XILITOL

2.2.1. Propriedades e aplicações

O xilitol (C5H1205) é um álcool pentahidroxilado (pentiol) de xilose, de massa molar 152, 15 g/mol (Figura 2.1 ).

FIGURA 2.1. Estrutura química da molécula de xilitol.

Este composto é um produto intermediário do metabolismo de carboidratos no homem e em animais. Sua concentração no sangue humano varia de 0,03 a 0,06 g/100 ml (MANZ et ai., 1973). É também encontrado em frutas e vegetais (Tabela 11.2) (EMODI, 1978).

TABELA 11.2 Conteúdo de xilitol de algumas frutas e vegetais (EMODI, 1978).

Produto Conteúdo de xilitol (mg/100g base seca)

Framboesa Morango Ameixa amarela Endivías Alface Couve-flor Espinafre berinjela Cogumelos

268 362 935 258 131 300 107 180 128

7

Pev,s.1o 81b/Jográfica

As propriedades físico-químicas (Tabela li 3) e fisiológicas do xilitol. o tornam um insumo promissor nas indústrias alimentícia. odontológica, e farmacêutica (BAR. 1991 ).

TABELA 11.3 Propriedades físico-químicas do xilitol (MANZ et ai .. 1973. HYVÓNEN

et ei., 1982, BAR, 1991 ).

Fórmula química

Massa molar

Sabor

Odor

Aparência

pH em solução aquosa a 5%

Solubilidade a 30 "C

Calor de solução

Poder adoçante

Valor calórico

Estabilidade

CsH12Üs

152, 15 g/mol

Doce

Inodoro

Pó cristalino, branco

5a7

68 g/100 g água

-34, 8 cal/g ( efeito refrescante)

Igual a sacarose, superior ao sorbitol e manitol

4,06 kcal/g

Estável a 120 "C e sob condições normais de

processamento de alimentos. A caramelização

ocorre se aquecido por vários minutos próximo

ao ponto de ebulição

A importância econômica e social do xilitol deve-se principalmente a seu potencial

como substituto de açúcares convencionais. devido a seu poder adoçante, que é

comparável ao da sacarose e superior ao do sorbitol e manitol (HYVÓNEN et et..

1982). Na indústria alimentícia o xilitol pode ser amplamente utilizado devido a sua

solubilidade em água. Por não apresentar em sua estrutura grupos aldeídices e cetônicos, o xilitol não provoca reações de escurecimento de tipo Maillard (EMODI, 1978). Por isso, ele é apropriado para o processamento, a elevadas temperaturas, de

alimentos nos quais estas reações são indesejáveis, como .na elaboração de produtos infantis (LAM et ai., 2000; ALANEN et ai., 2000). Uma vez que o xilitol não é fermentado pelas leveduras, sua utilização no preparo de xaropes e refrescos é altamente vantajosa, eliminando a necessidade de pasteurização do produto e da

8

Reviséo B1bhográflca

adição de conservantes para estoque por 4 ou 5 meses em frascos fechados (MANZ et el., 1973).

O xilitol apresenta também propriedade anticariogênica, pelo fato de não ser utilizado pelos microrganismos da flora bucal, em particular pela bactéria

Streptoccoccus mutans, e de, consequentemente, evitar a formação de ácidos que atacam o esmalte dos dentes (SODERLING et ai., 1997; LINGSTROM et ai., 1997: GALES. NGUYEN, 2000).

Por ser muito bem tolerado pelo organismo humano (MAKINEN, 1976) o xilitol vem sendo empregado com segurança na área clínica. De fato, esse adoçante tem sido indicado para pacientes com doenças biliares e renais, como também para pessoas obesas, já que contribui muito pouco para a formação de tecidos gordurosos, quando comparado com outros açúcares (BAR, 1991 ). O xilitol pode ser eficazmente empregado no tratamento de outras desordens metabólicas, como a deficiência da

enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (EMODI, 1978) e na dieta de diabéticos, pois não requer insulina para o seu metabolismo (YLIKAHRI, 1979) Segundo MAKINEN (2000), os efeitos clínicos associados com a administração de xilitol podem ser explicados por uma simples teoria pentiol-hexitol, a qual baseia-se no fato de que o metabolismo dos carboidratos que apresentam 6 átomos de carbono em sua estrutura

é freqüentemente inibido pelo metabolismo dos carboidratos com 5 átomos de carbono. Tem sido relatado que este poliol previne a redução da densidade dos ossos, bem

como seu conteúdo de minerais, cálcio e fósforo, melhorando consideravelmente as

propriedades bio-mecânicas dos ossos (MATIILA et al., 1998a; MATIILA et al., 1998b: MATTILA et ai., 1999) pelo que poderia ser utilizado no tratamento de doenças ósseas

como a osteoporose.

Vários estudos têm mostrado que o xilitol inibe com efetividade o crescimento das espécies bacterianas S. pneumoniae e Haenophilus influenzae causantes da otite média aguda, sendo recomendado seu uso como um tratamento alternativo promissor

ao emprego de antibióticos para combater essa doença (UHARI et ai., 2000: ERRAMOUSE, HEYNEMAN, 2000).

O xilitol combinado com glicóis é utilizado no campo da traumatologia para preparar poliesteres ramificados como por exemplo, o hidroxipropilxilitol, cujas propriedades

mecânicas e termofísicas são semelhantes às das espumas de poliuretano usadas para imobilização de lesões traumatológicas (SANROMÁN et ai. 1991 ).

No Japão, e em países da Europa, o xilitol tem sido amplamente aceito na nutrição parenteral (TOUSTER, 1974; MAKINEN, 1976) e no preparo de soluções parenterais

9

Revtsêo 81bhográfica

contendo açúcar e aminoácidos. pois, ao contrário do que ocorre com a glicose. não

reage com aminoácidos (FÔRSTER. 197 4 ). Como adoçante, é largamente empregado na Alemanha e na Suíça; no Brasil, é utilizado na formulação de gomas de mascar, pastilhas e creme dental.

2.2.2. Vias de obtenção

O xilitol pode ser extraído das fontes naturais por extração sólido-líquido, porém, devido a sua baixa concentração, na ordem de 900 mg/1 OOg, nessas fontes, este processo se torna economicamente inviável (HYVÔNEN et et., 1982). A Figura 2.1 resume as tecnologias disponíveis para a obtenção de xilitol.

2.2.2.1. Via química

O processo de produção de xilitol por via química, em escala comercial (Figura 2.2), consiste na hidrogenação catalítica da xilose de alta pureza, obtida

através da hidrólise de materiais lignocelulósicos, em presença do catalisador níquel,

resultando em uma mistura de xilitol com outros açúcares e polióis (HYVÔNEN et ai.,

1982). O rendimento e a qualidade do xilitol obtido por esse processo estão intimamente relacionados com a pureza da solução inicial de xilose, pois a presença de

impurezas interfere no processo de catálise. Além disso, são necessárias várias etapas

posteriores de purificação para a remoção de resíduos tóxicos do catalisador e dos subprodutos originados durante o processo de hidrogenação (MELAVA, HAMALAINEN, 1977), o que ocasiona aumento do tempo de processo e encarecimento do produto.

A via biotecnológica apresenta-se como alternativa à via química, uma vez que a bioconversão pode ser efetuada diretamente nos hidrolisados obtidos da fração hemicelulósica dos resíduos lignocelulósicos ricos em xilana, não sendo necessária a obtenção de uma solução de xilose de alta pureza (FELIPE et et., 1993, ROBERTO et el., 1994; CANETTIERI, 1998). Ademais, o processo biotecnológico opera em condições mais brandas de pressão e temperatura que o processo químico, e seu emprego pode reduzir os altos níveis de poluição ambiental bem como os gastos relacionados com o tratamento dos resíduos produzidos pela via química (WINKELHAUSEN, KUSMANOVA, 1998).

10

FRUTAS OL VEGETAIS

Agente de

extração l ~,

l~XTRA(t\O . . SOi .l D0/1.l<)U IDO

LIGNOCELLLOSICOS RICOS E\.1 XILAr\AS

Pevtsêo Bibuoqrétic«

XI LOS E I C0\1ERCIAL f

t)1 ·:s·1·c >X, , .. ,e·,\(.' A<>

FIGURA 2.2 Tecnologias disponíveis para a produção de xilitol (PARAJÓ et ai., 1998a).

Catalisado (ácido)

HIDRÓLISE

Soluções ricas cm xilose

H~

I IIDROGFNA(i\O CATAI .IJICA

j Produtos de reação

j SEPARAÇÃO/ PURIFICAÇt\O

Enzimas e/ou . .

m icrorgarusnn is

CONVERS,\O BIOTECNOLÓGIC\

XILITOL

11

M e/ m.; o de

/Jl' lll OS('

Hidrólise da matéria-prima contendo pentases

SoÍltCr'CIO de pentases

Rev,sJo 8:C;109,anca

Troca iônica

.. 11 idrogcnaçào

Fracionamento e cristalização

XI LOS E

Purificação final e remoção de cor

Solll((IO de pcnto:«: purificada

Melaço de /JL'III< JSL'

- So/11<Jio de noliois

Fracionamento e cristal izaçào

,

XILITOL

FIGURA 2.3 Esquema genérico do processo de produção de xilose e xilitol

(HYVONEN et ai., 1982).

12

:::e;:sãG :3-,tJ11ográhca

2.2.2 2. Via biotecnológica

Existem bactérias. leveduras e fungos capazes de assimilar e fermentar a xilose.

produzindo xilitol. etanol e outros compostos (PARAJÓ et ai., 1998a) As leveduras tem

sido apontadas como as melhores produtoras de xilitol, especialmente as do gênero

Candida (BARBOSA et ai., 1988; SIRISANSANEEYAKUL et ai., 1995). Dentro deste

gênero Candida guilliermondii tem se mostrado uma espécie promissora para produzir

xilitol, tanto quando cultivada em meio sintético (ONISHI, SUZUKI, 1966), quanto em

hidrolisado de materiais lignocelulósicos (FELIPE et ai., 1993; ROBERTO et ai.. 1994.

CANETTIERI, 1998).

A bioconversão de xilose em xilitol tornou-se possível a partir da descoberta por

ONISHI, SUZUKI (1966) de leveduras capazes de induzir, na presença de xilose, a

enzima xilose redutase (E. C.1.1.1 21) Esta enzima catalisa a redução da xilose a xilitol

na presença dos cofatores NAO(P)H ou NAOH, no início do metabolismo da xilose

(BARNETT, 1976; JEFFRIES, 1983) Posteriormente, ocorre a participação da enzima

xilitol desidrogenase (E.C. 1.1.1 9), que emprega NAD+ ou NAO(P)' como cofator,

oxidando xilitol a xilulose (SLININGER et ai., 1987) A xilulose é fosforilada a xilulose 5-

fosfato, que, na via das fosfopentoses, é convertida em frutose-fosfato. A frutose-

fosfato pode ser convertida em piruvato, através da conexão com a via Embden

Meyerhoff Parnas (EMP) ou retornar à via das fosfopentoses (TAYLOR et el., 1990;

WEBB, LEE. 1990; ROSEIRO et ai., 1991; NOLLEAU et ai., 1993), conforme esquema

apresentado na Figura 2.3.

A disponibilidade de oxigênio tem grande importância na assimilação da xilose

assim como no acúmulo e excreção de xilitol.

Segundo SKOOG. HAHN-HAGERDAL (1988) as células requerem oxigênio para

sintetizar esteróis, ácidos graxos insaturados e ácidos nicotínicos necessários para

realizar as funções de transporte de açúcares através da membrana celular. Tem sido

constatado que a assimilação de xilose é favorecida em cultivas conduzidos sob

condições aeróbias, indicando com isto que o oxigênio induz ou ativa o sistema de

transporte desta pentase (HAHN-HAGERDAL et ai., 1994) .•

13

Revisêc: B1bilogràflca

Xilose Glicose

t Consumo de Açúcares

NAOP+ NAOPH~ J -u-:':

6 Fosfogluconato e~ .....- ...__·----r-'~ ~· ~ NAOP+

Ribulose 5P NADP ..

1 .> ~~eSP Xilulose SP

-·-- . -/- -· -.·-----..... / Gliceraldeido 3P

NADPH---Y NADP+ -t--._

Xilitol

NAOH

Glicose

i Glicose 6P . l

Xilose

NAO+. --/

NAO/

Xilulose Frutose 6P

i Frutose 1,6 P

(~

Eritrose 4P Frutose 6P

Dihidroxi acetona P Sedoheptulose 7P

.. NADH

y~ NADH

} .. NAD+

Glicerol 3P

1 Frutose 6P -------~ - ....

Gliceraldeido 3P Glicerol

NAOH y Ciclo CAC

r>. ~----

Piruvato C02 .. ~" .> ~C02

Acetil CoA Acetaldeído

'<. ~.a·· Acetato NAOH

?" ~ Etanol

NAO+

Cadeia Respiratória

NAOH

FIGURA 2.4 Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de xilose

(HAHN-HAGERDAL et ai., 1994)

14

Fev,sao 81oilograt.ca

Conforme relatado por NOLLEAU et ai. (1995), sob condições anaeróbias. a xilose

não pode ser assimilada, não pela falta das enzimas específicas para o metabolismo

da xilose. mas pelo fato de que o NADH produzido não pode ser regenerado através da

fosforilação oxidativa.

O metabolismo da xilose em leveduras pode ser direcionado para o processo respiratório ou fermentativo em função da disponibilidade de oxigênio no meio de fermentação (VANDESKA, K~SMANOVA, 1995a). Segundo NOLLEAU et ai. (1995). este comportamento metabólico deve-se a que, em geral, à existência de diferenças no requerimento dos cofatores necessários para a atividade das enzimas específicas do metabolismo da xilose, sendo que o NAOPH é requerido pela xilose reductase. enquanto a xilitol desidrogenase depende de NAD+ p~ra sue atividade catalítica.

Conforme relatado por TAYLOR et ai. (1990) o NADH produzido é regenerado na cadeia respiratória, onde o oxigênio participa como aceptor final de elétrons.

Desta forma. a formação de xilitol é favorecida sob condições limitadas de oxigênio,

como conseqüência do acúmulo intracelular de NADH, o que resulta na inibição da

xilitol desidrogenase NAo• dependente. Este fenômeno surge da incapacidade das

leveduras para compensar o excesso intracelular de NADH, uma vez que estes

microrganismos carecem de atividade transhidrogenase (van Oijken. Scheffer ( 1986)

citados por WlNKELHAUSEN, KUSMANOVA, 1998).

Conforme relatado por FURLAN et ai. (1991 ), condições excessivas de oxigênio

ativam o Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos (CAT) e o sistema de transporte de elétrons

onde o NAo· é regenerado, tornando possível a transformação do xilitol em xilulose,

que adicionalmente é degradada através das vias fosfopentoses e Embden-Meyerhoff-

P arnas. resultando na formação de piruvato. Em conseqüência. menos xilitol é

acumulado no meio. Laplace et ai. (1991) citados por WINKELHAUSEN. KUSMANOVA

( 1998), têm sugerido que na presença de oxigênio o piruvato é oxidado completamente

através do CAT, resultando em um aumento da massa celular.

Tem sido detectada a presença, em pequenas quantidades. de etanol, glicerol e

arabitol, dentre outros compostos, durante a bioconversão de xilose em xilitol por

algumas espécies de leveduras. Isto, segundo NOLLEAU et ai. (1995), pode ser devido

ao fato de que em condições limitadas de oxigênio a célula regenera o NADH através

da formação destes compostos.

15

Revisão B1bilográhca

Nos últimos anos tem sido desenvolvidas inúmeras pesquisas com a finalidade de

aumentar a produção de xilitol por via microbiológica. Os trabalhos centram-se no

estudo de diversos fatores que influenciam a bioconversão de xilose em xilitol tais

como a concentração inicial de xilose (MEYRIAL et et.. 1991: NOLLEAU et et.. 1993) a

presença de glicose no meio de fermentação (BICHO et et.. 1988. SUGAI, DELGENES.

1995, GIRIO et ai., 2000 ), a fonte de nitrogênio (BARBOSA et el., 1988). o pH

(SLININGER et el., 1990; FELIPE et et., 1997b), a temperatura (BARBOSA et el. 1988.

CONVERTI et et., 2001 ), a disponibilidade de oxigênio (WINKELHAUSEN et et.. 1996.

ACOSTA et ai., 2000), a concentração de células no inóculo (PARAJÓ et ai. 1996c:

ROBERTO et ai, 1996a; FELIPE et ai, 1997a) e o efeito dos compostos inibidores

formados durante o processo de hidrólise dos materiais lignocelulósicos (CLARK.

MACKIE. 1984; LARSSON et ai, 1999; LARSSON et ai, 2000)

2.2.2.3. Toxicidade dos hidrolisados hemicelulósicos e suas influências na

bioconversào de xilose em xilitol

Além das condições de cultivo a bioconversão, de xilose em xilitol pelas leveduras

cultivadas nos hidrolisados de materiais lignocelulósicos é consideravelmente

influenciada pela presença de compostos tóxicos oriundos da degradação da estrutura

lignocelulósica durante o procedimento de hidrólise ácida desses materiais. Esses

compostos incluem o furfural, o hidroximetilfurfural, o ácido acético, os compostos

aromáticos bem como os íons metálicos pesados. Além destes, os hidrolisados contêm

compostos derivados dos extrativos dos materiais lignocelulósicos (CLARK. MACKI E.

1984; FRAZER, MacCASKEY. 1989; PREZIOSI-BELLOY et ai. 1997, LARSSON.

2000)

O furfural é um produto resultante da degradação das pentases. enquanto que o 5-

hidroximetilfurfural (5-HMF) resulta da desidratação das hexases. O 5-HMF é

considerado um intermediário reativo da desintegração das hexases, por isso. ele é

adicionalmente degradado aos ácidos levulínico e fórmico. O ácido fórmico também

pode ser obtido como um produto da desintegração do furfural quando a hidrólise •

ocorre sob condições ácidas e a elevadas temperaturas. Conforme relatado LARSSON

et ai ( 1999), o ácido fórmico possui maior potencial inibidor sobre . a atividade

fermentativa de Saccharomyces cerevisiae que os ácidos acético e levulínico. Esses

autores evidenciaram que este ácido quando presente no meio em concentração de

0,48 mmol/L causa uma redução de 15 e 22% no fator de rendimento em etanol

16

:;e 11são B1b/1ográf1ca

quando comparado com os valores obtidos nas fermentações efetuadas na presença de concentrações equimolares dos ácidos levulínico e acético no meio de fermentação. respectivamente. Segundo esses autores este comportamento deve-se ao fato de que a molécula de ácido fórmico possui menor tamanho, o que facilita sua difusão através da membrana celular resultando em maior toxicidade do ànion, enquanto que o ácido

levulínico pode ser levemente mais tóxico que o ácido acético como conseqüência de que a molécula deste composto é mais lipofílica que a molécula de ácido acético. o que promove sua difusão através da membrana celular. Além destes compostos, a desintegração dos açúcares rende um grupo de substâncias reativas denominadas substâncias húmicas. as quais têm sido pouco estudadas (CLARK. MACKIE. 1984). Na Figura 2.4 apresenta-se um esquema simplificado da deqradacáo dos carboidratos durante a hidrólise ácida.

A decomposição da fração hemicelulósica também resulta na formação de ácido acético. oriundo dos grupos acetil das cadeias laterais das hemiceluloses (FENGEL.

WEGENEGER. 1989). Embora a lignina seja resistente à hidrólise ácida. ela é parcialmente degradada

durante este processo. em conseqüência é obtida uma grande variedade de compostos

fenólicos monoméricos e poliméricos. dentre eles vanilina. álcool coniferílico. siringaldeído, ácido vanilinico e ácido siringico têm sido encontrados com maior freqüência (FRAZER, MacCASKEY. 1984; TRAN. CHAMBERS. 1985; SINGH. MISHRA. 1995; RODRIGUES. 1999). Conforme relatado por LARSSON et ai (2000).

os compostos aromáticos podem também ser oriundos da degradação dos açúcares e dos extrativos da madeira. Dentre eles. os mais freqüentemente encontrados nos

hidrolisados são os álcoois. taninos e terpenos (SINGH. MISHRA. 1995: FRAZER.

MacCASKEY. 1989). O efeito dos compostos tóxicos sobre o metabolismo da xilose é bastante discutido

e complexo. havendo evidências de que a inibição da atividade fermentativa é causada

pelo efeito sinergístico entre eles (CLARK. MACKIE. 1984; VOGEL et ai. 1998). Outros estudos têm indicado que o potencial inibitório desses compostos é fortemente

dependente de fatores tais como o microrganismo utilizado e o seu grau de adaptação. do tipo de hidrolisado e das condições operacionais estabelecidas durante o processo

fermentativo (AMARTEY, JEFFRIES. 1996; PARAJÓ et ai., ~998b), não sendo possível estabelecer a concentração máxima permissível desses compostos nos meios de

fermentação.

17

Revisão B,ouogrtihca

[ PENTOSES l [ HEXOSES l c:::::J D

Intermediários reativos

c:::::J D

Intermediários reativos

Substâncias

húmicas

[ FURFURAL ) [ HIDROXIMETILFURFURAL J = D

Ácidos levulínico e

fórmico

FIGURA 2.5 Degradação dos carboidratos durante a hidrólise ácida realizada a

elevadas temperaturas (CLARK, MACKIE, 1984).

18

Peviséo B1cIIcgràf1ca

Em relação à toxicidade do furfural, vários estudos têm sido conduzidos a fim de

avaliar o efeito deste composto no metabolismo microbiano AZHAR et ai. ( 1981)

constata ... arn uma redução de 80% na taxa de bioconversão de glicose em etanol por

S. cetevisiee. em meio contendo 3.0 g/L de furfural. Weigert et ai. (1988). citados por

PARAJÓ et ai. (1998b), também evidenciaram o efeito tóxico deste composto sobre o

metabolismo oxidativo de Pichia stipitis. Segundo Nipurama et ai. (1981) citados por

SANCHES. BAUTISTA et ai. (1988), em C. tropicalis o efeito tóxico do furfural está

associado à inibição da síntese de proteínas e .. RNA. Esses autores também

constataram inibição de várias enzimas da via glicolítica na presença de furfural.

afetando o crescimento e a capacidade de fermentar dessa levedura. Soboleva et ai.

(1973), citados por AZHAR et ai. (1981 ). demostraram que o furfural atua inibindo a

síntese de citocromos em C. tropicalis.

Recentemente, CONVERTI et ai. (2000b) evidenciaram o potencial inibitório do

furfural sobre a bioconversão de xilose em xilitol por C guilliermondii cultivada em meio

sintético. Segundo esses autores a presença de 0,62 g/L do referido composto foi

suficiente para reduzir consideravelmente a produtividade em xilitol.

Alguns trabalhos relatam a assimilação de furfural por várias espécies de

leveduras, obtendo-se como produtos do metabolismo o álcool furfurílico (MORIMOTO

et ai .. 1968; DIAZ de VILLEGAS et et., 1992) e o álcool furóico (SANCHES, BAUTISTA,

1988) Segundo Weigert et ai. (1988), citados por PARAJÓ et ai. (1998b). a enzima

álcool desidrogenase catalisa esta bioconversão.

Apesar da toxicidade do furfural, diferentes estudos têm mostrado que sua

presença em determinadas concentrações exerce um efeito estimulante no

metabolismo microbiano. Conforme relatado por OJAMO et ai. (1988). o furfural não

exerceu efeito inibitório para C. guilliermondii na faixa de 0,2-1,0 g/L. favorecendo

inclusive a bioconversão de xilose em xilitol. ROBERTO et ai. (1991 ). trabalhando com

a mesma levedura, evidenciaram o efeito estimulante deste composto sobre o

crescimento celular quando em concentrações menores de 0,5 g/L.

Segundo Wilson et ai. (1989), citados por PARAJÓ et ai. (1998b), a presença de

furfural na concentração de 0,28 g/L não inibiu o crescimento de C. tropicalis cultivada

em hidrolisado hemicelulósico de álamo. .. VILLA et ai. (1990) observaram que durante o

cultivo de S. cerevisiae uma concentração de 6,0 gil de furfural, adicionado ao meio de

19

Revisão Eionoqréttce

fermentação cada 6 horas. não exerceu efeito inibitório sobre o crescimento da

levedura e a fermentação alcoólica.

Quanto ao 5-HMF, lngran et ai. (1955), citados por AZHAR et ai. (1981 ).

evidenciaram que a concentração de 1,0 g/L deste composto foi suficiente para inibir o

crescimento celular e a fermentação por S. cerevisiae. SANCHES, BAUTISTA ( 1988)

observaram uma redução de 62% no crescimento celular de C. guilliermondii quando

este composto estava presente no meio na concentração de 2,0 g/L. FELIPE et ai.

(1993), trabalhando com mesma levedura, verificaram que baixas concentrações de 5-

HMF (0.11 g/L), não afetam a bioconversão de xilose em xilitol.

Apesar de ser uma fonte rica em energia para muitos microrganismos. o ácido

acético tem sido apontado como um forte inibidor do- metabolismo de leveduras

(PAMPULHA, LOREIRO-DiAS, 1989; FERRARI et et., 1992). O efeito inibitório deste

ácido esta relacionado à sua concentração (FELIPE et ai., 1995). à acidez do meio

(ROBERTO et el., 1996b; FELIPE et et., 1997b), à disponibilidade de oxigênio (FELIPE

et et.. 1996b; SANCHES et e!., 1997), à temperatura (van ZYL et et, 1988) e à relação

xilose/ácido acético (du PREZ et et, 1991)

A toxicidade do ácido acético tem sido atribuída à sua forma não dissociada, que

depende do pH (PAMPULHA, LOUREIRO-DIAZ, 1989; FERRARI et et, 1992,

LAWFORD et el., 1993 ). No pH ótimo para a fermentação por leveduras (4-5). este

ácido lipofílico se difunde livremente, através da membrana citoplasmática. para o

interior da célula, onde o pH fisiológico propicia sua dissociação iônica

(PAMPULHA, LOUREIRO-DIAZ. 1989). A elevada concentração intracelular de íons

afeta a atividade da ATPase responsável pela manutenção do gradiente de prótons

através da membrana, consequentemente ocorre desacoplamento da conservação da

energia. acidificação do citosol e descontrole no sistema de transporte de vários

nutrientes como fosfato, aminoácidos e açúcares (PARAJÓ et ai., 1997b: KUSUMEGI

et ai., 1998).

FELIPE et ai. ( 1997b) constataram a influência conjunta do pH e do ácido acético

sobre o crescimento e a produção de xiltiol por C. guilliermondii, em hidrolisado de

bagaço de cana-de-açúcar. Observou-se que na presença de 5,0 gil deste composto e

valores de pH menores que 4,5 o consumo de açúcares e a produção de xilitol foram

fortemente inibidos, não sendo detectado crescimento celular nestas condições.

Valores de pH iguais ou superiores a 5,5 proporcionaram a maior produção de xilitol.

20

Pev,sào B1b11ograf;ca

Resultados similares foram obtidos por ROBERTO et ai. ( 1996b) com a mesma

levedura cultivada em hidrolisado de palha de arroz.

O potencial inibitório do ácido acético é também dependente de sua concentração.

sendo relatado um efeito estimulante sobre o crescimento e a capacidade de fermentar

de várias espécies de leveduras quando presente em baixas concentrações (LEE.

MacCASKEY, 1983; van ZYL et ai., 1988; FELIPE et ai., 1995). Conforme relatado por

FELIPE et ai. (1995) a presença deste ácido na concentração de 1,0 g/L favoreceu a

produção de xilitol ( 42, 18 g/L) durante o cultivo de C. guilliermondii em meio

semisintético; entretanto, quando este ácido estava presente em concentração de

12 g/L, obteve-se uma redução de 50% no valor deste parâmetro quando comparado

com a concentração obtida após a fermentação conduzida em meio livre de ácido

(36,67 g/L) Segundo esses autores, uma possível explicação para este

comportamento é que parte do ácido entraria diretamente no ciclo de Krebs via Acetil-

CoA, enquanto que em concentrações acima de 1,0 g/L, parte seria dirigido ao ciclo de

Krebs e o restante utilizado por uma outra via metabólica que requer energia, como o

ciclo do ácido Glioxilico. Isto resultaria em perda de energia para a manutenção do

metabolismo celular, resultando, por exemplo, na redução do crescimento celular

Conforme relatado por CLARK, MACKIE (1984) os produtos da degradação da

lignina e os extrativos são mais tóxicos que o furfural e o 5-HMF Esses autores

constataram que estes compostos presentes no meio de cultivo em concentrações

menores que 1,0 g/L possuem elevado potencial inibitório.

RUIZ-ORDAZ et ai. (1998) estudaram o efeito inibitório do fenol sobre o

crescimento de C. tropicalis quando presente no meio na faixa de 0-400 ppm Foi

observado que este composto não só inibiu o crescimento da levedura. mas também

causou lise celular.

Em fermentações conduzidas por LEE, MacCASKEY (1983) com Pachysolen

tannophilus, constatou-se que a presença de vanilina no meio, a 5,0 g/L. inibiu

completamente o crescimento da levedura, enquanto o de ácido vanílico, a 3.7 gil,

causou uma redução de 50% do crescimento. Segundo esses autores a concentração

de compostos aromáticos de baixa massa molar, encontrada normalmente nos

hidrolisados hemicelulósicos, é suficiente para exercer um efeito tóxico considerável.

Em vários trabalhos tem se constatado que o potencial inibitório dos compostos

aromáticos depende do grupo funcional e da sua posição quando ligado ao anel

21

Reviséo 81bl1ográhca

benzeno. Ando et ai. (1986) citados por LARSSON (2000) estimaram que o potencial

inibitório dos grupos ligados ao anel aromático sobre a atividade fermentat,va de

Klebsiella pneumoniae aumentou do grupo carboxila (COOH) para o grupo hidroxila na

posição "para" (p-OH), seguido do grupo aldeidico (CHO) e finalmente o etileno

(CH=CH), sendo que a hidroxila ligada na posição meta (m-OH) carece de efeito

inibidor, enquanto que a presença do grupo metoxila (OCH3) provoca efeito

estimulante. Um comportamento similar foi observado por TRAN, CHAMBERS (1985,

1986) ao verificar o efeito tóxico de vários compostos aromáticos sobre a fermentação

etanólica por P. sipitis. Esses autores propuseram que os ácidos aromáticos são

menos tóxicos que os correspondentes aldeídos e que os ácidos graxos apresentando

entre 6 e 9 átomos de carbono em sua estrutura são mais tóxicos que aqueles com 16

átomos de carbono. Entretanto LARSSON et ai. (2000), em fermentações conduzidas

com S cerevisiae. constataram que a troca de um grupo hidroxila na em posição "para"

por um grupo metoxila no anel aromático. resulta em maior inibição no crescimento

celular e na formação de etanol. Segundo esses autores os compostos com grupos

metoxilas na posição "para" apresentam potencial inibitório similar ao manifestado

pelos compostos em que este grupo se apresenta na posição meta

Tem sido constatado que as leveduras podem converter os aldeídos aromáticos em

seus correspondentes álcoois (LARSSON et ai. 2000) De Wulf et ai (1986) citados

por LARSSON et ai. (2000), sugeriram que esta conversão não é catalisada pela álcool

desidrogenase senão por uma oxidoreductase cuja síntese é induzida pela presença

destes compostos no meio de fermentação.

Poucos estudos aparecem na literatura relacionados com o efeito dos cátions

metálicos sobre o metabolismo de leveduras. Watson et ai (1996). citados por

PARAJÓ et ai (1998b). observaram que a presença dos cátions cobre e cromo no

meio de cultivo, em concentrações entre O e 0,004 g/L e entre O e 0.1 O g/L.

respectivamente, não afetaram significativamente a velocidade específica de

crescimento máxima (µmax). Porém, observou-se uma redução de 60% no valor deste

parâmetro quando o níquel esteve presente na concentração de 0.1 O g/L.

Gíria et ai. (1996), citados por PARAJÓ et ai. (1998b). relataram que os cátions

cálcio, magnésio e manganês não influenciaram a atividade da enzima xilitol

desidrogenase, entretanto, a presença de zinco, cádmio e cobalto inibiram fortemente a

atividade da referida enzima.

22

=e11são B,bhogràfica

2.2.2.4. Tratamentos dos hidrolisados hemicelulósicos

Vários tratamentos têm sido utilizados a fim de melhorar o potencial dos

hidrolisados hemicelulósicos para serem utilizados em processos de bioconversão. através da remoção ou redução das concentrações dos compostos inibidores da atividade fermentativa. Segundo o princípio empregado para a separação dos compostos inibidores. estes tratamentos podem ser agrupados em três classes principais:

Tratamentos físicos: -

• Troca iônica (TRAN, CHAMBERS. 1985; FRAZER, MacCASKEY, 1989; DOMÍNGUEZ et ai, 1996).

• Adsorção em carvão ativado (FRAZE, MacCASKEY, 1989)

• Extração com solventes orgânicos (FRAZER, MacCASKEY. 1989: PARAJÓ et et..

1997a, CRUZ et ai., 1999)

• Extração em corrente de vapor (Beck, 1986, citado por PARAJÓ et et., 1998b; CONVERTI et e!., 2000a)

Tratamentos químicos:

• Ajuste de pH com álcalis (TRAN, CHAMBERS. 1985; FRAZER, MacCASKEY, 1989;

DOMÍNGUEZeta/., 1996; SILVAeta/.. 1998)

• Alteração de pH com álcalis e ácidos (TRAN, CHAMBERS. 1985. AMARTEY. JEFFRIES, 1996; ROBERTO et el.. 1991; SILVA et et.. 1998)

• Adição de substâncias redutoras (sulfitação) (PARAJÓ et el., 1997b)

Tratamentos biológicos:

• Destoxificação utilizando fungos e leveduras (SCHNEIDER. 1996: PALQMVIST et el., 1997)

Algumas dessas técnicas são caras. sendo que, dependendo do tipo de hidrolisado, ~

seu uso pode se tornar economicamente inviável. Além disso, devido à presença nos hidrolisados de compostos tóxicos com diferentes propriedades físico-químicas, a maioria desses tratamentos, quando usados separadamente, não são eficazes para

remover ou reduzir as concentrações de todos esses compostos a níveis que permitam

23

Revisão Bibuoqretice

o desenvolvimento dos processos de bioconversão. A literatura especializada relata o

uso de diferentes alternativas a estas técnicas. dentre as quais podem ser citadas o uso de cepas mutantes (MOHANDAS et ai.. 1995), adaptação das leveduras aos

hidrolisados (FELIPE et et., 1996b, SILVA, ROBERTO. 2001 ), reutilização de células (SENE et ai., 1998) assim como o uso combinado dos tratamentos físicos, químicos e biológicos, sendo a alteração de pH combinada com a adsorção em carvão ativado um dos procedimentos mais utilizados para destoxificar os hidrolisados (PARAJÓ et ai..

1996a; ALVES, 1997; FRAZER, MacCASKEY, 1989; PARAJÓ etal., 1997b: DOMÍNGUEZ et ai.. 1996).

O tratamento por ajuste de pH consiste da elevação do pH do hidrolisado. inicialmente ácido, a valores apropriados para a atividade microbiana, usando álcalis.

Tem sido constatado que a elevação do pH resulta na precipitação de componentes tóxicos como íons de metais pesados, acetatos. taninos, terpenos e compostos

fenólicos (LEE, MacCASKEY, 1983; FRAZER, MacCASKEY, 1989) Segundo Leonard. Hainy (1945), citados por PARAJÓ et ai. (1998b). os álcalis mais adequados para efetuar este tratamento são os hidróxidos de bário. cálcio, sódio e amônia. Entretanto. tem sido desenvolvidos vários trabalhos usando outros álcalis, dentre eles o óxido de

cálcio. o carbonato de cálcio e o carbonato de magnésio (ROBERTO et ai.. 1991. PARAJÓ et ai, 1996a; FELIPE et ai., 1996b).

A influência do tratamento do hidrolisado pela elevação do pH com diferentes álcalis sobre o consumo de xilose por C guilliermondii foi verificada por ROBERTO et ai.

(1991 ). Esses autores constataram que, com o uso de CaO e Ca(OH):2, o consumo de xilose foi de 20% e 12%, respectivamente. enquanto que elevando o pH com KOH a levedura não foi capaz de assimilar esta pentase.

Vários estudos têm mostrado que o tratamento por elevação do pH fornece hidrolisados pouco susceptíveis à fermentação, obtendo-se baixa ou nenhuma eficiência de bioconversão (TRAN. CHAMBERS, 1985; FRAZER, MacCASKEY. 1989; ROBERTO et ai., 1991 ).

O tratamento baseado na alteração de pH com álcalis e ácidos consiste da elevação do pH inicial do hidrolisado com o uso de um álcali seguido da redução deste

pela adição de um ácido, até o pH ideal de fermentação. Este tratamento tem sido proposto como um método para a destoxificação dos

hidrolisados devido a sua eficiência para remover o mesmo tipo de compostos que a

elevação do pH. Porém tem um marcado efeito benéfico devido à precipitação de compostos aromáticos de baixa massa molar e à conversão de furfural em álcool

24

Revisão 31oi,ogranc2

furfurílico (TRAN. CHAMBERS. 1985 Strickland. Beck, 1984. citados por ROBERTO

et et.. 1991 ).

No entanto. este tratamento pode provocar degradação parcial dos açucares

AMARTEY, JEFFRIES (1996) relataram perdas de glicose (14%). xilose (4%) e

arabinose (8%) após o tratamento de hidrolisados de espigas de milho

O tratamento dos hidrolisados por adsorção em carvão ativado constitui um dos

métodos mais econômicos e eficientes para reduzir as concentrações de compostos

tóxicos presentes nos hidrolisados

Este tratamento baseia-se na capacidade deste material poroso. de origem natural.

de absorver sobre sua superfície diferentes tipos de moléculas, as quais são retidas na

superfície do carvão através de forças fracas denominadas de Van Der Waals. Estas

forças são resultantes de uma atração intermolecular de tal modo que seu potencial é.

basicamente, uma função da área superficial do material. Dentre os vários materiais

comumente usados em processos de adsorção física o carvão ativo apresenta a maior

área superficial, podendo variar entre 600 e 1600 m2/g, dependo da matéria-prima

empregada para sua fabricação (CONSIDINE, 197 4)

Tem sido evidenciado que sua utilização proporciona hidrolisados mais susceptíveis

à fermentação que os tratados por sulfitação, alteração de pH com ácidos e álcalis e

neutralização (FRAZER, MacCASKEY, 1989; PARAJÓ et ai., 1997b)

FRAZER, MacCASKEY ( 1989) verificaram uma redução das concentrações do

ácido acético (27%) e dos compostos aromáticos monoméricos (73%) e poliméricos

(69%). após tratar o hidrolisado de madeira dura com carvão ativado. PARAJÓ et ai.

( 1997b) também constataram um decréscimo na concentração destes compostos ao

utilizarem este método para tratar o hidrolisado de eucalipto, obtendo uma maior

produtividade (O, 17 g/Lh) e rendimento em xilitol (0,54 g/g) quando comparados com o

hidrolisado não tratado (O, 11 g/Lh e 0,47 g/g, respectivamente).

25

Marenai e Mérodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO DE EUCALIPTO

3.1.1. Matéria prima

Neste trabalho foram utilizados cavacos de eucalipto da espécie Eucalyptus

grandis provenientes da indústria Votorantim de Celulose e Papel (Jacarei-São Paulo)

3.1.2. Hidrólise ácida dos cavacos de eucalipto

Os cavacos de eucalipto (tamanho médio 20 x 1 O x 15 mm). foram hidrolisados em

um reator de aço de 22 L de capacidade útil. 'A hidrólise foi realizada conforme

metodologia estabelecida por ALMEIDA e SILVA (1996) de acordo com as seguintes

condições: relação água para massa seca de madeira igual 1 para 4.5; temperatura de

156ºC; tempo de reação de 27 minutos e concentração de 0.35% de ácido sulfúrico. O

hidrolisado obtido foi armazenado em câmara fria, para posterior concentração.

tratamento e caracterização.

3.1.3. Concentração

A fim de aumentar o teor de xilose para valores 2,5 e 4,5 vezes maiores que o

inicial, o hidrolisado foi concentrado em evaporador rotatório a vácuo de 4 L de

capacidade útil, operando a 70 ± SºC. O hidrolisado original e os concentrados foram ~ caracterizados quanto a pH, concentração de açúcares (glicose, xilose, arabinose),

ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos aromáticos.

26

Matenat e Mérooos

3.1.4. Tratamento

Os hidrolisados concentrados foram submetidos a diferentes tratamentos. visando

a redução dos compostos tóxicos provenientes do processo de hidrólise ácida.

Estudou-se diferentes combinações que consistiram da elevação ou não do pH original

dos hidrolisados para 7,0 pela adição de CaO, seguida da adsorção em carvão ativado

marca Synth, na proporção de 1 % ou 5%. O tratamento com carvão ativado ocorreu em

incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co. ). utilizando-se

frascos Erlenmeyer de 125 ml com 50 ml de hidrolisado, sob agitação de 200 rpm a

30ºC ou 60ºC por 30 ou 60 minutos. Finalmente, o pH dos hidrolisados foi ajustado

para 5,5 com CaO ou H3P04. Nas etapas de alteração do pH e adsorção em carvão

ativado os precipitados formados foram removidos por filtração a vácuo, em filtro de

porcelana (tipo Buckner) com papel de filtro qualitativo.

3.2. MICRORGANISMO E PREPARO DE INÓCULO

3.2.1. Microrganismo

Os experimentos foram conduzidos com a levedura Candida guilliermondií

FTI 20037, da coleção de culturas do Grupo de Processos Fermentativos-

Oepartamento de Biotecnologia - FAENQUIL, selecionada por BARBOSA et ai .. (1988).

3.2.2. Preparo do inóculo

O inóculo foi obtido a partir de uma cultura estoque da levedura C. guilliermondii.

mantida a 4ºC em ágar inclinado de extrato de malte. O cultivo da levedura foi feito

inoculando-se células da cultura estoque recém repicada (24 horas) em meio semi-

sintético com a seguinte composição em (g/L): 30,0 de 0-xilose, 7,0 de glicose. 2.0 de

sulfato de amônia, 0, 1 de cloreto de cálcio dihidratado e 20,0 de solução de extrato de ~

farelo de arroz "in natura".

27

Matena/ e Métoaos

As soluções de xilose, glicose e extrato de farelo de arroz foram autoclavadas a

111 ºC por 15 minutos e as demais soluções de nutrientes foram esterilizadas a 121 ºC

por 20 minutos em autoclave SOC. FABBE LTDA.

Para o cultivo foram utilizados frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 50 ml do

meio acima descrito, em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick,

Scientific Co.), sob agitação de 200 rpm., a 30ºC durante 24 horas.

Após o período de incubação as células foram separadas por centrifugação a

2 000 rpm por 15 minutos, resuspensas em água destilada esterilizada, lavadas e. após

nova centrifugação, foi preparada a suspensão de células utilizada como inóculo. Para

todos os ensaios a concentração celular inicial, determinada por turbidimetria. foi de 3,0

g/L, equivalente a 108 células/ml.

3.3. MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO

O meio de fermentação foi preparado com os hidrolisados concentrados e tratados.

Os hidrolisados foram autoclavados a 111 ºC por 15 minutos e suplementados com

sulfato de amônia e farelo de arroz nas concentrações de 1, 1 g/L e 5,0 g/L,

respectivamente, conforme estabelecido por CANETIIERI (1998).

A avaliação dos tratamentos dos hidrolisados foi feita através de ensaios de

fermentação. Os ensaios foram efetuados em frascos Erlenmeyer de 125 ml com

50 ml do meio de fermentação, a 30 ºC, sob agitação de 200 rpm em incubadora de

movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.), por 96 horas.

A caracterização dos hidrolisados, após as etapas de hidrólise, concentração e

tratamento, foi feita através de análises de pH, concentração de glicose, xilose e

arabinose, ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural, bem como dos compostos

aromáticos provenientes da degradação da lignina e extrativos da madeira.

Para o acompanhamento das fermentações cada variante experimental foi

realizada colocando 3 frascos Erlenmeyer, sendo que cada um foi retirado a cada

24 horas a partir das 48 horas de cultivo até o final da fermentação, para realizar

observações de viabilidade e pureza da cultura, determinação do consumo de glicose,

xilose e arabinose, ácido acético, produção de xilitol, células e variação do pH bem

como para o armazenamento em "freezer" para subsequentes análises.

28

Marenat e Méto<tos

3.4. MÉTODOS ANALÍTICOS

3.4.1. Determinação do teor de umidade dos cavacos de eucalipto

O teor de umidade dos cavacos de eucalipto foi determinado pela secagem das

amostras em estufa a 105ºC, até peso constante.

3.4.2. Viabilidade e pureza da cultura

A viabilidade celular durante os ensaios efetuados em incubadora de movimento

rotatório foi verificada por contagem em câmara de Neubauer (1/400 mm2x1/10 mm).

As amostras foram coradas adicionando igual volume de uma solução 0.01 % (p/v) de

azul de metileno dissolvido em citrato de sódio 2% (p/v) (ODUMERO et ai. 1992).

A pureza da cultura foi verificada usando lâminas fixadas e coradas com fucsina

As observações foram feitas em microscópio óptico Leitz.

3.4.3. Determinação da concentração celular

A medida do crescimento celular para o preparo do inóculo e para os ensaios de

fermentação foi feita por turbidimetria em espectrofotômetro BECKMAN OU 6408. A

concentração celular (g/L) foi calculada através de uma curva padrão que correlaciona

a absorbância a 600 nm com a massa das células secas obtidas num cultivo de

24 horas em meio semi-sintético.

3.4.4. Determinação de pH

Os valores de pH dos hidrolisados original, concentrados e tratados, bem como

para o acompanhamento das fermentações foram determinados em pHmetro

MICRONAL modelo 37 4. ..,

29

Matenal e Métoaos

3.4.5. Determinação das concentrações de açúcares, ácido acético e xilitol

Determinou-se as concentrações de açúcares, ácido acético e xilitol por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em equipamento Shimadzu-LC-1 OAD.

empregando-se as seguintes condições: coluna Biorad Aminex HPX-87H

(300 x 7,8 mm), temperatura da coluna de 45ºC, fluxo de eluente igual a 0.6 ml/min,

volume da amostra injetada 20 µL. As amostras foram devidamente diluídas e filtradas

em filtro Sepack C18 (Millipore) e o eluente, antes do uso, foi filtrado à vácuo em

membrana HAWP 0,45 um (Millipore) e em seguida foi degaseificado em um banho

ultra-som (Microsonic SX-50) por 15 minutos.

3.4.6. Determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural

Determinou-se as concentrações de furfural e hidroximetilfurfural nos hidrolisados

por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em equipamento Shimadzu-LC-

1 OAD, sob as seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP 18 (200mm);

temperatura da coluna: 25° C, detetor de ultravioleta SPD-10A UV-VIS; eluente:

solução de acetronitrila/água (1 :8) com 1 % de ácido acético; volume de amostra

injetada 20~tl. As amostras foram devidamente diluídas e filtradas a vácuo em

membrana HAWP 0,45 um (Millipore). O eluente foi filtrado a vácuo em membrana

GVWP 0,22 um (Millipore) e, em seguida, degaseificado em banho ultra-som

(Microsonic SX-50) por 15 minutos.

3.4.7. Determinação da concentração dos compostos aromáticos na forma de

lignina solúvel

Esta determinação foi realizada em espectrofotômetro Beckman OU 6408 a

280 nm, baseado na metodologia descrita por ROCHA (2000), porém com algumas

modificações.

Foi preparada uma curva padrão de vanilina, como modelo de uma fração de baixa

massa molar da macromolécula de lignina, a partir de uma solução mãe de

concentração 1,0 g/l. Desta solução mãe, foram pipetados 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 e

10,0 ml, completando-se o volume para 1000 ml em balões volumétricos com água 30

Matenal e Métooos

destilada o pH ajustado previamente para 5,0 com HCI 1,0 N. Finalmente determinou-

se a absorbância das soluções padrão a 280 nm.

Para a determinação da concentração dos compostos fenólicos nos hidrolisados

original, concentrados e tratados, tomou-se 1,0 ml da amostra a ser analisada e diluiu-

se (1: 1000) com água destilada (pH 5,0). A absorbância da amostra foi então

determinada a 280 nm.

O teor dos compostos aromáticos na forma de lignina solúvel foi calculado de

acordo com a seguinte equação:

CcF = (AH280nm - 1,8x10-2)/61,8

Sendo,

CcF - Teor de compostos aromáticos referidos como vanilina (g/L) *

AH280nm = AHT280nm - A pd280nm

AHr2aonm - Absorbância de todos os compostos em 280 nm

C1 e C2 - Concentração de furfural e hidroximetilfurfural determinadas por

CLAE.

r.1 e i:2 - coeficientes de extinção do furfural e do hidroximetilfurfural

(156 L/g cm e 89,55 Ug cm), respectivamente. * Absorbância, a 280 nm, dos produtos de decomposição dos açúcares (furfural e

hidroximetilfurfural), cujas concentrações, C1 e C2, foram determinadas

previamente por CLAE, e E1 e E:2 por espectroscopia UV a 280 nm.

31

Matenal e Métodos

3.5. METODOLOGIA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS

3.5.1. Determinação das porcentagens de redução das concentrações dos

inibidores e dos açúcares

As porcentagens de remoção dos compostos inibidores foram calculadas pela

relação entre as concentrações dos compostos tóxicos antes e depois dos tratamentos,

de acordo com a seguinte equação:

%Rc, ={ (C,sr - C,r) I C,sr} 100

sendo,

%Rc1 - porcentagem de redução da concentração do composto inibidor i

C,sr - concentração do composto inibidor i antes do tratamento

CiT - concentração do composto inibidor i após o tratamento

i - composto inibidor: furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético, compostos derivados

da degradação da lignina e dos extrativos da madeira.

De forma similar aos compostos inibidores, as porcentagens de redução do teor de

açúcares (xilose, glicose e arabinose) foram calculadas pela relação entre as

concentrações desses açúcares antes e após os tratamentos de detoxificação, de

acordo com a seguinte equação:

%Rc, = f c,sr - C,r) I C,sT} .100

sendo,

%Rca - porcentagem de redução da concentração de açúcar •

CasT - teor de açúcares antes do tratamento

CaT - teor de açúcares após o tratamento

32

Marenat e .'Aétodos

3.5.2. Determinação dos parâmetros fermentativos

Os parâmetros fermentativos fator de rendimento. produtividade e eficiência de

conversão foram determinados como segue

• Fator de rendimento

Yp1s = {massa de xilitol produzido I massa de xilose consumida} (g/g)

• Produtividade volumétrica

Op = {concentração de xilitol produzido) I tempo} (g/L.h)

• Eficiência

ri= {(YP/S I 0.917*). 100} (%)

"rendimento teórico em g xilitol /g xilose, segundo BARBOSA et ai. (1988)

3.5.3. Análise estatística e modelagem matemática

A fim de rnmrrruzar o número de experimentos e modular o tratamento do

hidrolisado visando maior produção de xilitol, inicialmente foi realizado um

planejamento fatorial fracionário 2$-2 sem repetição (BOX et ai.. 1978;

BARROS NETO et ai., 1995). Os fatores estudados e seus respectivos níveis,

avaliados no tratamento do hidrolisado, estão apresentados na Tabela 1111, sendo que

os sinais (-1) e ( +1) representam os níveis inferior e superior dos fatores,

respectivamente.

A codificação dos níveis dos fatores foi estabelecida conforme a seguinte equação:

Xi = ( X - í..X/2 ) / 8. X/2

Sendo,

Xi - valor codificado do fator X - valor real do fator

f.X/2 - valor médio entre os níveis superior e inferior dos fatores

ó X/2 - valor médio da diferença entre os níveis superior e inferior dos fatores

33

Matenal e Métoaos

Para se avaliar o tratamento do hidrolisado sem prévia alteração do seu pH inicial

foi necessário fixar o nível inferior deste parâmetro (-1) em 1.5. sendo que este valor

representa a média aritmética dos valores de pH 1,8: 1,5 e 1,2. correspondentes aos

hidrolisados original e concentrados pelos fatores 2,5 e 4,5, respectivamente.

TABELA 111.1 Fatores e níveis estudados no planejamento fatorial fracionário 25-2.

Níveis

Fatores (-1) ( + 1)

Fator de Concentração [FC] pH (pH] Carvão Ativado [CA] Temperatura de adsorção [T] Tempo de adsorção [t]

2,5X 1,5 1%

30ºC 30 min.

4,5X 7,0 5%

60ºC 60 min.

Tabela 111.2 mostra a matriz do planejamento 25-2 composta pelos valores originais

e codificados dos fatores avaliados nesta primeira etapa.

TABELA 111.2 Matriz de planejamento composta pelos valores dos fatores originais e codificados no projeto fatorial fracionário 25-2.

Fatores Originais Fatores Codificados -------

Ensaio FC pH CA(%) T (ºC) t (min) FC pH CA T t

01 60,0 1,5 1,0 30 60 -1 -1 -1 -1 +1 02 109,0 1,5 1,0 60 30 +1 -1 -1 +1 -1 03 60,0 7,0 1,0 60 30 -1 +1 -1 +1 -1 04 109,0 7,0 1,0 30 60 +1 +1 -1 -1 +1 05 60,0 1,5 5,0 60 60 -1 -1 +1 +1 +1 06 109,0 1,5 5,0 30 30 ., +1 -1 +1 -1 -1 07 60,0 7,0 5,0 30 30 -1 +1 +1 -1 -1 08 109,0 7,0 5,0 60 60 +1 +1 +1 +1 +1

34

Matenal e Métodos

Os resultados foram analisados estatisticamente de acordo com o planejamento

preestabelecido, para verificar os efeitos dos fatores em estudo sobre a bioconversão

de xilose em xilitol. A análise dos dados foi efetuada pelo programa STATGRAPHICS.

versão 4.1, considerando os níveis de significância de 5% e 10%. Os resultados foram

expressos em tabelas de estimativas de efeitos, gráficos de probabilidade acumulativa.

erros-padrão. teste t de "Student", assim como tabelas de análise de variância com

colunas de causa de variação (CV). graus de liberdade (GL). soma de quadrados (SQ),

quadrado médio (QM) e nível de significância (p).

Uma vez efetuada a análise estatística dos resultados obtidos segundo o

planejamento 25-2, os fatores que não apresentaram efeitos significativos sobre as

respostas estudadas, foram retirados da matriz, enquanto que os fatores que exibiram

efeito significativo foram utilizados para compor um projeto fatorial fracionário 24-1,

incluindo três repetições referentes a um ensaio realizado nas condições do ponto

central do planejamento. Os fatores e níveis utilizados nesta nova etapa estão

apresentados na Tabela 111.3.

TABELA 111.3 Fatores e níveis estudados no planejamento fatorial fracionário 241 com três repetições no ponto central.

Níveis

Fatores (-1) (O) ( +1)

Fator de Concentração [FC] 2,5X 3,5X 4,5X pH [pH] 1,5 4,2 7,0 Carvão ativado [CA] 1% 3% 5% Tempo de adsorção [t] 30 min. 45 min. 60 min.

A análise estatística dos resultados obtidos no projeto fatorial fracionário 241 com

repetições no ponto central serviu para verificar a existência de curvatura nos modelos

representativos das respostas de interesse, sendo proposta como última etapa, a realização de oito ensaios adicionais na forma de face cêntrada. A matriz do novo

planejamento incluindo os ensaios iniciais, as três repetições no ponto central e os oito

ensaios da face centrada estão apresentados na Tabela 111.4.

35

Matenal e Métoaos

TABELA 1114 Matriz de planejamento fatorial fracionário 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central.

t:nsaio FC f2H CA 1 -1 -1 -1 +1 2 +1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 4 +1 +1 -1 +1 5 -1 -1 +1 +1 6 +1 -1 +1 -1 7 -1 +1 +1 -1 8 +1 +1 +1 +1 9 -1 o o o 10 +1 o o o 11 o -1 o o 12 o +1 o o 13 o o -1 o 14 o o +1 o 15 o o o -1 16 o o o +1 17 o o o o 18 o o o o 19 o o o o

.. - -

36

Resultados e Discussão

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO

Na primeira etapa do presente trabalho foi obtido o hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto conforme metodologia descrita no item 3.1.2. O hidrolisado ácido foi

concentrado a vácuo 2,5 e 4,5 vezes sua concentração inicial, a fim de avaliar a

influência da concentração inicial de xilose na bioconversão de xilose a xilitol por

C. guilliermondii. As características do hidrolisado original, obtido da fração

hemicelulósica de eucalipto, bem como dos hidrolisados concentrados pelos fatores 2,5

e 4,5 estão apresentados na Tabela IV 1.

TABELA IV.1 Composição parcial, em g/L, do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido por hidrólise ácida, em sua forma original e após ser submetido ao processo de concentração.

pH

Hidrolisado

original FC= 2,5 FC= 4,5

1,80 1,50 1,20

Xilose 24,32 64,2 108,4 Glicose 1,53 4,03 6,84 Arabinose 0,53 1,39 2,36

Ac. acético 5,90 8,51 9,31 Furfural 0,54 0,05 0,02 HMF* 0,10 0,24 0,41 CDL ** 1,41 2,75 4,78

Açúcares

Inibidores

*5-hidroximetilfurfural. **Compostos aromáticos derivados da degradação da lignina solúvel em ácido e dos extrativos ~

da madeira.

37

Resultados e Dtscusseo

Observa-se na Tabela IV.1 que a xilose (24,32 g/L) é o açúcar predominante no

hidrolisado. A glicose (1,53 g/L) e a arabinose (0,53 g/L), estão presentes em baixas

concentrações conforme já constatado nos hidrolisados hemicelulósicos de eucalipto

(ALMEIDA e SILVA, 1996; PARAJÓ et ai .. 1996a, CANETTIERI. 1998), de bagaço de

cana-de-açúcar (FELIPE et ai., 1993: ALVES, 1997) e de palha de arroz (ROBERTO

et ai., 1994).

Tem sido constatado que a predominância de xilose em relação a outros açúcares

comumente encontrados nos hidrolisados hemicelulósicos, em particular a glicose, é

uma característica desejável para a bioconversão de xilose a xilitol, uma vez que a

presença de glicose inibe o metabolismo de xilose pelas leveduras (LEE et et., 1996,

PREZIOSI-BELLOY, 1997; GIRIO et ai., 2000), sendo esta inibição dependente da

concentração dessa hexase no meio de fermentação (SUGAI. DELGENES, 1995;

FELIPE, 1994).

Pela análise da Tabela IV.1 verifica-se que, além dos açúcares, o hidrolisado

apresenta um grupo de compostos que têm sido apontados como inibidores potenciais

de metabolismo de leveduras. Os compostos tóxicos caracterizados neste trabalho

foram o furfural, o hidroximetilfurfural, o ácido acético, assim como os compostos

aromáticos de baixa massa molar oriundos da degradação da lignina e dos extrativos

da madeira.

Os teores de ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural encontrados no hidrolisado

(Tabela IV.1) são similares aos valores obtidos por ALMEIDA e SILVA (1996) ao

submeter cavacos de eucalipto da mesma espécie a condições hidrolíticas

semelhantes às utilizadas neste estudo.

Tem sido observado que a concentração desses compostos nos hidrolisados

hemicelulósicos varia em função do tipo de material lignocelulósico e das condições

hidrolíticas empregadas para a extração da fração hemicelulósica (FRAZER.

MacCASKEY, 1989, SILVA et ai., 1998; LARSON et ai., 1999). Desta forma têm sido

relatada a presença de ácido acético nos hidrolisados de diferentes tipos de madeiras

em concentrações na ordem de 12,0 g/L (TRAN, CHAMBERS, 1985) e 10,0 gil

(FERRARI et ai., 1992) para os hidrolisados de carvalho vermelho até 24,3 g/L no

hidrolisado de eucalipto (FELIPE et ai., 1996a).

38

Resultados e Discusséo

Nota-se ainda na Tabela IV. 1 que o hidrolisado obtido contém um grupo de

compostos aromáticos de baixa massa molar. Conforme relatado por CLARK, MACKIE

(1984), a hidrólise da fração hemicelulósica da madeira promove a solubilização

simultânea da lignina, o que resulta na formação destes compostos. Segundo esses

autores, as madeiras duras, como o eucalipto, caracterizam-se por apresentar uma

lignina de baixa massa molar, pouco reativa, o que impede a ocorrência de reações de

condensação dos fragmentos de lignina solúveis em meios ácido. favorecendo-se.

deste modo a solubilização de compostos monoméricos. O teor desses compostos

encontrado no hidrolisado, referidos como vanilina, foi similar ao valor encontrado por

CANETIIERI (1998) (1,25 g/L) no hidrolisado de eucalipto obtido pelo mesmo

procedimento de hidrólise empregado no presente trabalhá.

Verifica-se também na Tabela IV. 1 que as condições hidrolíticas utilizadas

provocaram a degradação parcial das pentases e hexases. gerando furfural e

hidroximetilfurfural em baixas concentrações. O teor de furfural obtido nas condições do

presente estudo é similar ao valor obtido por PARAJÓ et ai. (1996a). não sendo

detectada a presença de hidroximetilfurfural por esses autores no hidrolisado de

Eucalyptus globulus.

Podemos constatar (Tabela IV.1) que ao se concentrar o hidrolisado, ocorreu um

aumento proporcional da concentração dos açúcares em função do fator de

concentração (razão de volume inicial pelo volume final do hidrolisado ). mantendo-se

constante a relação xilose/glicose (15,9) tanto no hidrolisado original quanto nos

hidrolisados concentrados. Tem sido constatado um aumento dessa relação durante o

processo de concentração a vácuo o qual, segundo FENGUEL, WEGENEGER ( 1989).

deve-se à degradação parcial da xilose a furfural durante este processo, o que no

presente trabalho não ocorreu.

Semelhante aos açúcares. o hidroximetilfurfural teve sua concentração aumentada

proporcionalmente aos fatores de concentração. ACOSTA (1999), constatou um

comportamento similar ao concentrar hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar três

vezes seu volume inicial.

Quanto ao ácido acético, verifica-se na Tabela IV.1 um aumento na concentração

deste composto, porém de forma não proporcional aos fatores de concentração

utilizados. Conforme estudos realizados por RODRIGUES (1999) o baixo pH do

hidrolisado (aproximadamente 1,0) favorece a volatilização parcial deste ácido que,

39

Pesuneoos e Dtscussêo

nestas condições, encontra-se sob a forma não dissociada. O aumento não

proporcional na concentração do ácido também foi observado por PARAJÓ et ai.

(1997b) durante a concentração de hidrolisado hemicelulósico de Eucaliptus globulus.

Nota-se na Tabela IV.1 que o processo de concentração a vácuo causou uma

redução substancial da concentração de furfural em 90 e 96% nos hidrolisados

concentrados 2,5 e 4,5 vezes, respectivamente, em relação a sua concentração no

hidrolisado original. Esse comportamento pode ser atribuído às características físico-

químicas deste composto que, em condições de pressão reduzida apresenta ponto de

ebulição de 54-55ºC (PERRY, 1997) o que possibilita a sua remoção quase total nas

condições de temperatura (±70ºC) e pressão utilizadas neste trabalho. Uma redução

considerável do teor deste composto foi também observada por CANETIIERI (1998)

após concentrar o hidrolisado de eucalipto a 3 e 4 vezes sua concentração inicial de

xilose.

Os compostos aromáticos de baixa massa molar (Tabela IV.1 ), não aumentaram

sua concentração proporcionalmente aos fatores de concentração avaliados. O

aumento foi de 72% para o hidrolisado concentrado 2,5 vezes e de 22 % para o

hidrolisado concentrado 4,5 vezes. Este comportamento pode ser explicado se levar-

mos em consideração que, além dos compostos oriundos da degradação da lignina, o

hidrolisado original contém uma variedade de compostos aromáticos derivados da

degradação dos extrativos da madeira, sendo que alguns deles são voláteis e

.hidrosolúveis(PERRY, 1997), pelo que, nas condições operacionais do processo de

concentração a vácuo podem ser arrastados pelo vapor de água.

Verifica-se ainda na Tabela IV.1 que o processo de concentração a vácuo provocou

um decréscimo do pH original de 1,8 para 1,5 no hidrolisado concentrado no nível

mínimo de fator de concentração (FC= 2,5) e para 1,2 no hidrolisado concentrado no

nível máximo do fator de concentração (FC= 4,5). Essa redução provavelmente está

relacionada com o aumento da concentração de íons H+ provenientes do H2S04 utilizado na hidrólise ácida dos cavacos de eucalipto (CÔRREA et ai., 1995) e também

de ácido acético presente no hidrolisado.

40

Resuitados e Ciscussêo

4.2 TRATAMENTO DOS HIDROLISADOS CONCENTRADOS

Os hidrolisados concentrados foram submetidos a diferentes combinações de

tratamentos com vista a avaliar a influência dos fatores pH do hidrolisado e

concentração de carvão ativo, bem como os parâmetros operacionais temperatura e

tempo de adsorção sobre a remoção dos compostos inibidores da atividade

fermentativa de C. guilliermondii.

Os ensaios foram efetuados em conformidade com o delineamento experimental

proposto no item 3.5.3. A composição parcial dos hidrolisados e as porcentagens de

redução das concentrações dos açúcares e inibidores após os· diferentes tratamentos.

estão apresentadas nas Tabelas IV.2 e IV.3, respectivamente.

TABELA IV.2 Matriz de planejamento para o projeto fatorial zi-1 face centrada com triplicata no ponto central e composição parcial em g/L dos açúcares e inibidores presentes nos hidrolisados tratados.

~ Ensaios X, X2 X3 x4 Glicose Ác. Furfural *HMF **CDL " Xs Xilose

Acético

01 -1 -1 .. -1 -1 +1 3,87 60,02 8,32 0,011 0,106 1,62 02 +1 -1 -1 +1 -1 7,10 101,00 9,00 0,007 0,211 3,09 03 -1 +1 -1 +1 -1 3,71 56,25 8,24 0,008 0.100 1, 18 04 +1 +1 -1 -1 +1 6.87 94,45 8,62 0,006 0,186 2,85 05 -1 -1 +1 +1 +1 3,46 56,78 7,41 0,001 º·ººº 0,54 06 +1 -1 +1 -1 -1 6.03 93,05 7, 15 0,001 º·ººº 1.74 07 -1 +1 +1 -1 -1 2,76 54,12 8,00 0,000 º·ººº 0,20 08 +1 +1 +1 +1 +1 6,26 99,35 8,64 0,000 º·ººº 1, 18 09 -1 o o -1 o 3,51 62,15 7,89 0,004 0.013 1.1 O 10 +1 o o -1 o 5,93 105,85 8, 10 0,006 0.050 2.63 11 o -1 o -1 o 5.80 83.50 8,84 0,015 0,063 1.51 12 o +1 o -1 o 4,92 81,80 9,16 0,005 0,025 1,23 13 o o -1 -1 o 5.30 80,35 8,86 0,024 0, 191 2,53 14 o o +1 -1 o 5,23 77,00 7,88 0,004 0,015 0,89 15 o o o -1 -1 5,26 80,80 8,32 0,007 0,057 1,70 16 o o o -1 +1 5.13 78,45 8,10 0,013 0,049 1,51 17 o o o -1 o 4,82 75,30 7,62, 0,005 0,031 1,46 18 o o o -1 o 4,75 74,30 7,30 0,002 0,034 1,40 19 o o o -1 o 4,70 73,10 7,44 0,004 0,033 1,40

*5-hidroximetilfurfural. **Compostos aromáticos derivados da degradação da lignina solúvel em ácido e dos extrativos

da madeira.

41

Resutteaos e Dsscusséo

TABELA IV.3 Redução da concentração de açúcares e inibidores do hidrolisado de eucalipto submetido às diferentes combinações de tratamentos ( em porcentagens).

Ensaios Glicose Xilose Ác. acético Furfural *HMF **CDL

01 3,97 6,51 2,23 77,08 55,83 36.47 02 º·ºº 6,83 3,33 66,67 49,76 35.36 03 7,94 12,40 3, 17 83,33 58,33 53.73 04 0,00 13,93 7,41 71,43 55,71 40,38 05 14, 1 11,56 12,90 97,92 100,00 78.82 06 11,84 14, 16 23,20 95,24 100,00 63.60 07 31,50 15,70 5,99 100,00 100,00 92.16 08 8,48 8,35 7,20 100,00 100,00 75,31 09 12,88 3, 16 12,88 86,67 95,61 67,45 10 13,35 2,35 13,35 80,00 83, 11 45,00 11 0,00 0,42 2,75 50,00 78,72 56,10 12 9,25 2,44 0,00 83,33 91,55 64,24 13 2,29 4, 17 2,56 20,00 35,47 26.45 14 3,40 8, 17 13,34 86,67 94,83 74, 13 15 2,99 3,64 8,53 76,67 80,74 50,58 16 5,22 6,44 11,28 56,67 83,45 56,10 17 1, 19 5, 16 11,00 65,82 89,53 50, 10 18 2,54 6,42 17,90 66,67 88,51 52.20 19 3,55 7,93 13, 10 66,67 88,85 52,20

• 5-hidroximetilf urfural. ··compostos aromáticos derivados da degradação da lignina solúvel em ácido e dos extrativos

da madeira.

A análise preliminar dos resultados (Tabelas IV.2 e IV.3) mostra uma tendência no

aumento das perdas de glicose com o aumento da porcentagem de carvão ativo. sendo

que esta tendência é mais marcada no hidrolisado concentrado no nível mínimo do

fator de concentração (FC = 2,5) com previa alteração do seu pH inicial. Desta forma

observa-se que nos ensaios 02 e 04, referentes ao tratamento dos hidrolisados

concentrados no nível máximo (FC= 4,5), assim como no ensaio 11, correspondendo

ao tratamento do hidrolisado concentrado no nível intermediário do fator de

concentração (FC = 3,5), o teor de glicose não foi alterado pela adição de 1 % e 3% de

carvão ativo, respectivamente, enquanto que as maiores perdas desta hexase, 14, 1 e

31,5% (ensaios 05 e 07) ocorreram quando o hidrolisado concentrado no nível mínimo

do fator de concentração (FC= 2,5) foi tratado pela adsorção com a máxima

concentração de carvão ativo (5%). Comparando-se estes ensaios evidencia-se um

aumento considerável nas perdas de glicose do ensaio 05 para o ensaio 07, sendo que

neste último ensaio o pH do hidrolisado foi ajustado para 7,0 antes do processo de

42

Resuitados e Crscussào

adsorçáo. Um comportamento semelhante é observado nos ensaios 11 e 12 em que os

níveis avaliados para todos os fatores, exceto o pH do hidrolisado. foram mantidos

constantes, verificando-se que o aumento do pH inicial do hidrolísado de 1.5 para 7.0

promoveu a redução na concentração de glicose.

De acordo com as Tabelas IV.2 e IV.3, verifica-se que os tratamentos avaliados

influenciaram sobre a redução do teor de xilose A menor perda (0.42%) foi observada

quando o hidrolisado concentrado no nível intermediário do fator de concentração

(FC= 3,5), foi tratado sem previa alteração do seu pH inicial, com 3% de carvão ativo a

30ºC por 45 minutos (ensaio 11 ). A maior perda desta pentase (15,7%) foi obtida no

ensaio 07, em que o tratamento do hidrolisado concentrado no nível mínimo do fator de

concentração (FC = 2,5) consistiu da elevação do pH inictal (1,5) para 7,0, seguido da

adsorção com o nível máximo de concentração de carvão ativo (5%) por 30 minutos a

30ºC.

Embora há evidencias da influência da concentração de carvão ativo na redução

das concentrações dos açúcares presentes nos hidrolisados hernicelulósicos. na faixa

de concentrações utilizadas no presente trabalho, não podemos afirmar que existiu um

efeito único deste fator sobre as perdas de xilose. Ao comparar as porcentagens de

redução obtidas nos ensaios 02 e 04, em que os níveis do fator de concentração e a

porcentagem de carvão ativo foram iguais, FC= 4,5 e 1 %, nota-se um aumento de

89,3% na redução da concentração de xilose do ensaio 02 para o ensaio 04.

Observa-se ainda que nos ensaios 09-12, 15 e 16, em que a concentração de

carvão ativo foi de 3% em todos os tratamentos, ocorreram variações da porcentagem

de perda dessa pentase, o que sugere um efeito combinado de todos os fatores

avaliados neste estudo sobre a remoção de xilose. ALVES (1997). também constatou

que a redução no teor de xilose durante o tratamento do hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana foi independente da utilização ou não de 3% de carvão ativo. Segundo

PARAJÓ et ai. (1996a) a máxima perda desta pentase, em torno de 2%, foi obtida ao

tratar o hidrolisado hemicelulósico de eucalipto com a máxima porcentagem de carvão

ativo avaliada nesse estudo (5%).

Quanto ao furfural os resultados apresentados na Tabêla IV.2 mostram que todos

as combinações de tratamentos avaliadas reduziram a concentração deste composto a

valores menores que 0,03 g/L, apontados como não inibitórios do metabolismo da

xilose por C. guilliermondii (OJAMO et ai., 1988; ROBERTO et ai., 1991 ).

43

Pesutteaos e Discussêo

A concentração de hidroximetilfurfural (Tabela IV.3), foi também reduzida após

todas as combinações de tratamentos avaliadas. confirmando-se a eficiência do carvão

ativo na remoção total deste composto quando adicionado no nível máximo de

concentração (5%) nos ensaios 05-08. MARTON et ai. (2000), também evidenciaram

que o uso de 2.4% de carvão ativo foi suficiente para remover quase totalmente o

furfural (96%) e o hidroximetilfurfural (98%) do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana de açúcar. Nas fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

DOMINGUES et ai. (1996), verificou que o tratamento com carvão ativo reduz os teores

dos referidos compostos a níveis que não apresentam efeito inibidor sobre a

bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii.

No caso do ácido acético, observa-se na Tabela IV.3, que, em geral, a remoção

deste composto foi facilitada nos ensaios 05, 06, 09, 10, 14, 16, 17,18 e 19, em que os

hidrolisados foram tratados em pH ácido (1,5 e 4,4) empregando-se 3 e 5% de carvão

ativo. Verifica-se que no ensaio 12, em que o hidrolisado concentrado no nível

intermediário do fator de concentração (FC = 3,5), tratou-se pela elevação do seu pH

inicial para 7,0 e posterior adsorção em 3% de carvão ativo, não houve redução na

concentração deste ácido. Entretanto, a máxima redução na concentração deste

inibidor (23,2%) foi obtida no ensaio 06 em que o tratamento do hidrolisado

concentrado no nível máximo do fator de concentração (FC = 4,5) consistiu da adição

da máxima porcentagem de carvão ativo avaliada (5%) sem previa alteração do seu pH

inicial. Estes resultados evidenciam o efeito combinado do pH e da concentração de

carvão ativo sobre a remoção de ácido acético, sendo esta remoção favorecida quando

a operação de adsorção se efetua em pH ácido e utilizando maior porcentagem de

carvão ativo. No entanto, os valores de remoção obtidos no presente trabalho podem

ser considerados baixos, quando comparados com as porcentagens de remoção

alcançadas pelo tratamento dos hidrolisados hemicelúsicos com outros métodos tais

como troca iônica (DOMINGUES, 1996) e alteração de pH usando ácidos e álcalis

(ROBERTO et ai., 1991 ). Conforme relatado por PARAJÓ et ai. (1996a) a concentração

de ácido acético não variou significativamente após o tratamento do hidrolisado de

eucalipto com carvão ativo. Esses autores também evidenêiaram que quanto maior a

concentração de carvão utilizada, maior a remoção desse ácido.

Por outro lado, os tratamentos avaliados influenciaram na remoção dos compostos

aromáticos de baixa massa molar oriundos da degradação da lignina e dos extrativos 44

Resuueocs e Dtscussêo

da madeira. As menores reduções (36,5: 35,4 e 26,5%) foram obtidas nos ensaios 01.

02 e 13, respectivamente, em que os hidrolisados foram tratados em pH ácido com a

menor porcentagem de carvão ativo (1 %). O máximo valor de remoção (92.2%) foi

obtido no tratamento do hidrolisado concentrado no nível mínimo do fator de

concentração (FC= 2,5) pela elevação do pH para 7,0 seguido de adsorção com 5%

de carvão ativo (ensaio 07). Estas observações sugerem que remoção destes

compostos é promovida quando a operação de adsorção se efetua em pH neutro

usando a máxima concentração de carvão ativo (5%).

Segundo PARAJÓ et ai. (1996a), o objetivo principal do tratamento dos

hidrolisados hemicelulósicos pela adsorção em carvão ativo _é a remoção de uma

ampla gama de compostos de natureza fenólica provenientes da lignina solúvel em

meio ácido. Esses autores relataram uma maior redução na concentração dos referidos

compostos (±90%), presentes no hidrolisado de eucalipto neutralizado com CaC03,

utilizando 5% de carvão ativo. MARTON et ai. (2000), também obtiveram uma remoção

quase completa de fénoís (97%), ao tratarem o hidrolisado de bagaço de cana com

CaO comercial e H3PÜ4, seguido da adição de apenas 2,4% de carvão ativo.

4.3 FERMENTAÇÕES DOS HIDROLISADOS SUBMETIDOS A DIFERENTES COMBINAÇÕES DE TRATAMENTOS.

A fim de se avaliar a influência dos diferentes combinações de tratamentos sobre a

bioconversão de xilose em xilitol foram efetuados· ensaios de fermentação em meios

preparados com os diferentes hidrolisados, tratados de acordo as combinações de

tratamento propostas no item 3.5.3.

De acordo com estudos realizados por FELIPE et ai. (1996b) e CANETIIERI et ai.

(1997), para efetuar os ensaios de fermentação foi selecionada uma concentração

inicial de células de 3,0 gil (108 células/ml).

Na Tabela IV.4 estão apresentados os dados referentes ao consumo de xilose,

ácido acético, concentração de células e produção de xilitol após a fermentação por

C. guilliermondii dos hidrolisados tratados.

45

Resultados e Discusséo

TABELA IVA Consumo de xilose. ácido acético, produção de biomassa e xilitol no cultivo de C. guillíermondíi nos hidrolisados de eucalipto submetidos às diferentes combinações de tratamento.

Ensaio Consumo Consumo Células (g/L) Xilitol (g/L) Xilose {%l Ác. Acético {%l

01 100.0 5, 1 9,5 18.3 02 66,2 15,2 7,3 27,5 03 100,0 27,4 7,7 18.5 04 68,2 8,5 6.8 22.5 05 100,0 9,5 5.5 11,4 06 100,0 33,3 8,6 41,3 07 100,0 9,7 5,5 12,8 08 71,0 1,3 6.5 17,7 09 100.0 45,9 10.2 24,9 10 83,4 41,3 · 11,0 42,9 11 97,7 13,3 7,4 25,7 12 100,0 12,2 6,4 26,9 13 93,3 27,2 8,2 24,0 14 100,0 22, 1 7,6 24,2 15 97,7 17,6 8,2 29,6 16 97,4 20,3 7,6 24,4 17 98,5, 15,7 7,6 22,9 18 99,1 13,0 7,4 24,2 19 98.7 13,4 7, 1 23.0 ..

- -

A glicose, presente nos hidrolisados foi totalmente consumida nas primeiras 48

horas da fermentação (dados não apresentados). Comportamento semelhante no

consumo desta hexase por C. guílliermondii foi constatado nas fermentações dos

hidrolisados de bagaço da cana (FELIPE et et., 1993; ALVES et ai., 1997, ACOSTA et

ai., 2000), de palha de arroz (ROBERTO et el., 1994) e de eucalipto (FELIPE et et.,

1996a).

Apesar de que alguns autores relatarem que a presença de glicose no meio de

fermentação causa inibição da bioconversão de xilose a xilitol (JEFFRIES et ai., 1983;

BICHO et ai., 1988, WAL THER et ai., 2001 ), neste trabalho tal fato não foi constatado.

Segundo FELIPE et ai. (1993), a presença dessa hexase em baixas concentrações no ~

meio, em torno de 10% da concentração inicial de xilose, não interfere na bioconversão

de xilose em xilitol pela levedura C. guilliermondii.

Com relação ao consumo de xilose, os resultados apresentados na Tabela IV.4

mostram que esta pentase foi totalmente assimilada nas fermentações efetuadas com 46


o hidrolisado concentrado, nível inferior do fator de concentração (FC = 2,5) Nas

fermentações conduzidas com o hidrolisado concentrado 3,5 vezes seu volume inicial

(FC = 3,5) o cultivo praticamente assimilou toda a xilose presente inicialmente no meio

com porcentagens que variaram de 97,4% (ensaio 16) a 100% (ensaios 12 e 15)

Observa-se ainda que nos ensaios em que as fermentações foram efetuadas com o

hidrolisado concentrado no nível máximo do fator de concentração (FC = 4.5) o

consumo manteve-se na faixa de 66,2-83,4%.

Estes resultados sugerem que as combinações de tratamento avaliadas no

presente trabalho promoveram o consumo de xilose pela levedura, quando

comparados com os ensaios em que não foi aplicado tratamento algum aos

hidrolisados concentrados (dados não apresentados). Nos ensaios em que foram

utilizados os hidrolisados submetidos às diferentes combinações de tratamento o

consumo da xilose dependeu do seu teor inicial no hidrolisado e do tempo de

fermentação.

Conforme relatado por DOMINGUEZ et ai. (1996), o consumo de xilose por

C. guilliermondii foi maior (±96%), quando a fermentação foi conduzida com o

hidrolisado de bagaço de cana de açúcar tratado pela adição de 5% de carvão ativo

seguido de neutralização com CaO, em comparação com os consumos obtidos com o

hidrolisado tratado pelas técnicas de neutralização ou resinas de troca iônica.

O ácido acético (Tabela IV.4), presente inicialmente no meio em concentrações

apontadas como inibitórias para o metabolismo das leveduras. também foi assimilado

por C. guilliermondii, observando-se os menores consumos (5, 1 e 1,3%) para os

ensaios 01 e 08, respectivamente. Comparando-se ambos os ensaios, verifica-se que o

único fator que permaneceu invariável foi o tempo de adsorção, sendo que o mesmo foi

mantido no seu nível superior, correspondendo a 60 minutos. Os maiores consumos

(45,9 e 41,3%) ocorreram nos ensaios 09 e 10, respectivamente. Nesses casos o

tratamento dos hidrolisados foi efetuado sob as mesmas condições, ou seja, elevação

do pH inicial para 4,4 seguido de adsorção em 3% de carvão ativo, a 30ºC por 45

minutos.

A assimilação deste ácido ocorreu simultaneamente ao consumo de xilose (dados

não apresentados), semelhante ao observado por FELIPE et ai. (1995), FELIPE et ai.

(1996a), FELIPE et ai. (1996b) em fermentações conduzidas em meio semi-sintético,

47

Resultados e 01scuss<10

hidrolisado de bagaço de cana e de eucalipto. respectivamente. FEL! PE et ai. ( 1995),

sugeriram que a assimilação desse ácido por C guilliermondii. poderia contribuir para

destoxificação dos hidrolisados. visto que esse composto tem sido relatado como

potente inibidor da atividade fermentativa (PAMPULHA, LOUREIRO-DIAS. 1990.

HERRERO et al., 1985: NODA et ai.. 1992; FERRARI et ai., 1992)

O favorecimento do consumo de ácido pelo esgotamento de xilose tem sido

relatado por vários autores, porém nas condições estudadas neste trabalho, é difícil

estabelecer uma relação entre todos os fatores que possam estar interferindo no

consumo deste composto devido à dinâmica do processo fermentativo.

Alguns trabalhos relatam que a presença de ácido .acético no meio em

concentrações acima de 5,0 g/L exercem um potente efeito inibidor no crescimento

celular em leveduras (FELIPE et et, 1997b, PARAJÓ et et., 1997b), porém no presente

trabalho tal efeito não foi observado. Podemos constatar na Tabela IV4 que os maiores

valores de concentração celular, obtidos nos ensaios 09 (10,2 g/L) e 10 (11,0 g/L),

coincidiram com os maiores consumos deste ácido pela levedura. Em ambos os

ensaios o hidrolisado concentrado no nível mínimo do fator de concentração (FC = 2,5)

foi tratado pela adição da mínima concentração de carvão ativo ( 1 % ). Verifica-se

também que as menores concentrações de biomassa (5,5; 5,5) foram obtidas nos

ensaios 05 e 07, respectivamente, sendo que nesses casos o cultivo também foi

conduzido utilizando-se o hidrolisado concentrado no nível mínimo do fator de

concentração (FC = 2.5), porém para efetuar o tratamento foi adicionado carvão ativo

no nível máximo de concentração (5%).

Tem sido demonstrado que além da concentração, o potencial inibitório deste ácido

é dependente das condições experimentais empregadas durante o cultivo tais como pH

(LAWFORO et ai., 1993; FELIPE et et., 1997b), disponibilidade de oxigênio (MORITA,

SILVA. 2000), temperatura (van ZYL et ai., 1988), relação xilose/ácido acético

( du PREEZ et ai., 1991 ), bem como da presença de outros compostos inibitórios

(CONVERTI, 2000b), o que sugere que a influência favorável do consumo de acético

no crescimento celular observado aqui pode ter sido causado pelo efeito combinado de

todos esses fatores associado com o tratamento do hidrotisado, que pode ter

propiciado condições que estimulam a produção de biomassa.

Entretanto observa-se na Tabela IV.4 que nos ensaios 05 e 07 em que se verificou

pouco crescimento celular, a produção de xilitol também foi prejudicada obtendo-se

48


valores mínimos de 11,4 e 12,8 g/L, respectivamente. Comparando-se ambos os

ensaios evidencia-se que as fermentações foram efetuadas com o hidrolisado

concentrado no nível mínimo do fator de concentração (FC = 2,5), ou se1a mínima

concentração de xilose (60,4 g/L), enquanto que os fatores avaliados no tratamento do

hidrolisado variaram do tratamento 05 para o tratamento 07, mantendo-se apenas

constante a temperatura da operação de adsorção (30ºC). As maiores concentrações

de xilitol ( 41, 3 e 42, 9 g/L) foram alcançadas nos ensaios 06 e 1 O. Nesse.s casos o

processo fermentativo efetuou-se com o hidrolisado concentrado no nível máximo do

fator de concentração (FC= 4,5), referente a máxima concentração de xilose (108.4

g/L). Constata-se ainda que também nestes ensaios durante o tratamento do

hidrolisado, o único fator que permaneceu invariável foi a_ temperatura do processo de

adsorção que foi mantida no seu nível -1 (30ºC)

Estas observações sugerem que o fator de concentração, ou seja, o teor inicial de xilose, influencia na produção de xilitol, sendo que o aumento da concentração dessa pentase favorece a formação deste paliai. Comportamento semelhante foi observado por vários autores (GONG et ai, 1981; MEYRIAL et ai, 1991; VANDESKA et ai,

1995b), porém a concentração ótima de xilose para se atingir máxima produção de xilitol varia com a espécie do microrganismo e com as condições experimentais

empregadas durante o cultivo. Quanto a influência do tratamento dos hidrolisados sobre a produção de xilitol, os resultados obtidos não permitem identificar quais dos fatores avaliados exerceram efeito sobre a bioconverão, o que sugere um efeito

combinado desses fatores na produção de xilitol.

Os parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose-xilitol por C. guilliermondii

encontram-se na Tabela IV 5, onde pode-se constatar que os máximos valores de

rendimento em xilitol (0,50 e 0,53 g xilitol/g xilose) correspondentes às maiores eficiências de bioconversão (57,8 e 54,5%, respectivamente), foram obtidos nos ensaios 06 e 1 O, respectivamente, onde se verificaram as maiores concentrações de xilitol, confirmando-se assim o favorecimento da formação deste palio! com o aumento do teor de xilose no hidrolisado. Observa-se ainda que as máximas produtividades (0.43 e 0,45 g/Lh) corresponderam também aos ensaios 06 e 1 O. O menor valor (O, 13 g/Lh) foi encontrado no ensaio 07, o que pode ser atribuído à baixa concentração

~ de inicial de xilose (49,9 g/L), bem como os efeitos de outros fatores e interações que possam ter interferido no processo.

49


TABELA IV.5 Parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose a xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto submetido às diferentes combinações de tratamentos.

Ensaios Yp,s (g/g) Qp (g/L.h) ri(%) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

0,33 0,49 0,36 0.39 0,23 0,50 0,26 0,31 0,44 0,53 0.35 0,40 0,34 0,34 0,35 0,32 0,34 0,35 0,34

O, 19 0,29 O, 19 0,23 O, 12 0,43 O, 13 O, 18 0,26 0,45 0,27- 0,28 0,25 0,25 0,31 0,25 0,24 0,25 0,24

36,0 53.4 39.3 42.5 25, 1 54,5 28.4 33,8 48,0 57,8 38.2 43,6 37, 1 37, 1 38,2 34,9 37, 1 38,2 37, 1

Yp,:; (g/g) - Fator de rendimento em xilito,1 Qp (g/L.h) - Produtividade volumétrica em xilitol, q(%) - Eficiência de bioconversão.

Quanto a influência dos tratamentos avaliados sobre este bioprocesso, a discussão

será feita posteriormente após a análise estatística.

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA E MODELAGEM MATEMÁTICA

4.4.1 Análise estatístíca e modelagem matemátíca para o fator de rendimento em xilitol

A fim de se verificar a influência dos fatores estudados no tratamento do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto sobre a atividade fermentativa de C. guilliermondii e

determinar as condições que permitam obter um hidrolisado susceptível à fermentação

com máxima remoção dos compostos tóxicos, os dados obtidos foram processados

estatisticamente. 50

Resultados e Cnscusséo

Dentre os parâmetros fermentativos deste bioprocesso. foi dado ênfase para o fator

de rendimento em xilitol, como reposta analítica do processo frente a análise

estatística.

Para avaliar se os fatores estudados são significativos ou não, é necessário realizar

o cálculo do erro experimental, baseado nas repetições dos experimentos. Para um

planejamento fatorial fracionário sem repetição, não é possível efetuar tais cálculos,

devido a carência de graus de liberdade. Esse erro pode se estimar considerando as

interações maiores que as de segunda ordem, cujos efeitos geralmente não são

significativos ou seus valores são muito próximos ao erro experimental. Outra forma de

se estimar quais os fatores que realmente são significativos para o processo, é através

do uso de gráficos de probabilidade normal, que constitui-uma técnica alternativa para

distinguir os efeitos que diferem do erro experimental (BOX et et., 1988; BARROS

NETO et ai, 1995). Esta técnica baseia-se em associar o valor de cada efeito a um

valor de probabilidade acumulada, seguindo uma distribuição normal. Dessa forma. os

pontos que se ajustam a essa reta, denominada normal, representam efeitos não

significativos, enquanto que os pontos que se afastam, devem ser interpretados como

efeitos realmente significativos.

Na Figura 4.1 é visualizado o gráfico de probabilidade normal referente ao

rendimento em xilitol. Nota-se que três pontos se apresentam distantes da reta,

representando os efeitos principais do fator de concentração do hidrolisado [FC], a

porcentagem de carvão ativo (CA] e o tempo de adsorção [t], todos eles confundidos

com efeitos interativos de segunda ordem.

Estas observações indicam que esses fatores exercem efeito significativo sobre a

bioconversão de xilose a xilitol. Observa-se ainda que os pontos referentes aos efeitos

principais dos fatores pH do hidrolisado [pH] e temperatura de adsorção [T]

confundidos com interações de segunda ordem, estão praticamente sobre a reta de

probabilidade normal, o que indica que estes fatores não influenciam significativamente

o fator de rendimento em xilitol.

Com base nesta análise e tendo em conta que o fator temperatura de adsorção [T]

também não exerce efeito significativo sobre as respostas de remoção dos compostos

inibidores decidiu-se fixar o valor deste fator no nível mínimo (-1) correspondente a

30ºC.

51


99 ca "C .!! 95 ::::, • E 90 [FC] ::::, u ca 80 CD 70 "C ca :5! 50 .e ca 30 .e e 20 Q.

'#. 10 1 5 m 1

-0.09 -0.03 0.02 0.07 0.13

Efeitos Padronizados

FIGURA 4.1 Gráfico de probabilidade normal para os efeitos referentes ao rendimento

em xilitol por C. guilliermondii , cultivada em hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto submetido a diferentes combinações de tratamento segundo o

planejamento fatorial fracionário 2~2.

52


Após a seleção das variáveis que apresentam efeito significativo sobre a

bioconversão e desprezando o fator temperatura de adsorção [T], complementou-se os

o ensaios iniciais já executados com três ensaios realizados nas condições do ponto

central de cada variável estudada a fim de determinar pela análise de variância, a

possibilidade de ajuste dos dados experimentais a um modelo matemático de primeira

ou de segunda ordem, ou realizar ensaios adicionais em um novo intervalo de estudo.

A análise de variância para um modelo linear (Tabela IV.6) indica que todos os

efeitos principais dos fatores avaliados confundidos com efeitos interativos de segunda

ordem são significativos ao nível de 95% de confiança. É também significativa (p<0,05)

a interação entre o fator de concentração do hidrolisado e a concentração de carvão

ativo [FC][CA], porém os efeitos da interação entre o pH do hidrolisado e a

concentração de carvão ativo[pH][CA] bem como da interação entre a concentração de

carvão ativo e o tempo de adsorção [CA][t] não são significativos (p>O, 1 ). Ainda o

coeficiente de determinação (R2 = 0,9914) indica que um modelo de primeira ordem

(linear) pode representar adequadamente os dados experimentais referentes ao fator

de rendimento em xilitol.

TABELA IV.6 Análise de variância da estimativa de um modelo linear para o fator de rendimento em xilitol por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Efeitos Soma de Graus de Media Valor de F Valor de p Quadrados Liberdade Quadrática

[FC]-[pH][t] 0,0325 1 0,0325 166,67 0,0010* [pH]-[FC][t] 0,0066 1 0,0066 33,90 0,0101* [CA] 0,0091 1 0,0091 46,71 0,0064* [t]-[FC][pH] 0,0153 1 0,0153 78,50 0,0030* [FC][CA] 0,0021 1 0,0021 10,83 0,0461 *

[pH][CA] 0,0010 1 0,0010 5, 19 O, 1071 [CA][t] 0,0010 1 0,0010 5, 19 O, 1071 Erro total 0,0006 3 0,0002

T atai ( corr') 0,0683 10 e,

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade. R2= 0.9914

** Significativo ao nível de 10% de probabilidade.

53


A estimativa de um modelo quadrático para o fator de rendimento em xilitol

(Tabela IV.7), aponta também como significativos todos os efeitos analisados a níveis

de 1 e 5% de probabilidade, inclusive os efeitos interativos entre as variaveis avaliadas,

ou seja, o valor de F estimado para cada um deles é maior que o F tabelado, sendo

que este valor é maior quando comparado com aqueles obtidos na análise de variância

para um modelo linear. A estimativa também aponta como significativa, ao nível de

10% de probabilidade, a existência de curvatura. Essas observações aliadas a um

elevado valor para o coeficiente de determinação (R2 = 0,9990), indicam que a variação

no fator de rendimento em xilitol pode ser representada adequadamente através de um

modelo quadrático e que a região ótima para esta resposta está dentro do intervalo

estudado.

TABELA IV. 7 Análise de variância da estimativa de um modelo quadrático para o fator de rendimento em xilitol por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Efeitos Soma de Graus de Media Valor de F Valor de p Quadrados Liberdade Quadrática

[FC]-[pH][t] 0,0325 1 0,0325 975,38 0,0010*

[pH]-[FC][t] 0,0067 1 0,0067 198,38 0,0050*

[CA] 0,0091 1 0,0091 273,38 0,0036* [t]-[FC][pH] 0,0153 1 0,0153 459,38 0,0022*

[FC][CA] 0,0021 1 0,0021 63,38 0,0154* [pH][CA] 0,001 O 1 0,0010 30,38 0,0314* [CA][t] 0,0010 1 0,0010 30,38 0,0314* Curvatura 0,0005 1 0,0005 15,56 0,0587**

Erro total 0,0000 2 0,0000

Total (corr') 0,0683 10

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade. R2= 0.9990

** Significativo ao nível de 10% de probabilidade.

Para obter o modelo matemático de segunda ordem representativo do fator de

rendimento em xilitol, fez-se uso da metodologia de superfície de resposta, efetuando-

54


se 8 novos ensaios para compor um planejamento fatorial fracionário 24-1 face centrada

e três repetições nas condições referentes ao ponto central do planejamento.

A Tabela IV.8 apresenta as estimativas dos efeitos, erros-padrão, teste t de

"Student" e níveis de significância obtidos da análise de variância, após a triagem dos

fatores e interações de segunda ordem que foram significativos a 90 e 95% de

confiança.

TABELA IV.8 Estimativas dos efeitos erros-padrão, teste t de "Student" e níveis de significância para o fator de rendimento em xilitol por C. guil/iermondii seguindo um planejamento fatorial 24--1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Fatores e interações Estimativas Erros-padrão t p

Média 0,3707 ±0,0129

[FC] 0, 1200 ±0,0223 5,3862 0,0002*

[CA] -0,0540 ±0,0223 -2,4238 0,0338*

[t] -0,0760 ±0,0223 -3,4113 0,0058*

[FC][t] -0,0575 ±0,0249 -2,3084 0,0414*

[FC][FC] 0, 1918 ±0,0426 4,4990 0,0009*

[CA][CA] -0,0982 ±0,0426 -2,3051 0,0417*

[t][t] -0, 1082 ±0,0426 -2,5398 0,0275*

*Significativo ao nível de 95% de confiança (t5% = 2,201)

Os coeficientes, erros-padrão, valores de t e níveis de significância que compõem o

modelo para o rendimento em xilitol estão apresentados na Tabela IV.9, onde pode-se

observar que o fator de concentração [FC], a concentração de carvão ativo e o tempo

de adsorção apresentam efeito significativo ao nível de 95% de confiança. São também

significativos os efeitos da interação entre o fator de concentração e o tempo de

contato [FC][t] (p<0,05), os termos quadráticos desses fatores, [FC]2 e [t]2, (p<0,05) e

também o termo quadrático da concentração de carvão ativo [CA]2 (p<0,05).

55


TABELA IV.9 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa o fator de rendimento em xilitol por C. guillíermondií cultivada em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Variáveis Parâmetros Coeficientes Erros-padrão t p Independentes

Constante Constante 0,37 0,01290 28,7472 0,0000

[FC] X1 0,06 0,01114 5,3862 0,0002

[CA] XJ -0,03 0,01114 -2,4238 0,0338

[t] Xs -0,04 0,01114 -3,4113 0,0058

[FC][t] X1Xs -0,03 0,01245 -2,3084 0,0414

[FC][FC] X/ O, 10 -0,021-31 4,4990 0,0009

[CA][CA] X/ -0,05 0,02131 -2,3051 0,0417

[t][t] xs2 -0,05 0,02131 -2,5398 0,0275

R2 ajustado= O, 7917

Considerando-se que o efeito principal do fator de concentração bem como seus

termos linear e quadrático são positivos, indicando que maior concentração inicial de

xilose favorece a bioconversão de xilose a xilitol, atribuiu-se o nível superior avaliado

( +1) a esse fator e o valor de seu coeficiente foi adicionado ao termo constante e ao

coeficiente do tempo de adsorção, obtendo-se assim um modelo matemático

dependente da concentração de carvão ativo e do tempo de adsorção. Pela análise de

variância da regressão (Tabela IV.1 O), verifica-se que o modelo matemático é significativo (p<0,05) e possui um coeficiente de determinação (R2) de 0,8727,

indicando que o modelo obtido permite estimar 87,3% da variância ocorrida no fator de

rendimento em xilitol em função da concentração de carvão ativo e do tempo de

adsorção utilizados no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

56


TABELA IV.1 O Análise de variância da regressão do modelo que representa o fator de rendimento em xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Fonte de Soma dos Graus de Quadrado Valor de F Valor de p Variação Quadrados Liberdade Médio

Modelo 0,0935608 7 0,0133658 10,7712 0,0004 Resíduos 0,0136498 11 0,00124089

Total 0, 107211 18 R2 = 0,8727

O fator de rendimento em xilitol por C. guilliermondii é definido pela seguinte

equação:

Y1 = 0,53 - 0,03 X3 - 0,07 Xs - 0,05 X/ -0,05Xl

em que:

Y1 é o fator de rendimento em xilitol ,YPrs, g xilitol/g xilose

XJ e Xs são a concentração de carvão ativo e o tempo de adsorção, respectivamente.

O modelo matemático permite obter o máximo valor para o fator de rendimento

em xilitol quando se utiliza carvão ativo no nível -0,3 de concentração, correspondendo

a 2,4% e um tempo de adsorção no nível -0.7, correspondente a 34,5 minutos. Para

esses valores, o fator de rendimento em xilitol atinge 0,56 g xilitol/g xilose, conforme

mostrado na Figura 4.2, que apresenta a superfície de resposta e as curvas de nível

para o modelo proposto, indicando que ambos os fatores exercem um efeito combinado

sobre a bioconversão.

57


o.68 o.64 • 0.343

4 o.5 • 0.357 i 046 • 0.370 (Õ .AZ • 0.384 ~ o. i o.sª • 0.397

~- o.sA 1111 0.411

I o.s 0.424 D 0.438 ~

" Ili 0.451 ~ Q'Q " • 0.465

~"'? ~ • 0.478 % Ç) ~~ ~ • 0.492 ,s,' ~ 5)'? ~~º ~ $:)• • 0.505 ~~ 1' ~ G • 0.518 • 0.532 • 0.545

FIGURA 4.2 Superfície de resposta descrita pelo modelo quadrático para o fator de

rendimento em xilitol por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado


58


Desta forma, observa-se que quando se usa o nível inferior de ambos os fatores

(1 % de carvão ativo e 30 minutos de tempo de adsorção) o fator de rendimento cai

visivelmente atingindo o mínimo valor observado no intervalo estudado (0,33 g xilitol/g

xilose), o que pode ser explicado pelo fato de que tanto a porcentagem de carvão

quanto o tempo de adsorção insuficientes para reduzir as concentrações dos

compostos tóxicos a níveis que não afetem a bioconversão. Um decréscimo no fator de

rendimento (0,38 g xilitol/g xilose) também é observado ao usar esses fatores nos

níveis superiores avaliados (5% de carvão ativo e 60 minutos de tempo de adsorção).

Este comportamento pode ser atribuído a ao efeito combinado de uma elevada

concentração de carvão com um tempo de adsorção alto, que pode provocar a

remoção de um grupo de compostos que estimulam o processo de bioconversão. Ao

tratar o hidrolisado pelo uso de níveis diferentes destes fatores a bioconversão também

é afetada.

PARAJÓ et ai. (1996b), também evidenciaram a influência da concentração de

carvão ativo utilizada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto na

bioconversão de xilose a xilitol por D. hansenii. Os resultados obtidos por esses autores

revelaram que o valor ótimo de concentração de carvão ativo, dentro da faixa de estudo

avaliada (0,25-10%) para se atingir o máximo rendimento em xilitol (0,6 g/g) foi de

0,5%. ALVES (1997) também encontrou que no intervalo de concentrações de 0-3% de

carvão ativo avaliado no tratamento do hidrolisado de bagaço de cana, 2,4% foi valor

ótimo de concentração que permitiu obter o máximo fator de rendimento em xilitol

(O, 79 g/g) por C. guilliermondií.

Na Figura 4.3, encontra-se a análise dos resíduos do modelo matemático obtido,

onde se verifica que a disposição dos pontos estimados pelo modelo com relação à média e seus respectivos resíduos, estão dispostos aleatoriamente, não sendo

observado nenhum padrão geométrico que possa indicar uma anormalidade na

distribuição desses resíduos.

59


0.0454021 - 1 ~

UI o 0.00415077 - ::::, "C ·- UI l!!l (1) rx: l!ill

-0.0164749 - 1!11

l!I

-0.0371005 - l!il

1 1 1 1 1

0.27 0.33 0.40 0.46 0.53

0.0247764 -

Valores Previstos

FIGURA 4.3 Distribuição de resíduos do modelo proposto para o tratamento do

hidrolisado visando maior fator de rendimento em xilitol por

C. guilliermondii cultivada em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

60


4.4.2 Análise estatística e modelagem matemática para a remoção dos inibidores

Com o intuito de se conhecer os níveis de remoção dos compostos inibidores da

atividade fermentativa de C. guilliermondii cultivada em hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto submetido as condições ótimas de tratamento, os dados experimentais

referentes às porcentagens de redução das concentrações de ácido acético,

hidroximetilfurfural assim como dos compostos aromáticos derivados da degradação da

lignina e dos extrativos da madeira foram analisados estatisticamente.

A análise dos resultados seguiu a mesma seqüência proposta para a análise dos

dados correspondentes ao fator de rendimento em xilitol.

Na análise inicial do planejamento 25-2 foi constatado que, de forma similar ao fator

de rendimento em xilitol, o efeito principal do fator temperatura de adsorção não foi

significativo para nenhuma das repostas avaliadas.

De acordo com estudos realizados por PARAJÓ et ai. (1996b) a temperatura, na

faixa de 24-60ºC, só apresentou efeito significativo sobre a remoção dos compostos de

aromáticos na etapa inicial do processo de adsorção quando foram adicionadas baixas

concentrações de carvão ativo (0,25-1 %), não afetando os parâmetros cinéticos desse

processo.

Desta forma foi desprezado este fator e seu valor foi fixado no nível inferior

avaliado (30ºC).

Na análise do planejamento fatorial fracionário 24-1 com repetições no ponto

central, foi constatado que para todas as respostas, os modelos apresentavam

curvatura significativa, indicando que as variações nas porcentagens de remoção dos

inibidores podem ser adequadamente representadas por modelos de segunda ordem

(quadráticos).

A partir do teste t de "Student", foi feita uma triagem inicial permanecendo no

modelo somente os fatores e interações que apresentaram efeito significativo a 90 e

95% de confiança. ~

61


4.4.2.1 Análise estatística e modelagem matemática para a remoção de ácido acético.

As estimativas, erros-padrão, teste t de "Student" e níveis de significância para a

remoção de ácido acético encontram-se na Tabela IV.11, onde pode se verificar que

somente o efeito principal do fator de concentração [FC] apresentou significância

estatística a nível de 90% de confiança, enquanto que o termo quadrático deste fator

[FC]2 é significativo a 95% de confiança. São também significativos os efeitos principais

do pH [pH] (p<0,05) e da concentração de carvão ativo [CA] (p<0,05), bem como o

efeito interativo entre estes fatores [pH][CA] (p<0,05) e o termo quadrático do pH do

hidrolisado [pH]2 (p<0,05).

TABELA IV.11 Estimativas dos efeitos erros-padrão, teste t de "Student" e níveis de significância para a remoção de ácido acético seguindo um planejamento fatorial 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Fatores e interações Estimativas Erros-padrão t p

Média 10,1814 ±1,0061 [FC] 3,4640 ±1,7871 1,9383 0,0765**

[pH] -4, 1280 ±1,7871 -2,3099 0,0395*

[CA] 8,7860 ±1,7871 4,9163 0,0004*

[pH][CA] -6,9825 ±1,9981 -3,4946 0,0414*

[FC][FC] 9,3073 ±3,1814 2,9256 0,0044*

[pH][pH] -14,1727 ±3,1814 -4,4549 0,0008*

*Significativo ao nível de 95% de confiança (ts% = 2, 179)

**Significativo ao nível de 90% de confiança (t10% = 1, 782)

Na Tabela IV.12 encontram-se os coeficientes, erros-padrão, valores de te níveis

de significância referentes ao modelo representativo da remoção de ácido acético.

62


TABELA IV.12 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa a remoção de ácido acético no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Variáveis Parâmetros Coeficientes Erros-padrão t p independentes

Constante Constante 10, 18 1,0060 10, 1202 0,0000

[FC] X1 1,73 0,8936 1,9383 0,0765

[pHJ X2 -2,06 0,8936 -2,3099 0,0395 [CA) X3 4,39 0,8936 4,9163 0,0004 [pH][CA] X2X:3 -3,49 0,9990 -3,4946 0,0044 [FC][FC] X/ 4,65 1,5907 2,9256 0,0127 [pH][pH] X/ -7,09 1,5907 -4,4549 0,0008

R2 ajustado= 0,7678

Considerando-se que a máxima bioconversão de xilose a xilitol é obtida quando as

fermentações são efetuadas com o hidrolisado concentrado no nível máximo do fator

de concentração (FC= 4,5) e que o termo linear deste fator possui menor nível de

significância para a remoção do ácido sendo que este termo e o termo quadrático

referente a este fator são positivos, o que indica que o aumento do fator de

concentração contribui positivamente à remoção de ácido acético, substituiu-se o valor

desse fator pelo seu nível superior ( +1 ), e adicionou-se ao termo constante, obtendo-se

finalmente um modelo em função dos fatores concentração de carvão ativo e pH do

hidrolisado.

- ---

Com os fatores e interação significativos foi realizada a análise de variância para o

modelo proposto (Tabela IV.13), comprovando-se assim a significância estatística do

mesmo (p<0,01) com um coeficiente de determinação (R2 = 0,8452) que descreve

84,5% da variância total em torno da média.

Na Figura 4.4, encontra-se a disposição dos pontos estimados pelo modelo em

relação a média e seus respectivos resíduos. Observa-se-que existe aleatoriedade nos

pontos, indicando que os erros seguem uma distribuição normal e que os pontos foram

satisfatoriamente representados pelo modelo escolhido.

63


,--·------------------------. 1

4.71859 -

2.73184 - U) l!!ll o ::::, ,, mi !ll ·- l!lil U) 0.745092 - mi CI) ~ lí!I

!!li

!ll !iil -1.24166 - líl

l!!l

-3.22841 - mi l!ll!!I

1 1 1 1 1

0.20 5.00 9.81 14.62 19.43

Valores Previstos

.. FIGURA 4.4 Distribuição de resíduos do modelo proposto para o tratamento do

hidrolisado visando maior remoção de ácido acético do hidrolisado de

eucalipto.

64


TABELA IV.13 Análise de variância da regressão do modelo que representa a remoção de ácido acético no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.


Modelo 523,036 6 87, 1727 10,9177 0,0003 Resíduos 95,8146 12 7,98455

Total 618,851 18

R2 = 0,8451

O modelo resultante que descreve a remoção de ácido acético do hidrolisado de

eucalipto é definido pela seguinte equação:

em que:

Y2 é a remoção de ácido acético, %

X2 e XJ são o pH do hidrolisado e a concentração de carvão ativo, respectivamente

Este modelo prevê o favorecimento da remoção de ácido acético do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto utilizando o fator concentração de carvão ativo no nível

superior (+1) correspondendo a 5% e o fator pH no nível -0,45, correspondendo a um

valor de pH de 3,0. Nestas condições a concentração deste composto é reduzida até

22,0%, o que pode ser verificado na superfície de resposta e curvas de níveis

referentes a este modelo (Figura 4.5).

65


z6 ~ zZ j 1s ~t 1A t 10 g 6 iP.:

~ z ro E/ "~---

• 4.731 • 5.813 • 6.894 • 7.975 • 9.056 • 10.138 Ili 11.219 D 12.300 1111 13.381 • 14.463 • 15.544 • 16.625 • 17.707 • 18.788 • 19.869 • 20.950

FIGURA 4.5 Superfície de resposta descrita pelo modelo quadrático representativo da

remoção de ácido acético do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

66


4.4.2.2 Análise estatística e modelagem matemática para a remoção de hidroximetilfurfural

No caso do hidroximetilfurfural as estimativas dos efeitos, erros-padrão, teste t de

"Student"e níveis de significância (Tabela IV.14) mostra que a concentração de carvão

ativo tem efeito principal significativo (p<0,05) sobre esta resposta, como também é

significativo o termo quadrático deste fator (p<0,05). Observa-se também que o efeito

principal do fator de concentração [FC] não é significativo, porém seu termo quadrático

apresenta nível de significância a 95% de probabilidade.

TABELA IV.14 Estimativas dos efeitos erros-padrão, teste t de "Student" e níveis de significância para a remoção de hidroximetilfurfural seguindo um planejamento fatorial 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Fatores e intera~ões Estimativas Erros-eadrão t e Média 84,9155 ±1,8089 [FC] -4,2380 ±3,2133 1,9383 0,2084

[CAJ 47,9660 ±3,2133 4,9163 0,0000*

[FC][FCJ 15,8306 ±5,7202 2,9256 0,0151 *

[CA][CAJ -32,4894 ±5,7202 -4,4549 0,0001 *

*Significativo ao nível de 95% de confiança (ts% = 2,145)

O ótimo nível de significância (p<0,05) e o elevado coeficiente de determinação

(R2 = 0,9420) obtidos da análise de variância para o ajuste dos dados experimentais ao

modelo (Tabela IV.15), indicam que o mesmo é adequado para representar as

variações desta resposta em função da concentração de carvão ativo e que estima o

94,2% da variância em torno da média.

67


TABELA IV. 15 Análise de variância da regressão do modelo que representa a remoção de hidroximetilfurfural no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.


Modelo 6594,81 3 2198,27 81, 1596 0,0000

Resíduos 406,286 15 27,0858

Total 7001, 10 18

R2 = O 9420 '

A Tabela IV.16 apresenta os coeficientes de regressão, erros-padrão, valores de te

níveis de significância referentes aos fatores do modelo escolhido para representar a

remoção de hidroximetilfurfural do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

TABELA IV.16 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa a remoção de hidroximetilfurfural no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.


Constante Constante 84,91 1,8529 45,8273 0,0000 [CA] ~ 23,98 1,6458 14,5725 0,0000

[FC][FC] X/ 7,92 2,9298 2,7017 0,0164 [CA][CA] X/ -16,24 2,9298 -5,5447 0,0001

R2 ajustado= 0,9304

O modelo matemático que descreve a variação da remoção de hidroximetilfurfural em função do fator de concentração do hidrolisado e da concentração de carvão ativo utilizada para o tratamento é expresso pela seguinte equação:

68


Y3 = 84,91 +7,92 X1 + 23,98 X3-16,24 X/ em que:

Y3 é a remoção de hidroximetilfurfural, %

X1 e XJ são o fator de concentração e a concentração de carvão ativo, respectivamente.

Esse modelo estima uma remoção máxima de hidroximetilfurfural de 100% quando se utiliza o carvão ativo no nível superior de concentração avaliado (5%) o que pode ser visto na superfície de resposta e as curvas de nível mostradas na Figura 4.6. Observa-se ainda que independentemente da concentração do hidrolisado, a remoção de hidroximetilfurfural permanece acima de 90%, quando se utiliza o carvão no seu nível superior. Entretanto quando a concentração de carvão atinge seu nível inferior ( 1 % ), a redução na concentração deste composto diminui consideravelmente obtendo- se um valor mínimo de 44,7%. Na Figura 4.7 é mostrada a distribuição dos resíduos do modelo em torno de zero, onde se observa que a distribuição dos mesmos é aleatória, e que não existe tendência no modelo proposto.

Visto que o máximo fator de rendimento em xilitol é obtido quando o cultivo é

realizado com o hidrolisado concentrado no nível máximo do fator de concentração

(FC = 4,5) tratado pela adição de 2,4% de carvão ativo, os valores codificados destes

parâmetros foram substituídos no modelo matemático obtido para determinar a

porcentagem remoção de hidroximetilfurfural nestas condições de tratamento, obtendo-

se uma redução da concentração deste composto de 87, 11 %.

69


• 40.588 • 44.406 • 48.225 • 52.043 • 55.861 • 59.679

63.498 D 67.316 11J 71.134 • 74.952 • 78.771 • 82.589 • 86.407 • 90.225 • 94.044 • 97.862

FIGURA 4.6 Superfície de resposta e curvas de nível descritas pelo modelo

matemático representativo da remoção de hidroximetilfurfural do


70


!

7.862 ! mi

4.12725 -

!li

11!'1 u, o l!!I ::::s 0.3925 - "C ·- l!'!I tn 1i!I l!.lil .. (1) li!I .. -· -

r:t: ·-- Ili l!l!l iil 1111

-3.34225 -

-7.077 - 11\1

1

28.01 1

43.81 1

59.62 1

75.42 1

91.22

Valores Previstos

FIGURA 4. 7 Distribuição de resíduos do modelo proposto para o tratamento do

hidrolisado visando maior remoção de hidroxirnetilfurfural do

hidrolisado de eucalipto.

71


4.4.2.3 Análise estatística e modelagem matemática para a remoção dos compostos aromáticos

A Tabela IV.17, mostra as estimativas dos efeitos, erros padrão e teste t de "Student" e níveis de significância referentes a remoção dos compostos aromáticos oriundos da degradação da lignina e dos extrativos da madeira para o planejamento fatorial fracionário 24-1 face centrada com triplicata no ponto central. Conforme os resultados apresentados nesta tabela, observa-se que ao nível de 95% de confiança o fator de concentração e o pH do hidrolisado, bem como a concentração de carvão ativo são significativos. Também é significativa a estimativa quadrática para o fator pH em nível de 95% de confiança, apresentando efeito de 13, ?% sobre a remoção destes compostos.

TABELA IV.17 Estimativas dos efeitos, erros-padrão, teste t de "Student" e níveis de significância para a remoção dos compostos aromáticos seguindo um planejamento fatorial 24-1 com face centrada e três repetições no ponto central para cada variável estudada no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

- - Fatores e interações Estimativas Erros-padrão t p

Média 52,7656 ±1,3934 [FC] -13,6600 ±2,6437 -5, 1670 0,0001* [pH] 11,0940 ±2,6437 4, 1964 0,0009* [CA] 38,3260 ±2,6437 14,4971 0,0000* [pH][pH] 13,7029 ±3,8412 3,5673 0,0031*

*Significativo ao nível de 95% de confiança (t1o/o = 2, 977)

TABELA IV.18 Análise de variância da regressão do modelo que representa a remoção dos compostos aromáticos no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Fonte de Variação Soma dos Graus de Quadrado Valor de F Valor de p Quadrados Liberdade Médio

Modelo 4668,75 4 1167, 19 66,7995 0,0000

Resíduos 244,622 14 17,4730

Total 4913,37 18 R2 = O 9502 '

72


A análise de variância para o modelo proposto (Tabela IV.18), mostra que o mesmo é significativo ao 5% de probabilidade, proporcionando um coeficiente de determinação (R2) de 0,95.

Os resíduos para o modelo quadrático estão aleatoriamente distribuídos em torno do valor zero e da média dos resultados calculados pelo modelo (Figura 4.8), demonstrando que não existe nenhuma tendência no modelo. Estes resultados são confirmados através da análise de variância do modelo proposto (Tabela IV.18), sendo que o mesmo é significativo no nível de 95% de confiança com um coeficiente de determinação de 0,9502, ou seja, este modelo explica o 95% da variância observada nos valores da remoção destes compostos em função das mudanças no pH do hidrolisado e na concentração de carvão ativo empregada no tratamento do hidrolisado . de eucalipto. O percentual não-explicado está relacionado com o erro puro dos experimentos, ou seja, é devido a erros de metodologia da propia análise.

Com base nos resultados da análise de variância e níveis de significância (p) foi

feita análise de regressão múltipla para a estimação dos coeficientes que compõem o

modelo quadrático representativo da remoção dos compostos aromáticos. Os

resultados estão apresentados na Tabelas IV.19.

TABELA IV.19 Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa a remoção dos compostos aromáticos no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.


Constante Constante 52,77 1,3934 37,8694 0,0000 [FC] X1 -6,83 1,3219 -5, 1670 0,0001 [pH] X2 5,55 1,3219 4, 1964 0,0009 [CA] XJ 19, 16 1,3219 14,4971 0,0000 [pH][pH] X/ 6,85 1,9206 3,5673 0,0031

R2 ajustado= 0,9360

73


7.34831 _' 111

Ili llil

4.17681 - Ili

rll !!! o = "O 1.00531 - -- l!iiil rll ~ ~

l!I

l!I

-2.16619 - liii lil l!l

til

-5.33769 - lill

1 1 1 1 1

28.01 43.82 59.62 75.42 91.23

Valores Previstos

FIGURA 4.8 Distribuição de resíduos do modelo proposto para o tratamento do

hidrolisado visando maior remoção dos compostos aromáticos do

hidrolisado de eucalipto.

74


Verifica-se na Tabela IV.19 que o termo referente ao fator de concentração é

negativo, indicando que a remoção dos compostos aromáticos é favorecida ao

empregar o hidrolisado concentrado no nível inferior do fator de concentração

(FC= 4,5).

Visto que o rendimento em xilitol, bem como a remoção de ácido acético e

hidroximetilfurfural são favorecidos pelo aumento no teor de xilose do hidrolisado,

determinou-se fixar o valor deste fator no seu nível superior (108,4 g/L), sendo que o

valor do coeficiente foi subtraído ao valor do termo constante, resultando em um

modelo matemático dependente do pH do hidrolisado e da porcentagem de carvão

ativo empregada.

O modelo matemático que descreve a remoção dos compostos aromáticos

provenientes da degradação da lignina e dos extrativos da madeira pode ser expresso

pela seguinte equação:

Y4 = 45,94 + 5,55 X2 + 19, 16 X3 + 6,85 X/

em que:

Y4 é a porcentagem de remoção dos compostos de natureza fenólica, %

X2 e XJ são o pH do hidrolisado e a concentração de carvão ativo, respectivamente.

Este modelo matemático prevê um valor máximo de remoção dos referidos compostos

(77,5%) ao tratar o hidrolisado concentrado 4,5 vezes pela elevação do seu pH para o

nível superior avaliado (7,0) seguido da adsorção com carvão ativo utilizando o nível

superior deste fator (5%), conforme pode ser observado na superfície de resposta e

curvas de níveis referentes a este modelo (Figura 4.9).

75


• 28.706 • 31.756 • 34.806 • 37.855 • 40.905 • 43.954

47.004 D 50.054 Ili 53.103 • 56.153 • 59.202 • 62.252 • 65.302 • 68.351 • 71.401 • 74.450

FIGURA 4.9 Superfície de resposta e curvas de nível descritas pelo modelo proposto

que representa a remoção dos compostos aromáticos do hidrolisado

hemicelulõsico de eucalipto.

76


4.5 DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS DE TRATAMENTO DO HIDROLISADO

Uma vez determinados os modelos matemáticos representativos das respostas de interesse, a próxima etapa do estudo foi a determinação das condições ótimas de tratamento do hidrolisado de eucalipto em que é atingida a máxima bioconversão de xilose a xilitol por C. guílliermondíi, com· máxima remoção dos inibidores da atividade fermentativa desta levedura.

Tendo-se definido anteriormente que a máxima bioconversão de xilose a xilitol (Yp1s = 0,56 g xilitol/g xilose) por C. guílliermondíi cultivada em hidrolisado de eucalipto, é atingida quando a fermentação é conduzida com o hidrolisado concentrado no nível máximo do fator de concentração (FC = 4,5), ou seja máxima concentração de xilose (108,4 g/L), tratado pela adição de carvão ativo na concentração de 2,4%, permanece por elucidar o valor de pH ótimo do hidrolisado em que é obtida máxima redução das concentrações de ácido acético e dos compostos aromáticos.

Os modelos representativos da remoção de ácido acético e dos compostos aromáticos, indicam que essas respostas são dependentes das mudanças do pH e da concentração de carvão ativo utilizada no tratamento, sendo que para obter uma maior remoção do ácido, o hidrolisado deve ser tratado pela alteração do seu pH inicial para 3,0 enquanto que a maior remoção dos compostos aromáticos é atingida ao se elevar o pH do hidrolisado para 7,0, pelo que é necessario definir um valor ótimo de pH onde se possa obter valores máximos para ambas as repostas. Para isso foi utilizada a técnica de superposição de curvas de níveis.

Observa-se na Figura 4.1 O a região definida pela superposição das curvas de nível estimadas pelos modelos que descrevem as respostas remoção de ácido acético e compostos aromáticos. O máximo valor do fator de rendimento em xilitol (0,56 g xilitol/g xilose) é atingido ao tratar o hidrolisado pela adição de carvão ativo no nível de concentração -0,3 (2,4%). Para esse nível de concentração de carvão ativo o pH do hidrolisado pode variar no intervalo de -0,27 a 0,45, correspondente aos valores de 3,5 e 5,5, respectivamente. Considerando-se que a elevação do pH é efetuada pela adição de CaO comercial, determinou-se fixar o valor deste parâmetro no seu nível inferior, o que se corresponde com menor quantidade desse álcalí. Neste ponto são obtidas porcentagens de remoção de 9,44% para o ácido acético e de 41,5% para os compostos aromáticos. Os valores otimizados são destacados na Figura 4.1 O.

77

Condição ótima CA = -0,30 pH = -0,27

- Remoção ácido: 9,44% - Remoção aromáticos: 41 ,5%

<( o

-1.0 t-t---~--~------ -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

pH

Região de valores ótimos para atingir rnaxrma remoção de ácido acético e compostos aromáticos.

FIGURA 4.1 O Superposição das curvas de nível referentes aos modelos que

descrevem as variações de remoção de ácido acético e compostos

aromáticos do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.


4.6 TESTE DOS MODELOS

A fim de obter a validação dos modelos para os parâmetros fator de rendimento em

xilitol, bem como as porcentagens de redução das concentrações dos inibidores do

metabolismo microbiano, foi realizado um experimento denominado "teste do modelo",

utilizando as condições de tratamento determinadas pela metodologia estatística nas

quais obteve-se o máximo valor de rendimento em xilitol, visto ser esta a resposta de

maior interesse. Para isso, o hidrolisado concentrado 4,5 vezes sua concentração

inicial foi tratado pela elevação do pH até 3,5 com CaO comercial seguido de

tratamento com 2,4% de carvão ativo, efetuando a operação· de adsorção a 30ºC por

34,5 minutos. O hidrolisado tratado foi utilizado para efetuar a fermentação por

C. guilliermondii. Os resultados obtidos quanto ao fator de rendimento em xilitol e a

remoção dos inibidores estão apresentados na Tabela IV.20.

TABELA IV.20 Respostas obtidas no teste dos modelos para o fator de rendimento em xilitol e a remoção dos inibidores do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Valores Previstos Teste do Modelo*

YP/S

Remoção ác. acético (%) Remoção hidroximetilfurfural (%)

Remoção compostos aromáticos (%)

0,56 ± 0,013 9,44 ± 1,006

87, 11 ± 1 , 809

41,5±1,393

0,52

8,91 87,54

39,43

*Média de três repetições

Os valores experimentais obtidos quanto ao rendimento em xilitol e a remoção de

ácido acético, hidroximetilfurfural e compostos aromáticos, encontram-se em torno dos

valores previstos pelos modelos (Tabela IV.20). As variações observadas entre os

valores previstos pelos modelos e os obtidos experimentalmente estão dentro dos

limites do erro experimental, indicando que os modelos propostos podem representar

79


matemáticamente a bioconversão de xilose a xilitol por C. guilliermondií, assim como

as porcentagens de remoção dos inibidores do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto,

em função da concentração do hidrolisado e das condições de tratamento avaliadas.

Comparando-se os resultados obtidos no presente trabalho com os alcançados por

CANETTIERI (1998) quanto a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii

cultivada em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, verifica-se que a metodologia

selecionada neste estudo para o tratamento do hidrolisado 4,5 vezes concentrado

resultou em um aumento de 147% no fator de rendimento em xilitol, quando comparado

com o valor obtido por esse autor após fermentar o hidrolisado 4 vezes concentrado

previamente submetido a alteração de pH com álcali e ácido seguido de adsorção em

10% de carvão ativo a 30ºC por 60 minutos.

80

Conctusóes

5. CONCLUSÕES

- Os resultados experimentais obtidos no presente trabalho permitem concluir que a

bioconversão de xilose a xilitol por Candida guilliermondii é influenciada pela

concentração inicial de xilose e pelo tratamento aplicado ao hidrolisado


O melhor resultado para a bioconversão de xilose a xilitol (0,56 g/g) foi obtido com o

hidrolisado concentrado 4,5 vezes previamente tratado pela elevação do seu pH

para 3,5, adsorção em 2,4% de carvão ativo a 30ºC por 34,5 minutos

O tratamento do hidrolisado de eucalipto com carvão ativo reduz a concentração de

furfural a níveis apontados como não inibitórios ao metabolismo da xilose por

C. guilliermondii.

A temperatura do processo de adsorção não teve efeito significativo (p<0,05 ou

O, 10) no fator de rendimento em xilitol. nem na remoção dos compostos inibidores.

- O pH do hidrolisado não influenciou no processo de bioconversão. porém teve efeito

significativo sobre a remoção de ácido acético e dos compostos aromáticos. O

hidrolisado tratado em pH 3,5 resultou na remoção de 9,4% de ácido acético e de

41,5% de compostos aromáticos ao se empregar 2,4% de carvão ativo. Nessas

condições é removido 87. 1 % de hidroximetilfurfural.

- O uso da metodologia de superfície de resposta permitiu obter 4 modelos

matemáticos que descrevem as variações do fator de rendimento em xilitol (Y 1 ),

bem como das porcentagens de remoção dos inibidores como o ácido acético (Y2},

81

Ccoctusôes

o hidroximetilfurfural (Y 3) e os compostos aromáticos (Y 4) do hicrolrsado

hemicelulósico de eucalipto

Y1 = 0,53 - 0,03 X3 - 0,07 X5 - 0,05 X/ -0,05X/

Y: = 16,56 - 2,06 Xz + 4,39 X3 - 3,49 X2X3 - 7,09 X/

Y3 = 84,91 +7,92 X1 + 23,98 X3 -16,24 X/

Y4 = 46,0 + 5,6 Xz + 19,2 X3 + 6,9 X/

em que X1, X2. X3 e Xs correspondem aos valores cocificados das variáveis fator de

concentração (FC]. pH (pH], concentração de carvão ativo (CA] e tempo de

adsorção (t].

Os modelos foram validados por ensaios experimentais de acordo com suas

estimativas para aqueles níveis otimizados.

82

Pecomenoeções

6. RECOMENDAÇÕES

Efetuar uma caracterização completa do hidrolisado quanto a identificação e

quantificação dos compostos aromáticos presentes bem como outros compostos

tais como os ácidos fórmico e luvulínico

Continuar realizando estudos sobre o tratamento do hidrolisado de eucalipto para

melhorar a bioconversão de xilose em xilitol, empregando-se combinações de

técnicas que permitam a remoção seletiva dos compostos que realmente exercem

efeito tóxico no metabolismo da xilose por C gwlltermondii

83

Referencias 81bhograf;cas

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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., -- -- . ~-'"'

98

Aoencuc«

8. APÊNDICE

99

Apend1ce

TABELA AI Características principais do carvão ativo SYNTH utilizado no presente trabalho.

Características

Número de lodo 890 mg/g

Umidade 3,87%

Cinzas 4,51%

Adsorção em Azul de Metileno

Teor de Ferro

Índice de Melaço

16,10 g/100 g

650 ppm

174

10,20 pH

100

Aoénotce

TABELA A.2 Variação da concentração de açúcares e ácido acético em g/L na fermentação do hidrolisado de eucalipto submetidos a diferentes tratamentos.

Ensaio Glicose Xilose Ácido acético Inicial Final Inicial Final Inicial Final

01 3,2 º·º 55,4 o.o 7.9 7,5 02 6,0 0,0 85,4 28,9 7.9 6.7 03 3,6 º·º 51,0 O.O 7.3 5.3 04 6,3 o.o 84,0 26,7 8.2 7,5 05 3, 1 o.o 49,7 º·º 6,3 5,7 06 5,3 o.o 83, 1 0,0 6.6 4,4 07 2.8 0,0 49.9 o.o 7.2 6.5 08 5,8 0,0 92,3 26,8 7.8 7,7 09 2,6 0,0 56,5 º·º 7.4 4,0 10 5,5 0,0 97, 1 - 16, 1 7.5 4,4 11 6,0 º·º 74,1 1,7 7.5 6,5 12 2,7 0,0 73,6 o.o 8.2 7,2 13 2,6 0,0 73,3 4,9 8.1 5,9 14 2.7 º·º 71,9 o.o 6.8 5,3 15 2,2 0,0 74,4 1, 7 7.4 6, 1 16 2,0 0,0 72,9 1,9 7.4 5,9 17 3,7 0,0 69,5 o.o 7,0 5,9 18 3,6 0,0 68,4 0,6 6.9 6,0 19 3,7 o.o 68,0 0,9 6,7 5,8

101

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»cencce

TABELA A.3 Análise de variância da estimativa de um modelo quadrático para a remoção de ácido acético do hidrolisado de eucalipto.

Efeitos Soma dos Graus de Quadrado Valor de F Valor de p Quadrados Liberdade Médio

[FC]-[pH][t] 35,4903 1 35,4903 9,32 0.0927'"' [pH]-[FC][t] 40,0065 1 40,0065 10,50 0.0835** [CA] 137,3653 1 137,3653 36,05 0.0266* [t]-[FC][pH] 4,4253 1 4,4253 1, 16 0.3939* [FC][CA] 4,7586 1 4,7586 1,25 0,3800* [pH][CA] 97,5106 1 97,5106 25,59 0,0369* [CA][t] 18,6966 1 18,6966 4,91 0,1571* Curvatura 50,7152 1 50,7152 13,31 0.0676* Erro total 7,6200 2 3,8100

T atai { corr' ~ 396,5885 10

*Significativo ao nível de 5% de probabilidade. R2= 0,9808 **Significativo ao nível de 10% de probabilidade

103

Apéna,ce

TABELA A.4 Análise de variância da estimativa de um modelo quadrático para a remoção de hidroximetilfurfural do hidrolisado de eucalipto.

Efeitos Soma dos Graus de Quadrado Valor de F Valor de p Quadrados Liberdade Médio

[FC]-[pH][t] 9.4395 1 9,4395 35.00 0,0274** [pH]-[FC][t] 8,9253 1 8,9253 33.09 0,0289 ...... [CA] 4066,6671 1 4066,6671 15076,62 0,0001 * [t]-[FC][pH] 1,4878 1 1,4878 5,52 0, 1433* [FC][CA] 9,4395 1 9,4395 35,00 0,0274* [pH][CA] 8,9253 1 8,9253 33,09 0,0289* [CA][t] 1,4878 1 1,4878 5,52 O, 1433* Curvatura 289,0266 1 289,0266 1071,53 0,0009* Erro total 0,5395 2 0,2697 Total {corr'} 4395,9384 10

*Significativo ao nível de 1% de probabilidade R2=0,9998 **Significativo ao nível de 5% de probabilidade

104

,!oénd1ce

TABELA A.5 Análise de variância da estimativa de um modelo quadrático para a remoção dos compostos aromáticos do hidrolisado de eucalipto.

Efeitos Soma dos Graus de Quadrado Valor de F Valor de p ., Quadrados Liberdade Médio

[FC]-[pH][t] 270,6301 1 270,6301 81189,03 0.0000* [pH]-[FC][t] 280,0161 1 280,0161 84004,83 0.0000* [CA] 2590,2003 1 2590,2003 777060,09 0.0000* [t]-[FC][pH] 24,0471 1 24,0471 7214,13 0.0001 * [FC][CA] 38,7640 1 38,7640 11629,20 0,0001 * [pHJ[CA] 0,9591 1 0,9591 287,73 0.0035* [CA][t] 14,0715 1 14,0715 4221,45 0.0002* Curvatura 189.1961 1 189, 1961 56758,84 0.0000* Erro total 0,0067 2 0,0033

Total {corr·i 3407,8911 10

*Significativo ao nível de 1% de probabilidade. R2= 0.9999

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POR Candida guilliermondii. - USPsistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2001/BID01008OCR.pdf · muito para a realização deste trabalho. A sua família, sua esposa Marta e filhas