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POTENCIAL ANTIOXIDANTE Y ANTIHIPERGLUCEMIANTE DE
EXTRACTOS BIOACTIVOS OBTENIDOS DE GRANADILLA DE MONTE
(Pasiflora vitifolia Kunth).
JENNY ALEJANDRA AVILA OSPINA
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Biólogo
Director
JONH JAIRO MÉNDEZ ARTEAGA
Doctor en Ciencias Químicas
Codirectora
ELIZABETH MURILLO PEREA
Magister en Química
Codirector
ÁNGEL JIMÉNEZ RODRÍGUEZ
Biólogo
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
IBAGUÉ- TOLIMA
2017
2
3
A Dios que siempre guía mi
camino,
a la memoria de mi padre
que me motiva a superarme
cada día
y a mi madre, mi más grande
apoyo.
4
AGRADECIMIENTOS
La autora expresa sus agradecimientos:
A los integrantes del grupo de investigación en productos naturales GIPRONUT
por la orientación investigativa durante todo este aprendizaje.
Al laboratorio de extensión de la Universidad del Tolima LASEREX cuya
colaboración y orientación, aprecia en gran medida.
Al grupo de investigación CEDAGRITOL de la Facultad de Agronomía
(Universidad del Tolima), a la Universidad Nacional de Colombia (Sede Medellin)
y a la Universidad de Lleida por su colaboración y apoyo logístico.
A la Oficina de Investigaciones por su apoyo económico, que hizo posible la
materialización de este proyecto.
5
RESUMEN
Colombia posee 48 especies endémicas de Passifloraceae, de las cuales el 81%
se encuentra en la región andina. Algunos trabajos mencionan a Passiflora
vitifolia Kunth, pero pocos tratan los atributos físicas, químicas y biológicas de los
subproductos del fruto. Este estudio evaluó las características físicas y químicas
de semillas y cáscara del fruto de Passiflora vitifolia colectada en Ibagué, valoró
el potencial antioxidante y antihiperglucemiante de extractos provenientes de
estos subproductos y determinó el rendimiento y particularidades físicas y
químicas del aceite proveniente de semilla y cáscara. Passiflora vitifolia se
caracteriza por poseer flores de color escarlata, frutos ovoides de coloración
verde con manchas blancas diseminadas longitudinalmente, con gran cantidad
de semillas que conservan algunas características morfo-anatómicas del fruto,
además de ser el mayor reservorio de nutrientes extraíbles con etanol; los
fitofenoles son los constituyentes más abundantes, acompañados de baja
cantidad de alcaloides. El ácido p-cumárico y la rutina son quimiomarcadores de
la especie. Las semillas del fruto pueden utilizarse como material crudo en la
industria de alimentos, cosmetológica, farmacológica, biodiesel o implementarse
como suplemento alimenticio en personas con diabetes tipo 2. El rendimiento y
calidad del aceite extraído de las semillas da valor agregado al fruto. El conjunto
de los resultados no sólo permite conocer peculiaridades físicas, químicas y
biológidas de una Passiflora procedente de la región andina del Tolima, también
deja ver usos promisorios del fruto, abre posibilidades de trabajos de mayor
especificidad y grado de profundidad para una especie no convencional y de
limitado conocimiento científico.
Palabras clave: Passiflora vitifolia, Granadilla de monte, Actividad antioxidante,
Potencial antihiperglucemiante, Extractos.
6
ABSTRACT
Colombia has 48 endemic species of Passifloraceae, 81% are in the Andean
region. Some papers mention Passiflora vitifolia Kunth, but few assess the
physical, chemical and biological characteristics of the fruit byproducts. This study
determined the physical and chemical characteristics of seeds and peel of the P.
vitifolia fruit collected in Ibagué, the antioxidant and antihyperglycemic potential
of extracts from these byproducts were assessed and the physical and chemical
characteristics and performance of seed and peel oils were determined.
Passiflora vitifolia is characterized by scarlet flowers, ovoid greenish-brown fruits
with longitudinally scattered white spots, with a large number of seeds that retain
some morpho-anatomical characteristics of the fruit, furthermore being the largest
reservoir of nutrients that can be extracted with ethanol; phytophenols are the
most abundant constituents, accompanied by low amounts of alkaloids. p-
coumaric acid and rutin are chemo markers of the species. The fruit seeds can
be used as raw material in the food industry, cosmetology, pharmacology,
biodiesel or implemented as a dietary supplement in people with type 2 diabetes.
The yield and quality of the oil extracted from the seeds adds value to the fruit.
The results not only allows to know the physical, chemical and biological
characteristics of a Passiflora from the Andean region of Tolima, also permit to
see promising uses of the fruit, opens up possibilities to get greater specific
studies and depth degree for an unconventional species of limited scientific
knowledge.
Keywords: Passiflora vitifolia, Granadilla de monte, Antioxidant activity,
Antihyperglycemic potential, Extracts.
7
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 12
1. OBJETIVOS ................................................................................................. 14
1.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 14
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 14
2. MARCO REFERENCIAL .............................................................................. 15
2.1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA ........................ 15
2.2 MARCO TEORICO ..................................................................................... 19
2.2.1. La familia Passifloraceae ........................................................................ 19
2.2.2. Diabetes mellitus (DM) ............................................................................ 24
2.2.3 Actividad antiradicalaria y antioxidante (In vitro) ...................................... 28
3. MATERIALES Y METODOS ........................................................................ 33
3.1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS……..33
3.2 ENSAYOS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ....................... 33
3.2.1. Análisis morfométrico del fruto completo, cáscara y semillas ................. 33
3.2.2. Color instrumental ................................................................................... 34
3.2.3. Evaluación de la dureza/firmeza del fruto completo ................................ 34
3.2.4. Análisis Bromatológico ............................................................................ 34
3.2.5. Preparación de extractos ....................................................................... 35
3.2.6. Pruebas físicas ....................................................................................... 35
3.2.7. Análisis Fitoquímico Preliminar ............................................................... 35
3.2.8. Perfil químico de extractos etanólicos de cáscara y semilla ................... 36
3.2.9. Parámetros HPLC-UV ............................................................................. 36
3.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE .................................................................... 37
3.4. ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO ................................. 39
3.4.1 Inhibición de α-amilasa ............................................................................ 39
8
3.4.2. Inhibición de difusión de glucosa ............................................................ 40
3.5 EXTRACCIÓN Y COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL ACEITE DE P.
vitifolia ............................................................................................................. 41
3.5.1. Extracción de aceite ................................................................................ 41
3.5.2. Metilación de ácidos grasos del aceite de semilla .................................. 41
3.5.3. Parámetros de cromatografía de gases .................................................. 41
3.5.4. Análisis físico-químico del aceite de cáscara y semilla de P. vitifolia ...... 42
3.6 REACTIVOS ............................................................................................... 43
3.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................... 43
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................... 44
4.1 CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE FRUTO COMPLETO, CÁSCARA Y
SEMILLA DE P. vitifolia .................................................................................... 44
4.2 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ................................................................... 50
4.2.1. Análisis de minerales de la cáscara y semilla de P. vitifolia .................... 52
4.3 CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y QUÍMICA DEL ZUMO Y LOS
EXTRACTOS .................................................................................................... 54
4.2.1 Composición química de los extractos etanólicos .................................... 61
4.4 TAMIZAJE FITOQUÍMICO .......................................................................... 65
4.5 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE ACEITES DE P. vitifolia ......... 68
4.5.1 Perfil de ácidos grasos ............................................................................. 72
4.6 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ..................................................................... 74
4.6.1. Evaluación del potencial fenólico total y antioxidante ............................. 74
4.6.2. Actividad antihemolítica .......................................................................... 78
4.7 ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO .................................. 81
4.7.1. Inhibición de la difusión de glucosa a través de membrana de diálisis ... 82
4.7.2. Inhibición de la enzima alfa amilasa ....................................................... 86
4.8 ANÁLISIS DE CORRELACIÓN ................................................................... 91
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ......................................................... 94
9
REFERENCIAS ................................................................................................ 97
ANEXOS ......................................................................................................... 120
10
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Descripción botánica de Passiflora vitifolia ........................................ 23
Tabla 2. Caracterización física del fruto completo, cáscara y semilla de P. vitifolia
.......................................................................................................................... 44
Tabla 3. Evaluación bromatológica de cáscaras y semillas de P. vitifolia (%) .. 51
Tabla 4. Contenido en elementos minerales de cáscaras, semillas y zumo de P.
vitifolia (mg/g de materia seca) ..................................................................... 53
Tabla 5. Caracterización física comparativa del zumo (parte comestible) y
extractos etanólicos y de acetato de etilo de cáscara y semilla de frutos P. vitifolia
.......................................................................................................................... 55
Tabla 6. Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM) ....................... 61
Tabla 7. Análisis fitoquímico realizado a extractos de cáscara y semilla de P.
vitifolia ............................................................................................................... 66
Tabla 8. Caracterización fisicoquímica de aceites ............................................ 68
Tabla 9. Composición de ácidos grasos de aceite de semilla de P. vitifolia y P.
edulis ................................................................................................................ 73
Tabla 10. Contenido fenólico total y capacidad antioxidante de la cáscara y
semillas de P. vitifolia ........................................................................................ 75
Tabla 11. Comparación de los efectos protectores de extractos de P. vitifolia y
BHT ................................................................................................................... 79
Tabla 12. Porcentaje de Inhibición de difusión de glucosa a través de la
membrana de diálisis ........................................................................................ 82
Tabla 13. Porcentaje de inhibición de alfa amilasa de los extractos de P.
vitifolia ............................................................................................................... 87
Tabla 14. Correlaciones - Análisis Multivariado (Statgraphics Centurion
XVI.I.) ................................................................................................................ 92
Tabla 15. Pares de variables con valores- P por debajo de 0,05 .................... 93
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de la diabetes mellitus.................................................. 26
Figura 2. Color y aspecto de los frutos de P. vitifolia en estado verde (a) y con el
progreso de la madurez (b) ............................................................................... 46
Figura 3. Semillas del fruto de Passiflora vitifolia ............................................. 49
Figura 4. Analisis bromatológico de cáscara y semilla de P. vitifolia................ 52
Figura 5. % inhibición de la difusión de glucosa vs tiempo (h) ......................... 83
Figura 6. Inhibición de la alfa amilasa .............................................................. 88
12
INTRODUCCIÓN
En el tema de las Passifloraceae debe reconocerse a Colombia como país
privilegiado, pues de las casi 700 especies reportadas, en el territorio colombiano
se registran 170 distribuídas en 3 géneros: Ancistrothyrsus, Dilkea y Passiflora
(Escobar 1988; Ocampo, Coppens & Jarvis, 2010). Es llamativo en estas
entidades botánicas su distribución pantropical; algunas son lianas o
enredaderas, aunque existen organismos arbóreos o arbustivos; algunas son de
importancia económica reconocida (Passiflora edulis f flavicarpa Sims, maracuyá
amarillo, Passiflora ligularis Juss, granadilla y Passiflora mollissima Kunth,
curuba); otras por el contrario tienen limitado conocimiento (Passiflora vitifolia,
Passiflora capsularis, Passiflora magdalenae, entre otras). En general se les
encuentra silvestres o cultivadas por el atractivo de sus frutos, vistosidad de sus
flores o la curiosa forma de sus hojas (Ocampo, Coppens & Jarvis, 2010).
A las pasifloráceas se les halla en las cinco regiones biogeográficas de Colombia,
distribuidas en los géneros Passiflora (97%), Dilkea y Ancistrothyrsus (con el 3%
restante). La región Andina, de la que hace parte el departamento del Tolima,
alberga 137 especies (81% del total), sobre todo en alturas mayores a los 1500
m.s.n.m. (Hernández & Bernal, 2000). Sus frutos comestibles y lo anteriormente
expuesto justifica, al menos en parte, el que las comunidades las utilicen en la
preparación de zumos, jaleas, helados, golosinas y en la medicina tradicional
como sedativo, vermífugo, antiespasmódico, acción hipotensora, cardiotónica,
emenagoga, diurética, antihelmíntica, agente antimicrobiano, entre otras (Oga,
de Freitas, da Silva & Hanada, 1984; Anesini & Perez, 1993; Dhawan, Dhawan
& Sharm, 2004). La variabilidad de aplicaciones alimenticias y etnomédicas, al
igual que la reconocida presencia en ellas de alcaloides, compuestos fenólicos y
compuestos cianogénicos les ha valido ser objeto de múltiples estudios
científicos, por ejemplo en: biogeografía, taxonomía y/o morfología (Alvarado-
Cárdenas, 2007; Ibáñez, Idrogo, Llatas-Quiroz & Paredes, 2014; Mezzonato-
13
Pires, 2017), en ecología e importancia económica (Lindberg & Olesen, 2001;
Mezzonato-Pires, Salimena, & Bernacci, 2013), en biología reproductiva y
polinización (Faria & Stehmann, 2010; Ocampo, Arias & Urrea, 2016); también
sus características nutricionales y antioxidantes han sido revisadas (Rivas,
Muñoz & Balcázar, 2015; Sabogal, Chávez, Oliveros, Murillo, Méndez, 2016),
para sólo mencionar unos pocos.
De reciente interés científico son los estudios relacionados con su contenido de
compuestos fenólicos, entre ellos flavonoides, y el estrés oxidativo. Esta
anomalía fisiológica es considerada por muchos como el origen de múltiples
alteraciones orgánicas, entre ellas las asociadas a la diabetes. A su vez, la
diabetes es considerada como un conjunto de patologías agrupadas bajo la
misma denominación y catalogadas como crónicas; su origen más frecuente se
da cuando los islotes de Langerhans o islotes pancreáticos, particularmente las
células beta, no producen insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza
eficazmente esta hormona (WHO, 1999).
Aunque unos cuantos trabajos hacen referencia a P. vitifolia, los que tienen que
ver directamente con el conocimiento científico de esta especie de pasiflorácea
son de limitada disponibilidad. Este estudio determinó algunas de las
características físicas del fruto; evaluó el contenido nutricional y fitoquímico de
semillas y cáscaras y valoró el potencial antioxidante y antihiperglucemiante de
extractos orgánicos provenientes de cáscaras y semillas. El trabajo se
complementó determinando el rendimiento y características físicas y químicas
del aceite proveniente de la semilla y cáscara. La información obtenida en esta
investigación aportará conocimiento científico, tecnológico y/o farmacológico de
una de las pasifloráceas de baja divulgación en el mundo científico y podrá
constituirse en fundamento para el desarrollo de nuevas alternativas
nutracéuticas y fitofarmacológicas para la prevención y/o control de diabetes.
14
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar física, química y biológicamente la cáscara y semillas provenientes
del fruto de Passiflora vitifolia, una de las pasifloráceas no-convencionales y de
limitados estudios científicos.
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar comparativamente algunas de las características físicas y químicas
del fruto completo, semilla y cáscara de P. vitifolia.
Caracterizar física y químicamente el “zumo” del fruto y los extractos
provenientes de semilla y cáscara.
Evaluar el potencial antioxidante, antihiperglucemiante y protección de eritrocitos
de P. vitifolia, bajo condiciones in-vitro, a través de extractos orgánicos obtenidos
de los subproductos del fruto.
Estudiar comparativamente el rendimiento de aceite proveniente de la cáscara y
semilla, y realizar la caracterización física y química del producto oleífero.
Contribuir al conocimiento de una Passiflora de escaso conocimiento en
Colombia y en la región del Tolima.
15
2. MARCO REFERENCIAL
2.1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA
El género Passiflora es uno de los de mayor importancia económica en el trópico,
lo que se deriva de la presencia de casi 700 especímenes en estas regiones, en
su mayoría en el continente americano (Ulmer & MacDougal, 2004). Asociado a
esta amplia distribución, está la diversidad de usos y aplicaciones dadas por las
etnias de las diferentes regiones donde se les conoce, así como también la
multiplicidad de investigaciones realizadas con estas entidades botánicas. Se
incluyen estudios de tipo molecular, botánico y/o agronómico, alimenticio y
nutricional, usos etnomédicos y verificaciones de algunas de las funcionalidades
biológicas de muchas especies de pasifloráceas. En este orden de ideas, y para
sólo mencionar unos pocos:
Muschner, Lorenz, Cervi, Bonatto, Souza-Chies, Salzano, & Freitas (2003),
realizaron el primer análisis filogenético molecular de la familia Passifloraceae;
los resultados evidenciaron la necesidad de reevaluar la monofilia del género
Passiflora y su clasificación infraespecífica. Con propósitos similares, pero a nivel
del género, se destacan los trabajos de Yockteng & Nadot, en el 2004, logrando
abarcar casi todas las secciones de este gran género vegetal. Para el estudio se
utilizó el gen de la glutamina sintetasa expresada en cloroplasto a fin de examinar
las relaciones entre especies, evidenciando una sorprendente correlación global
entre la posición filogenética de las diferentes especies y su número
cromosómico. De otra parte, Lorenz-Lemke, Muschner, Bonatto, Cervi, Salzano
& Freitas (2005) se interesaron en las inferencias filogeográficas relacionadas
con la evolución de Passiflora actinia y Passiflora elegans sobre la base de la
variación del ADN nuclear ribosomal (nrDNA). Hansen, Escobar, Gilbert &
Jansen (2007) se ocuparon de establecer la herencia parental, maternal y
biparental del genoma del cloroplasto en el género y las implicaciones para
16
estudios filogenéticos. Ortiz, Bohórquez, Duque, Tohme, Cuéllar & Vásquez
(2012) analizaron la variabilidad genética entre individuos de Passiflora edulis de
plantaciones comerciales en Colombia, en total se compararon 419 fragmentos
de ADN pero ninguno mostró polimorfismos.
De interés taxonómico son dignos de mencionar los trabajos de Escobar (1989)
con la clasificación taxonómica de un nuevo subgénero y cinco nuevas especies
en passifloras de América del Sur. En el 2002, Pérez- cortés, Tillett & Escala,
realizaron un estudio morfológico de la semilla de 51 especies del género
Passiflora, encontraron que estas diferencias permiten la clasificación
taxonómica de las especies del género. También Plotze, Falvo, Pádua, Bernacci,
Vieira, Oliveira & Bruno (2005), mediante la aplicación del método morfométrico
conocido como dimensión fractal multiescalar de Minkowski, no utilizado antes
en pasifloráceas. Los autores lograron realizar un análisis de la forma de la hoja
que permitió establecer un patrón característico para cada una de las especies.
En el 2009 Krosnick y Freudenstein, reportaron una nueva especie de Passiflora
(Passiflora kuranda), mediante una revisión taxonómica de los subgéneros
Tetrapathea Incluyendo los Genomas Monotípicos Hollrungia y Tetrapathea
(Passifloraceae).
A nivel etnomédico, las pasifloráceas encuentran diversas aplicaciones en
muchos países como sedante, vermífugo, antiespasmódico, contra el insomnio,
diurético, emético, agente antimicrobial para tratar la neumonía, antihelmíntico,
antidiarréico, estimulante, tónico, antihipertensivo, y para tratar los síntomas
menopáusicos (Chopra, Nayar & Chopra, 1956; Dhawan, Dhawan & Sharm,
2004).
En el tema de la diabetes, el uso de diferentes sistemas vegetales ha despertado
el interés por la búsqueda de nuevas moléculas con actividad frente a la patología
y que, además, evidencien un mínimo de efectos colaterales. Con este propósito
son muchas las especies vegetales pertenecientes a la familia Passifloraceae
17
que han sido probadas; podrían mencionarse los trabajos realizados con
extractos de Passiflora incarnata (Gupta, Kumar, Chaudhary, Maithani & Singh,
2012), Passiflora nítida (Montefusco, de Carvalho, de Araújo, Teixeira, Matos &
Lima, 2013) y Passiflora alata (Colomeu, Figueiredo, Cazarin, Schumacher,
Maróstica, Meletti & Zollner, 2014), evaluados en modelos in vivo mediante
diabetes inducida por sustancias químicas como aloxano o estreptozotocina.
Estudios realizados con extractos de Passiflora nítida (Gupta et al., 2012),
Passiflora ligularis (Saravanan & Parimelazhagan, 2014), y Passiflora foetida
(Paulraj, Subharamanian, Suriyamoorthy & Kanakasabapathi, 2014) también
utilizaron modelos in vitro como inhibidores de las enzimas alfa y beta
glucosidasa, y alfa y beta amilasa.
Importa mencionar que Colombia cuenta con 170 especies que lo convierten en
el país con mayor diversidad de Passiflora, tanto en formas silvestres como
cultivadas (Ocampo, 2007; Ocampo, Coppens & Jarvis, 2010), no es por tanto
extraño que los investigadores enfoquen sus objetivos en estudiar las especies
colombianas pertenecientes a este género. Con estos propósitos se han
realizado trabajos de clasificación de nuevas especies pertenecientes al
subgénero Tacsonia (Passifloraceae): Passiflora formosa (Ulmer, 1999),
Passiflora tarminiana (D'Eeckenbrugge, Barney, Jørgensen & MacDougal, 2001),
Passiflora creuci-caetanoae (Aguirre, Aguirre & Cardenas, 2016). En el 2016,
Aguirre, Bonilla & Caetano, encontraron una nueva especie clasificada como
Passiflora franciscoi perteneciente al subgénero Astrophea (Passifloraceae). En
el 2007, Ocampo, publicó una nueva lista de Passifloraceaes colombianas que
incluye detalles sobre la distribución de estas especies y presenta 26 nuevas en
Colombia, integrando aspectos importantes para su conservación. También se
han realizado trabajos que han aportado valioso conocimiento vinculado a la
familia en Colombia, a través de los cuales se evalúa el desempeño fotosintético
y potencial hídrico foliar de gulupa (P. edulis f. edulis Sims) en estado
reproductivo en tres localidades de los Andes colombianos (Pérez & Melgarejo,
2015).
18
Pese a lo dicho anteriormente, de Passiflora vitifolia Kunth (1817) se conocen
limitados trabajos en comparación con otras especies colombianas del mismo
género. Este vacío estaría en parte justificado dado que se trata de una especie
silvestre, sólo cultivada a nivel de huertas de pan-coger y porque no se
identifican, hasta el momento, grandes extensiones de interés económico de ella.
Adicionalmente no se conocen protocolos de cultivo y fisiología de la especie lo
que se convierte en una limitante para su producción a gran escala y, por ende,
su interés comercial. No obstante, esta especie ha sido objeto de algunas
investigaciones, por ejemplo, en los campos de la taxonomía y la ecología.
Ramaiya, Bujang & Zakaria (2014a), estudiaron la caracterización morfológica y
el análisis filogenético de la región espaciadora transcrita interna (ITS) del ADN
ribosómico nuclear, para establecer la filogenia de especies de Passiflora. Sousa,
Souza, Melo & Sodré, en el 2015, analizaron los marcadores ISSR (inter-simple
sequence repeat) en especies silvestres de Passiflora como herramienta para la
selección de taxones en reproducción ornamental. A nivel ecológico podría
mencionarse un mayor interés en la especie, como es el caso de evaluación
realizada por Snow (1982), para medir la Intensidad de la polinización y el
potencial reproductivo de la semilla de P. vitifolia, encontrando que el sistema de
semillas limitado al polen puede ser una desventaja de la auto-incompatibilidad.
Por su parte, Lanza (1988) y Smiley (1986) relacionaron la preferencia de
algunas especies de hormigas por el néctar de P. vitifolia y su influencia en la
supervivencia de larvas.
Estudios más recientes vinculan los factores ecológicos y genéticos que influyen
en las estrategias para elección del huésped en las mariposas Heliconius,
encontrando a P. vitifolia como una de las plantas de preferencia (Merrill, Naisbit,
Mallet & Jiggins 2013). Por otra parte, Ramírez en el 2006, evaluó la hibridación
interespecífica en Passiflora, mediante polinización manual y características
florales; en este caso, P. vitifolia produjo semillas viables después de sufrir
polinización manual con polen de P. ambigua, P. edulis, P. platyloba, P.
cuadrangularis y P. miniata. Se concluyó que, debido a polinizadores específicos,
19
algunas especies de pasifloras han desarrollado mecanismos genéticos para el
aislamiento reproductivo y que las nuevas especies podrían haber evolucionado
simétricamente a través de la poliploidía. De igual forma, en el 2016, Ocampo et
al., evalúa la hibridación interespecífica entre diferentes especies cultivadas y
silvestres del género Passiflora encontrando el mayor porcentaje de germinación
(100%.) en el cruce P. edulis f Flavicarpa × P. vitifolia.
La revisión de literatura permite afirmar que son muy pocos los trabajos
enfocados hacia actividades biológicas de la especie. Puede citarse la
investigación realizada por Gomes en el 2014, donde se evalúa un método de
extracción de flavonoides y un método cromatográfico (HPLC-UV) para
cuantificar flavonoides: C-glicósidos, orientina, isoorientina, vitexina, isovitexina
y rutina en diferentes especies de Passiflora, dentro de las que se encuentra P.
vitifolia; el trabajo también evaluó la capacidad antioxidante utilizando la
metodología de estabilización del radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),
evidenciándose que los extractos de las Passifloras utilizadas presentan
capacidad antioxidante comparable a la del ácido gálico, aunque P. vitifolia no
mostró potencial inhibitorio de la enzima acetilcolinesterasa ni presentó actividad
citotóxica relevante para inhibir el crecimiento tumoral contra la línea celular de
ovario, carcinoma de colon humano y glioblastoma.
A este nivel, es importante hacer mención que en ninguno de los estudios antes
relacionados P. vitifolia es el objeto central de la investigación, sólo es tenida en
cuenta como una especie más en el trabajo.
2.2 MARCO TEORICO
2.2.1. La familia Passifloraceae: contiene 17 géneros y más de 700 especies
(Escobar y Ruiz, 1988). Algunos autores reconocen sólo 5 géneros, dos de los
cuales se encuentran en Colombia: Passiflora y Dilkea; este último, propio de
bosques húmedos tropicales, posee cinco especies, de las cuales dos se
20
encuentran en la Amazonia colombiana y en el Chocó. Por su parte, el género
Tetrastylis, fue creado con una sola especie brasilera (Killip, 1926); el género
Ancistrothyrsus, con dos especies descritas hasta ahora (Ancistrothyrsus
hirtellus, A. tessmannii), se encuentra en los bosques amazónicos del Perú y
Brasil, y el género Mitostemma, con tres especies, está restringido a los bosques
de la Amazonia en Brasil, Venezuela y Perú (Escobar & Ruiz, 1988).
El nombre de la familia y del género principal, Passiflora, tiene su origen en “flor
de la pasión”, refiriendose a la pasión de Jesucristo; para los antiguos
exploradores, los zarcillos representaban los látigos con los cuales azotaron el
cuerpo de Cristo, la corona floral, representaba la corona de espinas salpicada
de sangre, y el androginóforo con sus tres estilos y estigmas capitados y cinco
anteras, representan la cruz, los clavos y las cinco personas que acompañaron
al Señor en su muerte (Escobar & Ruiz, 1988).
La distribución de la familia es esencialmente pantropical, con pocas especies en
zonas templadas en América del norte y del sur, el sur de China y Nueva Zelanda
(Feuillet & MacDougal, 2007). Su morfología vegetativa es de plantas leñosas
erectas, con un brote accesorio (en serie) en la parte superior de la yema axilar,
con estipulas pequeñas, persistentes o caducas, en algunos casos ausentes
(Androsiphonia, Barteria), pero en algunas Passifloras son grandes, a menudo
asimétricas o pinnadas; a veces la parte apical imita en forma y color un huevo o
una larva de una mariposa heliconia, este fenómeno se considera un elemento
importante en el argumento para la existencia de la co-evolución entre Passiflora
y las mariposas heliconias (Gilbert 1971; Gilbert, 1975; Feuillet & MacDougal,
2007). Gilbert (1982), atribuye la gran diversidad de formas foliares a la presión
selectiva ejercida por las mariposas de la familia Heliconiidae, pues éstas en
estado larval son pestes específicas de las pasifloráceas, ya que las hembras de
las mariposas identifican los lugares de oviposición no sólo por el sentido del
olfato, también por la vista.
21
Las estructuras que identifican una planta perteneciente a la familia
Passifloraceae son: ovario súpero, estipitado; placentación parietal y la presencia
de una corona floral (Escobar & Ruiz, 1988). Puede encontrárseles como lianas,
enredaderas herbáceas con zarcillos axilares, o árboles; hojas alternas,
peciolados con estípulas (ausentes en Dilkea), con nectarios extraflorales
(ausentes en algunas especies de Passiflora), pedúnculos axilares; flores
hermafroditas; sépalos 4 ó 5, pétalos 4 ó 5 (ausentes en algunas especies de
Passiflora); opérculos membranáceo, erecto o péndulo (ausente en especies de
Dilkea y algunas especies de Passiflora), 5 estambres unidos por los filamentos,
formando un androginóforo u 8 y libres; ovario súpero, estipitado o subsésil, con
3 o 4 placentas parietales; semillas con testa lisa o reticulada, con arilo (Escobar
& Ruiz, 1988).
La característica más llamativa de las flores es la corola, que en su forma más
simple está representada por una membrana finamente lacerada, como se
encuentra en algunas del género Adenia (Feuillet & MacDougal, 2007). En otros
géneros, se desarrollan varias series de hilos, membranas plegadas y montículos
carnosos; la mayor complejidad se encuentra en el género Passiflora (Lindman,
1906; Puri, 1947; Puri, 1948; Tillett, 1988; Endress, 1994).
En cuanto a la biología reproductiva, la polinización en Passifloraceae se ha
estudiado principalmente a varias especies del género Passiflora, donde es
efectuada por abejas, avispas y colibríes, y más raramente por murciélagos; un
rasgo destacado es la ritmicidad en la floración, ya que un pequeño número de
flores se produce cada día durante un período que en algunas especies puede
durar hasta 9 meses, logrando que la antesis de una flor dure menos de un día
(Feuillet y MacDougal, 2007).
Los frutos de Passifloraceae son bayas carnosas, en su mayoria presentan
semillas con arilo, cuyo desarrollo se inicia durante la gametogénesis. En la
madurez de la semilla, el arilo es generalmente zumoso e incoloro, a veces
22
anaranjado (Feuillet y MacDougal, 2007). El endosperma es aceitoso y
proteináceo y persiste o es absorbido; el embrión es relativamente grande
(Dathan & Singh 1973; Corner 1976).
La dispersión de las semillas se da gracias a una gran variedad de animales,
incluyendo pájaros, murciélagos, monos e insectos. Muy pocas frutas son
descascaradas de manera que se necesitan roedores o mucho tiempo de
desintegración para exponer las semillas de los frutos caídos (Feuillet &
MacDougal, 2007).
Las Passifloraceae ocupan una gran variedad de hábitats desde el desierto hasta
las llanuras de inundación, pero son más abundantes en las selvas tropicales, la
mayoría de las especies crecen en las elevaciones bajas y medias, pero algunas
son pioneras en la playa y otras crecen por encima de la línea de árboles en las
pendientes andinas (Feuillet & MacDougal, 2007).
Desde el punto de vista fitoquímico, la familia posee un grupo de compuestos
fenólicos tales como C-glicosil-flavonas, derivados del ácido cinámico,
procianidina, ácido elágico y ácido gálico. Es también común en los miembros de
esta familia encontrar compuestos nitrogenados, tales como los alcaloides de
tipo harman (actúan como Inhibidores de la monoaminooxidasa , encontrados en
las semillas de Peganum harmala, por ejemplo la harmina, harmalina,
y harmalol), los cuales son relativamente solubles en agua. Los ciclopentenoides
y glucósidos cianogénicos son también de reconocida presencia en la familia
(Spencer, 1988). Los cianógenos están presentes en todos los tejidos, incluidas
las raíces, aunque desaparecen de los frutos durante el proceso de maduración
(Feuillet & MacDougal, 2007).
Los investigadores han encontrado relacion entre la fitoquímica y la herbivoria de
la familia Passifloracea. Las especies de Passiflora, y de otros géneros, son las
únicas plantas anfitrión para las mariposas heliconias; la especie o combinación
23
de especies de Heliconius que las prefieren para la oviposición estaría asociado
a la composición química intraespecífica de la hoja, resultando así una relación
única planta:insecto. Además, se ha evidenciado que las larvas de Heliconius
que se alimentan de las hojas de pasifloráceas, secuestran sus toxinas que las
hacen desagradables para las aves. De otra parte, la presencia de cianógenos y
alcaloides actúan como repelentes para la gran mayoría de herbívoros,
exceptuando a las Heliconiinae, estrechamente coevolucionados por alimentarse
de ellas. (Feuillet & MacDougal, 2007). Las glándulas de néctar extraflorales en
los pecíolos, hojas, estípulas o brácteas sirven como imitadores de huevo que
protegen las hojas de la depredación, y al secretar néctar, generan una fuerza
defensiva a hormigas predadoras, avispas y parasitoides (Gilbert 1971; Gilbert,
1975).
Referenciando específicamente a Passiflora vitifolia, su epíteto latino significa
"con las hojas de Vitis" (“Dictionary of Botanical Epithets”, 2017), especie descrita
por Carl Sigismund Kunth (Bonpland, von Humboldt, & Kunth, 1817). La tabla 1
agrupa las principales características morfoanatómicas de esta especie de
pasifloracea.
Tabla 1. Descripción botánica de Passiflora vitifolia
Parte vegetal Descripción
Es una enredadera que alcanza hasta 8 m de
longitud. Las plantas maduras tienen un tronco
leñoso, de 2-3 cm de diámetro, teniendo
numerosas ramas vegetativas y reproductivas.
La mayor parte de los tres lóbulos de las hojas
nacen en el dosel del bosque, mientras que las
flores escarlatas vistosas se muestran cerca
del suelo.
24
Parte vegetal Descripción
Hojas alternas, divididas parcialmente en tres
lóbulos, con el lóbulo central más largo, de 7–
15 cm de largo y 8–18 cm de ancho, lobos
agudos a acuminados, base truncada a
subcordada, márgenes irregularmente
serrados, densamente puberulentas en el
envés; pecíolos 2–5 cm de largo, con un par de
glándulas grandes en la base; estípulas
diminutas, caducas.
Flores rojas, solitarias, normalmente caulifloras,
brácteas lanceoladas, serradas, 1–2 cm de
largo; flores hasta 13 cm de ancho; tubo del
cáliz 1–2 cm de largo, sépalos libres 6–8 cm de
largo; pétalos 4–6 cm de largo; corona 3-
seriada.
Frutos elipsoides, tipo baya, 5–6 cm de largo y
3 cm de ancho, verde-cafés con manchas
blancas, puberulentos; semillas reticuladas.
Fuente: (“Tropicos.org”, 2017; El autor)
2.2.2. Diabetes mellitus (DM): la ciencia médica utiliza el término general
“diabetes mellitus” para referirse a los trastornos heterogéneos del metabolismo
cuya principal característica es la hiperglucemia crónica; es causada por una baja
secreción de insulina, el deterioro en la actividad de esta o como resultado de
ambos factores (Kerner & Brückel, 2014; Van Belle, Coppieters & Von Herrath,
2011). Las complicaciones más comunes en pacientes con DM son la nefropatía
diabética y la enfermedad cardiovascular, las cuales son responsables del 50-80
25
% del total de muertes por esta patología (Marenco & Lengua, 2016). En general,
las complicaciones diabéticas se clasifican en microvasculares o microangiopatía
(retinopatía, nefropatía y neuropatía), macrovasculares o macroangiopatía
(arterosclerosis, infarto agudo al miocardio, accidente cerebro-vascular y
vascular periférico) y mixtas como es el caso del pie diabético (Mantilla, 2012).
Algunos autores describen a la DM como una enfermedad multifactorial
(Colomeu, Figueiredo, Cazarin, Schumacher, Maróstica, Meletti & Zollner, 2014)
o como un grupo de enfermedades metabólicas (Marenco & Lengua, 2016). El
perfil fisiopatológico metabólico completo de la enfermedad va más allá de la
hiperglucemia (Asrafuzzaman, Afroz, Kamato, Gray & Little, 2017), debido a que
involucra un conjunto de factores de riesgo cardiovascular, incluyendo varias
combinaciones de obesidad abdominal, intolerancia a la glucosa, hipertensión,
dislipidemia aterogénica, además de enfermedades microvasculares y
macrovasculares (Cooper, Gilbert, & Epstein, 1998; Cooper, Bonnet, Oldfield &
Jandeleit-Dahm, 2001; Montefusco et al., 2013).
La capacidad orgánica para generar o no insulina ha hecho que la DM se
clasifique como tipo 1 y tipo 2 (DT1 y DT2, respectivamente). En común tienen
los altos niveles de glucosa en la sangre (hiperglucemia); sin embargo, la DT1
por lo general comienza en personas menores de 30 años, por lo que también
se denomina diabetes juvenil; a pesar de que puede ocurrir a cualquier edad,
este trastorno autoinmune crónico afecta, por factores ambientales, a individuos
genéticamente susceptibles (Atkinson & Eisenbarth, 2001). En personas con DT1
el propio sistema inmunológico del cuerpo ataca las células beta de los islotes de
Langerhans del páncreas, destruyéndolas o dañándolas lo suficiente para reducir
y eventualmente eliminar la producción de insulina (Van Belle, Coppieters & Von
Herrath, 2011). Por su parte, la DT2 suele estar asociada con la obesidad o la
edad, este es principalmente el resultado de la resistencia a la insulina cuando el
músculo o las células adiposas no responden adecuadamente a los niveles
26
normales de insulina producida por células beta (Van Belle, Coppieters & Von
Herrath, 2011).
Existen otros tipos de diabetes mellitus cuya clasificación y causa se exponen en
la Figura 1.
Figura 1. Clasificación de la diabetes mellitus.
Fuente: Modificado de: Kerner & Brückel, 2014.
La Federación Internacional de Diabetes estima que 366 millones de personas
alrededor del mundo tienen DM y se espera que para el 2030 estas cifras
aumenten a 552 millones de personas, lo cual equivale aproximadamente a 14
•Destrucción de las células β que conduce auna deficiencia absoluta de insulina.Usualmente mediada por mecanismosinmunológicos.
Diabetes tipo 1
•Puede ir desde una resistencia predominantea la insulina con relativa deficiencia deinsulina hasta una secreción defectuosaprevalente con resistencia a la insulina. Seasocia frecuentemente con otros problemasdel denominado síndrome metabólico.
Diabetes tipo 2
•Disminución de la actividad de la insulina,diagnosticada por primera vez durante elembarazo.
Diabetes Gestacional
•Enfermedades del páncreas (por ejemplo, pancreatitis, fibrosis quística, hemocromatosis)
•Endocrinopatías (por ejemplo, síndrome de Cushing, acromegalia, feocromocitoma)
•Medicamentos inductores (por ejemplo, glucocorticoides, neurolépticos, alfa-interferones, pentamidina)
•Defectos genéticos de la función de las células β (por ejemplo, formas MODY)
•Defectos genéticos de la acción de la insulina
•Otros síndromes genéticos que pueden asociarse con la diabetes
Otros tipos específicos de diabetes
27
millones de casos nuevos cada año (Calderón, Muñoz & Quintanar, 2013). Según
proyecciones de la OMS, la diabetes será la séptima patología causante de
mortalidad en el 2030; resulta interesante, que cerca del 80 % de las muertes por
diabetes se registran en países de medianos y bajos ingresos económicos
(Mathers & Loncar, 2006). En el caso de Colombia, la prevalencia de DT2 oscila
entre el 4 y el 8 % en zonas urbanas; mientras que en las zonas rurales es menor
del 2 %. El mestizaje, el envejecimiento y los factores asociados a la urbanización
(el sobrepeso y/o el síndrome metabólico) son los principales determinantes de
la epidemia de diabetes que se observa en el país (Marenco & Lengua, 2016).
La diabetes se encuentra entre las primeras cinco causas de muerte en Colombia
y su morbilidad también es considerablemente alta (Aschner, 2010).
La medicina alopática atribuye como causa fundamental de la Diabetes mellitus
a la hiperglucemia crónica, ya sea por una baja secreción de insulina, por el
deterioro en la actividad de esta hormona o bien, como resultado de ambos
factores. No obstante, el perfil fisiopatológico metabólico completo de esta
enfermedad va más allá de la hiperglucemia. De esta forma, la ciencia médica
sostiene que el control y la regulación de la glucosa en el organismo dependen
sustancialmente de la interacción entre las hormonas pancreáticas glucagón e
insulina secretadas por las células α y β, respectivamente, pero con acción
antagónica, mientras que el glucagón aumenta los niveles de glucosa sanguínea
la insulina los disminuye al ayudar a ingresar esta molécula al interior de las
células (Reyes & Plancarte, 2008).
Consecuentes con sus principios básicos, la medicina alópata justifica el
tratamiento fundamental del padecimiento con el suministro a los pacientes de
sustancias químicas que se oponen a su manifestación, es decir, utilizando
productos que suplan las deficiencias absolutas de insulina (diabetes tipo 1), que
disminuyan la resistencia a la insulina (diabetes tipo 2) o que incrementen su
actividad (diabetes gestacional), entre otros (Kerner & Brückel, 2014). En
cualquier caso, el control de la concentración plasmática de glucosa es vital para
28
disminuir la incidencia y la gravedad de las complicaciones diabéticas a largo
plazo. Sin embargo, debe reconocerse que las terapias con fármacos, solos o en
combinación, no logran restaurar totalmente la homeóstasis normal de la glucosa
en sangre, y existen muchas limitaciones en su uso (Gray & Flatt, 1997).
Una alternativa a estos tratamientos podría ofrecerse a través del uso de
productos naturales vegetales capaces de regular algunos de los mecanismos
fisiológicos del metabolito, buscando con ello atacar el origen del trastorno. En
este propósito, varios métodos in vivo son aplicados para analizar la actividad
antidiabética de plantas, pero los estudios in vitro son escasos. En este sentido,
un importante trabajo fue realizado por Gallagher, Flatt, Duffy, & Abdel-Wahad
(2003). Estos investigadores cimentaron su criterio en que las plantas
representan una vasta fuente de suplementos dietéticos potencialmente útiles
para mejorar el control de la glucosa en sangre y prevenir complicaciones a largo
plazo en la diabetes mellitus tipo 2.
2.2.3 Actividad antiradicalaria y antioxidante (In vitro): En lo referente a los
procedimientos aplicados para evaluar la funcionalidad antiradical y/o
antioxidante debe advertirse que los métodos de determinación in vitro han
recibido fuertes críticos por su limitado acercamiento a la fisiología de los
organismos vivos. Lo ideal sería medir la actividad antioxidante de cada
componente de la muestra por separado; sin embargo, y sobre todo en el caso
de muestras naturales, es muy difícil determinar el número y concentración de
los compuestos antioxidantes presentes en ella. Así, en los métodos in vitro, lo
que se evalúa realmente es el efecto antioxidante ya que, dependiendo del tipo
de constituyentes, de su cantidad en la muestra y del método aplicado se
evidenciará la capacidad antioxidante de ésta. La complejidad de los procesos
de oxidación hace necesario utilizar un conjunto de métodos que refleje de forma
completa el perfil antioxidante. Lo que a su vez facilita la comparación e
interpretación de resultados.
29
En lo que tiene que ver con las medidas de la actividad antiradicalaria
y/antioxidante se pueden realizar mediante dos estrategias distintas:
El radical se forma en ausencia de la muestra y así, cuando se añade la
sustancia antioxidante se produce un descenso de la señal debido a la
disminución de la concentración del radical. Es el caso del 2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl (DPPH•+) y del 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-
sulphonic acid) (ABTS•+).
La presencia de radicales libres produce la pérdida o aparición de un
reactivo, en consecuencia, en presencia de un antioxidante se provoca el
aumento o disminución de la señal, por ejemplo, en ORAC (Oxigen
Radical Absorbance Capacity) y FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant
Power).
De esta forma, es justificable únicamente comparar resultados entre métodos
con fundamentación similar.
DPPH•* es un radical estable, centrado en nitrógeno, que dista mucho de
parecerse a las especies reactivas de importancia biológica. En
consecuencia, muchos antioxidantes que reaccionan rápidamente con
radicales peroxilo no lo hacen así
con DPPH•, debido al impedimento
estérico que representa la
estructura química que rodea al
radical, lo cual hace que sustancias
pequeñas generalmente muestren
una mayor actividad (Chang, Yang,
Wen & Chern, 2002). Lo que, a su
vez, dificulta la correlación directa
de los resultados obtenidos en esta metodología con el contenido de
compuestos fenólicos.
30
ABTS también es un radical artificial que no
mimetiza bien la situación in vivo; presenta la ventaja
de que el sitio radical es plano, que presenta
estructuras resonantes (deslocalización del electrón
desapareado en el sitio radical y mayor estabilidad
radicalaria) y que este ensayo puede realizarse
tanto en muestras hidrosolubles como liposolubles, eligiendo el disolvente
apropiado en cada caso.
El ABTS puede ser reducido por compuestos que tengan un potencial
redox menor que el suyo (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical
muchos compuestos fenólicos con un potencial más bajo (Kuskoski,
Asuero, Troncoso, Mancini-Filho & Fett, 2005).
En el método FRAP se determina la capacidad antioxidante que tiene una
sustancia para reducir el Fe+3 a
Fe+2 que es menos antioxidante.
El complejo férrico-2,4,6-tripiridil-
s-triazina (TPTZ) incoloro es
reducido al complejo ferroso
coloreado. Así, cuanto más
antioxidante es la sustancia bajo estudio, entonces mayor es la reducción,
mayor la cantidad de Fe+3 reducido, y más alto el valor de la respuesta
obtenida.
El complejo Fe+3-TPTZ puede ser reducido por productos con potenciales
redox menores a su potencial redox 0.7 V (García, De la Rosa, Herrera,
González, López, González & Álvarez, 2011).
Debido a que el potencial redox del complejo Fe+3-TPTZ es comparable
con el del ABTS (0.68 V) se pueden analizar compuestos similares con
ambos métodos, aunque las condiciones de la reacción sean distintas.
31
Sin embargo, Floegel, Kim, Chung, Koo & Chun (2011) compararon los
métodos DPPH y ABTS para evaluar la actividad antioxidante en
alimentos; observaron una elevada correlación de actividad antioxidante
entre ambos.
En el método ORAC el radical artificial AAPH (2,2’ azobis-(2-
aminopropano-2-dihidrocloruro, generador
de radicales libres) oxida a la fluoresceína
de forma que esta pierde su fluorescencia.
De esta forma, las sustancias antioxidantes
presentes en el extracto obtenido a partir de
la muestra disminuirían dicha pérdida de
fluorescencia (Medina, 2010). La capacidad antioxidante de una muestra
es la diferencia entre el área bajo la curva (AUC) de la muestra y el blanco.
2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)
A través de análisis electroquímico por voltametría cíclica (electrodo
referencia Ag/AgCl), se encontró que los polifenoles sintéticos presentan
un potencial de oxidación entre 0,156 y 0,638 V, donde la quercetina tiene
el menor valor.
Los compuestos polifenólicos con muy bajo potencial de oxidación (entre
0,14 y 0,15 V), revelan una buena actividad antioxidante.
Fluoresceina La fluorescencia es asociada con la presencia de un puente de oxígeno (lactona)
32
Los antioxidantes fenólicos poseen una característica privilegiada, pues
son excelentes donadores de electrones o de hidrógeno y, además, sus
radicales intermediarios son relativamente estables (Muedas, La Rosa &
Robles, 2008).
Fukushima, Ohie, Yonekawa, Yonemoto, Aizawa, Mori, Watanabe,
Takeuchi, Hasegawa, Taguchi & Kondo (2009) estudiaron las posibles
correlaciones entre parámetros de capacidad antioxidante (DPPH y
potencial redox) y el contenido de polifenoles de muestras de café y
observaron una elevada y significativa corre lación entre ambos
parámetros y los compuestos del café tostado, sugiriendo la importante
contribución del contenido de polifenoles a la capacidad antioxidante en
esta matriz.
La determinación del contenido total de compuestos fenólicos, utilizando
el método originalmente propuesto por Folin & Ciocalteu en 1927,
modificado por Singleton & Rossi (1965), no es considerada en sí misma
una metodología para medir actividad antioxidante, a pesar de que su
principio se basa en la capacidad redox de los polifenoles. Sin embargo,
la alta correlación de los resultados con otros métodos ha hecho que esta
determinación se popularice como una herramienta simple y rápida para
predecir actividad antioxidante, principalmente en matrices complejas,
donde la cantidad de compuestos fenólicos, más que la composición
específica de estas sustancias, determina la actividad antioxidante
(García-Cruz, Salinas-Moreno & Valle-Guadarrama, 2012).
33
3. MATERIALES Y METODOS
3.1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
Se trabajó con cáscara y semilla de frutos de P. vitifolia provenientes de plantas
colectadas en el jardín botánico Alejandro von Humboldt, Universidad del Tolima,
Ibagué (N 4° 15' a N 4° 40', y W 75° 00' a 75° 30; 1285 m.s.n.m.; temperatura
media 27 °C; 1620 mm de precipitación promedio/año). Separadamente se
colectó un ejemplar completo (flores, hojas y frutos) para la determinación
taxonómica en el Herbario Nacional de Colombia, así como frutos enteros
maduros para la realización de las pruebas físicas, químicas y biológicas.
3.2 ENSAYOS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
3.2.1. Análisis morfométrico del fruto completo, cáscara y semillas: se
seleccionaron frutos sanos, maduros y de plantas espaciadas a una distancia
mayor de 10 m para evitar el efecto de coancestría (probabilidad de que dos
alelos tomados al azar en dos individuos sean idénticos por descendencia)
(Castro, 2002). De cada planta se colectaron 3 frutos al azar. A los frutos
completos (n=30) se les determinó el peso, % de parte comestible, el diámetro
longitudinal y diámetro transversal. Se calculó el peso promedio de las semillas,
tomando 10 de cada fruto, el largo y el ancho de las semillas, número de
semillas/fruto, % de semillas, color visual y espectroscópico. En la cáscara se
estableció el peso, espesor, % de cáscara, color visual y espectroscópico. En el
zumo del fruto se evaluó el color espectroscópico, características físicas y físico-
químicas (densidad, índice de refracción, viscosidad, pH, acidez titulable,
contenido de ácido ascórbico, fenoles totales, mineralógico y tamizaje fitoquímico
preliminar). Se determinó la media y la variación estándar en cada caso.
34
3.2.2. Color instrumental: los parámetros de color se evaluaron usando un
espectrofotómetro de reflectancia (CM-5 Konica Minolta, Estados Unidos). La
calibración se realizó utilizando las placas de calibración en blanco y negro,
suministradas con el instrumento. Los resultados se expresaron de acuerdo con
el sistema de color CIELab (los valores de L* indican brillo/oscuridad (negro, L=0
y blanco, L=100), los valores de a* indican rojo-verdor (rojo, a*=100 y verde, a*=-
100), y los valores de b* indican amarillamiento/color azul (amarillo, b*=100 y
azul, b*=- 100). Las mediciones se tomaron a partir de frutas frescas
seleccionadas aleatoriamente en cuatro partes diferentes de una fruta y se
promediaron. La misma metodología se aplicó a semillas y zumos, con algunas
modificaciones. Los índices de color (CI) y blancura (WI) se calcularon de
acuerdo con las ecuaciones 1 y 2, respectivamente, propuestas por López,
Gómez, & Cacace (1995).
CI=𝑎∗1000
𝐿∗𝑏∗ (1)
WI= 100-[(100-L)2+a2+b2]0.5 (2)
3.2.3. Evaluación de la dureza/firmeza del fruto completo: se utilizó una sonda
cilíndrica con punzón de acero de 3 cm de longitud y 3 mm de diámetro para
perforar los frutos, utilizando un texturómetro LS1 Lloyd (AMETEK Inc, USA),
velocidad de 2,0 mm/s y compresión de 20 mm según el método de Duprat,
Grotte, Loonis & Pietri, (2000).
3.2.4. Análisis Bromatológico: Sobre el material fresco se evaluaron los
porcentajes de humedad, proteína bruta (método de Kjeldahl), grasa (método de
Soxhlet) y ceniza (600ºC), siguiendo en todos los casos las recomendaciones de
la AOAC (2012). Para la determinación de la fibra ácido detergente neutra (FDN)
y ácida (FDA) se aplicó la metodología de Van Soest, Robertson & Lewis (1991).
El contenido de minerales, mayores y menores, se cuantificó por
espectrofotometría de absorción atómica (Thermo Scientific iCE 3000 Series AA,
35
USA). La cuantificación de fósforo, boro y azufre se determinó por
espectrofotometría UV-Visible (Thermo Scientific Evolution 600, USA).
3.2.5. Preparación de extractos: a partir de las cáscaras y semillas secas (Estufa
a 42 °C, 3 días) y trituradas se prepararon por separado extractos hexánicos en
un equipo soxhlet (6 h). Una parte del marco hexánico (50%), totalmente retirado
de residuos del solvente fue tratado por percolación con etanol al 96% y la
restante con acetato de etilo. Las determinaciones analíticas se efectuaron sobre
el extracto hexánico (baja polaridad), el de acetato de etilo (mediana polaridad)
y el etanólico (alta polaridad). Los extractos se secaron a presión reducida en un
rotavapor (BÛCHI R114, Suiza) y se almacenaron (4 °C) en frascos ámbar
protegidos de la luz hasta su análisis.
3.2.6. Pruebas físicas: a los extractos etanólicos y de acetato de etilo obtenidos
se les evaluó el rendimiento y algunos parámetros físicos como densidad, índice
de refracción, acidez titulable y pHmétrica (AOAC, 2012). El conocimiento de los
extractos se complementó mediante una caracterización fitoquímica, en la
búsqueda de los principales núcleos de metabólicos secundarios presentes en
ellos (Pharmacognosie & Phytochimie,1993).
3.2.7. Análisis Fitoquímico Preliminar: en los extractos crudos y el zumo extraído
de la fruta se evaluó la presencia o ausencia de fitoconstituyentes tales como
esteroles (prueba Lieberman-Burchard), triterpenos (prueba Salkouwski), taninos
(pruebas de gelatina y cloruro férrico), saponinas (Rosenthaler y espuma),
fenoles (reactivo de Folin-Ciocalteu), flavonoides (ensayo de Shinoda y reacción
con hidróxido sódico), alcaloides (pruebas Dragendorff, Mayer, Tanred y Valser),
antocianinas (reactivo hidróxido sódico 2N), antraquinonas (reactivo de
Borntrager), carbohidratos totales, (reactivo de Molisch) y carbohidratos
reductores (reactivo de Benedict), con referencia a la técnica descrita por
Pharmacognosie & Phytochimie (1993).
36
3.2.8. Perfil químico de extractos etanólicos de cáscara y semilla: las muestras
de zumo liofilizado y los extractos etanólicos (0,25 g), se extrajeron primero con
5 ml de metanol/agua (50:50) (acidificado al 0,1% v/v con ácido acético) y luego
dos veces con 5 ml de acetona: Agua (70:30) en un baño de ultrasonidos durante
30 min. Se reunieron las soluciones extraídas, se diluyeron relación 1:4 con agua
Milli-Q acidificada (0,1%, v/v con ácido acético) y se filtraron a través de filtros de
politetrafluoretileno (PTFE). Las soluciones se mantuvieron a 6 °C hasta análisis
HPLC-UV. Todos los disolventes contenían ácido ascórbico (0,2% p/v).
3.2.9. Parámetros HPLC-UV: el análisis de cromatografía líquida de alto
rendimiento se realizó en un sistema de módulos de separación Waters Alliance
2695, acoplado a un detector de absorbancia de doble canal (320 y 280 nm).
Los compuestos se separaron con una columna Waters Atlantis dC18 (5 μm, 2,1
mm 150 mm) y utilizando un sistema de gradiente con la fase móvil consistente
en disolvente A, H2O (0,1% v/v ácido fórmico) y disolvente B, Metanol 100 % 0,1
% v/v de ácido acético). El flujo fue de 0,500 ml/min. El gradiente lineal fue el
siguiente: 0-0,5 min, 10 % de B (isocrático); 1,89-17,84 min, 30 % de B, (gradiente
lineal); 0,5-15 min, 30 % de B, (gradiente lineal); 15-25 min, 60 % de B, (gradiente
lineal); 25-35 min, 80 % de B, (gradiente lineal); 35-40 min, 10 % de B, (gradiente
lineal); y 40-45 min, 10 % de B, (isocrático). La inyección fue de 10 μL y la
columna se mantuvo a 30 °C, mientras que la temperatura se mantuvo a 10 °C.
La presión máxima promedio en el sistema cromatográfico fue 16,55x106 Pa.
La identificación de los compuestos fenólicos en las muestras se basó en
estándares disponibles y en revisión de literatura para identificar el número
máximo de picos (Delpino-Rius, Eras, Vilaró, Cubero, Balcells & Canela-
Garayoa, 2015).
Para cuantificar, las curvas de calibración se construyeron representando
gráficamente las áreas de los picos cromatográficos medidas a las longitudes de
onda específicas de las siguientes normas químicas: 284 nm para 5-
37
hydroxymethyl-furfural (HMF); 320 nm para ácidos hidroxicinámicos; 283 nm
para flavanonas; 285 nm para dihidrocalcona; y 340 nm – 350 nm para flavonoles
(apigenina, isorhamnetina, kaempferol y quercetina glicosidos). Los valores de
fluorescencia para flavan-3-ols se midieron a 310 nm (ex=280). Para los
compuestos para los que no se disponía de patrones, se realizó la cuantificación
con una curva lineal (mmol/L) de un patrón con la misma aglicona (parte
cromófora) a través de la correspondiente corrección al peso molecular. Las
áreas cromatográficas de los compuestos fenólicos presentes en las muestras,
medidas a su longitud de onda específica, se utilizaron para cuantificar por
interpolación (Delpino-Rius, Eras, Vilaró, Cubero, Balcells & Canela-Garayoa,
2015)
3.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
Se valoró la capacidad estabilizante de los radicales ABTS (González, Marquina,
Rondón, Rodríguez-Malaver & Reyes, 2008) y DPPH (Braca, Sortino, Politi,
Morelli & Mendez, 2002) de los extractos de acetato de etilo y etanol (0,97-500
mg/L) efectuando en ambos casos modificaciones en los volúmenes para su
adaptación a microplacas. Para la preparación de la curva de calibración se
utilizó ácido ascórbico a digetentes concentraciones (0,3125 - 5 mg/L) el cual se
sometió a las mismas condiciones de ensayo. El porcentaje de estabilización se
calculó según la ecuación 3:
% Inhibición =(Abs C− Abs M)
Abs C x 100 (3)
Donde:
Abs C = absorbancia del radical sin agente inhibidor de su actividad.
Abs M= absorbancia de las muestras + el radical
Capacidad reductora: la potencialidad antioxidante de los extractos se
complementó mediante la determinación del poder reductor férrico, FRAP
(Berker, Güçlü, Tor & Apak, 2007), y la capacidad estabilizadora de radicales
oxígenos, ORAC, por su nombre en inglés (Ou, Hampsch-Woodill & Prior, 2001).
Cabe advertir que ambas determinaciones fueron aplicadas sólo a los extractos
38
etanólicos (10000 mg/L). Varias consideraciones justifican, al menos en parte, la
exclusión del extracto de acetato de etilo en estas dos evaluaciones: 1) la baja
solubilidad del extracto en los reactivos de los ensayos en cuestión. 2)
dificultades para encontrar un antiemulsionante adecuado que disminuyera la
tensión superficial entre las fases. La prospección antioxidante de la cáscara y
las semillas de P. vitifolia se enriqueció evaluando el contenido de fenoles totales
(Makkar, 2003) en los extractos etanólicos y de acetato de etilo.
Actividad Antihemolítica: Previo a la determinación analítica se preparó la
suspensión de eritrocitos a partir de un donante voluntario sano, no fumador, no
consumidor habitual de bebidas alcohólicas, con previa lectura y firma del
consentimiento informado.
Siguiendo la metodología de Durán, Montero & Marrugo (2013), se obtuvo por
venopunción 4 mL de sangre periférica citrada, la cual se centrifugó a 3000 rpm
durante 10 minutos para separar el plasma y los leucocitos de los eritrocitos. El
pellet de eritrocitos obtenido fue resuspendido en igual volumen de buffer fosfato
salino (PBS) pH 7.4, se hicieron tres lavados, centrifugando a 3000 rpm durante
10 minutos a 4 °C. Finalmente, los eritrocitos se resuspendieron al 5 % en (PBS)
pH 7.4.
La actividad antihemolítica se evaluó de acuerdo cpn lo descrito por Aguillón,
Maldonado, Loango, Arango & Landázuri (2013). Se tomaron 250 μl de
suspensión de eritrocitos, a los que se agregaron 300 μl de H2O2 (concentración
final de 0,5 M) y se adicionaron a 950 μl de las muestras (extractos etanólicos y
de acetato de etilo), para una concentración final de 50, 100 y 200 μg/ml en PBS.
Como control se utilizó Butil hidroxitolueno (BHT) diluido en etanol y
posteriormente en PBS para preparar soluciones a 50, 100 y 200 μg/ml. Las
muestras se mantuvieron en incubadora a 37 °C durante 1 hora, posteriormente
se centrifugaron a 3000 rpm (10 min), se tomaron los sobrenadantes y se leyeron
en el lector de microplacas Thermo Scientific Multiskan GO a una longitud de
39
onda de 560 nm. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. El porcentaje
de inhibición de hemólisis se calculó usando la ecuación 4.
% Inhibición hemólisis =(Abs C− Abs M)
Abs C x 100 (4)
Donde:
Abs C: es la absorbancia del control negativo (eritrocitos y H2O2)
Abs M: es la absorbancia de la muestra (extractos o BHT)
3.4. ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO
La hiperglicemia ha sido asociada al estrés oxidativo; con esta idea en mente en
este trabajo se implementaron dos metodologías in vitro: inhibición de la α-
amilasa e inhibición de difusión de glucosa, para evaluar la actividad
antihiperglucemiante de P. vitifolia. Estas evaluaciones se aplicaron a los
extractos etanólicos y de acetato de etilo provenientes de semillas y cáscara.
3.4.1 Inhibición de α-amilasa: el método aplicado para medir la actividad
inhibitoria de α-amilasa fue el propuesto por Bernfeld (1951). La acarbosa
(obtenida de Sigma) se utilizó como control positivo de la inhibición enzimática
(50-200 mg/L). Para la reacción se mezcló 500 μL de almidón al 1% con 100 μL
de los extractos de acetato de etilo y etanol a diferentes concentraciones (100-
800 mg/L), posteriormente se agregó 100 μL de la enzima α-amilasa Sigma-
A6255 factor de dilución 1/10 en buffer Tris-HCl (0.05M, pH 6.9) que contiene
CaCl2 0.01M. La reacción se incubó a 40 °C por 10 min y finalmente se adicionó
500 μL de DNS y se llevó a 100 °C en el baño de maría durante 5 min.
Inmediatamente se pusó a baño de hielo para detener la reacción, finalmente se
agregó 5 mL de agua destilada y se leyó a 540 nm en un espectrofotómetro
Thermo Scientific Multiskan GO. (Miller, 1959).
40
Los resultados de la inhibición de α-amilasa se expresaron en términos de
porcentaje de inhibición. Siguiendo la ecuación 5
% Inhibición = Abs Control−(Abs muestra−Abs blanco muestra)
Abs Control× 100
(5)
Donde:
Abs control: corresponde a la actividad total de la enzima durante 10 minutos sin
inhibidor (el volumen del inhibidor se reemplaza por buffer Tris- HCl).
Abs muestra: corresponde a la absorbancia obtenida como resultado de la
actividad enzimática sobre los extractos o bien sobre el control positivo
(acarbosa)
Abs blanco muestra: corresponde a la absorbancia del extracto crudo obtenida
en la cuantificación de sus azúcares reductores sin adicionar la enzima.
Se realizó una curva de calibración con glucosa soluble (0,1-4,0 mg/L).
3.4.2. Inhibición de difusión de glucosa: Gallagher, Flatt, Duffy, & Abdel-Wahad,
(2003) propusieron un modelo simple para medir la difusión de la glucosa a través
de una membrana dialítica. Consiste en medir los efectos causados por los
extractos de origen vegetal sobre el transporte activo de los constituyentes
celulares, por ejemplo, la glucosa, a través de una membrana de diálisis. Esto
modelo simula la absorción de glucosa en el intestino delgado. La metodología
aplicada fue propuesta por Gallagher et al. (2003), con algunas modificaciones
en cuanto a la cuantificación de azúcares reductores, la cual se realizó según la
metodología de DNS propuesta por Miller (1959). Se evaluaron los extractos de
acetato de etilo y etanol a (10000 mg/L). La absorbancia se midió a 540-nm. Los
resultados de inhibición se expresaron aplicando la ecuación 6.
% Inhibición= Abs control− Abs muestra
abs control*100 (6)
Donde:
Control: corresponde a la concentración de glucosa adicionada en el interior de
la membrana, más la concentración de azucares reductores determinado para
41
cada extracto. Se realizó una recta de calibrado con glucosa soluble (125-2000
mg/L).
3.5 EXTRACCIÓN Y COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL ACEITE DE P.
vitifolia.
3.5.1. Extracción de aceite: las cáscaras y semillas se separaron manualmente,
se lavaron ligeramente con agua destilada, se secaron a temperatura ambiente
durante aproximadamente dos semanas y se pulverizaron usando un molino
doméstico. Las cáscaras y semillas pulverizadas (200 g) se extrajeron
separadamente con n-hexano en un extractor soxhlet (6 h). Después de la
extracción, el disolvente se evaporó a presión reducida en un rotavapor a 60 °C
(BÛCHI R114, Suiza). Los aceites obtenidos se protegieron con nitrógeno
gaseoso, se sellaron y se almacenaron en frascos de vidrio ámbar (-80 °C,
Freezer Kaltis prime 390).
3.5.2. Metilación de ácidos grasos del aceite de semilla: La metilación de ácidos
grasos a partir de semillas secas se realizó siguiendo la metodología propuesta
por Tomás et al. (2009). Se añadió la muestra (0,5 g), 20 μl de solución de patrón
interno (heptadecanoato de metilo), 0,5 ml de metanol saturado con nitrógeno,
0,5 ml de clorotrimetilsilano y 1 mg de 2,6-di-t-butil-4-metilfenol, se sometieron a
vortex y se colocaron en el reactor de microondas monomodo a 90 ° C. Después
de enfriar, se añadieron 2 ml de una solución de hexano: éter dietílico 1: 1,
posteriormente se sometió a vortex. La mezcla se neutralizó con bicarbonato
sódico sólido y solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. La fase
superior se recuperó y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro.
3.5.3. Parámetros de cromatografía de gases: los ésteres metílicos se
determinaron utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 6890 con un detector
de ionización de llama (Agilent Technologies España, S.L., Las Rozas, España).
La columna capilar de sílice fundida (30 m x 0,25 mm) se recubrió con una
42
película de 0,25 μm de (50% de cianopropil) metilpolisiloxano DB-23 (J & W
Agilent, Madrid España). La temperatura del horno se programó a 150 ° C
durante 1 min, aumentó a 180 ° C a 25 ° C / min, a 220 ° C a 5 ° C / min y se
mantuvo a 230 ° C durante 2 min. Se utilizó una proporción de inyección dividida
1:20. Se utilizó hidrógeno como el gas portador a un caudal constante de 2 ml /
min. El volumen de inyección fue de 1 μl. El sistema de inyección y las
temperaturas del detector de ionización de llama fueron de 250 ° C. La cantidad
absoluta de cada ácido graso en la muestra se calculó mediante la siguiente
ecuación:
mi (mg)/mmuestra (g) =Ai
Ais 𝑥
mis (mg)
𝑅𝑓 𝑥
𝑓stoich
𝑚muestra (g)
Donde Ai es el área cromatográfica del éster metílico de ácido graso, Ais es el
área cromatográfica del patrón interno, mis es la masa del patrón interno, Rf es
el factor de respuesta de cada éster metílico de ácido graso al patrón interno,
fstoich es la corrección estequiométrica para transformar cada concentración de
éster metílico de ácidos grasos en concentración de ácidos grasos, y la masa de
muestra. Los factores de respuesta de ésteres metílicos de ácidos grasos
comercialmente disponibles se calcularon utilizando las mismas condiciones
cromatográficas y en concentración conocida mediante la siguiente ecuación:
Rf = Ai
Ais 𝑥
mis
mi
Los compuestos individuales se identificaron comparando sus tiempos de
retención con los de muestras auténticas y los datos disponibles en la biblioteca
y literatura NIST05 (Adams, 1989; Adams, 2001).
3.5.4. Análisis físico-químico del aceite de cáscara y semilla de P. vitifolia: Los
índices de refracción (27 ºC), saponificación (mg KOH/g), yodo (g I2/100 g),
acidez (mg KOH/g) peróxido (meq peróxido/Kg), se determinaron siguiendo las
metodología planteadas en AOAC (2012).
43
3.6 REACTIVOS
Todos los reactivos químicos implementados en este estudio fueron de alta
pureza. Alfa amilasa, DPPH, ABTS y persulfato de potasio y los utilizados en el
análisis de HPLC y CG fueron adquiridos de Sigma–Aldrich Corp. (St. Louis, MO,
USA).
3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se aplicaron las herramientas estadísticas adecuadas para cada prueba. Los
resultados mostrados son la media de tres (n=3) determinaciones realizadas en
cada ensayo aplicado ± La desviación estándar (DE). La comparación entre
medias de los diferentes grupos en todas las pruebas experimentales se realizó
mediante un análisis de varianza y el Test de Tukey para detectar las diferencias
entre las medias, con un 95% de confianza. Todo el procesamiento se realizó
con los paquetes estadísticos GraphPad Prims versión 6.01 y Statgraphics
Centurion XVI.I.
44
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE FRUTO COMPLETO, CÁSCARA Y
SEMILLA DE P. vitifolia
La planta de interés en este trabajo fue identificada en el Herbario Nacional de
Colombia con el nombre de Passiflora vitifolia Kunth (Nº COL 592024). El nombre
P. vitifolia del latín passio + flora; vitifolia significa "con hojas similares al género
Vitis". Comúnmente se le conoce en diferentes regiones como “pasiflora
perfumada”, “granadilla de monte”, “granadilla de quijo” y “güillita. La Tabla 2
presenta algunas características físicas del fruto completo en comparación a la
cáscara y la semilla.
Tabla 2. Caracterización física del fruto completo, cáscara y semilla de P. vitifolia
Parámetro
Constituyente
Fruto
Completo Cáscara Semilla
Forma
Ovoide
Ovoide
Elíptica
Margen: estriado
Ápice: sin cuerno
Base: obtusa
Ornamentación:
retículo alveolada
(Pérez-Cortéz et
al., 2002).
Color
(visual)
El color varía
de verde a café
oscuro con
manchas
blancas.
En estado inmaduro el
epicarpio es liso, verde con
manchas blancas; con el
avance de la madurez la
coloración del epicarpio
varía desde ligeramente
amarilla hasta café oscuro.
Café oscuro
45
Parámetro
Constituyente
Fruto
Completo Cáscara Semilla
Color
Instrumental
L*
a*
b*
55,5 ± 2,48
–3,80 ± 1,51
28.5 ± 1,82
55,5 ± 2,48
–3,80 ± 1,52
28,5 ± 1,82
28,8±0,01
0,99±0,03
7,354±0,01
Índice de Color -2,63±0,17 -2,63±0,17 4,67±0,16
Índice de Blancura 42,12±2,93 42,12±2,93 28,41±0,01
Tamaño
Longitud:
6-7 cm
diámetro:
4-5 cm
Grosor:
58 mm ± 0,09
longitud:
0,70 cm ±0,05
diámetro:
0,45 cm ±0,04
Relación longitud/
diámetro
1:2 NA 1:2
Peso promedio (g)
(n=30)
74,46 ±15,03 34,96±9,75
0,0247 ± 0,02
Porcentaje de parte
comestible (pulpa),
cáscara y semilla (%)
Pulpa
48,81±8,02
18,30±6,03 32,90±7,57
Relación
pulpa/semilla (%)
1:2 N.A. N.A.
Dureza(N) 17,79 ± 0,87 N.A. N.A.
Número de semillas
por fruto (n=10)
240- 330
embebidas en
pulpa
N.A. N.A.
N.A.: no aplica.
P. vitifolia es una Passiflora con hermosas flores escarlatas o rojo bermellón. La
fruta es muy amarga cuando cae de la planta y puede tomar un mes para madurar
completamente, en donde adquiere un sabor de fresas amargas. Debido a la
belleza de sus flores y fragancia de sus frutos se le encuentra cultivada a
pequeña escala en el Caribe (Young, 1980). En general, el color se deriva de los
pigmentos naturales en frutas y verduras, muchos de los cuales cambian a
medida que la planta avanza a través de la maduración, pero esto no es evidente
en esta especie lo que dificulta observar el proceso de maduración. Visualmente
se aprecia un fruto verde con manchas blancas cuando está inmaduro (figura
46
2a), con un contenido de semilla de 240-330/fruto embebidas en la pulpa, la parte
comestible se encuentra cubierta por un pericarpio duro y coriáceo. Con el
avance de la madurez la coloración del epicarpo varía de amarillo ligeramente a
marrón oscuro que se va arrugando lentamente (figura 2b), lo que se explica por
las reacciones de pardeamiento enzimático y no enzimático que pueden dar lugar
a la formación de pigmentos de color marrón, gris y negro, acompañado con la
pérdida de agua. Las enzimas implicadas en las reacciones de maduración
incluyen la polifenol oxidasa, que cataliza la oxidación de compuestos
polifenólicos, que prevalecen en el fruto (Artés, Castañer & Gil, 1998).
El tamaño y la forma de un fruto pueden estar influenciados por el cultivar, la
madurez, los insumos de producción y el ambiente en crecimiento. Por su parte,
la apariencia de un fruto está determinada por factores físicos incluyendo el color,
el tamaño, la forma, la tonalidad, la presencia de defectos (manchas, moretones,
hendiduras, etc.) y la consistencia, muchos de los cuales cambian a medida que
la planta avanza a través de la maduración.
Fuente: autor
Muchas especies de Passiflora han sido clasificadas taxonómicamente con base
en rasgos vegetativos y de morfología floral; además, se podrían utilizar las
Figura 2. Color y aspecto de los frutos de P. vitifolia en estado verde (a) y con el
progreso de la madurez (b).
47
características superficiales (apariencia) de la semilla, ya que son poco afectadas
por las condiciones ambientales, por lo que reflejarían el genoma de las plantas
y, por tanto, las relaciones filogenéticas entre ellas (Tillett, 1988; Pérez-Cortéz,
Escala & Tillett, 2002). El perfil morfológico permite apreciar en la fruta de P.
vitifolia que la semilla conserva la forma del fruto, tiene una superficie de reticulo-
alveolado sin surcos cruzados, ápice sin cuernos y margen estriado, relación
longitud-espesor (1:2).
Para la fruta fresca, se obtuvieron los valores y desviaciones estándar para los
parámetros de color que muestra la Tabla 2. Puesto que el parámetro L* mostró
la mayor variación de la fruta fresca, mientras que el parámetro a* reveló el
menor, el valor a* es mucho más representativo del color que el valor L*. En la
semilla, a diferencia de la cáscara, el valor L* indica una tendencia hacia los
colores marrón, gris y negro, que coincide con la apariencia visual de la semilla
(Tabla 2).
La determinación visual y espectroscópica del color de cáscara y semilla se
confirmó a través de los índices de color y blancura. Sin olvidar que los
consumidores evalúan primero la apariencia visual y el color, resultando así que
el color determina en muchos casos si el producto es aceptado o rechazado. Así
las cosas, el índice de color es utilizado para determinar fechas de cosecha o
decidir si el fruto podría sufrir deterioro por tratamientos tecnológicos. El índice
de blancura es una medida estrechamente relacionada con las preferencias de
los consumidores por el color del producto; matemáticamente combina en un solo
término luminosidad y tendencia hacia la tonalidad amarillo-azul. Los datos
obtenidos para el índice de color y blancura fueron: -2,63 y 42,12; 4,67 y 28,41
de la cáscara y la semilla, respectivamente. Como se ve, los valores confirman
lo mostrado en la figura 2a y 2b, así como la coloración visual descrita y los
valores del color espectroscópico consignados en la Tabla 2.
48
En general, el color de frutos y vegetales es derivado de los pigmentos naturales.
Estos pigmentos primarios son las clorofilas solubles en grasa (verde), los
carotenoides (amarillo, naranja y rojo) y las antocianinas solubles en agua (rojo,
azul), flavonoides (amarillo) y betalainas (rojo). Además, las reacciones de
pardeamiento enzimático y no enzimático pueden dar lugar a la formación de
pigmentos de color marrón, gris y negro (Barrett, Beaulieu & Shewfelt, 2010).
La dureza del fruto (17,79 N) estaría asociada con el espesor de la cáscara (58
mm), este valor es superior al de otras Passifloras; por ejemplo, los frutos de P.
edulis f. flavicarpa, maracuyá amarillo, (12,8 N y 10,29 mm) y P. ligularis,
granadilla, (14,3 N y 15 mm) para dureza y espesor, respectivamente (Espinoza,
Arreaza, Mendez, Cañizares & Buonafina, 2008; Linares, Castillo & Londoño,
2013).
La tabla 2 muestra que el peso y el tamaño de la semilla son considerablemente
menores a los correspondientes del fruto completo, lo que a su vez permite alojar
en la masa comestible un número elevado de ellas (240-330 unidades/fruto); la
abundante cantidad podría asociarse con el ofrecimiento que la planta hace a la
diversidad y tipos de organismos encargados de su dispersión (pájaros,
murciélagos, monos e insectos), garantizando así las probabilidades
reproductivas (Lanza, 1988; Smiley, 1986; Feuillet y MacDougal, 2007),
característica que se complementa con el atractivo color de las flores de la
especie de interés. Las plantas zoófilas deben llamar la atención de sus vectores
con colores y olores atrayentes. La belleza visual característicamente asociada
a las flores es el efecto de su coevolución con insectos u otros animales
polinizadores (Feuillet & MacDougal, 2007).
49
La figura 3 deja ver las características morfológicas de la semilla y las zonas
consideradas en la descripcion morfológica: el ápice y la base.
Fuente: autor
En general, la semilla es descrita como el óvulo fecundado, transformado y
maduro. Ella constituye el órgano de dispersión y perpetuación de las
angiospermas y representa la culminación de la evolución reproductiva de las
plantas; tres estructuras la conforman: el embrión, la cubierta seminal (que deriva
de los tegumentos del óvulo) y una reserva alimenticia constituída por una gran
diversidad de proteínas, carbohidratos (llevados como sacarosa vía floema) y
lípidos; lo cual hace que la composición genética sea compleja (Courtis, 2013).
Uno de los atributos comunes de las pasifloras es que las especies del género
poseen abundante cantidad de semillas, las cuales se adhieren al funículo sobre
la pared del ovario y están rodeadas por el arilo que recubre la semilla, el cual
constituye la parte comestible del fruto (Werker, 1997). Además, presentan una
cubierta con células generalmente lignificadas, la cual no solo afecta la absorción
de agua, sino que ofrece una resistencia al crecimiento del embrión (Cardozo,
1988). Las capas de las semillas de pasifloras son desarrolladas de óvulos
bitégmicos en las cuales se observa elongación celular radial desigual (Werker,
1997). El arilo se inicia de un borde meristemático continuo alrededor de la parte
Figura 3. Semillas del fruto de Passiflora vitifolia
50
distal del rafe, e incluye la región exoestomal. Los pigmentos del arilo se
encuentran en los cromoplastos (Werker, 1997).
MacDougal (1994) realizó una revisión taxonómica de la sección
Pseudodysosmia del subgénero Decaloba del género Passiflora, y entre los
caracteres utilizados en sus descripciones incluye la ornamentación de la
superficie del cuerpo seminal. Esto ha permitido considerar las especies del
género Passiflora como un excelente tema de estudio para caracterizar la
morfología de la semilla con la finalidad de evidenciar el potencial taxonómico
presente en dicha estructura para este género (Pérez-Cortéz, Escala, M., &
Tillett, 2005).
La caracterización e identificación de las semillas de una especie no sólo es
válida para estudios taxonómicos, sistemáticos, arqueológicos y de
paleobotánica, sino que además reviste singular utilidad para la evaluación de
dietas en animales silvestres; sobre esta base, agricultores y horticultores
pueden disponer de tal información para mejorar y facilitar sus actividades de
cultivo al permitirles la identificación de las especies tan sólo con la semilla (Johri
& Rao, 1984; Pérez-Cortéz, Escala, M., & Tillett, 2002). Esto es de especial
importancia cuando se trabaja con taxa como las pasifloras que agrupan gran
cantidad de especies utilizadas comercialmente en la industria ornamental,
medicinal y alimentaria (Escobar 1981; Delascio-Chitty 1985; Vanderplank 1990).
4.2 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO
El análisis bromatológico de frutas y verduras comestibles desempeña un papel
crucial en la evaluación de su importancia nutricional. El resumen de la
composición próximal (en peso seco) de cáscara y semilla de P. vitifolia se
muestra en la Tabla 3 y se ilustra a través de la figura 4. Se observa que el
contenido de humedad de los subproductos de los frutos es ligeramente diferente
en ambos componentes de la planta y menor del 50%, lo que les permitiría ser
51
reservados durante un período de tiempo más largo. A su vez, este bajo nivel de
agua dá a entender alto grado de materia seca, la cual es depositaria de los
nutrientes “mayores” (proteínas, grasas, fibra, etc) y “menores” (vitaminas y
minerales) del material vegetal.
El contenido de cenizas, que es un índice de minerales, también es ligeramente
diferente en la cáscara y las semillas (5,6; 4,0, respectivamente). Sin embargo,
se observa que los frutos de P. vitifolia tienen un contenido de proteína bruta dos
veces mayor en las semillas (15,5) que en la cáscara (6,6); también, el nivel de
grasa cruda en las semillas (25,6 ± 1,30) excede cinco veces a la cáscara (5,7),
mientras que la fibra cruda en las semillas (2,8) fue considerablemene menor que
en la cáscara (11,4). Este valor elevado de fibra en la cáscara explicaría la dureza
y consistencia del fruto de P. vitifolia (Tabla 2). Esta fibra insoluble está
compuesta de celulosa y lignina (insolubles en agua y en solventes comunes),
las que provienen principalmente de las paredes celulares primarias y
secundarias de la cáscara.
Las fibras obtenidas a partir de frutas resultan de mayor calidad debido a que
presentan una composición más equilibrada, menor contenido catiónico y de
ácido fítico, mayor capacidad de retención de agua y aceite, así como una mayor
fermentabilidad colónica, necesaria para la digestión y para la eliminación de
desechos (Larrauri, José, Saura & Fulgencio, 1999).
Tabla 3. Evaluación bromatológica de cáscaras y semillas de P. vitifolia (%)
Constituyente Humedad Ceniza Proteína
cruda
Grasa
bruta
Fibra
bruta Carbohidratos
Cáscara 36,7
±0,10 5,6±0,22 6,6±0,90 5,7±1,70 11,4±1,34 34.0±1,1
Semilla 33,8±0,35 4,0±0,12 15,5±0,60 25,6±1,30 2,8±0,34 18,4±0.7
*Diferencias significativas (p<0.05)
52
Figura 4. Analisis bromatológico de cáscara y semilla de P. vitifolia
Fuente: autor
La composición proximal de algunas especies de pasifloras es ampliamente
conocidas. Por ejemplo, se ha reportado que las semillas de P. incarnata (Liu,
Yang, Li, Zhang, Ji y Hong, 2008), tienen una cantidad de proteína (10,80%), son
ricas en aceites (23,40%) y fibra cruda (17,48%). En tanto que en Passiflora
edulis f. flavicarpa (maracuyá amarillo), el porcentaje de proteínas fue encontrado
en 12,23%, el contenido de lípidos del 30,39%, y el porcentaje de carbohidratos
y fibra del 48,73% (Malacrida & Jorge, 2012). En un trabajo realizado en
Colombia, se encontró que el fruto de la curuba larga, P. mollisima, del municipio
de Sonsón (Antioquia) mostraba: un contenido de humedad 77,93%, cenizas
0,55%, proteína total 0,36% (Chaparro-Rojas, Maldonado, Franco-Londoño &
Urango-Marchena, 2014). Estos últimos resultados dan a entender que el mayor
contenido de nutrientes en estas pasifloráceas se haya en la semilla.
4.2.1. Análisis de minerales de la cáscara y semilla de P. vitifolia: el cuerpo
humano requiere de minerales para mantener una buena salud. Una serie de
minerales esenciales para la nutrición humana se acumulan en diferentes partes
de las plantas (Liu, Yang, Li, Zhang, Ji y Hong, 2008). Los resultados de la
53
composición de los elementos minerales de las semillas de P. vitifolia se
presentan en la Tabla 4.
Tabla 4. Contenido en elementos minerales de cáscaras, semillas y zumo de P.
vitifolia (mg/g de materia seca).
Elementos minerales Semilla Cáscara Zumo
Potasio 0,500 6,200 1,830
Sodio 1,100 0,500 0,110
Calcio 1,300 1,700 0,300
Magnesio 0,800 0,500 0,350
Cobre 0,020 0,010 4,2x10-4
Zinc 0,010 0,008 8,8 x10-3
Hierro 0,002 0,001 7,4 x10-3
Manganeso 0,001 0,001 1,25 x10-3
Boro 0,008 0,007 N.D.
Fósforo 0,210 0,110 N.D.
Azufre 0,090 0,260 N.D.
N.D.: No determinado
Las semillas presentaron un alto nivel de calcio (1,3 mg/g), seguido de sodio (1,1
mg/g), magnesio (0,8 mg/g), potasio (0,5 mg/g) y fósforo (0,21 mg/g), pero la
cáscara mostró mayores contenidos de potasio (6,2 mg/g) y calcio (1,7 mg/g).
Tal como muestra la Tabla 4, el contenido mineralógico del zumo no superó a los
correspondientes de la semilla y la cáscara, excepto en el potasio (0,5; 6,2 y 1,83
mg/g para semilla, cáscara y zumo, respectivamente). Los niveles bajos de estos
nutrientes en el zumo podrían estar asociados también a los polifenoles, dado
que son reconocidos como inhibidores de la absorción de diferentes minerales
por su capacidad quelante de metales divalentes, principalmente Fe, Cu y Zn, lo
cual afecta su biodisponibilidad (Martínez, Periago & Ros, 2000). Se adiciona que
la polifenoloxidasa, que tiene como cofactor al cobre, actúa sobre los polifenoles
vegetales en presencia de oxígeno generando agua y quinona; la cual es
responsable de los pigmentos amarillos y marrones (Porras & López, 2009). El
54
resultado de la actividad de esta enzima es no sólo contribuir al cambio de
coloración del fruto de P. vitifolia sino también disminuir la disponibilidad de cobre
en él, lo que justificaría el bajo nivel encontrado (4,2x10-4 mg/g).
En algunos estudios se ha indicado que la acumulación de calcio en la pared
celular facilita la reticulación de los polímeros pécticos que conducen a una red
de pared celular que aumenta la resistencia de la misma y la cohesión celular, lo
que se asociaría con la firmeza de la piel de las frutas de P. vitifolia. También se
puede usar como indicador de calidad el calcio unido en la fracción de pectina
insoluble en agua (Manganaris, Vasilakakis, Diamantidis & Mignani, 2007).
El potasio es un elemento mineral esencial que ayuda a regular la presión arterial,
mientras que el calcio es necesario para el crecimiento óseo y la contracción
muscular y en la coagulación de la sangre. El magnesio trabaja con el calcio para
mantener los huesos sanos. El calcio es también muy importante en el
mantenimiento de un corazón sano y el fósforo trabaja con el calcio para construir
el hueso. El fósforo es un constituyente importante del trifosfato de adenosina
(ATP) y ácido nucléico y también es esencial para el equilibrio ácido-base, la
formación de huesos y dientes. Los otros elementos encontrados (cobre, zinc,
hierro, magnesio, manganeso) son cofactores importantes que se encuentran en
la estructura de ciertas enzimas y son indispensables en numerosas vías
bioquímicas (Soetan, Olaiya & Oyewole, 2010).
4.3 CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y QUÍMICA DEL ZUMO Y LOS EXTRACTOS
Las frutas no convencionales son consumidas tradicionalmente como fruta
fresca, aunque los lugareños de las regiones donde estas se dan
espontáneamente las aprovechan también como zumo, ya que se consideran
fuente de nutrientes, por lo que recientemente se ha observado una fuerte y
amplia tendencia hacia su consumo como zumos naturales (Freitas, 2007). Los
55
valores obtenidos para las principales características físico-químicas del zumo
del fruto de P. vitifolia se presentan en la tabla 5.
Tabla 5. Caracterización física comparativa del zumo (parte comestible) y
extractos etanólicos y de acetato de etilo de cáscara y semilla de frutos P. vitifolia.
Parámetro
Constituyente
Zumo
Extracto Acetato de etilo Extracto Etanólico
Cáscara Semilla Cáscara Semilla
Rendimiento
(%)
24,26±4,68 2,52±2,1 6,23±4,1 16,62±1,2 18, 94±2,3
Color
Instrument
al
L
*
a
*
b
*
51,38±0,02
6,11±0,02
40,03±0,06
5,71±0,07
-0,38±0,02
1,35±0,05
13,30±0,11
-0,22±0,30
8,80±0,07
4,67±0,4
-0,08±0,1
2,48±0,4
8,47±1,7
-1,24±0,2
3,22±2,2
Índice de color 0,3±0,002 -48,8±2,35 -1,88±2,54 -94,29±13,05 -4,21±2,47
Índice de
blancura
36,73±0,03 5,70±0,07 12,86±0,11 8,38±1,61 4,64±0,35
Densidad
relativa
(27°C)
1,04±0,03 0.98±0,07 0,88±0,01 1,06±0,09 1,01±0,04
° Brix 16,10±0,1 20,50±0,1 21,27±0,06 20,30±0,1 20,37± 0,06
Índice
Refracción
(27°C)
1,3500±0,0
1
1,3200±0,01 1,2900±0,01 1,3800±0,01 1,3300±0,0
Viscosidad
(mPa, 24 °C)
6,24±1,01 N.A. N.A. N.A. N.A.
UV (365 nm) N.A. Fluorescenci
a azul
Fluorescenci
a azul
Fluorescenci
a azul
Fluorescenci
a azul
pH (27°C) 2,80±0,12 6,30±0,11 5,30±0,11 4,90±0,10 3,50±0,10
Acidez titulable
(% ácido
cítrico)
6,36±0,3 0,36±0,2 0,94±0,4 2,52±0,2 2,90±0,1
Vitamina C
(mg/100g
zumo)
231±0,1 N.A. N.A. N.A. N.A.
56
Parámetro
Constituyente
Zumo
Extracto Acetato de etilo Extracto Etanólico
Cáscara Semilla Cáscara Semilla
Contenido
fenólico total
mgEAG/L
236,8±2,48 N.A. N.A. N.A. N.A.
N.A.: no aplica; mPa: milipascal; mgEAG: miligramo equivalente de ácido gálico; nm: nanómetros.
Los parámetros L* y b* mostraron los mayores valores entre ellos (51,38; 6,11 y
40,03), lo que indica una tendencia hacia el blanco con ligera tonalidad de
amarillo y la capacidad de reflejar la luz. Nuevamente, los índices de color y
blancura obtenidos confirman lo antes dicho (Tabla 5).
Los valores del contenido de sólidos solubles totales y de acidez titulable del
zumo (16,1 °Brix, 6,36% de ácido cítrico, relación 2,53) son muy diferentes a los
reportados para el zumo de maracuyá amarillo, P. edulis f. flavicarpa (10,00 °Brix,
0,462%, relación 21,64; Rocha & Bolini, 2015), pero son similares con los datos
reportados para Passiflora edulis f edulis Sims, gulupa (Franco, Cartagena,
Correa, Rojano, Piedrahíta & Lobo, 2014). La información obtenida a partir de los
sólidos solubles (ºBrix) y la acidez titulable es importante para determinar la etapa
de maduración de una fruta. Anthon, LeStrange & Barrett (2011) advirtieron que
los azúcares solubles, tales como la glucosa y la fructosa, son el mayor
contribuyente a los sólidos solubles totales.
El valor de vitamina C obtenido para el zumo de P. vitifolia (231 mg/100 g de
zumo) es comparativamente superior al de algunas passifloras. Por ejemplo, el
jugo de P. edulis f edulis (maracuyá morado) mostró 0.32 g Kg-1 (Devi Ramaiya,
Bujang, Zakaria, King, Sahrir & Arif, 2013). En la pulpa de P. edulis f. flavicarpa
(maracuyá amarillo) se encontró 15,11±0,16 mg/100 g (Avila, 2004); esta especie
de Passiflora es la de mayor importancia comercial a nivel mundial (Malacrida &
Jorge, 2012), y su acidez resulta atractiva para los consumidores principalmente
para la preparación de zumos (Deliza, MacFie & Hedderley, 2005). Según
Orjuela, Campos, Sáncehz, Melgarejo & Hernández (2011), la pulpa de P. edulis.
57
f. edulis. Sims (gulupa), que hace parte de las llamadas "especies de frutas del
alto-andino", reveló 20 mg vitamina C/100 g. El contenido de esta vitamina en el
mesocarpio de Passiflora quadrangularis (badea) osciló entre 0.62-0.72 g Kg-1
(Devi Ramaiya et al., 2013). De acuerdo a The Natural Food Hub, cualquier
alimento que tenga entre 15-30 mg de ácido ascórbico puede considerársele
como una buena fuente de vitamina C; si el nivel es mayor a 30 mg, se le califica
como una excelente fuente de esta vitamina (Devi Ramaiya et al., 2013).
Los ácidos orgánicos son una fuente de energía respiratoria directa tanto en
células animales como en células vegetales. El producto final de la ß-oxidación
(Acetil-CoA) se convierte en CO2 y H2O, preferiblemente a través del ciclo de
Krebs, por lo que las células de las frutas son capaces de utilizarlos como
sustrato respiratorio y convertirlos en azúcares (Fennema, 2000). Debe
recordarse que el fruto de P. vitifolia es climatérico lo que le exige disponer de
fuentes de energía en abundancia durante la alta frecuencia respiratoria
requerida con el avance de maduración; entonces, la alta acidez del fruto,
revelada a través del pH, acidez titulable y contenido de vitamina C que muestra
la Tabla 3, es tal vez aprovechada como fuente de energía respiratoria, o bien,
contribuye en las características organolépticos, por ejemplo, el sabor de la parte
comestible del fruto.
La determinación de compuestos fenólicos totales se realizó aplicando una
reacción de oxido-reducción mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu, el valor
obtenido fue 236,8±2,48 mgEAG/L de zumo liofilizado. Datos reportados para
otras especies de Passiflora permiten afirmar que esta concentración es similar
a la encontrada en Passiflora maliformis (277,00±1,00 mgEAG/L material fresco),
P. quadrangularis (272,96±0,67 mgEAG/L material fresco), aunque inferiores a
los de P. edulis púrpura (362.00±4.68 mgEAG/L material fresco) y P. edulis
amarillo (310,93±3,56 – 361,73 ± 3,99 mgEAG/L material fresco) (Devi Ramaiya
et al., 2013). Luximon-Ramma, Bahorun & Crozier (2003), obtuvieron en el fruto
de la pasión valores de 574±107 mgEAG/L, mientras que Janzantti, Macoris,
58
Garruti & Monteiro (2012) registraron para la misma especie 5289,3 mgEAG/L, y
Macoris, De Marchi, Janzantti & Monteiro (2012) reportaron valores mayores a
281,8 mgEAG/L para P. edulis f. flavicarpa.
Vasco, Ruales & Kamal-Eldin (2008), determinaron el contenido de ácido
ascórbico y de constituyentes fenólicos, entre otros, en P. ligularis (granadilla),
considerada la segunda Passiflora de importancia comercial en Colombia,
después de P. edulis (maracuyá amarillo), encontrando valores para el ácido
ascórbico y los fenoles totales: 16-25 mg/100 g de peso fresco y 91 ± 43
mgEAG/g peso fresco, en tanto que para P. edulis reportaron 30–40 mg/100 g
de peso fresco y 61±32 mgEAG/g peso fresco.
El conjunto de resultados mostrados confirma que el nivel de constituyentes en
un fruto está fuertemente influenciado por factores genéticos, climáticos, estado
de desarrollo vegetativo y sistema de cultivo (Devi Ramaiya et al., 2013), así
como también del método aplicado y la unidad de equivalencia al reportar el
resultado.
La información científica que caracteriza a las frutas exóticas no convencionales
en relación con sus características físicas y físico-químicas constituye una
referencia importante en estudios sobre la calidad de estos frutos, con el fin de
determinar los requisitos de aceptación del consumidor. La calidad se define
como la ausencia de defectos o grado de excelencia e incluye apariencia, color,
forma, lesiones, sabor, aroma, valor nutricional y seguridad para el consumidor.
Por otra parte, la Tabla 5 también deja ver características físicas determinadas a
los extractos orgánicos derivados de cáscara y semilla. Un “extracto vegetal”
puede ser considerado como una mezcla compleja, generalmente líquida, de
constituyentes provenientes de una parte específica del vegetal, o de la planta
completa, pero que, en cualquier caso, posee menor número de compuestos que
la totalidad del material que le dio origen. La simplificación de entidades químicas
en los extractos, lejos de convertirse en una desventaja, más bien posibilita su
59
manejo en los ensayos experimentales, lo transforma en un sistema de
concentración de principios activos y en una fuente muy diversificada de
oportunidades de trabajo y de rentas. Todo lo anterior hace de los extractos
vegetales (medicinales, aromáticos, condimentarios), en todas sus facetas, en
una poderosa herramienta de trabajo en los laboratorios de cualquier nivel (de
investigación o industriales) y en los establecimientos comerciales más
especializados.
También, la determinación exitosa de compuestos biológicamente activos a partir
de material vegetal depende en gran medida del tipo de disolvente utilizado en el
procedimiento de extracción. La Tabla 3 muestra que el etanol penetra con mayor
facilidad la membrana celular para extraer los ingredientes intracelulares del
material vegetal (16,62 y 18,94% para cáscara y semilla) que el acetato de etilo
(2,52 y 6,23% para cáscara y semilla), aunque mayor cantidad de extractivos se
obtienen a partir de la semilla.
En este trabajo se desestimó la posibilidad de utilizar el agua (índice de polaridad
9.0) y el metanol (índice de polaridad 6.6) como solventes de extracción pese a
la polaridad alta de ambos y a sus posibilidades de hacer puentes de hidrógeno
con el material fenólico, característicos de la familia Passifloraceae. El agua no
fue tenida en cuenta por cuanto permite la ocurrencia de microoganismos,
comparado con el etanol; así mismo, no se consideró el metanol por su toxicidad
que lo hace inadecuado en pruebas de interés biológico. De esta forma, se
consideró pertinente trabajar con el etanol (índice de polaridad 5.2), también
considerado un solvente polar, aunque más bajo que los dos anteriores. La gama
de posibilidades se complementó utilizando un solvente aprótico: el acetato de
etilo ( ), cuyo índice de polaridad es 4.3. Así las cosas, se pudo obtener de
las matrices vegetales utilizadas no sólo metabolitos desde los muy polares (p.ej.,
carbohidratos y fenoles) sino también los de mediana (p.ej., alcaloides) y hasta
los de baja polaridad (p.ej., terpenoides y esteroides) que no pueden hacer
puentes de hidrógeno.
60
La extracción, como es el término utilizado farmacéuticamente, es la separación
de las porciones que contienen los principios activos del tejido utilizado como
muestra. En ese orden de ideas, la tabla 5 deja ver que la semilla se mostró como
el mayor reservorio de compuestos en el fruto, puesto que en ella se obtuvieron
los mayores porcentajes de extracción, lo cual está en concordancia con la
fisiología vegetal. No obstante, los valores arrojados en la determinación de
densidad e índice de refracción insinúan que se trata de entidades químicas que
tienen una masa molecular baja en relación con el espacio que ocupan; esta
observación es más notoria cuando se utiliza acetato de etilo como solvente
extractor.
Si se tiene en cuenta que la separación con etanol y acetato de etilo fue posterior
a un desengrasado con n-hexano, debe entenderse que no se trata de
compuestos de naturaleza lipídica que pudieran disminuir la densidad. Pudiera
entonces pensarse que los dos extractos objetos del interés en este trabajo
estarían constituidos más bien por compuestos voluminosos, tales como los
flavonoides, junto con los ácidos fenólicos y sus ésteres, genéricamente
denominados “compuestos fenólicos”.
Los valores de los parámetros de color (L*, a* y b*), al igual que el índice de color
y de blancura de los extractos consignados en la Tabla 3 indican una tendencia
hacia el color marrón, gris y negro, que coincide con la apariencia visual del
material vegetal que les dio origen. En este caso, el valor de a* es el parámetro
representativo del color del extracto proveniente de la cáscara; L* y b son
distintivos para el de semilla, independientemente del solvente utilizado.
Aunque no se evidencian diferencias importantes en las otras características
determinadas (densidad relativa, °Brix, índice de refracción), si se nota
variabilidad de resultados en el pH y la acidez titulable del zumo y los extractos
de cáscara y la semilla. Estas diferencias estarían asociadas no sólo con la
presencia de ácidos orgánicos sino también con los contenidos diferenciales de
61
compuestos fenólicos, que pueden formar enlaces de hidrógeno con el etanol,
tales como compuestos fenólicos glicosidados (p.e., flavonoides).
Es importante recordar que los fenoles son compuestos de carácter ligeramente
ácido, propiedad que los distingue de los alcoholes. Esta discrepancia se debe a
la estabilidad del ión fenóxido por deslocalización de la carga en el anillo
aromático que les permite el desprendimiento del protón (H+) de los grupos
fenólicos disminuyendo así el pH de sus soluciones. La mayoría de los fenoles
son menos ácidos que el agua. El ión fenóxido les confiere también la capacidad
de absorber la radiación ultravioleta. Ver tabla 3. Los estudios sobre flavonoides
mediante espectroscopia han revelado que la mayoría de las flavonas y
flavonoles exhiben dos bandas de absorción principales: la banda I (320-385nm)
representa la absorción del anillo B, mientras que la banda II (250-285nm)
corresponde a la absorción del anillo A. Los grupos funcionales unidos al
esqueleto de flavonoides pueden causar un cambio en la absorción como es el
caso de 360nm en rutina (Wollenweber & Dietz, 1981).
4.2.1 Composición química de los extractos etanólicos: en este estudio se realizó
el control de calidad de los extractos etanólicos de cáscara y semilla de la especie
de interés aplicando un análisis de HPLC- Espectrometría de masas (HPLC-EM).
La tabla 6 agrupa los resultados obtenidos en este análisis. La determinación
química fue solo efectuada en el extracto etanólico dado que este es el de mayor
aplicación comercial.
Tabla 6. Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM).
Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM)
Compuesto
Cáscara
(µg/g de muestra)
Semilla
(µg/g de muestra)
Ácido clorogénico 24 N.D.
Ácido p-cumárico 73,80 78,40
Hiperóxido 20 N.D.
62
Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM)
Compuesto
Cáscara
(µg/g de muestra)
Semilla
(µg/g de muestra)
Quercetina 6,20 N.D.
Rutina 399,40 48,80
Ácido sinápico 35,40 N.D.
N.D.: No detectado bajo las condiciones del ensayo
En la tabla se observa que el ácido p-cumárico (ácido hidroxicinámico) y la rutina
(flavonoide glicosidado) podrían considerarse marcadores químicos para los
frutos de esta especie. No obstante, debe tenerse en cuenta que el nivel de rutina
en la cáscara es aproximadamente 8 veces superior (399,4 µg/g de muestra) al
de la semilla (48,8 µg/g de muestra), y el acido p-cumárico aparece en
proporciones casi iguales en ambos subproductos (73,8 y 78,4 µg/g de muestra
cáscara y semilla).
Otras especies de Passiflora presentan contenidos variables de los compuestos
reportados en este trabajo y consignados en la Tabla 4. Por ejemplo, la pulpa de
P. edulis f. flavicarpa fue analizada por su contenido de compuestos bioactivos
mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC-PDA-MS/MS); se
encontró un contenido de ácido p-cumarico de 1,35 mg/100 g (Konta, Almeida,
Amaral, Darin, Rosso, Mercadante & Bianchi, 2014). Talcott, Percival, Pittet, &
Celoria (2003) usaron HPLC-DAD al jugo de P. edulis, reportando una
concentración de acido p-cumárico de 519 µg/L y de ácido sinápico 626 µg/L. En
tanto que, la rutina y el ácido clorogénico (164 µg/ mL y 284 µg/ mL,
respectivamente) fueron reportados en el el extracto etanólico de hoja de P.
incarnata aplicando HPLC-DAD (Masteikova, Bernatoniene, Bernatoniene &
Velziene, 2008).
La Agencia Europea de Medicamentos define los marcadores químicos como
constituyentes o grupos de constituyentes definidos químicamente de un
63
producto herbario que son de interés para fines de control de calidad
independientemente de si poseen alguna actividad terapéutica (Agencia Europea
de Medicamentos, 2015). Es importante tener en mente que no sólo interesa
conocer la presencia/ausencia del marcador químico, sino que, además, su
cantidad puede constituirse en un indicador de la calidad de una medicina
herbaria. También interesa mencionar que la mayor parte de los fármacos
contienen constituyentes químicos definidos de los que deriva su actividad
farmacológica y biológica, pero la identificación de los constituyentes químicos
activos depende de los métodos químicos de determinación (Kushwaha,
Neelottama, Neeleshwar & Rai, 2010).
Aunando la información de la Tabla 6 con los planteamientos anteriores, se
encuentran razones suficientes no sólo para justificar la escogencia de la rutina
y el ácido p-cumárico como quimiomarcadores del fruto de P. vitifolia sino
también para explicar muchas de las características organolépticas del fruto; por
ejemplo, la coloración adquirida lenta, pero paulatinamente, con el avance de la
maduración (figura 2) así como el sabor característico (fresas amargas) percibido
al zumo, a lo que contribuiría el contenido, relativamente alto, en relación a otras
pasifloráceas, del ácido ascórbico (231 mg/100g zumo) detectado en él.
Es importante destacar que todo el perfil químico de los extractos etanólicos del
fruto de P. vitifolia hacen pensar en sus perspectivas tecnológicas
(farmacológicas y/o cosmetológicas) y nutricionales; afirmación que encuentra
respaldo en los compuestos fenólicos identificados en la tabla 6. Así:
Según ACOFARMA, la rutina se usa en el tratamiento de estados patológicos
caracterizados por hemorragias capilares asociadas a un incremento de la
fragilidad capilar, como accidentes vasculares de la hipertensión, nefritis
hematúrica y vasculopatías diabéticas. También se utiliza en casos de
insuficiencias venosas tales como várices, hemorroides, piernas cansadas,
64
flebitis, tromboflebitis y calambres nocturnos. En serums y cremas se usa como
revitalizante para atenuar las ojeras (Castaño, Ruíz & Vidal, 1998).
El ácido p-cumárico fue encontrado con capacidad de activar funciones
microbianas potencialmente beneficiosas para la función intestinal, entre las que
se incluyen una fuerte respuesta antioxidante y la destoxificación por parte del
compuesto frente a Lactobacillus plantarum, un microrganismo probiótico y
comensal humano; también se ha evidenciado que la presencia de este ácido
hidroxicinámico puede activar genes que facilitan la adaptación del
microrganismo probiótico al intestino (Tapia & Schmeda, 2005).
El ácido sinápico detectado en la cáscara de P. vitifolia (35,4 µg/g de muestra);
es un derivado hidroxicinámico que encuentra aplicación como componente de
cosméticos no terapéuticos, especialmente para el blanqueamiento de la piel y
como agentes cosméticos contra signos de envejecimiento de la piel (Markert,
Moussou, Danoux & Rathjens, 2012).
En general, los ácidos hidroxicinámicos (ácido ferúlico, ácido caféico, ácido p-
cumárico y ácido sinápico) presentan propiedades anti-cancerígenas,
antiinflamatorias y anti-oxidantes (Martínez, Periago & Ros, 2000). Esta última
propiedad es de gran interés para la industria de los alimentos, cosmetológica y
farmacéutica.
Rutina Ácido p-cumarico Ácido sinapico Ácido clorogénico
65
La tabla muestra también un contenido no despreciable de ácido clorogénico (24
µg/g de muestra), aunque su aparición se dio solo en cáscara. Algunas de las
propiedades farmacológicas reconocidas para este compuesto son: mejorar el
metabolismo lipídico y promover la pérdida de peso mediante la reducción de la
síntesis de la grasa visceral, colesterol y ácidos grasos. Además, regula la
distribución de las grasas corporales, incrementa la utilización de los ácidos
grasos para obtener energía y regula el metabolismo de la glucosa. (McCarty,
2005; Van Dijk, Olthof, Meeuse, Seebus, Heine & Van Dam, 2009; Ong, Hsu &
Tan, 2013).
4.4 TAMIZAJE FITOQUÍMICO
En el presente trabajo se realizó la búsqueda de algunos de los principales
núcleos de metabolitos secundarios en los extractos de acetato de etilo y etanol
de de cáscaras y semillas a fin de garantizar una mejor detección de aquellos de
mayor interés farmacológico y/o industrial. En tal propósito se investigaron 11
compuestos bioactivos principales; seis componentes fueron positivos para
ambos extractos, los cuales incluyen: compuestos fenólicos, como taninos y
flavonoides, presentes en grandes cantidades junto con los azúcares reductores,
esteroles y esteroides; mientras que los alcaloides se encontraron en bajas
cantidades. Las saponinas, las cumarinas, los glucósidos cardiacos y las
antraquinonas están ausentes en ambas partes de la fruta. En la tabla 7 se
consignan los resultados obtenidos en este análisis.
La tabla 7 deja ver abundante presencia de carbohidratos reductores en semilla
y cáscara (por ejemplo, glucosa o fructosa) y/o no reductores (sacarosa) que
normalmente aparecen ligados a muchos metabolitos secundarios, tales como
los fenólicos, entre ellos los flavonoides.
66
Tabla 7. Análisis fitoquímico realizado a extractos de cáscara y semilla de P.
vitifolia
Metabolito
Prueba
Extracto Acetato
Etilo
Extracto
etanólico Zumo
Cáscara Semilla Cáscara Semilla
Carbohidratos totales
y reductores
Molish + + +++ +++ +++
Benedict ++ ++ +++ +++ +++
Fenoles Folin-Ciocalteu + + + +++ ++
Flavonoides Shinoda N.D. N.D. ++ +++ ++
CCD + + ++ +++ +
Taninos Cloruro Férrico ++ ++ +++ +++ N.D.
Saponinas Rosenthaler N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
Espuma N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
Antraquinonas Borntrager N.D. N.D. + +++ +
Triterpenos y
esteroides
Lieberman-
Burchard ++ ++ +++ +++ +++
Salkouwski + ++ +++ +++ +++
CCD N.D. N.D. ++ +++ +
Alcaloides
Tanred N.D. N.D. N.D. + +
Dragendorff + + + + +
Mayer N.D. N.D. + + +
Valser N.D. N.D. N.D. + +
Antocianinas Hidróxido
sódico 2N N.D. N.D. N.D. +++ +
+++: Contenido relativo alto. ++: Contenido relativo medio. +Contenido relativo bajo. N.D.: No detectado
bajo las condiciones del ensayo.
Los compuestos fenólicos, ya sea como ésteres, glucósidos o polímeros, son
ubicuos en las plantas, son una parte esencial de la dieta humana, y son de
considerable interés debido a sus propiedades antioxidantes, mientras que los
flavonoides son los principales fitoconstituyentes en el género. La presencia de
taninos, que constituyen el tercer grupo importante de fenólicos, también fueron
encontrados en forma abundante. Su detección sugiere la capacidad de P.
vitifolia para desempeñar un papel como agente antidiarréico y antihemorrágico
(Awoyinka, Balogun & Ogunnowo, 2007). Una de las funciones asociadas a estos
67
fitoconstituyentes es servir como mecanismo de defensa de los nutrientes
acumulados en los frutos vegetales, lo cual parece estar en concordancia con su
hallazgo tanto en cáscara como en semilla.
Puesto que los terpenos, o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso de
metabolitos secundarios, no resulta extraña su presencia en los subproductos de
los frutos de P. vitifolia, ya sea participando en los procesos de crecimiento o en
funciones de defensa; en este caso localizados principalmente en las semillas.
La presencia de alcaloides parece una característica común de la cáscara de
otras pasifloráceas (Carvajal, Ceballos, Álvarez, Rodríguez, Àlvarez, Bonilla &
Rodríguez et al., 2014), aunque también se les reconoce en otras partes de la
planta (Fuentes, Méndez, Lemes, Rodríguez, Soler, González & López, 2001).
Además, se han encontrado muchas especies de pasifloras que contienen
pequeñas cantidades de alcaloides harmala (es decir, harmane y posiblemente
harmina, harmalina, harmol y harmalol) (Dhawan, Kumar y Sharma, 2003).
Agrupando información se llega al conocimiento que los residuos frutícolas de P.
vitifolia contienen metabolitos secundarios de diversa naturaleza química, tales
como compuestos glicosidados (altamente polares), entre ellos flavonoides;
entidades medianamente polares, por ejemplo, alcaloides, además de los
constituyentes terpénicos y la materia grasa (de baja polaridad), cuya cantidad
resulta ser no despreciable.
La determinación de la composición química de metabolitos secundarios con
frecuencia es base de una taxonomía vegetal más alta, ya que cada especie y
cada unidad taxonómica, posee una composición específica de estos
compuestos. Si además se tiene en cuenta que los resultados del tamizaje
fitoquímico en la cáscara y las semillas de la planta bajo estudio pueden ser
adecuados para el cribado de moléculas bioactivas, la información fitoquímica y
la observación de la interacción de la planta con su entorno sugieren como
criterios de selección de fuentes potenciales de moléculas naturales de
68
relevancia farmacológica o de industria cosmetológica; entonces no resulta
osado reconocer que el discernimiento de los constituyentes químicos de las
plantas es fundamental porque dicha información será de valor para la síntesis
de sustancias químicas complejas, además de coadyuvar en su determinación
taxonómica.
Algunos autores sostienen que los compuestos fenólicos son el grupo más
extenso de sustancias no energéticas presentes en los alimentos de origen
vegetal y que, además, los subproductos de los alimentos vegetales son ricas
fuentes de compuestos bioactivos, incluyendo compuestos fenólicos (Quiñones,
Miguel & Aleixandre, 2012; Balasundram, Sundram, & Samman, 2006); sin
embargo, su contenido cualitativo y cuantitativo es diferente en cada especie
vegetal.
4.5 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE ACEITES DE P. vitifolia
Se realizaron las determinaciones para identificar adulteraciones en los aceites
o caracterizar nuevos materiales; estos análisis de rutina son utilizadas para
confirmar la identidad y usos potenciales de la mayoría de las grasas y aceites
(Tabla 8) (Fennema, 2000).
Tabla 8. Caracterización fisicoquímica de aceites
Parámetro físico-
químico
Passiflora vitifolia Semilla P. edulis f.
flavicarpa
Semilla
soya
Semilla
Maiz
Cáscara Semilla (Malacrida &
Jorge, 2012)
Silva et al.,
2015
Comisión Codex
Alimentario
(2008)
Rendimiento
(%) 5,61 25,60 - - - -
Densidad
(g/mL, 27°C) 0,84± 0,02 0,90± 0,06 - - - -
Índice de
Refracción,
27°C
1,473±0,08 1,482±0,09 1,4682±0,0001 - 1,466-
1,470
1,465-
1,468
69
Parámetro físico-
químico
Passiflora vitifolia Semilla P. edulis f.
flavicarpa
Semilla
soya
Semilla
Maiz
Cáscara Semilla (Malacrida &
Jorge, 2012)
Silva et al.,
2015
Comisión Codex
Alimentario
(2008)
Índice de
Saponificación
(mg KOH/g
aceite)
263,92±0,8 108,93±0,1 190,7±2,76 173,95±1,48 189-
195
187-
195
Índice de Iodo
(g I/100 g
aceite)
128,10±0,7 135,81±0,7 128,0±0.75 109,48
±5,02
124-
139
103-
135
Índice de
acidez
(% ácido
oléico)
3,22±0,18
2,31±0,04
2.35±0,06 1,63 ± 0,08
-
-
Indice de
ésteres
(mg KOH/ g
aceite)
260,7±0,2 106,62±0,3 - - - -
Índice de
peróxidos
(meq O2 /Kg
aceite)
1,68±0,3 1,24±0,22 1,46 ± 0,03 1,54 ± 0,12 - -
En la tabla 8 se observa que el material lipídico (extracto hexánico) de la semilla
(25.6%) es mayor al contenido en la cáscara (5,6%); no obstante, los valores
obtenidos son similares al de otras semillas de passifloras como la granadilla (P.
liquiaris, 26,69%; Uehara, 1985) y el maracuyá (P. edulis, 29,3%; Cerón, Osorio,
& Hurtado, 2012; Chamorrro, Benavides, & Correa, 2017), o superiores como en
curuba (P. mollisima, 11.16%; Uehara, 1985). El rendimiento también resulta
similar al de semillas oleaginosas de importancia comercial como la soya (20%;
Ortiz, Pasos, Rivas, Valdés & Cabrera, 2009); girasol (36%; Agüero, Pereyra,
Aguirrezábal & Lúquez, 1999) y maíz (20.7 - 55.3%; Roy, 2000).
70
La densidad relativa de la mayor parte de los aceites, minerales y vegetales
refinados, se encuentra entre 0.840 y 0.960 g/cm3. Debe tenerse en cuenta que
en la tabla se reportan datos de aceites crudos; aun así, los valores de densidad
se encuentran dentro del rango esperado.
El índice de refracción en grasas y aceites mide la pureza e identifica sustancias.
El valor obtenido para P. vitifolia tanto en cáscara (1,473) como en semilla (1,482)
es comparable con otros aceites vegetales que presentan valores entre 1.4557–
1.4770, incluyendo P. edulis (maracuyá; 1,46) (Cruz & Meléndez, 2004). Este
resultado sugiere que el aceite se encuentra dentro de un rango de pureza
aceptable. Esta información estaría asociada al peso molecular de los ácidos
grasos combinados y al porcentaje de ácidos saturados e insaturados contenidos
en el aceite, lo cual influye en el valor de esta propiedad física (Fennema, 2000).
El índice de saponificación indica el peso molecular medio de ácidos grasos
esterificados en glicerol en la molécula de triacilglicerol; entonces, un alto índice
de saponificación indica el ácido graso de pesos moleculares más bajos, y
viceversa (Jorge & Luzia, 2012). El valor encontrado para el índice de
saponificación del aceite de cáscara fue considerablemente mayor (263,92 mg
KOH/g aceite) que el de la semilla de P. vitifolia (108,93 mg KOH/g). Los datos
indican que los ácidos grasos del aceite de la semilla de P. vitifolia son de mayor
peso molecular que los correspondientes de la cáscara, y éste último a su vez,
resulta ser de menor peso molecular en relación a otros aceites de semilla de
passifloras como el de Passiflora edulis, Maracuyá, reportado por Cruz &
Melendez, 2004 (217,39 mg KOH /g) y otros autores (Tabla 8).
El índice de acidez proporciona datos importantes sobre el estado de
conservación del aceite. La Comisión del Codex Alimentarius (2008) determina
el valor máximo del índice de acidez de 4,0 mg KOH/g como parámetro de
calidad. Los valores encontrados en este trabajo (3,22 y 2,31 mg KOH/g para
cáscara y semilla, respectivamente) indican que el aceite estudiado puede
71
utilizarse con fines alimenticios, ya que se encuentra dentro de los valores de
calidad estipulados.
El índice de ésteres indica la cantidad de ácidos esterificados (tri, di y
monoglicéridos) los cuales son superiores en la cáscara 260,7 que los contenidos
en la semilla (106,6). Por su parte, el índice de peróxidos del aceite proveniente
de la cáscara indica mayor disposición a la oxidación que el de semilla, lo cual
estaría asociado al menor peso molecular de los ácidos grasos (mayor índice de
saponificación) que lo conforman, aunque de más bajo nivel de insaturación que
en el aceite proveniente de la semilla (Tabla 8). La Comisión del Codex
Alimentarius (2008) ha definido un valor máximo de peróxido de 10 y 15 meq/kg
para los aceites crudos y refinados, respectivamente, como parámetros de
calidad. Los valores 1,68 y 1,24 meq O2/Kg aceite dan razón de la buena calidad
del aceite de cáscara y semilla de P. vitifolia, lo cual se puede verificar por los
bajos valores de ácido y peróxido, a su vez relacionados con el desarrollo de
reacciones hidrolíticas y oxidativas, respectivamente.
El índice de yodo está directamente relacionado con el grado de insaturación
presente en el aceite. Se entiende que, el aceite de semilla de P. vitifolia se
compone principalmente de ácidos grasos insaturados con un valor de yodo de
135,81g I2/100 g aceite, mayor al de cáscara (128,10). Industrialmente, este
parámetro se utiliza como una forma de controlar la hidrogenación de aceites.
Con un índice de yodo por encima de 100 g I2/100 g muestra, el aceite puede
considerarse como semisecante (Bello, Akindele, Adeoye & Oladimeji, 2011).
Los valores del índice de refracción, yodo y saponificación en el aceite de semilla
de P. vitifolia (Tabla 8) fueron consistentes con los encontrados para aceites
convencionales como soja y maíz (Comisión del Codex Alimentarius, 2008),
indicando su posible uso en el procesamiento de alimentos y productos químicos.
Los aceites y las grasas de origen vegetal o animal, se encuentran en estado
líquido o sólido, algunas veces coloreados, untuosos o inflamables; menos
72
densos que el agua, son insolubles en solventes polares debido a su naturaleza
apolar que le confiere su constitución principalmente de carbono, hidrógeno y
oxígeno. En el caso de aceites y grasas de origen vegetal, se encuentran en
mayor proporción en las semillas que en otras partes de la planta, ya que es allí
donde está el principal reservorio de energía para la germinación. La
composición química confiere diferentes características físicas al material
lipídico, que pueden variar según sea el tipo de extracción implementado (con
solventes, prensado al frio, entre otros).
4.5.1 Perfil de ácidos grasos: sobre la base de los rendimientos de material graso
obtenidos en cada uno de los subproductos que muestra la tabla 8, se determinó
realizar el estudio de carcaterización química solo a la grasa proveniente de la
semilla. Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 9.
En la tabla 9 se observa que los constituyentes mayoritarios del aceite son: ácido
linoléico (52,51%) y ácido oleico (11,41%), junto con una menor proporción de
ácido palmitíco (7,15%) y esteárico (1,58%). Como se nota este perfil está
compuesto por un alto porcentaje de ácidos grasos insaturados, UFA, (64,64%)
y un bajo porcentaje de ácidos grasos saturados, SFA, (9,05%), lo cual es
considerado ideal en aceites comestibles e indica las posibilidades del aceite de
semilla de P. vitifolia de ser utilizado en culinaria como aceite para ensaladas o
en la formulación de margarinas. La calidad y digestibilidad de aceites vegetales
comestibles está determinada por la cantidad y composición de ácidos grasos
insaturados (Malacrida & Jorge, 2012).
Es importante recalcar que el aceite en estudio contiene 2 ácidos grasos
esenciales linoléico (18:2-6) y linolénico (18:3ω-3), pero el contenido de ácido
linoléico (52,51%) es superior al del α-linolénico (0,39%). La prevalencia de ácido
linoléico resulta de particular importancia dado que éste ayuda en la prevención
de desórdenes cardiovasculares tales como enfermedades coronarias,
ateroesclerosis y presión sanguínea (Rana & Blazquez, 2008, Malacrida & Jorge,
73
2012). Se ha reportado que el aceite de semilla de P. edulis f. flavicarpa Sims
(maracuyá amarillo) contiene ácido oléico (6,67- 14,7%) y ácido linoléico (53,23-
73,14%), en conjunto con con ácido palmítico (6,13- 13,83%) y ácido esteárico
(1,33-3,0%) (Autores: Tabla 7; Rana & Blazquez, 2008, Malacrida & Jorge, 2012).
Comparando los resultados obtenidos en este trabajo con aceites comestibles de
importancia comercial, puede decirse que P. vitifolia podría ser un producto
oleifero con grandes perspectivas similares al aceite de girasol, soya, maíz y uva,
los cuales son ricos en acido linoléico (60,0; 49,8-57,0; 39,4-65,6 y 58,0-78,0%,
respectivamente) y ácido oleico (45,3; 17,7-26,1; 20,0-42,2; 12,0- 28,0%).
Cotejando la relación de ácidos grasos saturados totales y ácidos grasos
insaturados SFA/UFA obtenidos en este estudio (1/7,14) con aquellos reportados
por Malacrida & Jorge (2012) para el aceite de semilla de P. edulis f. flavicarpa
(1/7,06), se encuentra que P. vitifolia presentó un perfil similar.
Tabla 9. Composición de ácidos grasos de aceite de semilla de P. vitifolia y P.
edulis.
Componentes COMPOSICIÓN %
Methyl esters Passiflora vitifolia Pasiflora edulis*
Cáprico (C10) 0,03 0,02
Tridecílico (C13) 0,02 0,02
Mirístico (C14:0) 0,06 0,03
Pentadecílico (C15) 0,02 0,01
Palmítico (C16:0) 7,15 6,13
Palmitoléico (C16:1) 0,15 0,12
Margárico (C17) 0,04 0,05
Esteárico (C18:0) 1,58 1,33
Oléico (C18:1) 11,41 6,91
Linoléico (C18:2) 52,51 56,23
Linolénico (C18:3) 0,39 0,34
Araquidíco (C20) 0,39 0,35
Eicosenoíco (C20:1) 0,10 0,06
Eicosadienoico (C20:2) 0,07 0,08
74
Componentes COMPOSICIÓN %
Methyl esters Passiflora vitifolia Pasiflora edulis*
Behénico (C22:0) 0,06 0,05
UFA 64,64 63,74
MUFA 11,67 7,09
PUFA 52,97 56,66
PUFA/MUFA 4.54 7.99
SFA 9,05 7,71
SFA/UFA 1/7,14 1/8,26
UFA: ácidos grasos insaturados; MUFA: ácidos grasos monoinsaturados; PUFA:
ácidos grasos poliinsaturados; SFA: ácidos grasos saturados.
* Fuente: Autores
Dubois, Breton, Linder, Fanni & Parmentier (2007) categorizaron a los aceites
vegetales de acuerdo con su composición de ácidos grasos. Sobre la base de
esta clasificación el aceite de semilla de P. vitifolia pertenece a los aceites
insaturados, que contienen ácidos oléico y linoléico en altas cantidades. En este
grupo están incluidos varios aceites vegetales como maíz, girasol, germen de
avena y sésamo. Adicionalmente, cuando la relación de los ácidos grasos
esenciales nominalmente llamados omega-6 (linoléico) y omega-3 (α-linolénico)
está en relación entre 5-10 se considera óptima; si esta relación es superior a 50
el aceite es calificado como peligroso para la salud (Rana & Blazquez, 2008).
4.6 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
4.6.1. Evaluación del potencial fenólico total y antioxidante: los resultados del
contenido fenólico total y capacidad antiradical y antioxidante de la cáscara y
semillas de P. vitifolia se presentan en la Tabla 10.
El contenido de constituyentes fenólicos total varió entre las diferentes partes de
la planta de Passiflora vitifolia entre 10671,52 mg EAG/100g en semillas, y
2817,18 mg EAG/100g, en la cáscara. Estos valores se diferencian a los
reportados para algunas especies de Passiflora altamente comercializadas. Por
75
ejemplo, Ramaiya, Bujang, & Zakaria (2014b), encontraron un contenido de
compuestos fenólicos en extractos metanólicos de hoja de 3,32; 2,37 y 2,17
g EAG/100 g para P. maliformis, P. edulis y P. quadrangularis, respectivamente.
Tabla 10. Contenido fenólico total y capacidad antioxidante de la cáscara y
semillas de P. vitifolia.
Extractos
Fenoles
totales
(mg
EAG/100g
muestra)
DPPH
(CI50, mg
equivalente
s de ácido
ascórbico
/100 g
muestra)
ABTS
(IC50, mg
TEAC/10
0 g
muestra)
FRAP
(AEAC)
ORAC
(µmol TEAC
/ 100g
muestra)
Etanólic
o
Cáscar
a
2817,1±19,9
c
1.95±0,9 c 2,33±1,1
b
78,2±496,
4 b
43518,2±20
9 b
Semilla 10671,5±13
7 a
0,94±0,4 a 0,46±0,2
a
2577,1±65
a
56999,3±17
0 a
Acetato
Etilo
Cáscar
a
1554,8±
29,9 d
154,3±0,7 e 36,5±08 e N.D. N.D.
Semilla 3142,1±
15,9 b
97,1±0,9 d 12,0±0,5
d
N.D. N.D.
Acido ascorbico N.D. 1,4±0,1 b 2,96±0,1
c
N.D. N.D.
Letras diferentes indican diferencias significativas por cada columna (p<0.05). N.D.: No
Determinado; EAG: equivalentes de ácido gálico; AEAC: ascorbic acid equivalent antioxidant
capacity; TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity.
De igual manera, otras especies de Passiflora no convencionales han sido
reportadas con valores diferentes; así, en el extracto metanólico de semilla P.
subpeltata, Saravanan & Parimelazhagan (2014) encontraron 115.7±3.60 mg
EAG/g. Por su parte, Sasikala, Saravana & Parimelazhagan (2011) hallaron que
los extractos etanólicos de P. foetida contenían en cáscara 10,09±0,0 y 4,5±0,1
en semillas, expresados como porcentaje equivalente de ácido tánico.
76
Se evidencia claramente que los datos reportados son dependientes de la parte
de la planta estudiada, así como del solvente de extracción y de la unidad
equivalente en que se expresen los resultados.
Los valores numéricos consignados en la tabla 10 permiten categorizar que la
actividad antioxidante de las muestras frente al DPPH se incrementó en el
siguiente orden, de acuerdo a las CI50: extracto etanólico de semilla 0.46±0.2
(ABTS) < 0.94±0.4 (DPPH), seguido del extracto etanólico de cáscara 1.95±0.9
(DPPH) < 2.33±1,1 (ABTS), extracto de acetato de etilo de semilla 12.0±0.5
(ABTS) < 97.1±0.9 (DPPH) y del extracto acetato de etilo de cáscara 36,5±08
(ABTS) <154.3±0.7 (DPPH). Los datos evidencian a los constituyentes de la
semilla con mayor funcionalidad antiradical, mejores resultados obtenidos con
etanol que con acetato de etilo, y CI50s menores frente al ABTS que con el
DPPH. No obstante, el contenido fenólico total, mgEAG/100 g muestra, decreció
en el siguiente orden: 10671,5±137 extracto etanólico de semilla> 3142,15± 15,9
extracto de acetato de etilo de semilla >2817,18±19,9> extracto etanólico de
cáscara>1554± 29,9 extracto acetato de etilo de cáscara; no encontrando
entonces correlación directa entre la funcionalidad y la presencia de estos
metabolitos.
De igual forma, el método de FRAP suministra información complementaria a la
antiradicalaria y resulta útil en la determinación de la capacidad antioxidante de
productos que tengan distintos tipos de antioxidantes (Medina, 2010). En este
caso, los valores de la AEAC de las semillas (56999,3±170) son
considerablemente más altos que los correspondientes de la cáscara
(78,2±496,4). Se deduce que los fitocomponentes contenidos en la semilla dejan
ver la mayor actividad reductora.
Por otra parte, los valores de la tabla 10, evidencian que al igual que para los
casos anteriores, en el método de ORAC el extracto etanolico de semilla es más
activo en comparación con el de cáscara. Importa recalcar que la semilla contiene
77
casi cuatro veces más compuestos fenólicos (10671,52mgGAE/100g muestra)
que la cáscara (2817,18mg GAE/100 g muestra).
En un trabajo realizado por Zapata, Piedrahita & Rojano (2014), se estimó el
contenido de fenoles totales de 24 matrices alimenticias y su capacidad
atrapadora de radicales de oxígeno. Se encontró para la curuba (Passiflora
mollissima (Kunth) L.H. Bailey) un contenido de fenoles de 10584,7 ± 260,6
mgEAG/100 g muestra, un alto valor ORAC (207.850,4 ± 2.906,5 µmol Trolox/100
g); entre tanto, el maracuyá (Passiflora edulis var. Flavicarpa) dejó ver en fenoles
39,1 ± 1,9 mgEAG/100 g muestra, calificado entre los más bajos, y ORAC 2154,5
± 74,3, designado como moderado frente a la mayoría de granos, legumbres y
frutas estudiadas. Los autores concluyeron que, en general, las frutas y hortalizas
con una baja capacidad antioxidante presentaron un bajo contenido de
compuestos fenólicos. También, Santos, Carvalho, Pereira, Aranha, Malik,
Mendonça & de Sousa (2016), investigaron la actividad antioxidante de hojas de
P. edulis aplicando in vitro DPPH y FRAP. El más alto contenido de fenólicos
(16.30%), flavonoides (3.88%) y actividad antioxidante (DPPH IC50 84.23 µg ml-
1; FRAP 1.89 mmol Fe2+ g-1) se obtuvo por maceración de la droga en una
relación con solución hidroalcohólica como solvente 1:8.
En resumen, el comportamiento revelado por los fitocomponentes de la semilla
frente a los métodos DPPH, ABTS, FRAP y ORAC mostraron la mayor actividad,
particularmente cuando fueron extraídos con etanol.
En la literatura, la actividad antioxidante puede, entre otros factores, depender
del tipo (posición y número de hidroxilos en la molécula y concentración de
compuestos fenólicos, y de la presencia de metales de transición (Monreal,
Manzanera & Tomé, 2012). De allí la necesidad de ensayar diferentes
metodologías para evaluar el efecto antioxidante, y no existe un método que
refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra (Medina, 2010).
78
Son numerosos los estudios que han mostrado que los fenoles poseen
propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica y captando
radicales libres como hidroxilo, supéroxido y alcoxi (Sichel, Corsaro, Scalia, Di
Bilio & Bonomo, 1991; Maydata, 2002). Además, protegen de la oxidación a las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) desempeñando un papel clave en la
prevención de la aterosclerosis. También pueden prevenir la trombosis,
inhibiendo la agregación plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza,
2000). Son considerados reguladores del sistema inmune y como
antiinflamatorios, probablemente debido a la modulación del metabolismo del
ácido araquidónico, reduciendo los niveles de tromboxano. Modulan la actividad
enzimática de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa A2, hialuronidasa, e
inhiben la acción de la angiotensina convertasa, mieloperoxidasa (que produce
el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa (que produce los radicales
superóxido) (Quiñones, Miguel, & Aleixandre, 2012; Medina, 2010).
4.6.2. Actividad antihemolítica: los glóbulos rojos se ven ampliamente afectados
por los radicales libres del organismo que los conducen a la lisis celular. Los
efectos antioxidantes de muchos compuestos de origen natural pueden aliviar
eficazmente el daño de las células sanguíneas (Saravanan & Parimelazhagan,
2014). En este ensayo, la hemólisis de los eritrocitos fue inducida por el radical
hidroxilo mediante la adición de H2O2. Esto provoca la ruptura de los eritrocitos;
el contenido se filtra dando el característico color rojo de la hemoglobina al medio.
Las reacciones se llevaron a cabo a pH y temperatura fisiológicos. Los resultados
de la inhibición de hemólisis de eritrocitos de los extractos de P. vitifolia y BHT,
fueron consignados en la tabla 11.
79
Tabla 11. Comparación de los efectos protectores de extractos de P. vitifolia y
BHT.
Concentración
(mg/L)
Porcentaje de inhibición de los extractos
Acetato de etilo Etanólico BHT
Cáscara Semilla Cáscara Semilla
50 24,81±0,6
c
38,23±0,9
c
24,02±0,7
c
40,12±0,5
c
31,3±0,
1 c
100 27,14±0,5
b
39,66±0,4
b
42,14±0,4
b
43,95±0,1
b
40,5±0,
3 b
200 29,10±02
a
44,44±0,6
a
44,85±0,5
a
47,70±0,4
a
58,2±0,
8 a
Letras diferentes indican diferencias significativas por cada columna (p<0.05).
La tabla 11 evidencia que los extractos de P. vitifolia reducen en gran medida las
alteraciones inducidas por peróxido de hidrógeno en eritrocitos. Sin embargo,
ninguno de los extractos a las concentraciones evaluadas (50, 100, 200 mg/L)
supera el 50% de inhibición de la lisis celular. Se debe resaltar que la actividad
del extracto etanólico de semilla (50 y 100 mg/L) es comparable y superior con
la actividad del control positivo de la actividad (BHT) a las mismas
concentraciones. Como era de esperarse, por los ensayos anteriormente
discutidos, el extracto etanólico de semilla de P. vitifolia, evidencia la mayor
actividad antioxidante, esto se puede relacionar con su alto contenido de fenoles
totales (tabla 10), además de la presencia de diferentes fitoquímicos que actúan
en sinergia, para reaccionar con el radical hidroxilo.
Los resultados obtenidos dejan ver que la propiedad antioxidante del extracto
etanólico de semilla de P. vitifolia resulta comparable a la acción del BHT a la
misma concentración (200 mg/L). Este comportamiento es promisorio para la
especie de interés ya que podría aplicarse en la generación de productos
farmacéuticos y nutracéuticos que coadyuven al control de enfermedades
degenerativas como las asociadas al estrés oxidativo.
80
El peróxido de hidrógeno es una de las especies reactivas de oxígeno (ROS)
más importantes formadas a partir de superóxido. Mediante la reacción de
Fenton, los iones de metales de transición (como Fe2+) reducen el peróxido de
hidrógeno al radical hidroxilo, por lo que la quelación de los iones Fe2+ y/o la
reducción de los iones Fe3+ resulta importante en la prevención o reducción del
estrés oxidativo (Okoko & Ere, 2012). Este oxidante celular deteriora los
componentes de la membrana que están encargados de su estabilidad, como los
fosfolípidos, el colesterol, las proteínas transmembranales, ADN, y
posteriormente la muerte celular necrótica a través de la apoptosis impulsada por
la mitocondria (Tavazzi, Di Pierro, Amorini, Fazzina, Tuttobene, Giardina &
Lazzarino, 2000; Sebastia, Pertusa, Vilchez, Planas, Verbeek, Rodriguez-Farre
& Sanfeliu, 2006; Sheline & Wei, 2006).
La metodología aplicada aquí demuestra que la oxidación de eritrocitos es un
buen modelo para la oxidación de biomembranas en general, complementando
los ensayos de actividad antioxidante in vitro expuestos anteriormente.
La presencia de altas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados en las
membranas eritrocitarias, el transporte activo de oxígeno por la hemoglobina
también contribuye a la susceptibilidad de los eritrocitos al estrés oxidativo
(Sadrzadeh, Graf, Panter, Hallaway & Eaton, 1984). El peróxido de hidrógeno
provoca la degradación del grupo hemo cuando está en contacto con la
hemoglobina, liberando iones Fe, lo que podría iniciar la producción de radicales
libres a través de la reacción de Fenton y consecuentemente la peroxidación de
lípidos, que es un mecanismo de deterioro y posteriormente muerte celular
(Bagchi, Bagchi, Stohs, Das, Ray, Kuszynski & Pruess, 2000; Nagababu, Chrest
& Rifkind, 2003; Hossain, Shah, Gnanaraj & Iqbal, 2011).
Ademas, la alteración de la estructura del eritrocito derivada de la pérdida de la
integridad de la membrana, puede originar diversos desórdenes no solo a nivel
celular también a nivel del organismo, favoreciendo la aparición de numerosas
81
enfermedades resultantes de procesos degenerativos como el envejecimiento, el
cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes, entre otras (Çimen,
2008). El daño oxidativo a los eritrocitos, también puede estar implicado en la
hemólisis que se asocia con algunas hemoglobinopatías y deficiencias en una
serie de sistemas antioxidantes eritrocitarios (Ko, Hsiao & Kuo, 1997). Por lo
tanto, la eliminación de peróxido de hidrógeno podría reducir estos efectos
celulares y contribuir significativamente a la mejora de la salud y el bienestar.
4.7 ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO
Teniendo en cuenta que los polifenoles se les ha encontrado una acción
importante en la inhibición de la alfa amilasa (Sosa, Tibisay & Araujo, 2002) y a
los elevados contenidos de estos metabolitos en los extractos etanólicos de
cáscara y semilla del fruto de P. vitifolia, en este estudio se consideró de
importancia particular evaluar la inhibición de glucosa a través de una membrana
de diálisis y determinar la capacidad inhibitoria de la enzima alfa amilasa, en un
intento por ampliar las posibilidades de aplicación a nivel industrial o
farmacológico de esta especie de Passiflora no convencional y de escaso
conocimiento científico.
Un mayor acercamiento a lo propuesto en nuestro trabajo lo constituyó la
investigación realizada por Büyükbalci & El (2008), quienes determinaron el
efecto antidiabético, la actividad antioxidante y el contenido fenólico de algunos
tés herbales. Bajo esta óptica, se tomó la determinación de aplicar dos
metodologías que no sólo podrían dejar ver la funcionalidad antihiperglucemiante
de los fitocomponentes de los extractos orgánicos de semilla y cáscara de P.
vitifolia, sino que además permitirían ampliar las perspectivas farmacológicas de
esta especie vegetal, así como también materializar los objetivos de esta
investigación.
82
4.7.1. Inhibición de la difusión de glucosa a través de membrana de diálisis: se
aplicó la técnica de tubos de diálisis como un modelo simple que mimetice el
potencial de las fibras dietéticas solubles para retardar la difusión y el movimiento
de la glucosa en el tracto intestinal (Adiotomre, Eastwood, Edwards & Brydon,
1990). El porcentaje de inhibición de los extractos sobre la difusión de glucosa a
través de la membrana dialítica se registra en la tabla 12 y se ilustra a través de
la figura 5.
Tabla 12. Porcentaje de Inhibición de difusión de glucosa a través de la
membrana de diálisis.
Tiempo de
prueba
(h)
Porcentaje de inhibición de los extractos
Acetato de etilo Etanólico
Cáscara Semilla Cáscara Semilla
2 27,4±0,8 b 23,9±1,2 c 18,1±0,7 b 69,9±0,5 a
6 35,5±0,4 a 35,2±0,5 a 10,4±1,6 c 61,8±1,6 b
24 17,6±0,9 c 34,6±0,2 b 20,1±1,9 a 45,6±2,1 c
Letras diferentes indican diferencias significativas por cada columna (p<0.05).
Los datos consignados en la tabla evidencian que la actividad de los
constituyentes de los extractos de acetato de etilo, obtenidos de cáscara o
semilla, es inferior al 30% a las 2 h de experimentación, 4 h después están en su
máxima capacidad (35%) y posteriormente ésta decae, aunque el extracto de
semilla logra mantener su funcionalidad a las 24 de trabajo continuo (34.6%).
Por su parte, los metabolitos contenidos en el extracto etanólico de la cáscara
dejan ver la acción más baja en todo el tiempo de prueba; pero, contrariamente,
los componentes de la semilla en el mismo solvente se revelan como los más
activos entre las muestras en el mismo período de ensayo. Cabe destacar que,
independientemente del solvente extractor, los extractos de semilla mostraron
mayor capacidad para impedir el paso de la glucosa a través de la membrana,
83
con resultados significativamente diferentes a los compuestos extraídos con
acetato de etilo, como se muestra en la tabla 12 y lo ilustra la figura 5.
Figura 5. % inhibición de la difusión de glucosa vs tiempo (h)
Fuente: Autor
Gallagher et al. (2003), asociaron la capacidad de las plantas para inhibir la
absorción de glucosa con la viscosidad de los polisacáridos solubles, sugiriendo
que la acción antihiperglicémica puede deberse en parte al decrecimiento de la
funcionalidad de absorción del metabolito in vivo. Estos investigadores sostienen
que el modelo empleado, pese a la constante agitación aplicada, que imita el
movimiento gastrointestinal, tiene limitantes asociadas al tiempo de prueba (22-
26 h) por cuanto éste momento no es directamente comparable con el espacio
temporal de los mecanismos celulares de absorción de glucosa en el intestino,
debido a que la glucosa es un carbohidrato que se absorbe rápidamente en el
intestino delgado y tarda no más de 3 h en llegar al torrente sanguíneo (Noriega,
2004).
Los resultados encontrados con el extracto etanólico de semilla de P. vitifolia
resultan promisorios, por cuanto la funcionalidad más alta (70%) se logra a las 2
h de trabajo, 24 horas después ha descendido hasta el 50%. Entonces, puede
proponerse que el efecto retardante de los constituyentes de la semilla es digno
de tener en cuenta, también se podría pensar que el predominio de fenoles en
84
esta parte del vegetal podría estar fuertemente comprometida con la inhibición
de la difusión de glucosa a través de la membrana de diálisis en las primeras 2 h
de evaluación. Consecuentemente, el consumo de productos derivados de la
semilla de la planta ayudaría a disminuir la absorción de azúcares provenientes
de la ingesta, lo que repercutiría en la calidad de vida del paciente
hiperglucémico. Parece haber varios mecanismos posiblemente implicados
asociados a las características físico-químicas de los extractos.
Para Gallagher et al. (2003), la validez del modelo se apoya, al menos en parte,
en el uso de la membrana dialítica a base de goma guar. Experimentos in
vitro e in vivo sugieren que, si bien la viscosidad del polisacárido se puede reducir
parcialmente por su paso a través del estómago, se conserva mejor que otros
tipos de gomas puesto que no es digerible en el intestino delgado; más bien,
forma soluciones viscosas con el agua ingerida y las secreciones digestivas
(Narayan, 2012).
También, algunos investigadores mencionan que la concentración y la masa
molecular de las fibras solubles son los principales determinantes de la actividad
antihiperglucemiante de la planta (Wood, Beer & Butler, 2000; Gallagher et al.,
2003). Cabe mencionar que, en este trabajo, aunque los extractos se probaron a
la misma concentración (10000 mg/L), no se estudió la dependencia entre esta
variable y el efecto sobre la difusión de la glucosa.
En las últimas décadas, varios estudios han indicado el valor de la fibra vegetal
o carbohidratos complejos, incluyendo fibras solubles altamente viscosas para el
control de concentraciones de glucosa en sangre (Jenkins, Wolever, Leeds,
Gassull, Haisman, Dilawari & Alberti, 1978; Edwards, Johnson & Read, 1988;
Groop, Stenman, & Groop, 1993; Wood, Beer & Butler, 2000). Aunque los efectos
de los diversos tipos de fibras sobre estos procesos fisiológicos no se conocen,
es evidente que las acciones in vivo de ellas pueden diferir de las in vitro. Al unir
agua, cationes y ácidos biliares o mediante la formación de geles que secuestran
85
mono o di-sacáridos, los alimentos que contienen fibra modifican los procesos
digestivos y absortivos. Aunque los efectos de los diversos tipos de fibras sobre
estos procesos fisiológicos no se conocen, la osmolaridad, el pH, la mezcla de
fibras y nutrientes, la retención de agua y la presencia de bacterias influyen en la
acción fisiológica de fibras específicas (Anderson & Chen, 1979; Gallagher et al.,
2003).
Se ha reportado que la disminución de la difusión de glucosa hacia la solución
externa puede deberse a la capacidad de atrapamiento de glucosa de los
extractos (Palanuvej, Hokputsa, Tunsaringkarn & Ruangrungsi, 2009). El retraso
del flujo de nutrientes en el medio externo es una indicación del efecto modulador
de la fibra de los extractos sobre la absorción de glucosa en el yeyuno (Adiotomre
et al., 1990). También ha sido revisada la influencia de los metabolitos
secundarios en el alivio de la diabetes tipo 2 (Kelble, 2005).
En este trabajo se encontró un mayor contenido de fibra en la cáscara (11,4%)
que en la semilla (2,8%). Ver Tabla 3. Sin embargo, las semillas dejaron ver casi
6 veces más constituyentes fenólicos que la cáscara (Tabla 10). Si se
correlacionan estos valores con lo mostrado en la figura 5, se podría asociar la
mayor actividad del extracto etanólico más a su disponibilidad fenólica que al de
fibra.
Algunos autores sostienen que existe poca correspondencia entre la multiplicidad
de compuestos encontrados en plantas del género Passiflora y los estudios
realizados para probar la bioactividad de estas especies. No obstante, la revisión
literaria permitió encontrar varios trabajos que agrupan en un todo una amplia
gama de funcionalidades probadas científicamente en estos organismos
vegetales, muchas de las cuales han sido sustentadas por la composición de
compuestos bioactivos determinados. Estos trabajos tienen en común que las
actividades han sido correlacionadas con los constituyentes fenólicos (Dhawan,
86
Dhawan & Sharma, 2004; Gadioli, da Cunha, de Carvalho, Costa & Pineli, 2016;
Miroddi, Calapai, Navarra, Minciullo & Gangemi, 2013).
De otra parte, Büyükbalci & El (2008), afirman que algunas plantas antidiabéticas
pueden ejercer su acción estimulando la función o número de células β y
aumentando así la liberación de insulina. En algunas otras plantas, el efecto se
debería a la disminución de la síntesis de glucosa en sangre debido a la
disminución de la actividad de enzimas como la glucosa-6-fosfatasa, la fructosa
1,6-bisfosfatasa, etc. En otras, la actividad deriva de la lenta absorción de
carbohidratos e inhibición del transporte de glucosa. Se adiciona que a los
polifenoles se les ha encontrado acción importante en la inhibición de la alfa
amilasa (Sosa, Tibisay & Araujo, 2002). Con estos antecedentes, en este estudio
se consideró de importancia particular evaluar la capacidad inhibitoria de la
enzima alfa amilasa.
4.7.2. Inhibición de la enzima alfa amilasa: la enzima digestiva α-amilasa
constituye una familia de endo-amilasas que catalizan la hidrólisis inicial de
almidón en oligosacáridos más cortos a través de la escisión de α-D-(1-4) enlaces
glucosídicos. Ni los residuos terminales de glucosa ni los enlaces α-1,6 pueden
escindirse por α-amilasa. Los productos finales de la acción son oligosacáridos
de longitud variable con una configuración α y dextrinas α-limitadas los cuales
incluyen una mezcla de maltosa, maltotriosa y oligosacáridos ramificados de 6-8
unidades de glucosa unidas mediante enlaces α-1,4 y α-1,6 (Michelle, Monteiro,
Simeoni, Oliveira, Silveira D, 2012).
La ruptura enzimática de los enlaces alfa (1-4) de la maltosa libera unidades de
glucosa que pueden ser absorbidas, dando como resultado incrementos en los
niveles de glucosa sanguínea. El ensayo utiliza como modelo un inhibidor de la
absorción de almidón puesto que éstos son capaces de bloquear la acción de la
enzima, previniendo la liberación de disacáridos y su posterior absorción como
glucosa (Mendoza & Loza, 2014). Bajo esta consideración, la inhibición de la α-
87
amilasa puede entonces constituirse en otra posibilidad de reducción de la
hiperglicemia postprandial en condiciones diabéticas (Saravanan &
Parimelazhagan, 2014). Los resultados de esta prueba se consignan en la tabla
13 y se ilustran en la figura 6.
Los extractos secos fueron resuspendidos en buffer Tris-HCl (0.05M, pH 6.9),
para evitar cualquier interferencia de los solventes. La tabla evidencia que, bajo
las condiciones en que se realizó este ensayo, sólo fue posible observar un
porcentaje inhibitorio de la enzima alfa amilasa ligeramente superior al 50% con
el extracto etanólico de semilla. Esta actividad fue comparable a la de la acarbosa
utilizada como control positivo, pero sólo incrementando la concentración del
extracto 8 veces (800mg/L) en relación a la del fármaco (100mg/L).
No obstante, este resultado puede considerarse bajo si se compara con los
obtenidos en otras passifloras como P. nítida cuyo extracto hidroetanólico de
hoja, a 130 μg/ml, inhibió 60% a la enzima (Montefusco-Pereira et al., 2013); P.
ligularis hizo lo propio a través del extracto acetónico de pulpa a 125μg/ml, con
una inhibición del 82.56% (Saravanan & Parimelazhagan, 2014).
Tabla 13. Porcentaje de inhibición de alfa amilasa de los extractos de P. vitifolia.
Concentración
(mg/L)
Inhibición Extractos (%)
Semilla Cáscara
Acetato Etilo Etanol Acetato Etilo Etanol
100 -0,11±0,1 2,27±0,2 -8,23±0,1 -5,34±0,2
200 0,50±0,2 13,00±0,1 -9,42±0,1 -11,58±0,4
400 5,11±0,2 35,67±0,4 -17,41±0,3 -13,14±0,6
800 10,35±0,1 55,05±0,1 -21,64±0,1 -32,97±0,3
Concentración (mg/L) % inhibición Acarbosa (control positivo)
50 40,73±0,7
100 47,24±0,1
150 59,15±0,1
200 63,15±0,3
88
Figura 6. Inhibición de la alfa amilasa
Fuente: Autor
La acarbosa, un inhibidor de la α-glucosidasa, ha sido estudiado clínicamente en
la diabetes mellitus tipo 2. Un informe reciente ha demostrado que este
tratamiento se coliga con una reducción del 25%
en la incidencia de este tipo de diabetes. El
tratamiento reduce el pico de glicemia
postprandial en un 20%. Sin embargo, las dosis
formuladas van desde 150 mg/día a 300 mg/día
que, de hecho, satura los sitios activos de las enzimas; dando a entender que las
dosis altas no incrementan el efecto inhibidor del fármaco. Además, este
producto presenta efectos adversos relacionados directamente con la dosis, los
más comunes son los trastornos gastrointestinales como flatulencia, meteorismo
y distensión abdominal (Akkarachiyasit, Charoenlertkul, Yibchok-anun &
Adisakwattana, 2010), atribuíbles a la digestión alterada de almidón por la fuerte
inhibición de la α-amilasa intestinal (Kim, Jo, Kwon & Hwang, 2011).
El papel potencial de las plantas medicinales como inhibidores de la α-amilasa
ha sido revisado por varios autores (Mendoza & Loza, 2014). Se ha reportado
que una variedad de plantas actividad inhibidora de la α-amilasa y por lo tanto
pueden ser relevantes para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (Padilla, Acuña,
Velásquez & Rubio, 2006). En realidad, la ciencia médica utiliza diversas
89
estrategias terapéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo 2, incluyendo la
reducción de la demanda de insulina, la estimulación de la secreción de insulina
endógena, el aumento de la acción de la insulina en los tejidos diana y la
inhibición de la degradación de oligo y disacáridos (Funke & Melzing, 2006).
Una amplia gama de principios derivados de plantas que pertenecen a
compuestos, principalmente alcaloides, glicósidos, goma de galactomanano,
polisacáridos, hipoglucanos, peptidoglicanos, guanidina, esteroides,
glicopéptidos y terpenoides, han demostrado bioactividad frente a la
hiperglucemia (Lo Piparo, Scheib, Frei, Williamson, Grigorov & Chou, 2008)
estudiaron las interacciones entre flavonoides y la α-amilasa en humanos. Estos
investigadores encontraron que la capacidad inhibitoria
está correlacionada con el número de grupos hidroxilo
en el anillo B del esqueleto de flavonoides. La
interacción se produce por la formación de enlaces de
hidrógeno entre los grupos hidroxilo en la posición R6
o R7 del anillo A y la posición R4' o R5' del anillo B de
los ligandos de polifenoles y los residuos catalíticos del sitio de unión, con la
formación de un sistema conjugado que estabiliza la interacción con el sitio
activo (Lo Piparo et al., 2008). Este mecanismo está en concordancia con la
acción propuesta para la acarbosa (Brownlee, 2005).
Parece importante recordar que la actividad de una enzima está determinada,
entre otros factores, por la adaptación de su estructura terciaria (estructura
nativa), que permite en forma extremadamente selectiva la unión al sustrato.
Cabe aclarar que la mayoría de los polifenoles en los vegetales están presentes
como ésteres, glucósidos o polímeros. Entonces, la estructura química de los
polifenoles, más que su concentración, es determinante en la funcionalidad que
estos evidencien (Sosa, Tibisay & Araujo, 2002).
90
Taninos, alcaloides y triterpenos son igualmente considerados como inhibidores
de la enzima α-amilasa (Michelle, Monteiro, Simeoni, Oliveira, Silveira, 2012).
Importa recordar que flavonoides, taninos, alcaloides y triterpenos hacen parte
del perfil fitoquímicos de semilla y cáscara de P. vitifolia, por lo que no parece
sorprendente la actividad moderada revelada de los extractos, pese a disponer
de una amplia gama de compuestos con capacidad para inhibir la endo-amilasa.
También se sabe que la hiperglucemia continua promueve la generación de
especies reactivas del oxígeno (ROS) y estimula el estrés oxidativo. Además, el
estrés oxidativo se asocia como causa remota de las complicaciones diabéticas,
como nefropatías y retinopatías (Iwai, 2008). El contenido fenólico total de
especies vegetales ha sido correlacionado con la actividad antioxidante
(Büyükbalci & El, 2008). Los altos niveles de estos metabolitos en P. vitifolia,
podrían sustentar no sólo el potencial antioxidante del extracto etanólico de
semilla sino también ser la razón de la actividad de inhibición de la α-amilasa y
de la difusión de glucosa a través de una membrana dialítica observada en este
estudio.
Las ROS también pueden causar reticulación o fragmentación de proteínas,
rupturas de ADN, peroxidación de lípidos y daño a la membrana y podrían ser
responsables de algunas secuelas de la hiperglucemia. Existe una creciente
evidencia que sugiere que la lesión diabética inducida por hiperglucemia modula
el comportamiento biológico de las células y que esto se refleja en cambios de la
proteína quinasa C relacionados con el estrés oxidativo (Montefusco-Pereira et
al., 2013).
Passiflora vitifolia no mostró una composición diferente a la de sus congéneres,
dejando ver amplia variabilidad de compuestos entre los que priman los
fitofenoles, principalmente flavonoides (Tabla 7), ratificado a través de los
contenidos fenolicos que muestran la tabla 10, del perfil de compuestos
bioactivos consignado en la tabla 6 y de las bioactividades antioxidante (Tabla
91
10), inhibición de hemólisis (tabla 11), inhibición de la difusión de glucosa a través
de la membrana de diálisis ( tabla 12) y la inhibición de la alfa amilasa (tabla 13).
4.8 ANÁLISIS DE CORRELACIÓN
Los resultados obtenidos en esta investigación se sometieron a un análisis
multivariado de correlación en el paquete estadístico Statgraphics Centurion
XVI.I. La Tabla 14 muestra las correlaciones producto de Pearson, entre cada
par de variables. El rango de estos coeficientes de correlación va de -1 a +1, y
miden la fuerza de la relación lineal entre las variables. También se indica, entre
paréntesis, el número de pares de datos utilizados para calcular cada coeficiente.
El tercer número en cada bloque de la tabla es un valor-P que prueba la
significancia estadística de las correlaciones estimadas. Valores-P abajo de 0,05
indican correlaciones significativamente diferentes de cero, con un nivel de
confianza del 95,0%. La tabla 15 resume los pares de variables con valores-P
por debajo de 0,05.
De acuerdo a la Tabla 15, en los subproductos del fruto de Passiflora vitifolia
(granadilla de monte) existe correlación directa, con un 95,5% de probabilidad,
entre las determinaciones de la actividad antioxidante y a las correspondientes a
las funcionalidad antihiperglucemiante las que, a su vez, estarían influenciadas
por el contenido fenólico total o por la naturaleza química de estos
fitoconstituyentes; lo cual dá soporte a las afirmaciones planteadas a lo largo de
la discusión en este trabajo. En particular, ORAC y FRAP influyen en la inhibición
de la difusión de glucosa e inhibición de la alfa amilasa, confirmando así las
potencialidades de esta passifloracea en el tratamiento de la hiperglucemia.
92
Tabla 14. Correlaciones - Análisis Multivariado (Statgraphics Centurion XVI.I.)
Correlaciones
ABTS DPPH Fenoles FRAP Inhibición alfa amilasa
ABTS 0,8634 -0,9368 -1,0000 -0,8739
(Tamaño de muestra) (4) (4) (2) (4)
P- valor 0,1366 0,0632 0,0000 0,1261
DPPH 0,8634 -0,7760 -1,0000 -0,6787
(Tamaño de muestra) (4) (4) (2) (4)
P- valor 0,1366 0,2240 0,0000 0,3213
Fenoles -0,9368 -0,7760 1,0000 0,9874
(Tamaño de muestra) (4) (4) (2) (4)
P- valor 0,0632 0,2240 0,0000 0,0126
FRAP -1,0000 -1,0000 1,0000 1,0000
(Tamaño de muestra) (2) (2) (2) (2)
P- valor 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
Inhibición alfa amilasa -0,8739 -0,6787 0,9874 1,0000
(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2)
P- valor 0,1261 0,3213 0,0126 0,0000
Inhibición difusión glucosa -0,8561 -0,5579 0,9531 1,0000 0,9739
(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2) (4)
P- valor 0,1439 0,4421 0,0469 0,0000 0,0261
Inhibición hemolisis -0,6251 -0,9098 0,6294 1,0000 0,5591
(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2) (4)
P- valor 0,3749 0,0902 0,3706 0,0000 0,4409
ORAC 1,0000 1,0000 -1,0000 -1,0000 -1,0000
(Tamaño de muestra) (2) (2) (2) (2) (2)
P- valor 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
Inhibición difusión glucosa -0,8561 -0,5579 0,9531 1,0000 0,9739
(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2) (4)
P- valor 0,1439 0,4421 0,0469 0,0000 0,0261
93
Tabla 15. Pares de variables con valores- P < 0,05
Variables
ABTS FRAP
ABTS ORAC
DPPH FRAP
DPPH ORAC
Fenoles FRAP
Fenoles Inhibición alfa amilasa
Fenoles Inhibición difusión glucosa
Fenoles ORAC
Fenoles Inhibición difusión glucosa
FRAP Inhibición alfa amilasa
FRAP Inhibición difusión glucosa
FRAP Inhibición hemolisis
FRAP ORAC
FRAP Inhibición difusión glucosa
Inhibición alfa amilasa Inhibición difusión glucosa
Inhibición alfa amilasa ORAC
Inhibición alfa amilasa Inhibición difusión glucosa
Inhibición difusión glucosa ORAC
Inhibición hemolisis ORAC
ORAC Inhibición difusión glucosa
94
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
De los resultados obtenidos se puede concluir que Passiflora vitifolia es una
especie vegetal caracterizada, entre otras, por poseer flores llamativas de
tonalidad escarlata, frutos ovoides de coloración verde con manchas blancas
diseminadas longitudinalmente, que contienen gran cantidad de semillas las
cuales conservan algunas de las características morfo-anatómicas del fruto tales
como la forma y la dureza. Los fenoles son los más abundantes fitocompuestos
de los subproductos del fruto, acompañados de baja cantidad de alcaloides; el
mejor solvente para extraer estos constituyentes es el etanol (96%).
La actividad antiradicalaria fue mayor frente al ABTS en relación al DPPH, en
tanto que la actividad antioxidante por el método ORAC fue superior que en
FRAP, pero siempre mostrando a los constituyentes provenientes de la semilla
como los más activos.
La bioprospección de esta especie no-convencional de Passiflora se evidenciaría
por su aplicación como:
Nutracéutico para incrementar la estabilidad y calidad de productos
alimenticios, lo cual estaría respaldado por la abundante presencia de
compuestos fenólicos ampliamente reconocidos por su actividad
antioxidante.
Tratamiento de enfermedades del sistema circulatorio y vasculopatías
diabéticas, sustentado por el contenido de rutina, tanto en cáscara como
en semilla; compuesto que a su vez puede ser utilizado como
quimiomarcador de la especie.
La presencia de ácido p-cumárico justificaría su uso en productos
probióticos para mejorar la función intestinal. Este constituyente, al igual
95
que el anterior, podría ejercer la función de quimiomarcador a la hora de
identificar la especie o de verificar la autenticidad de la especie.
Una opción más es el uso de P. vitifolia como aditivo en la elaboración de
cosméticos no terapéuticos, respaldado por la presencia de ácido
sinápico, un derivado hidroxicinámico presente en la cáscara. También
esta parte del fruto contiente ácido clorogénico, lo que permite la
aplicación del fruto para mejorar el metabolismo lipídico y promover la
pérdida de peso mediante la reducción de la síntesis de la grasa visceral,
colesterol y ácidos grasos.
Las cantidades significativas de proteína y grasa cruda en las semillas asi
como la alta concentración de fibra y carbohidratos en la cáscara, hacen
de esta especie un producto promisorio en la alimentación animal.
Adicionalmente, el rendimiento y elevado nivel de ácidos grasos
insaturados del aceite extraído de las semillas dá valor agregado a los
subproductos de este fruto por su aplicación en la industria alimentaria.
En particular, las semillas pueden aprovecharse como material crudo en
varias industrias que incluyen la de alimentos, cosmetológica,
farmacológica y biodiesel.
El extracto etanólico de semilla de P. vitifolia podría implementarse como
suplemento dietético en la planificación alimenticia de personas con
diabetes tipo 2.
Sin embargo, se necesitan más estudios que corroboren los efectos in vitro
observados en este trabajo lo que representa un potencial terapéutico que podría
limitar la absorcion de glucosa posprandial y mejorar así el control glucémico en
pacientes con diabetes de tipo 2.
El conjunto de los resultados deja ver usos promisorios del fruto, abre
posibilidades de trabajos de mayor especificidad y grado de profundidad para
una especie no convencional y de limitado conocimiento científico de una
Passiflora procedente de la región andina del Tolima. Este parece ser el primer
96
trabajo realizado para estudiar las características físicas, químicas y biológicas
de Passiflora vitofolia en Colombia. En nuestro grupo de investigación,
GIPRONUT, se continúa trabajando en este sentido.
97
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120
ANEXOS
121
Anexo A. Consentimiento informado.
122
123
Anexo B. Identificación taxonómica P. vitifolia
124
125
126
![352-(72 '( /(, 1 '( '( $*2672 '( /'2 25,*(0 (;(&87,92 ... · 352-(72 '( /(, 1 '( '( $*2672 '( /'2 25,*(0 (;(&87,92 'lvs}h vreuh dv gluhwul]hv sdud d hoderudomr h h[hfxomr gd /hl](https://img.document.onl/doc/110x75/5fd0b305dcd21e6d95072793/352-72-1-2672-2-250-8792-352-72-1-.jpg)
