potencial de fungos para combate de carrapatos vetores da febre

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

WALMIRTON BEZERRA D’ALESSANDRO

POTENCIAL DE FUNGOS PARA COMBATE DE

CARRAPATOS VETORES DA FEBRE MACULOSA

Orientador: Prof. Dr. Wolf Christian Luz

Co-orientador: Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes

Tese de Doutorado

Goiânia – Goiás, 2012

Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal

de Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [X] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor(a): Walmirton Bezerra D’Alessandro CPF: 729.439.201-34 E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não

Vínculo Empregatício do autor Não Agência de fomento: - Sigla: País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: POTENCIAL DE FUNGOS PARA COMBATE DE CARRAPATOS VETORES DA

FEBRE MACULOSA

Palavras-chave: Amblyomma cajennense, Rhipicephalus sanguineus, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Purpureocillium lilacinum, micoacaricida.

Título em outra língua: POTENTIAL OF FUNGI TO CONTROL TICK VECTORS OF THE ROCKY MOUNTAIN SPOTTED FEVER

Palavras-chave em outra língua: Amblyomma cajennense, Rhipicephalus

sanguineus, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Purpureocillium lilacinum, micoacaricide.

Área de concentração: Parasitologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 12/12/2012 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública Orientador(a): Wolf Christian Luz CPF: 695.616.641-00 E-mail: [email protected] Co-orientador(a): Éverton Kort Kamp Fernandes CPF: 071.248.587-20 E-mail: [email protected]

3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [X] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: _____________________________________________ [ ] Outras restrições: _________________________________________________

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

________________________________________ Data: 12/12/ 2012 Assinatura do autor

1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

WALMIRTON BEZERRA D’ALESSANDRO

POTENCIAL DE FUNGOS PARA COMBATE DE CARRAPATOS

VETORES DA FEBRE MACULOSA

Orientador:

Prof. Dr. Wolf Christian Luz

Co-orientador: Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública.

Esse trabalho foi realizado com o auxílio financeiro do CNPq Universal processo

473141/2010-8 e com a taxa de bancada fornecida pelo mesmo órgão.

Goiânia – Goiás, 2012

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(GPT/BC/UFG)

D’Alessandro, Walmirton Bezerra. D141p Potencial de fungos para combate de carrapatos

vetores da febre maculosa [manuscrito]/ Walmirton Bezerra D’Alessandro . - 2012. xi, 86 f.: il., figs., tabs. Orientador: Prof. Wolf Christian Luz. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goias, Instituto de Patologia Tropical e Saude Publica, 2012. Bibliografia Inclui listas de figuras, siglas e abreviaturas

1. Carrapato. 2. Beauveria bassiana 3.

Purpureocillium lilacinum 4. Metarhizium anisopliae 5. micoacaricida. I. Título

CDU: 95.42:616.995.42

iii

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO

Aluno: Walmirton Bezerra D’Alessandro

Orientador: Wolf Christian Luz

Co-orientador: Éverton Kort Kamp Fernandes

Membros:

1. Rogério Biaggioni Lopes

2. Eliane Quintela

3. Walquíria Arruda

4. Lígia Miranda Borges

Data: 12 /12/2012

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 v

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Wolf Christian Luz, pela paciência, estímulo no meu processo de

crescimento pessoal e profissional, além da excepcional dedicação a esta pesquisa.

Ao Professor Éverton Kort Kamp Fernandes pela co-orientação, estímulo e

tranquilidade em repassar seus conhecimentos nos bons e difícies momentos.

Ao Richard A. Humber pela ajuda na identificação de fungos patogênicos de

carrapatos.

Ao CNPq pelo auxílio financeiro o qual me foi concedido e bolsa de estudos,

sendo de extrema importância para o desenvolvimento desta pesquisa.

Ao Jeremias Lunardelli pela oportunidade e espaço concedido na Fazenda

Santa Branca, para realização dos experimentos de semi-campo e levantamento de

fungos neste local.

Ao Professor André Kipnis, pela paciência, dedicação no ensinamento da arte

molecular. Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular em especial ao Lázaro

Moreira Marques Neto, Rogério Coutinho das Neves, Fábio Muniz de Oliveira, Viviane

Lopes Rocha e Renato Beilner Machado.

Aos funcionários do IPTSP, em especial José Clementino de Oliveira Neto

(Zezinho) e Kariny Vieira Soares pelo carinho e atenção.

Ao Bruno Sérgio Alves Silva do Centro de Zoonoses de Goiânia pela

cooperação das coletas de Rhipicephalus sanguineus em cães e toda sua equipe.

Ao Durval da Rocha Ferreira “Ananias”, pela assitência na coleta de carrapatos

em cavalos na Fazenda Santa Branca.

Ao Laboratório de Patologia de Invertebrados LPI/UFG, pelo espaço físico e

equipamentos utilizados na realização dos bioensaios.

A todos os colegas do LPI em especial Renan Nunes Leles, Macsuel Corado

Barreto, Géssica Bueno Bárbara, Flávia Regina Santos da Paixão, Fabrício Moreira

Alves e Tássio Lima Tavares que deram apoio referente aos estudos com carrapatos.

Aos meus pais, Walmirton Thadeu D’Alessandro e Celina Barbosa Bezerra

D’Alessandro que acompanharam diretamente meu esforço e persistência na procura de

Ambyomma cajennense para o desenvolvimento desta pesquisa. A Aline Almeida

Barbaresco, pela paciência, dedicação, amor e companheirismo. Aos meus irmãos

Emmanuel Bezerra D’Alessandro e Andre Luiz Bezerra D’Alessandro, que mesmo

depois de levarem picadas acidentais de ninfas de A. cajennense, decorrente de escapes

das mesmas tiveram paciência e levaram na esportiva.

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 vi

“Meus ouvidos tinham

escutado falar de ti, mas agora

meus olhos te viram”.

Jó 42,5

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................. viii LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS................................................................................. ix RESUMO..................................................................................................................................... x ABSTRACT................................................................................................................................. xi

1-INTRODUÇÃO........................................................................................................................ 1

1.1- Carrapatos.......................................................................................................................... 2 1.1.1- Aspectos biológicos de Amblyomma cajennense e Rhipicephalus sanguineus............ 2 1.1.2- A importância de carrapatos na saúde humana e animal.............................................. 6

1.2- Métodos de controle de carrapatos..................................................................................... 9 1.3- Fungos entomopatogênicos................................................................................................ 11 1.4- Aspectos biológicos de fungos entomopatogênicos........................................................... 11 1.5- Associação de carrapatos e fungos..................................................................................... 12 1.6- Desenvolvimento de micoacaricidas.................................................................................. 14

1.6.1-Produção de fungos........................................................................................................ 14 1.6.2-Formulações e aplicações de fungos.............................................................................. 14 1.6.3- Segurança de fungos..................................................................................................... 15

2- JUSTIFICATIVA.................................................................................................................... 16

3- OBJETIVOS............................................................................................................................ 18

3.1- Objetivo Geral.................................................................................................................... 19 3.2- Objetivos Específicos......................................................................................................... 19

4- RESULTADOS....................................................................................................................... 20

4.1-Manuscrito 1- Ocorrência de fungos patogênicos em Amblyomma cajennense em uma área rural do Centro-Oeste do Brasil e sua atividade contra vetores da Febre Maculosa.........

21

4.2-Manuscrito 2- Susceptibilidade de ovos e larvas de Rhipicephalus sanguineus a Metarhizium anisopliae aplicado em solo sob condições de laboratório.................................

34

4.3-Manuscrito 3- Formulados aquoso e oleoso de Metarhizium anisopliae e sua aplicação em ovos de Rhipicephalus sanguineus.....................................................................................

44

4.4-Manuscrito 4- Atividade e persistência de formulação oleosa de Metarhizium anisopliae sobre Amblyomma cajennense em teste de semi-campo no Centro-Oeste do Brasil.........................................................................................................................................

56

5-DISCUSSÃO............................................................................................................................ 70

6- CONCLUSÕES....................................................................................................................... 73

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................... 75

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Macho de Amblyomma cajennense, com festões (seta) e escudo dorsal (A), espinhos

desiguais entre o primeiro e o quarto par de pernas (seta) (B). Fêmea de A. cajennense, com o

escudo dorsal pequeno (seta) (C) e peritrema após o quarto par de pernas (D).............................

3

Figura 2. Ciclo biológico de Amblyomma cajennense (adaptado de Pereira & Labruna 1998)... 4

Figura 3. Macho (A) e fêmea (B) de Rhipicephalus sanguineus, sendo possível observar o

peritrema (C, D) (seta)...................................................................................................................

5

Figura 4. Ciclo biológico de Rhipicephalus sanguineus............................................................... 6

Figura 5. Lesões em cavalo provocadas por alta taxa de parasitismo de Amblyomma

cajennense......................................................................................................................................

7

Figura 6. Gêneros de fungos mais comuns que ocorrem sobre artrópodes, Metarhizium (A) e

Beauveria (B) (adaptado de Alves 1998).......................................................................................

11

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 ix

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS AFLP................................................................Amplified fragment length polymorphism

ANOVA............................................................................................ Análise de Variância

APV.......................................................................................................Álcool de Polivinil

B.D.A................................................................................................Batata Dextrose Ágar

CIE50................................................................concentração inibitória de 50% de eclosão

CIE90................................................................concentração inibitória de 90% de eclosão

CL50 ..................................................... Concentração para matar 50% das larvas testadas

CL90 ..................................................... Concentração para matar 90% das larvas testadas

CLs..................................................................................................... Concentrações letais

CTC................................................................Cloranfenicol, Tiabendazol e Cicloexamida

EPM................................................................................................. Erro Padrão da Média

FM..............................................................................................................Febre Maculosa

h...................................................................................................................................horas

IC.....................................................................................................Intervalo de confiança

IPTSP...................................................... Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

K2CO3...............................................................................................Carbonato de potássio

LPI................................................................... Laboratório de Patologia de Invertebrados

NaCl......................................................................................................... Cloreto de sódio

p.....................................................................................................................probabilidade

PCR................................................................................ Reação de Cadeia da Polimerase

RAPD..........................................................Random Amplification of Polymorphic DNA

RFLP............................................................ Restriction Fragment Length Polymorphism

SDAL......................................................................Sabouraud Dextrose Agar e Levedura

SVS/MS.................................. Secretaria da Vigilância da Saúde do Ministério da Saúde

TL50................................................................................................... Tempo Letal de 50%

TL90................................................................................................... Tempo Letal de 90%

UFC...................................................................................Unidade Formadora de Colônia

UFG................................................................................... Universidade Federal de Goiás

UR...........................................................................................................Umidade Relativa

WGS..............................................................................................World Geodetic System

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 x

RESUMO

Amblyomma cajennense e Rhipicephalus sanguineus são carrapatos que possuem

grande importância médica e veterinária como transmissores de doenças. As

dificuldades existentes no controle de A. cajennense e R. sanguineus, incluindo o

desenvolvimento de resistência a alguns acaricidas químicos sintéticos, principais

produtos utilizados em seu controle, incitam estudos para o desenvolvimento de

medidas alternativas mais eficientes e de menor impacto ambiental. Dentre as

estratégias estudadas, fungos patogênicos para carrapatos parecem ser uma opção

eficiente e segura. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência natural de fungos

em solo e em A. cajennense em uma área do Centro-Oeste do Brasil, além de verificar a

patogenicidade destes fungos para A. cajennense e R. sanguineus. Adicionalmente.

foram avaliadas, em condições de laboratório, formulações e aplicações de Metarhizium

anisopliae s.l. IP 46 sobre ovos de R. sanguineus. Em condições de semi-campo IP 46

teve persistência estudada no solo. Fêmeas ingurgitadas de carrapatos foram coletadas

em hospedeiros sem resíduos de acaricidas. No laboratório foram lavadas, com água

estéril e colocadas em placas de Petri. Foi escolhido o menor número de ovos (25 ovos

aglomerados) que pode ser utilizado em teste de laboratório sem que os ovos perdessem

a viabilidade. Suspensões de conídios de IP 46 foram preparadas, e com auxílio de uma

micropipeta foram aplicadas indiretamente em solo ou testadas formulações oleosas ou

aquosas em aglomerados de ovos de R. sanguineus. Beauveria bassiana,

Purpureocillium lilacinum e M. anisopliae foram isolados de A. cajennense ou em

habitats (solo) em uma área do Centro-Oeste do Brasil, especialmente em época

chuvosa. No teste de patogenicidade, teleóginas de R. sanguineus revelaram ser mais

susceptíveis do que A. cajennense. Ovos de R. sanguineus foram altamente susceptíveis

à infecção com M. anisopliae em solo com umidade alta. O desenvolvimento de IP 46

sobre os conjuntos de ovos, eclosão e sobrevivência de larvas dependeram do

formulado, da aplicação e da concentração dos conídios. Larvas eclodidas só foram

observadas em aplicações indiretas. Formulados à base de óleo têm mais atividade

ovicida e larvicida do que formulados aquosos e poderiam ser empregados na

preparação de micoacaricidas, sendo utilizados como nova estratégia para controle de

carrapatos.

Palavras chave: carrapato, Beauveria bassiana, Purpureocillium lilacinum,

Metarhizium anisopliae, micoacaricida, formulação.

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 xi

ABSTRACT

Amblyomma cajennense and Rhipicephalus sanguineus ticks have great medical and

veterinary importance as disease carriers. The difficulties in controlling A. cajennense

and R. sanguineus, including the development of acaricide resistance to some synthetic

chemicals, main products used in their control, encourage the development of

alternatives and fewer environments. Among different strategies; pathogenic fungi seem

to be a safe and efficient option to control ticks. The objective of this study was to

evaluate the occurrence of fungi in natural habitats of A. cajennense in an area in the

Midwest of Brazil and to verify the pathogenicity of these fungi to A.cajennense and R.

sanguineus. Additionally, formulations and applications of IP 46 were evaluated in

laboratory on eggs of R. sanguineus. In semi-field conditions persistence of IP 46 was

studied. Engorged female ticks were collected from hosts without residues of acaricides.

In the laboratory they were washed with sterile water and placed in Petri dishes. The

smallest number of eggs (25 egg clusters) was chosen that could be used in a test lab

without losing viability of the eggs. Suspensions of conidia were prepared and

Metarhizium anisopliae s.l. IP 46, was applied indirectly tested in soil or oily and

aqueous formulations containing egg clusters of R. sanguineus. Beauveria bassiana,

Purpureocillium lilacinum and M. anisopliae were isolated in an area of the Midwest of

Brazil, especially in the rainy season. In pathogenicity tests, R. sanguineus proved to be

more susceptible than A. cajennense. Eggs of R. sanguineus were highly susceptible to

infection by M. anisopliae in soil and high humidity. The development of IP 46 over

sets of eggs hatching and larval survival depended on the formulation type, application

method and concentration of conidia. Hatched larvae were only observed in indirect

applications of eggs. Oil-based formulation was more ovicidal than aqueous suspension

and formulated conidia could be used in the preparation of micoacaricidas, being used

as a new strategy for tick control.

Key words: tick, Beauveria bassiana, Paecilomyces lilacinus, Metarhizium anisopliae,

mycoacaricide, formulation.

1- INTRODUÇÃO

D’Alessandro WB – Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – Parasitologia – IPTSP/2012 2

1.1- Carrapatos

Os carrapatos pertencem ao filo Arthropoda e classe Arachnida. Os carrapatos

Amblyomma cajennense e Rhipicephalus sanguineus, estão entre as espécies mais

comuns encontradas no Brasil (Barker & Murrell 2004).

As larvas de carrapatos se transformam em ninfas e depois adultos. As larvas

apresentam três pares de patas podendo ser diferenciadas dos estágios subsequentes, que

possuem quatro pares de patas.

O número de ovos postos pelas fêmeas varia entre espécies (Labruna et al.

1997, Prata & Daemon 1997). Em geral os ovos medem menos de 1 mm e formam

aglomerados que os protegem contra ressecamento, e favorecem maior eclodibilidade

das larvas (Kurup et al. 2008).

Ixodídeos adultos têm dimorfismo sexual acentuado. Nos machos o escudo

dorsal é rígido, quitinoso e cobre todo o dorso. Nas fêmeas o escudo dorsal estende-se

apenas em uma parte do dorso, permitindo a dilatação do abdômen durante a

alimentação.

1.1.1- Aspectos morfológicos e biológicos de Amblyomma cajennense e

Rhipicephalus sanguineus

Os machos de A. cajennense possuem um sulco marginal distinto, com a

presença de festões (Figura 1 A). O escudo dorsal é castanho com faixas esbranquiçadas

ou acobreadas que dão um aspecto de pseudo-escudo à região anterior do corpo

(Flechtmann 1973). Na coxa do primeiro par de pernas do macho encontram-se dois

espinhos desiguais, e no quarto par de pernas um espinho longo (Figura 1 B). Nos tarsos

do primeiro par de pernas localiza-se o órgão de Haller, o qual possui células olfativas

receptoras com as quais o carrapato detecta umidade e odores estimulantes ao carrapato,

como CO2 e feromônios (Gachoka 2010).

As fêmeas têm um escudo dorsal subtriangular, sem vestígios de depressões

laterais, de coloração castanha-escura e com manchas esbranquiçadas ou acobreadas,

contínuas na parte médio-posterior (Figura 1 C). As coxas do primeiro par de pernas

possuem dois espinhos iguais e as do quarto par de pernas têm um espinho. Atrás do

quarto par de pernas encontra-se o peritrema em forma de “ferradura” (Figura 1 D)

(Flechtmann 1973).


Figura 1. Macho de Amblyomma cajennense, com festões (seta) e escudo dorsal (A),

espinhos desiguais entre o primeiro e o quarto par de pernas (seta) (B). Fêmea de

A. cajennense, com o escudo dorsal pequeno (seta) (C) e peritrema após o quarto par

de pernas (D).

A. cajennense é conhecido na fase adulta como “carrapato-estrela” ou

“rodoleiro”, devido a sua ornamentação do escudo dorsal. Na fase de ninfa, por

“vermelhinhos” e quando no estado larval, por “carrapatinhos” ou “micuins” (Pereira &

Labruna 1998).

Larvas e ninfas de A. cajennense têm baixa especificidade por hospedeiros e

parasitam o homem, além de cavalos e outros animais domésticos, como cães e gatos, e

animais silvestres como gambás, ratos, coelhos, capivaras e aves (Lopes et al. 1998,

Oyafuso et al. 2002, Martins et al. 2004). Em ambientes rurais, o cavalo é o hospedeiro

mais parasitado, e em áreas silvestres o hospedeiro mais comumente parasitado é a

capivara.


Esta espécie necessita de três hospedeiros para completar seu ciclo. As fêmeas

adultas, depois de fecundadas e ingurgitadas, desprendem-se do hospedeiro, caem ao

solo à procura de abrigo para realizar postura única com cerca de 6 a 8 mil ovos e

depois morrem. Após aproximadamente 30 dias de incubação à 25ºC as larvas eclodem.

Elas sobem nas gramíneas, arbustos e até em árvores, esperando a passagem de

hospedeiros. Ao encontrar um hospedeiro as larvas iniciam o hematofagismo por um

período entre 3 e 6 dias, desprendem-se e caem no solo onde transformam-se em ninfas

após 18 a 26 dias. Essas ninfas fixam-se em outro hospedeiro e em 6 dias ingurgitam-se

de sangue, voltam ao solo e após 23 a 25 dias transformam-se em adultos (Pereira &

Labruna 1998). O ciclo biológico é sazonal com apenas uma geração (larva, ninfa e

adulto) e marcadamente distribuído ao longo do ano (Pereira & Labruna 1998, Oliveira

et al. 2000, Labruna et al. 2002). As larvas predominam nos meses de março a julho, as

ninfas de julho a novembro e os adultos nos meses quentes e chuvosos, de novembro a

março (Camargo-Neves et al. 2004) (Figura 2).

Figura 2. Ciclo biológico de Amblyomma cajennense (adaptado de

Pereira & Labruna 1998).

Os machos de R. sanguineus possuem um escudo dorsal marrom-avermelhado

(Figura 3 A). Fêmeas adultas de R. sanguineus têm o corpo elíptico e possuem

coloração marrom-avermelhada a amarelada (Figura 3 B). Os peritremas nos dois sexos

têm forma de vírgula (Flechtmann 1973) e situam-se após o quarto par de pernas

(Figura 3 C e D).


Figura 3. Macho (A) e fêmea (B) de Rhipicephalus

sanguineus, sendo possível observar o peritrema (C, D)

(seta).

R. sanguineus é considerado cosmopolita. É conhecido como “carrapato

vermelho do cão”. Esse carrapato parasita principalmente o cão doméstico e

secundariamente outros mamíferos, inclusive o homem (Dantas-Torres et al. 2006,

Louly et al. 2006). Os adultos vivem aproximadamente um ano e sua sobrevivência

prolonga-se em regiões de clima temperado (Rey 2002).

O ciclo biológico de R. sanguineus corresponde a um ciclo trioxeno (Figura 4),

ou seja, necessita de três hospedeiros para desenvolver seus estágios. Fêmeas

ingurgitadas, após destacarem do terceiro hospedeiro, procuram um abrigo no solo,

onde cada fêmea deposita cerca de um mil a três mil ovos aglomerados, sendo o período

de ovipostura em média de 8 a 67 dias (Labruna 2004). O desenvolvimento embrionário

nos ovos depende diretamente da temperatura sendo que em baixas temperaturas é

retardado (Koch & Tuck 1986, Bellato & Daemon 1997, Carneiro & Daemon 2003). As

larvas ao eclodirem (19 a 142 dias), vão procurar abrigo em arbustos e frestas de

paredes. Estas larvas vão ao encontro do hospedeiro e se fixam sugando sangue.

Posteriomente, as larvas caem no solo e se transformam em ninfas sendo este processo,

de 3 a 7 dias, depedente da temperatura local. A ninfa procura um hospedeiro e

ingurgita-se de sangue, dando origem ao adulto entre 12 e 129 dias (Labruna 2004)

(Figura 4).


Figura 4. Ciclo biológico de Rhipicephalus sanguineus.

1.1.2- A importância de carrapatos na saúde humana e animal

Os carrapatos alimentam-se de sangue de vertebrados, principalmente

mamíferos, mas também de aves, répteis e anfíbios. Ocasionam grandes prejuízos, tanto

no meio veterinário infestando equídeos, ovinos, caprinos e animais silvestres, entre

outros, quanto no meio médico, infestando humanos (Rojas et al. 1999, Lemos et al.

2002, Martins et al. 2004, Dantas-Torres et al. 2006). Formas imaturas de

R. sanguineus, parasitam humanos no exterior e no Brasil (Clarck et al. 1996, Felz et al.

1996, Dantas-Torres et al. 2006). Em Goiânia foram observadas larvas em pessoas em

áreas residenciais (Louly et al. 2006, D’Alessandro dados não publicados). Podem

inocular toxinas juntamente com a saliva durante o hematofagismo. Essas toxinas

afetam o metabolismo do hospedeiro e podem causar astenia, hipersensibilidade,

decréscimo do hematócrito, paralisia e até a morte do hospedeiro (Flechtmann 1973).

Os carrapatos são responsáveis por danos físicos a peles e couros de animais. O

homem quando é atacado por larvas e ninfas desenvolve reações alérgicas relacionadas

às picadas que são extremamente pruriginosas. O tamanho reduzido desses estágios

dificulta a localização e a retirada do corpo. Os adultos são relativamente grandes, o que

facilita sua localização e retirada (Camargo-Neves et al. 2004). Além da espoliação

sanguínea do hospedeiro, ocorrem lesões em locais de fixação (Flechtmann 1973,

Marcondes 2001, Costa & Botelho 2005) (Figura 5).


Figura 5. Lesões em cavalo provocadas por alta taxa de parasitismo por

Amblyomma cajennense.

Os carrapatos podem transmitir bactérias, dos gêneros Rickettsia, Ehrlichia,

Anaplasma e Borrelia, provocando enfermidades em humanos e animais como febre

maculosa (FM) (Lemos et al. 1997, Pereira & Labruna 1998, 2002, Leiby 2011),

erliquiose (Almonsny & Massard 1999), anaplasmose (Piesman & Eisen 2008) e doença

de Lyme (Joppert et al. 2001, Fonsesa et al. 2005, Mantovani et al. 2007). Os carrapatos

também estão envolvidos na transmissão do vírus do oeste do Nilo e protozoários como

Leishmania spp. e Babesia spp. em homens e animais (Leiby 2011).

Por desenvolver-se em ambientes sinantrópicos no Centro-Oeste, Sudeste e

Nordeste no Brasil, onde ocorre em altas densidades, existe risco de aumento da

incidência de zooantroponoses emergentes como erliquiose, babesiose e febre maculosa

transmitidas por R. sanguineus (Andereg & Passos 1999, Costa & Botelho 2005).

Devido à semelhança na sintomatologia e métodos pouco específicos de diagnóstico,

tais enfermidades são às vezes confundidas com outras doenças, o que pode levar ao

diagnóstico tardio e até a morte de pacientes (Hoogstraal 1967, Veronesi 1982, Harrison

et al. 1997).

A febre maculosa (FM) é uma enfermidade causada por Rickettsia rickettsii,

uma bactéria gram-negativa intracelular obrigatória. Também é conhecida como febre

maculosa brasileira (Brasil), Rocky Mountain spotted fever (Estados Unidos), fiebre

manchada (México) e fiebre de Tobia (Colômbia). Tem sido relatada em diferentes

estados brasileiros com maior prevalência em Minas Gerais e São Paulo (Del Guercio et

al. 1997, Galvão et al. 2003, SVS/MS 2006). No Centro-Oeste há apenas três casos

registrados, dois foram notificados no Distrito Federal em 2005 e 2006, e outro caso em

Pires do Rio-Goiás em 2010 (SINAN 2011).


Os principais sintomas da FM são pouco específicos como febre alta, cefaléia e

mialgia, o que dificulta o diagnóstico clínico definitivo. Em cerca da metade dos casos,

aparecem petéquias a partir das extremidades, espalhando-se para todo o corpo

(SVS/MS 2006). Além do homem, cães domésticos desenvolvem a forma clínica da

FM, embora seja menos letal do que em humanos. Quanto mais precoce o tratamento,

menor os índices de letalidade (Fortes et al. 2011).

No Brasil o principal vetor de R. rickettsii é o A. cajennense. Há evidências de

que essa espécie seja vetor também na Argentina. Ainda no Brasil, Amblyomma

aureolatum é outro vetor da FM em locais específicos de São Paulo (Barros-Battesti et

al. 2006). Acredita-se que existam cepas brasileiras de R. sanguineus adaptadas ao

homem como hospedeiro, a exemplo, de outros países, como no México, onde essa

espécie é considerada principal vetor da FM para o homem (Sanchez et al. 2009,

Eremeeva et al. 2011).

Os vetores mais comuns de R. rickettsii nos Estados Unidos e no Canadá são

Dermacentor andersoni e Dermacentor variabilis. Além dessas espécies, R. rickettsii já

foi isolada do “carrapato de coelho”, Haemaphysalis leporispalustris, na Costa Rica e

nos Estados Unidos. Suspeita-se de que esta espécie tenha um papel no ciclo enzoótico

da bactéria (Nicholson et al. 2006, Hun et al. 2008). Nos Estados Unidos R. sanguineus

já foi confirmado como vetor (Demma et al. 2005).

Nos carrapatos, R. rickettsii pode ser passada de geração para geração, através

de transmissão transovariana e sobrevivência transestadial (SVS/MS 2006). Resultados

de testes de laboratório demonstraram que a infecção por R. rickettsii pode ser letal

também para o vetor (SVS/MS 2006). Sendo assim, o carrapato, embora seja o principal

reservatório da bactéria, não é suficiente para mantê-la na natureza (SVS/MS 2006).

Hospedeiros vertebrados podem ser amplificadores da infecção por R. rickettsii e

tornam-se essenciais para a sobrevivência do patógeno (SVS/MS 2006). Um hospedeiro

(cavalo, capivara) amplificador é aquele que é frequentemente parasitado por estágios

imaturos do carrapato vetor e, ao mesmo tempo, é capaz de se infectar com bactérias e

desenvolver bacteremia. Para que ocorra a transmissão da bactéria para humanos é

necessário que o artrópode permaneça aderido ao homem, por no mínimo 4 a 6 horas

(SVS/MS 2006).

Síndrome infecto-reacional Lyme símile é conhecida também por doença de

Baggio-Yoshinari e tem A. cajennense como vetor do agente causador desta

enfermidade infecciosa, que é emergente no Brasil. Esta doença está associada com


bactérias de atividade latente, na qual ocorrem manifestações semelhantes à doença de

Lyme (Shinjo et al. 2009). Os sinais clínicos são erupções na pele, no local de fixação

do carrapato, seguidas por artrite, dores musculares e anormalidades cardíacas ou

neurológicas (Mantovani et al. 2007). Os quadros clínicos seguidos de cardiopatia têm

sido raramente descritos no Brasil. Em apenas 5% dos casos estudados pacientes

apresentaram quadro clínico com cardiomegalia e arritmia. O tratamento da síndrome

infecto-reacional Lyme símile no Brasil é semelhante ao recomendado para a doença de

Lyme nos EUA e Europa, porém é mais prolongado para prevenir recidivas (Mantovani

et al. 2007).

R. sanguineus pode participar na epidemiologia da leishmaniose viceral.

Experimentalmente uma cepa de Leishmania chagasi foi inoculada em R. sanguineus e

posteriormente o macerado de carrapatos inoculado via oral e peritoneal em hamsteres

(Coutinho et al. 2005). O protozoário foi encontrado em maior porcentagem em

hamsteres que receberam cepas inoculadas via peritoneal. O cachorro sendo o principal

animal doméstico parasitado por R. sanguineus poderia ser um reservatório de

protozoários como L. chagasi, tendo em vista que este animal come carrapatos

(Coutinho et al. 2005).

A babesiose é uma doença que é transmitida ao homem por carrapatos

infectados ou por transfusão sanguínea (Leiby 2011). Um estudo feito durante 1979 a

2009 nos Estados Unidos revelou que houve 159 casos da doença associada à transfusão

sanguínea, e que 77% desses casos ocorreram entre 2000 a 2009 (Leiby 2011).

1.2- Métodos de controle de carrapatos

Dentre os métodos de controle empregados contra carrapatos, o uso de

acaricidas químicos sintéticos ainda é a principal ferramenta utilizada. Entretanto, ao

longo dos anos, muitos carrapatos foram capazes de sobreviver à maioria dos produtos

químicos utilizados para o seu controle, fenômeno denominado de resistência (FAO

1995, 2004). A aplicação dos produtos de forma errônea, com dosagens inferiores às

recomendadas pelo fabricante, talvez seja, uma das situações mais relevantes para o

surgimento de resistência em populações de carrapatos (FAO 1995, 2004, Piesman &

Eisen 2008).

Estudos foram feitos para análise da resistência de R. sanguineus a diferentes

grupos de acaricidas e baixa eficiência de cumafós foi detectada sobre fêmeas adultas

dessa espécie na Venezuela (Conrado & Mujica 1998), enquanto que no Panamá, R.


sanguineus mostrou-se resistente não só ao cumafós como também à permetrina, DDT e

amitraz (Miller et al. 2001). No Brasil, o controle de A. cajennense tem sido feito

indiscrimidamente, através do uso de produtos carrapaticidas encontrados no comércio.

São usados acaricidas a base de organofosforados, carbamatos, amidinas e mais

recentemente piretróides sintéticos, em concentrações recomendadas para o controle do

carrapato de bovinos. As concentrações dos diferentes piretróides utilizadas no controle

de R. microplus nao tem mostrado boa eficiência no controle do A. cajennense,

demonstrando que este ixodídeo exige concentrações mais elevadas e intervalos entre

banhos estratégicos, para se obter sucesso no seu controle. Outros pesquisadores

recomendam que seja utilizado no controle quimico de A. cajennense doses de 1,8 vezes

maiores do que as recomendadas para controle de R. microplus (Barros-Battesti et al.

2006, Martins et al. 2006).

O manejo ambiental também é praticado e intercalado com o uso de inseticida.

Este médodo visa diminuir a população de carrapatos de uma determinada região,

retirado-se os animais de áreas infestadas até que todas, ou pelo menos a maioria das

larvas de carrapatos, sejam eliminadas (Mendes et al. 2008). Também o preparo do solo

e principalmente a aração, promove mudanças físicas no ambiente do solo podendo

diminuir a população de carrapatos. Época e profundidade de aração são dois pontos

importantes a serem observados. Além desses benefícios, estas práticas levam

frequentemente ao ressecamento da camada superficial do solo, ao enterrio de ovos,

larvas, ninfas e adultos de carrapatos.

Vacinas contra Rhipicephalus microplus estão disponíveis comercialmente

(GavacTM, Cuba, e Tick Guarda Plus®, Austrália). Estas vacinas possuem antígenos

recombinantes (Bm 86 e Bm 91) do intestino do carrapato. Quando injetada no

hospedeiro, a vacina atua no sistema imunológico do mesmo e produzem anticorpos

específicos que agridem o intestino do carrapato e podem levá-lo à morte ou, em alguns

casos, podem interferir na sua capacidade reprodutiva (Kemp et al. 1989). Entretanto, a

eficiência destas vacinas pode ser de moderada a baixa, em algumas populações de

carrapatos o que tornaria nescessário o emprego de medidas alternativas (Barros-

Battesti et al. 2006).


1.3- Fungos entomopatogênicos

Fungos entomopatogênicos são micro-organismos com grande potencial para o

controle de pragas. Métodos alternativos ao controle químico que auxiliem no controle

de artrópodes causando menor impacto ambiental têm sido muito pesquisados nos

últimos anos. Dentre as estratégias estudadas, fungos entomopatogênicos parecem ser

uma opção eficiente e segura (Zimmermann 2007a,b, Fernandes & Bittencourt 2008).

Fungos patogênicos a invertebrados têm ampla importância como reguladores

naturais (Alves 1998). Cerca de 80% das doenças de artrópodes são causadas por

fungos. Estima-se que existem mais de 700 espécies de fungos entomopatogênicas no

mundo, distribuídas em pelo menos 90 gêneros e muitos desses ocorrem provavelmente

no Brasil (Roy et al. 2006, Sosa-Gómez et al. 2010). Apesar da maioria das espécies

serem desconhecidas, poucas espécies, especialmente as dos gêneros Metarhizium,

Beauveria e Paecilomyces, foram as mais estudadas até o presente (Faria & Wraight

2007, Rocha et al. 2012).

1.4- Aspectos biológicos de fungos entomopatogênicos

A identificação e classificação de fungos entomopatogênicos são baseadas em

características morfológicas e moleculares. Dentre as características morfológicas,

estruturas macroscópicas de colônias sobre meio de cultivo e microscópicas

reprodutivas podem ser utilizadas para a identificação (Figura 6). Porém, meios

diferentes e mutações, podem levar a diferenças morfológicas de um mesmo isolado.

Figura 6. Gêneros de fungos mais comuns que ocorrem

sobre artrópodes, Metarhizium (A) e Beauveria (B)

(adaptado de Alves 1998).

A partir dos anos 80, técnicas moleculares foram se aprimorando e foram

incorporadas na identificação, diferenciação e classificação de fungos (Hibbett et al.

A B


2007). Com o surgimento da PCR (reação em cadeia de polimerase), foi possível

amplificar regiões do DNA e comparar o tamanho dos fragmentos amplificados entre

diferentes linhagens e espécies de fungos. A técnica de AFLP (amplified fragment

length polymorphism) é uma ferramenta que possibilita avaliar a diversidade genética

de uma população em estudo (Fernandes et al. 2009, 2010a). AFLP produz vários

marcadores de DNA altamente replicáveis de qualquer indivíduo e sua eficiência em

tempo e custo é superior ou igual àqueles de outros marcadores como isoenzimas,

RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) e RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism). Devido à sua facilidade de uso, marcadores AFLP estão sendo

aplicados na ecologia molecular de fungos (Fernandes et al. 2009, 2010a).

A maioria dos fungos entomopatogênicos inicia o ciclo biológico com adesão

de conídios à cutícula dos hospedeiros terrestres (carrapatos, baratas, triatomíneos). A

adesão de conídios envolve forças hidrofóbicas, eletrostáticas e interações fisiológicas

entre o fungo e a superfície do hospedeiro. Após a adesão, os conídios formam tubos

germinativos e hifas, e em alguns fungos há formação de apressório e grampo de

penetração. Em seguida, as hifas formadas penetram na cutícula. Proteases, quitinases e

lipases são produzidas e favorecem a penetração do fungo no hospedeiro (Moraes et al.

2003). Após a penetração, as hifas se ramificam e atingem a hemocele. O sistema

imunológico do hospedeiro exerce um papel de defesa e tenta impedir o crescimento

fúngico (Hajek & St. Leger 1994). Porém, fungos patogênicos conseguem vencer a

resposta imune do hospedeiro, colonizam o artrópode e excretam toxinas (Kirkland et

al. 2004, 2005, Pal et al. 2007). Essas toxinas, em associação a distúrbios na hemocele

provocados por crescimento de corpos hifais e micélio, levam o hospedeiro à morte. No

hospedeiro morto, o fungo invade vários sistemas como digestivo, nervoso e muscular

(Garcia et al. 2005) e posteriormente, hifas emergem dos espiráculos e da cutícula e há

esporulação. Os conídios sobre o cadáver podem ser disseminados no ambiente, pela

água, vento, animais e infectar novos hospedeiros (Alves 1998).

1.5- Associação de carrapatos e fungos

A infecção de carrapatos por fungos é favorecida por alta umidade, alta

temperatura e pouca incidência de raios ultravioletas (Fernandes & Bittencourt 2008). A

espécie e estágios de desenvolvimento de carrapatos, também contribuem para a

infecção fúngica (Samish et al. 2001). Estudos histopatológicos revelaram detalhes


sobre diversas fases da infecção em fêmeas ingurgitadas de R. microplus (Bittencourt et

al. 1995) e em ovos de R. sanguineus (Garcia et al. 2005).

Acredita-se que fungos entomopatogênicos podem exercer papel importante

como reguladores naturais de carrapatos, especialmente daqueles em fase de vida livre,

pois encontram-se no meio ambiente e não sobre o hospedeiro (Fernandes & Bittencourt

2008). Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae já foram isolados de R. microplus

e R. sanguineus coletados no campo, respectivamente (Costa et al. 2002, Fernandes et

al. 2003). No entanto, ainda pouco se sabe como os fungos intervêm na dinâmica de

populações em condições naturais.

A grande maioria das pesquisas sobre interação de carrapatos e fungos

realizadas nos últimos anos focalizou sobre a atividade fúngica em ovos, larvas, ninfas e

adultos, em condições de laboratório. Os resultados têm demonstrado o potencial de

fungos como agentes de controle de carrapatos (Samish & Rehacek 1999, Chandler et

al. 2000, Samish et al. 2004, Fernandes & Bittencourt 2008). Em geral, ovos e larvas

são as fases mais suscetíveis à infecção fúngica. Espécies e linhagens de fungos

entomopatogênicos, no entanto, podem apresentar variação de virulência para as

diferentes espécies e estágios de carrapatos (Fernandes & Bittencourt 2008). A atividade

de B. bassiana e M. anisopliae em condições de laboratório foi mostrada para vários

carrapatos, porém o maior número de estudos foi feito com R. microplus (Fernandes &

Bittencourt 2008).

Os conhecimentos sobre interações entre carrapatos e fungos patogênicos, ainda

são restritos, tanto em condições de laboratório como no campo (Tanada & Kaya 1993,

Hynes et al. 2008) e muitas vezes se baseiam em resultados obtidos com outros

artrópodes. Os primeiros testes combinando fungos com carrapaticidas químicos ou

formulações de fungos à base de óleos indicaram um avanço significativo no

desenvolvimento de métodos integrados eficientes (Lopes et al. 2007, Fernandes &

Bittencourt 2008, Souza et al. 2009).

Atualmente existe uma lista de 171 produtos a base de micopesticidas e

micoacaricidas comercializados no mundo (Faria & Wraight 2007). Estes produtos se

concentram na América do Sul (42,7%), na América do Norte (20,5%), Europa e Ásia

(12,3%), América Central (7%), África (2,9%) e Oceania (2,3%). O produto Metarril

SC 1037 (Itaforte Industrial de BioProdutos Agro-Florestais Ltda., Brasil) à base de M.

anisopliae é comercializado no Brasil e recomendado para o controle de hemipteros e

ixodídeos. Tick-EX EC (Novozymes Biologicals Inc., USA) é registrado nos Estados


Unidos e recomendado para o controle de ixodídeos e coleópteros. Metazam (Escuela

Agricola Panameriacana, Honduras) é registrado e vendido em Honduras, El Salvador,

Guatemala e Jamaica, para o controle de hemipteros, lepidopteros e ixodídeos (Faria &

Wraight 2007).

1.6- Desenvolvimento de micoacaricidas

1.6.1-Produção de fungos

Existem três sistemas de produção: laboratorial, artesanal e industrial. A

produção laboratorial é a mais utilizada quando visa pequenas quantidades de inóculo.

Nesse nível, fungos patogênicos são produzidos sobre meio de cultura sólido em placas

de Petri ou em meio líquido em frascos de Erlenmeyer para a obtenção de conídios,

corpos hifais ou micélio. A produção artesanal e industrial visa quantidades

intermediárias ou grandes de fungo, para comercialização e aplicações em semi-campo

ou campo (Alves 1998).

1.6.2-Formulações e aplicações de fungos

As formulações e aplicações de fungos entomopatogênicos visam aumentar a

eficiência de linhagens virulentas, adaptadas ao comportamento do hospedeiro-alvo.

Para isso, propágulos fúngicos como conídios, são misturados a veículos que podem ser

líquidos, semi-sólidos ou sólidos. A adição de óleo auxilia na proteção dos conídios a

condições adversas do meio ambiente, como baixa umidade e alta temperatura, além de

proporcionar o aumento da adesão de conídios à cutícula do hospedeiro, quando

comparados a conídios formulados em água (Luz & Batagin 2005).

Formulações à base de óleo-água de conídios de M. anisopliae ou B. bassiana

foram testadas em laboratório em ninfas de A. cajennense, resultando em maior

letalidade quando comparado com formulado aquoso (Lopes et al. 2007).

Emulsificantes também podem ser adicionados em formulados para diminuir a

hidrofobicidade da cutícula (Boucias et al. 1988) e assim aumentar o espalhamento do

formulado sobre a cutícula do hospedeiro (Alves 1998).


1.6.3- Segurança de fungos

A maioria dos fungos entomopatogênicos isolados de artrópodes é considerada

tanto segura para o homem como para o meio ambiente. Relatos de pessoas que

adoeceram ou morreram por infecção de fungos entomopatogênicos ainda são

desconhecidos (Zimmermann 2007a, b). A temperatura elevada é uma das principais

barreiras que impede o desenvolvimento de fungos entomopatogênicos em mamíferos.

Os carrapatos são invertebrados ectotérmicos e sua temperatura é, em geral,

consideravelmente inferior à temperatura do corpo humano, este fator favorece o

desenvolvimento do fungo no carrapato. Os fungos entomopatogênicos em geral têm

seu crecimento beneficiado abaixo de 30ºC e crescimento reduzido em temperaturas

superiores a 35ºC, sendo uns dos fatores que asseguram que fungos entomopatogênicos,

a princípio, não causariam infecção em humanos (Alves 1998).

2-JUSTIFICATIVA


2- JUSTIFICATIVA

Altos gastos com acaricidas químicos sintéticos, os quais constituem a

principal forma de combate de A. cajennense e R. sanguineus, somados ao crescente

número de relatos de resistência, suscitam esforços para o desenvolvimento de

estratégias alternativas de controle, mais eficientes, mais econômicas, menos tóxicas ao

homem e aos animais vertebrados e de menor impacto ambiental.

Resultados promissores obtidos com fungos patogênicos, em nível

experimental no controle de A. cajennense e R. sanguineus, colocam-se como uma

alternativa promissora para controle de carrapatos.

Pesquisas com A. cajennense, R. sanguineus e fungos realizadas nos últimos

anos focalizaram, na grande maioria, sobre atividade carrapaticida em ovos, larvas,

ninfas e adultos em condições de laboratório. Porém, conhecimento sobre formulação e

aplicação de fungos adaptadas a carrapatos ainda é escasso. Conhecer melhor as

interações entre fungos e carrapatos reforça a necessidade de mais estudos sobre a

aplicabilidade e formulações de fungos para o combate de carrapatos.

3-OBJETIVOS


3- OBJETIVOS

3.1- Objetivo Geral

Contribuir para o controle integrado de carrapatos com fungos patogênicos.

3.2- Objetivos Específicos

-Estudar a ocorrência natural de fungos patogênicos em A. cajennense no Centro-

Oeste do Brasil;

-Examinar o crescimento de M. anisopliae sobre ovos de R. sanguineus colocados

em solo, em condições de laboratório;

-Avaliar em condições de laboratório, formulações oleosas e aquosas de

M. anisopliae, em ovos de R. sanguineus.

-Estudar em condições de semi-campo a atividade e persistência de uma

formulação oleosa de M. anisopliae em A. cajennense.

4-RESULTADOS


4.1- Manuscrito 1- Ocorrência de fungos patogênicos em Amblyomma

cajennense em uma área rural do Centro-Oeste do Brasil e sua

atividade contra vetores da Febre Maculosa


Resumo: Dois isolados de Beauveria bassiana e um de Purpureocillium lilacinum

foram encontrados infectando fêmeas ingurgitadas de Amblyomma cajennense coletadas

de cavalos (0,15% de 1982 espécimes) e outros dois P. lilacinum e um M. anisopliae

foram isolados de solo, onde havia a presença deste carrapato. As coletas foram

realizadas em uma região do Centro do Brasil, entre outubro de 2009 a março de 2011.

Para isolamento de fungos a partir de amostras de solo foram utilizadas fêmeas

ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus. Não foram encontrados fungos em carrapato

ou em solo em meses secos (Maio a Agosto). Em testes de patogenicidade com R.

sanguineus e A. cajennense, os fungos isolados mataram fêmeas ingurgitadas das duas

espécies. Fêmeas de A. cajennense foram menos suceptíveis à infecção por P. lilacinum.

Em 20 dias de exposição os fungos foram observados esporulando sobre os indivíduos

mortos. Todas as três espécies de fungos provavelmente atuam naturalmente como

antagonistas de A. cajennense particulamente em estações chuvosas e têm interesse para

o controle de vetores da febre maculosa.

Palavras chave: carrapato, Rickettsia, Metarhizium, Beauveria, Paecilomyces.

1. Introdução

Amblyomma cajennense é um ectoparasito heteroxeno que é especialmente

comum em cavalos, embora esta espécie também infesta outros animais domésticos e

selvagens além de causar incômodos em humanos. Na América Latina A. cajennense é

um dos principais vetores de Rickettsia rickettsii, o agente causal da febre maculosa

(Parola et al. 2005). Este carrapato completa somente uma geração por ano e tem uma

sazonalidade distinta. No Centro do Brasil os adultos predominam na estação quente e

chuvosa no período de novembro a março; larvas eclodem na estação mais seca (abril a

julho) e mais fria seguidas pelas ninfas. Frequentemente podem ser achadas ambas as

fases imaturas em pastos, onde elas atacam os hospedeiros que andam na vegetação.

Carrapatos livres, distribuídos em grandes áreas, são difíceis de controlar com

acaricidas químicos sintéticos, mas micro-organismos patogênicos, especialmente

fungos, atuam como antagonistas naturais de muitos artrópodes e podem ser

particularmente importante no controle integrado de carrapatos (Samish et al. 2004,

Fernandes & Bittencourt 2008, Tuininga et al. 2009).

Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae infectam ovos, larvas, ninfas e

adultos em condições de laboratório (Lopes et al. 2007, Fernandes & Bittencourt 2008)


porém, não há registro na literatura de ocorrência natural de fungo patogênico em A.

cajennense. Rhipicephalus sanguineus é outro ixodídeo importante e, vetor em

potencial, de R. rickettsii no Neotrópico, atacando principalmente cachorros e

secundariamente o homem (Parola et al. 2005).

A seleção de fungos altamente virulentos adaptados a espécies de carrapatos e

condições climáticas regionais torna-se ponto de partida importante para o

desenvolvimento de micoacaricidas efetivos.

O presente estudo informa os primeiros isolamentos de fungos patogênicos a

A. cajennense e demonstra a patogenicidade deles a fêmeas de A. cajennense e

R. sanguineus.

2. Material e Métodos

As coletas de A. cajennense e solos foram feitas mensalmente entre outubro de

2009 e março de 2011 na Fazenda Santa Branca, localizada a 40 km de Goiânia (latitude

16º 23’ 41” e longitude 49º 04’ 47’’, WGS 84) (Figura 1 A). A. cajennense é frequente

nesta área e pode ser encontrado em vários hospedeiros, mas predomina em cavalos e

capivaras (Figura 1 B, C, D, E, G). Humanos também são atacados por este carrapato,

mas a febre maculosa nunca foi relatada na área estudada.

Os locais de coleta de solo foram escolhidos de forma aleatória onde havia

pasto (Brachiaria decumbens, Poaceae). Estes locais eram parcialmente sombreados e

serviam de descanso para cavalos, gado e capivaras. De cada um dos oito locais

selecionados (separados entre si por pelo menos 100 m), foram retirados 25 g de solo a

uma profundidade de 2-3 cm, depois de remover folhas ou outra matéria orgânica. A

amostra foi transferida para uma sacola plástica de poliestireno e armazenada em um

caixa térmica a 20⁰C até o processamento em laboratório. Cada mês pelo menos 100

indivíduos de A. cajennense, ninfas e adultos, foram coletados em cavalos livres da

aplicação de acaricidas e armazenados individualmente em tubos de plástico estéreis

(2 ml). Foram monitoradas temperatura ambiente e umidade relativa no início (9:00 da

manhã) de cada coleta ao longo do estudo com termohigrômetro (91 Comercial Química

Americana Ltda, Paulínia, São Paulo, Brasil).

No laboratório a superfície dos carrapatos foi limpa, girando individualmente

cada carrapato durante 10 segundos em 3 ml de água estéril. Os carrapatos foram secos

em papel filtro e colocados dentro de placas de Petri com papel filtro estéril (55 x 10


mm) e mantidos a 25 ± 1°C em umidade relativa (UR) > 98%. A mortalidade foi

monitorada diariamente durante 20 dias. Carrapatos mortos tiveram sua superfície

esterilizada primeiramente com etanol 93%, hipoclorito de sódio 2,5% durante 3

minutos e por fim lavados três vezes em água estéril. Os carrapatos foram transferidos

para placa de Petri com papel filtro e incubados a >98% UR e 25 ± 1°C durante 15 dias.

O desenvolvimento de fungos em indivíduos mortos foi avaliado diariamente. Fungos

crescidos em carrapatos mortos foram transferidos diretamente sobre meio BDA (Batata

Dextrose Ágar) com clorafenicol (0,5 g/L) (Stevens 1981).

Para isolamento de fungos patogênicos em amostras de solo, fêmeas adultas de

R. sanguineus foram coletadas de cães naturalmente infestados e utilizadas vivas como

“isca”. A escolha desta espécie foi devida as fêmeas adultas estarem disponíveis ao

longo do ano em quantidades suficientes para desenvolvimento dos testes. Três fêmeas

ingurgitadas foram limpas e colocadas em placas de Petri (90 x 20 mm) em contato com

3 g de cada amostra de solo incubadas a >98% UR e 25±1°C durante 20 dias

(Figura 2 A, B). Fungos crescidos em carrapatos mortos foram transferidos diretamente

sobre meio BDA com clorafenicol (Stevens 1981) (Figura 2 C).

Para avaliação da patogenicidade dos fungos isolados, três fêmeas ingurgitadas

de R. sanguineus e A. cajennense foram giradas com auxílio de uma pinça estéril sobre

a cultura esporulada por 10 segundos (Figura 2 D). Posteriomente, os carrapatos com o

inóculo e outros sem tramento foram colocados em placas de Petri (55 x 10 mm),

incubados a 25 ± 1°C e >98% UR. A mortalidade dos carrapatos foi monitorada durante

20 dias. Foram feitas quatro repetições independentes. Indivíduos mortos foram

processados como mencionado acima e os fungos foram reisolados de cadáveres e

comparados com os fungos previamente inoculados (Figura 2 E).

Foram identificados morfologicamente (Humber 1997) todos os fungos que

emergiram de carrapatos mortos e estes se encontram armazenados na Coleção de

Fungos Entomopatogênicos no IPTSP/UFG (Instituto de Patologia Tropical e Saúde

Pública/Universidade Federal de Goiás) em Goiânia, Brasil.

3. Resultados

Um total de 1982 indivíduos de A. cajennense e 144 amostras de solo foi

coletado entre outubro de 2009 e março 2011. Carrapatos adultos prevaleceram de

outubro a maio em ambos os anos testados, com totais de 1041 fêmeas e 630 machos

durante estes períodos, enquanto as ninfas (total de 311) predominaram de junho a


agosto em 2010 (Figura 3). As temperaturas e umidades relativas medidas no começo

de cada coleta são apresentadas na Figura 4. Fungos patogênicos foram isolados em

A. cajennense e em solo durante os meses chuvosos (Tabela 1). Dos seis fungos

isolados de carrapatos, três (2,1%) foram encontrados em solos (M. anisopliae IP 363 e

Purpureocillium lilacinum [anteriormente chamado de Paecilomyces lilacinus;

Luangsa-ard et al. 2011] IP 359 e IP 360) e outros três (0,15%) de A. cajennense

coletados vivos, em cavalos (B. bassiana IP 361, B. bassiana IP 364 e P. lilacinum IP

362) (Tabela 1).

O teste de patogenicidade para cada isolado de fungo, resultou em 100% de

mortalidade de R. sanguineus em 20 dias de incubação. A mortalidade em A. cajennense

variou de 66,6% (IP 359, IP 360, IP 362) até 100% (IP 361, IP 363, IP 364) no mesmo

período. Não houve morte de carrapatos no grupo controle. Fungos esporularam em

cadáveres em 15 dias de incubação após exposição em câmara úmida (Tabela 1).

4. Discussão

O presente estudo informa a primeira ocorrência natural de B. bassiana e P.

lilacinum em A. cajennense. Ambos P. lilacinum e M. anisopliae ocorreram em solos no

mesmo habitat onde pode ser achado A. cajennense. Nos testes de patogenicidade foi

confirmado que os fungos isolados podem infectar e matar A. cajennense e

R. sanguineus. Todos os fungos isolados foram fungos típicos de solo e B. bassiana e

M. anisopliae são as espécies mais comuns descritas infectando outros carrapatos em

campo em estudos prévios (Chandler et al. 2000, Samish et al. 2004). Este é o primeiro

relato de ocorrência natural deste Purpureocillium em ixodídeos. Outra espécie, como

Isaria fumosorosea (Paecilomyces fumosoroseus) foi anteriomente isolada de Ixodes

ricinus (Hartelt et al. 2007).

A proporção de carrapatos com infecção fúngica (0,15%) e de amostras de

solos com fungos patogênicos (2,1%) no estudo presente foi notavelmente abaixo que

valores achados em outros estudos onde até 25% de Rhipicephalus spp. ou Ixodes

scapularis foram encontrados infectados por B. bassiana ou M. anisopliae (Samish et

al. 2004, Benoit et al. 2005).

Os fungos patogênicos foram isolados de solo ou carrapatos durante o período

chuvoso, mas nunca entre os meses de maio e agosto. Além disso, nunca foram

descobertos fungos em ninfas, só em fêmeas adultas ingurgitadas que parecem ser mais


suscetíveis à infecção fúngica do que os machos ou fases imaturas, como também

achadas para Ixodes spp. (Samish et al. 2004). Fêmeas ingurgitadas são alvos

fundamentais, pois a morte dessas fêmeas resulta na eliminação de grande número de

ovos.

A esporulação de conídios em indivíduos mortos, provavelmente declinou

durante as épocas de seca (quando o fungo esporula externamente, alguns carrapatos

podem não se infectar, pois ocorre uma diminuição de água no ambiente) e menos

carrapatos podem se infectar devido à quantidade reduzida do inóculo infeccioso e

umidades relativas baixas.

A redução qualitativa e quantitativa de fungos patogênicos em solos coletados

em pastos parece estar relacionada à vegetação e a fatores abióticos (especialmente luz

solar e umidade). Rocha et al. (2009) isolaram M. anisopliae, P. lilacinum, Fusarium sp

e Pochonia chlamydosporia de solo e “lama” colecionados em uma floresta de galeria

tropical na vizinhança da área investigada, utilizando R. microplus como “isca” e

seguindo metodologia similar a do presente estudo.

A efetividade de M. anisopliae e B. bassiana em condições de laboratório é

bem estabelecida para R. sanguineus, mas poucos estudos demonstraram atividades

deles em A. cajennense (Reis et al. 2004, Samish et al. 2004, Lopes et al. 2007,

Fernandes & Bittencourt 2008). R. sanguineus pareceu ser mais suscetível à infecção

por P. lilacinum que A. cajennense. Os fungos isolados tiveram a capacidade de reciclar

através dos carrapatos mortos e assim podem infectar novos indivíduos.

Todas as três espécies de fungos estudadas aqui provavelmente atuam como

antagonistas naturais de populações de A. cajennense na área estudada, particularmente

durante a estação chuvosa. Mais adiante investigações explorarão o potencial destes

fungos para desenvolvimento de micoacaricidas no controle dos vetores da febre

maculosa.

Agradecimentos

Os autores agradecem o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq, Brasil) pelo apoio financeiro, ao Jeremias Lunardelli por permitir a

coleta de fungos na Fazenda Santa Branca, e ao Durval R. Ferreira pela ajuda técnica.


5. Referências

Benoit JB, Yoder JA, Ark JT, Reilingen EJ 2005. Fungal fauna of Ixodes scapularis Say

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Figura 1. Área de coleta de solos e carrapatos na Fazenda Santa Branca, Terezópolis –

Goiás. Locais de coleta de solo (círculo vermelho) onde havia circulações de cavalos e

local de coleta de Amblyomma cajennense em cavalos (círculo azul), entre outubro de

2009 e março de 2011 (A). Hospedeiros de Amblyomma cajennense na Fazenda Santa

Branca, onde foram avistados cavalos (B) capivaras (C), animal parasitado (D) e

carrapatos em fase de vida livre (E, F, G).


Figura 2. Amostras de solo com Rhipicephalus sanguineus (A e B -“seta”) e

crescimento de fungo sobre fêmeas de R. sanguineus (C-“seta”). Exposição de fêmeas

em cultura de Purpureocillium lilacinum (D) e reisolamento do fungo a partir de

indivíduos mortos (E).


Figura 3- Ocorrência relativa sazonal de adultos e ninfas de Amblyomma cajennense

sobre cavalos em uma área rural central do Brasil entre outubro de 2009 a março de

2011.


Figura 4- Temperatura (ºC) e umidade relativa matinal (9 h) monitorada entre outubro

de 2009 e março de 2011 na área do experimento.


Tabela 1- Fungos isolados de adultos de Amblyomma cajennense ou solos entre outubro de 2009 a março de

2011 em uma área rural no Central do Brasil e sua atividade patogênica sobre fêmeas adultas de A. cajennense

e Rhipicephalus sanguineus.

Fungos Isolados Origem Mês/ano Mortalidade Acumulada (%) 1,2

A. cajennense R. sanguineus

Beauveria bassiana IP 361 carrapato 01/10 3 100 100

IP 364 carrapato 09/10 4 100 100

Metarhizium anisopliae IP 363 solo 09/10 4 100 100

Purpureocillium lilacinum IP 362 carrapato 04/10 5 66,6 ± 11,6 100

IP 359 solo 10/09 4 66,6 ± 9,1 100

IP 360 solo 01/10 3 66,6 ± 11,6 100 1 20 dias pos-inoculação 2 Todos os indivíduos mortos apresentaram esporulação externa após 15 dias em câmara úmida 3 Época de chuva 4 Início da época de chuva 5 Fim da época de chuva


4.2-Manuscrito 2- Susceptibilidade de ovos e larvas de

Rhipicephalus sanguineus a Metarhizium anisopliae aplicado em solo

sob condições de laboratório


Resumo: Metarhizium anisopliae infecta ovos e larvas de Rhipicephalus sanguineus em

condições de laboratório. Estudar o efeito deste fungo em ovos irá esclarecer melhor o

potencial desse fungo para um combate integrado. O objetivo desse trabalho foi avaliar

o efeito de conídios de M. anisopliae aplicados ao solo sobre ovos e larvas eclodidas de

R. sanguineus. Solos esterilizados, hidratados a 25% do peso seco, foram tratados com

conídios de M. anisopliae IP 46 suspensos na concentração final de 3,3x103; 104;

3,3x104; 105; ou 3,3x105 conídios/g de solo ou não solo tratado para o controle. Quatro

conjuntos circulares de 25 ovos de R. sanguineus foram colocados sobre cada amostra

de solo e incubados em câmara úmida (<98%) a 25°C, durante 30 dias. O

desenvolvimento de micélio e conídios na superfície dos ovos, a eclosão e a

sobrevivência de larvas foram avaliados diariamente. Micélio e conídios foram

encontrados na base dos conjuntos de ovos com 5 e 10 dias de incubação,

respectivamente em concentrações superiores a 104 conídios/g. A eclosão de larvas foi

nula ou mínima (<7%) para os ovos expostos a solos tratados para todas as

concentrações testadas. No controle a eclosão das larvos foi >90%. Os ovos de R.

sanguineus foram altamente susceptíveis à infecção com M. anisopliae em solo tratado

com conídios, mesmo em concentrações baixas e quando expostas a umidade alta.

Palavras chave: carrapato, fungos, entomopatogênicos, ovos.

1. Introdução

Rhipicephalus sanguineus é um carrapato que ataca cães e eventualmente o

homem (Felz et al. 1996, Dantas-Torres et al. 2006 ). Em alguns países da América

Latina, em especial no México é considerado o principal vetor da febre maculosa (FM)

(Parola et al. 2005).

Carrapaticidas químicos são, ainda, os produtos mais utilizados para o combate

desse carrapato, mas o surgimento de espécies multirresistentes e problemas que esses

produtos causam ao meio ambiente têm levado à busca de métodos eficientes e

sustentáveis para o controle de R. sanguineus (Miller et al. 2001, Samish et al. 2004).

Aplicações mais específicas e efetivas poderiam ajudar no desenvolvimento de

micoacaricidas e no controle dos vetores da FM.

Metarhizium anisopliae é um fungo patogênico frequentemente isolado de solos

(Samish et al. 2004, Fernandes et al. 2004, Rocha et al. 2009, 2012). Em condições de


laboratório tem atividade em ovos, larvas, ninfas e adultos de R. sanguineus (Garcia et

al. 2005, Fernandes & Bittencourt 2008). Os ovos deste vetor são colocados em lugares

com alta umidade e protegidos contra raios solares e predadores. Estes microhabitats

favorecem a atividade de fungos patogênicos em ovos e em outras fases de

desenvolvimento (Polar et al. 2005).

Em testes de laboratório são utilizados papéis filtro impregnados com suspensão

de conídios, no entanto, o decréscimo da viabilidade de conídios impossibilita avaliar

efetivamente a ação de fungos (Ment et al. 2010, Hedimbi et al. 2011). Os testes de

aplicação tópica não representam o que ocorre a campo em uma eventual aplicação do

fungo. Por isso, estudos em solo refletem o real potencial, sendo assim, o solo parece

ser um substrato mais natural para a utilização de conídios de fungos patogênicos no

controle de carrapatos (Garrido-Jurado et al. 2011).

O objetivo deste estudo foi avaliar a susceptibilidade de ovos de R. sanguineus a

conídios de M. anisopliae misturados em solo em condições de laboratório.


M. anisopliae s.l. IP 46 foi isolado de uma amostra de solo no Centro-Oeste do

Brasil em 2001 (Rocha et al. 2012). O fungo foi revigorado infectando fêmeas adultas

de R. sanguineus uma vez antes dos testes e então cultivado em meio BDA (Batata-

Dextrose-Ágar) a 25±1ºC, 75 ± 10% umidade relativa (UR) e fotofase de 12 h durante

15 dias. Foram coletados conídios com uma espátula raspando a superfície de cultura.

Logo após, foram suspensos em 0,1% Tween 80® e a suspensão agitada com vórtex por

um minuto. O número de conídios foi quantificado com câmara de Neubauer. No

começo de cada repetição, a viabilidade dos conídios (>95%) foi confirmada inoculando

100 µl de suspensão conidial em meio SDAL (Sabouraud-Dextrose-Ágar-Levedura) em

uma placa de Petri. Em seguida, a placa de Petri foi incubada a 25±1°C e avaliada a

germinação de conídios em até 24 h.

Cerca de 1 kg de latossolo vermelho sem matéria orgânica macroscopicamente

visível foi coletado no cerrado, na proximidade de Goiânia, Brasil. O solo foi seco por

48 h a 37ºC, peneirado com malha de diâmetro de 0,59 mm e esterelizado. Quatro

gramas de solo foram separados. Os conídios suspensos em água (concentrações finais

de 3,3x103; 104; 3,3x104; 105; 3,3x105 conídios/g de solo) foram aplicados diretamente

no solo, resultando em 25% de hidratação para cada amostra de solo. O tratamento


controle recebeu apenas água. O solo foi misturado e separadas em alíquotas de 2 g, que

foram transferidas para um tubo (TPP®, Suíça). O solo dentro do tubo foi compactado

mecanicamente com uma pequena espátula, para prover uma superfície consistente.

Fêmeas ingurgitadas coletadas em cães naturalmente infestados foram lavadas

e incubadas para oviposição. Após, quatro aglomerados de 25 ovos de R. sanguineus

com idade de 1 a 3 dias de oviposição foram preparados e colocados sobre a superficie

de cada amostra de solo (Figura 1 A). Posteriormente, as amostras foram incubadas

durante 45 dias a 25 ± 1°C e >98% UR. O desenvolvimento de micélio e conídios nos

ovos e a eclosão e sobrevivência de larvas no solo foram avaliados diariamente. Foram

realizadas quatro repetições independentes.

3. Resultados

Foi observado o aparecimento de micélio e conídios nos aglomerados de ovos

de R. sanguineus em 5 e 10 dias de incubação (3,3x104; 105 e 3,3x105 conídios/cm2)

respectivamente (Figura 1 B, C). A eclosão de larvas no controle foi mais alta (>90%)

quando comparada com a eclosão de larvas na menor concentração (3,3x103 conídios/g)

(Tabela 1). No controle as larvas eclodidas permaneceram vivas (93%), porém, no

grupo tratado a eclosão de larvas foi nula ou reduzida (<7%). Não houve nenhum

sobrevivente nas concentrações de 104; 3,3x104; 105 e 3,3x105 conídios/cm2 45 dias de

observação (Tabela 1). Não foram observados micélio ou conídios sobre os ovos do

controle. As larvas do controle foram as primeiras a eclodir, iniciando em 24 dias e

chegando a 93% em 35 dias de incubação. Para o grupo controle não houve mortalidade

até 45 dias de incubação (Figura 2).

4. Discussão

Os ovos de R. sanguineus expostos ao solo com 25% de hidratação favoreceu a

embriogênese e foram altamente suscetíveis à infecção por M. anisopliae mesmo em

concentrações reduzidas de conídios no solo. A hidaratação do solo e apenas alguns dos

fatores que podemos inferir para uma melhor permanêcia do fungo no solo (Lopes et al.

2013).

A compactação mecânica do solo e colocação de ovos na superfície lisa

provavelmente impediu o desenvolvimento do fungo no solo subjacente devido o

arejamento reduzido, o que pode, por sua vez, resultar em menores exposições efetiva


dos ovos ao fungo. Esta mesma constatação relatada foi observada em outro estudo

(Leles et al. 2012).

Os efeitos ovicida e larvicida de M. anisopliae dependeram do tempo de

exposição dos ovos sobre o solo tratado. O crescimento de micélio e conídios sobre os

ovos concorreu com a embriogênese, impedindo a eclosão de larvas em concentrações

superiores a 3,3x103 conídios/g. Os ovos foram eliminados em poucos dias e as poucas

larvas que eclodiram na mais baixa concentração (3,3x103 conídios/g) provavelmente já

estavam infectadas antes da eclosão e morreram nos dias seguintes.

Ficou claro que M. anisopliae reciclou sobre os ovos o que leva a um aumento

quantitativo do inóculo e maior probabilidade de infectar fêmeas ovipondo no mesmo

local ou novos ovos ou larvas eclodindo.

M. anisopliae atuou contra R. sanguineus em condições de laboratório,

sobretudo em ovos ou larvas andando no solo e mostrou seu potencial para controle

dessa espécie.

5. Referências

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Figura 1. Conjunto de 25 ovos de Rhipicephalus sanguineus dispostos na superfície de 6

g de latossolo vermelho em tubo (TPP®) (A). Conjunto de 25 ovos de Rhipicephalus

sanguineus com presença de micélio (B) e conídios (C) de Metarhizium anisopliae.


Tabela 1- Média e erro padrão da média ( ±EPM) do aparecimento de micélio e conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 sobre

aglomerados de 25 ovos de R. sanguineus, seguido da eclosão e sobreviência de larvas de R. sanguineus a 250C >98% UR.

Concentração

(Conídios/cm2)

Micélio

( ±EPM)

Conídios

( ±EPM)

Eclosão (%)

( ±EPM)

Sobreviventes (%)

( ±EPM)

0 * * 93±2,4a 93±2,4a

3,3x103 7±0,9a 14±1,3a 6,3±1,6b 3,8±0,9b

104 6,5±0,8a 11,5±0,3b 3,2±1,4b 0c

3,3x104 5,2±0,2b 10,7±0,5b 2,5±0,1c 0c

105 5,2±0,4b 10,5±0,3b 2,3±0,1c 0c

3,3x105 5±0,4b 10,5±0,5b 1±0,7c 0c

*Não houve crescimento de micélio e conídios;


0

20

40

60

80

100

25

30

35

40

45

1e+4

1e+5

Ecl

osão

(%

)

Dias d

e inc

ubaç

ão

Conídios/g(log)

3,3 x 103104

3,3 x 104105

3,3 x 105

Figura 2- Eclosão (%) acumulada de larvas de R. sanguineus depois de

aplicar indiretamente conídios de Metharizium anisopliae em solo. Os

algomerados de ovos e larvas eclodidas permaneceram incubados em 45

dias a UR > 98% em 25°C.


4.3- Manuscrito 3- Formulados aquoso e oleoso de Metarhizium

anisopliae e sua aplicação em ovos de Rhipicephalus sanguineus


Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar formulações oleosa e aquosa de M.

anisopliae IP 46 em ovos de Rhipicephalus sanguineus. Conjuntos circulares de 25 ovos

de R. sanguineus, foram colocados sobre papel filtro de 1 cm². Formulados de IP 46

aquoso ou oleoso (10% de óleo vegetal) foram aplicados com pipeta semi-automática de

forma direta sobre os ovos ou indireta colocando os ovos sobre papel filtro previamente

tratado, nas concentrações de 3,3x103; 104; 3,3x104; 105 e 3,3x105 conídios/cm2.

Os ovos foram incubados em tubos e o desenvolvimento de micélio, conídios na

superfície dos ovos, eclosão e sobrevivência de larvas foram avaliados diariamente por

até 40 dias. Não houve eclosão de larvas quando as formulações foram aplicadas

diretamente e foi observado que os conjuntos de ovos foram cobertos por micélio e

conídios antes que ocorresse a eclosão de larvas. O aparecimento de micélio e conídios

sobre os ovos ocorreu em média de 4 e 8 dias, respectivamente, quando utilizada a

formulação oleosa. O formulado de IP 46 à base de óleo teve a maior atividade em ovos

de R. sanguineus e tem interesse para combate desse carrapato.

Palavras chave: carrapato, controle biológico, fungo, ovos, Rhipicephalus sanguineus.

1. Introdução

Rhipicephalus sanguineus é um carrapato cosmopolita trioxênico, que parasita

principalmente cães, e ocasionalmente ataca humanos (Dantas-Torres et al. 2006). Esta

espécie transmite vários patógenos importantes para seus hospedeiros, como Rickettsia

rickettsii (Parola et al. 2005). R. sanguineus é controlado principalmente com acaricidas

sintéticos. O uso excessivo desses produtos causa sérios problemas como poluição do

meio ambiente e seleção de populações de carrapatos resistentes (Miller et al. 2001,

Borges et. 2007, Morgan et al. 2009).

A necessidade de controle alternativo de R. sanguineus estimulou o interesse

em produtos à base de fungos que atacam este no meio ambiente ou em seus

hospedeiros (Faria & Wraight 2007). Resultados confirmaram o potencial de fungos

para um controle integrado de carrapatos (Samish & Rehacek 1999, Chandler et al.

2000, Samish et al. 2004, Fernandes & Bittencourt 2008). No entanto, o conhecimento

sobre a eficácia de fungos contra R. sanguineus especialmente em ovos ainda é escasso,

e uma melhor compreensão da efetividade ovicida contribuirá decisivamente para o

desenvolvimento de formulações e aplicações com micoacaricidas voltadas para essa

espécie.


Formulações oleosas visam apoiar o processo de adesão de conídios à cutícula

do carrapato e proteger o fungo contra condições desfavoráveis de temperatura, radiação

ultravioleta e baixa umidade, quando comparadas com formulação aquosa (Polar et al.

2005). Estudos comparativos entre formulado aquoso e oleoso, foram realizados em

ninfas de Amblyomma cajennense, resultando maior letalidade quando aplicado o

formulado oleoso (Lopes et al. 2007).

O objetivo deste estudo foi avaliar em laboratório o efeito de formulação

oleosa e aquosa de conídios de M. anisopliae e de formas de aplicações no colntrole de

R. sanguineus.


Origem, obtenção e preparação de ovos: Foram coletadas no Centro de

Zoonoses de Goiânia, Goiás, fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus, presentes em cães

naturalmente infestados. No laboratório, as fêmeas foram lavadas com água estéril e

secas em papel. Depois foram acondicionadas em placas de Petri (100 x 15 mm) sobre

papel filtro e incubadas a 25±1ºC e umidade relativa (UR) de >98 % para oviposição

(Figura 1 A). Conjuntos de 25 ovos foram preparados com ajuda de uma lupa e pincel

desinfetado (D’alessandro & Luz dados não publicados) (Figura 1 B, C). Estes

aglomerados de 25 ovos foram divididos visualmente em três níveis (0,1 e 2): 0 (base),

1 (seção intermediária) e 2 (topo). Os testes foram iniciados com ovos de 1 a 3 dias de

idade.

Origem, cultivo e preparação de M. anisopliae: M. anisopliae sensu latu (s.l.)

IP 46 foi isolado em solo do cerrado brasileiro (Rocha et al. 2012) e está armazenado na

Coleção de Fungos Entomopatogênicos do IPTSP/UFG. Antes dos testes foi passado

em fêmeas de R. sanguineus, reisolado e cultivado em placa de Petri com meio de

cultura BDA (Batata, Dextrose, Ágar) durante 15 dias a 25ºC, UR 70 ± 10% e fotofase

de 12 h. Para preparação de conídios, estes foram raspados na superfície da cultura e

suspensos em água + Tween 80® (0,1%). A suspensão foi filtrada com algodão

hidrófilo, os conídios quantificados em câmara de Neubauer e as concentrações de

conídios ajustadas (3,3x103; 104; 3,3x104; 105 e 3,3x105 conídios/cm2) para os testes.

Preparação e aplicação do formulado aquoso e oleoso: 50 µL dos formulados

foram aplicados com auxílio de uma micropipeta semi-automática. Foram testados dois

tipos de aplicação: (1) aplicando diretamente o formulado sobre os ovos e (2) tratando

indiretamente papel filtro e expondo em seguida o conjunto de ovos sobre papel tratado


(Figura 1 D, E). No grupo controle foi utilizado água para o formulado aquoso e óleo -

água (10% Graxol®) para o formulado oleoso. Após o tratamento os papéis filtro com os

ovos foram transferidos, cuidadosamente, para tubos de cultura de células (TPP®,

Suíça), permeáveis para ar, com áreas totais de 63,6cm2 de superfície interna

(Figura 1 F, G). Os tubos foram incubados em umidade >98% a 25±10C, até 40 dias. O

desenvolvimento de micélio e conídios na superfície dos ovos, a eclosão e a

sobrevivência de larvas foram avaliados diariamente (Figura 1 H, I). Foram realizadas

quatro repetições independentes.

Análise de Dados: Dados da eclosão e sobrevivência de larvas foram

transformados em arcsin e submetido a análise de variância (ANOVA) seguida do teste

de comparação múltipla de médias Student-Newman-Keuls (SNK). As médias foram

consideradas estatisticamente diferentes entre si com P <0,05. As concentrações

inibitórias de eclosão para 50% e 90% (CIE50 e CIE90) e tempos letais 50% e 90%

(TL50= Tempo para matar 50% dos indivíduos e TL90 = Tempo para matar 90% dos

indivíduos) de larvas foram calculados pela análise de Probit para valores independentes

e dependentes, respectivamente (Throne et al. 1995).

3. Resultados

O desenvolvimento de IP 46 sobre os conjuntos de ovos, eclosão e sobrevivência

de larvas dependeram do formulado, da aplicação e da concentração de conídios

(Tabela 1). O aparecimento de conídios de IP 46 aplicados diretamente nos ovos de R.

sanguineus foi de 5 e 7 dias para os formulados oleoso e aquoso, respectivamente

(Tabela 1). O crescimento de conídios nos ovos quando aplicados indiretamente foi de

11 e 17 dias para os formulados oleoso e aquoso, respectivamente. Não houve eclosão

de larvas quando os formulados foram aplicados diretamente. Larvas eclodidas só foram

observadas em aplicações indiretas.

O percentual médio de eclosão e sobreviventes para os dois formulados

aplicados indiretamente foi significativamente inferior ao do grupo controle (F5,18 =7,4;

p < 0,001) (Figura 2). A eclosão de larvas foi maior em formulado aquoso quando

comparado com o formulado oleoso. Houve diferenças significativas entre as

concentrações para formulado aquoso (F5,18 = 2,9; p < 0,047) e oleoso (F5,18 = 6,7; p <

0,001). Larvas sobreviventes foram numericamente inferiores com o aumento da

concentração de conídios e o tempo de incubação. A redução de larvas foi maior com

formulado oleoso quando comparado com formulado aquoso (Figura 2).


Os valores de concentração inibitória de eclosão (CIE50 e CIE90) foram menores

para o formulado oleoso em comparação ao formulado aquoso (Tabela 2). Na

concentração de 104 conídios/cm2 o valor do tempo letal TL90 encontrado para o

formulado aquoso foi significativamente maior (19,4 dias) quando comparado com o

formulado oleoso (15,8 dias) (Tabela 3). Para concentrações acima de 3,3x104

conídios/cm2 aplicado com o formulado oleoso, não foi possível calcular os valores de

TL50 e TL90 devido à alta taxa de mortalidade em pouco tempo.

4. Discussão

As formulações de M. anisopliae IP 46 à base de óleo e água foram responsáveis

por inibir a completa eclosão de larvas quando aplicadas diretamente sobre os ovos de

R. sanguineus. Devido ao período de embriogênese desse carrapato ser acima de 20 dias

em UR 98% à 25⁰C (Flechtmann 1973), o fungo conseguiu desenvolver em menos

tempo, inibindo a eclosão das larvas.

Por R. sanguineus ser um carrapato heteroxênico e realizar diversas mudas no

meio ambiente aplicações indiretas seriam mais eficientes que aplicações diretas, pois

cerca de 95% da população de carrapatos fica no meio ambiente (Barros-Battesti et al.

2006). Além disso, aplicações indiretas de fungo poderia ser uma saída mais efetiva

para resolução do problema, pois o fungo entraria em contato com a maioria de

carrapatos circulantes e teria a redução maior da população (Samish et al. 2004).

O fungo foi favorecido no seu crescimento acelerando e concorrendo contra a

eclosão de larvas de R. sanguineus (Polar et al. 2005). Apesar da sobrevivência de

larvas ter atingido um tempo prolongado ao aplicar indiretamente formulado oleoso esta

sobrevivência foi zero em 3,3 x 105 conídios/cm2.

Os fatores abióticos como temperatura, umidade e raios ultravioletas podem

inativar ou retardar o desenvolvimento de M. anisopliae, demonstrando uma

desvantagem. Estes fatores podem ser contornados com a utilização de formulados,

sendo que, o formulado oleoso se mostra mais efetivo.

Formulações e aplicações de IP 46 inibiram a eclosão e sobrevivência de larvas

de R. sanguineus. O formulado testado à base de óleo teve maior atividade ovicida e

larvicida do que o formulado aquoso e poderia ser empregado na preparação de

micoacaricidas.


Agradecimentos

Os autores agradecem o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

(CNPq, Brasil) e Tecnológico pelo apoio financeiro.

5. Referências

Barros-Battesti DM, Arzua M, Bechara GH 2006. Carrapatos de importância médico-

veterinária da região neotropical: um guia ilustrado para identificação de espécies.

Vox/ICTTD-3/ Butantan, São Paulo, p. 223.

Borges LMF, Soares SF, Fonseca IN, Chaves VV, Louly CCB 2007. Resistência

acaricida em larvas de Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) de Goiânia-GO,

Brasil. Rev Patol Trop 36:85-97.





Trop 39: 64-67.

Faria MR, Wraight SP 2007. Mycoinsecticides and mycoacaricides: a comprehensive

list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biol

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American tick species. Exp Appl Acarol 46: 71-93.

Flechtmann CHW 1973. Ácaros de Importância Médico-veterinária. Nobel, São Paulo,

192 pp.

Lopes RB, Alves SB, Padulla LFL, Perez CA 2007. Eficiência de formulações de




Miller RJ, George JE, Guerrero F, Carpenter L, WELCH JB 2001. Characterization of



302.

Morgan JAT, Corley SW, Jackson LA, Lew-Tabor AE, Moolhuijzen PM, Nicholas NJ

2009. Identification of a mutation in the para-sodium channel gene of the cattle tick

Rhipicephalus (Boophilus) microplus associated with resistance to synthetic pyrethroid

acaricides. Inter J Parasitol 39: 775-779.


emerging diseases, challenging old concepts. Clin Microbiol Rev 18: 719-756.

Polar P, Kairo MTK, Moore D, Pegram R, John S 2005. Comparison of water, oils and

emulsifiable adjuvant oils as formulating agents for Metarhizium anisopliae for use in

control of Boophilus microplus. Mycopathol 160: 151-157.


403.

Samish M, Rehacek J 1999. Pathogens and predators of ticks and their potential in

biological control. Ann Rev Entomol 44: 159-182.

Throne JE, Weaver DK, Chew V, Baker J 1995. Probit analysis of correlated data:

Multiple observations over time at one concentration. J Econ Entomology 88: 1510-

1512.


Figura 1. Fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus (A) em oviposição. Após

oviposição, foram montados conjuntos de 25 ovos (B, C) sobre papel filtro. Em

seguida, foi feita uma aplicação direta de IP 46 sobre os ovos de Rhipicephalus

sanguineus (D) ou sobre papel filtro tratado com posterior exposição dos ovos sobre a

área tratada (Aplicação indireta) (E). Os papéis filtros foram inseridos dentro de tubos

com tampa permeável a ar (F, G) e o apareciemto de mícelio e conídios de

Metarhizium anisopliae em ovos (H) e larvas (I) foram observados diariamente.


Tabela 1. Média de dias (dias ± erro padrão da média) para análise de crescimento de

micélio e conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 sobre conjuntos de 25 ovos, tratados

diretamente ou indiretamente com formulado aquoso ou oleoso em diferentes

concentrações de conídios (3,3x103 até 3,3 x105 conídios/cm2).

Formulação Aplicação Nível Micélio Conídios aquosa direta 2 5,7 ± 0,5a 14,3± 1,3a

1 4,9 ± 0,3a 11 ± 1,2b 0 4,5 ± 0,2a 4,5± 0,2a

indireta 2 14±1,2c 19 ± 0,6c

1 10±0,0b 13,3 ± 0.2b 0 6 ± 0,1a 8,9 ± 0,8a

oleosa direta 2 4,2±0,0a 7,5 ± 0,3a

1 4,1±0,0a 8,7 ± 0,5b 0 4,1±0,1a 7,9 ± 0,1ab

indireta 2 4,9 ± 0,2a 9 ± 0,3a

1 4,7 ± 0,1a 8,1± 0,3a 0 4,7±0,0a 8

Média de valores calculada para cinco concentrações (3,3x103; 10

4; 3,3x10

4; 10

5; 3,3 x10

5 conídios/cm

2); Conjuntos de 25 ovos foram

divididos em três níveis (0-2): 0 (base), 1 (seção intermediária) e 2 (topo); Valores seguidos de letras diferentes significa diferença entre

as média dos períodos (SNK, p<0,005).


Figura 2. Eclosão (%) acumulada e sobrevivência (%) de larvas de Rhipicephalus

sanguineus submetidas a diferentes concentrações (3,3x103 a 3,3x105 conídios/cm2) em

formulado aquoso (A, B) ou formulado oleoso (C, D), após aplicação indireta de

conídios de Metarhizium anisopliae IP 46.


Tabela 2. Valores de concentração inibitória de eclosão (CIE50 e CIE90) com intervalos de confiança (I.C. 95%),

slope e ± e erro padrão (E.P).

Formulado CIE50 (95% I.C.) CIE90 (95% I.C.) Slope ± EP

Aquoso 5,5 x 103 (2 x 103 – 1 x 104) a 1.69 x 106 (5,5 x 105 – 1,4 x 107) a 0,5 ± 0.1

Oleoso 3,1 x 103 (2,2 x 102 – 6,7 x 103) a 3.8 x 104 (1,8 x 104 – 4 x 105) b 1,2 ± 0.1

Médias seguidas da mesma letra na mesma coluna, não diferem entre si, pelo teste de Student-Newman-Keuls (SNK; P=0,05%);

Aglomerado de 25 ovos de Rhipicephalus sanguineus, tratadas indiretamente com conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 formulados

em água ou óleo, no trigésimo dia de exposição dos ovos a 25°C e > 98% (umidade relativa) UR.


Tabela 3. Valores de tempo letal (TL50 e TL90) em dias com intervalos de confiança (I.C. 95%) (I.C) de larvas de

Rhipicephalus sanguineus submetidas a diferentes concentrações de conídios de Metarhizium anisopliae aplicando

indiretamente formulado aquoso e oleoso sob aglomerados de 25 ovos.

Formulado Aquoso Formulado Oleoso

[ ] de conídios/ cm2 TL50 (95% I.C) TL90 (95% I.C) TL50 (95% I.C) TL90 (95% I.C)

0 ** ** ** **

3,3x103 * * 21,6 (14-37) 51 (36-103)

104 10 (7-12,6) 19,4 (16,2-27) 12,1 (11-13,5) 15,8 (14,1-19)

3,3x104 * * * *

105 10,5 (6,5-13,5) 17,5 (14,4-26,2) * *

3,3x105 9 (4,4-11,4) 15 (12,3-22,5) * *

* Não foi possível calcular devida a alta taxa de mortalidade; **Não houve mortalidade de larvas;


4.4- Manuscrito 4- Atividade e persistência de formulação oleosa de

Metarhizium anisopliae sobre Amblyomma cajennense em teste de semi-

campo no Centro-Oeste do Brasil


Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar em condições de semi-campo a

persistência e o efeito de uma formulação oleosa preparada com conídios de

Metarhizium anisopliae (IP 46) em A. cajennense. Uma formulação oleosa foi aplicada

no interior de dispositivos numa concentração de 5x106 conídios/cm2. Estes dispositivos

foram colocados em uma região de pastagem no centro-oeste, Goiás, Brasil. Fêmeas

ingurgitadas coletadas de cavalos foram pesadas e colocadas individualmente, dentro de

dispositivos um dia antes, no dia e até 30 dias (1d, 2d, 3d, 5d, 10d, 15d, 20d, 25d, 30d)

após aplicação. Os dispositivos foram fechados com tecido do tipo voil para evitar o

escape das fêmeas ou larvas emergindo de ovos postos. Após, 74 dias foram

quantificadas as larvas. Amostras de solo previamente tratadas com a mesma

formulação foram coletadas em tempos definidos, conforme supracitado e o número de

colônias de Metarhizium sp. crescidas em meio semi-seletivo foi quantificado. Foram

feitas três repetições independentes. O percentual de eclosão de larvas no dia e após 30

dias de aplicação foi de 8,7% e 70%, respectivamente. Uma redução de 95% do número

de colônias de Metarhizium sp. foi observada após 30 dias de aplicação comparando-se

com o controle. Estes resultados reforçam que novas aplicações poderiam ser utilizadas

para reduzir larvas sobreviventes e aumentar o período do efeito residual ao longo do

tempo.

Palavra-chave: micoacaricida, carrapato, óleo, larvas. 1. Introdução

Amblyomma cajennense é um dos principais vetores da Rickettsia rickettsi, agente

causal da febre maculosa (Parola et a., 2005). As dificuldades existentes no controle de

Amblyomma cajennense, incluindo o desenvolvimento de resistência a alguns acaricidas

químicos sintéticos, incitam mais estudos para desenvolvimento de medidas integradas

em condições de campo. Formulações oleosas de Metarhizium anisopliae têm

comprovada atividade em ovos, larvas, ninfas e adultos de A. cajennense em condições

de laboratório e representam uma opção eficiente e segura (Chandler et al. 2000, Samish

et al. 2004, Fernandes & Bittencourt 2008, ).

Em condições de campo M. anisopliae é utilizado para controlar populações de

insetos-pragas, de importância médica, veterinária e agrícola. No Brasil, M. anisopliae

vem sendo utilizado com sucesso contra cigarrinhas da cana-de-açúcar (Mahanarva

spp.) e das pastagens (Zulia entreriana e Deois flavopicta) (Faria et al. 2002; Leite, et


al. 2003) e outra espécie, é apontado como um agente de controle biológico de grande

potencialidade para carrapatos. Em alguns países africanos, Metarhizium acridum está

sendo aplicado como bioinseticida no controle de gafanhotos (Driver et al. 2000). No

momento não há produtos comercializados para o controle de A. cajennense.

As condições ambientais têm grande influência sobre os fungos, sendo estas

influências prejudiciais ao controle microbiano. Os fatores ambientais como a

temperatura, a umidade, a luz solar e o pH interferem na germinação, esporulação e

virulência de fungos entomopatogênicos (Blanford & Thomas 2001). Dessa maneira,

apesar da importância dos fungos patogênicos para carrapatos, pouco se sabe sobre seu

potencial de controle quando aplicado no solo em condições de semi-campo. Assim,

tornam-se necessárias pesquisas, visando selecionar e melhorar linhagens fúngicas que

demonstram ser promissoras em estudos em laboratório para emprego destes

microrganismos em testes de semi-campo e campo.

A persistência de fungo no solo está relacionada à sua adaptação em solo e a

tolerância a fatores abióticos adversos. Conídios de M. anisopliae e Beauveria bassiana

foram estudados na superfície de solo argiloso e em condições caracterizadas pela

presença de neve permanente durante o inverno, demonstrando que após três anos da

aplicação do inóculo os propágulos de M. anisopliae permaneceram ativos; o mesmo

não aconteceu com os de B. bassiana, que desapareceram (Vänninen et al. 2000).

O presente trabalho teve por objetivo estudar em condições de semi-campo, a

atividade e persistência de conídios de M. anisopliae formulado em óleo contra

A. cajennense.


Origem e Cultivo de Metarhizium anisopliae: M. anisopliae sensu lato (s.l) IP

46 foi isolado em 2001 de amostra de solo coletada no cerrado no estado de Goiás,

Brasil. Antes dos testes o fungo foi inoculado em fêmeas de A. cajennense, reisolado e

cultivado em placa de Petri com meio de cultura BDA (batata, dextrose e ágar) durante

15 dias a 25°C, UR 70±10% e fotofase de 12h. A linhagem foi então cultivada em grãos

de arroz parboirizado (Arroz Tio Jorge tipo 1, Goiânia), previamente autoclavada e

hidratada com 30% de peso (1kg/300 ml de água) utilizando-se método de bandeja (Luz

et al. 2004). Após 14 dias de cultivo em arroz, os conídios foram coletados, com uma

peneira de malha de 0,59 mm de diâmetro. Os conídios foram quantificados (números

de conídios/peso) com câmara de Neubauer.


Local de estudo: Os experimentos foram realizados na fazenda Santa Branca

(latitude 16º 23’ 41” e longitude 49º 04’ 47’’, WGS 84) Goiânia, Goiás, Brasil. Os

testes foram feitos entre abril e agosto 2011.

Preparação da área do experimento: No local do experimento foi nivelada a

altura da grama com o uso de um cortador, aproximadamente 5 cm do solo.

Posteriormente, foram feitos buracos para colocação dos tubos de PVC (Dispositivos).

Preparação dos dispositivos: Foram utilizados 72 tubos de PVC com 20 cm de

altura e 15 cm de largura. Estes foram inseridos no solo, numa profundidade de 10 cm

(Figura 1 A). Nas partes de baixo dos tubos ficaram fechadas com “sombrite”, e no

interior de cada tubo, foi colocado solo e um pedaço de grama com 3 cm de altura e 15

cm de largura. A parte superior do tubo ficou aberta, até a aplicação da formulação

oleosa de M. anisopliae em seu interior. Foram feitas três repetições independentes.

Preparação da formulação e tratamento dos dispositivos: Os conídios

oriundos do processo de peneiramento foram misturados com o óleo (Graxol®, Agrária)

e depois com água (10% do óleo). O número de conídios foi ajustado para uma

concentração final de 5x106 conídios/cm2 em solução óleo água 10% de óleo vegetal. A

formulação com conídios ou sem conídios (controle) foi aplicada manualmente com

pulverizador ao final da tarde. Um dia anterior à aplicação (-1d), no dia (0d) da

aplicação e após a aplicação (1d, 2d, 3d, 5d, 10d, 15d, 20d, 25d e 30d) foi colocada uma

fêmea ingurgitada de A. cajennense com peso conhecido (para prévia do número de

ovos e larvas) (Figura 1 B). Um outro dispositivo, contendo as mesmas descrições dos

dispositivos supracitados recebeu o mesmo tratamento, porém sem a fêmea ingurgitada

de A. cajennense em seu interior. Assim, foi feito para avaliar a persistência da

formulação em condições de semi-campo. A persistência de IP 46 foi avaliada com os

mesmos dias interpostos a aplicação da formulação em fêmea ingurgitada de A.

cajennense (Figura 1 B). Após, a aplicação, a parte de cima do tubo foi vedada com um

tecido do tipo voile e esse fixado com uma abraçadeira de borracha (Correia de

tanquinho A 18). A eficácia da formulação oleosa foi avaliada através da presença

quantitativa de larvas em movimento, comparando-se o grupo tratado com o controle.

Coleta e processamento de amostras de solo para análise de persistência de

Metarhizium sp: Com auxílio de uma espátula, cerca de 5 g de solo foi coletado em

tempos definidos: -1d, 0d, 1d, 2d, 3d, 5d, 10d, 15d, 20d, 25d e 30d (Figura 1 B). As

amostras de solo foram transferidas para sacos plásticos rotulados e armazenadas em

caixa térmica.


Quantificação de larvas em dispositivos tratados: Cada dispositivo foi

retirado após 74 dias de tratamento. Estes dispositivos foram encaminhados para o

laboratório e com o uso de uma lâmpada incandescente foi realizado um estímulo

térmico para “fuga” de larvas (Figura 2 A). Em seguida, o tecido voile e a abraçadeira

de borracha foram retirados (Figura 2 B). As larvas que se locomoviam no interior do

tubo foram capturadas com fita-crepe e quantificadas (Figura 2 C). As larvas foram

fixadas em fita dupla-face, que aderia na parte superior de placa de Petri.

Posteriormente, fragmentos da fita contendo larvas foram colocadas dentro de câmera

úmida a 25ºC e monitoradas até 15 dias quanto ao desenvolvimento de fungo sobre as

larvas capturadas.

Isolamento quantitativo in vitro (Persistência) e in vivo de Metarhizium sp.:

Para teste in vitro, um grama de solo foi suspenso e homogeneizada em 9 ml de água e

homogeneizado. A suspensão foi diluída em 10-3 e 200µl da suspensão foi aplicado

sobre meio seletivo CTC (composto de: meio BDA acrecido de extrato de levedura

(1 g), cloranfenicol (0,5 g), cicloexamida (0,25 g), tiabendazol (0,004 g/L), água

destilada (1000 ml) com pH 7) em placa de Petri (9 x 1,5 cm) e a placa incubada a 25°C

(Fernandes et al. 2010). O número de colônias (unidades formadoras de colonias: UFC)

de Metarhizium sp. foi monitorado até 6 dias após inoculação. Para teste in vivo, as

amostras de solo foram homogeneizadas e três gramas de cada amostra foram

transferidas para uma placa de Petri. Três fêmeas ingurgitadas de A. cajennense foram

expostas ao material, “roladas” e incubadas a 25°C e >98% UR. A mortalidade foi

examinada diariamente e indivíduos mortos foram incubados em câmara úmida. O

desenvolvimento de fungos foi examinado diariamente por até 15 dias. Fungos

desenvolvendo-se sobre a superfície de carrapatos mortos foram inoculados em meio

BDA acrescido de cloranfenicol (0,5 g/1000 ml) para posterior identificação.

3. Resultados

Durante o período do experimento não choveu e a temperatura variou de 20⁰C a

34⁰C e a umidade de 25% a 79% (Figura 3). Foi observado durante todas as manhãs

depósitos de gotas de água na pastagem (orvalho). Durante os quatros meses de estudo,

foram encontrados larvas e adultos de A. cajennense livres no ambiente onde foi

realizado o experimento. Não foram visualizados conídios de Metarhizium sp. sobre

larvas de A. cajennese oriundas de dispositivos tratados.


Para o teste in vitro o número de unidades formadoras de colônias, UFC

(1,2x106 UFC/cm2) no dia do tratamento foi reduzido a 6x105 UFC/cm2 nos cinco

primeiros dias, e uma redução > 95% do número de colônias foi observada 30 dias após

aplicação (2x104 UFC/cm2) (Figura 4 A). No teste in vivo as fêmeas ingurgitadas de A.

cajennense que ficaram em contato com os substratos oriundos dos três primeiros dias

resultaram numa redução da sobrevivência de 44%. Foi possível visualizar conídios de

Metarhizium sp. crescendo em fêmeas mortas de A. cajennense. No entanto, exposição

aos substratos coletados do 10º ao 30º dias não ocasionaram mortalidade das fêmeas

(Figura 4 B).

O número de larvas de A. cajennense foi reduzido nos três primeiros dias após a

aplicação da formulação de conídios de IP 46. Porém, ocorreu um aumento de larvas no

quinto dia após a aplicação da formulação. No intervalo de 15 a 20 dias ocorreu uma

redução do número de larvas, que foi rapidamente aumentada nos dias seguintes

(Figura 5).

4. Discussão

No presente estudo, a umidade relativa e a temperatura verificada apresentaram-

se como fatores primordiais para a persistência do fungo no solo. Estes dois fatores

abióticos são essenciais para a disseminação, germinação e penetração do fungo. Porém,

o micro-clima onde estes carrapatos vivem pode ser mais importante para a ocorrência

da doença quando comparada com a umidade relativa atmosférica. Neste estudo foi

possível verificar a presença de conídios em aglomerados de ovos e em larvas que

estavam no interior dos dispositivos.

As fêmeas ingurgitadas de A. cajennense ficaram mantidas durante 74 dias no

interior dos dispositivos e após, este período não havia fêmeas vivas. Porém, um

número expressivo de larva foi encontrado, no tratamento em que fêmeas foram

colocadas três dias após a aplicação de IP 46.

O número de aplicações é importante para manutenção do fungo na natureza

(Lopes 2009). No presente trabalho só foi feita uma aplicação, sendo que esta foi

realizada numa estação quente e seca, quando tem maior frequência de larvas de A.

cajennense em pastagens. As larvas de R. microplus também não foram controladas em

gramíneas que receberam uma aplicação com M. anisopliae (Castro et al. 1999,

Bittencourt et al. 2003). Um estudo de campo com Beauveria bassiana e M. anisopliae

na concentração de 109 conídios/ml verificou mortalidade de 100%, 76-95% e 36-64%


em larvas, ninfas e adultos de Rhipicephalus appendiculatus, respectivamente. Estes

resultados foram contrários ao do presente trabalho possivelmente devido a diferença

entre as espécies de carrapato e de cepas de fungos utilizadas (Kaaya et al. 1996).

A formulação oleosa é mais eficiente que formulação aquosa. Formulações em

óleos vegetais no controle de artrópodes, provavelmente pela característica lipofílica da

formulação, aumenta a adesão de conídios à cutícula e favorece sua penetração (Lopes

et al. 2007, Lopes 2009).

Os resultados reforçaram o potencial de uma formulação oleosa de M.

anisopliae, mas também a necessidade de mais testes de campo para avaliar questões

cruciais como técnicas de aplicação e persistência de conídios no campo.

Agradecimentos

Os autores agradecem o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

(CNPq, Brasil) e Tecnológico pelo apoio financeiro.

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Figura 1. Esquematização de um tubo de PVC utilizado em teste de semi-campo (A).

Esquema da simulação de tempo (dias) antes, no dia e após aplicação de formulação

oleosa de Metarhizium anisopliae entre tratamento do solo e exposição de fêmeas

ingurgitadas de Amblyomma cajennense (in vivo) ou retirada do solo (in vitro) (B).

B

A


Figura 2. Abertura do tubo de PVC (A, B) e coleta de larvas de Amblyomma cajennense

com fita-crepe (C).


Mês

abr mai jun jul ago set

Tem

pera

tura

0 C

0

20

40

60

80

100

Um

idad

e re

lati

va (

%)

0

20

40

60

80

100

Figura 3. Dados climáticos medidos por um equipamento manual (Testo 605-H1) entre

abril e agosto de 2011, Goiânia, Goiás, Brasil.


Dias de exposição

0 5 10 15 20 25 30So

bre

vivê

nci

a d

e A

du

lto

s d

e A

. caje

nn

en

se

0

20

40

60

80

100

Figura 4. Número de unidades formadores de colônias (UFC) de Metarhizium sp.

contadas apartir de uma grama de substrato suspenso em 9 mililitros de água, e

aplicações de alíquota de 200 µl sobre meio CTC e incubado em 6 dias a 75%±10 e

250C (A). Número de adultos de A. cajennense sobreviventes, decorrente do contato

direto com o substrato previamente tratado, e após 25 dias de incubação a 250C em

umidade >98% (B). O substrato foi tratado previamente com 5x 106conidios/cm2 e

exposto 30 dias em condições de semi-campo (A e B).

Dias de exposição

0 5 10 15 20 25 30Nú

mer

os

de

colô

nia

s/cm

2 d

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bst

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0,0

2,0e+5

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1,0e+6

1,2e+6

1,4e+6 A

B

Controle Tratamento


Dias de aplicação

0 5 10 15 20 25 30

Nú

mer

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rvas

so

bre

vive

nte

s

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Figura 5. Número de larvas de Amblyomma cajennense quantificadas 74 dias após

aplicação de 5x 106conidios/cm2 no interior dos dispositivos. Os dispositivos estavam

submetidos a condições de temperatura e umidade local (semi-campo).

Controle Tratamento

5-DISCUSSÃO


O presente estudo descreve a primeira ocorrência de B. bassiana e P. lilacinum

em A. cajennense. Todos os fungos encontrados são típicos de solo e B. bassiana e M.

anisopliae são as espécies mais comuns isoladas de carrapatos em campo (Chandler et

al. 2000, Samish et al. 2004). A porcentagem (0,1% em carrapatos; 2,1% em solo) de

fungos encontrados em A. cajennense ou na área de estudo foi inferior quando se

comparado a outros estudos em que 25% de Rhipicephalus spp ou Ixodes scapularis

estavam infectados por B. bassiana ou M. anisopliae (Samish et al. 2004, Benoît et al

2005). Sabe-se que o A. cajennese é um carrapato heteroxênico e na fase adulta tem

mais contato com solo e maior probabilidade de se infectar com fungos presentes em

solo, resultando em maior proporção de indivíduos infectados quando comparado com

carrapatos monoxênicos.

A produção pós-morte de conídios, em indivíduos previamente infectados,

provavelmente diminui em épocas mais secas e menos carrapatos se infectam devido à

quantidade reduzida do inóculo infeccioso. Fatores abióticos encontrados nos mais

diferentes tipos de vegetação podem estar relacionados com o encontro de fungos. No

mesmo local de estudo Rocha et al. (2009) isolaram M. anisopliae, P. lilacinum,

Fusarium sp e Pochonia chlamydosporia de solo e “lama” colecionados em uma

floresta de galeria tropical tendo como isca R. microplus.

Sabe-se que aglomerados com grande número de ovos ajudam na embriogênese

de carrapatos e favorece a eclosão de larvas. Porém, em testes de laboratório a análise

de eclosão e sobrevivência de larvas de milhares de indivíduos, se torna difícil. Existe

na literatura registro de 1 g de ovos para cada espécie, correspondente ao número de

indivíduos (Labruna et al. 1997, Prata & Daemon 1997, Kurup et al. 2008). Estes

registros podem ajudar a entender melhor a relação entre o peso da massa de ovos e o

número de indivíduos resultantes. No presente estudo foi possível observar que

quantidades de ovos reduzidas, podem facilitar a observação quantitativa da eclosão e

sobrevivência de larvas. Em condições de laboratório, resultados de estudos anteriores

revelaram que a quantidade mínima de 25 ovos em formato esférico é viável, pois

eclodiram 100% das larvas, podendo ser utilizados para avaliação da atividade ovicida

ou micoacaricida desde que esteja em umidade relativa >98% (D’Alsessandro dados

não publicados).

Na maioria dos estudos laboratoriais, tubos de vidro ou papel filtro são

utilizados como métodos avaliativos, porém isolados de M. anisopliae são

rotineiramente oriundos de solo (Monteiro et al. 1998, Fernandes et al. 2003, Prette et


al. 2005, Garcia et al. 2005, Ment et al. 2010, Hedimbi et al. 2011). A utilização de solo

como substrato, auxilia no entendimento da relação entre o fungo e o carrapato, tendo

em vista que ambos podem estar localizados no solo. IP 46 colocado em solo infectou

ovos de R. sanguineus em condições de laboratório, impedindo a eclosão de larvas

mesmo em concentrações reduzidas. Estes ovos postos sobre solo misturado com

conídios foram eliminados em poucos dias e as poucas larvas que eclodiram na mais

baixa concentração provavelmente já estavam infectadas e morreram nos dias seguintes.

M. anisopliae reciclou sobre os ovos que levou a um aumento quantitativo do inóculo e

maior probabilidade de infectar fêmeas ovipondo outros ovos ou larvas eclodindo. Os

resultados encontrados reforçaram a hipótese que M. anisopliae atuou como antagonista

de R. sanguineus, sobretudo de fases não parasíticos andando no solo.

Aplicações diretas de conídios de IP 46 inibiram a eclosão e sobrevivência de

larvas de R. sanguineus. Porém, aplicações indiretas são mais eficientes que diretas,

quando se deseja reduzir uma população de carrapatos em uma área infestada, pois

cerca de 95% da população de carrapatos fica no meio ambiente (Samish et al. 2004,

Barros-Battesti et al. 2006). O óleo utilizado nos experimentos acelerou o crescimento

de micélio e conídios nos ovos cobrindo o aglomerado de ovos. O óleo por ser vegetal

pode ter desvantagem, pois microrganismos podem concorrer na degradação

diminuindo a eficiência. No presente estudo um formulado à base de óleo teve mais

atividade ovicida e larvicida do que formulado aquoso e poderia ser empregado na

preparação de micoacaricidas.

6-CONCLUSÕES


Os isolados de M. anisopliae (IP 363), B. bassiana (IP 361, 364) e P. lilacinum

(IP 362, 359, 360) encontrados em habitats de A. cajennense, têm interesse para o

desenvolvimento de micoacaricidas contra os vetores da febre maculosa.

Conídios de M. anisopliae IP 46 misturados no solo eliminam ovos e larvas de

R. sanguineus, e neste ambiente contribuem para o controle desta espécie.

Em condições de laboratório ovos de R. sanguineus foram eliminados com a

aplicação direta de conídios de IP 46 independentemente da formulação testada.

A formulação óleo-água de conídios de IP 46 acelerou o desenvolvimento do

fungo sobre ovos de R. sanguineus tratados e foi mais eficiente que a formulação

aquosa.

Em condições de semi-campo no centro-oeste do Brasil na época seca a

formulação óleo-água de IP 46 aplicada no solo não eliminou todos os ovos postos por

A. cajennense após aplicação. Devida a baixa persistência dos conídios nas condições

testadas ás aplicações deveriam ser repetidas pelo menos 15 dias. O micro-clima no

local dos ovos pode influenciar a dinâmica da infecção fúngica nos ovos.

7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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potencial de fungos para combate de carrapatos vetores da febre