Produo de enzimas microbianas

1. RESUMOA utilizao de enzimas pelo homem uma prtica antiga embora no seu comeo no fossem conhecidos os mecanismos bioqumicos e a ao biolgica especfica destes compostos. As aplicaes industriais das enzimas requerem que estas sejam produzidas em grande escala e baixo custo por isso a produo de enzimas um dos campos mais promissores dentro das indstrias biotecnolgicas. Os investimentos em pesquisas na produo de enzimas, juntamente com a utilizao de indutores baratos e facilmente disponveis, tornou-se um procedimento habitual de grandes empresas. Esta crescente busca e avano da tecnologia, facilitou as produes enzimticas e explorou de forma positiva a utilizao de microrganismos, como principal fonte de matria prima biolgica, devido ao fato dos microrganismos possurem a capacidade para realizar grandes transformaes qumicas. Desta maneira, foram descritas diferentes tcnicas visando-se sempre exemplificar as importncias da produo de enzimas microbianas, caractersticas gerais, realizao de novas pesquisas de fontes de enzimas, de novas tcnicas de produo e suas acessibilidades aliando-se a grandes redues nos custos da produo.2. INTRODUO Durante sculos as enzimas foram utilizadas como parte de clulas ou extratos de materiais vegetais, animais ou microbiano. Assim, de forma emprica, embora no fosse conhecido o seu mecanismo de ao nem suas propriedades biolgicas, comeou seu grande uso na indstria da produo de cerveja, vinho, po e queijo.As pesquisas cientficas que dispemde microrganismos, como alvos de estudos, se focaram diretamente na indstria biotecnolgica, principalmente na produo alimentcia, como exemplo: processos de fermentaes alcolicas, lticas, acticas, entre outras (Schmidt e Pennacchiotti, 2001). Embora estas pesquisas tenham conseguido sua importncia no mundo atual, relatos implicam que antigamente, o homem j buscava cepas de diferentes bactrias, que apontassem efeitos positivos na produo e modificao de alimentos. Logo, com os avanos do conhecimento na biologia e bioqumica dos microrganismos, foi possvel obter produtos a partir de processos biolgicos, sendo alguns deles focados principalmente na produo enzimtica. As tecnologias enzimticas so estudadas e desenvolvidas para processos que necessitam de praticidade, rapidez e baixo custo, no qual a importncia do mercado mundial de enzimas microbianas fica em torno de 1,5 bilhes de dlares por ano (Rajasekaran et al. 2008).Estima-se que existem na natureza umas 25000 enzimas e at o momento s foram estudadas umas 2800, sendo que 400 delas so comerciais. A maioria das enzimas que so utilizadas por diversas indstrias pertencem aos grupos das proteases (59%), carboidrases (28%) e lipases (3%); sendo que as restantes enzimas comerciais (10%) so utilizadas em anlises (Malajovich, 2009).Os produtos gerados por microrganismos, dependendo das suas funes no metabolismo do prprio organismo podem ser divididos em: primrios, as macromolculas essenciais, ou secundrios os produtos que, aparentemente, no so essenciais ao crescimento (Serafini etal. 2002). Desta maneira, so produzidos os metablitos primrios como coenzimas e produtos intermedirios ou finais das vias metablicas, e os metablitos secundrios que incluem outros produtos como antibiticos, pigmentos, toxinas dentre outros compostos que podem ser aproveitados pelo homem (Rajasekaran et al. 2008).

3. CARACTERSTICAS GERAIS DAS ENZIMASAs enzimas so biomolculas que atuam como catalisadores biolgicos, intervindo em numerosos processos celulares, sendo que geralmente so produzidas em pequenas quantidades e tem funes especficas. Uma das vantagens das enzimas como catalisadores a propriedade de se manter nas mesmas concentraes e no alterar o seu equilbrio qumico aps a reao (Schmidt e Pennacchiotti, 2001). Todos os organismos possuem a capacidade de produzir enzimas, as quais podem ser do tipo extracelular quando secretadas ao meio, ou intracelulares quando atuam dentro das clulas que as produziram (Carrera, 2003). Pelo fato de serem protenas com estrutura terciria ou quartenria, as enzimas so dotadas de dobramentos tridimensionais em suas cadeias polipeptdicas, o que proporcionam formas e caractersticas exclusivas (Schmidt e Pennacchiotti, 2001). Devido a esta complexa estrutura molecular, as enzimas possuem uma inerente labilidade que s vezes um impedimento para o seu uso. Por isso, para conseguir a estabilidade e a atividade requerida de uma enzima preciso levar em conta fatores externos como a temperatura e a presena de compostos qumicos os quais podem ativar ou inibir suas funes. Sendo assim, considera-se umaenzima apropriada para utilizao comercial quando esta possui estabilidade suficiente para uma dada aplicao.

4. IMPORTNCIA DAS ENZIMAS MICROBIANASEntre as enzimas de origem microbiana, se incluem aquelas produzidas por bactrias, arqueias e fungos (Tabela 1), sendo que so mais utilizadas que as de origem vegetal ou animal por possurem ampla disponibilidade, baixo custo, condies suaves de sntese, grande estabilidade e ampla especificidade para substratos, oferecendo assim maiores facilidades no seu uso e na modificao dos processos para otimizar a produo (Dalla-Vecchia et al. 2004). Algumas enzimas de origem microbiana so produzidas em maiores concentraes e excretadas ao meio, muitas destas enzimas microbianas extracelulares so do tipo hidrolticas (Carvalho et al. 2009) e so de grande uso em processos industriais, devido a sua capacidade de digerir muitos materiais polimricos, como a celulose, amidos e protenas cujos monmeros so utilizados como nutrientes pelos microrganismos (Carrera, 2003).A sntese de enzimas em pequenas quantidades ocorre durante a fase de crescimento do microrganismo, pois durante a fase de latncia so acumulados muitos compostos (Rajasekaran et al. 2008).As enzimas bacterianas podem ser induzidas a criar resistncia a diferentes tipos de antibiticos que se encontram no meio, como exemplo, um grupo de bactrias produz a enzima -lactamase, a qual hidrolisa o anel beta-lactmico presente na estrutura da penicilina, criando resistncia ao antibitico (Essack, 2001).

Tabela - 1. Exemplos de enzimas microbianas e suasaplicaes.EnzimaFonteAplicaes AmilaseBactrias FungosDegradao de amido, produo de detergentesPectinaseFungosProduo de alimentosProteaseBactriasFungosProduo de alimentos, detergentes, esterilizao LipaseFungosProduo de frmacos, detergentes, estabilizao de substncias volteisCelulaseBactriasFungosProduo de alimentos, indstria txtil CutinaseFungosProduo de frmacos, detergentes, produtos de uso na agriculturaCarboidraseBactriasFungosProduo de alimentosLactaseLevedurasProduo de laticnios InvertaseLevedurasProduo de alimentosDNA PolimeraseBactrias Biotecnologia

5. PESQUISA DE FONTES DE ENZIMAS MICROBIANASOs processos biotecnolgicos dependem essencialmente de matrias primas biolgicas e de recursos naturais, como os organismos vivos que so amplamente utilizados devido s suas molculas e atividades funcionais. Os recentes avanos na tecnologia de diferentes reaes biolgicas tm gerado notveis melhorias na indstria biotecnolgica, devido aos processos de caracterizao de biomolculas e otimizao da produo (Prez e Carreo, 2007). Decorrente destas pesquisas, a cincia avanou gradativamente, de forma que tcnicas de metagenmica tm sido aplicadas, na busca de novos biocatalizadores a partir de amostras ambientais (Lorenz e Eck, 2005). O desenvolvimento de novas fontes, mtodos de isolamento, purificao e melhorias nos desenhos de reatores enzimticos tem originado a engenharia enzimtica, uma nova rea da biotecnologia. Alm disso, pode-seacrescentar o rendimento de uma enzima modificando as condies ambientais, ou obtendo cepas mutantes mais eficientes na produo que as linhagens originais (Malajovich, 2009).Existem muitos modelos de estudos para biocatalizadores, porm no contexto enzimtico, cientistas tomam por base as descobertas de extremozimas, prprias de ambientes extremos, (Tabela 2), um exemplo comumente utilizado em laboratrios que disponham de tcnicas moleculares e genticas, a utilizao da Taq-polimerase, descoberta a partir do microrganismo Thermus aquaticus, o qual foi isolado de um ambiente com caractersticas inspitas caracterizado pelo elevado pH, temperatura e presso (Chien et al. 1976). Outra linha de pesquisa muito utilizada na descoberta de novas enzimas, focam-se no isolamento de microrganismos presentes no sistema digestivo de ruminantes, onde estas enzimas previamente isoladas e testadas apresentam timos resultados na degradao de celulose (Duan et al. 2009). Tambm a partir de microrganismos patognicos das plantas, como Fusarium oxysporium, so obtidas enzimas como a cutinase, de grande utilidade na indstria farmacutica e na produo de compostos qumicos para agricultura (Macedo e Pio, 2005).

Tabela - 2. Exemplos de extremozimas identificadas em microrganismos de ambientes extremos.

Tipo de organismoExtremozimasAlcalfilos (pH > 9)Proteases, Amilases, LipasesAcidfilos (pH < 5)Glucosidases, PululanaseHalfilos (> 9% NaCl)Amilases, ProteasesPsicrfilos (0 15C)Proteases, Desidrogenasas, Amilases, Lpases, DNA polimerasesHipertermfilos (>80C)Proteases, Amilases, celulases, Pululanases, Xilanases, DNA Polimerases

6. OBTENO DE ENZIMASA produo artificial de enzimas realizada principalmente mediante dois processos: extrao de tecidos de plantas e animais, ou mediante fermentaes, no caso de enzimas microbianas, que se podem realizar em cultivos semi-slidos ou submersos (Figura 1). Atualmente a produo de enzimas microbianas maior devido s vantagens que oferece o processo de fermentao, estas relacionadas com o baixo custo e por obter produtos em espaos de tempo curtos (Schmidt e Pennacchiotti, 2001).O processo mais utilizado para produzir enzimas microbianas a fermentao submersa, pois a partir da fermentao em cultivos semi-slidos podem-se ter maiores riscos de contaminaes, concomitantemente aponta menores rendimentos dos produtos finais (Lima et al. 2001). A produo industrial de enzimas realizada em fermentadores ou biorreatores que podem dispor de sistemas de agitao para conseguir a total homogeneidade do meio e/ou caractersticas que permitem a realizao de processos fermentativos aerados (Serafini et al. 2002). Os biorreatores para fermentao submersa podem ter diversas caractersticas que permitem que as clulas fiquem livres no meio de cultura ou fixas em suportes inertes (Malajovich, 2009).

Para que o processo de fermentao seja eficiente o microrganismo utilizado deve se multiplicar rapidamente, a matria-prima deve ser barata e o produto obtido deve ser sintetizado em grande quantidade (Malajovich, 2009). Na produo industrial de enzimas os maiores custos(30-40%) se devem aos meios de cultura utilizados (Nascimento et al. 2007), portanto a otimizao dos custos produtivos uma necessidade. Para isso, como componente no preparo de meios de cultura para produo de enzimas microbianas, podem-se usar resduos agroindustriais que viabiliza a produo de enzimas devido ao baixo custo. Alguns componentes alternativos usados so soros de queijo, a gua de macerao de milho, e resduos dos processos em usinas para produo de etanol.

6.1. Fases de um processo fermentativo para obter enzimas microbianas6.1.1. Seleo e preparo do inoculoA escolha do inculo que vai ser utilizado no processo de fermentao geralmente passa por vrios estgios desde a pesquisa do microrganismo adequado at, s vezes, a modificao gentica deste visando acrescentar a produo ou obter outros produtos desejados. Porm, alm dos conhecimentos dos processos fermentativos e da tecnologia direitamente relacionada fermentao, o homem faz uso dos avanos na tecnologia do DNA recombinante para otimizar a produo industrial de enzimas (Lima, 2001). Existem tambm instituies, como American Tipe Culture Collection (ATCC), entre outros, que se dedicam produo de inculos para processos industriais de obteno de enzimas microbianas. O preparo do inculo pode variar dependendo do processo, mas geralmente inicia-se com um cultivo para enriquecer a cepa selecionada e para conseguir a ativao e adaptao desta s condies requeridas no processo.

6.1.2. Processo de fermentaoO meio de cultura varia em funo dos requerimentos metablicosdo microrganismo e do produto desejado. De maneira geral todos os meios de cultura utilizados no laboratrio contem gua, matrias aucaradas ou amilceas como fonte de energia e de carbono, matrias proticas, componentes nitrogenados e substncias fornecedoras do crescimento microbiano (Malajovich, 2009).Outro fator importante nos processos de fermentao para obteno de enzimas microbianas so as caractersticas biolgicas, qumicas e fsicas dos materiais a serem utilizados nas reaes (Shanmugam et al. 2008). Os meios biolgicos devem conter uma esterilizao adequada dos equipamentos e materiais a serem utilizados na preparao do processo, evitando-se assim qualquer tipo de contaminao externa, portanto o processo de fermentao deve conter unicamente o inculo do organismo que ser fonte do processo biolgico. A questo do meio qumico se refere composio qumica do meio de cultura, onde dever ser inoculado o microrganismo em questo, sendo que deve se levar em conta os nveis de concentraes dos substratos utilizados, os valores de pH e a comprovao da ausncia de substncias que possam inibir o processo de fermentao. O meio fsico favorvel se consegue manter as condies fsicas do fermentador, considerando sempre o controle adequado de diferentes fatores, como a temperatura e agitao do meio (Malajovich, 2009).Em alguns processos de fermentao a reao passa por diferentes etapas, as quais requerem diversas condies fsicas timas, que combinam de acordo com as sucessivas fases de crescimento do inculo no meio de cultura, por exemplo, naproduo de lpase extracelular a partir de Bacillus sp. foi comprovado que a temperatura tima pode variar desde 30 at 60C dependendo da taxa de crescimento do microrganismo (Senthilkumar e Selvakumar, 2008).Aps a incubao do processo fermentativo deve-se separar a biomassa e o resto das clulas dos componentes slidos do meio. Para isso se realiza a filtrao ou centrifugao e o liquido obtido j pode ser usado como preparado enzimtico (Schmidt e Pennacchiotti, 2001), embora geralmente se utilizem tcnicas de purificao e/ou isolamento que compreendem diferentes fases e que se podem aplicar tambm para obteno de enzimas vegetais e animais.

6.1.3. Purificao e isolamento de enzimasA purificao e isolamento de enzimas produzidas grande escala na indstria podem passar por diferentes processos (Schmidt e Pennacchiotti, 2001):a) Adsoro seletiva: todas as protenas no so adsorvidas nas mesmas condies, por isso para separar os produtos proticos do processo de fermentao usam-se hidrxidos coloidais e lavagens com gua ou soluo salina geralmente alcalina.b) Precipitao: esta tcnica permite o fracionamento das protenas at o ponto delas precipitarem. Nesse procedimento usam-se sais, elevada concentrao inica ou solventes orgnicos em baixa temperatura.c) Dilise: usam-se gradientes de concentrao atravs membranas semipermeveis.d) Ultrafiltrao: filtragem de protenas em membranas finas. uma boa alternativa para separar enzimas porque neste caso no existem altos gradientes de temperatura que possam modificar as propriedadesdo produto obtido.e) Electroforesis: realiza-se sobre suportes de papel, gel de amido, agar entre outros materiais.O uso dos processos acima alm de outros podem ser feitos separadamente ou em conjunto e permitem a separao de complexas misturas de enzimas. Todas as etapas devem ser rigorosamente controladas para obter produtos enzimticos de grande qualidade.

7. ASPECTOS SANITRIOS NA PRODUO DE ENZIMASA elaborao de preparados enzimticos a partir de microrganismos deve levar em conta medidas sanitrias rigorosas para evitar a propagao no desejada dos microrganismos. Deve-se pensar tambm no despejo dos resduos da produo, pois podem representar perigos para o meio ambiente (Malajovich, 2009), embora alguns deles possam ser usados em outros processos de produo. As enzimas obtidas de microrganismos devem ser de procedncia conhecida, evitando aquelas produzidas por organismos patognicos ao homem, pois podem ser carcinognica, teratognica e/ou mutagnica (Schmidt e Pennacchiotti, 2001). O tratamento durante o processo de produo deve ser sensvel para garantir as atividades do produto final e evitar a contaminao com microrganismos estranhos que possam interferir no uso dos produtos.

8. CONCLUSOA grande importncia da produo de enzimas realizadas com o auxilio dos microrganismos, importante matria prima biolgica. Tal importncia deve-se ao fato, de que os microrganismos podem ser acessados de inmeras maneiras, facilitando-se assim as pesquisas de novas fontes enzimticas, que podem ser usados como catalisadores biolgicos, devido asua facilidade de atuar em reaes qumicas especificas. Embora cada mtodo apresente vantagens e desvantagens, a escolha da estratgia de produzir enzimas de origem microbiana dever considerar as relaes custo-produo, levando em conta os aspetos sanitrios que possam interferir na utilizao do produto obtido considerando os possveis perigos para a sade e para o meio ambiente. Contudo, a intensa busca de novas fontes enzimticas microbianas, vem sendo estudada de forma crescente por grandes indstrias tecnolgicas, as quais inovam suas maneiras de obteno, dispondo-se de diferentes tcnicas microbiolgicas e genticas. Os custos da produo industrial de enzimas podem ser reduzidos utilizando-se dejetos industriais como fonte de substratos, os quais possuem alto valor nutricional para o crescimento e excitao dos microrganismos a produzirem enzimas.Qualificando como significativos os avanos cientficos nesta rea, a identificao de novas fontes de enzimas e novas metodologias para a produo industrial destas ainda poder ser mais explorada.

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