Conteúdo:

1. Biodegradação de biomassa lignificada em ambientes naturais:

organismos envolvidos, aspectos macroscópicos e microscópicos da

degradação, secreção de enzimas e outros metabólitos, mecanismos de

ação das enzimas oxidativas e hidrolíticas.

2. Produção de enzimas de origem microbiana envolvidas na degradação de

biomassa lignificada: cinética do crescimento e produção de metabólitos.

3. Controle sobre a síntese enzimática – indução e repressão.

4. Celulases, hemicelulases e oxidorredutases: estrutura, função e aplicação.

5. Organismos degradadores de biomassa amilácea, oleaginosa e protéica

6. Produção de enzimas envolvidas na degradação de amido, lipídeos e

proteínas.

7. Controle sobre a síntese enzimática – indução e repressão. 8. Lipases e

proteases: estrutura, função e aplicação.

Forma de Avaliação:

O estudante será avaliado: (i) por duas provas escritas; (ii) por sua

participação durante as aulas da disciplina

Enzimas em conversão de biomassa

Enzimas em conversão de biomassa

Porque esta foto pode servir para abrir a disciplina sobre enzimas em conversão de biomassa?

Enzimas em conversão de biomassa

Este fungo requer enzimas EXTRACELULARES para a conversão de biomassa.......................

Qual é a composição de um galho de árvore??

Qual é o alimento deste fungo??

Qual seria a forma de absorção dos nutrientes por esse fungo??

O que difere esta foto da foto anterior?

Enzimas em conversão de biomassa

O substrato colonizado corresponde a uma biomassa de "acesso" facilitado

Enzimas em conversão de biomassa 2014

Colonização intensa por um fungo verde

O substrato parece ter sido "pré-tratado"

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16

% d

a m

assa

de

ce

lulo

se

inic

ial

Tempo de biodegradação (semanas)

Trametes versicolor (WR)

Irpex lacteus(WR)

Gleophyllum trabeum (BR)

Comparativo de eficiências para a metabolização de celulose

Ascomiceto Trichoderma reesei

Basidiomicetos de decomposição branca e parda

dias

semanas

Enoki et al, Holzforschung 42(1988) 85-93

Biodegradação de biomassa lignificada em ambientes naturais: organismos envolvidos, aspectos macroscópicos e microscópicos da degradação

Referências básicas: Nilsson T. 2009. Biological Wood degradation. In: Pulp and Paper Chemistry and

Technology Volume 1, Wood Chemistry and Wood Biotechnology

Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson

cap. 10, pp. 219-244

LEVY JF. 1987. The natural-history of the degradation of wood.

Philosophical transactions of the royal society of London - series a-mathematical

physical and engineering sciences 321: 423-433:1987

A biodegradação da madeira, e dos lignocelulósicos em geral,

constitui um importante ciclo do carbono na natureza

Pode ser indesejável nos casos onde se usa a madeira com função

estrutural: construção civil; cercas e postes em áreas rurais;

embarcações de madeira.

Biodegradação da madeira em ambientes naturais

1. Alguns insetos se alimentam de fragmentos de madeira que são posteriormente

decompostos por fungos e bactérias. “Perfuradores marinhos” usualmente

utilizam a madeira como local de refúgio e não como alimento (ambos não serão

abordados nesse tópico)

2. Para os fungos degradadores, a madeira se parece com uma série de cavidades

convenientemente orientadas rodeadas por alimento.

3. O nível de umidade é crítico.

- deve ser elevado o suficiente para a difusão de enzimas e outros

metabólitos

- não deve ser elevado em demasia para evitar a formação de ambientes

anaeróbios

- não deve ser baixo em demasia para evitar que fique abaixo do limite que

permite a sobrevivência dos microrganismos

1. Baixas concentrações de Nitrogênio nos lignocelulósicos representam

uma condição limitante para a maioria dos microrganismos

2. Um lignocelulósico quando em contato com o solo em um ambiente

natural é atacado por uma série de grupos de microrganismos que se

sucedem ao longo de todo o processo biodegradativo

a) bactérias

b) bolores primários

c) fungos de tingimento

d) fungos de decomposição branda

e) fungos degradadores de madeira (decomposição parda e decomposição

branca)

f) bolores secundários Estude e responda: do que cada grupo é capaz de se alimentar

The natural-history of the degradation of wood (LEVY JF). Philosophical transactions of the

royal society of London series a-mathematical physical and engineering sciences 321:423-

433, 1987

Biodegradação da madeira em ambientes naturais

Organismos envolvidos na biodegradação da madeira

fungos de decomposição branca

“white-rot fungi”

degradam todos os componentes

da madeira

fungos de decomposição parda

“brown-rot fungi”

degradam principalmente

polissacarídeos

fungos de decomposição

branda

“soft-rot fungi”

Degradam lignina e

polissacarídeos, porém em

velocidades muito baixas

Símbolos:

Quadrado = glucana

triângulo = polioses

Círculo = lignina

Balanço de massas dos componentes durante a biodegradação da

madeira - Decomposição de Eucalyptus grandis

60

70

80

90

100

859095100

Co

mp

onen

te (%

do

inic

ial)

Massa do lignocelulósico (% do inicial)

C

60

70

80

90

100

708090100

Co

mp

onen

te (%

do

inic

ial)

Massa do lignocelulósico (% do inicial)

B

60

70

80

90

100

708090100

Co

mp

onen

te (%

do

inic

ial)

Massa do lignocelulósico (% do inicial)

A

Parda: Wolfiporia cocos Branca, não seletivo: Trametes versicolor

Branca, seletivo: Ceriporiopsis subvermispora

Biodegradação da madeira do ponto de vista

microscópico

- As hifas do fungo penetram pelo lúmen

Três tipos de ataque da parede celular

Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico

2. Remoção de lignina e polioses sem

a simultânea erosão da parede

celular vegetal (tem sido

observado em fungos seletivos

para a degradação de lignina).

3. Formação de microcavidades na

parede secundária, causada por

fungos de decomposição branda

1. “escamação” no sentido lúmem-

lamela média, levando à diminuição

progressiva e irregular da espessura

da parede celular.

Enzimas envolvidas no processo degradativo

O processo é

extracelular

Exo-glucanase

Endo-glucanase

beta-glucosidase

CELULOSE

OLIGÔMEROS

CELOBIOSE

GLICOSE

Sinergismo na ação das celulases

Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a

hidrólise completa de celulose de algodão.

Enzima Atividade relativa das

celulases

Endo-glucanase < 1%

Exo-glucanase < 1%

ß-glucosidase Nenhuma

Endo-glucanase + ß-glucosidase 5%

Exo-glucanase + ß-glucosidase 4%

Endo-glucanase + Exo-glucanase

+ ß-glucosidase

103%

Caldo de cultura original 100%

Degradação da celulose

(ação das Celulases, modelo clássico)

Degradação das hemiceluloses

(ação das xilanases e enzimas acessórias)

Degradação das hemiceluloses

(ação das mananases e enzimas acessórias)

Degradação das hemiceluloses

(ação de feruloil esterases)

Éster passível de hidrólise enzimática

Enzimas envolvidas na degradação de lignina

a) Fenoloxidases

b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio

C0 CI

CII

S

S+•

S

S+•

H2O2

H2O H 2 O

C 0 C I

C II

H 2 O 2

Mn3+

Mn2+

PhOH PhO

.

Mn3+

Mn2+

ou

LiP MnP

Enzimas oxidativas (peroxidases)

Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP)

Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.

Lacase (Cu2+)

Lacase red. (Cu1+)

O2

H2O PhOH

PhO•

Enzimas oxidativas (lacases)

glicose oxidase

(intracelular)

glioxal oxidase

(extracelular)

aril-álcool oxidase

(extracelular)

Enzimas que produzem peróxido

(são acessórias às peroxidases)

Enzimas que produzem peróxido

Também MnP pode gerar H2O2 a partir da oxidação de

ácidos orgânicos como o malônico e oxálico.

O=O

H-O-O. + CO2

Doador de H

HO-(C=O)-(C=O)-OH

Mn3+ Mn2+

O=C=O + H+ + HO-C.=O

H2O2

Enzimas com descrição recente: LPMOs

Oxidação intracadeia e clivagem da celulose e também hemiceluloses

Celobiose desidrogenase (CDH)

- Atua sobre celobiose, oligômeros de glicose e mesmo celulose,

oxidando o terminal redutor

- Utiliza quinonas, Fe3+ ou O2 como aceptor de elétrons

- Pode gerar radicais hidroxila, indiretamente, via reação de

Fenton

Degradação de celulose (modelos contemporâneos)

- AA9 (anteriormente denominadas com GH61 e LPMOs

(lytic polysaccharide monoxigenases)

Complexidade dos sistemas enzimáticos revelados com os estudos

recentes de proteômica - Exemplos

G. trabeum

em madeira

P. chrysosporium em

madeira

Table S12. The number of genes encoding the lignin oxidative enzymes in V. volvacea and other basidiomycetes

species lignin peroxidase manganese-dependent peroxidase laccases versatile peroxidase

V. volvacea 0 2 11 2

C. cinerea 0 1 17 0

A. bisporus 0 2 12 0

S. commune 0 0 2 0

P. chrysosporium 10 5 0 0

P. placenta 0 0 5 0

S. lacrymans 0 0 5 0

Bao D, Gong M, Zheng H, Chen M, Zhang L, et al. (2013) Sequencing and Comparative

Analysis of the Straw Mushroom (Volvariella volvacea) Genome. PLoS ONE 8(3): e58294.

doi:10.1371/journal.pone.0058294

- Limitação da parede celular lignificada à infiltração das enzimas

(teorias emergentes sobre o processo degradativo)

A parede celular vegetal não é "porosa" o suficiente para

permitir a penetração das enzimas.

Desse fato surge a dúvida de como alguns fungos poderiam

atacar a parede celular de forma não erosiva

Erosiva versus não erosiva

Esse tópico carece de teorias bem estabelecidas e comprovadas. No

entanto, vários artigos tomados em conjunto permitem compilar

informações que indicam claramente a importância de compostos

de baixa massa molar como intermediários do processo

degradativo:

Um dos artigos mostrou de forma inequívoca que a degradação de

lignina na parede celular tem início mesmo antes de ser porosa às

enzimas

Blanchette RA, Krueger EW, Haight JE, Akhtar M, Akin DE. Cell wall alterations in

loblolly pine wood decayed by the white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora.

J. BIOTECHNOL. 53:203-213, 1997

Madeira não tratada Tratada por 2 semanas Tratada por 4 semanas

Amostra insulina 5,7 kDa mioglobina 17,6 kDa ovoalbumina 44,3 kDa

não trat não infiltra não infiltra não infiltra

2 semanas infiltra início da S2 não infiltra não infiltra

4 semanas infiltra começa a infiltrar não infiltra

8 semanas infiltra infiltra começa a infiltrar

Remoção de lignina evidenciada por TEM com contraste para lignina

Infiltração de Ovoalbumina

contendo partículas de ouro,

após 8 semanas de

biodegradação

MnP/Mn-ácido oxálico

- Enoki M, Watanabe T, Nakagame S, Koller K, Messner K, Honda Y, Kuwahara M.

Extracellular lipid peroxidation of selective white-rot fungus, Ceriporiopsis

subvermispora. FEMS MICROBIOL LETT 180:205-211, 1999

- Kapich AN, Jensen KA, Hammel KE. Peroxyl radicals are potential agents of lignin

biodegradation. FEBS LETT 461:115-119, 1999

- Kapich AN, Stefen KT, Hofrichter M, Hataka A. Involvement of lipid peroxidation in

the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of

the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla. BIOCHEM. BIOPHYS. RES.

COMM. 330: 371-377, 2005.

MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados

Mn3+ ou .OH

.

Mn2+ ou H2O

COOH

O2

COOH.

COOH

OO.

Abstração de H de um doador

COOH

O OH

COOH

COOH

COOH.(etapa de propagação)

(etapa de iniciação)

MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados

OCH3

OOCH3

OH

HO

OC2H5

ROO.

ROOH

OCH3

OOCH3

OH

HO

OC2H5

.O2

OCH3

OOCH3

OH

HO

OC2H5

.OO

HOO.

OC2H5

OH

OCH3O

OCH3

O

OCH3O.

+

OC2H5

HO

OH

OCH3

OCH3

OH

OC2H5

O

AB

Peroxidação de ácidos

graxos iniciada por Mn3+ ou

OH radical

Degradação de

um modelo não

fenólico por

radicais peroxila

Degradação in vitro de

lignina contida em um

material lignocelulósico

pelo sistema MnP/ácido

linoleico

G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and

Microbial Technology 46 (2010) 262–

267

Sistema

lacase/mediador

Origem : sistemas in

vitro desenhados para

degradação de lignina

durante o

biobranqueamento de

polpas celulósicas

BOURBONNAIS, R., PAICE, M. G., FREIERMUTH, B., BODIE, E. & BORNEMAN,

S. (1997) Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model

compounds. Appl Environ Microbiol 63: 4627-4632.

SREBOTNIK E, HAMMEL KE (2000) Degradation of nonphenolic lignin by the

laccase:1-hydroxybenzotriazole system. Journal of Biotechnology 81:179–188

Mediadores naturais de lacase

Li K, Horanyi PS, Collins R, Phillips RS, Eriksson K-EL. Investigation of the

role of 3-hydroxyanthranilic acid in the degradation of lignin by white-rot

fungus Pycnoporus cinnabarinus. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 28:

301-307, 2001.

Fungos de decomposição parda e a reação de Fenton

Goodell, B. Brown-rot fungal degradation of wood: our evolving view. In: Wood

deterioration and preservation – advances in our changing world. ACS Symp. Ser.

845, p.97-118, 2003.

Hammel KE, Kapich AN, Jensen KA, Ryan ZC. Reactive oxigen species as agents of

wood decay by fungi. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 30: 445-453, 2002.

Reação de Fenton

H2O2 + Fe2+ + H+ ----------- H2O + Fe3+ + .OH

Fe2+ pode ser gerado pela ação de Celobiose

desidrogenase

ou

por ação de hidroquinonas produzidas pelos

fungos de decomposição parda