SOLUÇÕES dos EXERCÍCIOS de ENZIMAS 1. Um inibidor não-competitivo puro causa 65% de inibição quando presente numa concentração igual a 3,35 mM. Qual é o valor da constante de inibição (KI)? Grau de inibição = 1 −− vi/v Como se trata de um inibidor não competitivo puro, KI = KI’, isto é, a afinidade da enzima livre pelo inibidor é igual à afinidade da enzima complexada pelo inibidor. O grau de inibição, β, independente da concentração do substrato, é dado por:

IK]I[]I[

+=β

Isolando KI, que é o que devemos calcular:

β=+

]I[K]I[ I , ]I[

]I[K I −

β= ; substituindo os valores:

mM 80,1mM 35,365,0mM 35,3

K I =−=

2. Durante danos consideráveis no fígado, uma enzima (E1A) é liberada na corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima do músculo (E1B), que catalisa a mesma reação, é liberada na corrente san-guínea. E1A e E1B podem ser diferenciadas porque possuem KM's diferentes. O valor de Km da enzima do músculo é igual a 2 ×× 10-5 M. Uma determinação numa amostra de sangue de um paciente apresentou os resul-tados da tabela ao lado. O paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente?

[S] (M)

v mmol ×× ml de soro-1 min-1

5 ×× 10-5 43 7 ×× 10-5 57 1 ×× 10-4 75

1,5 ×× 10-4 100 2 ×× 10-4 120 3 ×× 10-4 150 6 ×× 10-4 200

É preciso avaliar o valor de KM; de quebra podemos também avaliar Vmax. Isto pode ser feito graficamente. Primeiro será necessário calcular os inversos de [S] e v:

Agora, devemos plotar (representar) graficamente 1/v versus 1/[S] e avaliar KM e Vmax de acordo com a equação de Lineweaver-Burk:

maxmax

M

V1

]S[1

VK

v1

+⋅=

M000299,05,3344

1K M ==

11- minml mmol 65,2990033372,0

1Vmax

−==

[S] (M)

1/[S] (M−− 1)

v mmol ×× ml de soro -1 ××

min-1

1/v (min ×× ml de soro

×× nmol−− 1)

5 × 10-5 20000 43 0,0232 7 × 10-5 14285,71 57 0,0175 1 × 10-4 10000 75 0,0133

1,5 × 10-4 6666,67 100 0,01 2 × 10-4 5000 120 0,00833

3 × 10-4 3333,33 150 0,00666 6 × 10-4 1666,66 200 0,005

O KM não coincide com o da enzima do músculo; é mais provável que o indivíduo esteja

sofrendo de uma doença do fígado 3. Que concentração de um inibidor competitivo é necessária para produzir 75% de inibição a uma concentração de substrato de 1,5 ×× 10-3 M, se Km = 2,9 ×× 10-4 M e KI = 2 ×× 10-5 M? A que valor devemos elevar a concentração do substrato para restabelecer o valor original (não inibido) da velocidade de reação? Para a inibição competitiva, o grau de inibição é dado por:

MI

I

K/]S[K/]I[1K/]I[++

=β

A primeira pergunta é sobre o valor de [I] para que β seja igual a 0,75. Para obter isto, é peciso isolar [I] na equação acima:

IMI K/]I[)K/]S[K/]I[1( =β++ , depois IMI K/]I[K/]S[K/]I[ =β+β+β Isolando os termos que contém [I]:

β+β=β− MII K/]S[K/]I[K/]I[ , depois β+β=β− MI K/]S[K/)1](I[

e, finalmente β−+β=

β−β+β=

1)1K/]S([K

1KK/]S[K

]I[ MIIMI; substituindo valores:

M 1070,325,0

10258,975,01

)1109,2/105,1(10275,0]I[ 4

5435−

−−−−

×=×

=−

+××××=

Este valor está certo? É só tirar a prova:

max43

3max

m

max V837,0109,2105,1)105,1(V

K]S[]S[V

v =×+×

×=

+=

−−

−

max4

5

43

3max

mI

maxi V209,0

109,2102107,3

1105,1

)105,1(V

KK

]I[1]S[

]S[Vv =

××

××

++×

×=

++

=−

−

−−

−

Calculando o grau de inibição:

75,0V837,0/V209,01v/v1 maxmaxi =−=−=β

E a segunda pergunta: a que valor devemos elevar [S] para fazer com que vi passe a ter o valor de v? Nós queremos um valor de [S] tal que:

mI

maxi

KK

]I[1]S[

]S[Vvv

++

==

mas com [I] = 3,7 × 10−4 M. Na verdade, basta isolar [S] na expressão acima e calcular:

SIC DEMONSTRANDUM ERAT!

]S[VKK

]I[1]S[v maxm

I

=

++ ; e ainda: ]S[VK

K]I[

1v]S[v maxmI

=

++

continuando: mI

max KK

]I[1v]S[v]S[V

+=− ; ou seja: m

Imax K

K]I[

1v)vV](S[

+=−

e, finalmente: mImax

KK

]I[1

vVv

]S[

+

−=

substituindo valores: 4

5

4

maxmax

max 109,2102107,3

1V837,0V

V837,0]S[ −

−

−

××

××

+−

=

( ) M029,0109,25,19134,5109,25,19837,01

837,0]S[ 44 =×××=××

−= −−

4. Uma enzima pura tem uma atividade específica de 120 unidades/mg de proteína. (a) Calcule o número de turnover, se o peso molecular é 360000. (b) Calcule o tempo necessário para um ciclo catalítico. Uma atividade específica de 120 unidades/mg corresponde a uma atividade de 120 µmol minuto−1 mg−1 a) O peso molecular é de 360 000; logo 1000 µg (ou 1 mg) correspondem a:

1000/360000 = 0,002778 µmol

b) Portanto, uma atividade específica de 120 µmol minuto−1 mg−1 corresponde a

43196,54 mol 002778,0 min

mol 120kcat =

µ×µ

= minuto−1

Isto significa que cada molécula de enzima é capaz de transformar 43196,54 moléculas de substrato por minuto (ou cada µmol de enzima é capaz de transformar 43196,54 µmol de substrato por minuto).

Durante 1 segundo, que é um intervalo de tempo 60 vezes menor, a quantidade a ser transformada deverá ser 60 vezes menor. Portanto, o valor de kcat é igual a 43196,54/60 = 719,94 segundo−1. Quando ao ciclo catalítico, em segundos,

duração do ciclo catalítico = 1/kcat = 1/719,94 = 0,001389 segundos

A enzima leva 0,001389 segundo (ou 1,38 msegundo) para fazer uma transformação; ou seja, 0,00002315 minuto (ou 23,15 µminutos). 5. Um extrato livre de células de Escherichia coli contém 24 mg de proteína por ml. Vinte microlitros (20 µµl) deste extrato num volume padrão de incubação de 0,1 ml catalisaram a incorporação de [14C]glicose a partir de [14C]glicose 1-fosfato no glicogênio, com uma velocidade de 1,6 nmol/minuto. Calcule a velocidade da reação em termos de: (a) µµmol/minuto; (b) µµmol ×× litro-1 min-1; (c) µµmol ×× mg de proteína-1 ×× minuto-1. Calcule também a atividade da enzima do extrato em termos de (d) unidades/ml e (e) unidades/mg de proteína. a) µµmol/minuto? A velocidade de reação é de 1,6 nmol/minuto; 1 µmol = 1000 nmol; portanto, 1,6 nmol/minuto correspondem a 1,6 × 10−3 µmol/minuto. b) µµmol ×× litro −− 1 minuto −− 1? O volume de incubação é de 0,1 ml, ou 0,1 × 10−3 litro, ou ainda 1 × 10−4 litro. Portanto,

µmol × litro−1 minuto−1 ⇒ (µmol/minuto por 0,1 ml)/10−4 = 1,6 × 10−3/10−4 = 16 µmol × litro−1 minuto−1

c) µµmol ×× mg proteína−− 1 minuto −− 1?

µmol × mg proteína−1 minuto−1 ⇒ µmol minuto−1/mg proteína no ensaio

1 ml (1000 µl) do extrato contém 24 mg de proteína; por isto, os 20 µl usados para medir a atividade contém:

mg proteína no ensaio = (20/1000) × 24 = 0,48 mg

Portanto:

µmol × mg proteína−1 minuto−1 ⇒ 1,6 × 10−3/0,48 = 0,00333 µmol min−1 mg−1 d) unidades/ml? Uma unidade corresponde à quantidade que transforma 1 µmol por minuto. 20 µl do extrato tem uma atividade de 1,6 × 10−3 µmol/minuto. Logo, tem também, 1,6 × 10−3 unidades. Por ml: 1,6 × 10−3 unidades/0,1 ml = 1,6 × 10–2 unidades/ml.

e) unidades/mg proteína? É só dividir 1,6 × 10−3 unidades por 0,48 mg de proteína: 0,00333 unidades/mg proteína. 6. Cinquenta mililitros (50 ml) do extrato livre de células descrito no problema anterior foram fracionados por precipitação com sulfato de amônio. A fração que precipita entre 30 e 50% de saturação foi redissolvida num volume total de 10 ml e dialisada. A solução após a diálise forneceu um volume de 12 ml e continha 30 mg de proteína/ml. Vinte microlitros (20 µµl) da fração purificada catalisaram a reação da fosforilase com uma velocidade de 5,9 nmol/minuto sob condições padrão de ensaio. Calcule (a) a recuperação da enzima; (b) o grau de purificação obtido na etapa de precipitação com sulfato de amônio. 6)

a) Recuperação da enzima? Quanto havia no início? Em 20 µl da solução original havia atividade de 1,6 nmol/minuto. O volume era de 50 ml (50000 µl), portanto

atividade total original = (50000/20) × 1,6 nmol/minuto = 4000 nmol/minuto

Quanto sobrou depois do tratamento com sulfato de amônio? Em 20 µl há atividade de 5,9 nmol/minuto. O volume final obtido era de 12 ml (12000 µl), portanto

atividade total depois da purificação = (12000/20) × 5,9 nmol/minuto = 3540 nmol/minuto

A recuperação, portanto, foi de

Recuperação(%) = (3540/4000) × 100 = 88,5%

b) Purificação da enzima? É preciso comparar as atividades específicas.

50 ml, contendo 24 mg

proteína/ml 20 µl catalisam 1,6 nmol/minuto

Sulfato de amônio

Precipitado com 30-50% de sulfato de amônio: redissolvido em 10 ml e dialisado; volume

final: 12 ml e 30 mg proteína/ml

20 µl tem uma atividade de 5,9 nmol/minuto

atividade específica original = atividade/mg proteína = 4000/(50 × 24) = 4000/1200= 3,33 nmol min−1 mg−1 atividade específica depois da purificação = 3540/(12 ml × 30 mg) = 3540/360 = 9,83 nmol min−1 mg-1

Grau de purificação = 9,83/3,33 = 2,95 vezes

7. O etanol no corpo humano é oxidado a acetaldeído pela álcool desidrogenase do fígado. Outros álcoois também são oxidados pela enzima. Por exemplo, o metanol, que é mode-radamente tóxico, é oxidado a formaldeído, que é muito mais tóxico. Os efeitos tóxicos do metanol podem ser diminuídos pela administração de etanol. O etanol age competindo com o metanol e deslocando-o do sítio ativo na álcool desidrogenase. Se um indivíduo ingeriu 100 ml de metanol (cachaça baiana; dose que pode ser letal), que quantidade de uísque escocês de fabricação paraguaia (50% em etanol) ele deve beber para reduzir a atividade da álcool desidrogenase com o metanol a 5% de sua atividade original? Um adulto humano contém, em média, 40 litros de fluídos aquosos nos quais os álcoois se distribuem rapidamente e de modo uniforme. As densidades do etanol e metanol são ambas iguais a 0,79 g/cm3. Os KM's da álcool desidrogenase para o etanol e do metanol são, respectivamente, 1 ×× 10-3 M e 1 ×× 10-2 M. Considere o KI do etanol como sendo igual ao KM. A pergunta é, que quantidade de uísque (50% em etanol) que o sujeito deve ingerir para reduzir a atividade da álcool desidrogenase com o metanol a apenas 5% da atividade original. Espera-se que o etanol atue como inibidor competitivo do metanol:

Original (sem beber uísque): m

max

K]Met[]Met[V

v+

=

Depois de beber uísque: m

I

maxi

KK

]Et[1]Met[

]Met[Vv

++

=

Nós queremos que vi = 0,05v (isto é, vi deve reduzir-se a 5% de v). Nós temos KM e KI. Se soubermos [Met], poderemos calcular [Et] necessário para que vi = 0,05v. Vmax, v e vi podem ser eliminados dividindo uma das equações pela outra. Por exemplo, dividindo vi por v:

M

M

KK

]Et[1]Met[

K]Met[

K]Met[]Met[V

KK

]Et[1]Met[

]Met[V

05,0vv

I

M

M

max

I

max

i

++

+=

+

++

==

Podemos isolar [Et]:

MK

K]Et[

1]Met[05,0

)K]Met([

I

M

++=

+

ou ainda I

MM

M

K]Et[K

K]Met[05,0

K]Met[++=

+

e mais ainda MM

I

M K]Met[05,0

K]Met[K

]Et[K−−

+=

e finalmente

−−

+= M

M

M

I K]Met[05,0

K]Met[KK

]Et[

[Et] é a concentração de etanol que precisamos atingir para que a velocidade de transformação de metanol diminua em 95% (para 5%). Mas, para poder calcular usando a fórmula acima, precisamos saber a concentração de metanol. O sujeito ingeriu 100 ml. A densidade do metanol é de 0,79 g/ml, logo, o sujeito ingeriu 79 g. O peso molecular do metanol (CH3OH) é igual a 32. Logo, 79 g correspondem a

79/32 = 2,468 mol de metanol

A concentração de metanol [Met] nos 40 litros de água do sujeito é igual a:

[Met] = 2,468/40 = 0,0617 M.

Agora podemos aplicar a fórmula:

−−

+= M

M

M

I K]Met[05,0

K]Met[KK

]Et[

−−+×=

−

01,00617,005,0

01,00617,001,0101]Et[

3

( ) M135,001,00617,043,11,0]Et[ =−−=

Vamos tirar a prova? vi/v tem que dar 0,05, não é mesmo?

0504,001,0

001,0135,0

10617,0

01,00617,0

KK

]Et[1]Met[

K]Met[vv

M

I

Mi =

++

+=

++

+=

Mas, e a dose de uísque? Para atingir uma concentração de 0,135 M em 40 litros, precisamos de 40 × 0,135 = 5,4 mol.

O peso molecular do etanol (CH3CH2OH) é igual a 46. Portanto, serão necessárias 5,4 × 46 =

248,4 gramas.

Com uma densidade de 0,79 g/ml, isto corresponde a 248,4/0,79 = 314,4 ml; como o uísque é 50%, precisamos (oh! felicidade) de 314,4 × 2 = 628,8 ml

8. Uma enzima que segue o modelo simétrico para os efeitos do pH sobre a sua atividade tem pKES1 = 4 e pKES2 = 8. Qual é o pH no qual a V'max é ótima para esta enzima? Que fração da Vmax o V'max atinge neste pH?

A velocidade máxima função do pH (Vmax’) é igual a:

]H[K

K]H[

1

V'V

2E

1E

maxmax

+

+

++=

SIC DEMONSTRANDUM ERAT! Ad nauseam!

onde Vmax é uma hipotética velocidade máxima independente do pH. A dependência entre log Vmax’e o pH é simétrica. Portanto, o pH ótimo deve situar-se no ponto médio entre pKE1 e pKE2; portanto,

pHótimo = (pKE1 + pKE2)/2 = (4 + 8)/2 = 6

Neste pH, o valor da Vmax’ será:

maxmaxmax

6

8

4

6max

max V98,002,1

V01,001,01

V

1010

1010

1

V'V ==

++=

++=

−

−

−

−

9. A técnica de marcação por afinidade é utilizada para identificar resíduos de aminoácidos no sítio ativo ou próximos a ele. Este procedimento baseia-se no tratamento da enzima com um análogo do substrato na forma substrato-X, no qual X é um grupo reativo que pode ligar-se covalentemente à cadeia lateral de um ou poucos aminoácidos específicos. Como o análogo ao substrato liga somente ao sítio ativo, X irá reagir apenas com aminoácidos próximos, que podem ser identificados por hidrólise seletiva. Explique os seguintes resultados encontrados em três experimentos de marcação por afinidade realizados com três amostras diferentes:

(a) Não houve marcação (b) Foram obtidas duas sequências marcadas:

Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro Arg-Lys-Val-*Ser-Glu-Asp-Gly

(c) Duas sequências marcadas foram obtidas:

Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro Val-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro

a) Se não houve marcação, é provável que não haja tal aminoácido no sítio ativo desta enzima b) As sequências são completamente diferentes, mas Ser apareceu marcada. A hipótese mais provável é que haja duas serinas no sítio ativo, mas pertencentes a segmentos diferentes da cadeia polipeptídica, postas em proximidade por causa do enovelamento da proteina (estutura terciária). c) As duas sequências marcadas diferem em apenas um aminoácido. Pode ser que haja isoenzimas na amostra, que dizer, formas diferentes da mesma enzima. Pode ser também que a enzima tenha vários sítios ativos em diversas subunidades, cuja sequência de aminoácidos seja um pouco diferente.

10. Qual é o fator de aceleração de uma reação a 25oC, se a enzima reduz a energia livre de ativação (∆∆G‡) em (a) 1 kJ ×× mol-1 e (b) 10 kJ ×× mol-1? A energia livre de ativação é dada pela equação de Arrhenius:

Reação não catalisada: RT/G

NC

*NCAeV ∆−=

Reação catalisada: RT/G

C

*CAeV ∆−=

Para calcular fatores de aceleração, deve-se dividir VC/VNC:

RT/)GG(

RT/G

RT/G

NCC

*C

*NC

*NC

*C

ee

eV/V ∆−∆

∆−

∆−

==

A diferença, *C

*NC GG ∆−∆ é precisamente a redução na energia livre de ativação causada

pelo catalisador. R = 8,134 J mol−1 grau−1 e T = 298 K.

49,1eeV/V 404,0)298314,8/()1000(NCC === ×

7,56eeV/V 04,4)298314,8/()10000(NCC === ×

11. Para uma reação de Michaelis-Menten, k1 = 5 ×× 107 M-1 s-1, k-1 = 2 ×× 104 s−−1, e k2 = 4 ×× 102 s-1. Calcule a constante de dissociação do complexo enzima-substrato (Ks) e a constante de Michaelis (Km). A ligação do substrato atinge o equilíbrio ou apenas o estado estacionário? A constante de dissociação do complexo enzima-substrato:

M104105102

kk

]ES[]S][E[

K 47

4

1

2S

−×=××===

A constante de Michaelis-Menten:

M1008,4105

104102k

kkK 4

7

24

1

32M

−×=×

×+×=+=

KS e KM são muito próximas; o sistema está praticamente em equilíbrio. 12. Para a enzima aspartato transcarbamoilase o succinato age como um inibidor competitivo de um dos substratos, aspartato. A dependência da velocidade de reação (v) da concentração de aspartato, sob condições saturantes do outro substrato, é mostrada no gráfico (a). No experimento do gráfico (b) a concentração de aspartato foi mantida constante no valor indicado pela flecha no gráfico (a), enquanto que a concentração de succinato foi aumentada. O succinato não pode participar como substrato na reação. Explique os resultados.

O gráfico (a), em que [aspartato] foi variada, mostra uma enzima como efeitos homotrópicos positivos. Esta enzima, conforme vimos, tem vários sítios ativos/alostéricos No gráfico (b) escolheu-se uma concentração pequena de aspartato e variou-se succinato desde zero até determinado valor. O succinato deve ligar aos mesmos sítios do aspartato, sem que haja reação, no entanto. Ao fazer isto deve deslocar o equilíbrio da enzima do estado T para o estado R, colocando mais sítios ativos à disposição do aspartato, o que justifica o aumento inicial da atividade. Devemos lembrar que a enzima mantém sua simetria: se um sítio passa ao estado R, todos os outros passam também.. Mas, à medida que a concentração de succinato aumenta mais, os sítios extra colocados à disposição pela conversão T → R

passam a ligar o próprio succinato que ganha a competição com o aspartato. Por isto, acaba havendo inibição uma vez atingido o ponto de máxima atividade. 13. O KM de certa enzima de comportamento michaeliano é igual a 1 ×× 10−− 5

M. Numa concentração de substrato igual a 0.1 M, a velocidade inicial experimental foi igual a 37 µµmol/min para uma certa concentração da enzima. No entanto, diminuindo a concentração do substrato para 0.01 M, observou-se que a velocidade de reação permaneceu sendo igual a 37 µµmol/min. Por que uma redução de dez vezes na concentração do substrato não produziu nenhuma variação perceptível na velocidade da reação? Evidentemente a enzima está saturada com [S] = 0,1 M e continua saturada com [S] = 0,01 M. O seu KM dve ser muito menor do que 0,01 M. 14. Velocidades iniciais da reação da glutamato desidrogenase

Glutamato + H2O + NAD+

αα -cetoglutarato + NH3 + NADH + H+

foram medidas espectrofotometricamente a 340 nm (o NADH absorve a 340 nm e o NAD+ não). Foram feitas medidas variando a concentração de glutamato na presença e ausência de salicilato de sódio 40 mM, conforme a tabela abaixo:

v, na ausência de salicilato (∆∆A/min)

vi, na presença de salicilato 40 mM

(∆∆A/min)

[Glutamato] (mM)

0.21 0.08 1.5 0.25 0.10 2.0 0.28 0.12 3.0 0.33 0.13 4.0 0.44 0.16 8.0 0.40 0.18 16.0

Determine o tipo de inibição, o valor do KM e o valor da constante de inibição (KI).

A representação de v e vi contra [S] fornece:

v

0 3 6 10 13 16

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Os valores foram obtidos fazendos ajustes de mínimos quadrados, mas poderiam ter sido obtidos por manipulação gráfica. Trata-se de inibição não-competitiva. Lembrem-se que:

IK]I[1+=α

e 'IK]I[1' +=α

Portanto, conhecendo α, α’, KM, Vmax e [I], vocês podem determinar KI e KI’.

[S] mM

v

]S[879,1]S[482,0

]S[K]S[V

vM

max

++==

++== ; Vmax = 0,482 ∆A/min

KM = 1,879 mM

]S[20,2]S[204,0

]S[K)'/(

]S['

V

vM

max

i ++==

++αααα

αα== ; Vmax/α' = 0,204; (α/α’)KM = 2,20