Profª Bianca Seminotti

2012/2

Comentário inicial Condições fundamentais para a vida:

Auto-replicação Capacidade de catálise eficiente e seletiva das reações químicas

Ex.: sacarose → CO2 + H2O Processo altamente exergônico (termodinamicamente

favorável), porém muito lento (cineticamente desfavorável)à CATÁLISE

Conceito de enzimas

Catalisador biológico cuja natureza é na maioria proteica

Existem raras enzimas com natureza ribonucleica, são moléculas de RNA com atividade enzimática, as RIBOZIMAS

Características gerais das enzimas

Eficiência catalítica > catalisadores sintéticos ou inorgânicos A enzima não é consumida na reação Aceleram reações químicas Atuam em pequenas concentrações Apresentam alto grau de especificidade por seus substratos (substâncias que são transformadas) Não alteram o equilíbrio das reações Atuam em soluções aquosas, em condições brandas de T e pH Por atuarem geralmente em condições amenas, as enzimas minimizam reações colaterais indesejadas, como: decomposição, isomerização e rearranjos, responsáveis pela formação de produtos indesejados

Importância das enzimas ü Agem em sequências organizadas, as vias metabólicas

 q Degradação de nutrientes → conservação de energia química q Síntese de macromoléculas à partir de precursores mais simples

ü Enzimas reguladoras: controlam as vias metabólicas ü Deficiências enzimáticas: erros inatos do metabolismo ü Alterações de atividade enzimática presentes em doenças ü Alvo da ação de muitas drogas (medicamentos) ü Indústria química-farmacêutica; antibióticos ü Diagnóstico laboratorial, ELISA, PCR

ü Indústria de alimentos: fermentos, produtos lácteos ü Agricultura: pesticidas, agrotóxicos

Características Estruturais das Enzimas

vProteínas c/ massa molecular variável: 12.000 a mais de 1 milhão

vA atividade catalítica depende da integridade da conformação protéica: vA atividade é, geralmente, destruída ou diminuída quando

a enzima é desnaturada, dissociada em subunidades (perda das estruturas secundárias, terciária ou quaternária)

vA atividade é totalmente destruída quando a enzima é clivada em seus AA constituintes (perda da estrutura primária)

Primária: Sequência    de AA  

Secundária: Arranjos estáveis    da sequência de AA  

 Terciária: Enovelamento  tridimensional do pep;deo  

Quaternária:      Mais de 1    subunidade  

Estruturas primária, secundária, terciária e quaternária são  essenciais para a atividade catalítica

Características Estruturais das Enzimas Algumas enzimas requerem componentes não

proteicos para a atividade: Cofator: um ou mais íons inorgânicos Coenzima: molécula orgânica complexa, geralmente derivada de vitaminas

Grupo prostético Cofator ou coenzimas ligados firmemente à

molécula enzimática

Holoenzima: enzima completa e ativa (proteína + coenzima e/ou íons metálicos ligados)  

Apoenzima ou apoproteína: parte protéica

Atuam como transportadores transitórios de grupos funcionais  

Proteínas

Ribozimas

RNAs

 Simples            Apoenzima

     Conjugadas          Cofator/Coenzima

 + apoenzima        

   Holoenzima

 Estrutura Enzimática

NOMENCLATURA DAS ENZIMAS

1o dígito -­‐ classe  2o dígito -­‐ subclasse  3odígito -­‐ sub-­‐subclasse  4odígito -­‐ indica o substrato  

Sistema oficial da União Internacional de Bioquímica As enzimas são classificadas e denominadas de acordo com a natureza da reação química que catalisam. Existem 6 classes, várias sub-classes e sub-subclasses

Cada enzima - no de código (E.C.- Enzyme Comission) com 4 dígitos que caracterizam o tipo de reação

Nomenclatura e Classificação das  enzimas  

Nomenclatura e Classificação das enzimas

Evita ambiguidades  IdenIficação da enzima através da reação que ela catalisa  

ATP + Glicose → ADP + Glicose-­‐6-­‐P  Nome alternaIvo, trivial ou recomendado: Hexoquinase  Nome sistemáIco: ATP-­‐glicose fosfotransferase  

E.C. 2.7.1.1  2. classe: transferases  7. subclasse: fosfotransferase  1. fosfotransferase com grupo hidroxil como aceptor  1. glicose como aceptor  

ou a clivagem de ligações C-­‐O, C-­‐N, C-­‐C, eliminação  

3. Hidrolases  

 5. Isomerases      Epimerases  

Determinadas mutases        Racemases  

                                 6. Ligases          Carboxilases              Sintetases  

         Esterases              Lipases  

Nucleosidases e NucleoIdases    PepIdases      Fosfatases        Sulfatases  

                         4. Liases                  Aldolases          Descarboxilases                Hidratases                    Sintases  

Transaminases  

1. Oxidorredutases      Desidrogenases        Desaturases        Hidroxilases              Oxidases          Oxigenases            Redutases  

           2. Transferases                    Quinases    Determinadas mutases                  Fosforilases                Polimerases  

Transaldolases e transcetolases  

•Sintetase (ligase) à obtém energia para uma nova ligação a  parIr da quebra de uma ligação de alta energia  • Sintase (liase) à obtém energia de outras fontes  

Como funcionam as enzimas As   enzimas   fornecem o   ambiente   específico   onde   dada   reação   é  energeIcamente mais favorável  A reação ocorre no interior de uma cavidade na enzima chamada de sí-o a-vo  

qSítio ou centro ativo é formado por resíduos de AA que contornam este local da enzima; geralmente são resíduos de AA que estão distantes na sequência da estrutura 1ª (justificando o tamanho das proteínas)

qOs grupos substituintes dos resíduos dos AA se ligam ao substrato e catalisam a sua transformação

qPoucos AA são responsáveis pela catálise qO sítio ativo promove a aproximação e correta orientação para

catálise qFormação do complexo ES: ponto de partida para os

tratamentos matemáticos que definem o comportamento cinético e das descrições teóricas dos mecanismo enzimáticos

Como funcionam as enzimas

As enzimas afetam a velocidade mas não o equilíbrio químico das reações

ΔG‡ ⇒ energia de ativação ΔG° ⇒ variação de energia livre padrão: 298K, 1 atm, 1M ΔG’° ⇒ variação de energia livre padrão nos sistemas biológicos em pH 7

Enzimas  

Alguns princípios explicam o poder catalítico e a especificidade das enzimas

Rearranjos das ligações covalentes (substrato ↔ cadeia lateral dos AA, cofatores e coenzimas) Interações não covalentes (enzima ↔ substrato): pontes de H, interações hidrofóbicas e iônicas, que são otimizadas no estado de transição...ENERGIA DE LIGAÇÃO

ENERGIA DE LIGAÇÃO üÉ a principal fonte de energia livre usada pelas enzimas

para diminuir as energias de ativação das reações üContribui para a especificidade (habilidade de

discriminar entre o seu substrato e uma molécula competidora) e para a catálise

As interações fracas entre a enzima e o substrato são      otimizadas no estado de transição

   

 Como uma enzima usa a energia de ligação para    diminuir a energia de ativação de uma reação?

   Modelo Chave – Fechadura?    SíIo aIvo complementar ao substrato  

               Modelo Chave – Fechadura?  

SíIo aIvo complementar ao estado de transição          (Linus Pauling)  

Não                      

ü OK  

As interações fracas entre a enzima e o substrato são otimizadas no estado de transição

Sem enzima  

Enzima complementar ao substrato  

Enzima complementar ao estado de transição  

Grupos catalíticos específicos contribuem para a catálise

q Energia de ligação...interações fracas enzima ↔ substrato

qInterações covalentes enzima ↔ substrato § Catálise ácido-base geral § Catálise covalente § Catálise por íons metálicos

Catálise ácido-base geral

qFormação de intermediários carregados instáveis que tendem a se degradar nos reagentes

qEstabilização através da transferência de prótons para ou de um substrato, facilitando a conversão em produto

qParticipação de ácidos orgânicos fracos (doadores de H+)e bases orgânicas fracas (aceptoras de H+)...cadeias laterais de AA

Catálise ácido-base específica: reações não enzimáticas, onde a transferência de prótons ocorre entre moléculas de água ou outros doadores ou aceptores de prótons fracos (H3O+ e OH-)

Catálise ácido-base geral

Resíduos de AA presentes no síIo aIvo que parIcipam da catálise ácido-­‐base geral  

}              }                    }              }        }

Princípios de Bioquímica. Lehninger. Michael M. Cox, David L. Nelson. 4ª e 5ª Eds. Editora Sarvier. Capitulo 6 Bioquímica Médica Básica de Marks - Uma Abordagem Clínica. Colleen Smith, Michael Lieberman, Allan D. Marks. 2ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 115 Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Thomas M. Devlin. 6ª Ed. Editora Blücher. Nutritional Biochemistry. Tom Brody. 2ª Ed. Editora Academic Press. Alimentos: a química de seus componentes. T.P. Coultate. 3ª Ed. Artmed.

http://bcs.whfreeman.com/lehninger5e/content/cat_030/index.html

CinéLca  EnzimáLca  

       CinéLca  enzimáLca        

   Determinar  a  velocidade  da  reação  e      

     como  ela  é  alterada  por  diferentes    condições  experimentais  permite  estudar  o      

 mecanismo  de  uma  reação  enzimáLca.  

E + S ES EP E + P

A  concentração  do  substrato  afeta  a  velocidade    das  reações  catalisadas  por  enzimas  

[S]  =  concentração  de    substrato  V0 =  velocidade  inicial    (quando  a [S] é  muito    maior  que  a  [E]  Vmáx =  velocidade  quando    o  aumento  de  V0 é  muito    pequeno  à  medida  que  a    [S] aumenta  Km    =  constante  de    Michaelis-­‐Menten -­‐ [S]  onde  V0   aInge  metade    da  Vmáx  

Variação  do  Km entre  enzimas  e  diferentes    substratos  para  a  mesma  enzima  

Inibição  EnzimáLca  

   Inibição  enzimáLca    Inibidores  à agentes  moleculares  que  interferem  a  catálise    

 (diminuir  ou  interromper  as  reações  enzimáIcas)    Ex:  Inibires  da  ciclooxigenase (ácido  aceIlsalicílico,  ibuprofeno,    

 nimesulida)    

 Inibidores  de  protease  (tripsina)  provenientes  da  soja  crua      (leguminosas)  

 

     INIBIDORES

REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS      SUICIDAS

COMPETITIVOS ACOMPETITIVOS MISTOS

 ↑ Km  

 Não  altera  Vmáx  

Inibição  reversível  compeLLva  

O  inibidor  (I)  compete  com  o  substrato  pelo  síIo  aIvo  (forma  o    complexo  EI)  e  não  ocorre  catálise    Compostos  com  estrutura  semelhante  ao  substrato  (idenIficação    da  porção  molecular  que  se  liga  à  enzima)  Muitos  produtos  da  reação  enzimáIca  inibem  a  enzima  dessa    forma  

Como  a  ligação  do    Inibidor    é  reversível,      

adicionar  mais  Substrato      reduz  o  efeito  inibitório  

 Álcool  desidrogenase    intoxicação  por  metanol  

Álcool desidrogenase

Metanol  à Formaldeído  

Ø Formaldeído é tóxico para os tecidos  Ø Cegueira  

Ø Tratamento: infusão intravenosa lenta de etanol,  que compete com o metanol pela enzima álcool  desidrogenase, impedindo a formação de  formaldeído, enquanto o metanol é eliminado pelo  sistema renal  

Inibição  reversível  acompeLLva  

O Inibidor (I) liga-se a um sítio na enzima distinto do sítio ativo (ligação ao complexo ES) Observado para enzimas com 2 ou mais substratos

↓ Km aparente      ↓ Vmáx  

Inibição  reversível  

AcompeLLva   CompeLLva  

Inibição  reversível  mista  

O inibidor liga-se a um sítio distinto do sítio ativo (ligação à enzima livre ou ao complexo ES ) Observado para enzimas com 2 ou mais substratos

Inibição  Irreversível  

 Se  combina  com  um  grupo  funcional  na    molécula  da  enzima,  destrói  ou  forma  um    

ligação  bastante  estável  (covalente)    _ inaIvação  permanente  da  enzima  

Inibidores  suicidas  São  pouco  reaIvos  até  se  ligarem  ao  síIo  aIvo;    

Ao  invés  de  formar  o  produto,  ele  gera  um    composto  muito  reaIvo  que  combina    

irreversivelmente  com  a  enzima  

Inibição  Irreversível  ORGANOFOSFORADOS    (Contaminantes  de  alimentos)  

à Inibidores  irreversíveis  da  aceIlcolinesterase  

DIFP

Fatores  que  alteram  a  aLvidade    enzimáLca  (velocidade)  

A  aLvidade  enzimáLca  (velocidade)      é  afetada  pelo  pH  

 Pepsina  Hidrólise  de  ligações  pep;dicas    no  estômago  pH  óImo  de  1,6  

 Glicose-­‐6-­‐fosfatase    Hepatócitos,  liberação  de  glicose      pH  óImo  de  7,8    

Manutenção  de  condições  como:    (1)  temperatura,  (2)  concentração  de  substrato,  (3)  concentração  de  enzima  

A  aLvidade  enzimáLca  (velocidade)  é  afetada    pela  temperatura  

↑  T  à aumento  na  velocidade  das  reações  

“↑  energia  vibracional  dos  substratos”  

↑↑↑ T  à desnaturação  protéica    

(perda  de  estruturas  secundária  e  terciária)  

T  óIma  (humanos  ≈  40-­‐45°C)  

A  aLvidade  enzimáLca  (velocidade)  é  afetada      pela  temperatura  

Temperatura  óIma   ENZIMA   TEMPERATURA  ÓTIMA      (°C)  

AIvação      térmica  

Desnaturação      térmica   Pepsina      

Tripsina        Urease  

31,6      25,5      20,8  

ManLdas  constantes  as  condições  de:  -­‐ pH  ó óLmo  -­‐ concentração  de  substrato  -­‐ concentração  de  enzima  É  escolhida  uma  temperatura    

 pouco  abaixo  da  óIma.  

A  aLvidade  enzimáLca  (velocidade)  é  afetada    pela  quanLdade  de  enzima  

É  escolhida  uma      quanLdade  de  enzima    da  ascendente  da  curva  

ManIdas  fixas  as  condições  de:  -­‐ temperatura  óIma  -­‐ pH  óImo  -­‐ [substrato]  em  excesso  

Bibliografia  }              }                    }              }

Principios de Bioquímica. Lehninger. Michael M. Cox, David L. Nelson. 4ª e 5ª Eds. Editora Sarvier. Capítulo 6 Bioquímica Médica Básica de Marks - Uma Abordagem Clínica. Colleen Smith, Michael Lieberman, Allan D. Marks. 2ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 9 Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Thomas M. Devlin. 6ª Ed. Editora Blücher. Nutritional Biochemistry. Tom Brody. 2ª Ed. Editora Academic Press.

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Enzimas  reguladoras  

Comentário inicial

ë Vias metabólicas (anabólicas e catabólicas) tem uma série de etapas catalisadas por diferentes enzimas

Substrato à à à à à Produto

ë Enzimas reguladoras: modulam a velocidade da rota em  resposta a diversos sinais

 ë Primeira enzima da via  ë Economia de energia

Como são moduladas as Enzimas Reguladoras?

Regulação alostérica

Enzimas alostéricas Conceito

q Possuem sítios reguladores diferentes do sítio catalítico    q A ligação de efetores (+ ou -) alteram a conformação

 da enzima (ativa e inativa) e consequentemente sua  atividade enzimática

q Os efetores podem ser inibitórios ou estimulatórios, alterando a afinidade da enzima pelo substrato

q Ocorre um efeito à distância do modulador, via sítio regulador, sobre o sítio ativo

Enzimas alostéricas Classificação

Enzima homotrópica: substrato = modulador

�Efetores homotrópicos

ë Frequentemente ação positiva

ë Idéia de cooperatividade (≈ hemoglobina)  ë Sítio catalítico = sítio regulatório

Enzima heterotrópica: modulador ≠ substrato

�Efetores heterotrópicos

ë Incluem a inibição por retroalimentação (produto inibe enzima chave da via metabólica)

Sítios ativos e alostéricos

Enzimas alostéricas Inibição por retroalimentação

ëA enzima alostérica é frequentemente inibida pelo produto final da via

ëQuando a concentração do produto excede o requerimento celular

ëReduzindo a atividade da enzima alostérica, toda a via tem sua atividade reduzida, desde que seus substratos estão em concentração reduzida

Regulação por modificação covalente

Enzimas reguladas por modificação covalente

ëGrupos moduladores que se ligam  covalentemente à enzima: fosforila, adenila, uridila,  metila e grupos adenosina difosfato ribosila

 

ëEsses grupos são adicionados e removidos da enzima alvo por enzimas separadas

Enzimas reguladas por interação proteína- proteína

ëProteína causa uma alteração conformacional no sítio ativo ou bloqueia o sítio ativo (impedimento estérico)

ëPodem ativar ou inibir a enzima a qual estão ligadas

Ex.: proteína quinase A, proteína quinase Ca+- Calmodulina-dependente

Enzimas reguladas por remoção de  fragmento peptídico (Zimogênios)

Enzimas reguladas por remoção de segmentos peptídicos (clivagem proteolítica)

ëPrecursor inativo (zimogênio ou proproteína ou  proenzima) é clivado para formar a enzima ativa

Ex: quimotripsinogênio, tripsinogênio, pró-colágeno, proteínas da coagulação sanguínea (fibrinogênio)

ëClivagem específica, expondo o sítio ativo da enzima ëMecanismo de ativação irreversível

ëInativação ocorre por ligação de proteínas inativadoras, que se ligam ao sítio ativo das enzimas

Ex.: Inibidor pancreático da tripsina

Enzimas reguladas pela expressão gênica

Enzimas reguladas pela expressão gênica

 Algumas enzimas não são sintetizadas continuamente

 pelas células Ex: indução de enzimas da via

glicolítica por insulina

 Enzimas reguladoras moduladas por sequestro para compartimento

diferente do local sua atuação

 Regulação da hexoquinase IV (glicoquinase) por sequestro no núcleo celular: o inibidor é uma proteína nuclear que mantém a hexoquinase IV no núcleo liberando-a para o citosol quando a [glicose] no hepatócito estiver alta

Regulação múltipla

ëMuitas enzimas são reguladas de diferentes formas, alostericamente, covalentemente, ...

Por quê?

ëControle da atividade de enzimas importantes, chaves nas vias metabólicas

ëEvitando o desperdício de energia ëPromovendo a síntese dos produtos necessários em  cada “momento celular”

ëManutenção da VIDA

}              }                    }              }        }

Princípios de Bioquímica de Lehninger. Michael M. Cox, David L. Nelson. 5ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 6 Bioquímica Médica Básica de Marks - Uma Abordagem Clínica. Colleen Smith, Michael Lieberman, Allan D. Marks. 2ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 9 Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Thomas M. Devlin. 6ª Ed. Editora Blücher. Nutritional Biochemistry. Tom Brody. 2ª Ed. Editora Academic Press. Capítulo Alimentos: a química de seus componentes. T.P. Coultate. 3ª Ed. Artmed.

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