Aula de enzimologia

Tema Efeito da temperatura e pH na

atividade e estabilidade das enzimas

Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena

Universidade de São Paulo – USPadriane@debiq.eel.usp.br

Conteúdo:

1. Determinação da temperatura ótima2. Energia de ativação3. Estabilidade térmica4. Parâmetros termodinâmicos 4.1 Enzimas termoestáveis 4.2 Enzimas adaptadas ao frio5. Influência do pH

Termoestabilidade x termofilicidate

3INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA AÇÃO ENZIMÁTICA

temperatura dois efeitos ocorrem:

(a) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas;

(b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.

temperatura ótima - é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo.

Atividade Enzimática

É dada pela medição da velocidade inicial da reação sob uma faixa de condições determinadas

O aumento na temperatura aumenta o numero de colisões

Energia de ativação (Ea) – energia mínima para que uma reação ocorra

BAkv

A + B C + D

RT

Eact

Aek

INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA

Ea Lei de Arrhenius

ATR

Eak

Aek RTEa

log1

3,2log

/

Ea pode ser determinada medindo-se a constante de velocidade da reação em ≠ temperaturas.

Curva A: gráfico usual.

Curva B: o gráfico mostra uma variação definida na inclinação, se em determinada temperatura, uma etapa ≠ se torna limitante da velocidade.

Curva C: uma queda brusca na curva indica inativação enzimática.

A + B C + D

BAkv BA

DCKeq

velocidade equilíbrio

v relaciona-se com Eact

RT

Eact

eh

TKk

Keq relaciona-se com ∆G

eqKRTG ln

K – cte Boltzman (1,38×10−23 J. K−1)h – cte Planck (6,626×10−34 J/s)

Determinação dos parâmetros termodinâmicos

Determinação dos parâmetros termodinâmicos

ln Keq = – ∆H 1 + ∆ S R T R

∆G = ∆ H - T ∆ S

-RT ln K eq = ∆ H - T ∆ S

eqKRTG ln

ln Kcat.h = – ∆H 1 + ∆ S Kb. T R T R

Kcat = Keq.AKeq = kcat/( Kb.T) h

Kb – cte Boltzman (1,38×10−23 J. K−1)h – cte Planck (6,626×10−34 J/s)

– ∆H R

∆ S R

∆S ∆H

A temperatura ótima foi a 55oC

Ea= 96,7 kJ/mol

Ea = 3,32 kJ/mol

Determinação da Energia de Ativação de uma endoglucanase

Dados obtidos em temperaturas entre 25 e 70 oC

Plot trifásico(CMC tem 2 conformações até a temp ótima)

Parâmetros determinados a 55 oC A. niger A oryzae cmc 1

H (kJ /mol) 50 0,59

G (kJ /mol) 69 64,57

S (J /mol.K) - 61 - 195

Menor entalpia do transgênico indica que ele é altamente ativo e eficiente

Estabilidade enzimática

Capacidade das enzimas de reter sua capacidade catalítica sob diferentes condições de reação ao longo do tempo – função biológica das enzimas e está intimamente associada à sua estrutura tridimensional

Desnaturado nativo

Ta (oC) t1/2 (min)47 138,653 9,7756 2,3

Termoinativação

Determinação da energia de desativação

Ead = 378 kJ/mol

Texto para leitura:

M. R. Javed, M. H. Rashid, H. Nadeem, M. Riaz & R. Perveen - Catalytic and thermodynamic characterization of endoglucanase (CMCase) from Aspergillus oryzae cmc-1 Appl Biochem Biotechnol (2009) 157:483–497

Enzimas adaptadas ao frio

Em temperaturas baixas a energia cinética do sistema é insuficiente para superar a barreira de reação

Como as enzimas evitam um decréscimo na sua atividade como consequência de uma queda na

temperatura de 37 para 0o C?

Kcat resultado do decréscimo no ∆ H (menor numero de interações que necessitam ser quebradas durante a formação do estado de transição).

ln Kcat.h = – ∆H 1 + ∆ S Kb. T R T R

% a

tivi

da

de

enzi

má

tic

a m

áxim

a

• Ionização de grupos em E e/ ou S.

•A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH ótimo.

•Efeito de tampões e força iônica.

INFLUÊNCIA DO pH

V

pH

EH22+ EH+ + H+ E + 2H+

pKa = 6,0 pKa = 9,0

inativa ativa inativa

INFLUÊNCIA DO pH

Em pH desaparecimento das cargas negativas (grupos COOH de Asp e Glu)

Em pH desaparecimento das cargas positivas (acúmulo de cargas negativas em grupos COOH e nas tirosinas e cisteínas)

Efeito do pH na V

Determinação gráfica dos valores de pKs

pH nmoles/min (Vmax)

Ks pH nmoles/min (Vmax)

Ks

2 0,01 1 6,5 9,66 10

2,3 0,02 1,02 7 9,8 10,8

2,5 0,032 1,03 7,3 9,76 11,7

2,8 0,063 1,06 7,5 9,66 12,7

3 0,099 1,09 7,8 9,39 15,3

3,3 0,196 1,18 8 9,08 18,2

3,5 0,307 1,28 8,3 8,33 25

3,8 0,594 1,53 8,5 7,6 31,6

4 0,909 1,82 8,8 6,13 44,8

4,3 1,66 2,5 9 5 55

4,5 2,4 3,16 9,3 3,34 70

5 5 5,5 9,5 2,4 78,4

5,5 7,6 7,86 9,8 1,37 87,7

6 9,08 9,26 10 0,909 91,8

Log Vmax x pH = Vmax e pKes1 e pK es2Log pKs x pH = kmLog vmax/ks = pke1 e pke2

pH (Vmax/ks) Log (Vmax/Ks)

pH (Vmax/ks) Log (Vmax/Ks)

2 0,01 -2 6,5 0,97 -0,01

2,3 0,019 -1,72 7 0,91 -0,04

2,5 0,031 -1,51 7,3 0,83 -0,008

2,8 0,059 -1,23 7,5 0,76 -0,012

3 0,091 -1,04 7,8 0,61 -0,21

3,3 0,166 -0,78 8 0,5 -0,3

3,5 0,24 -0,62 8,3 0,33 -0,48

3,8 0,39 -0,41 8,5 0,24 -0,62

4 0,5 -0,3 8,8 0,14 -0,85

4,3 0,66 -0,18 9 0,09 -1,04

4,5 0,76 -0,12 9,3 0,05 -1,3

5 0,91 -0,04 9,5 0,03 -1,52

5,5 0,97 -0,013 9,8 0,015 -1,82

6 0,98 -0,0087 10 0,009 -2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 2 4 6 8 10 12

pH

Vm

ax/K

m

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5

pH

log

Vm

ax/k

M

pKe1= 4pKe2 = 8

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5

pH

pK

M

kM

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5

pH

log

Vm

pKes1 = 5,1pKes2 = 8,5

pKes1 pKes2

pH ótimo de uma endoglucanase

pH ótimo – 4,1 a 5,3 - , com atividade máxima no pH 4,4

Os valores de pKes1 = 3,5 e pKes2 = 6,4 indicam a presença de Asp e Glu como doadores de prótons e His como aceptor.

Estabilidade ao pH

Considerações finais:

1) A estrutura tridimensional da enzima pode ser afetada por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais. Isto torna a atividade enzimática dependente do pH e da temperatura.

2) Características termodinâmicas das enzimas são importantes para identificar a ocorrência de estados conformacionais distintos.

3) Através da determinação da temperatura ótima e da termoestabilidade da enzima é possivel determinar seus parâmetros termodinamicos.

4) Através de medidas da velocidade da reação em função do pH é possíivel especular sobre os grupos envolvidos na catálise.