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Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e
Materiais
Marcelo Fernandes Cipreste
Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Materiais
Orientador: Dra. Edésia Martins Barros de Sousa
Belo Horizonte
2014
NANOPARTÍCULAS DE HIDROXIAPATITA FUNCIONALIZADAS
COM PVA E COLÁGENO CONTENDO RADIOISÓTOPOS COMO UM
POTENCIAL AGENTE DE TRATAMENTO PARA OSTEOSSARCOMA
Marcelo Fernandes Cipreste
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
das Radiações, Minerais e Materiais, como parte dos requisitos para obtenção do
Grau de Mestre.
Belo Horizonte, 2014
Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e
Materiais
NANOPARTÍCULAS DE HIDROXIAPATITA FUNCIONALIZADAS COM PVA E
COLÁGENO CONTENDO RADIOISÓTOPOS COMO UM POTENCIAL AGENTE
DE TRATAMENTO PARA OSTEOSSARCOMA
Marcelo Fernandes Cipreste
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações,
Minerais e Materiais, como parte dos requisitos à obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Materiais
Orientador: Dra. Edésia Martins Barros de Sousa
Belo Horizonte
2014
AGRADECIMENTOS
À minha esposa, à minha filha (Mirlan e Julia), aos meus pais e irmãs (Pedro Paulo, Nazaré,
Cynthia, Karla e Érika) pelo apoio incondicional e compreensão nos momentos difíceis. Amo
vocês!
À professora Edésia Martins Barros de Sousa pela sua dedicação, pelos seus ensinamentos,
pela sua paciência e, principalmente, por dividir seu conhecimento comigo. Professora, eu
aprendi muito com você e foi um enorme prazer trabalhar contigo.
Aos colegas de laboratório (André, Carol, Grá, Pamela, Raquel, Tiago, Karina, Ana Flávia,
Érika, Patrícia e Thaís) por terem me socorrido tantas vezes e por estarem sempre disponíveis
para me ajudar. Nunca me esquecerei de vocês.
Aos membros da banca, professor Herman Sander Mansur e José Domingos Árdisson, pelas
contribuições que considero fundamentais para esse trabalho.
À professora Raquel Gouvêa dos Santos e seus alunos (Felipe, Pryscila, Lucilene e Flávia)
pelas colaborações com os experimentos biológicos.
A todos os professores da pós-graduação do CDTN por compartilharem seus conhecimentos.
Ao Geraldo Antônio Scoralik Martins pelas enormes contribuições com as usinagens em
peças de aço e acrílico que foram extremamente necessárias ao longo desse curso.
Aos professores Waldemar Augusto de Almeida Macedo e Fernando Soares Lameiras pela
grande contribuição em minha formação.
Aos servidores do prédio 7 que sempre me ajudaram quando precisei.
Ao pessoal da “senzala” pela agradável companhia nesses dois anos.
Ao CDTN por essa magnífica estrutura e por me aceitar como parte desse importante centro
de pesquisas.
À CAPES pela bolsa de estudos.
RESUMO
O osteossarcoma é o tipo mais comum entre os tumores ósseos malignos primários, atingindo
principalmente crianças, adolescentes e adultos jovens. O tratamento padrão empregado em
osteossarcomas, é feito através da aplicação de um agente neoadjuvante quimioterápico
seguido de ressecção cirúrgica. Devido à baixa sensibilidade dos osteossarcomas à radiação
ionizante, este tipo de tratamento não é utilizado com muita frequência, podendo ser
recomendado apenas para o tratamento pós-cirúrgico. Considerando esta dificuldade e as
limitações impostas, existe uma necessidade emergente para encontrar novas alternativas
terapêuticas para esse tipo de tumor. Os sistemas nanoestruturados carreadores de
radioisótopos apresentam um potencial promissor para o tratamento dos osteossarcomas,
permitindo o emprego mais seletivo das radiações em células tumorais e podendo aumentar a
radiossensibilidade desses tumores devido à proximidade que podem manter entre os
radioisótopos e as células tumorais. No presente trabalho, foi preparado um sistema híbrido
constituído por nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita funcionalizadas com colágeno e
álcool polinivílico contendo os radioisótopos ítrio-90 e gadolinio-159 para avaliar a atividade
anti-tumoral desse sistema sobre a linhagem de células T98 de fibroblasto humano. As
amostras de hidroxiapatita foram sintetizadas por cinco rotas distintas e caracterizadas pelas
técnicas de difração de raios X (DRX), espectroscopia na região do infravermelho (FTIR),
adsorção de gases e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados dessas
análises indicaram a formação de nanopartículas de hidroxiapatita carbonatada de fase única e
mesoporosas em quatro das cinco rotas. A amostra sintetizada pela rota 3c, por ter
apresentado a maior área superficial e volume de poros, foi escolhida para ser submetida ao
processo de funcionalização com PVA e colágeno. As amostras funcionalizadas foram
caracterizadas pelas técnicas de DRX, FTIR, adsorção de gases, análise elementar CHN,
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de correlação de fótons, que
indicaram que o processo de funcionalização foi bem sucedido. O potencial de incorporação e
a cinética de liberação de ítrio e gadolínio em relação à amostra funcionalizada foram
estudados com os isótopos estáveis desses elementos pela técnica de espectrometria de
emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES) que revelou um potencial de
incorporação de 44% e 100% para o ítrio e gadolínio, respectivamente, e baixa cinética de
liberação dos isótopos para os dois sistemas, credenciando o material para a ativação
neutrônica e para os estudos citotoxidade in vitro. Os testes biológicos indicaram
qualitativamente que os materiais possuem um potencial para a proposta desse trabalho.
ABSTRACT
Osteosarcoma is the most common type of primary malignant bone tumors, affecting mostly
children, adolescents and young adults. The standard treatment used in osteosarcomas, is done
through the application of a neoadjuvant chemotherapeutic agent followed by surgical
resection. Due to the low sensitivity of osteosarcoma to ionizing radiation, this treatment is
not used very often and can be recommended only for post-surgical treatment. Considering
the difficulties with these treatments, there is an emerging need to find new therapies for this
tumor type. The nanostructured systems acting as radioisotopes carriers have promising
potential in the treatment of osteosarcoma, allowing more selective employment of radiation
on tumor cells and enhancing the radiosensitivity of tumors because they can maintain a
higher proximity between the radioisotope and tumor cells. In the present work, it was
prepared a hybrid system consisting of mesoporous hydroxyapatite nanoparticles
functionalized with collagen and poly (alcohol vinyl), the incorporation of the elements
yttrium and gadolinium was promoted and the anti-tumor activity of these systems on the
lineage of T89, human cells of glioblastoma, was evaluated. Hydroxyapatite samples were
synthesized by five different routes and characterized by the techniques of X-ray diffraction
(XRD), infrared spectroscopy (FTIR), gas adsorption and transmission electron microscopy
(TEM), and the results of these analyzes indicated the formation of carbonated hydroxyapatite
mesoporous nanoparticles in single phase by three routes. The sample synthesized by Route
3c, due to the largest surface area and pore volume, was chosen to be submitted to the
functionalization process with PVA and collagen. The functionalized samples were
characterized by the techniques of XRD, FTIR, gas adsorption , CHN elemental analysis ,
scanning electron microscopy (SEM) and photon correlation spectroscopy, and these analyzes
indicated that the functionalization process was successful. The potential for incorporation
and release kinetics of yttrium and gadolinium to functionalized samples were studied with
stable isotope of this element by the technique of atomic emission spectrometry with
inductively coupled plasma (ICP-AES) revealing a potential merger of 44% and 100% for
yttrium and gadolinium respectively and low isotope release kinetics for both systems,
qualifying the material for neutron activation analysis and for in vitro cytotoxicity. Biological
tests indicated qualitatively that the materials have a potential for the proposal of this work.
SUMÁRIO
Lista de Figuras ...................................................................................................................... 10
Lista de Tabelas ...................................................................................................................... 12
Lista de Notações .................................................................................................................... 13
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 17
2.1. Objetivo geral ............................................................................................................... 17
2.2. Objetivos específicos .................................................................................................... 17
3. Revisão da literatura .......................................................................................................... 18
3.1- Hidroxiapatita, um biomaterial multifuncional ....................................................... 18
3.2- Colágeno ....................................................................................................................... 22
3.3- Poli (álcool vinílico) ..................................................................................................... 24
3.4- O câncer ........................................................................................................................ 25
3.5- Osteossarcoma ............................................................................................................. 27
3.6- O emprego da radiação ionizante em oncologia ....................................................... 28
3.7- Nanomateriais aplicados à oncologia ......................................................................... 29
3.8- Ativação neutrônica em reatores nucleares .............................................................. 31
4. METODOLOGIA ............................................................................................................... 34
4.1- Síntese de nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita ...................................... 34
4.1.1- Síntese de HA pelo método de precipitação aquosa (Rota 1) ............................ 34
4.1.2- Síntese de HA pelo método sol-gel (Rota 2) ........................................................ 35
4.1.3- Síntese de HA pelo método hidrotermal (Rota 3a) ............................................ 36
4.1.4- Síntese de HA pelo método hidrotermal (Rota 3b) ............................................ 37
4.1.5- Síntese de HA pelo método hidrotermal (Rota 3c) ............................................ 37
4.2- Funcionalização da matriz de HA com PVA e colágeno .......................................... 39
4.3- Estudo do potencial de incorporação e liberação dos elementos ítrio e gadolineo 40
4.4- Caracterizações morfológicas e físico-químicas das amostras ................................ 41
4.4.1- Difração de raios X (DRX) ................................................................................... 41
4.4.2- Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR) ............................................................................................................................... 42
4.4.3- Análise elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN) ....................... 42
4.4.4- Análise termogravimétrica (TGA) ...................................................................... 42
4.4.5- Espectroscopia de correlação de fótons por espalhamento dinâmico da luz
(DLS) ................................................................................................................................ 42
4.4.6- Microscopia eletrônica de transmissão (MET) .................................................. 43
4.4.7- Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ..................................................... 43
4.4.8- Ensaios de adsorção de nitrogênio ...................................................................... 43
4.5- Ativação neutrônica dos elementos ítrio e gadolínio ................................................ 44
4.6- Ensaios preliminares de citotoxicidade in vitro ......................................................... 44
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................................................... 47
5.1- Caracterizações das matrizes de hidroxiapatita sintetizadas pelas três rotas ....... 47
5.1.1- Difração de raios X ............................................................................................... 47
5.1.2- Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourier .. 50
5.1.3- Ensaios de adsorção de nitrogênio ...................................................................... 55
Figura 5.07- Mecanismo da formação das nanopartículas de hidroxiapatita pela
formação de micelas do CTAB. Adaptado de (NGUYEN et al., 2013a). ....................... 58
5.2- Caracterizações das amostras funcionalizadas ......................................................... 59
5.2.1- Adsorção de gases ................................................................................................. 59
5.2.2- Difração de raios X ............................................................................................... 60
5.2.3- Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourier .. 61
........................................................................................................................................... 62
5.2.4- Análise elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio .................................... 64
5.2.5- Análise termogravimétrica ................................................................................... 65
5.2.6- Espectroscopia de correlação de fótons por espalhamento dinâmico da luz ... 66
5.2.7- Microscopia eletrônica de transmissão ............................................................... 68
5.2.8- Microscopia eletrônica de varredura .................................................................. 70
5.3- Estudo do potencial de incorporação e cinética de liberação de radioisótopos ..... 71
5.4- Ativação neutrônica dos elementos ítrio e gadolínio ................................................ 73
5.4.1- Potencial de ativação do ítrio ............................................................................... 73
5.4.2- Ativação do gadolínio ........................................................................................... 74
5.5- Ensaios preliminares de citotoxidade in vitro ........................................................... 75
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 79
7. PROPOSIÇÕES FUTURAS .............................................................................................. 81
8. PRODUÇÕES CIENTÍFICAS .......................................................................................... 82
9. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 83
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.01- Célula unitária da hidroxiapatita .......................................................................... 20
Figura 3.02- Diagrama de fase de solubilidade dos fosfatos de cálcio .................................... 21
Figura 3.03- Ligações de hidrogênio entre a hidroxiapatita, Colágeno e PVA ........................ 22
Figura 3.04- Esquema representativo da estrutura da tripla hélice do Colágeno ..................... 23
Figura 3.05- Estrutura fibrilar do Colágeno ............................................................................. 23
Figura 3.06- Esquema da formação das fibras de Colágeno a partir das fibrilas, microfibrilas e
tropocolágeno ....................................................................................................................... 24
Figura 3.07- Fórmula estrutural do PVA: (A) Parcialmente hidrolisado e (B) completamente
hidrolisado ............................................................................................................................ 24
Figura 3.08- Efeito EPR demonstrado esquematicamente ....................................................... 30
Figura 3.09- Esquema em corte do núcleo do reator TRIGA ................................................... 32
Figura 4.01- Fluxograma esquemático da rota 1 de síntese da hidroxiapatita ........................ 35
Figura 4.02- Fluxograma esquemático da rota 2 de síntese da hidroxiapatita ......................... 36
Figura 4.03- Fluxograma esquemático das rotas 3a e 3b de síntese da hidroxiapatita ............. 37
Figura 4.04- Fluxograma esquemático da rota 3c de síntese da hidroxiapatita ........................ 38
Figura 4.05- Desenho esquemático do MTT ............................................................................ 45
Figura 5.01- Difratograma de raios-X ...................................................................................... 47
Figura 5.02- Difratogramas das amostras de hidroxiapatita sintetizadas pelas rotas 1, 2 e 3 .. 48
Figura 5.03- Espectro de FTIR da amostra de hidroxiapatita pura .......................................... 51
Figura 5.04- Esquema dos quatro modos vibracionais dos íons PO43-
..................................... 51
Figura 5.05- Espectros de FTIR das amostras sintetizadas pelas rotas 1, 2 e 3 ....................... 54
Figura 5.06- Isotermas de adsorção de nitrogênio das cinco amostras de hidroxiapatita
sintetizadas............................................................................................................................ 56
Figura 5.07- Mecanismo da formação das nanopartículas de hidroxiapatita ........................... 58
Figura 5.08- Curva de isoterma do estudo de adsorção de N2 nas nanopartículas mesoporosas
de hidroxiapatita, do sistema PVA/HA e do sistema PVA/COL/HA ................................... 59
Figura 5.09- Difratograma comparativo entre a amostra de HA .............................................. 61
Figura 5.10- Espectros de FTIR para PVA puro (a), Colágeno puro (b), hidroxiapatita pura (c)
e para o sistema híbrido PVA/COL/HA ............................................................................... 62
Figura 5.11- Espectro de FTIR comparativo entre as amostras puras e a amostra do sistema
híbrido PVA/COL/HA em escala expandida no intervalo de 725 a 400 cm-1
...................... 63
Figura 5.12- Espectro de FTIR comparativo entre as amostras puras e a amostra do sistema
híbrido PVA/COL/HA em escala expandida no intervalo de 3700 a 3500 cm-1
.................. 63
Figura 5.13- Curvas de TGA e DTG das amostras de HA pura e dos sistemas híbridos ......... 66
Figura 5.14- Esquema representativo do potencial Zeta .......................................................... 67
Figura 5.15- Curva pH x Potencial zeta para a amostra de hidroxiapatita ............................... 68
Figura 5.16- Curva pH x Potencial zeta para a amostra de hidroxiapatita funcionalizada....... 68
Figura 5.17- Imagens da microscopia eletrônica de transmissão da amostra de hidroxiapatita
.............................................................................................................................................. 69
Figura 5.18- Histogramas da distribuição de tamanho de partículas de hidroxiapatita ............ 69
Figura 5.19- Imagens da microscopia eletrônica de varredura da amostra de hidroxiapatita .. 70
Figura 5.20- Resultados do estudo do potencial de incorporação ............................................ 71
Figura 5.21- Resultados do estudo da capacidade de retenção................................................. 71
Figura 5.22- Resultados do teste de citotoxidade em células T98G ......................................... 75
Figura 5.23- Fotos das células T98G utilizadas nos testes de citotoxidade ............................. 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1- Família dos fosfatos de cálcio ............................................................................... 19
Tabela 4.1- Principais parâmetros das rotas de síntese química de H ...................................... 39
Tabela 5.1- Resultados dos cálculos para tamanho de cristalito e distância interplanar .......... 49
Tabela 5.2- Bandas de adsorção na região do infravermelho para hidroxiapatita .................... 52
Tabela 5.3- Resultados das análises de BET das amostras de HA sintetizadas pelas três rotas
.............................................................................................................................................. 57
Tabela 5.4- Resultados das análises de BET para as amostras funcionalizadas ....................... 60
Tabela 5.5- Resultados da análise elementar de CHN .............................................................. 64
Tabela 5.6- Resultados da análise termogravimétrica .............................................................. 65
Tabela 5.7- Variáveis utilizadas no cálculo da ativação do ítrio .............................................. 73
Tabela 5.8- Variáveis utilizadas no cálculo da ativação do gadolínio...................................... 74
LISTA DE NOTAÇÕES
BET – Brunauer, Emmet e Teller (método de cálculos de porosidade a partir de dados da
análise de adsorção de gases)
COL – Colágeno
DRX – Difração de raios X
Emax – Energia maxima
EPR – Enhanced Permeability and Retention
FDA – Food and Drug Administration
FTIR – Fourier Transform Infrared Spectroscopy (espectroscopia na região do infravermelho
por transformada de Fourier
HA – Hidroxiapatita
IAEA – International Atomic Energy Agency
INCA – Instituto Nacional do Cancer
keV – Quilo elétron-volt (subunidade do elétron-volt, unidade de energia. 1keV 1,6E-16J)
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
MeV – Mega elétron-volt (subunidade do elétron-volt. 1MeV 1,6E-13J)
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
MPS – Mononuclear phagocyte system (sistema fagocitário mononuclear)
PI – Ponto isoelétrico
PVA – Poli (álcool vinílico)
PVA/COL/HA – Hidroxiapatita funcionalizada com PVA e colágeno
PVA/HA – Hidroxiapatita funcionalizada com PVA
SBF – Simulated Body Fluid (líquido corpóreo simulado)
13
1. INTRODUÇÃO
O osteossarcoma é o tipo mais comum entre os tumores ósseos malignos primários,
atingindo principalmente crianças, adolescentes e adultos jovens (WITTIG et al., 2002).
Dados epidemiológicos indicam que a incidência dessa enfermidade na população mundial é
de 2 a 3 casos anuais por milhão de pessoas. Entretanto, em adolescentes esses números
podem atingir de 8 a 11 casos anuais por milhão de habitantes jovens entre 5 e 19 anos de
idade (BIELACK; CARRLE; CASALI, 2009). No Brasil, estima-se que o número de novos
casos de tumores ósseos, para jovens de até 19 anos, seja cerca de 670 casos por ano por
milhão de habitantes (CAMARGO et al., 2010) e uma publicação do Instituto Nacional de
Câncer José Alencar Gomes da Silva (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. INSTITUTO
NACIONAL DE CÂNCER., 2010), tendo como referência o registro hospitalar de câncer
correspondente ao período de 1983 a 2005, aponta uma taxa de 13,8 % de novos casos de
tumores ósseos malignos nessa população. Esses dados reforçam a necessidade de
investimentos para se desenvolver formas de tratamento para essas enfermidades.
O tratamento padrão, empregado em osteossarcomas, é feito através da aplicação de
um agente neoadjuvante quimioterápico seguido de ressecção cirúrgica (ANDO et al., 2013;
BACCI et al., [s.d.], 1993; CARRLE; BIELACK, 2006; FERGUSON; GOORIN, 2001b).
Apesar do sucesso da quimioterapia para o tratamento de osteossarcomas, observa-se uma das
mais baixas taxas de sobrevivência para câncer pediátrico. Na maioria dos casos, a
quimioterapia é utilizada antes da cirurgia para matar células tumorais e ajudar a controlar a
propagação do tumor, o que facilita a remoção cirúrgica. Em alguns pacientes, a
quimioterapia é aplicada de forma paliativa para ajudar a retardar o crescimento do tumor e a
diminuir os sintomas quando o quadro se torna avançado e incapaz de se obter a cura. A
cirurgia é utilizada para remover o tumor primário, mas em alguns casos, devido à posição ou
o tamanho do tumor, a cirurgia pode envolver a remoção de todo o membro (FERGUSON;
GOORIN, 2001a).
A radioterapia convencional (teleterapia) é utilizada ocasionalmente em situações
especiais, onde ocorre a impossibilidade de remover todo o tumor cirurgicamente. Devido à
baixa sensibilidade dos osteossarcomas à radiação ionizante, este tipo de tratamento não é
utilizado com muita frequência, podendo ser recomendada para o tratamento pós-cirúrgico
com o objetivo de destruir possíveis células residuais após a remoção do tumor (BRULAND;
SKRETTING; SOLHEIM, 1996). A baixa sensibilidade dos osteossarcomas à teleterapia
14
possivelmente está associada também à distância entre a fonte de radiação e as células
tumorais, que impede a aplicação de doses maiores devido aos efeitos das radiações em
células sadias. A braquiterapia, técnica baseada na implantação cirúrgica de fontes
encapsuladas diretamente no interstício de tumores, reduz a distância entre fonte radioativa e
células cancerosas, mas em casos de tumores multifocais e metástases ósseas, essa técnica se
torna inaplicável devido às altas doses de radiação em que os pacientes seriam submetidos (o
que afetaria células sadias) e devido à característica invasiva do processo cirúrgico para
implantação das fontes. Considerando as dificuldades expostas, existe uma necessidade
emergente para encontrar novas alternativas terapêuticas para esse tipo de tumor.
Sistemas nanoestruturados têm sido amplamente explorados em pesquisas biomédicas
com grande otimismo para o diagnóstico e terapia do câncer. Como carreadores de
radioisótopos, esses sistemas apresentam um potencial promissor para o tratamento dos
osteossarcomas, permitindo o emprego mais seletivo das radiações em células tumorais e
podendo aumentar a radiossensibilidade desses tumores devido à proximidade que podem
manter entre os radioisótopos e as células tumorais. Nanomateriais, como a sílica mesoporosa,
as nanopartículas de hidroxiapatita, os nanotubos de carbono e os lipossomas, possuem
propriedades únicas que permitem a acumulação espontânea em tecidos tumorais, tornando-os
bons agentes para atuarem como veículos de entrega para liberação controlada de fármacos ou
como carreadores estáveis para radionuclídeos e radiofármacos (TORCHILIN, 2011, 2007).
A hidroxiapatita (HA) é um fosfato de cálcio, quimicamente definido como
Ca10(PO4)6(OH)2. Nanoestruturas de hidroxiapatita são exploradas em pesquisas biológicas
por apresentarem biocompatibilidade, bioatividade e semelhança com a composição mineral
dos tecidos ósseos (HAN et al., 2008). O pequeno tamanho do cristalito desses nanomateriais
é um importante fator que está relacionado com suas propriedades biológicas e estruturais,
como atividade superficial e baixa solubilidade (MIR et al., 2012). Além disso, biomateriais
mesoporosos permitem a fácil incorporação de agentes como os radioisótopos, visando o
tratamento de enfermidades como o osteossarcoma.
O tecido ósseo é um compósito inorgânico-orgânico consistindo principalmente de
colágeno (COL) e HA. Alguns estudos mostram que o processo de funcionalização de
superfícies de hidroxiapatita com colágeno melhora a aderência desse material em células de
tecidos ósseos (VOHRA et al., 2008). No entanto, os biocompósitos sintéticos de colágeno e
hidroxiapatita sozinhos não possuem as propriedades mecânicas adequadas para proporcionar
a estabilidade necessária em aplicações biomédicas. Entretanto este comportamento pode ser
15
optimizado com a utilização de ligantes poliméricos que formam uma interface entre os
materiais e melhoraram suas propriedades mecânicas, promovendo maior durabilidade para
esses sistemas (DEGIRMENBASI; KALYON; BIRINCI, 2006). Um bom candidato para
promover essa interface é o poli (álcool vinílico) (PVA), um polímero que exibe
biocompatibilidade e alto módulo de elasticidade, características que credenciam esses
materiais para aplicações biomédicas como sistemas de entrega de fármacos e carreadores de
radioisótopos (BAKER et al., 2012a; PEPPAS; MONGIA, 1997). Além disso, nanomateriais
funcionalizados com polímeros vinílicos apresentam a capacidade de evadir do sistema
fagocitário e se tornarem materiais de longa circulação sanguínea, favorecendo ainda mais ao
acúmulo espontâneo desses materiais em regiões tumorais (TORCHILIN; TRUBETSKOY,
1995b).
O ítrio-90 é um radioisótopo emissor beta (Emax = 2,28 MeV) com meia-vida de 64
horas. Este radionuclídeo tem sido empregado com sucesso em sinovectomia radioisotópica e
braquiterapia para tratamento de tumores metastáticos do fígado. Além disso, Khalid &
Mushtaq (2005), demonstraram que formulações 90
Y-HA apresentam estabilidade compatível
com aplicações in vitro e in vivo, credenciando esse sistema como um potencial agente para
tratamento de neoplasias. O gadolínio-159 é um radioisótopo emissor beta (Emax 1 MeV) e
gama (363 keV) com meia-vida de 18 horas que, encapsulado por nanopartículas, pode ser
utilizado tanto para tratamento quanto para o diagnóstico do câncer, como encontrado na
literatura (LIU; ZHANG, 2012; SOARES et al., 2011).
Embora já existam alguns estudos sobre partículas de hidroxiapatita contendo ítrio-90
relatados na literatura (KHALID; MUSHTAQ, 2005a; KUCUK et al., 2011; MULLAN;
SURVEYOR, 1989; THOMAS et al., 2013), até o momento não foi reportado na literatura o
uso de nanopartículas de hidroxiapatita funcionalizadas com estrutura mesoporosa como um
sistema híbrido carreador de ítrio-90 ou gadolínio-159, visando o tratamento de
osteossarcomas. Esse sistema pode oferecer uma alternativa mais eficaz para o tratamento
proposto, visando a redução da atividade radioativa em células sadias e promovendo o
acúmulo seletivo dos radioisótopos no interstício das células tumorais, o que poderia
aumentar a radiossensibilidade dessas células devido à proximidade mantida em relação à
fonte radioativa.
Com base no que foi exposto, a proposta do presente trabalho é a elaboração de um
sistema híbrido constituído por nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita funcionalizadas
com PVA e colágeno para promover a incorporação de radioisótopos e estudar, in vitro, a
16
atividade citotóxica desses sistemas sobre a linhagem de células T98G de glioblastoma
cerebral humano.
Este trabalho está basicamente dividido em 9 capítulos. No Capítulo 2 são explicitados
os principais objetivos para o desenvolvimento deste trabalho. No terceiro capítulo é
apresentado todo o referencial teórico utilizado como base para essa pesquisa; no quarto
capítulo são apresentadas as metodologias empregadas para síntese bem como a
caracterização dos materiais. No quinto capítulo são apresentados e discutidos todos os
resultados obtidos em laboratório e, finalmente, o capítulo 6 apresenta as conclusões sobre
todo o conteúdo desse trabalho. O Capítulo 7 apresenta as perspectivas futuras para essa
pesquisa, no capítulo 8 são apresentadas as produções científicas que resultaram desse
trabalho e as referências bibliográficas aparecem no Capítulo 9.
17
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Sintetizar sistemas híbridos compostos por nanopartículas mesoporosas de
hidroxiapatita funcionalizadas com PVA e colágeno, incorporar os radioisótopos ítrio-90 e
gadolínio-159 e realizar o estudo citotoxicidade in vitro com a linhagem de células T98G de
glioblastoma humano.
2.2. Objetivos específicos
Sintetizar nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita com tamanho, área superficial
e distribuição de poros adequados para realização de estudos de funcionalização,
incorporação e testes biológicos in vitro;
Caracterizar físico-quimicamente e morfologicamente as nanoestruturas de
hidroxiapatita;
Funcionalizar as nanopartículas de hidroxiapatita com PVA e colágeno;
Estudar o potencial de incorporação dos elementos ítrio e gadolínio no sistema híbrido
nanoestruturado PVA/COL/HA;
Estudar, em fluído corpóreo simulado (SBF), a cinética de liberação dos elementos
ítrio e gadolínio incorporados nas nanoestruturas;
Promover a ativação neutrônica do elemento gadolínio;
Promover a incorporação do radioisótopo gadolínio-159 no sistema híbrido
nanoestruturado PVA/COL/HA;
Realizar estudos de citotoxicidade in vitro com células de linhagem T98G para
diferentes formulações dos materiais estudados.
18
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1- Hidroxiapatita, um biomaterial multifuncional
Dentro da classe dos biomateriais, a hidroxiapatita é uma biocerâmica que merece
atenção especial devido à semelhança que apresenta com a fase mineral encontrada nos
tecidos ósseos e devido à ausência de toxicidade, sendo considerado um material bioativo e
biocompatível (HAN et al., 2008). Um biomaterial é um material sintético ou natural usado
para substituir partes de um sistema vivo ou para funcionar em contato íntimo com os tecidos
vivos. O principal diferencial de um biomaterial é a sua capacidade para permanecer em um
ambiente biológico sem provocar danos no ambiente e sem serem danificados no processo
(DOROZHKIN, 2010). Um material bioativo é aquele que induz à formação de uma camada
de fosfato de cálcio biologicamente ativa ao seu redor por meio de complexas reações físico-
químicas, iniciando o crescimento de uma capsula fibrosa fina que o separa dos tecidos
normais quando presente em sistemas biológicos (OREFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).
Esses tipos de materiais permitem a reconstituição tecidual em locais de implantes e são
bastante utilizados em ortopedia e odontologia.
As apatitas são minerais representados pela fórmula A10(BO4)6X2, onde A geralmente
representa um metal bivalente (Ca2+
, Sr2+
, Ba2+
, Pb2+
,...), BO4 representa um ânion trivalente
(PO43-
, AsO43-
, VO43-
,....) e X um ânion monovalente (F-, Cl
-, Br
-, I
-, OH
-,...). Cristais de
apatita comumente apresentam estrutura hexagonal, com grande habilidade para formarem
soluções sólidas e aceitarem inúmeras substituições na rede cristalina, possibilitando a
funcionalização desses materiais ou a realização de alterações estruturais para torná-los mais
aptos às suas aplicações (ELLIOTT, 1994; WHITE, 2005). Os ortofosfatos de cálcio
constituem uma importante família de apatitas, onde os arranjos atômicos são construídos em
torno da rede do grupo ortofosfato (PO4), que provê estabilidade à estrutura. A maioria dos
ortofosfatos de cálcio são moderadamente solúveis em água e insolúveis em soluções
alcalinas, mas todos eles são facilmente solúveis em ácidos (ELLIOTT; MACKIE; YOUNG,
1973).
Uma maneira conveniente de classificar os compostos de fosfatos de cálcio é através
da razão molar Ca/P. Geralmente vários tipos de fosfatos de cálcio, tendo diferentes razões de
Ca/P variando de 0,5 a 2,0, podem ser sintetizados através da mistura de soluções com íons
cálcio e fosfato sob condições ácidas ou alcalinas. A Tabela 3.1 apresenta características dos
vários tipos de fosfatos de cálcio sintéticos (LEGEROS, 1991, 2002).
19
Tabela 3.1: Família dos fosfatos de cálcio (Adaptado de LEGEROS, 1991 e 2002).
Ca/P Fórmula Nome Abreviação
2,0 Ca4O(PO4)2 Fosfato tetracálcico TTCP
1,67 Ca10(PO4)6(OH)2
Ca10-xH2x(PO4)6(OH)2
Hidroxiapatita
Fosfato de cálcio amorfo
HA
ACP
1,50 Ca3(PO4)2 Fosfato tricálcico TCP
1,33 Ca8H2(PO4)6.5H2O Fosfato octacálcico OCP
1,0 CaHPO4.2H4O Fosfato dicálcico dihidratado DCPD
1,0 CaHPO4 Fosfato dicálcico DCP
1,0 Ca2P2O7 Pirofosfato de cálcio CPP
1,0 Ca2P2O7.2H2O Pirofosfato de cálcio dihidratado CPPD
0,7 Ca7(P5O16)2 Fosfato heptacálcico HCP
0,67 Ca4H2P6O20 Fosfato dihidrógeno tetracálcico TDHP
0,5 Ca(H2O4)2.H2O Fosfato monocálcico monohidratado MCPM
0,5 Ca(PO3)2 Metafosfato de cálcio CMP
A hidroxiapatita cristaliza normalmente num sistema hexagonal e, em algumas
exceções, em sistema monoclínico (ELLIOTT; MACKIE; YOUNG, 1973; MORGAN et al.,
2000). O sistema pertence ao grupo espacial hexagonal P63/m, com simetria de rotação
hexagonal e parâmetros de rede a = b = 9,418 Å e c = 6,884 Å - , 2011). A
Figura 3.01 mostra a célula unitária da hidroxiapatita que contém 10 íons de cálcio
localizados em sítios não equivalentes, sendo quatro localizados no sítio I ([Ca(I)] e seis
localizados no sítio II [Ca(II)]). Os íons de cálcio pertencentes ao sítio I estão alinhados em
Colunas, enquanto que no sítio II, estão alinhados em triângulos equiláteros perpendiculares à
direção “c” da estrutura. Os cátions Ca+2
do sítio I estão coordenados por 6 átomos de
oxigênio pertencentes a diferentes tetraedros de PO43-
e também por outros 3 átomos de
oxigênio relativamente distantes - , 2011).
20
Figura 3.01- Célula unitária da hidroxiapatita. Adaptado de Muñoz (2011).
Os fosfatos de cálcio podem ser sintetizados por diferentes técnicas, como o método
sol-gel, o método de precipitação em soluções aquosas e o método hidrotermal (LÓPEZ-
MACIPE et al., 1998; SADAT-SHOJAI; KHORASANI; JAMSHIDI, 2012; SALIMI et al.,
2012; YAN et al., 2001). Uma das maiores dificuldades na síntese da hidroxiapatita é a
grande probabilidade do aparecimento de outras fases de fosfatos de cálcio. Cada uma dessas
fases possui características próprias e, dessa maneira, a presença dessas fases altera as
propriedades da hidroxiapatita. O TCP é a fase mais provável de aparecer em conjunto com a
hidroxiapatita. Este composto é solúvel em meio fisiológico, ao passo que a hidroxiapatita é
praticamente insolúvel. Portanto, a presença TCP confere a HA uma solubilidade maior do
que a que caracteriza o material (KOUTSOPOULOS, 2002).
A solubilidade é convencionalmente descrita como a quantidade de sólido que pode
dissolver em unidade de volume da solução. Para os fosfatos de cálcio, esta quantidade pode
mudar em várias ordens de grandeza com a mudança de pH e concentrações de ácidos e bases
(CHOW, 2009). Na Figura 3.02 é mostrado um diagrama de fase de solubilidade dos fosfatos
de cálcio em função do pH.
21
Figura 3.02- Diagrama de fase de solubilidade dos fosfatos de cálcio. Adaptado de CHOW
(2009)
Vohra e colaboradores (2008) mostraram que o processo de funcionalização de
superfícies de hidroxiapatita com colágeno melhora a aderência desse material em células de
osteossarcoma por tornar o material mais compatível com tecidos ósseos, uma vez que os
ossos são basicamente formados por colágeno e HA. Essa funcionalização agrega à
hidroxiapatita uma característica muito importante para o presente trabalho, uma vez que um
dos objetivos é promover a entrega seletiva desse material em massas tumorais de
osteossarcomas. Entretanto, segundo Degirmenbasi e colaboradores (2006), biocompósitos
sintéticos de colágeno e HA não apresentam propriedades mecânicas adequadas para
bioaplicações, mas este comportamento pode ser optimizado com o emprego de um ligante
polimérico capaz de formar uma interface entre o colágeno e a hidroxiapatita. O poli (álcool
vinílico) é um bom candidato para essa função, pois trata-se de um polímero que exibe
biocompatibilidade e alto módulo de elasticidade, além de apresentar grupamentos químicos
capazes de promover ligações de hidrogênio com a hidroxiapatita e com o colágeno, como
sugerido por Asran e colaboradores (2010) e demonstrado na Figura 3.03.
22
Figura 3.03- Ligações de hidrogênio entre a hidroxiapatita, Colágeno e PVA. Fonte:
(ASRAN; HENNING; MICHLER, 2010a).
3.2- Colágeno
O colágeno é a proteína mais abundante da matriz extracelular e o principal
componente estrutural dos tecidos conjuntivos. São conhecidos, pelo menos, 27 tipos de
colágeno que são caracterizados pela sua complexidade e diversidade na estrutura. O
Colágeno do tipo I, encontrado na forma de fibras com tamanhos entre 80 e 160 nm, é o mais
abundante e está presente de forma generalizada no organismo (GOISSIS, 2007; RICARD-
BLUM, 2011). Os colágenos são formados por 19 cadeias α (cadeia peptídica) que são
associadas em grupos de três para dar origem a cada tipo de Colágeno, formando estruturas de
tripla hélice (GOISSIS, 2007).
A estrutura primária das moléculas de colágeno (Figura 3.04) é uma unidade formada
por três aminoácidos e o primeiro aminoácido desta unidade é uma glicina (GLI). Os outros
dois aminoácidos são principalmente a prolina (PRO) e a hidroxiprolina (HIPRO), mas
também é possível que uma lisina seja incorporada (GELSE, 2003). A hidroxiprolina forma
ligações de hidrogênio, essenciais para a estabilidade da tripla hélice, onde as glicinas estão
posicionadas no centro e os aminoácidos de maior diâmetro são posicionados nos lados
exteriores, resultando em uma estrutura densa em torno do eixo central da molécula
(MARION, 2006). A distância entre dois grupos consecutivos de GLI é de 8,7 Å, sendo que
cada grupo de aminoácido contribuí com a distância de 2,8 Å e as posições X podem ser
ocupadas pela PRO ou HIPRO. A estrutura tropocolágeno corresponde à unidade monomérica
do colágeno do tipo 1 (GOISSIS, 2007).
23
Figura 3.04- Esquema representativo da estrutura da tripla hélice do Colágeno. Fonte:
(GOISSIS, 2007)
Nas unidades terminais de nitrogênio e carbono, o colágeno contém uma estrutura não
helicoidal, os telopeptídeos (Figura 3.05), que são estruturas capazes de formar ligações
covalentes cruzadas entre o colágeno e outras moléculas, sendo um fator importante para os
processos de funcionalização dos nanomateriais (BALGUID et al., 2007).
Figura 3.05- Estrutura fibrilar do Colágeno. Fonte: (VIEIRA, 1999)
A formação das microfibrilas de colágeno ocorre pelas interações entre as moléculas
de tropocolágeno e, depois de formadas, elas se agregam por um processo denominado
fibrilogênese (Figura 3.06) para formar fibrilas insolúveis que, por sua vez, se agregam para
formar as fibras colagênicas (EGAWA, 2007).
24
Figura 3.06- Esquema da formação das fibras de colágeno a partir das fibrilas, microfibrilas e
tropocolágeno. Fonte: (FIGUEIREDO, 2009).
3.3- Poli (álcool vinílico)
O poli (álcool vinílico) (PVA) é um polímero sintético, de fórmula geral
(C2H4O)n(C4H6O2)m e peso molecular que varia entre 30.000 e 200.000 g/mol, usado desde o
início da década de 1930 em uma ampla gama de aplicações industriais e médicas, incluindo a
produção de resinas, vernizes, fios cirúrgicos e aplicações alimentícias. As características
físicas do PVA são dependentes do modo de sua preparação a partir da hidrólise ou hidrólise
parcial do acetato de polivinilo (Figura 3.07). O PVA é geralmente classificado em dois
grupos, parcialmente hidrolisado (A) e completamente hidrolisado (B) (DEMERLIS;
SCHONEKER, 2003).
Figura 3.07- Fórmula estrutural do PVA: (A) Parcialmente hidrolisado e (B) completamente
hidrolisado. Fonte: (DEMERLIS; SCHONEKER, 2003).
Fibra
Fibrila
Microfibrila
Hélice de
Tropocolágeno
25
A quantidade de hidroxilação determina as características físicas, as propriedades
químicas e as propriedades mecânicas do PVA. O polímero resultante será altamente solúvel
em água e mais resistente aos solventes orgânicos. Quanto maior o grau de hidroxilação e
polimerização do PVA, menor será a solubilidade em água e mais difícil será sua cristalização
(BAKER et al., 2012b). Devido à sua solubilidade em água, o PVA pode ser reticulado para
formar hidrogéis e ser utilizado em suas várias aplicações. As reticulações, químicas ou
físicas, fornecem a estabilidade estrutural que o hidrogel precisa quando está na presença de
água ou fluido biológico. O grau de reticulação determina a quantidade de absorção do fluido,
estabelecendo-se, assim, as características físicas, químicas e as propriedades de difusão do
polímero que, finalmente, determinam suas propriedades biológicas (HUGLIN, 1989).
O PVA está aprovado pelo FDA para utilização em várias aplicações médicas,
incluindo sistemas transdérmicos, preparação de géis que secam rapidamente quando
aplicados à pele e em formulações para liberação de fármacos. Soluções oftálmicas, tais como
lágrimas sintéticas, podem também conter o PVA, pois fornece uma boa dispersão e possui
propriedades de revestimento (DEMERLIS; SCHONEKER, 2003). Hidrogéis e membranas
de PVA têm sido desenvolvidos para outras aplicações oftálmicas, tais como lentes de
contato, e humor vítreo sintético, bem como para materiais médicos implantáveis visando a
substituição de cartilagem e menisco (BAKER et al., 2012b). O PVA apresenta grande
resistência à tração e alongamento antes de sua ruptura, fazendo dele um hidrogel adequado
para lentes de contato gelatinosas, permitindo a extensão do tempo de uso sem indução de
hipóxia para o córnea (KITA et al., 1990).
3.4- O câncer
O câncer é um termo geral utilizado para fazer referência a alterações patológicas
caracterizadas por células que perdem a capacidade de limitar e controlar o seu próprio
crescimento, resultando na produção de uma massa denominada de tumor (CORNER, 2001).
Os tumores podem ser classificados como benignos ou malignos. As células de tumores
benignos crescem lentamente e mantêm uma estrutura semelhante à estrutura de uma célula
normal, enquanto as células dos tumores malignos crescem descontroladamente, sem respeitar
a estrutura e funções do tecido adjacente. Além disso, estas células possuem a capacidade de
evadir da ação do sistema imunológico, disseminando-se para diversas regiões do organismo
26
por um processo denominado metástase, responsável por cerca de 70% de óbitos dentre seus
portadores (FYNAN; REISS, 1993)
As estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS) apontam para uma
incidência de 27 milhões de novos casos de câncer, com 17 milhões de mortes e 75 milhões
de portadores da doença em todo o mundo até o ano de 2030 (BRASIL. MINISTÉRIO DA
SAÚDE. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER., 2010). No Brasil, foi estimada uma
ocorrência de 518.510 novos casos de câncer no país nos anos de 2012 e 2013, com atenção
especial aos cânceres de próstata (60.180 casos) e mama (52.680 casos), que serão os tipos
mais incidentes em homens e mulheres, respectivamente.
Os tecidos orgânicos sadios são constituídos por um conjunto de células específicas
que possuem as propriedades morfofisiológicas adequadas para a realização de suas funções
características. Cada uma dessas células apresenta um ciclo de vida bem regulado que
proporciona a constante renovação tecidual, etapa fundamental para o desenvolvimento e a
manutenção de todo organismo vivo. O câncer é uma doença causada por uma falha genética
relacionada ao mecanismo que regula o ciclo celular, conduzindo ao crescimento desordenado
e invasivo de células, que leva à formação de uma massa tumoral com capacidade para se
infiltrar em tecidos sadios (GOLDMAN; AUSIELLO, 2010). Mesmo que os mecanismos
etiológicos do câncer não sejam completamente compreendidos pela Ciência, alguns estudos
demonstram que tais mecanismos podem ser de origens variadas, tendo origem interna ou
externa ao organismo e podendo estar inter-relacionados (HANAHAN; WEINBERG, 2011)
Todos os tipos de câncer são resultados de mutações ou supressões de dois tipos de
genes: o gene supressor de tumores que precisa ser desativado e o oncogene que precisa ser
ativado para que o crescimento celular seja iniciado (VERMA; PATEL; VERMA, 2011)
Esses eventos podem ocorrer devido a erros internos de replicação durante as etapas da
divisão celular ou podem ocorrer devido a alguns fatores mutagênicos externos como as
radiações, produtos químicos e alguns vírus (TOKINO; NAKAMURA, 2000).
Devido à rápida evolução dos tumores, a detecção precoce dessas neoplasias é um
fator determinante no prognóstico dos pacientes. O câncer possui um estadiamento que
envolve algumas etapas, sendo que em estágios iniciais o tratamento se torna mais eficaz e
com menores chances de reincidências (GOLDMAN; AUSIELLO, 2010).
27
3.5- Osteossarcoma
O osteossarcoma é o tumor ósseo maligno primário mais comum em crianças e
adolescentes, tendo maior incidência entre a faixa de 10 a 20 anos de idade, quando a taxa de
crescimento ósseo é mais acentuada (WEISS, 2005). Essa enfermidade representa o tipo mais
comum de sarcoma ósseo, sendo um quarto de todos os tumores malignos dos ossos e um
terço de todos os tipos de sarcomas (DORFMAN; CZERNIAK, 1998).
O osteossarcoma é uma enfermidade definida como uma neoplasia mesenquimal
maligna que apresenta diferenciações na formação óssea. Esses tumores podem afetar a região
intramedular ou podem afetar a superfície dos ossos, embora seja mais raro. Os locais mais
comuns para incidência de osteossarcomas são as regiões com as mais altas taxas de
crescimento, como as metáfises dos ossos tubulares. Se não for tratada, essa enfermidade se
torna fatal, com grandes possibilidades para ocorrência de metástases (WEISS, 2005).
Vários subtipos de osteossarcoma podem ser identificados através de exames de Raios
X e análises em microscópios. Com base em sua aparência ao microscópio, osteossarcomas
podem ser classificados como de alto grau, grau intermediário ou de baixo grau.
Osteossarcomas de alto grau são os de crescimento mais rápido e quando vistos sob um
microscópio eles não se parecem com o osso normal e apresentam muitas células em processo
de divisão. A maioria dos osteossarcomas que ocorrem em crianças e adolescentes é de alto
grau. Osteossarcomas de grau intermediário ficam entre osteossarcomas de alto e de baixo
grau e são tratados como osteossarcomas de baixo grau. Os osteossarcomas de baixo grau são
os que apresentam crescimento mais lento, os tumores parecem mais com o osso normal e têm
poucas células em divisão, quando visto sob um microscópio (DORFMAN; CZERNIAK,
1998).
Para se estabelecer um adequado tratamento do câncer, é necessário conhecer as
características do paciente, do tumor e as opções terapêuticas disponíveis. O tratamento pode
ter intenção curativa, paliativa ou de suporte. Existem basicamente três modalidades
terapêuticas: (i) cirurgia, aconselhada quando o tumor é localizado em regiões anatômicas
mais favoráveis; (ii) radioterapia, útil para tratamento de tumores localizados que não podem
ser ressecados ou não apresentam morbidade grave, podendo ser utilizada também para
redução do tamanho tumoral antes de uma intervenção cirúrgica; (iii) quimioterapia, que é um
tratamento sistêmico e consiste de uma combinação de fármacos específicos para destruir
células tumorais circulantes ou de tumores sólidos (GOLDMAN; AUSIELLO, 2010).
28
3.6- O emprego da radiação ionizante em oncologia
As radiações ionizantes atuam destruindo as células tumorais através de mecanismos
que podem originar quebras na molécula de DNA e por meio da produção de radicais livres
dentro do citoplasma (TUBIANA; DUTREIX; WAMBERSIE, 1990). Células cancerígenas
não possuem um mecanismo de defesa eficaz e, assim, danos no DNA são fatais para essas
células. A radiólise da água promove a formação de radicais livres dentro do citoplasma
celular e os radicais podem se recombinar, originando substâncias químicas letais como o
peróxido de hidrogênio (TAUHATA et al., 2003). Entretanto, as limitações de emprego das
radiações ionizantes, no presente contexto, residem no fato que células sadias e células
cancerígenas não são discriminadas, resultando em severos efeitos colaterais. Neste contexto,
a radioterapia convencional (feixe externo) apesar de ser efetiva para alívio das dores ósseas e
ser capaz de promover redução da massa tumoral em alguns casos, não pode ser utilizada para
tratamentos multifocais devido à grande probabilidade de depositar elevadas doses de
radiação em vários tecidos sadios (HARVEY; CREAM, 2007; STERLING et al., 2011). Uma
alternativa à radioterapia convencional é o emprego dos radionuclídeos administrados
sistemicamente por meio de radiofármacos ou através de sementes de braquiterapia,
constituídas por materiais radioativos encapsulados por um material protetor e biocompatível,
implantadas diretamente ou lateralmente nos volumes tumorais (GABRIEL, 2007;
TAUHATA et al., 2003).
O ítrio-90 (90
Y) é um radioisótopo que possui uma meia-vida de 64 horas e emite
radiação beta com 2,28 MeV de energia. Quando administrado sistemicamente, estudos
demonstram que uma parcela de 25% será diretamente excretada, 50% serão captados pelo
esqueleto, 15% serão direcionados ao fígado e uma parcela de 10% é uniformemente
distribuída por todos os outros órgãos e tecidos (VENNART, 1981). A alta captação do 90
Y
pelos tecidos ósseos credencia esse radioisótopo para o tratamento de osteossarcomas,
sugerindo que essa afinidade aumente a eficácia e a especificidade de ação das radiações
ionizantes nesses tumores.
Observam-se nos últimos anos intensas pesquisas onde sistemas nanoestruturados
carreadores de radioisótopos como os lipossomas têm sido investigados a fim de melhorar a
especificidade das radiações ionizantes sobre os tecidos tumorais (MAGIN; MORSE, 1983;
PHILLIPS, 1999; ROMBI; COSSU; MELIS, 1991). Em outros estudos, nanopartículas de
hidroxiapatita contendo os radioisótopos 177
Lu e 90
Y foram empregadas com sucesso no
29
tratamento de tumores hepáticos e prostáticos de cobaias (CHAKRABORTY et al., 2008;
KHALID; MUSHTAQ, 2005b).
3.7- Nanomateriais aplicados à oncologia
Sistemas nanoestruturados focados em aplicações biológicas têm sido amplamente
explorados em pesquisas biomédicas com grande otimismo para o diagnóstico e terapia do
câncer. Nanomateriais como nanopartículas de sílica mesoporosa e de hidroxiapatita, assim
como os nanotubos de carbono e os lipossomas, possuem propriedades únicas que permitem o
acúmulo desses materiais em tecidos tumorais, podendo atuar como carreadores para
liberação controlada de drogas ou como carreadores de radionuclídeo (TORCHILIN;
TRUBETSKOY, 1995a).
Em circunstâncias como inflamações e hipóxia, tipicamente observadas em regiões
infartadas ou tumorais, o revestimento endotelial da parede dos vasos sanguíneos se torna
mais permeável do que no estado normal. Como resultado, moléculas grandes e partículas
pequenas, que variam de 10 a 500 nm, podem deixar o leito vascular e acumularem-se no
interior do espaço intersticial (TORCHILIN, 2011), como demonstrado esquematicamente na
Figura 3.08. O acúmulo espontâneo, que funciona especialmente bem com tumores devido à
falta de drenagem linfática, é conhecido como efeito EPR (enhanced permeability and
retention) (TORCHILIN, 2007). Considerando esta oportunidade, diversos sistemas
nanoestruturados foram propostos como potenciais sistemas carreadores de drogas
antitumorais. Por exemplo, as formulações lipossomais Depocyt e Myocet (Citarabina e
Doxorubicina, respectivamente) integram o conjunto de medicamentos atualmente aprovados
para uso clínico em humanos (O’SHAUGHNESSY, 2003; PEREZ et al., 2002).
30
Figura 3.08- Efeito EPR demonstrado esquematicamente. (1) Nanoestruturas de tamanhos
maiores, contendo drogas de tratamento tumoral (4) conseguem permear em regiões tumorais
(3) que possuem permeabilidade vascular aumentada (2). Sem estarem dentro de estruturas
maiores, as drogas conseguem permear a parede vascular em tecidos normais e provocar a
morte de células sadias (setas finas sem números). Adaptado de TORCHILIN, 2007.
Em estudos conduzidos por Chakraborty et al. (2008), nanopartículas de hidroxiapatita
marcadas com o radioisótopo 177
Lu foram preparadas com sucesso e apresentaram excelente
estabilidade in vitro. Os estudos mostraram uma retenção sistêmica de aproximadamente 73%
da atividade injetada após 14 dias da administração, sendo que os estudos de biodistribuição
demonstraram insignificantes absorções do composto em órgãos e tecidos maiores, exceto no
esqueleto. Clunie e colaboradores (1995) estudaram a biodistribuição de partículas de
hidroxiapatita marcadas com 153
Sm em pacientes portadores de sinovites do joelho, e os
resultados desses estudos demonstraram uma boa distribuição do composto na região óssea de
interesse, com baixas absorções pelos pulmões, linfonodos e fígado. Os resultados obtidos em
outros estudos indicaram que a hidroxiapatita nanoestruturada possui boa afinidade pelos
tecidos ósseos com baixa captação por órgãos não alvos como fígado, pulmões e linfonodos,
sugerindo esse nanomaterial como um potencial sistema como carreador de radionuclídeos
para aumentar a especificidade de ação das radiações em neoplasias ósseas (CLUNIE et al.,
1995).
Nanopartículas de hidroxiapatita apresentam lento processo de biodegradação in vivo,
conferindo boa estabilidade para aplicações biológicas (OREFICE; PEREIRA; MANSUR,
2012). Estudos recentes avaliaram as diferenças na morfologia e nas propriedades da
superfície de micro e nanopartículas de HA com respeito à adsorção de drogas e relataram que
31
os fenômenos de adsorção ou dessorção dependem das propriedades físico-químicas das
drogas e dos tamanhos (micrometros ou nanômetros) das partículas de HA
(MOBASHERPOUR et al., 2007). Um mesmo método pode produzir nanopartículas de HA
com diferentes propriedades físicas e químicas, devido à formação de diferentes morfologias e
características dependentes do método de síntese (LI-YUN; CHUAN-BO; JIAN-FENG,
2005).
A maximização da concentração de nanopartículas terapêuticas no interior dos
tumores é vital para a maior eficácia do tratamento porque minimiza os danos para as células
saudáveis em outras partes do corpo. Segundo HAN (2008), a biodistribuição de estruturas
nanométricas é fortemente afetada pela captação de macrófagos do sistema fagocitário
mononuclear (MPS). O principal fator determinante da cinética de absorção dos
nanomateriais pelo sistema MPS é o tamanho de partícula (STORM et al., 1995), sendo
desejável a obtenção de partículas de tamanhos menores para que o sistema tenha a
capacidade de evadir do sistema fagocitário (TORCHILIN, 2007).
3.8- Ativação neutrônica em reatores nucleares
O reator nuclear IPR-R1, do Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear -
CDTN, é um reator do tipo TRIGA (training research isotopes general atomics), fabricado
pela Gulf General Atomic (USA). Esse reator foi projetado para operar em regime contínuo
até a potência de 100 kW. O núcleo do reator (Figura 3.09) apresenta a forma cilíndrica com
91 canais onde estão instalados 63 elementos combustíveis, sendo circundado por um refletor
de grafita. Uma coluna de aproximadamente 5 m de água faz a blindagem em relação ao topo
do poço.
32
Figura 3.09- Esquema em corte do núcleo do reator TRIGA. Fonte (ZANGIROLAMI, 2010).
A ativação neutrônica de radioisótopos ocorre preferencialmente pela reação nuclear
(n,γ) produzida por nêutrons térmicos e epitérmicos. O princípio de funcionamento dos
reatores nucleares é a fissão de isótopos pesados como o 235
U, 238
U e 239
Pu, que produzem
uma média de 2 a 3 nêutrons por fissão, com energias entre 0 e 15 MeV. Uma vez iniciada a
fissão do combustível nuclear, parte dos nêutrons produzidos é utilizada para provocar novas
fissões, mantendo a reação em cadeia e um fluxo de nêutrons dentro do núcleo do reator. As
amostras ativáveis são conduzidas para dentro do núcleo do reator, na mesa giratória ou no
33
tubo central, através de sistemas pneumáticos que permitem a inserção segura das amostras
para dentro do núcleo.
A atividade induzida em uma amostra depende do número de átomos alvo, da secção
de choque para nêutrons térmicos e da integral de ressonância para nêutrons epitérmicos do
isótopo estável que será ativado, dos fluxos de nêutrons térmicos e epitérmicos característicos
do reator e do tempo de irradiação da amostra dentro do núcleo. A equação (1), que relaciona
esses fatores, permite o cálculo teórico da atividade induzida em uma amostra dentro do
núcleo do reator.
(1)
Onde N é o número de átomos do isótopo estável, ΦTh é o fluxo de nêutrons térmicos
dentro do núcleo do reator, σTh é a secção de choque do isótopo estável para nêutrons
térmicos, ΦEPI é o fluxo de nêutrons epitérmicos dentro do núcleo do reator, Iγ é a integral de
ressonância do isótopo estável, λ é a constante de decaimento radioativo do radioisótopo
ativado e TIR é o tempo de irradiação da amostra (ZANGIROLAMI, 2010). Com base nestes
dados é possível estimar teoricamente a atividade induzida em uma amostra submetida a um
fluxo de nêutrons específico.
Com base no que foi exposto neste capítulo e tendo em vista os objetivos apresentados
no capítulo 2, o capítulo a seguir expõe todas as metodologias empregadas nessa pesquisa,
desde as rotas de síntese adotadas para produção da matriz de hidroxiapatita e as rotas para o
processo de funcionalização e incorporação do radioisótopo ítrio, até os estudos de
citotoxicidade in vitro.
34
4. METODOLOGIA
4.1- Síntese de nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita
Segundo estudos conduzidos por Torchilin (2011), materiais nanoestruturados, com
partículas de tamanho médio variando entre 70 e 200 nm, são adequados para o tratamento do
câncer pelo efeito EPR e, segundo Wu e Colaboradores (2012), estruturas mesoporosas com
grandes áreas superficiais e volume de poros são meios eficazes para promover a
incorporação de radioisótopos. Procurando a obtenção de um material constituído de
nanoestruturas mesoporosas de hidroxiapatita com tamanhos de partícula dentro da faixa
mencionada acima, foram testadas cinco rotas químicas de síntese baseadas no processo de
precipitação aquosa, no processo sol-gel e no método hidrotermal, seguindo a literatura com
algumas adaptações (BAVARESCO et al., 2000; LIN et al., 2007; SALARIAN et al., 2009;
SALIMI et al., 2012; SHIH; WANG; HON, 2005; WANG et al., 2006b; WU et al., 2012;
YAO et al., 2003; YUAN et al., 2010)
4.1.1- Síntese de HA pelo método de precipitação aquosa (Rota 1)
Nanopartículas de hidroxiapatita foram preparadas pelo método de precipitação
aquosa, seguindo os estudos conduzidos por LIMA (2010), com algumas modificações. A
Figura 4.01 representa de forma esquemática essa rota de síntese. Foram preparadas duas
soluções: a solução (i) foi preparada com a dissolução de 78,7 g de nitrato de cálcio
tetrahidratado, Ca(NO3)2.4H2O (Synth), em 300 mL de água Milli-Q® previamente aquecida
à temperatura de 50 °C e a solução (ii) foi preparada com a dissolução de 26,4 g de
monohidrogênio fosfato de dibásico, (NH4)2HPO4 (Sigma-Aldrich), em 500 mL de água
Milli-Q® previamente aquecida à temperatura de 50 °C. Após a completa dissolução, o pH de
ambas as soluções foi ajustado para 12 com adição de hidróxido de amônia, NH4OH (Fmaia).
A solução (i) foi diluída para um volume total de 600 mL e a solução (ii) para um volume de
800 mL, ambas com água Milli-Q® aquecida a 50
°C. A reação entre as soluções ocorreu
através da adição controlada de (ii) em (i) com auxílio de bureta, sob constante agitação à
temperatura de 50
°C durante 30 minutos. Após o término da adição, o excesso de
sobrenadante da suspensão foi retirado e o precipitado foi filtrado e sucessivamente lavado
com água Milli-Q®, acetona e éter de petróleo. O material foi deixado para secar em estufa a
60 °C até adquirir o aspecto de pó e, finalmente, foi transferido para um cadinho de porcelana
35
e colocado no forno tubular para calcinar a 150 °C durante 7 horas. A reação química (1), que
representa a síntese do material é a seguinte (LIMA, 2010):
10Ca(NO3)2.4H2O + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH → Ca10(PO4)6(OH)2 + 20NH4NO3 + 46H2O
(1)
Figura 4.01- Fluxograma esquemático da rota 1 de síntese da hidroxiapatita.
4.1.2- Síntese de HA pelo método sol-gel (Rota 2)
Nanopartículas de hidroxiapatita foram preparadas pelo método sol-gel, baseado nos
estudos conduzidos por Salimi et al. (2012), com pequenas modificações. A Figura 4.02
representa forma esquemática a rota de síntese 2. Soluções estequiométricas de (i) nitrato de
cálcio tetrahidratado, Ca(NO3)2.4H2O (Dinâmica Química), e (ii) pentóxido de fósforo, P2O5
(Sigma-Aldrich), foram dissolvidas em álcool etílico, C2H5OH (ECIBRA), com
concentrações molares de 100 mM e 30 mM respectivamente. Em seguida, as duas soluções
foram transferidas para um béquer com o auxílio de buretas a uma taxa de 20 mL/min. A
solução resultante teve o pH ajustado para 12 com NaOH 2,5 M e foi agitada (450 rpm)
durante 24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi deixada em repouso por
24 horas à temperatura ambiente para envelhecimento e, logo após esse processo, foi lavada,
filtrada e secada em estufa. A amostra obtida foi então calcinada em forno tubular (INTI,
Brasil) à temperatura de 600 °C, com taxa de aquecimento de 5 °C/min durante 2 horas. Por
fim, o material foi moído em graal de ágata durante 20 minutos de onde se obteve um pó fino
Água Milli-Q®
50oC
Ca(NO3)2.4H2O
Solução (i)
Ajuste de pH
Água Milli-Q® 50
oC
(NH4)2HPO4.3H2O
Solução (ii)
Ajuste de pH
Solução HA
Filtração/lavagem Calcinação HA
Agitação
30 minutos
50 oC
Ajuste de pH
36
de coloração e aspecto característicos da hidroxiapatita. A reação química que representa a
obtenção deste material é descrita como:
10Ca(NO3)2.4H2O + 3P2O5 + 20NaOH → Ca10(PO4)6(OH)2 + 20Na(NO3) + 49H2O (2)
Figura 4.02- Fluxograma esquemático da rota 2 de síntese da hidroxiapatita.
4.1.3- Síntese de HA pelo método hidrotermal (Rota 3a)
A síntese de HA pela rota 3a começou com a preparação de duas soluções precursoras,
conforme representado de forma esquemática na Figura 4.03. A solução (i) foi preparada com
a dissolução de nitrato de cálcio, Ca(NO3)2.4H2O (Dinâmica Química), em água Milli-Q®
para se obter uma concentração final de 0,167 M de cálcio. A solução (ii) foi preparada com a
dissolução de monohidrogênio fosfato de dipotássio, K2HPO4.3H2O (Sigma-Aldrich) em
150 mL de água Milli-Q®
, para se obter uma solução com concentração final de 0,1 M de
potássio, e a posterior adição de 2 g do surfactante brometo de hexadeciltrimetilamônio
(CTAB), C14H42N.Br (Sigma-Aldrich). A solução (ii) ficou sobre agitação durante 6 horas
para promover o direcionamento da rede pela formação de micelas e o seu pH foi ajustado
para 12 com a adição de NaOH 2,5 M, antes e durante o lento gotejamento da solução (i).
Após o processo de adição da solução (i) sobre a solução (ii) com a manutenção da
temperatura em 50 °C, a solução resultante foi envelhecida à temperatura ambiente durante 14
horas. Após esse processo, foi realizado um tratamento hidrotérmico com temperatura de
150 °C durante 10 horas. Em seguida, a solução foi filtrada e lavada com água Milli-Q® e
etanol. O material filtrado ficou em estufa durante 24 horas à temperatura de 60 °C para secar.
Etanol
Ca(NO3)2.4H2O
Solução (i)
P2O5
Etanol
Solução (ii)
Solução HA Agitação 24H
Repouso 24H
Filtração/lavagem
Calcinação
HA
37
Como os direcionadores são iônicos, a interação entre as moléculas direcionadoras e a
superfície inorgânica é forte, por atração eletrostática. Esta forte interação requer extração
pelo método da calcinação. O material foi então calcinado durante 6 horas a 550 °C para
promover a remoção do surfactante, obtendo-se um fino pó branco.
4.1.4- Síntese de HA pelo método hidrotermal (Rota 3b)
A rota 3b consistiu apenas da modificação na temperatura do tratamento hidrotérmico
da rota 3a de 150 para 100 oC, conforme o fluxograma da Figura 4.03.
Figura 4.03- Fluxograma esquemático das rotas 3a e 3b de síntese da hidroxiapatita. 4.1.5- Síntese de HA pelo método hidrotermal (Rota 3c)
Nanopartículas de hidroxiapatita mesoporosas foram sintetizadas através do método
hidrotermal com a utilização de um surfactante catiônico que atuará como direcionador da
rede de HA. A síntese de HA por esta rota, representada de forma esquemática na Figura 4.04,
começou com a preparação de duas soluções precursoras. A solução (i) foi preparada com a
dissolução de nitrato de cálcio, Ca(NO3)2.4H2O (Dinâmica Química), em água Milli-Q® para
se obter uma concentração final de 0,167 M de cálcio. A solução (ii) foi preparada com a
completa dissolução de 2 g de brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB), C14H42N.Br
(Sigma-Aldrich), em 150 mL de água Milli-Q®
e a posterior adição de monohidrogênio
Solução (ii)
K2HPO4.3H2O
Água
Milli-Q
CTAB
6 horas de
agitação
Solução (ii)
Ajuste de pH Água
Milli-Q Ca(NO3)2.4H2O
Solução (i) Gotejamento
lento
Solução HA
Tratamento
Hidrotérmico
Filtração/lavagem Calcinação HA
Envelhecimento
Rota 3b:
100oC
Rota 3a:
150oC
38
fosfato de dipotássio, K2HPO4.3H2O (Sigma-Aldrich), para se obter uma solução com
concentração final de 0,1 M de potássio. A solução (ii) foi agitada durante 6 horas para
promover o direcionamento da rede pela formação de micelas e o seu pH foi ajustado para 12
com a adição de NaOH 2,5 M, antes e durante o lento gotejamento da solução (i). Após o
processo de adição da solução (i) sobre a solução (ii) com a manutenção da temperatura em
50 °C, a solução resultante foi envelhecida à temperatura ambiente durante 14 horas e, após
esse processo, foi conduzida a um tratamento hidrotérmico com temperatura de 100 °C
durante 10 horas. Em seguida, a solução foi filtrada e lavada com água Milli-Q® e etanol. O
material filtrado ficou em estufa durante 24 horas à temperatura de 60 °C para secar e foi
calcinado durante 6 horas a 550 °C para promover a remoção do surfactante, obtendo-se um
fino pó branco. A reação química que descreve as três rotas de síntese pelo método
hidrotermal pode ser descrita como:
10Ca(NO3)2.4H2O + 6K2HPO4.3H2O + 8NaOH → Ca10(PO4)6(OH)2 + 8NaNO3 + 12KNO3 +
64H2O (3)
Figura 4.04- Fluxograma esquemático da rota 3c de síntese da hidroxiapatita.
Solução CTAB
CTAB
Água
Milli-Q
K2HPO4.3H2O
6 horas de
agitação
Solução (ii)
Ajuste de pH Água
Milli-Q Ca(NO3)2.4H2O
Solução (i) Gotejamento
lento
Solução HA
Tratamento
Hidrotérmico
Filtração/lavagem Calcinação HA
Envelhecimento
39
A Tabela 4.01 apresenta os principais parâmetros utilizados em cada rota de síntese
química, sumarizando as principais diferenças entre elas.
Tabela 4.1- Principais parâmetros das rotas de síntese química de HA
Ro
ta
Rea
gen
tes
qu
ímic
os
Aju
ste
de
pH
Tem
per
atu
ra
de
pre
pa
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ção
do
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ra
de
sín
tese
qu
ímic
a
Tem
per
atu
ra
de
tra
tam
ento
hid
roté
rm
ico
1 Ca(NO3)2.4H2O e
(NH4)2HPO4.3H2O
Nas soluções
precursoras e ao
final da síntese
química
50 °C -**
50 °C -***
2 Ca(NO3)2.4H2O e
P2O5
Ao final da síntese
química T.A.
* -**
T.A.*
-***
3a Ca(NO3)2.4H2O e
K2HPO4.3H2O
Na solução
precursora de
fosfato e durante a
síntese química
T.A.*
Após
dissolução do
K2HPO4.3H2O
50 °C 150 °C
3b Ca(NO3)2.4H2O e
K2HPO4.3H2O
Na solução
precursora de
fosfato e durante a
síntese química
T.A.*
Após
dissolução do
K2HPO4.3H2O
50 °C 100 °C
3c Ca(NO3)2.4H2O e
K2HPO4.3H2O
Na solução
precursora de
fosfato e durante a
síntese química
T.A.*
Antes da
dissolução do
K2HPO4.3H2O
50 °C 100 °C
* - temperatura ambiente; ** - CTAB não foi utilizado; *** - não houve tratamento hidrotérmico
4.2- Funcionalização da matriz de HA com PVA e colágeno
A funcionalização de nanopartículas de HA com PVA completamente hidrolisado e
colágeno do tipo I foi realizada com base na literatura (BAKER et al., 2012a;
DEGIRMENBASI; KALYON; BIRINCI, 2006; FICAI et al., 2010; POURSAMAR et al.,
2010). Inicialmente, foi preparada uma solução com 7,3 % p/p de PVA em água Milli-Q®
sobre agitação vigorosa com temperatura de 90 °C durante 6 horas. Em seguida, 450 mg de
HA foram adicionados a 30 mL da solução de PVA e esse sistema foi mantido sobre agitação
com temperatura de 60 °C durante 4 horas. Após o resfriamento da solução de PVA/HA, uma
alíquota de 10 mL foi retirada do recipiente, centrifugada e o pó separado foi deixado em
40
estufa a 40 oC durante 24 horas para secar e ser armazenado para futuras caracterizações. Em
seguida, 600 mg de colágeno foram adicionados a 20 ml da solução de PVA/HA e esse
sistema foi mantido sobre agitação à temperatura ambiente durante 5 horas. A solução final
foi centrifugada e o pó separado nesse processo foi secado durante 24 horas em estufa a 40°C,
preservando assim a estrutura do colágeno.
4.3- Estudo do potencial de incorporação e liberação dos elementos ítrio e gadolínio
Os estudos de incorporação e liberação foram inicialmente conduzidos com os
isótopos estáveis dos elementos ítrio e gadolínio, sendo os compostos cloreto de ítrio (Cl3Y,
Sigma-Aldrich) e oxido de gadolínio (Gd2O3, Sigma-Aldrich) foram escolhidos como fonte
desses elementos, respectivamente.
O processo foi iniciado com o preparo de duas soluções, uma delas contendo cloreto
de ítrio e a matriz de hidroxiapatita funcionalizada com razão em peso de 1:3
(Y:PVA/COL/HA) e a outra solução contendo oxido de gadolínio e a matriz de hidroxiapatita
funcionalizada com a razão em peso de 1:3 (Gd:PVA/COL/HA). Estas soluções foram
mantidas sob agitação à temperatura ambiente durante 48 e 24 horas respectivamente. Em
seguida, as soluções foram filtradas através do sistema swinex com a utilização de membranas
de poros com diâmetros de 100 nm (Millipore). Os líquidos passantes foram analisados pelo
método de espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-
AES) utilizando-se o equipamento Spectroflame (Spectro Analytical Instruments, Alemanha)
para se determinar as quantidades de ítrio e gadolínio incorporadas no sistema hibrido
PVA/COL/HA. As amostras retidas nas membranas foram utilizadas para avaliar a cinética de
liberação dos isótopos incorporados na matriz funcionalizada de hidroxiapatita, para estimar a
estabilidade do sistema com relação ao teor dos elementos encapsulados. As nanoestruturas
contendo ítrio e gadolínio foram imersas em solução de SBF a temperatura de 37°C em
intervalos de tempo determinados (12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas). Após cada intervalo de
tempo, as amostras foram filtradas utilizando o sistema swinex descrito acima, e avaliadas por
ICP-AES quanto às massas de ítrio e gadolínio liberadas a partir das nanopartículas de
PVA/COL/HA.
41
4.4- Caracterizações morfológicas e físico-químicas das amostras
As técnicas de caracterização das amostras sem funcionalização foram realizadas após o
processo de calcinação das hidroxiapatitas e as amostras funcionalizadas foram caracterizadas
ao final do processo químico funcionalizante.
4.4.1- Difração de raios X (DRX)
A difração de raios X é uma técnica que permite identificar as fases cristalográficas
presentes em uma amostra através da análise dos ângulos de reflexão correspondentes aos
planos cristalográficos característicos do material. Essa técnica foi utilizada para avaliar as
fases cristalográficas presentes na amostra de hidroxiapatita mesoporosa sintetizada neste
trabalho e verificar a conformidade do material com base na literatura.
O difratograma de raios X da amostra de HA foi obtido utilizando-se um equipamento
TTRAX III (Rigaku Inc., Japão) com gerador de 18 kW e anodo de cobre (λ = 1.54 Ǻ),
operado com 40 kV e 30 mA, fazendo varredura de 4o/min entre os ângulos de (2θ) de 4
o e
80o. A amostra foi triturada em graal de ágata e colocada no porta-amostra do equipamento
realizando-se a técnica de compressão e raspagem do pó.
Dados da técnica de difratometria de raios X permitem estimar o tamanho (t) dos
cristalitos do material através da equação de Scherrer (equação 2) (SALIMI et al., 2012). Essa
equação relaciona o comprimento de onda (λ) dos raios X em nanômetros, o cosseno do
ângulo θ de difração e a largura a meia altura (FWHM – Full Width at Half Maximum) do
pico de maior intensidade no difratograma em radianos.
(2)
A difração de raios X ocorre segundo a Lei de Bragg (Equação 3), a qual estabelece a
relação entre o ângulo de difração e a distância entre os planos que a originaram
(característicos para cada fase cristalina):
2dsenθ = nλ (3)
Sendo d = distância interplanar (Å); θ = ângulo de difração; λ = comprimento de onda
42
dos raios X incidentes (radiação utilizada Kα = 1,5406 nm); n = número inteiro. A equação 3
foi utilizada para calcular as distâncias interplanares das amostras de HA sintetizadas.
4.4.2- Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR)
Para avaliar a composição química das amostras, espectros de FTIR foram obtidos
com sistema de pastilhas de brometo de potássio (KBr) à temperatura ambiente com um
espectrômetro Nicolet 6700 (Thermo Scientific, USA) de alcance entre 4000 – 400 cm-1
e
resolução de 4 cm-1
com 64 varreduras. As amostras foram preparadas com a proporção de
100:1 (KBr:amostra).
4.4.3- Análise Elementar de Carbono, Hidrogênio e Nitrogênio (CHN)
As análises elementares de carbono, hidrogênio e nitrogênio nas amostras foram
conduzidas no o equipamento CHNS/O EA 2400 (Perkin Elmer, USA) com o objetivo de
avaliar o processo de funcionalização das nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita com
PVA e Colágeno. Foram feitas três medidas de cada amostra e o valor final de cada elemento
analisado é a média dos resultados.
4.4.4- Análise Termogravimétrica (TGA)
A análise termogravimétrica foi realizada no equipamento DTG-60H (Shimadzu,
Japão) para investigar a estabilidade e ocorrência de transformações químicas nas amostras
durante tratamentos térmicos, sendo mais uma ferramenta para avaliar o processo de
funcionalização das nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita com PVA e Colágeno.
Aproximadamente 8,0 mg de cada amostra foi analisada nas seguintes condições: razão de
aquecimento de 20ºC.min-1, faixa de temperatura de 25 a 800ºC, atmosfera de N2 com fluxo de 20
mL.min-1 e célula de platina aberta.
4.4.5- Espectroscopia de correlação de fótons por espalhamento dinâmico da luz (DLS)
Foi avaliado o potencial Zeta, empregando-se a técnica de mobilidade eletroforética
das partículas. Todos estes ensaios foram conduzidos no equipamento Zetasizer Nano ZS
(Malvern Instruments, Inglaterra), um espectrômetro de correlação de fótons.
Para a realização das medidas, foram preparadas amostras com pH 6,5 e concentrações
de 0,1 mg/mL em água Milli-Q®. Em seguida, as amostras foram sonificadas com energia de
43
4 kJ para promover a desagregação das partículas. As medidas foram efetuadas à temperatura
de 25ºC com laser incidente apresentando ângulo de incidência de 179º em relação ao detector
(retroespalhamento). Para se determinar o ponto isoelétrico (PI), que corresponde ao valor de
pH responsável por originar um potencial zeta nulo, foram preparadas 7 soluções com
concentrações de 0,7 mg/mL, variando-se o pH (1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12), e as análises foram
realizadas nas mesmas condições citadas acima.
4.4.6- Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As imagens foram obtidas utilizando o microscópio eletrônico de transmissão Tecnai
G2-12 Spirit Biotwin (FEI Company, Japão) do Centro de Microscopia da UFMG. As
amostras foram preparadas em soluções de baixa concentração, sonicadas durante 7 minutos
em banho de ultrassom e gotejadas sobre uma grade-suporte de cobre de 300 mesh de malha
revestida de carbono.
Para obter informações sobre forma, tamanho médio e distribuição das partículas de
HA, foi realizado um estudo estatístico a partir das imagens de microscopia eletrônica de
transmissão, utilizando-se o software Quantikov (PINTO, 1996).
4.4.7- Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
O estudo morfológico da hidroxiapatita pura e dos sistemas híbridos PVA/HA e
PVA/COL/HA foi realizado por meio da microscopia eletrônica de varredura, utilizando-se o
microscópio eletrônico modelo Quanta 200 (FEI Company, Japão) do Centro de Microscopia
da UFMG. As amostras foram preparadas em soluções de baixa concentração, sonicadas
durante 15 minutos em banho de ultrassom, gotejadas sobre placas de silício e, após secarem,
metalizadas durante 20 segundos para receber uma fina camada de ouro.
4.4.8- Medidas de Adsorção de Nitrogênio
Os parâmetros de superfície e porosidade das amostras foram avaliados utilizando-se o
equipamento Autosorb iQ (Quantachrome, EUA). As amostras foram desgaseificadas durante
2 horas a 120ºC, antes de cada ensaio. O instrumento foi configurado para obter valores de
pressões relativas P/P0, (onde P é a pressão de trabalho e P0 é a pressão de vapor do gás na
temperatura utilizada) menores que 5.10-2
Torr, fornecendo mais de 70 valores de pressão
relativa em toda faixa da isoterma. A área superficial específica foi calculada pelo tradicional
método de Brunauer, Emmet e Teller (BET) usando os dados de adsorção na faixa de pressão
44
relativa de 0,05 a 0,35. O volume de poros foi estimado pela quantidade adsorvida a uma
pressão relativa de aproximadamente 0,99. O software AS Qwim v 2.0 da Quantachrome
Instruments foi utilizado para análise dos dados coletados.
4.5- Ativação neutrônica dos elementos ítrio e gadolínio
Os potenciais de ativação dos elementos ítrio e gadolínio através da reação
nuclear (n,γ) do cloreto de ítrio e óxido de gadolínio, foram calculados a partir de dados da
literatura (MENEZES; JAĆIMOVIĆ, 2006; ZANGIROLAMI, 2010) para ativação neutrônica
no reator nuclear TRIGA, conforme a Equação (1). Os valores das secções de choque para
nêutrons térmicos e integrais de ressonância para nêutrons epitérmicos do ítrio e do gadolínio
foram obtidos na literatura (NUCLEAR; COMMITTEE, 2003). A ativação do elemento ítrio
não foi possível devido a problemas operacionais, o laboratório de Radiobiologia do CDTN
não está licenciado para a manipulação do radioisótopo ítrio-90. Dessa forma, apenas o
elemento gadolínio foi submetido à ativação neutrônica no reator nuclear TRIGA.
Foi irradiada uma massa de 280 mg de óxido de gadolínio diluída em 5 mL de água
Milli-Q®, durante 2 horas na mesa giratória. Essa amostra foi retirada 18 horas após o término
da irradiação para aguardar o decaimento da atividade dos isótopos indesejáveis.
4.6- Ensaios preliminares de citotoxicidade in vitro
A atividade citotóxica das amostras foram avaliadas através do ensaio com o MTT, [3-
(4,5-dimetyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)], um sal de coloração amarela
capaz de captar elétrons em uma reação de oxirredução. O MTT forma cristais de coloração
roxa (Formazan) ao ser reduzido por enzimas desidrogenases de células metabolicamente
viáveis, essa reação está representada na Figura 4.05. Esses cristais são insolúveis em água e
apresentam pico de absorção em 570 nm (ISO 10993-5, 2009).
Os ensaios de citotoxidade foram conduzidos com a linhagem de células T98G de
glioblastoma cerebral humano cordialmente cedidas pela professora Raquel Gouvea do
laboratório de Radiobiologia do CDTN. Temos consciência de que essa linhagem de células
não é a ideal para se testar o efeito dos materiais em osteossarcomas. A linhagem de células
SAOS, provenientes de osteossarcoma humano, seria a ideal para esses estudos, mas, devido a
problemas operacionais, perdemos essa linhagem e não tivemos tempo de repor essas células
para o experimento. As células foram cultivadas em meio Dulbecco’s modified Eagle’s
(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de
45
N N
N+
N
C
S
N C
H3
C
H3
N N
H
N
N
C
S
N C
H3
C
H3
NAD+
NADH
FORMAZAM MTT
penicilina/estreptomicinaem, sendo incubadas em estufa (Cole Parmer) à temperatura de 37ºC
com 5% de CO2 e atmosfera úmida.
Figura 4.051- Desenho esquemático do MTT sendo reduzido pelas enzimas desidrogenasse
de células metabolicamente viáveis e dando origem ao Formazam.
Ao atingirem 80% de confluência, as células foram tripsinizadas para repique e a
contagem foi realizada com o auxílio de uma câmara de Neubauer e microscópio óptico. Em
seguida, as células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (1000 células por poço,
deixando duas colunas vazias para branco) e incubadas por 24 horas para aderência.
Decorrido esse tempo, diferentes concentrações das amostras foram adicionadas aos poços
com células aderidas e incubadas por 24 horas. Os tratamentos foram realizados com a
hidroxiapatita não funcionalizada (HA), com a hidroxiapatita funcionalizada (PVA/COL/HA),
com a amostra funcionalizada contendo o isótopo estável do gadolínio (PVA/COL/HA-Gd) e
com a hidroxiapatita funcionalizada contendo o radioisótopo 159
Gd incorporado
(PVA/COL/HA-159
Gd). Esses materiais foram testados em triplicata e em diferentes
concentrações.
Em seguida, as células foram novamente incubadas por mais 24 horas. Após este
tempo, os sobrenadantes foram descartados, o MTT (0,5 mg/mL) foi adicionado em todos os
poços e a placa foi novamente incubada durante 4 horas, ao abrigo da luz. Posteriormente, o
sobrenadante contendo MTT foi retirado e 100 µl de DMSO foram colocados em cada poço
para solubilizar os cristais de Formazan. As amostras foram medidas por espectrofotometria
em um leitor de microplaca UV-visível (Molecular Devices) a 570 nm. A fração de
sobrevivência foi calculada como porcentagem do controle (Absorbância no controle = 100%
de sobrevivência).
46
As alterações cromossômicas foram avaliadas pela técnica do DAPI (diidrocloreto de
4, 6-diamidino-2-fenindole), um corante fluorescente capaz de se ligar especificamente às
fitas duplas do DNA cromossômico (KUBOTA; KUBOTA; TANI, 2000). Para essa análise,
células, T98-G foram semeadas em placas de 96 poços e, após 24 h, foram tratadas com os
mesmos materiais que o teste de MTT. Após 24 horas de tratamento, as células foram lavadas
com PBS e fixadas em metanol gelado por 20 minutos. Após fixação, as células foram
lavadas novamente com PBS e incubadas por 30 minutos com DAPI (Sigma-Aldrich) na
concentração de 400 ng.mL-1
, diluído em PBS. Após o período de incubação, o sobrenadante
contendo DAPI foi retirado e as células foram lavadas cinco vezes com PBS. Os núcleos das
células corados com DAPI foram visualizados em microscópio de fluorescência invertido
(Nikon – Eclipse TS100 – CSHG 385-410nm) e fotografadas (Nikon - Coolpix 4500).
47
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1- Caracterizações das matrizes de hidroxiapatita sintetizadas pelas três rotas
5.1.1- Difração de raios X
O difratograma da hidroxiapatita pura sintetizada pela rota 3c está representado na
Figura 5.01, que revela a formação de uma única fase de HA hexagonal com grupo espacial
P63/m (arquivos JCPDS: 09-0432), sem picos característicos de impurezas. Esta análise
indica a produção de hidroxiapatita pura e mostra que a presença de CTAB não induziu a
cristalização de outras fases.
Figura 5.01- Difratograma de raios-X comparativo entre a amostra de hidroxiapatita
sintetizada pela rota 3c (acima) e um padrão dos arquivos JCPDS de entrada 9-432 (abaixo).
A Figura 5.02 apresenta um comparativo entre os difratogramas das cinco amostras
sintetizadas através das três rotas, onde podemos observar que as fases da hidroxiapatita
foram formadas na rota 1 e nas três variações da rota 3. Na rota 2, devido à formação de picos
não correspondentes à hidroxiapatita e à fraca intensidade dos picos referentes a esse material,
não podemos afirmar que HA pura tenha sido formada. A literatura sita o controle do pH
Ângulo 2θ
Inte
nsi
dad
e
Nanopartículas Mesoporosas de Hidroxiapatita
JCPDS: 9-432 Hydroxylapatite, syn
002
210
211
300
202 212
222
213 004
48
como um fator crucial na formação da hidroxiapatita (ZHANG; DARVELL, 2011).
Provavelmente, o baixo pH durante a síntese na rota 2 tenha desfavorecido à formação do
material de interesse, uma vez que o ajuste para pH 12 foi realizado apenas ao final do
gotejamento. A formação da HA pode ocorrer mediante fases precursoras intermediárias, que
apresentam existência transitória durante a etapa de obtenção; essas fases, dependendo das
condições utilizadas, podem ser detectadas quando o material sofre tratamentos térmicos e
influenciam na qualidade do produto final.
Figura 5.02- Difratogramas das cinco amostras de hidroxiapatita sintetizadas pelas rotas 1, 2
e 3.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Ângulo 2 (graus)
Rota 1
Rota 2
Inte
nsid
ade (
u. a.)
Rota 3a
Rota 3b
004
213222212202
300
211
Rota 3c
002
210
49
Os difratogramas apresentam um perfil composto de bandas largas que pode estar
associado a diferentes características do material: presença de cristais com dimensões
nanométricas, presença de defeitos na estrutura e baixa cristalinidade do pó formado.
O principal pico de difração característico da hidroxiapatita estequiométrica (211) está
localizado próximo ao ângulo 2θ de 32o (ZYMAN; ROKHMISTROV; GLUSHKO, 2012) e
pode ser observado nas cinco amostras, (Figura 5.02), embora menos definido e intenso na
amostra sintetizada pela rota 2. Este pico foi utilizado para o cálculo do tamanho de cristalito
pela Equação (1) e para o cálculo da distância interplanar pela Equação (2), com exceção da
rota 2 (para essa amostra foi utilizado seu pico mais intenso, 30,6°). A largura a meia altura
(FWHM) desses picos foi determinada com a utilização do software Origin 9 com base em
cálculos estatísticos e os resultados estão representados na Tabela 5.1.
Tabela 5.1- Resultados dos cálculos para tamanho de cristalito e distância interplanar.
Amostra FWHM Ângulo 2θ Tamanho do cristalito
(nm)
Distânicia interplanar
(Å)
Rota 1 1,6° 31,7° 5 ± 0,25 2,8
Rota 2 0,4° 30,6° 18 ± 0,90 2,9
Rota 3a 0,2° 31,7° 39 ± 1,95 2,8
Rota 3b 0,3° 32° 32 ± 1,60 2,8
Rota 3c 0,8° 32° 11 ± 0,55 2,8
Os tamanhos médios dos cristalitos variaram aproximadamente de 5 a 38 nm para as
diferentes rotas propostas. A temperatura na qual a precipitação se processa tem grande
importância na fase obtida e na conversão de uma em outra. O tamanho da partícula e a
morfologia também são influenciados pela temperatura. Comparando-se as três variações da
rota 3, pode-se perceber que a diferença de 50 °C na temperatura do tratamento hidrotérmico
entre as rotas 3a e 3b pouco influenciou no tamanho do cristalito dessas amostras,
considerando que essa foi a única diferença entre essas duas rotas. Dessa forma, para tentar
promover uma redução mais significativa no tamanho do cristalito, a temperatura de 100°C
foi mantida para tratamento hidrotérmico na rota 3c e a forma de preparo da solução
precursora de fosfato foi alterada pela ordem de dissolução do direcionador de rede, que
ocorreu antes da dissolução do monohidrogênio fosfato de dipotássio. Pode-se perceber que
essa alteração promoveu uma redução significativa no tamanho do cristalito, passando de 32
nm para 11 nm. Provavelmente, essa forma de preparo favoreceu ao direcionamento da rede
50
pela formação de um número maior de micelas, sem a influência dos íons fosfato presentes na
solução, o que poderia ter originado um número maior de sítios para formação dos núcleos de
hidroxiapatita (WANG et al., 2006b). Com um número maior de núcleos formados, o
crescimento dos cristalitos ficaria restrito devido à menor oferta de íons fosfato em solução.
No caso das partículas formadas pelas rotas 3a e 3b, percebe-se que durante o
envelhecimento, os cristais formados foram sujeitos a um processo de dissolução e
recristalização, no qual os cristais menores desapareceram em detrimento dos maiores, os
quais crescem mais rapidamente; em consequência disto, o número total de cristais pode
diminuir. O crescimento das partículas durante o envelhecimento comprova que a
precipitação continua mesmo após o gotejamento de todo o volume das soluções.
As partículas sintetizadas pela rota 1 apresentaram o menor tamanho de cristalito
dentre todas as rotas, possivelmente pela maior temperatura empregada no preparo das
soluções precursoras de cálcio e fosfato, que poderia ter favorecido à formação de um número
maior de núcleos em detrimento do crescimento dos cristalitos.
5.1.2- Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourier
Os espectros de FTIR foram obtidos para investigar a composição química das
amostras. A Figura 5.03 mostra o espectro de FTIR das nanopartículas de HA sintetizadas
pela rota 3c em acordo com a literatura (DEGIRMENBASI; KALYON; BIRINCI, 2006; MIR
et al., 2012; VERMA et al., 2013). Todos os padrões vibracionais dos grupos funcionais
característicos da hidroxiapatita podem ser observados (Tabela 5.2). A Figura 5.04 mostra de
forma esquemática os quatro modos vibracionais dos íons PO43-
. O ombro fraco, localizado
em 959 cm-1
, e o pico forte, situado em 1029 cm-1
, correspondem aos modos vibracionais de
estiramento ν3 e ν1 do fosfato, enquanto que o ombro em 474 cm-1
e os picos fortes em 563 e
603 cm-1
indicam a presença dos modos de flexão ν2 e ν4 deste grupo funcional (VERMA et
al., 2013). As bandas de absorção correspondentes ao grupo hidroxila da estrutura da
hidroxiapatita podem ser observadas em 3580 e 632 cm-1
e a banda larga observada entre
3237 e 3663 cm-1
pode ser atribuída aos modos de vibração da molécula H2O (MIR et al.,
2012). Também podem ser observados picos fracos relacionados à deformação angular e ao
estiramento de ligações C-O de íons carbonato em 881, 1416 e 1467 cm-1
(NETO, 2009;
VOHRA et al., 2008), sugerindo a formação de HA carbonatada.
51
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
1416
474
563
603
632
881
959
1029
1099
Tra
nsm
itância
(u. a.)
Número de onda (cm-1)
35801467
1645
14672358
29242850
Vibração C-O de CO2
do meio
Figura 5.03- Espectro de FTIR da amostra de hidroxiapatita pura, rota 3c.
Figura 5.04- Esquema dos quatro modos vibracionais dos íons PO43-
, = P e = O. Fonte:
(NGUYEN et al., 2013a)
959 cm-1 474 cm
-1 1029 e 1099 cm-1
603 e 563 cm-1
52
Tabela 5.2- Bandas de adsorção na região do infravermelho para hidroxiapatita.
Adaptado de (NETO, 2009)
Grupo funcional Tipo de vibração Frequência de vibração (cm-1
)
Deformação angular simétrica no plano ( ) 474
Deformação angular assimétrica no plano ( ) 563
Deformação angular assimétrica no plano ( ) 603
OH estrutural Dobramento fora do plano 632
Deformação angular assimétrica fora do plano ( ) 881
Estiramento simétrico ( 959
Estiramento assimétrico ( 1029
Estiramento assimétrico ( 1099
Estiramento assimétrico ( 1416
Estiramento assimétrico ( 1467
H2O adsorvida Deformação angular assimétrica fora do plano ( ) 1645
H2O adsorvida Estiramento simétrico 3012 a 3686
OH estrutural Estiramento 3569
Os espectros de FTIR das amostras sintetizadas pelas rotas 1, 2 e 3 (a, b e c) estão
representados na Figura 5.05; todos os picos de absorção referentes aos padrões vibracionais
da hidroxiapatita estão presentes nas cinco amostras. Entretanto, verificando a forte
intensidade do pico em torno de 1460 cm-1
(seta na Figura 5.05), referente aos íons
carbonatos, presente na amostra sintetizada pela rota 3a, pode-se afirmar que esta rota
favorece a formação de uma amostra mais carbonatada. A presença de íons carbonato na
estrutura promove distorções na rede cristalina da hidroxiapatita, criando microestresses e
defeitos nas suas proximidades, o que influencia muito a solubilidade do material. Uma
possível razão para incorporação desses íons na rede cristalina da HA é quando, em meio com
dióxido de carbono atmosférico (CO2) e água (H2O), ocorre a formação de certa quantidade
53
de ácido carbônico (H2CO3) e este se dissocia para formar íons (H+) e íons carbonato que, por
sua vez, podem atacar os componentes da HA, provocando a substituição nos sítios de OH
(carbonatação tipo A) ou íons fosfato (carbonatação tipo B) (NETO, 2009). A temperatura
mais elevada empregada no tratamento hidrotérmico da rota 3a pode ter favorecido ainda mais
à difusão dos íons carbonato pela rede da HA, permitindo a incorporação de uma maior
quantidade de íons carbonato nessa matriz quando comparada com as demais amostras.
Uma vez formada a molécula de H2CO3 em meio aquoso, esta se dissocia e os íons
CO32-
são retidos pelos íons Ca2+
na rede cristalina da hidroxiapatita, provocando a remoção
dos íons PO43-
ou de forma a ocupar esses sítios liberados. Em meio básico, devido à
presença de NaOH, os íons H+ são neutralizados e liberam íons Na
+ na rede que, por sua vez,
são neutralizados pelos íons PO43-
provocando a formação de que sai da rede durante
o processo de lavagem. As reações a seguir representam esse processo.
(4)
(5)
(6)
(7)
Nos espectros das amostras funcionalizadas com o direcionador de rede CTAB da
Figura 5.05, observam-se bandas de pequena intensidade na região de 2950 e 2850 cm-1
,
indicando a permanência de resquícios das moléculas deste direcionador presentes nas
hidroxiapatitas mesoporosas.
54
Figura 5.05- Espectros de FTIR das amostras sintetizadas pelas rotas 1, 2 e 3
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm-1)
Rota 1
Rota 2
Inte
nsi
da
de
Rota 3a
Rota 3b
Rota 3c
55
5.1.3- Medidas de Adsorção de Nitrogênio
Esta técnica de caracterização é de extrema importância para os materiais
mesoporosos. Ela determina as propriedades de adsorção do material, já que este é um
fenômeno superficial. O conceito de superfície compreende não só a superfície externa do
material, mas também a superfície interna das cavidades e canais dos poros, sempre que
estiverem livres ao acesso, em seu interior, às moléculas de nitrogênio que são empregadas
para estas medidas.
As isotermas de adsorção de nitrogênio das cinco amostras de hidroxiapatita
sintetizadas pelas três rotas estão representadas na Figura 5.06 e os resultados das análises de
superfície estão representados na Tabela 5.3. O perfil das isotermas de adsorção e a histerese
fornecem informações a respeito da textura do material. As histereses indicam que o material
apresenta poros, podendo ser microporoso quando a histerese ocorre a baixas pressões
parciais e mesoporoso, a altas pressões parciais. Ela resulta da diferença entre o mecanismo
de condensação e evaporação do gás adsorvido e seu formato determina a geometria dos
poros. As amostras exibem isoterma do tipo IV, características de materiais mesoporosos,
com contribuição de microporos. Entretanto, observa-se que a quantidade de microporos é
desprezível em relação a de mesoporos, pois a baixos valores de pressão parcial relativa
(P/P0), o volume de gás adsorvido é extremamente baixo. A diferença entre as várias
isotermas das Figuras 5.06 e 5.09 está na variação do volume máximo de gás adsorvido. Este
volume está relacionado com a capacidade máxima de adsorção do sólido (P/P0) sendo esta
associada diretamente à quantidade total de poros existentes. Exibem um loop de histerese do
tipo H3, conforme classificação da IUPAC e em boa concordância com a literatura (WU et
al., 2012), que é frequentemente relacionado com agregados de partículas do tipo placa,
responsável pelo aumento de poros de forma de corte. O ponto P/P0 de inflexão entre 0,8 e 0,9
confirma esta característica estrutural de poros. Analisando a Figura 5.06, observa-se um
dramático decréscimo do volume de N2 adsorvido nas amostras das rotas 2, 3a e 3b quando
comparadas com as amostras das rotas 1 e 3c. Essa observação indica que as amostras das
rotas 1 e 3c possuem maior área superficial e volume de poros, que podem ser confirmados
pelos resultados obtidos pelo método BET.
56
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Vo
lum
e a
dso
rvid
o (
cm
-1/g
)
Pressão relativa (P/P0)
Rota 1
Rota 2
Rota 3a
Rota 3b
Rota 3c
Figura 5.06- Isotermas de adsorção de nitrogênio das cinco amostras de hidroxiapatita
sintetizadas.
A Tabela 5.3 apresenta os resultados obtidos das medidas de adsorção de N2, que
mostram as diferenças nos valores da área superficial específica (SBET), volume de poros (Vp)
e diâmetro de poros (Dp) para as amostras investigadas. Uma diferença considerável nos
valores de área superficial específica foi observada entre as amostras, que tiveram variações
de 6 a 56 m2/g. Com relação ao volume de nitrogênio adsorvido, pode ser verificado que as
alterações nas rotas apresentaram uma influencia significativa neste parâmetro, em até nove
vezes, passando de 0,01 na rota 3a para 0,09 na rota 3c. Além disso, é possível observar um
significativo aumento no valor de Dp para as amostras obtidas na rota 3c, em comparação às
demais, variando de 3 nm para 18 nm.
57
Tabela 5.3- Resultados das análises de Adsorção de Gases das amostras de HA
sintetizadas pelas três rotas
Parâmetros de superfície
Material Área superficial
específica (m2/g)
Diâmetro de
poro (nm)
Volume de poros
(cm3/g)
Rota 1 52 3 0,07
Rota 2 14 4 0,02
Rota 3a 6 3 0,01
Rota 3b 18 3 0,02
Rota 3c 56 18 0,09
Assim, pode ser observada uma considerável diferença entre os resultados das
amostras sintetizadas pela rota 3, possivelmente causada pela forma em que o direcionador de
rede foi dissolvido no momento da síntese. Os maiores parâmetros de superfície foram
observados para a amostra sintetizada pela rota 3c, que teve o CTAB completamente
dissolvido antes da dissolução do fosfato de potássio, diferentemente das rotas 3a e 3b onde
essa ordem foi invertida. O procedimento da rota 3c pode ter favorecido a um melhor
direcionamento da rede pela formação de um número maior de micelas com uma maior taxa
de crescimento, o que explicaria o maior volume e diâmetro de poros encontrados nessa
amostra. Dessa forma, os íons fosfato, acrescentados após a completa dissolução do CTAB,
ocupariam as bordas das micelas previamente formadas, onde a nucleação e o crescimento
dos cristais de HA começariam a partir desses sítios durante o gotejamento da solução
precursora de cálcio, conforme o esquema representativo do mecanismo de formação da HA
mostrado na Figura 5.07 (NGUYEN et al., 2013b). Primeiro, o CTAB forma micelas em
forma de haste, quando em solução aquosa de elevado pH (12). Subsequentemente, as micelas
em forma de haste reagem com o primeiro precursor (K2HPO4.3H2O) para se obter o produto
intermediário com a fórmula composta pelo surfactante com carga positiva e a espécie
inorgânica com carga negativa. Na etapa seguinte, esse produto intermediário interage com o
segundo precursor (Ca(NO3)2.4H2O) para formar os nanobastões. A ligação entre o CTAB e o
precursor de fósforo provavelmente foi quebrada durante o tratamento hidrotérmico, e as
moléculas de CTAB foram, em seguida, removidas por calcinação. A presença de ligações
C-H na região entre 2980 e 2800 cm-1
observada nos resultados de FTIR indica que ainda
resta algum surfactante residual na amostra. Neste sentido, nanobastões de HA podem ser
formados em temperatura relativamente baixa com a assistência das moléculas de CTAB
utilizadas como direcionadores de rede.
58
A rota 1 forneceu uma amostra com volume de poros e área superficial compatíveis
com a amostra sintetizada pela rota 3c, mas com um diâmetro de poros bem menor, que
poderia ser explicado pela ausência de um direcionador de rede nessa rota.
Os resultados fornecidos pela análise de adsorção de gases indicaram que as amostras
obtidas pela rota 3c apresentam características mais adequadas para o objetivo do presente
trabalho, ou seja, a presença de maiores área superficial e volume de poros, bem como
tamanho de poros adequado para a incorporação de compostos funcionalizantes e os
radioisótopos propostos. Neste sentido, esta amostra foi selecionada para o prosseguimento da
pesquisa, sendo então funcionalizada com PVA e colágeno e avaliada em relação ao potencial
de incorporação e cinética de liberação dos elementos gadolínio e ítrio.
Figura 5.07- Mecanismo da formação das nanopartículas de hidroxiapatita pela formação de
micelas do CTAB. Adaptado de (NGUYEN et al., 2013a).
59
5.2- Caracterizações das amostras funcionalizadas
5.2.1- Adsorção de Gases
As isotermas de adsorção de nitrogênio das nanopartículas de hidroxiapatita não
funcionalizada e das amostras funcionalizadas estão representadas na Figura 5.08 e os
resultados das análises superficiais e calculados pelo método BET, estão representados na
Tabela 5.4. É importante observar que a forma da isoterma de adsorção não é alterada pela
incorporação superficial tanto do colágeno como do PVA, uma vez que as amostras
mantiveram as características de isoterma do tipo IV com um loop de histerese do tipo H3
apresentado pela hidroxiapatita pura; entretanto pode ser observada uma dramática redução do
volume de N2 adsorvido quando comparamos progressivamente as amostras HA, PVA/HA e
PVA/COL/HA. Essa observação indica que o processo de funcionalização foi bem sucedido
porque podemos observar uma redução gradual de volume e diâmetro de poros calculados
para as amostras funcionalizadas, possivelmente causado pelo recobrimento do PVA sobre a
HA e, depois, do colágeno sobre as nanopartículas de PVA/HA, conforme dados da Tabela
5.4. O mesmo comportamento ocorre no caso da área superficial, uma vez que os espaços
livres disponíveis foram parcialmente ocupados com os agentes funcionalizantes.
Figura 5.08- Curva de isoterma do estudo de adsorção de N2 nas nanopartículas mesoporosas
de hidroxiapatita, do sistema PVA/HA e do sistema PVA/COL/HA
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0
20
40
60
80
100
Vo
lum
e a
dso
rvid
o (
cm
3/g
)
Pressão relativa (P/P0)
HA
PVA/HA
PVA/COL/HA
60
Tabela 5.4- Resultados das análises de BET para as amostras funcionalizadas.
Parâmetros de superfície
Material Área superficial
específica (m2/g)
Diâmetro de
poro (nm)
Volume de poros
(cm3/g)
HA 56 18 0,09
PVA/HA 34 15 0,06
PVA/COL/HA 13 15 0,02
5.2.2- Difração de Raios X
A Figura 5.09 mostra um comparativo entre os difratogramas do sistema
PVA/COL/HA (a), da HA pura (b) e do PVA puro (c). Pode-se observar que o poli (álcool
vinílico) e o colágeno não deslocam os picos de difração característicos da hidroxiapatita e
não destorcem a estrutura cristalográfica desse material, indicando que o sistema híbrido
mantém as propriedades estruturais da fase HA, favorecendo a aplicação proposta para o
material do presente trabalho. Entretanto, pode-se observar a presença de um novo pico de
difração na amostra híbrida quando comparada com a amostra de HA pura, no ângulo 2θ de
9,42° (seta na Figura 5.09-a). Esse pico indica um processo de funcionalização bem sucedido
com PVA, considerando que este material apresenta cristalização, embora o seu pico
característico seja no ângulo de 20º (2θ). Uma hipótese para o surgimento desse novo pico na
matriz PVA/COL/HA é a formação de uma ligação entre o poli (álcool vinílico) e o colágeno,
resultando em uma nova fase cristalina, como sugerido na literatura (ASRAN; HENNING;
MICHLER, 2010b; SONG et al., 2012a).
61
Figura 5.09- Difratograma comparativo entre a amostra de HA pura, do PVA puro e do
sistema híbrido PVA/COL/HA
5.2.3- Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourier
O sucesso do processo de funcionalização foi avaliado, também, por comparação entre
os espectros de FTIR da HA pura, do PVA puro, do colágeno puro e do sistema híbrido
PVA/COL/HA, como mostrado nas Figuras 5.10, 5.11 e 5.12. O espectro do colágeno (Figura
5.10 (b)) mostra bandas de absorção para amina I (C=O) em 1660 cm-1
e os grupos de amina
II e III, em 1449, 1388 e 1239 cm-1
; o pico em 1529 cm-1
está associado com o alongamento
da ligação C-N de aminas I e II (DEGIRMENBASI; KALYON; BIRINCI, 2006). Os picos do
colágeno puro são repetidos no espectro de FTIR do sistema híbrido PVA/COL/HA e não são
encontrados no espectro da HA pura (Figura 5.10 (d) e (c) respectivamente), indicando que o
processo de funcionalização foi bem sucedido. A Figura 5.10 (a) mostra a presença de picos
de absorção a 869, 663 e 420 cm-1
para o PVA. Comparando-se os espectros de FTIR em
escala expandida (Figuras 5.11 e 5.12) pode ser observado que alguns modos vibracionais
característicos, em 3676, 668, 451 e 424 cm-1
, presentes no PVA e no colágeno, são
observados também na amostra PVA/COL/HA em intensidades mais baixas e não são
observados na hidroxiapatita pura, fornecendo um novo indicativo de que o processo de
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Ângulo 2
PVA
HA
004
213222212202
300
211
210
c)
b)
Inte
nsid
ade
PVA/COL/HAa)
002
62
funcionalização foi bem sucedido tanto para o PVA quanto para o colágeno. No entanto, não
foram observadas todas as vibrações características dos grupos funcionalizantes, porque
alguns modos de vibração do PVA puro e do Colágeno puro ocorreram no mesmo intervalo
dos modos vibracionais da HA.
Figura 5.10- Espectros de FTIR para PVA puro (a), Colágeno puro (b), hidroxiapatita pura
(c) e para o sistema híbrido PVA/COL/HA.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm
-1)
PVA/Col/HA
HA pura
d)
c)
b)
Tra
nsm
itânic
a (
u. a.)
Colágeno puro
1660
1529
1449
1388
1239
869
420
663
PVA puroa)
63
Figura 5.11- Espectro de FTIR comparativo entre as amostras puras e a amostra do sistema
híbrido PVA/COL/HA em escala expandida no intervalo de 725 a 400 cm-1
.
Figura 5.12- Espectro de FTIR comparativo entre as amostras puras e a amostra do sistema
híbrido PVA/COL/HA em escala expandida no intervalo de 3700 a 3500 cm-1
.
3700 3650 3600 3550 3500
Tra
nsm
itância
(u. a.)
Número de onda (cm-1)
HA pura
Colágeno puro
PVA puro
PVA/Col/HA
3676
700 650 600 550 500 450 400
Tra
nsm
itânc
ia (
u. a
.)
Número de onda (cm-1)
HA pura
Colágeno puro
PVA puro
PVA/Col/HA
669
450
425
64
5.2.4- Análise Elementar de Carbono, Hidrogênio e Nitrogênio
A análise de CHN foi utilizada para avaliar o processo de funcionalização da matriz
mesoporosa de nanopartículas de hidroxiapatita com PVA e colágeno. A avaliação foi
conduzida através da comparação entre as análises das amostras de HA pura, PVA/HA e
PVA/COL/HA quanto às diferenças no teor de carbono, hidrogênio e nitrogênio dessas
amostras. Os resultados estão representados na Tabela 5.5.
Tabela 5.5- Resultados da análise elementar de CHN
Amostra Percentual de
Carbono
ΔC Percentual de
Hidrogênio
ΔH Percentual de
Nitrogênio
HA 0,538 ± 0,001 - 0* - 0
*
PVA/HA 4,662 ± 0,132 4,124 0,909 ± 0,049 0,909 0*
PVA/COL/HA 10,866 ± 0,132 6,204 1,853 ± 0,031 0,904 1,280 ± 0,084
* Leituras abaixo do limite de detecção do equipamento (0,3%) são consideradas valores nulos.
A hidroxiapatita, como um fosfato de cálcio, não apresenta os elementos carbono,
hidrogênio e nitrogênio em sua estrutura. Entretanto, o espectro de FTIR da amostra de HA
revelou a presença de íons carbonato na estrutura sintetizada, que pode ser confirmado pela
análise de CHN em valores muito baixos de carbono (0,538%). Ainda, estes valores podem
estar relacionados com a presença de surfactante residual, conforme resultados anteriores. O
poli (álcool vinílico) apresenta a relação de 1:2 de átomos de carbono para átomos de
hidrogênio em seu monômero (Figura 3.07 B); a análise de CHN confirma a presença desse
material no sistema funcionalizado PVA/HA, observando os aumentos nos percentuais de
carbono e hidrogênio nessa amostra em relação à amostra de HA pura (0,538% para 4,662%
de carbono e 0 para 0,909% de hidrogênio). O colágeno é uma proteína que apresenta
carbono, hidrogênio e nitrogênio em sua estrutura e, com base nessa informação, pode-se
inferir que o processo de funcionalização foi bem sucedido tanto para o colágeno quanto para
o PVA quando comparamos os percentuais desses elementos entre as três amostras, já que o
percentual de carbono sobe de 0,538% na amostra de HA e 4,662% na amostra de PVA/HA
para 10,866% na amostra PVA/COL/HA, o percentual de hidrogênio sobe de valores nulos
em HA e 0,909% em PVA/HA para 1,853% em PVA/COL/HA e, principalmente no caso da
introdução do colágeno na estrutura, um percentual de nitrogênio que só pode ser observado
no sistema PVA/COL/HA (1,280%).
65
5.2.5- Análise Termogravimétrica
A Figura 5.13 mostra os resultados da análise termogravimétrica e suas derivadas das
amostras de HA pura, PVA/HA e PVA/COL/HA. A hidroxiapatita apresenta uma estrutura
termicamente estável que pode ser confirmada por essa análise, uma vez que não ocorrem
perdas de massa significativas com a amostra de HA pura com o aumento da temperatura.
Como materiais orgânicos poliméricos, o colágeno e o PVA são degradados quando
submetidos a temperaturas na faixa de 200 a 750 °C e 210 a 540 °C, respectivamente
(ASRAN; HENNING; MICHLER, 2010a). Observando o comportamento dos sistemas
PVA/HA e PVA/COL/HA, podem-se perceber significativas perdas de massa dentro da faixa
de degradação dos polímeros. As perdas iniciais até a temperatura de 150 °C podem ser
atribuídas à saída de moléculas de água fracamente ligadas às estruturas por fisissorção. O
sistema funcionalizado apenas com o poli (álcool vinílico) apresentou menor perda de massa
do que o sistema funcionalizado com as duas substâncias, como pode ser observado através
das derivadas que confirmam a existência e a diferença entre essas perdas de massa pela
diferença de intensidade entre os picos em torno de 200°C e 300°C respectivamente. Como o
colágeno foi acrescentado posteriormente ao sistema, esse resultado fornece um novo
indicativo de que o processo de funcionalização foi bem sucedido para tanto para o PVA
quanto para o colágeno. As perdas de massa calculadas a partir das análises
termogravimétricas estão demonstradas na Tabela 5.6.
Tabela 5.6- Resultados da Análise Termogravimétrica - porcentagem de perda de massa
em função da temperatura.
Amostra
Perdas de massa (%) Massa final (%)
50 – 150 °C 150 - 650 °C 650 - 800°C
HA 1,5 0,1 97,8
PVA/HA 2,1 8,4 89,1
PVA/COL/HA 4,3 23,6 68,8
66
200 400 600 800
65
70
75
80
85
90
95
100
105
HA pura
PVA/COL/HA
PVA/HA
Derivada PVA/HA
Derivada PVA/COL/HA
Temperatura (oC)
Pe
rda
de
ma
ssa
(%
)
0.0000
-0.0002
-0.0004
-0.0006
-0.0008
-0.0010
-0.0012
-0.0014
-0.0016
dm
/dT
(mg
/oC
)
Figura 5.13- Curvas de TGA e DTG das amostras de HA pura e dos sistemas híbridos
PVA/HA e PVA/COL/HA.
5.2.6- Espectroscopia de Correlação de Fótons por Espalhamento Dinâmico da Luz
Para suspensões de nanopartículas em água, o potencial Zeta (Figura 5.14) indica a
diferença de potencial eléctrico entre o meio de dispersão e a fase estacionária do fluido
circundante ligado à partícula dispersa (ARAMWIT et al., 2010). O potencial Zeta pode ser
relacionado com a estabilidade das dispersões, indicando o grau de repulsão entre partículas
adjacentes. Para nanopartículas que são suficientemente pequenas, um elevado potencial Zeta
(negativo ou positivo) confere estabilidade quanto a floculações, ou seja, as partículas irão
resistir à agregação. Quando o potencial é baixo, a atração excede a repulsão e as partículas
tendem a uma agregação. Um valor de 25 mV (positivo ou negativo) pode ser tomado como
o valor arbitrário que separa as superfícies de baixa carga das superfícies de alta carga
(DOOSTMOHAMMADI et al., 2012). Tratando-se de uma formulação para bioaplicações de
longa circulação sanguínea, a estabilidade do coloide é fundamental para evitar floculações
que possam alterar a dispersão do material e favorecer a neutralização das nanopartículas pelo
sistema fagocitário. Os principais fatores que afetam o potencial Zeta de nanopartículas em
67
suspenção estão relacionados com as características elétricas do meio de dispersão e com o
pH da suspenção (MALVERN, 2009).
Figura 5.14- Esquema representativo do potencial Zeta de nanopartículas. Fonte:
(MALVERN, 2009).
Para a investigação do ponto isoelétrico (PI) das amostras de hidroxiapatita pura e
funcionalizada, foram montadas as curvas do potencial Zeta em função do pH (Figuras 5.15 e
5.16). Pode ser observado nesses gráficos que o PI corresponde ao pH 3,6 para a amostra não
funcionalizada e 3,3 para a amostra funcionalizada. Este resultado diverge um pouco em
relação à literatura, que cita valores positivos de potencial zeta para soluções ácidas e
potenciais negativos para meios neutros e básicos (DOOSTMOHAMMADI et al., 2012). A
divergência entre esses resultados tem duas possíveis explicações, a forma de obtenção da HA
(considerando que Doostmohammadi e colaboradores obtiveram HA derivada de ossos) e o
meio de dispersão utilizado para o ensaio. Dessa forma, pH em torno de 12 seria ideal para
formulações com esses materiais.
68
0 2 4 6 8 10 12 14-30
-20
-10
0
10
3,3
pH
Po
ten
cia
l Z
eta
(m
V)
0 2 4 6 8 10 12 14-30
-20
-10
0
10
20
3,6
pH
Po
ten
cia
l Z
eta
(m
V)
Figura 5.15- Curva pH x Potencial zeta para a amostra de hidroxiapatita.
Figura 5.16- Curva pH x Potencial zeta para a amostra de hidroxiapatita funcionalizada.
5.2.7- Microscopia Eletrônica de Transmissão
Para avaliar a morfologia, o tamanho e a porosidade das partículas de hidroxiapatita
sintetizadas, a microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada como ferramenta de
imagem. A Figura 5.17 mostra duas imagens de MET para a amostra de HA, onde podem ser
observadas nanopartículas porosas em forma de bastão em perfeito acordo com a literatura
(MIR et al., 2012; VERMA et al., 2013) e monodispersas. Utilizando-se o software Quantikov
(PINTO, 1996), foi realizada uma análise estatística da distribuição de tamanho de partículas
e os resultados dessa análise estão representados nos histogramas da Figura 5.18, onde
podemos observar partículas com tamanho médio de 78,23 ± 19,43 nm de comprimento e
69
10-14
15-19
20-24
25-29
30-34
35-40
40-50
0
10
20
30
40
50
Faixas de diâmetro (nm)
Nú
me
ro
de
pa
rtí
cu
las
30-39
40-49
50-59
60-69
70-09
80-89
90-99
100-109
110-119
120-129
130-139
140-149
150-159
160-170
0
4
8
12
16
20
Faixas de com prim ento (nm )
Nú
me
ro
de
pa
rtí
cu
las
18,99 ± 3,96 nm de diâmetro. Considerando a faixa ideal para tratamento do câncer pelo
efeito EPR, de 10 a 500 nm (TORCHILIN, 2007), as imagens da MET revelaram que a
hidroxiapatita sintetizada apresenta a distribuição de tamanho ideal para esse tipo de
tratamento. Outra característica importante dessas partículas se refere à porosidade revelada
tanto pela MET quanto pela técnica de adsorção de N2, que favorece à incorporação de
agentes como os radioisótopos propostos nesse trabalho.
Figura 5.17- Imagens da microscopia eletrônica de transmissão da amostra de hidroxiapatita
Figura 5.18- Histogramas da distribuição de tamanho de partículas de hidroxiapatita, à
esquerda para o comprimento e à direita para o diâmetro dos bastões.
70
5.2.8- Microscopia Eletrônica de Varredura
Imagens de microscopia eletrônica de varredura (Figura 5.19) das amostras de
hidroxiapatita pura, do sistema PVA/HA e do sistema PVA/COL/HA foram obtidas para
conduzir estudos morfológicos e avaliar possíveis alterações estruturais causadas pelo poli
(álcool vinílico) e pelo colágeno. Pode-se observar a morfologia de bastões das nanopartículas
de hidroxiapatita monodispersas (Figura 5.19 a e b) em acordo com as imagens da MET, além
disso, a presença de aglomerados da ordem de 500 nm pode ser notada nessas imagens, o que
é um comportamento típico de nanoparticulas de HA (LÓPEZ-MACIPE et al., 1998;
POURSAMAR; AZAMI; MOZAFARI, 2011). A avaliação das imagens dos sistemas
PVA/HA e PVA/COL/HA (Figura 5.19 c e d, respectivamente) revela que tanto o poli (álcool
vinílico) quanto o colágeno não alteram a morfologia das nanopartículas, mas altera o estado
de agregação do material, aumentado o tamanho dos aglomerados.
Figura 5.19- Imagens da microscopia eletrônica de varredura da amostra de hidroxiapatita
pura (a e b), do sistema PVA/HA (c) e do sistema PVA/COL/HA (d).
a b
c d
71
HA PVA/COL/HA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
44 %
100 %100 %
Per
cent
ual d
e in
corp
oraç
ão (
%)
Ítrio
Gadolínio
73 %
0 20 40 60 80 100 120
0,000
0,001
0,002
0,000
0,001
0,002
0,000
0,001
0,002
0,000
0,001
0,002
Tempo (h)
PVA/COL/HA-Gd
HA-Gd
PVA/COL/HA-Y
HA-Y
Teo
r de
libe
raçã
o (m
g/m
L)
5.3- Estudo do potencial de incorporação e cinética de liberação de radioisótopos
O potencial de incorporação e a cinética de liberação dos elementos ítrio e gadolínio
nas matrizes de HA e PVA/COL/HA foram avaliados pela técnica de ICP-AES. No estudo do
potencial de incorporação, a leitura realizada por essa técnica permite quantificar a massa não
incorporada dos elementos durante o processo. Já para o estudo da cinética de liberação, essa
análise permite calcular a massa dos elementos que é desprendida da matriz. Os resultados
dessa análise estão representados nas Figuras 5.20 e 5.21 respectivamente.
Figura 5.20- Resultados do estudo do potencial de incorporação de gadolínio e ítrio nas
matrizes de HA e PVA/COL/HÁ
Figura 5.21- Resultados do estudo da capacidade de retenção de gadolínio e ítrio nas matrizes
de HA e PVA/COL/HA. Valores abaixo do limite de detecção do método (2,0x10-4
mg/mL)
são considerados nulos.
72
Para incorporação do elemento ítrio, cada solução foi preparada em um volume de 25
mL, dessa forma podemos calcular que uma massa de 147,5 mg de ítrio não foi incorporada
na matriz de HA e que o seu potencial de incorporação nessa matriz, sabendo que 540 mg
desse elemento foram adicionados no processo de incorporação, é de 72,69% (a massa desse
elemento representa 68,56% da formulação final). Para a matriz funcionalizada, seguindo o
mesmo raciocínio acima, o potencial de incorporação foi de 44,44% e a massa de ítrio nessa
formulação representa 57,14%. Esses resultados mostram que é possível incorporar uma
quantidade significativa do elemento ítrio tanto na matriz de HA quanto na matriz
funcionalizada PVA/COL/HA que apresentou menor potencial de incorporação,
possivelmente devido às alterações dos parâmetros superficiais causados durante o processo
de funcionalização como mostrou o ensaio de adsorção de gases. Os estudos da cinética de
liberação demonstram que ambos os materiais analisados apresentam grande estabilidade para
retenção do elemento ítrio, uma vez que em todas as leituras realizadas pela técnica de ICP-
AES não foram detectados níveis significativos desse elemento nos sobrenadantes,
credenciando o material PVA/COL/HA-Y para estudos in vitro.
Para o elemento gadolínio, os resultados indicam um potencial de incorporação de
100% tanto para a amostra de HA pura quanto para a funcionalizada, uma vez que não foram
detectadas quantidades significativas desse elemento nos líquidos passantes no processo de
filtração. O gadolínio representa 75% da massa da formulação final, indicando que as
nanopartículas de hidroxiapatita podem incorporar grandes atividades do radioisótopo
gadolínio-159. Da mesma forma que o ítrio, o gadolínio não é liberado da matriz de HA,
considerando os intervalos de tempo testados no estudo da cinética de liberação.
Os materiais nanoestruturados se acumulam nos tumores pelo efeito EPR devido
basicamente a dois fatores, porosidade aumentada nos tecidos tumorais que favorece à entrada
dos nanomateriais e ausência ou carência de drenagem linfática que impede a saída desses
materiais. Dessa forma, a liberação de radioisótopos a partir das matrizes nanoestruturadas
não é um efeito desejável, uma vez que, estando fora das nanopartículas, os radioisótopos
poderiam deixar os tecidos tumorais e entrar em tecidos sadios. Assim, a retenção dos
elementos ítrio e gadolínio, observada nas nanopartículas de hidroxiapatita, são as
características ideais para os processos seguintes desse trabalho, ativação neutrônica do
elemento gadolínio e os testes de biocompatibilidade e citotoxidade.
73
5.4- Ativação neutrônica dos elementos ítrio e gadolínio
5.4.1- Potencial de ativação do ítrio
O potencial de ativação neutrônica do ítrio foi calculado pela equação (1), conforme
descrito no Capítulo 3.
(1)
Com dados obtidos da literatura (NUCLEAR; COMMITTEE, 2003;
ZANGIROLAMI, 2010), foi possível estimar a atividade induzida no ítrio contido no
composto cloreto de ítrio. A Tabela 5.8 apresenta as variáveis e a atividade teórica calculada
para o ítrio-90.
Tabela 5.7- Variáveis utilizadas no cálculo da ativação do ítrio.
Variável Valores
A 130,8 MBq (3,51 mCi)
N 4,1E20
ΦTH (Tubo central) 2,8E12 n∙cm-1
∙s–1
σTH 1,28E-24 cm2
ΦEPI (Tubo central) 2,6E11 n∙cm–1
∙s–1
Iγ 1E-24 cm2
T1/2 64,1 horas
TIR 8 horas
A atividade teórica de 3,51 mCi, Tabela 5.8, foi calculada considerando a ativação de
uma massa de 60 mg de ítrio-89 (que corresponde a 45,5% de 131,9 mg de Cl3Y), quantidade
necessária para formulações em testes de citotoxicidade.
O potencial de incorporação do ítrio é de 44% numa razão em peso de 1:3 na matriz de
PVA/COL/HA, de acordo com resultados do ICP-AES. Considerando que este potencial de
incorporação do ítrio seja o mesmo para o seu radioisótopo, é possível obter uma atividade de
1,56 mCi em 20 mg de HA funcionalizada. Conforme descrito na metodologia, as limitações
de licenciamento no Laboratório de Radiobiologia impediu que os experimentos fossem
realizados com este material. Contudo, informações obtidas a partir dos dados teóricos e com
74
base nos experimentos de incorporação indicam a potencialidade deste sistema para ser
utilizado com agente de tratamento para osteossarcomas.
5.4.2- Ativação do gadolínio
Seguindo a metodologia para cálculo da ativação do ítrio a partir da equação (1), a
Tabela 5.9 apresenta as variáveis e a atividade teórica calculada para o gadolínio-159.
Tabela 5.8- Variáveis utilizadas no cálculo da ativação do gadolínio.
Variável Valores
A 73,83 MBq (1,99 mCi)
N 2,23E20
ΦTH (mesa giratória) 6,3E11 n∙cm-1
∙s–1
σTH 2.28E-24 cm2
ΦEPI (mesa giratória) 4,4E10 n∙cm–1
∙s–1
Iγ 73E-24 cm2
T1/2 18,56 horas
TIR 2 horas
Uma massa de 280 mg de óxido de gadolínio (que corresponde a aproximadamente
243 mg de gadolínio) diluída em 5 mL de água Milli-Q® foi enviada ao Departamento de
Técnicas Nucleares do CDTN para o processo de ativação neutrônica no reator TRIGA, onde
foi induzida uma atividade na ordem de 2 mCi. A amostra irradiada ficou retida durante um
tempo de meia-vida do gadolínio-159 (aproximadamente 18 horas) para que ocorresse o
decaimento da atividade induzida em contaminantes como o sódio, que poderiam influenciar
no experimento. Nesse contexto, a atividade de 1 mCi foi utilizada para o processo de
incorporação do radioisótopo 159
Gd na matriz de PVA/COL/HA. Como o Laboratório de
Radioquímica, anexo ao Departamento de Técnicas Nucleares do CDTN, está passando por
processo de licenciamento e não está operante, a atividade induzida na amostra não pode ser
aferida.
O potencial de incorporação do gadolínio é de 100% numa razão em peso de 1:3 na
matriz de PVA/COL/HA, de acordo com resultados do ICP-AES. Considerando que este
potencial de incorporação do gadolínio seja o mesmo para o seu radioisótopo e considerando
75
as diluições realizadas no processo de formulação do material para o teste de citotoxicidade in
vitro, a atividade empregada no ensaio biológico foi de 1,54 nCi.
5.5- Ensaios preliminares de citotoxidade in vitro
Os testes de citotoxicidade foram conduzidos em células T98G de glioblastoma
humano, sendo realizados os estudos de MTT e DAPI. Alguns imprevistos encontrados ao
longo deste ensaio impediram realizar um estudo quantitativo. O reator TRIGA do CDTN
estava passando por reformas e por processo de licenciamento, que não foram concluídos no
tempo previsto, e planejado no cronograma do presente trabalho. Neste contexto não houve
tempo suficiente para a realização desse experimento de forma a seguir os protocolos ideais,
como número de repetições e adequação das concentrações utilizadas. Outro grande problema
enfrentado mediante esse estudo se refere à característica de aglomeração da hidroxiapatita
quando formulações em meio de cultura e em concentrações maiores são preparadas. Esta
característica foi observada nas medidas de DLS, Figura 5.16, que indicou um baixo valor de
potencial zeta no pH neutro, que é pH do meio de cultura. Este fato inviabilizou uma análise
quantitativa porque o material não se distribui homogeneamente nos poços da placa onde as
células foram cultivadas. Dessa forma, apenas testes qualitativos foram realizados na tentativa
encontrar possíveis tendências de comportamento desse material frente a sistemas biológicos,
que, de certa forma, foram de grande valia para futuros estudos com os padrões ideais. O
gráfico de viabilidade celular do teste de MTT está representado na Figura 5.22 e as imagens
são apresentadas na Figura 5.23 juntamente com as imagens do ensaio de DAPI.
Figura 5.22- Resultados do teste de citotoxidade em células T98G.
0
20
40
60
80
H A
P V A /C O L/H A
P V A /C O L /H A -G d
P V A /C O L /H A -G d-159
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r (
% d
o c
on
tro
le)
76
Figura 5.23- Fotos das células T98G utilizadas nos testes de citotoxicidade. Ensaio de MTT
na coluna da esquerda e ensaio de DAPI na coluna da direita.
Pela leitura do gráfico, pode-se perceber que todos os materiais apresentaram certa
atividade citotóxica, uma vez que a viabilidade das células tratadas com cada sistema ficou
abaixo da viabilidade celular do controle. As fotografias do teste de MTT expressam a
densidade celular em cada poço da placa onde as células foram semeadas e permitem
investigar alterações morfológicas que possam ter ocorrido com essas células após o
tratamento com os materiais; as fotografias de DAPI, onde os núcleos celulares ficam corados
em azul, permitem investigar alterações cromossômicas características de apoptose. É
Controle
HA
PVA-COL-HA
PVA-COL-HA-Gd
PVA-COL-HA-159
Gd
77
possível notar uma redução significativa no número de células quando comparamos as
fotografias referentes a cada material com as fotografias do controle (tanto as fotografias de
MTT quanto as fotografias do DAPI). Essa redução é um forte indício de que os materiais
apresentaram atividade citotóxica, em conformidade com os resultados mostrados no gráfico.
Alterações morfológicas, como irregularidades na membrana, também podem ser observadas
por análise das fotografias do teste de MTT, fornecendo novas evidências sobre efeitos
citotóxicos dos materiais utilizados no tratamento. As imagens de DAPI também sugerem
alterações cromossômicas características de morte programada, onde os núcleos afetados
apresentam-se com maior brilho em relação ao controle.
Na literatura podem ser encontradas publicações onde os autores relatam que a
funcionalização da hidroxiapatita com PVA e colágeno podem aumentar a biocompatibilidade
do material (SONG et al., 2012b) e essa tendência foi ser observada quando comparamos os
resultados qualitativos exibidos no gráfico da Figura 5.22, que sugerem menor citotoxicidade
dos materiais funcionalizados em relação à hidroxiapatita não funcionalizada. Embora esses
resultados sejam apenas qualitativos, os ensaios in vitro também sugerem outro indício
importante para a presente pesquisa: a amostra incorporada com o radioisótopo apresentou
maior atividade citotóxica em relação aos demais materiais, principalmente em relação à
amostra incorporada com o isótopo estável. Essas constatações, mesmo que qualitativas,
indicam que o material preparado nesse trabalho apresenta um potencial para ser utilizado
como agente para tratamento de osteossarcomas.
Embora existam publicações na literatura que apontam a hidroxiapatita como um
material biocompatível (SALEHI; FATHI, 2010; SHIH; WANG; HON, 2005; VERMA et al.,
2013; WANG et al., 2006a; WU et al., 2012) e os resultados dessa pesquisa tenham sugerido
qualitativamente uma relativa citotoxicidade para esse material, algumas constatações podem
ser enumeradas na tentativa de elucidar esse problema: o tipo de célula utilizada em cada
experimento, o processo de síntese da hidroxiapatita, o processo de purificação e esterilização
do material antes de sua aplicação no ensaio biológico e a forte tendência da HA para formar
aglomerados.
Diferentes tipos de células já foram utilizadas para ensaios de biocompatibilidade da
hidroxiapatita e os resultados desses trabalhos são divergentes (GEETHA et al., 2013;
MOTSKIN et al., 2009; MÜLLER et al., 2014; SONG et al., 2012b). Geetha e colaboradores
(GEETHA et al., 2013) demonstraram que esse material não apresenta atividade citotóxica na
linhagem celular L929 de fibroblastos até a concentração de 600 µg/mL. Motskin e
78
colaboradores (MOTSKIN et al., 2009) realizaram estudos sobre a linhagem HMMs de
células derivadas de macrófagos humanos e demonstraram que, nestas células, a
citotoxicidade da hidroxiapatita varia consideravelmente de acordo com as formulações e
estão relacionadas com suas propriedades físico-químicas.
O processo de síntese da hidroxiapatita pode estar relacionado com a atividade
citotóxica encontrada nesses ensaios sobre a linhagem T98G. Podem ser observados picos de
absorção característicos do CTAB (em torno de 2950 e 2850 cm-1
) pelo espectro de FTIR da
hidroxiapatita sintetizada nesse trabalho, sugerindo que esse surfactante não tenha sido
completamente removido da matriz no processo de calcinação. Dessa forma, umas das causas
da toxicidade observada para a hidroxiapatita pode estar associada a este direcionador de rede.
Müller e colaboradores (MÜLLER et al., 2014) estudaram processos de esterilização
da hidroxiapatita antes da realização do tratamento de células para teste de MTT. Os
resultados dessa pesquisa demonstraram que o processo de autoclavagem e de diálise são
eficientes para reduzir a toxicidade desse material, fornecendo uma boa alternativa para testes
futuros com os materiais sintetizados no presente trabalho. Nessa mesma publicação, Müller e
seus colaboradores discutem sobre a aglomeração da hidroxiapatita e como essa característica
está relacionada com a interação desse material as linhagens de células estudadas, sugerindo
uma possível correlação com a atividade citotóxica.
Com base no que foi discutido logo acima, pode ser inferido que os resultados
apresentados nesse trabalho, mesmo que qualitativos, indicam que o material sintetizado pode
ser trabalhado sistematicamente para que suas características sejam melhoradas visando
futuros testes biológicos.
Estes ensaios se caracterizam como preliminares e um estudo mais profundo e de
forma sistemática deverá ser realizado para avaliar a reprodutibilidades dos ensaios, bem
como estabelecer relações entre dados de citotoxicidade, composição e morfologias das
amostras.
79
6. CONCLUSÃO
A hidroxiapatita nanoestruturada pode ser sintetizada por métodos distintos, sendo que
o controle do pH é fundamental para o sucesso da obtenção desse material em fase cristalina.
Os direcionadores de rede exercem grande influência sobre a porosidade do material e sobre o
tamanho do cristalito, sendo fundamentais para obtenção de hidroxiapatita mesoporosa
nanoestruturada.
A funcionalização com PVA e colágeno altera consideravelmente os parâmetros
superficiais das nanopartículas, promovendo redução da área superficial específica e do
volume e diâmetro de poros. Entretanto, poucas alterações na carga superficial foram
observadas para essa funcionalização, como demonstrado pela técnica de DLS.
Os dados das caracterizações por FTIR e DRX indicaram que o material de interesse no
presente trabalho, a hidroxiapatita, foi adequadamente sintetizado e sugeriram, juntamente
com as técnicas de análise elementar CHN e análise termogravimétrica, que o processo de
funcionalização desse material com PVA e colágeno foi bem sucedido. Essa funcionalização
tem grande influência na biocompatibilidade da hidroxiapatita como sugerido pelo teste
preliminar de citotoxicidade.
As imagens de MET e MEV permitiram observar que a estrutura mesoporosa desejada
para a hidroxiapatita foi alcançada, em concordância com os resultados da análise de adsorção
de N2 pelo método BET. As imagens das microscopias eletrônicas indicaram também que a
faixa de tamanho desejada para as nanopartículas foi obtida, credenciando o material para o
tratamento do câncer pelo efeito EPR.
A incorporação de isótopos é mais eficiente para a hidroxiapatita não funcionalizada,
mas também é possível incorporar quantidades significativas nas amostras funcionalizadas,
como sugerido pelas análises por ICP-AES. A hidroxiapatita pode ser considerada um
carreador estável de radioisótopos, porque os elementos incorporados ficam retidos nas
nanopartículas e não são liberados no meio, como demonstrado no estudo de liberação. Essa é
a característica ideal para materiais incorporados com radioisótopos e candidatos a agentes de
tratamento do câncer pelo efeito EPR.
A ativação dos elementos ítrio e gadolínio, através de reações do tipo (n, γ) em reatores
nucleares, é possível e pode gerar uma atividade suficiente para a preparação de formulações
a base de hidroxiapatita visando o tratamento de câncer.
80
Com base nos resultados obtidos nesse trabalho, nanopartículas mesoporosas de
hidroxiapatita funcionalizadas com PVA e colágeno, contendo o radioisótopo gadolínio-159
ou ítrio-90, apresentam potencial elevado para serem utilizadas como agentes de tratamento
de osteossarcoma, justificando a continuidade desses estudos em trabalhos futuros.
81
7. PROPOSIÇÕES FUTURAS
Estudar sistematicamente a síntese de hidroxiapatita nanoestruturada através de
diferentes rotas e o processo de funcionalização das nanoestruturas com PVA,
colágeno e outros agentes funcionalizantes;
Estudar a incorporação e a retenção de diferentes radioisótopos nas nanoestruturas
funcionalizadas;
Estudar a estabilidade in vitro dos materiais propostos;
Estudar a atividade citotóxica in vitro dos materiais propostos sobre a linhagem de
células SAOS de osteossarcoma humano;
Estudar a biodistribuição e a atividade antitumoral in vivo dos materiais propostos em
camundongos Swiss.
82
8. PRODUÇÕES CIENTÍFICAS
Artigo publicado no Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology:
CIPRESTE, M. F.; SOUSA, E. M. B. Poly(Vinyl Alcohol)/Collagen/Hydroxyapatite
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Trabalhos apresentados em congressos na forma de pôster:
XII Brazilian MRS Meeting SBPMat - Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais
Campos do Jordão - Setembro 2013
Hydroxyapatite Nanoparticles Containig 90
Y Applied to Osteosarcoma Treatment
VIII Congresso Internacional da SBBN – Sociedade Brasileira de Biociências Nucleares
Recife – Novembro 2012
Hhydroxyapatite nanoparticles containing 153
Sm-EDTMP applied to bome metastases
treatment
83
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