Programa de Pós-Graduação em Genética e … · Landfarming Ex situ Tempo de tratamento Monitoramento Características ambientais Mais eficiente Relativamente passiva Atenuação

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

“PERSPECTIVAS DO USO DE MICRORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO”

Paula Fabiane MartinsDr. Ricardo Antunes de Azevedo

INTRODUÇÃO

CENÁRIO ATUAL

DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS

SISTEMAS GENÉTICOS DE CONTROLE

MONITORAMENTO AMBIENTAL

“SISTEMA DE BIORREMEDIAÇÃO”

DISCUSSÃO

“PERSPECTIVAS DO USO DE MICRORGANISMOSNA BIORREMEDIAÇÃO”

POLUIÇÃO AMBIENTAL

� laboratório � campo

� controle de crescimento

� conhecimento sobre metabolismo

� sub-produtos tóxicos

� método simples

� custos menores

� ambientavelmente favorável

� completa mineralização

BIORREMEDIAÇÃO: MÉTODO ALTERNATIVO

USO DA AÇÃO DE MICRORGANISMOS OU OUTROS SISTEMAS BIOLÓGICOS PARA DEGRADAÇÃO DE POLUENTES AMBIENTAIS. (Kuiper, 2004)

Técnicas convencionais• incineração – altas temperaturas

• decomposição química

BIORREMEDIAÇÃO COMO TECNOLOGIA

Como outras tecnologias, a biorremediação tem suas limitações. O controle e a otimização do processo de biorremediação é um complexo sistema que envolve muitos fatores.

(Vidalli, 2001)

Parâmetros importantes

� Estrutura e hidrogeologia do solo

� Natureza dos componentes

� Estado nutricional e composição microbiana do sítio

in situ

ex situ

BIORREMEDIAÇÃO COMO TECNOLOGIA

Alto custoPode precisar de

escavaçãoCusto operacional

Otimiza parâmetros ambientais

Rápida degradação

AquososSlurryBioreatores

Transferência de massa

Requer espaçoControle abiótico

EficienteBaixo custo

CompostagemBiofilmes

LandfarmingEx situ

Tempo de tratamentoMonitoramentoCaracterísticas

ambientais

Mais eficienteRelativamente passiva

Atenuação naturalNão evasiva

BioestimulaçãoBiodegradaçãoBioaumentação

BiospargingRizoremediação

In situ

LimitaçõesBenefíciosEstratégiasTecnologia

CENÁRIO ATUAL DA BIORREMEDIAÇÃO

� Alemanha é o país com maiores investimentos da Europa na área debiorremediação, apresenta mais de 20 centros de estudos.

� Inglaterra e Dinamarca fazem aplicação desde 1982

EUROPA

Applied Biotechnology for situremediation, 1994http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=375&canal=5

ESTADOS UNIDOS

� 1992: Biorremediação de querosene no Sul da Califórnia, através de implantação de nutrientes nos sítios contaminados.

BRASIL

� A primeira provável aplicação da biorremediação no tratamento de drenagem ácida de mina ocorreu na mina de Esperança, do grupo Anglo GoldAshanti, em Nova Lima, MG e ainda se encontra em operação.

�Segundo maior derramamento de petróleo ocorrido (2000), teve em sua fase final a implantação de remediação através de fungos e bactérias. Haviam estudos sendo conduzidos pela Petrobrás e houve a participação de um empresa de consultoria canadense – Hidrogéo.

CENÁRIO ATUAL DA BIORREMEDIAÇÃO

Desvio no arroio da mata contaminada permitiu biorremediação

PETROBRÁS DESCONTAMINAVAZAMENTO COM MICRÓBIOS

O segundo maior derramamento de petróleo do País, ocorrido na Reparem 2000, está na fase final de remediação utilizando bactérias e fungos

como despoluidores


Conhecimento sobre a forma de metabolização do poluente

Mineralização

Fermentação

Cometabolismo

� Isolamento e seleção

*culturas puras

� Identificação de microrganismos

* correlação com possíveis rotas metabólicas

� Estudo dos produtos e da taxa de metabolização


Metolachlor

Sítios de clivagens

• linhagem isolada de solo contaminado com acetochlor

• identificada por análise da seqüência do gene ribossômico 16S

Isolation and characterization of a Pseudomonas oleovorans degradingthe chloroacetamide herbicide acetochlor

Biodegradation (2006) 17: 219-225

8 semanasMM + acetochlorLB

MM + acetochlor

ISOLAMENTO

amostra

Isolation and characterization of a Pseudomonas oleovorans degradingthe chloroacetamide herbicide acetochlor

Taxa de degradação

� MM�MM +Act + 2g sacarose� MM + Act + 10g sacarose

Rota parcial de biodegradação

• análise de degradação através de HPLC e GC-MS

• construção da rota metabólica


Construção e regulação das rotas metabólicas

• ausência de via catabólica adequada

• via catabólica com baixo potencial

• características particulares: compostos aromáticos apresentam uma resistência maior a degradação

Microrganismos geneticamente

modificados

Modificações para mudanças na rota de metabolização

� Modificação de genes que codificam enzimas biodegradáveis

- mutação sítio-dirigida

- troca de genes que codificam subunidades de enzimas de espécies relacionadas

MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS


Modificações para mudanças na rota de metabolização

�Melhorar a performance das enzimas

- modificação de especificidade

- afinidade enzimática

�Regulação de regiões codantes de interesse

- preposição de promotores, mudança de regulação

� Fusão de proteínas

Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (6), 1353-1356, 2004

Pentacloroetano Tetracloroetano

PCE TCE ...TCE

Tricloroetano

Total degradation of pentachloroethane by an engineered Alcaligenes strain expressing a modified camphor monooxygenase and a hybrid dioxygenase

O2• Declorinação • redução por halogenases

• oxigenases

CamMox

Tolueno dioxigenase

Difenil dioxigenase



CamMox

CamC CamA CamB

Phe Trp

CamC CamACamB

Bph Dox genes

Hibrid Dox genes

Tol Dox genes

Plasmídio suicidaCam C(F87-W)AB


Tol Dox genes

Bph Dox genes

Hibrid Dox genes

Alcaligenes sp.

Alcaligenes sp.

PseudomonasCam C(F87-W)AB

[ ]TCE

45%

90%


O2

[ ]TCE


• A linhagem Alcaligenes sp. exibiu alta eficiência na degradação de PCE e TCE via a introdução de CamMox modificada e gene Doxhíbrido .

• A mutação Phe 87 para Trp não afeta a especificidade da enzima CamMox pelo substrato.

• O gene original Bph Dox da linhagem de Pseudomonas é inativo ao substrato TCE.

Discussão

PCE TCE ...TCE

O2


Sobrevivência e estabilidade de GEM´s

� habilidade de crescimento

�manutenção do genótipo construído

� capacidade de transferência de genes

- tamanho do inóculo

- condições ambientais

- interações (competidores)

- estabilidade plasmidial

- campo difere do laboratório

- instabilidade estrutural

- falha na retenção do

plasmídio pela célula filha

- Transferência indesejada

SISTEMAS GENÉTICOS DE CONTROLE

Sistemas suicidas

regulador repressor killer

regulador Anti-killer killer

poluente

poluente

Controle negativo

Controle positivo


� Método tradicional: crescimento de CFU em placas

- técnica dependente de cultivo

- número subestimado

- mais trabalhosa

� Métodos moleculares

Habilidade em estudar comunidades microbianas sem a cultura de microrganismos, preserva o status do metabolismo in situ, além de manter a integridade da comunidade.


� Métodos moleculares

– PCR

– RT - PCR

DNA

RNA

RFLP T-RFLP

AFLP RAPD

microarrays

TGGE DGGE

• Detecção de pequenas diferenças de seqüências de DNA ganha importância quando analisadas sobre a estrutura da comunidade microbiológica.

fluorescência

RFLP – polimorfismo do tamanho de fragmentos de

restrição

MONITORAMENTO AMBIENTALTécnicas moleculares

DGGE – eletroforese em gel de gradiente desnaturante

Gra

dien

te li

near

de

desn

atur

ação

A B C

C G A T

Diferença de comportamento eletroforético, caracterizado pela seqüência de nucleotídeos.


Grampo CG


Fluorescência

• permite analisar a atividade e número de células através de genes biomarcadores como gfp – green fluorescent protein e luc – luciferase.

• entre as técnicas ultilizadas para o monitoramento está a luminometria e a citometria.

DIAGRAMA DE TÉCNICAS BASEADAS EM GENÔMICA

SISTEMA DE BIORREMEDIAÇÃO

� sistemas matemáticos: controle do

comportamento dos poluentes e

quantificação de transferência horizontal.

� sistema de biorremediação: necessidade de integração de modelos matemáticos e biológicos com modelos geohidrológicos (interação entre várias áreas).

�avanço de técnicas moleculares que conseguem trabalhar com microrganismos não cultiváveis.


DISCUSSÃO

� compostos não- biodegradáveis

� subprodutos da rota de biodegradação mais tóxicos e persistentes

�processos biológicos altamente específicos

�biotecnologia com tempo de aplicação longo

�aceitação e melhor regulação do sistema de biorremediação

��

��

��

��


DISCUSSÃO

PERSPECTIVAS

� conhecimento sobre promotores, genes e vias

� controle do crescimento dos GEMs in situ

� maior sobrevivência dos GEMs em relação a tempo e espaço

� rotas de degradação completas

�INTEGRAÇÃO ENTRE ÁREAS

OBRIGADA PELA ATENÇÃO!

Paula Fabiane Martins

Laboratório de Genética e

Bioquímica de Plantas

Documents

Programa de Pós-Graduação em Genética e … · Landfarming Ex situ Tempo de tratamento Monitoramento Características ambientais Mais eficiente Relativamente passiva Atenuação