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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
“SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES”
Aluno: Gustavo Vitti MoroOrientador: Prof. Dr. Cláudio Lopes de Souza Jr.
2
• Introdução– Seleção Assistida por Marcadores Moleculares (SAM)– Vantagens– Procedimentos
• Aplicações SAM – Exemplos (sucesso)– Retrocruzamento Assistido– Piramidação– Seleção Característica de Interesse– Seleção Combinada
• Fatores que dificultam utilização da SAM (alternati vas)
• Perspectiva: Genome-Wide-Selection
• Considerações Finais
TÓPICOS
3
• Melhoramento Convencional - seleção dos genótipos superiores é realizada com base no fenótipo
• Muito tempo e resultados bastantes significativos
• Fatores que dificultam:
– Grande influência ambiental (caracteres quantitativos)
– Precisão das avaliações fenotípicas
– Dependente do ambiente para as avaliações
� FENÓTIPO GENÓTIPO
INTRODUÇÃO
≠
4
• Advento dos marcadores moleculares – década de 80
• Utilização desses marcadores para auxiliar na seleç ão
• Marcadores Moleculares:
– Não sofrem influência ambiental
– São herdados mendelianamente
– Apresentam herdabilidade igual a um
• Aumento na eficiência do processo de seleção
INTRODUÇÃO
5
• Piramidação de genes – combinações gênicas/alélicas de interesse (um ou vários caracteres)
• Genes em homozigose (dominância) – elimina etapa de autofecundação
• Determinação do fenótipo é complexa (organolépticas, destruição da planta, ambientes específicos) ou apresenta custo elevado
• Caracteres de baixa herdabilidade (influência ambie ntal)
• Seleção precoce – estágios iniciais (antes da manifestação do caráter e antes do florescimento)
INTRODUÇÃO
6
• Eficiência Relativa da SAM em relação a SF:(Lande e Thompson, 1990)
• h2 – herdabilidade do caráter em sentido restrito
• p – proporção da variância genética aditiva do caráter que é explicada pelos marcadores
ph
p
h
pER
2
2
2 1
)1(
−−+=
31090
190102
2
≅⇒==≅⇒==
ER,he,pSe
ER,he,pSe
Valores extremos – hipotético
ASSISTIDA vs FENOTÍPICA
7
• 1º - Seleção dos marcadores genéticos
• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas
• 3º - Aplicação dessas informações na seleção
PROCEDIMENTOS
8
• 1º - Seleção dos marcadores genéticos
• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas
• 3º - Aplicação dessas informações na seleção
PROCEDIMENTOS
MAPA GENÉTICO
10
• 1º - Seleção dos marcadores genéticos
• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas
• 3º - Aplicação dessas informações na seleção
PROCEDIMENTOS
11
L-08-05F2.91-0.18bnlg1607-bnlg18238Ph8b
L-08-05F11.86 -0.31phi420701-phi01198Ph8a
L-08-05F5.40 -0.20umc1520-bnlg17596Ph6
L-08-05F6.49 -0.30bnlg2162-umc10864Ph4
L-08-05F5.77 -0.25umc1659-umc13203Ph3
L-08-05F5.77-0.25 umc1073-umc10211Ph1
DireçãoR2aditivomarcascromoQTL
Tabela 1. Localização e estimativa dos efeitos gené ticos dos QTLs(resistência a Phaeosphaeria maydis)
Moreira, Tese ESALQ, 2004
MAPEAMENTO DE QTLs
Moreira, Tese ESALQ, 2004
MAPEAMENTO DE QTLs
13
• 1º - Seleção dos marcadores genéticos
• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas
• 3º - Aplicação dessas informações na seleção
PROCEDIMENTOS
14
-50AB+5AA-10BB5
-15-10AA-5BB0AB4
-50AB-5BB0AB3
+25+10BB+5AA+10AA2
+5-10AA+5AA+10AA1
ValorGenótipoValorGenótipoValorGenótipo
Valor Genotípico
Loco 3Loco 2Loco 1Genótipo
Tabela 2. Valores Genotípicos – exemplo hipotético
Baseado nesses marcadores, o genótipo dois é o melho r.
APLICAÇÃO NA SELEÇÃO
15
Número de artigos com o termo QTLs e SAM de 1984-20 05.
Xu e Crouch, Crop Science, 2008
SAM
QTLs vs SAM
16
Retrocruzamento assistido por Marcadores Moleculares
– Introdução de um ou poucos alelos favoráveis de genótipos não adaptados, em genótipos elites
�Seleção genótipos contendo os marcadores associados a esses alelos
� Identificação, dentre as plantas selecionadas para os alelos de interesse, aquelas com maior proporção do genoma recorrente
– Diminuição do tempo para recuperação do genoma recorrente (três gerações)
– Diminui o linkage-drag
ALGUMAS APLICAÇÕES
17
• Introgressão de QTLs para aumento de produtividade presentes em materiais não cultivados, em materiais elites
• Ocorrência de progênies transgressivas é RARA (introdução dos QTLs – ganhos significativos)
• Detecção prévia de marcadores ligados aos QTLs de produtividade
• Retrocruzamento e seleção para presença desses marcadores
• Obtenção das linhagens recorrentes contendo esses QTLs
EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO
18
Objetivo: Introgredir QTLs nas linhagens elites B73 e Mo17 e melhorar o híbrido B73 x Mo17
EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO
19
• Detecção de 6 QTLs (Tx303) e 4 QTLs (Oh43) complementares a B73 e Mo17, e introgressão via retrocruzamento
• B73 melhorada x Mo17 melhorada – 93 híbridos avaliad os em experimentos com repetição
Grupo Heterótico I Grupo Hete rótico IIB73 x Tx303 Mo17 x Oh 43
F1 F1
F2 QTLs F 2 QTLs
Presentes na Tx303 Presentes na Oh43
20
9.716,8B73 x Mo17
Testemunha
10.601,96
10.727,45
10.689,74
10.890,63
11.179,32
11.217,01
ProduçãoGenótipo Selecionado
Tabela 3. Produção de grãos (Kg ha-1) dos genótipos selecionados e do genótipo original.
Somente 4 dos 93 híbridos obtidos foram inferiores ao híbrido original
21
Objetivo: Introgredir QTLs para aumento de produtivi dade presentes em uma linhagem selvagem de arroz, em uma linhagem cultivada, através de retrocruzamento assi stido
EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO
22
O. rufipogon (QTLs) x “9311” (cultivada)
F1 x “9311”
RC1
RC1-S x “9311”
RC2
RC2 -S x “9311”
RC3
RC3 -S
Seleção para microssatélitesligados aos QTLs de produtividade
Seleção para microssatélitesligados aos QTLs de produtividade
Seleção para microssatélitesligados aos QTLs de produtividade
23
23,35,7144,59311
original
31.16,5165,19311
melhorada
Produção (g pl -1)Panículas/PlantaGrãos/PanículaGenótipo
Tabela 4. Comparação dos genótipos selecionados con tendo os QTLs de produtividade, com a linhagem original.
24
• A introgressão de QTLs favoráveis presentes em materiais não elites, em materiais elites, através da SAM, foi eficiente em “melhorar” os materiais elites
• Elimina efeitos ambientais envolvidos na seleção fenotípica
• Explora QTLs de materiais não elites que dificilmen te seriam utilizados em programas convencionais de melhoramento
EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO
25
Piramidação de Genes
– Combinação de diferentes genes/alelos em um único genótipo
– Resistência a doenças (obtenção de um genótipo resistente a diferentes raças de um patógeno ou a diferentes patógenos)
– Obtenção de um genótipo contendo QTLs favoráveis para diferentes caracteres
ALGUMAS APLICAÇÕES
26
Objetivos: Utilização de marcadores microssatélites na piramidação de três genes de resistência ( Rv1, Rv3 e Rv4) em uma única linhagem de soja ( Essex), para criar uma forma de resistência durável e ampla ao vírus do mo saico da soja.
EXEMPLO-PIRAMIDAÇÃO
27
Rsv1Rsv1Rsv3Rsv3Rsv4Rsv4
três genótipo
Obtenção de populações segregando para os três gene s resistência
Seleção–marcas associadas a resistência ao vírus mosaico da
soja (VMS)
3 isolinhas de Essex, contendo cada um dos genes em homozigose dominantes
Rsv1Rsv1rsv3rsv3rsv4rsv4 rsv1rsv1rsv3rsv3Rsv4Rsv4rsv1rsv1Rsv3Rsv3rsv4rsv4
RRRRRRRsv1Rsv3Rsv42
RRRRRRRsv1Rsv3Rsv43
RRRRRRRsv1Rsv3Rsv41
Isolinhas piramidadas – 3 genes de resistência (homozi gose)
RRSRSRRsv4C
RSSSSSRsv3B
SRRRRRRsv1A
Isolinhas – 1 dos genes de resistência (homozigose)
SSSSSSrsv1Essex
SMVG7
SMVG6
SMVG5
SMVG3
SMVG2
SMVG1
Reação Observada
GeneGenótipo
Tabela 5. Resistência de genótipos contendo diferen tes genes de resistência ao vírus do Mosaico da Soja.
29
• Combinação dos três genes de resistência em uma úni ca linhagem, em apenas dois ciclos de cruzamento.
• Marcadores não mascaram os efeitos dos outros marcadores (epistasia - Rsv1Rsv3 e Rsv1Rsv4)
• Obtenção de indivíduos resistentes sem necessidade de inoculação ou teste de progênies
EXEMPLO-PIRAMIDAÇÃO
30
Seleção Assistida para a Característica de Interess e
– Identificação prévia do(s) gene/QTLs que afetam a característica de interesse
– Existência de marcadores que permitam monitorar a presença dos alelos favoráveis
– Seleção na população, dos genótipos que contém esses marcadores
– Natureza genética da característica, modo de ação gênica, efeito do gene na expressão do fenótipo, complexidade da avaliação fenotípica e eficiência c om que o marcador discrimina a característica
ALGUMAS APLICAÇÕES
31
Objetivos: Avaliar a eficiência da SAM em fornecer resistência ao mofo branco, em duas populações de R ILsde feijão, desenvolvidas utilizando o parental resi stente Bunsi.
EXEMPLO-CARÁTER DE INTERESSE
Mapeamento em uma população e seleção em outras duas populações
32
Bunsi (R) x Midland (S)
96 RILs (F 4:7)
seleção marcadores (resistência)
20 RILs
Controle – selecionados para ausência dos marcadores
associados aos QTL de resistência
POPULAÇÃO 1
33
72,441,4Controle
62,133,9Assistida
Incidência (%) (2001 e 2002)
Severidade (%)(2001 e 2002)
Genótipos
Tabela 6. Comparação da resistência ao mofo branco entre as RILsselecionadas com base nos marcadores e o grupo cont role
34
Bunsi (R) x Raven (S)
98 RILs (F4:7)
28 RILs
(somente marcadores)
18 RILs
(componente de arquitetura)
10 RILs
(considerando produção)
Controle – selecionados para ausência dos marcadores associados aos QTL de
resistência
POPULAÇÃO 2
35
4192477545174484Produtividade
(Kg/ha)
72,552,559,559,9Incidência (%)
40,427,733,033,2Severidade (%)
ControleGrupo M+A+P
Grupo M+AGrupo MCaráter
Tabela 7. Comparação dos genótipos selecionados com base nos marcadores (M), marcadores e arquitetura (fenotípic a) (M+A), marcadores arquitetura e produtividade (fenotípica ) (M+A+Y) e controle.
36
• Confirmação da SAM para ganhos em diferentes background genéticos
• SAM pode ser utilizada na ausência de patógenos e e m estágios iniciais
• Como a contribuição individual dos QTLs é pequena, informações de diferentes QTLs é crucial para ganho s significativos de resistência ao mofo branco atravé s da SAM
EXEMPLO-CARÁTER DE INTERESSE
37
Objetivo: Estimar Respostas à Seleção para diferente s esquemas de seleção (seleção fenotípica e com base em marcadores moleculares)
ASSISTIDA vs FENOTÍPICA
38
P1(r) x P2(s) x P3(r) x P4(s)
1200 F1 (CD)
135 genótipos 26 genótipos
Seleção Fenotípica
Seleção Baseada nos marcadores
39
4,428,826Baseada nos Marcadores
3,2412,6135Fenotípica
Ganho de Seleção por
Ano
Tempo para um ciclo
Ganho Total de Seleção
N
Caráter FHB (% espiguetas infectadas)
Seleção
Tabela 8. Ganho de seleção obtido através da seleçã o fenotípica e com base nos marcadores moleculares, para “ Fusarium head blight” (FHB).
40
• Embora a resposta a seleção para a seleção fenotípi ca tenha sido maior, a introgressão de QTLs de resistên cia em materiais elites utilizados em programas de melhoramento convencional, através da SAM, podem resultar em substancial aumento na resistência em u m menor tempo.
ASSISTIDA vs FENOTÍPICA
41
Caracteres complexos
• Lande e Thompson (1990)
onde: b p é o peso dado a informação fenotípica
P é a informação fenotípica
bm é o peso dado a informação genotípica
M é a informação genotípica
e:
MbPbI mp .. +=
( )[ ] ( )phbm −−= 1/1/1 2
SELEÇÃO COMBINADA
42
igual00001
total1.330.670.440.370.75
total421.331.110.5
total12643.330.25
total361812100.1
10.750.50.250.1h2
p
Tabela 9. Pesos da informação genotípica em relação ao peso 1 dado a informação fenotípica, em função da herdabilidade ( h2) e proporção da variância aditiva explicada pelas marcas ( p)
SELEÇÃO COMBINADA
43
Mapas genéticos com baixa saturação (GAPS)
• diminuição do poder e da precisão das estimativas d e posição e efeito dos QTLs
FATORES QUE DIFICULTAM
44
Mapas genéticos com baixa saturação (GAPS)
• ADIÇÃO DE NOVOS MARCADORES (SATURAÇÃO DOS MAPAS) - TENTAR COBRIR REGIÕES COM GRANDE INTERVALO ENTRE MARCADORES ADJACENTES
FATORES QUE DIFICULTAM
45
Modelos de mapeamento consideram apenas um QTL por intervalo
• Viés na estimativa dos efeitos dos QTLs/não detecçã o do QTL
QTL mapeado
0.62
1.81
1.21
aQTLs existentes
FATORES QUE DIFICULTAM
46
Modelos de mapeamento consideram apenas um QTL por intervalo
• SATURAÇÃO DOS MAPAS – DIMINUIR O INTERVALO ENTRE MARCADORES ADJACENTES
• DESENVOLVIMENTO DE MODELOS QUE CONSIDEREM MAIS DE UM QTL POR INTERVALO
FATORES QUE DIFICULTAM
47
Interação QTLs por ambiente
• função do caráter, geralmente efeito é acentuado
• busca por QTLs estáveis
FATORES QUE DIFICULTAM
X21
X22
XXXX23
XXXX20
XXX19
XXX24
XXXXXXX18
XXXXXX17
XXXX16
X15
X14
X13
XXX12
XX11
XXX10
XXXX9
XX8
X7
XX6
XXX5
XXX4
XXX3
X2
XX1
IHGFEDCBA
AmbienteQTL
Tabela 10. Mapeamento de QTLs para produção de grão s (9 ambientes).Bento, tese ESALQ, 2006
49
FATORES QUE DIFICULTAM
Interação QTLs por ambiente
– ESTRATÍFICAÇÃO DAS ÁREAS AGRÍCOLAS
– AGRUPAMENTO REGIÕES BAIXA/AUSÊNCIA DE INTERAÇÃO G x A
– MANIPULAÇÃO DE GRUPOS ESPECÍFICOS DE QTLs PARA CADA REGIÃO, AUMENTANDO EFICIÊNCIA DA SAM
Epistasia
L-08-05F3.41 D x D0.56Efeito dominante =8Ph8axPh8b
L-08-05F2.91 -0.18bnlg1607-bnlg18238Ph8b
L-08-05F11.86 -0.31phi420701-phi01198Ph8a
L-08-05F5.40 -0.20umc1520-bnlg17596Ph6
L-08-05F6.49 -0.30bnlg2162-umc10864Ph4
L-08-05F5.77 -0.25umc1659-umc13203Ph3
L-08-05F5.77 -0.25 umc1073-umc10211Ph1
DireçãoR2aditivomarcascromoQTL
Tabela 11. Efeito espistático (resistência a Phaeosphaeria maydis)
FATORES QUE DIFICULTAM
51
Epistasia
• DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA ESTIMAÇÃO PRECISA DA EPISTASIA (efeito e direção)
• ESTRATÉGIAS ADEQUADAS PARA “MANIPULAÇÃO”DOS EFEITOS DE EPISTASIA
FATORES QUE DIFICULTAM
52
Pequena proporção da variação fenotípica explicada por cada QTLs
2.31-0.20-2.12bnlg18638Qoil8
1.72-0.83-1.74umc14077Qoil7
2.040.989-1.87phi01266Qoil6
1.75-0.23-1.85BNLG17115Qoil5c
3.40-0.42-2.57phi01285Qoil5b
2.86-0.212.36BNLG18925Qoil5a
0.770.271.21umc10514Qoil4e
3.24-0.562.49bnlg21624Qoil4d
6.58-1.663.39bnlg22444Qoil4c
0.280.100.74dupssr344Qoil4b
1.121.48-1.05bnlg22914Qoil4a
0.170.08-0.57bnlg14523Qoil3
0.30-0.94-0.39umc14642Qoil2
2.15-0.53-2.02umc11061Qoil1c
2.18-0.28-2.06bnlg10141Qoil1b
1.95-1.46-1.66umc11771Qoil1a
daMarcaCromoQTL 2FenR
Mapeamento de QTLs para teor de óleo em milho, dados não publicados
FATORES QUE DIFICULTAM
53
GENOME-WIDE-SELECTION
• Foi possível devido ao baixo custo dos marcadores
• Marcadores abundantes no genoma (SNPs) – aumenta a probabilidade de estar ligado a algum gene de inter esse
• Informação de todos os marcadores do genoma, não apenas aqueles associados com o caráter por meio d e mapeamento de QTLs
• Elimina etapa de construção de mapas genéticos e mapeamento de QTLs (diminui tempo e custo)
• O valor genético de cada marcador é estimado (maior associação do marcador, maior valor genético do marcador)
• Só resultados de simulação
PERSPECTIVA - SAM
54
Os marcadores moleculares podem trazer grandes benefícios para os programas de melhoramento genéti co
– Seleção estágios iniciais
– Caracteres difícil/alto custo para avaliação
– Seleção caracteres correlacionados (pleiotropia)
– Auxílio na “manipulação” dos efeitos de epistasia
– Introgressão de genes/QTLs detectados em materiais não elites (dificilmente seriam explorados nos programas convencionais) – PROGÊNIES TRANSGRESSIVAS
CONSIDERAÇÕES FINAIS
55
Na literatura, a SAM apresenta resultados de sucesso e insucesso de sua aplicação. No entanto, para a maioria dos casos, ela
se mostra como uma importante ferramenta a ser implementada nos
programas convencionais de melhoramento, não como uma alternativa
aos programas convencionais de melhoramento!
OBRIGADO !
Gustavo Vitti Moro – [email protected]