Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de ... · envolvidas na sinalização celular Várias modificações regulam a função de microtúbulos Proteínas de membrana

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Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS DE PROTEÍNAS

Fernanda SalvatoDr. Carlos Alberto Labate

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

DefiniçõesDefinições

? Proteômica:

- Diz respeito ao estudo em larga escala de proteínas em sistemasbiológicos;

- Pode ser vista como uma metodologia experimental que explica a informação contida na seqüência genômica em termos de estrutura, função e controle de processos biológicos.

? Proteoma:

A totalidade de proteínas existentes em uma célula, tecido ou organismo.

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P

Transcrição Alternativa

Splicing Alternativo

Tradução

1 Gene ? 1 Transcrito ? 1 Proteína

? O número de genes é muito menor que o número de proteínas em humanos (~33.000 genes vs ~200.000 a 1 milhão proteínas)

? Cada gene codifica XX proteínas diferentes- devido à diversidade alélica, splicing alternativo e às modificações

pós-traducionais de proteínas

? Há muitos casos em que a população de RNAm não está fortemente correlacionada com o perfil protéico;

Por que estudar o Por que estudar o ProteomaProteoma??

Maneira direta para se Maneira direta para se estudar expressãoestudar expressão

Objeto de estudo: Objeto de estudo: PROTEOMAPROTEOMA

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Determinação direta da Determinação direta da seqüência de aminoácidos seqüência de aminoácidos

Seqüência traduzida Seqüência traduzida a partir do DNAa partir do DNAX

? Freqüentemente, as proteínas são modificadas para formar a proteína madura que difere significativamente da predita pela tradução;

- em muitos casos, a falta da modificação pós-traducional é muito importante e tem conseqüências funcionais;

? Além disso, em alguns casos, o RNAm é editado antes da tradução, criando mudanças na seqüência de aminoácidos que não são inferidas pelos genes.

Por que estudar o Por que estudar o ProteomaProteoma??

Uma proteína inferida a partir da seqüência Uma proteína inferida a partir da seqüência genômicagenômica é um objeto é um objeto hipotético até um experimento verificar sua existência.hipotético até um experimento verificar sua existência.

? Desde o primeiro artigo de revisão “Plant Proteome Analysis” (Canóvas etal, 2004) foram publicados 246 artigos relacionados com proteoma de plantas menos de 1% de publicações na área proteômica!!

? Cerca de 3% são artigos relacionados ao estudo de modificações pós-traducionais de proteínas neste mesmo período (2004-2007).

? Destes, 60% representam artigos de revisão;

? Este período pode ser interpretado como avanço potencial da proteômica, refletindo mais expectativas do que realizações;

? Período de adequações de técnicas e estratégias de análise.

Pesquisa no Pesquisa no WebWeb of of ScienceScience::

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Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais

O que são?

? Definição Geral: qualquer modificação na forma traduzida das proteínas.

? Adições covalentes que regulam a função da proteína, determinando o estado de atividade, a localização celular e a dinâmica de interações com outras proteínas.

Por que alterar as proteínas depois de traduzidas ao invés Por que alterar as proteínas depois de traduzidas ao invés de utilizarde utilizar--se do controle se do controle transcricionaltranscricional??????

É mais fácil:

A partir de um “esqueleto protéico”

•Criar um espectro de proteínas ligeiramente diferentes;

•Mudar totalmente as propriedades dessas proteínas

Ao invés de construir cada proteína correndo o risco de não ser utilizada num dado momento.


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Características Gerais

? São conhecidas mais de 200 tipos;? Estão presentes em pelo menos 80% das proteínas eucariotas;? Foram encontradas em todas as espécies;? Estão localizadas em seqüências específicas;? Algumas são transientes;? Presentes sob baixa estequiometria;? Geralmente agem em conjunto.



Características Gerais

? Quase todas as proteínas são modificadas durante a síntese ou após a síntese de proteínas;

? Estas modificações podem ser químicas ou por meio de clivagem;

? Toda proteína pode potencialmente ser modificada de diferentes maneiras;

? As modificações não podem ser preditas através da seqüência, somente os possíveis locais de sua ocorrência.

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ModificaçõesModificações

Adição de grupos funcionais Adição de grupos funcionais

- sulfato, acetato, metil, fosfato

Cadeias de carboidratos e/ou lipídiosCadeias de carboidratos e/ou lipídios


? Estas mudanças químicas podem alterar a hidrofobicidade de umaproteína e assim determinar a localização celular;

? Outras modificações, como a fosforilação, são parte de um sistema de controle do comportamento protéico (por exemplo, ativando ou inativandouma enzima).

Cacatas de fosforilaçãoenvolvidas na sinalização

celular

Várias modificações regulam a função de microtúbulos

Proteínas de membrana podem se ligar à membrana

através de âncoras GPI

Poliubiquitinaçãoinduz à degradação

protéica

Proteínas carregam O-glicanos

Histonas controlam muitos processos

nucleares

Proteínas de Membrana com

N-glicanos

(Jensen, 2006)

Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais CelularesCelulares

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A B C

MecanismoMecanismo FunçãoFunção

Processamento proteolítico e mudança

comformacional

Ativação

Proteólise dependente-MPT

Degradação

Reconhecimento dependente-MPT

Ativação, interação,

localização e secreção

Múltipla-MPTsRegulação dinâmica

ou modulação de atividade protéica,

interação prot-prot e interação DNA-prot

Função protéica Função protéica dependentedependente--MPTMPT

MPTMPT

Mecanismo de Ação das Mecanismo de Ação das MPTsMPTs

(Jensen, 2006)


Estabilidade protéica, estrutura tridimensional

Pontes de dissulfeto

Atividade protéicaSulfatação

Sinal de degradaçãoUbiquitinação

Estabilidade protéicaHidroxiprolina

Reversível, interações célula-célula, proteínas secretadas, funções regulatórias

Glicosilação

Regulação da expressão gênica, estabilidade protéica

Metilação

Reversível, estabilidade, regulação das interações DNA-proteína (histonas)

Acetilação

Reversível, regulação da atividade protéica, sinalização

Fosforilação

FunçãoTipo

(Adaptado de Mann & Jensen, 2003)

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Funções Biológicas

? Regulação da atividade de proteínas e de suas funções;

? Aumenta significativamente a diversidade e a complexidade do proteoma;

? Essenciais na transdução de sinais desde a membrana plasmática até o núcleo em resposta a estímulos externos;

? Ativação e inativação de enzimas;

? Modulação de interações moleculares proteína-proteína;

? Reconhecimento de DNA;

? Estabilidade protéica;

? Controle da transcrição gênica (fatores de transcrição);

? Desbalanços de modificações estão associadas a doenças;

Modificações Pós-Traducionais mais estudadas

? Fosforilação- adição e remoção de grupos fosfatos

? Glicosilação- adição de uma cadeia curta de carboidratos

(oligossacarídeos ou glucanos)

? Ubiquitinação- adição de ubiquitina(tag para localização e degradação)


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ANÁLISE DE MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS

•Enriquecimento de amostras complexas

•Identificação de MPTs

Análise de Modificações Análise de Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais

? É recente o início do estudo de MPTs em uma escala proteômica;

? Muitas das modificações estudadas hoje foram descobertas ao acasoestudando-se somente uma proteína em particular;

Combinações de diferentes

modificações

Amostra complexa!

Heterogênea!

Difícil caracterização e quantificação das

modificações

? Premissa básica: as modificações resultam em perda ou incremento de massa relativa no peptídeo.

? Logo, a detecção deste incremento/perda de massa pode ser feita por espectrometria de massasespectrometria de massas.

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Os métodos se baseiam:

? Em separação de proteínas;

? Análise comparativa de amostras antes e depois da remoção de modificações;

? Técnicas específicas de coloração para modificações pós-traducionaisparticulares.

Métodos:


? Método ideal: Espectrometria de Massas

- Modificações pós-traducionais causam mudança na massa predita;

- Ideal para adições e substituições, mas a proteína deve ser isolada.

? Anticorpos específicos para tipos de modificações

? Coloração de Gel específica


? A complexidade das amostras com MPTs

? Características físico-químicas (MPTs lábeis)

? Tamanho de peptídeos com MPTs

? Baixa concentração de MPTs

Diminuem a eficiência/acurácia

de detecção por MS

? Para análise em “escala proteômica” é necessário :

- enriquecimento de amostras com MPTs

- utilização de MS em combinação com outras técnicas (géis 2D)

Só é possível detectar MPTs quando em abundância

Grande quantidade de amostra é necessáriaAumenta

Sensibilidade !!!

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TÉCNICAS DE ENRIQUECIMENTO DA AMOSTRA

•IMAC

•Imunoprecipitação

•Tags

Enriquecimento da amostra

? Objetivo é aumentar a abundância relativa de uma classe de modificação pós-traducional de polipeptídeos de uma amostra;

? É aplicada ao nível protéico ou peptídico.

Técnicas:

? Colunas de afinidade (IMAC, colunas de lectina)

? Anticorpos imunoprecipitação

? Tags (biotina)

Enriquecimento de AmostrasEnriquecimento de Amostras

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Técnicas de EnriquecimentoTécnicas de Enriquecimento

IMAC (Immobilized Metal-Affinity Chromatography)

? Técnica de CromatografiaCromatografia de de AfinidadeAfinidade utlizando metal imobilizado (faseestacionária);

? Muito utilizado para isolar fosfopeptídeos a partir de uma amostra protéica digerida antes da análise por espectrometria de massas;

? Íons metálicos imobilizados carregados positivamente (FeIII) atraem grupos fosfato negativos;

? Surgiu com o estudo de fosfoproteínas de células de leveduras (Ficaro et al, 2002);

? Outros exemplos: •purificação de fosfotirosinas de proteínas humanas (Salomon et al,2003)• isolamento de proteínas de membranas em plantas(Nühse et al, 2003)

Digestão

Adesão à coluna

Eluição

Peptídeos fosforilados

Peptídeos não fosforilados

Fração não aderida

Amostra complexa de

proteínas

AnáliseMS

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tempo (min)

Abu

ndân

cia

Rel

ativ

a

29.16

61.9750.6039.27 74.5936.6527.90

Antes do enriquecimento

Depois do enriquecimento

K.FQS*EEQQQTEDELQDK.I

K.FQS*EEQQQTEDELQDK.I50.50

28.83

22.35 33.7062.87

42.56 57.1320.17

41.08

Cromatrografia de Afinidade por lectina

? Utilizada para enriquecimento de amostras com glicoproteínas e glicopeptídeos;

? Lectinas são carboidratos que se ligam às proteínas;

? Reconhecem estruturas específicas de carboidratos;

? Este método revelou 400 locais de N-glicosilação em 250 proteínas de Caenorhabditis elegans.

Introdução de Tags de Afinidade

? Através de reações químicas incorpora-se uma tag molecular na proteína que pode subseqüentemente ser purificada;

? Converte MPTs de aminoácidos em espécies facilmente detectáveis por MS, ou seja, aumenta a habilidade de detecção de MPTs;


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? Biotina: é uma glicoproteína muito utilizada como tag molecular;

? Moléculas biotiniladas podem ser imobilizadas através da interação com proteínas (avidin) que se ligam à biotina.

? Avidin: proteína que possui forte interação com a biotina

+

Avidin beads Biotina-proteína

Afinidade Avidin-Biotinaoutras proteínas

Purificação

biotina

Proteína com MPT

TagsTags de Biotinade Biotina

Proteína eluída/purificada

Digestão

Mistura de Peptídeos

AnáliseMS/MS

TagsTags de Biotinade Biotina

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Imunoprecipitação

Anticorpo contra proteína de interesse

Anticorpo se liga às proteínas de

interesse

Adiciona-se proteína A tornando o complexo

insolúvelCentrifugação

? Extensivamente utilizado na purificação de fosfoproteínas intactas;

? Desvantagem: ligação fraca proteína-anticorpo.


Descarte !

Outras proteínas

Proteínas com a modificação de interesse

IDENTIFICAÇÃO E MAPEAMENTO DE MPTs

•Espectrometria de Massas (ESI-Q-TOF)

•Gel 2D

•Coloração específica

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Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas

? É o método ideal para análise de modificações pós-traducionais;

? O espectrômetro de massa determina a razão massa/carga do peptídeo ou proteína ionizadas;

? O erro de massa é freqüentemente inferior a 10 ppm (depende da máquina)

- Exemplo: 0,02 Da por peptídeo de 2000 Da

? A presença ou ausência de modificações pós-traducionais causam diferenças na massa do peptídeo.

? Em princípio, qualquer MPT pode ser detectada pela espectrometria de massa.

? O espectrômetro funciona como uma balança analítica;

? Mede a massa dos resíduos de aminoácidos;

? Cada aminoácido tem sua massa previamente definida;

Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas

Massa (Da)Aminoácido

113.1594Isoleucina (I)

137.1411Histidina (H)

57.0519Glicina (G)

128.1307Glutamina (Q)

129.1155Ácido Glutâmico (E)

103.1388Cisteina (C)

115.0886Ácido Aspártico (D)

114.1038Asparagina (N)

156.1875Arginina (R)

71.0788Alanina (A)

Massa (Da)Aminoácido

99.1326Valina (V)

163.1760Tirosina (Y)

186.2132Triptofano (W)

101.1051Treonina (T)

87.0782Serina (S)

97.1167Prolina (P)

147.1766Phenylalanina (F)

131.1926Metionina (M)

128.1741Lisina (K)

113.1594Leucina (L)

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-2Ligações Disulfíticas

238Acilação

14Metilação

16Hidroxilação

1Deaminação

42Acetilação

> 1.000Ubiquitinação

> 800Glicosilação

80Fosforilação

? Massa, DaMPT


? Exemplos de mudanças de massas devido às modificações


Como funciona?

? Existem diversos modelos que diferem quanto à fonte de ionização, quanto ao analisador de massas diferentes propósitos.

? Componentes:

Ionizador•MALDI•Electrospray (ESI)

Amostra

+_

Analisador de Massa•Tempo de vôo (TOF)•Quadrupolo•Ion-Trap

Detector

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Gás nebulizador N2

Temp 20-350ºC

Espectrometria de Massas

Como funciona ?? Modelo: ESI-Quadrupolo-TOF

•Fonte de ionização: Electrospray (ESI)

Análise massa

+ 6.000 V

Eletrodo


Detector

Quadrupolo

AmostraVoltagens

Íon ressonante

Íon não ressonante

? Analisador de Massa ou Filtro de Massa ou Separador de Massa

• O Analisador Quadrupolar é o mais comum atualmente.

•Mudando-se o potencial elétrico aplicado,

seleciona-se diferentes massas.

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? Tempo de Vôo (TOF): é um analisador de massa.

+

++

++

+

++ +

Íons - amostra Detector

Distância fixa

Mais leveMais pesado


? Espectrometria em Tandem – MS/MS

-São filtros de massa concetados em série.

- Ideal para moléculas grandes e amostras complexas (mais sensíveis).

DetecçãoAmostra Ionização Separação m/z

Fragmentos Separação m/z

ESI

MALDI

Célula de Colisão

-

+

++ +

+

+

MS 1

Íon precursor

MS 2

produto do íon

Detector

Gás Ar

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Análise de MPTs

Levar em consideração o

déficit de massa!

•?m= 80 Da

Protease

Protease

Proteína Modificada

Proteína não modificada

Peptídeos

Peptídeos

Corresponde à adição de um

HPO3

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? Nos fornece picos m/z característicos durante a MS/MS;

? Espectrômetros MS/MS podem ser programados para detectar somente os peptídeos que geram sinais específicos de MPTs;

? Exemplo: peptídeos contendo resíduos Lisina acetilada geram um sinal de íon fragmentado com m/z de 126,1.

MPTs – mistura proteínas

Digestão proteolítica

HPLC

Íons peptídeos

spray Espectro MS/MS


LC-MS total

Anotação da MPT no peptídeo

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Gel 2 DimensõesGel 2 Dimensões

? Separação dos diferentes estados de modificações das proteínas;

? Em seguida, os spots são excisados e identificados por MS;

? Técnicas se baseiam na utilização de corantes e anticorpos específicos, marcações com P-32;

Incorporação de P-32

(Bikova et al, 2003)

IEF

Mas

sa M

olec

ular

(KD

a)

SD

S-P

AG

E

Comassie Phospho-imagem

Visualização por autorradiografiadas proteínas fosforiladas


? Análise utilizando anticorpo para fosfotirosina:

(Kim et al., 2002)

Coloração de Prata Coloração imunofosforilação

MAP Kinases

GAPDH

Proteínas totais Proteínas fosforiladas

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? Corantes fluorescentes específicos Análise Multiplex

(Invitrogen)

Células Normais de Fígado Células de Tumor de Fígado

Estratégia Geral de Análise de Estratégia Geral de Análise de MPTsMPTs

Célula

Preparação da Amostra

•Extração Proteínas

•Enriquecimento da amostra com proteínas modificadas

•Digestão proteolítica

•Enriquecimento da amostra com peptídeos modificados

Peptídeos modificados

Ionização

Fase gasosa

Peptídeos ionizados

Aquisição MS

Análise computacional

Anotação de MPTs

Validação da anotação

RéplicaFunção da MPT

Continuação experimentos

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Cuidados Gerais na Análise de Cuidados Gerais na Análise de MPTsMPTs

? A quantidade de amostra deve ser suficiente;

- as MPTs encontram-se sob baixa concentração.

- spots devem ser concentrados.

? Remoção de contaminantes e concentração da amostra através da purificação com microcolunas antes da MS;

? Deve haver uma boa cobertura de seqüência peptídica;

- requer análise do peptídeo específico que contém a modificação.

- a cobertura de seqüência pode ser melhorada pela divisão da amostra em frações antes da análise MS

- outra técnica utilizada para a melhora da cobertura de seqüência é a utilização de duas enzimas diferentes para digestão das proteínas.

Cuidados Gerais na Análise de Cuidados Gerais na Análise de MPTsMPTs

? Um spot pode conter uma proteína com a mesma modificação em locais específicos diferentes;

- Ex: em um mesmo spot tenho proteína fosforilada em Ser e Tyr

Um spot pode conter também proteínas modificadas e não modificadas;

- a utilização de faixas de pI menores (melhor resolução) ajudará a identificar/separar proteínas modificadas das não modificadas.

? Algumas modificações possuem ligações lábeis, ocorrendo perda destas MPTs durante o processo o preparo da amostra e ionização;

- devemos encontrar condições que mantenham estas ligações (muito difícil!!!)

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SIMPLICIDADE

SELETIVIDADE

SENSIBILIDADE

Experimentos baseados em:Experimentos baseados em:

Bancos de Bancos de MPTsMPTs

? As diferentes MPTs ocorrem em seqüências específicas;

? A presença de uma seqüência específica não significa que a mesma se encontra modificada;

? A presença de modificações em seqüências particulares pode ser útil na predição da função e localização de proteínas;

? O RESID DatabaseRESID Database é um banco público que possui documentado mais de 320 modificações pós-traducionais;

? Possui uma coleção de anotações e estruturas de modificações pós-traducionais incluindo modificações na extremidade amino-terminal, carboxi-terminal e nas cadeias peptídicas;

? Possui informações cruzadas com o SWISS-PROT e TrEMBL (bancos de seqüências de proteínas);

http://www.ebi.ac.uk/RESID/

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•EXPASYEXPASY (Ferramentas proteômicas)

•Predição de locais onde podem ocorrer modificações pós-traducionais;

•É importante associar a predição com a detecção experimental!

Exemplos de Ferramentas:

•TermiNator – Predição de modificações N-terminais•Sulfinator - Predição de sulfatação de tirosina•NetPhos – Predição de fosforilação de Ser, Thr e Tyr em proteínas eucarióticas•MITOPROT – Predição de seqüências-sinais mitocondriais•NetNGlyc – Predição de N-glicosilação em proteínas humanas

Predição de Predição de MPTsMPTs

http://ca.expasy.org/

ConclusõesConclusões

? As MPTs são extremamente importantes para o funcionamento de sistemas biológicos;

? O grande interesse em entender a diversidade de proteínas e a regulação de processos têm levado ao estudo de MPTs;

? Existem numerosas técnicas que estão sendo desenvolvidas rapidamente e aplicadas ao estudo de MPTs;

? Instrumentos extremamente rápidos e precisos (espectrômetros de massa);

? O estudo de MPTs contribui para o entendimento:

- etiologia de doenças (diagnóstico, novas drogas);

- respostas a estresses;

- redes de sinalização que regulam os processos biológicos da célula

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Obrigada pela Atenção!

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