UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS

ENERGÉTICAS E NUCLEARES

Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria

glabrata exposto a Radiação Gama de 60Co

LUANNA RIBEIRO SANTOS SILVA

RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL

AGOSTO – 2010

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Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria glabrata exposto a

Radiação Gama de 60Co

LUANNA RIBEIRO SANTOS SILVA

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Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria glabrata exposto a

Radiação Gama de 60Co

Dissertação de Mestrado submetido

ao Programa de Pós-graduação em

Tecnologias Energéticas e Nucleares,

do Departamento de Energia Nuclear,

da Universidade Federal de

Pernambuco, para obtenção do título

de Mestre em Ciências. Área de

Concentração: Dosimetria e

Instrumentação Nuclear.

Orientador: Profª. Drª Edvane Borges da Silva (CAV/DEN-UFPE) Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Maria M. De Albuquerque Melo (DBR-UFPE)

RECIFE-PERNAMBUCO-BRASIL

AGOSTO-2010

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7

Dedico à minha família e meus amigos

que sempre me acompanharam

em todos os momentos.

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AGRADECIMENTOS

A todas as forças celestiais que me ajudaram na minha jornada da vida.

À Nossa Senhora da Conceição, por nunca ter me faltado quando precisei.

Aos meus pais, Antonio Ribeiro Silva Filho e Severina Cecília dos Santos, por toda dedicação, amor e educação a mim dada.

À minha Orientadora, Ana Maria Mendonça de A. Melo, pela paciência, amor e companheirismo e por TODOS esses anos juntos no laboratório. Porque sem ela não sei o que eu seria.

À minha Orientadora, Edvane Borges da Silva, pelo carinho e toda paciência durante todo o mestrado.

Ao professor Amâncio, pelos ensinamentos e por ser meu pai cientifico.

À minha amada avó Alice Anunciação (in memorian) por ter simplesmente ter sido tudo na minha vida e ter me ensinado que o amor é o maior troféu que um homem pode carregar.

Aos meus avós que mesmo sem perceber me ajudam muito.

A meu irmão Luann Ribeiro, por ter me apoiado em todos as momentos que precisei.

Aos meus amigos que sempre estavam ao meu lado em todos os momentos da minha vida.

A todos do laboratório de Radiobiologia da UFPE, Cris, Mona, Fabrício, Gustavo, Pedro, Edvaldo, Will, Samia, Karine e todos que me ajudaram direta e indiretamente.

A minha amiga Rebeca Cantinha, pelo carinho e pela parceria.

Ao departamento de Biofísica e Radiobiologia do CCB/UFPE, pelo suporte e ajuda na minha jornada cientifica.

À seu Fredson pelo apoio e pelos incentivos que me foi dado durante todo o estagio.

Ao Laboratório de Metrologia das Radiações Ionizantes (DEN/ UFPE), na pessoa da Profª Helen Koury, por ter cedido gentilmente a fonte radioativa para realização de meus trabalhos.

Ao LAMBDA, na pessoa do Profº Ademir Amaral, pelo suporte de equipamentos e insumos para realização dos experimentos.

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À Ronaldo e Clarissa, pelo o amor, pois é isso que nos une.

Ao meu grande amigo Luiz Reinuax (in memorian), por ter vibrado a cada conquista e por todo carinho que me foi dado. Te amo, jamais esquecerei a sua alegria.

À todas amizades cultivadas na graduação, que nunca esquecerei.

À Carlos Eduardo (Dola), pelo companheirismo, PACIÊNCIA e amor cultivado.

A todos os membros das bancas examinadoras Prof. Dr. Francisco Fernandes Amancio, Profa. Dra. Vlaudia Costa, Prof. Dr. Ademi r Amaral, Prof. Dr. Thiago de Salazar e Fernandes e Prof. Dr. Cristiano Aparecido Chagas por suas valiosas contribuições para o enriquecimento deste trabalho. Ao Departamento de Energia Nuclear na pessoa do Prof. Dr. André Maciel Netto.

Aos professores do DEN, pelo suporte científico que me concederam neste mestrado

A todos os funcionários do DEN, em especial a Magali e Nilvânia, pela amizade e por tornarem minha jornada muito mais agradável.

Aos colegas do GERAR , pela companhia e pelos momentos agradáveis que passamos juntos.

Aos colegas do DEN pela amizade e companhia neste caminho.

À minha pequenina cunhada Natalia Mirrely, por ter aquentado meus estresses.

Às minhas filhas, Sasha, Lecca e Raquely por terem alegrado todos os meus dias.

À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo suporte financeiro para a execução deste trabalho.

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema da ação da radiação na molécula de DNA. www.cnen.gov.br 5

Figura 2 Classificação taxonômica de Biomphalaria glabrata, segundo Rey (2001) 10

Figura 3 (A) Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melânico. (B) Concha do molusco B. glabrata1. Fonte: http://www.elrincondelmalacologo.com 11

Figura 4 Hemócito de B. glabrata, corados com DAPI e observados no microscópio de fluorescência. (aumento 1000X) 13

Figura 5 (A) Hialinócitos corados com Giemsa.(1000 X); (B) Granulócitos corado com Giemsa.(1000 X) 14

Figura 6 Aquários de criação de moluscos B. glabrata do moluscário do Departamento de Biofisica e Radiobiologia-UFPE 18

Figura 7 (A) Recipientes individuais de B. glabrata; (B) Molusco, demonstrando o diâmetro da concha 19

Figura 8 (A) Fonte Gammacell® 220 Excel-MDS Nordion. (B) Tubos Falcon com os B. glabrata que serão irradiados 21

Figura 9 Microscópio óptico Medilux do laboratório de Radiobiologia (DBR-UFPE) 23

Figura 10 Microscópio de Fluorescência Leica CW4000 do Lambda (DEN-UFPE) 24

Figura 11 Esquema com os critérios de identificação de MN; (A) Diâmetro menor que 1/3 do tamanho do núcleo; (B) Cor e textura semelhante ao núcleo; (C) Não estar em contato direto com o núcleo. 25

Figura 12 Alterações encontrados na hemolinfa de B. glabrata irradiados nas doses de 35, 45 e 55 Gy. (A) Núcleo bilobulado; (B) núcleos interligados 28

Figura 13 Apoptose em hemócitos de Biomphalaria glabrata submetidos a 55Gy de radiação gama de 60Co 29

Figura 14 (A) Hemócito corado com Giemsa; (B) Hemócito corado com Hoechst 33258. A seta vermelha indica MN 34

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Hemócitos originários dos moluscos irradiados e não

irradiados

26

Tabela 2 – Dados da Frequência de Micronúcleo de B. glabrata

submetidos a radiação gama de 60Co

30

Tabela 3- Vantagens e limitações das técnicas de coloração Giemsa e

Hoechst 33258

35

12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

B. glabrata Biomphalaria glabrata 60Co Cobalto-60

CNEN Comissão Nacional de Energia Nuclear

DBR Departamento de Biofísica e Radiobiologia

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DEN Departamento de Energia Nuclear

Gy Gray

kGy KiloGray

MN Micronúcleo

13

Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria glabrata exposto a

Radiação Gama de 60Co

Autor: Luanna Ribeiro Santos Silva Orientador: Profª. Drª Edvane Borges da Silva Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Maria M. De Albuquerque Melo

RESUMO

As radiações ionizantes podem induzir mutações gênicas, aberrações cromossômicas e morte celular. Recentemente, começou a haver grande empenho no desenvolvimento de técnicas que auxiliem na compreensão desses possíveis danos biológicos surgidos após exposições dos organismos a certas doses de radiação ionizante. Dentre estas técnicas, o teste do micronúcleo tem se mostrado um ótimo biomarcador de efeitos de genotoxicidade do dano ao DNA. Esta técnica também pode ser utilizada para detecção de genotoxicidade ambiental, na biomonitoração. O molusco Biomphalaria glabrata, devido às suas características biológicas e ambientais, tem se apresentado como um ótimo modelo experimental, possibilitando a avaliação de efeitos produzidos por agentes físicos e químicos. Diante disso, o presente trabalho visou detectar os efeitos genotóxicos da radiação gama de 60Co em hemócitos de Biomphalaria glabrata, por meio do teste do micronúcleo, bem como estabelecer este ensaio como um novo biomarcador ambiental. Os moluscos foram divididos em grupos e submetidos a dose de 0 (controle), 25, 35, 45 e 55 Gy de radiação gama. Após 48 horas da irradiação, a hemolinfa dos moluscos foi coletada e analisada em microscópios óptico e de fluorescência. As lâminas foram coradas com Giemsa e hoechst 33258, posteriormente foram analisadas quanto ao número de hemócitos, alterações nucleares e frequência de micronúcleos. A análise estatística foi realizada por meio do Teste do χ2, ANOVA e teste de Tukey, com p<0,05. Os resultados obtidos demonstram que moluscos adultos de B. glabrata se mostraram sensíveis aos efeitos da radiação gama de 60Co. Na dose 35 Gy apresentaram um número menor de hemócitos, enquanto que os expostos a 55 Gy uma maior quantidade de hemócitos. Os hemócitos dos moluscos irradiados apresentaram alterações morfológicas e aterações celulares nas doses de 35, 45 e 55 Gy, sendo a dose de 55 Gy a mais radiotóxica. A freqüência de micronúcleos não foi dose-dependente, porém apresentou diferença significativa entre o grupo controle e os grupos irradiados. Pode-se concluir que a análise morfológica e a frequência de micronúcleo de hemócitos de Biomphalaria glabrata são parâmetros confiáveis na avaliação da ação de agentes genotóxicos em ambientes aquáticos.

Palavras-chave: genotoxicidade ambiental, micronúcleo, hemócitos,

biomonitoramento, Biomphalaria glabrata, Radiação, 60Co

14

Detection of Micronuclei in Haemocytes from Biomphalaria glabrata exposed to 60Co Gamma Radiation

Author: Luanna Ribeiro Santos Silva Adviser: Profª. Drª Edvane Borges da Silva Co-adviser: Profª. Drª. Ana Maria M. De Albuquerque Melo

ABSTRACT

Ionizing radiation can induce genetic mutations, chromosomal aberrations and cellular death. Recently, a large effort has been done for the development of several techniques that help with the comprehension of possible biological damages that occur after some organisms’ exposure to certain doses of ionizing radiation. Among these techniques, the micronucleus test has proved an excellent biomarker of genotoxic effects from DNA damage. This technique can also be used for the detection of environmental genotoxicity in biomonitoring. The mollusk Biomphalaria glabrata, due to their biological characteristics and environmental factors, has emerged as an excellent experimental model, enabling the evaluation of effects produced by physical and chemical agents. Therefore, this study aims to detect the genotoxic effects of gamma radiation from 60Co in haemocytes from Biomphalaria glabrata through micronucleus tests, and set this as a new biomarker test environment. The snails were divided into groups and subjected to doses of 0 (control), 25, 35, 45 and 55 Gy of gamma radiation. After 48 hours of irradiation, the mollusks haemolymph were collected and examined in optical and fluorescence microscopes. The slides were stained with Giemsa and Hoechst 33258, and analyzed according to the haemocytes number, nuclear changes and micronuclei frequency. The statistical analysis was performed using the χ2Test, ANOVA and Tukey test with p<0.05. The results showed that adult snails B. glabrata were sensitive to effects of 60Co gamma radiation. The 35 Gy dose showed a lower number of haemocytes, whereas the exposed to 55 Gy showed greater amounts of haemocytes. The haemocytes of irradiated mollusks showed morphological and cellular abnormalities at doses of 35, 45 and 55 Gy and the dose of 55 Gy was more radiotoxic. The micronuclei frequency was not dose-dependent, but there is significant difference between control and irradiated-groups. It can be concluded that morphology analysis and the micronuclei frequency in haemocytes of Biomphalaria glabrata are reliable parameters to evaluate the effects of genotoxic agents in aquatic environments. Keywords: micronucleus, haemocytes, biomonitoring, Biomphalaria glabrata, radiation, 60Co

15

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DE LITERATURA 4

2.1. Radioecologia 4

2.2. Biomonitoramento 7

2.2.1. Teste do micronúcleo 9

2.3. Biomphalaria e sua utilização como bioindicador 10

3. METODOLOGIA 18

3.1. Criação e Manutenção dos Moluscos 18

3.2..Seleção dos moluscos 19

3.3. Irradiação de Moluscos Adultos 20

3.4. teste de Micronúcleo dos moluscos B. glabrata 21

3.4.1. Coloração Giemsa (convencional) 22

3.4.2. Coloração para fluorescência 23

3.5. Análise das lâminas 24

3.6. Análise estatística 25

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 26

4.1. Análise da radiosensibilidade celular dos hemócitos de

B. glabrata.

26

4.2. Análise da freqüência de micronúcleo 30

4.3. Comparação entre Metodologias de Coloração 33

5. CONCLUSÕES 36

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 37

16

1. INTRODUÇÃO

Os organismos vivos estão expostos naturalmente à ação das

radiações, sejam elas provenientes de fontes naturais ou artificiais (MELO, 1994

& MELO, 1998). Sabe-se que as radiações ionizantes também podem induzir a

mutações gênicas, aberrações cromossômicas e morte celular (SEGRETO, 2005;

HALL, 1994).

As células irradiadas apresentam ainda uma tendência ao aumento

ou diminuição do número de cromossomos e muitos dos efeitos celulares são

decorrentes de mudanças durante a duplicação ou reparo de danos do DNA.

Estas alterações podem causar instabilidades cromossômicas transmissíveis,

resultando em efeitos variados, mesmo depois de vários ciclos mitóticos

(GREENSTOCK, 1986; COSTA; MENK, 2000).

Recentemente tem havido grande empenho no desenvolvimento de

técnicas que auxiliem na compreensão desses possíveis danos biológicos que

surgem após exposições dos organismos a certas doses de radiação ionizante.

São elas: o teste do letal dominante (NAKANO, 2003; BATEMAN, 1971;

TALLARICO, 2004), ensaio do cometa (GRAZEFFE, 2008; VILELLA, 2006a);

teste do micronúcleo (FERNANDES, 2005; BRAGA, 2006, PAVLICA, 2000;

GODOY, 2008, CARVALHO, 2005) e aberrações cromossômicas (BAUCHINGER,

1995; RAMALHO, et al, 1988; LLOYD, 1997; FERNANDES, 2008a;

FERNANDES, 2008b).

Os micronúcleos (MN) são estruturalmente pequenos núcleos

representando o material genético que foi perdido pelo núcleo principal, como

consequência de um dano genético que pode ser causado por agentes físicos,

químicos ou biológicos, capazes de interferir no processo de ligação do

cromossomo às fibras do fuso ou que possam induzir a perda de material

genético, como cromossomos inteiros ou fragmentos de cromossomos

(SCHMIDT, 1975; VILLELA, 2006).

17

O ensaio do micronúcleo tem se mostrado um ótimo biomarcador da

ação de agentes genotóxicos ou mutagênicos. Por esta razão é utilizado no

estudo da genotoxicidade ambiental, com o propósito de biomonitoramento

(VILLELA, 2006).

O estudo da monitoração dos ambientes é importante, devido aos

diversos agentes físicos e químicos que são lançados no ambiente, provenientes

de diversas atividades humanas (ARAUJO et al., 2001). Organismos vivos, como

os moluscos Biomphalaria glabrata, que estão nesses ambientes podem sofrer

danos em suas biomoléculas. Por esta razão, o desenvolvimento de técnicas

sensíveis e de baixo custo para detecção destes efeitos é de grande importância.

O molusco, Biomphalaria glabrata, devido às suas características

biológicas e ambientais, tem-se apresentado como ótimo modelo experimental,

possibilitando a avaliação de efeitos produzidos por agentes físicos e químicos

(ESTEVAM, 2006; CANTINHA, 2010; SILVA, 2008, TALLARICO, 2004). Por sua

ampla distribuição geográfica e interferência sobre a saúde humana, como vetor

intermediário da esquistossomose mansônica, ganha interesse não apenas como

modelo de alterações fisiológicas induzidas por estímulos externos, mas também

por viabilizar a padronização de metodologias de controle populacional, ou como

bioindicadores e biomarcadores de interferentes ambientais.

Com isso, o objetivo geral deste trabalho é fornecer subsídios para a

padronização do ensaio do micronúcleo em hemócitos de Biomphalaria glabrata

como nova ferramenta na biomonitoração da ação de agentes físicos e químicos

lançados em ambientes aquáticos.

Neste contexto, esta pesquisa busca especificamente:

• Estudar a radiossensibilidade dos moluscos adultos da espécie

Biomphalaria glabrata;

• Avaliar alterações celulares nos hemócitos destes moluscos

submetidos a diferentes doses de radiação gama de 60Co;

• Analisar a frequência de micronúcleos em moluscos B. glabrata

submetidos a radiação gama de 60Co.

18

• Comparar qual a melhor metodologia de coloração, entre o Giemsa

e Hoechst, a ser utilizada no ensaio do micronúcleo em hemócitos

de B. glabrata.

19

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Radioecologia

Didaticamente, radioecologia ou “ecologia da radiação” pode ser

considerada uma ciência multidisciplinar, que visa a compreensão das inter-

relações entre a radiação ionizante ou de substâncias radioativas com o meio

ambiente. Portanto, podemos dizer que esta ciência desempenha um papel cada

vez mais importante no controle das diferentes fontes de poluição ambiental

(ANJOS, et al., 2004; ANJOS, 2006).

Sabe-se que a radiação é energia que se propaga através da matéria

ou do espaço em forma de onda (radiação eletromagnética) ou partícula (radiação

corpuscular) (CNEN, 2005).

A radiação eletromagnética, dependendo de sua energia e interação

com a matéria, pode ser classificada em ionizante (radiação gama e os raios-X),

quando possuir energia suficiente para arrancar elétrons de um átomo,

produzindo pares de íons, e não ionizante que interage com o meio podendo

interferir nas biomoléculas excitando, os elétrons promovendo de sua camada de

origem para uma camada mais externa. São exemplos de radiação não ionizante

os raios ultravioletas, infravermelhos, as ondas de radiofrequência, o laser, as

microondas e a luz visível (CNEN, 2005; BITELLI, 2006).

A radiação corpuscular é representada por partículas carregadas,

como alfa, beta, prótons e elétrons, que podem interagir com o meio causando

grande ionização das moléculas (CNEN, 2005; BITELLI, 2006).

Os efeitos da radiação em nível celular são decorrentes de mudanças

ocorridas durante a duplicação ou no reparo de danos do DNA, causando

instabilidade cromossômica transmissível. Os efeitos podem ocorrer quando o

DNA sofre ação direta das radiações (ionização) ou indireta, por meio do ataque

de radicais livres que são produzidos pela radiólise da molécula da água (Figura

20

1). O DNA expõe-se basicamente a dois tipos de danos: mutações gênicas e

quebras, acarretando falhas na divisão celular podendo levar a morte celular ou a

efeitos variados mesmo depois de vários ciclos mitóticos (SABATIER et al., 1995).

Figura 1 Esquema da ação da radiação na molécula de DNA. www.cnen.gov.br

Ao interagir com o sistema biológico, a radiação ionizante pode

provocar nas células diversas respostas que acabam ou não as levando à morte.

Os efeitos dependem do tipo de estrutura atingida e da eficiência do mecanismo

de reparo celular (BARACAT, 2000; MOORE, 2002). Outros aspectos inerentes

às radiações ionizantes e interferentes sobre seus efeitos biológicos devem ser

observados, tais como: o tipo de radiação empregada, a quantidade de energia

liberada no percurso desta, a atividade da fonte radioativa, a taxa de dose da

fonte, a presença de oxigênio e a dose absorvida (POUGET; MATHER, 2001).

Pode-se observar ainda que o dano biológico produzido pela radiação

ionizante aumenta com o incremento da dose ou com a quantidade de energia

absorvida da radiação. Podemos conceituar dose absorvida como a energia

21

média depositada pela radiação em um volume elementar de matéria (CNEN,

2005).

Segundo Okuno (1988) e Segreto (2000), os efeitos biológicos da

radiação são comumente classificados em somáticos e genéticos. Os efeitos

somáticos afetam apenas a pessoa irradiada e podem ser divididos em imediatos

e tardios. Os efeitos imediatos aparecem nos indivíduos que foram expostos à

radiação ionizante e apresentarão sinais e sintomas em até 60 dias (eritemas,

síndrome aguda da radiação etc). Os efeitos tardios caracterizam-se por surgirem

após este período ou até anos depois da exposição, podendo induzir

cancerização. Os efeitos genéticos (hereditários) podem ocorrer quando células

germinativas são irradiadas, dessa forma os efeitos resultantes podem provocar

modificações.

O homem, não possui sensores biológicos capazes de detectar este

tipo de energia ionizante; logo, diferentes equipamentos foram desenvolvidos para

esta finalidade, tais como: Geiger-Müller, caneta dosimétrica, contador

proporcional, dosímetro termoluminescente e emulsão fotográfica. No entanto, os

detectores físicos são capazes de aferir quantitativamente a dose recebida pelo

sistema material ou biológico, porém são imprecisos na determinação dos danos

que podem surgir no meio ambiente e consequentemente no homem. Isto tem

sido motivo para o desenvolvimento de diferentes estudos nas diversas áreas

relacionadas à energia nuclear, inclusive na radioecologia (ICRP, 2003).

Estudos anteriores utilizaram bactérias (MORAES et. al, 1998),

culturas de células (COSTA et al, 2002), peixes (CHATY et al, 2004), conchas de

moluscos (FRANTSEVICH et al, 1995), ghost de hemácias (AMANCIO, 1998) e

cultura de linfócitos (FERNANDES, 2005) como modelos para mensurar os danos

provocados pela radiação nos sistemas biológicos.

Os modelos animais ideais para o estudo dos efeitos biológicos das

radiações ionizantes devem possuir como características um curto ciclo vida, fácil

manutenção em laboratório, baixo custo de manutenção, resposta rápida e

precisa e boa reprodutibilidade. O molusco Biomphalaria glabrata (B. glabrata) por

22

reunir todas estas características vem se tornando alvo de estudo para uma futura

utilização como bioindicador, não apenas da ação de agentes químicos, mas

também de agentes físicos presentes no meio ambiente (MÜNZINGER, 1987;

MOTTA et al., 1997; CANTINHA, 2008).

2.2. Biomonitoramento

Com o crescimento da industrialização e da urbanização ocorrido nas

últimas décadas, os ecossistemas aquáticos passaram a sofrer grandes impactos

decorrentes destes processos. Atividades industriais, agrícolas e domésticas são

responsáveis pelo uso de mais de um terço da água doce acessível, além disso,

estas atividades são grandes responsáveis pela contaminação destas águas por

numerosos compostos químicos. Estas águas atingem os rios, lagos e oceanos

contendo uma infinidade de contaminantes em diversas concentrações (FENT,

2004).

Para o estabelecimento da condição homeostática destes ambientes

naturais, é necessário que seja realizado monitoramento destas áreas o que

possibilitaria tomada de ações corretivas (MONSERRAT et al., 2007). Entretanto,

o monitoramento e a avaliação do risco dos ambientes impactados não podem ser

baseados exclusivamente em análises químicas de amostras ambientais, pois

não são apropriadas na indicação e predição dos efeitos deletérios causados por

contaminantes na biota (BARSIENE et al., 2006, CAJARAVILLE et al., 2000).

Desta forma, para avaliar os impactos dos poluentes na qualidade ambiental é

pertinente que sejam mensurados os efeitos que estas substâncias causam nos

organismos vivos destes ecossistemas (WELLS et al., 2001).

Logo, biomonitoramento pode ser definido como o uso sistemático

das respostas de organismos vivos para avaliar mudanças ocorridas no ambiente,

geralmente causadas por ações antropogênicas (BUSS, et al., 2003).

23

Dentre as diversas metodologias utilizadas para biomonitoração

ambiental, têm-se utilizado ensaios in vitro como o teste de AMES e in vivo, por

exemplo, o teste do MN e aberrações cromossômicas (VILLELA, 2006).

O teste do MN utiliza organismos vivos expostos a um agente

mutagênico em um determinado ambiente, os dados coletados podem nos

fornecer uma resposta complexa entre a atividade genotóxica e a eficiência dos

mecanismos de defesa do organismo. Por esta razão, representa uma ferramenta

de grande relevância ecotoxicológica (VILLELA, 2006).

A dosimetria citogenética foi utilizada na biomonitoração ambiental no

acidente nuclear de Chernobyl. Cristaldi et al. (1991) investigaram o impacto

ambiental do acidente de Chernobyl sobre roedores (Clethrionomys glareolus

Schreb) de diferentes idades que habitavam quatro regiões do sudeste sueco. O

experimento empregou testes para determinação dos radionuclídeos

(principalmente 137Cs) e testes de mutagenicidade (teste do micronúcleo de

medula óssea e ensaio da anormalidade do esperma). Os resultados obtidos

mostraram uma correlação positiva entre o aumento de micronúcleos em

eritrócitos policromáticos e a dose absorvida. Ao final dos experimentos

observaram que o teste do micronúcleo se mostrou eficaz na análise dos efeitos

biológicos da contaminação por radionuclídeo.

No Brasil, a aplicação prática da dosimetria citogenética foi realizada

nas vítimas do acidente de Goiânia (1987), quando uma parcela da população foi

contaminada por Césio (137Cs). Nesse caso, detectou-se a freqüência de seis

aberrações cromossômicas instáveis (cromossomos dicêntricos, em anel e

fragmentos acêntricos) permitindo o cálculo da dose de radiação absorvida por

cada indivíduo estudado (RAMALHO; NASCIMENTO, 1991).

Pode-se afirmar que a dosimetria citogenética, tão utilizada para

mensurar dose absorvida de radiação em humanos expostos, pode ser utilizada

para medir os efeitos da radiação ou de substâncias químicas sobre outros

indivíduos ou espécies, mostrando ser uma excelente ferramenta nos estudos da

radioecologia.

24

2.2.1. Teste do Micronúcleo (MN)

Micronúcleos são corpúsculos similares em estrutura ao núcleo,

constituído de uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada

do núcleo principal. Podem ser formados a partir de perdas de fragmentos

acêntricos; por uma variedade de consequências mecânicas de quebra e troca

cromossômica e por perda de cromossomos inteiros (HEDDLE et al., 1991).

Assim sendo, o micronúcleo representa perda da integridade da cromatina em

consequência de dano cromossômico estrutural (fragmento) ou dano no aparelho

mitótico, sendo agentes genotóxicos um dos prováveis causadores destes danos.

(VILLELA, 2006b)

O teste do MN é um ensaio tecnicamente simples que permite a

detecção da ação de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos) e

aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal),

sendo considerado um excelente biomarcador. Amplamente utilizado há vários

anos, sendo, portanto, bem validado para um grande número de substâncias

testadas. É uma técnica de triagem rápida e de baixo custo, adequada para

avaliar a exposição de peixes marinhos e de água doce a contaminantes (CÓLUS

et al., 2002).

O aspecto mais importante do teste do micronúcleo é que ele permite

identificar eventual aumento na frequência de danos genéticos em células que

são expostas variados agentes genotóxicos, sendo capaz de expressar os danos

nos cromossomos na forma de MNs. Assim, esse teste é originalmente, entre os

testes citogêneticos, o que fornece uma medida de confiança da perda do

cromossomo e da ruptura do fuso mitótico (FENECH, 1998).

25

O teste do micronúcleo, ao lado da análise de aberrações

cromossômicas e o ensaio do Cometa, é considerado o padrão-ouro dentre os

métodos citogenéticos. Tem sido amplamente utilizado em programas de

biomonitoramento, e é considerado uma valiosa ferramenta para avaliar

exposições de organismos aquáticos a substâncias genotóxicas. O teste do

micronúcleo é um importante sinalizador precoce de danos com consequências

irreversíveis (FREIRE, 2008).

Diante do que foi mostrado e da escassez de trabalhos utilizando

animais dulcícolas, vê-se necessário a padronização de uma técnica sensível,

como o teste do MN, para detectar a ação de agentes mutagênicos químicos e

físicos.

2.3 Biomphalaria e sua utilização como bioindicador

O caramujo Biomphalaria tem sua classificação taxonômica descrita

segundo Rey (2001) como demonstrado no fluxograma a seguir:

Figura 2 Classificação taxonômica de Biomphalaria glabrata, segundo Rey

(2001).

26

Os moluscos Biomphalaria glabrata são de água doce, possuem

conchas grandes em geral discóides, enroladas em espiral plana, sem opérculo,

na qual se forma de cada lado uma depressão que lembra um umbigo (Figura 3-

A). Nos criadouros naturais são encontrados exemplares com tamanho entre 1 a

2,5 cm, apresentando conchas com 4 a 6 giros (Figura 3 -B) (REY, 2001)

Figura 3 (A) Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melânico. (B) Concha do molusco

B. glabrata1. Fonte: http://www.elrincondelmalacologo.com.

Dentre os invertebrados, o filo Mollusca mostra evoluções nos

sistemas que não aparecem nos outros filos. Fazendo uma breve descrição dos

sistemas desses animais, podemos citar o sistema excretor que é composto de

uma estrutura alongada denominada rim que tem um curto ureter. Ao longo de

todo o rim observa-se uma prega mucosa, saliente e pigmentada, denominada

crista renal (REY, 1991; NEVES, 2004). A respiração é feita por dois órgãos: o

saco pulmonar e as pseudobrânquias, embora o órgão respiratório principal seja o

saco pulmonar (PESSÔA; MARTINS, 1988; REY, 1991; CIMERMAM;

CIMERMAM, 2001; NEVES, 2004).

A principal evolução do filo mollusca é o desenvolvimento de um

sistema nervoso primitivo, ausente nos demais filos de invertebrados (BARNES,

1996). Nos gastrópodes, o sistema nervoso é formado por gânglios que ficam

dispostos em torno do esôfago, atrás do saco bucal. Os órgãos dos sentidos são:

um par de olhos, um receptor olfativo (osfrádia), um par de órgãos do equilíbrio e

A B

27

orientação locomotora (otocistos), receptores de contato sob a forma de

elementos sensitivos (ex.: tentáculos); além de quimioreceptores

morfologicamente diferenciados ou não, denominados rinóforos (REY, 1991;

CIMERMAM; CIMERMAM, 2001).

O aparelho digestivo desses animais começa com a abertura bucal,

localizada, por vezes, na extremidade da tromba; espessamentos cuticulares

denominados mandíbulas, e um par de glândulas salivares que se abrem na

cavidade bucal (REY, 1991).

No interior do saco bucal encontra-se a rádula, fita alongada e

revestida de numerosos dentes quitinosos, cujos dentículos, em forma de

ganchos, têm as pontas dirigidas para trás (PESSÔA; MARTINS, 1988). A rádula

faz com que os alimentos sejam ralados e ao mesmo tempo dragados em direção

ao esôfago (REY, 1991). Alguns autores consideram a rádula como estrutura

responsável pela eclosão dos ovos embrionados, sendo assim classificada como

um órgão radiossensível (MELO, 1998).

Os resíduos da digestão são evacuados pelo intestino, onde ocorre

também a reabsorção de água (REY, 1991). Essa evacuação ocorre ao nível da

pseudobrânquia (PESSÔA; MARTINS, 1988).

Esses moluscos são seres hermafroditas, com gônada única em

forma de cacho, providas de numerosos ácinos, denominadas ovoteste, onde

óvulos e espermatozóides formam-se lado a lado (PESSÔA; MARTINS, 1988;

REY, 1991; MONTEIRO; KAWANO, 1998; CIMERMAM; CIMERMAM, 2001).

Experimentos realizados por Paraense (1970) e Rozemberg (1989)

demonstraram que quando estes moluscos estão em colônia a forma de

reprodução preferencial é a fecundação cruzada, porém podem mudar sua forma

de reprodução para autofecundação, principalmente quando as circunstâncias

ambientais são severas.

Poucos relatos são encontrados na literatura sobre a presença de um

órgão hematopoiético especializado nos moluscos gastrópodes e bivalves,

28

existindo uma indicação de que nestes animais as células da hemolinfa são

formadas por todo o corpo. A presença de amebócitos (hemócitos) está dividida

entre a circulação sanguínea e o tecido conectivo, o que favorece o grande

sucesso adaptativo destas espécies, que ocupam posição de destaque no filo

Mollusca (SOUZA, 2006; GEORGE; FERGUSON, 1950; BROWN; BROWN,

1965).

O sistema circulatório desses animais é composto por coração com

duas cavidades: aurícula e ventrículo. O sangue ou hemolinfa compõe-se de

elementos amebóides (hemócitos), plasma rico em água, cloreto de sódio,

bicarbonatos e hemoglobina dissolvida, contendo ferro que permite a utilização do

oxigênio dissolvido à baixa tensão (PESSÔA; MARTINS, 1988; REY, 1991;

VERRENGIA GUERRERO et al., 1997). Os hemócitos (Figura 4) são as principais

células efetoras do sistema de defesa do caramujo, fagocitando, encapsulando e

destruindo agentes infecciosos (JEONG et al., 1983). Como o sistema circulatório

é aberto, os hemócitos podem se mover livremente para dentro e fora dos tecidos

(VAN DER KNAAP; LOKER, 1990).

Figura 4 Hemócito de B. glabrata, corados com DAPI e observados no

microscópio de fluorescência (aumento 1000X).

29

Os hemócitos são células morfológica e bioquimicamente

heterogêneas e podem ser dividas em hialinócitos que têm núcleo proprocional ao

tamanho do citoplasma, possuem poucas estruturas lisossomais e mostram baixa

tendência de formar pseudópodes ou fagocitar partículas (Figura 5 A). Outro tipo

são os chamados de granulócitos que tem mais citoplasma e lisossomos, formam

pseudópodes e fagocitam ativamente (Figura 5 B) (KNAAP & LOKER, 1990).

Figura 5 (A) Hialinócitos corados com Giemsa (1000 X); (B) Granulócitos corados

com Giemsa (1000 X).

Podemos citar ainda outra característica destes moluscos, que é o

poder de adaptação a variações ambientais, ou seja, vivem em regiões de

florestas tropicais e em zonas áridas, sobrevivem em baixas e altas altitudes,

porém, geralmente habitam cursos d’água de pouca velocidade, lagos e coleções

de água parada; suportando variação de pH entre 5,8 e 9,0 (JUBERG et al., 1987)

O gênero Biomphalaria é encontrado em vários países do mundo e no

Brasil já foram estudadas e identificadas 10 espécies, são elas: B. glabrata, B.

tenagophila, B. straminea, B. amazônica, B. peregrina, B. occidentale, B.

intermedia, B. schrammi, B. oligoza e B. kuhniana. (CARVALHO, 1992; REY,

A B

30

2001). Dentre estas destacamos as três primeiras como principais hospedeiras

intermediárias do S. mansoni, agente causador da esquistossomose mansônica,

doença endêmica no Brasil e em 70 países do mundo (PARAENSE, 1972).

Vários estudos mostraram que uma opção para eliminar ou diminuir a

população de moluscos é utilizar a radiação ionizante com o objetivo de esterilizar

estes animais, diminuindo consequentemente o número de espécimes no meio,

reduzindo assim a proliferação da esquistossomose (PERLOWAGORA-

SZUMLEWICZ, 1966; FARVAR; CEMBER, 1969; CANTINHA, 2008).

Após estes estudos, vários achados sobre a biologia de B. glabrata

foram desvendados, dando origem a novas linhas de pesquisas. Dentre elas vem

recebendo destaque a utilização destes moluscos como indicadores de poluição

ambiental química ou causada por agentes físicos, como a radiação ionizante

(ESTEVAM et al., 2006, SILVA et al., 2008; NAKANO et al., 2003)

Podemos citar primeiramente o trabalho de Okazaki et al. (1996), que

utilizando embriões destes moluscos, verificou que, após a exposição a radiação

gama de 60Co, foi possível verificar malformações específicas da presença de tal

agente. Melo (1998), também irradiando embriões de B. glabrata demonstrou que

os mesmos respondem de forma diferente a crescentes doses de radiação

ionizante.

Portanto, o desenvolvimento de técnicas mais sensíveis tornou-se um

objetivo entre os pesquisadores da área. Nakano et al. (2003) adaptou o teste do

letal dominante, utilizado primeiramente em mamíferos, para moluscos adultos de

B. glabrata. Neste experimento foram utilizados agentes químicos, mitomicina c e

ciclofosfamida, sendo utilizadas as linhagens albina e pigmentada do B. glabrata,

para detecção de mutações ligadas ao alelo dominante nos cruzamentos. Com

este experimento, foi comprovado que os espécimes adultos também apresentam

sensibilidade a substâncias mutagênicas.

O teste do letal dominante passou a ter diversificadas aplicações,

como a detecção da ação da radiação 60Co (TALLARICO et al, 2003), e ação de

31

herbicidas utilizados na agricultura e testados em laboratório (ESTEVAM et al.

2006, SILVA et al, 2008; SÁ, 2008) demonstrando a possibilidade do uso do

molusco adulto da espécie B. glabrata como biondicador de poluição ambiental

por agentes mutagênicos. Porém esta técnica possui como limitação a demora

para a obtenção dos resultados, o que torna necessário procurar técnicas mais

eficazes, de baixo custo e de resposta mais rápida.

Outro teste de mutagenicidade padronizado foi o ensaio cometa em

caramujos de água doce Biomphalaria glabrata (GRAZEFFE, 2008). O

experimento foi realizado objetivando detectar danos nos DNA de hemócitos

circulantes. Para isto, caramujos adultos foram irradiados com doses únicas de

2,5; 5; 10 e 20 Gy de radiação gama de 60Co. Os resultados demonstraram que

os efeitos genotóxicos da radiação ionizante foram detectados em todas as doses

utilizadas. O ensaio cometa em B. glabrata demonstrou ser mais uma ferramenta

na avaliação desses efeitos genotóxicos no ambiente (GRAZEFFE, 2008). No

entanto, essa técnica possui como principal limitação só ser possível realizar a

análise pontual do dano no DNA da célula, não mensurando danos de uma

geração celular para outra.

O teste do MN foi realizado in vivo e in vitro com a ostra Crassostrea

gigas para avaliar a efeitos genotóxicos do meio ambiente aquático. Os testes in

vitro foram realizados em adultos e jovens expostos ao benzo [a] pireno (BaP) e a

água de um efluente do rio Sena nas concentrações de 5, 50, 75 e 100%, um dos

locais mais contaminados da França. A freqüência de MN foi observada após 48

horas de exposição, para os dois poluentes. Observou-se que a frequência de

micronúcleos não foi muito sensível a diferentes graus de poluição, mas mostrou

alta variabilidade interindividual (BURGEOT, 1995).

Godoy (2008) utilizou os mexilhões Perna perna na região da ilha de

Cabo Frio, Arraial do Cabo, cerca de 100 km a nordeste da cidade do Rio de

Janeiro, como indicador de poluição por metais pesados 210Po/210Pb. Os

resultados demonstraram que a hemolinfa apresentou uma concentração média

de 210Po de 155 Bq.kg-1 na área contaminada. A dose de radiação não teve

qualquer efeito observável sobre a frequência de MN e quebra do DNA no

32

mexilhão, provavelmente devido à baixa taxa de dose utilizada, já que o limite de

dose sugerido foi de 10 mGy e o utilizado foi de 0,02 mGy.

Pavlica (2000) analisou a freqüência de MN, induzida por

pentaclorofenol em hemócitos do mexilhão zebra, Dreissena polymorpha e nos

gastropodas Planorbarius corneus. Os resultados obtidos sugeriram que

hemolinfa das duas espécies proporcionam um bom teste tecidual para avaliação

ambiental de genotoxicidade.

Villela (2006a) analisou a sensibilidade do mexilhão dourado,

Limnoperna fortunei, expondo as células à radiação ultravioleta, sulfato de cobre e

pentaclofenol. Todos os compostos utilizados induziram danos, gerando uma

curva dose-resposta.

Os testes de genotoxicidade, como o estudo das aberrações

cromossômicas e o teste do micronúcleo, já são utilizados como biomarcadores

da ação da radiação em células de mamíferos (AGER et al., 1990; FORAY;

MALAISE, 1995; ZHOU et al.,1997) e vêm se mostrando como boa alternativa

para análise da ação dos agentes físicos e químicos sobre moluscos marinhos

(MAJONE et al., 1990; BOLOGNESI et al., 1999), porém nenhum dado foi

encontrado na literatura especializada sobre estes testes em moluscos dulcícolas

expostos a radiação ionizante ou a agentes químicos.

Esta lacuna nos motivou a investigar a possibilidade de se utilizar B.

glabrata como um bioindicador de poluentes químicos e físicos ambientais. Isto é

de suma importância para a monitoração de meios ambientais que sejam

circunvizinhos de áreas onde haja risco ambiental, como indústrias químicas,

indústria petrolífera e usinas nucleares.

33

3. METODOLOGIA

3.1. Criação e Manutenção dos Moluscos

Os moluscos utilizados nos experimentos foram Biomphalaria

glabrata (melânicos) oriundos de São Lourenço da Mata – PE e mantidos no

moluscário do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da Universidade

Federal de Pernambuco (UFPE), em aquários plásticos, com volume de

aproximadamente 20 litros de água filtrada, declorada (filtro Bellaforte), pH em

torno de 7,0 e temperatura de 25oC ± 2oC. A limpeza dos recipientes ocorreu 3

vezes por semana e a alimentação foi realizada diariamente com alface fresca

orgânica, cultivada livre de agrotóxicos (Figura 6).

Figura 6 Aquários de criação de moluscos B. glabrata do moluscário do

Departamento de Biofisica e Radiobiologia-UFPE.

34

3.2. Seleção dos moluscos

Para realização dos experimentos foram selecionados moluscos B.

glabrata pigmentados e adultos jovens. Os animais primeiramente foram

acondicionados em aquários individuais, com capacidade de 180 mL (Figura 7-

A), e observados por cinco dias consecutivos, para comprovação de

maturidade sexual por meio da oviposição. Durante este período foram

selecionados os moluscos que apresentaram as seguintes características:

a) Adulto jovens, sexualmente maduros, constatado pela

produção de desovas com embriões saudáveis sem malformações;

b) Diâmetro da concha superior a 10 mm, medidos com

paquímetro (Figura 7 B);

c) Idade mínima de 2 meses.

Ao término destas etapas, foram selecionados 50 animais.

Figura 7 (A) Recipientes individuais de B. glabrata; (B) Molusco, com diâmetro

da concha superior a 10 cm.

A B

35

3.3. Irradiação de Moluscos Adultos

Os moluscos selecionados foram separados em grupos com 10

animais para cada dose de radiação. A exposição foi realizada na fonte

Gammacell 60Co (modelo 220 Excel- MDS Nordion) do Departamento de

Energia Nuclear da UFPE, com a taxa de dose de 6,912 kGy/h (Janeiro de

2010) (Figura 8-A). As doses utilizadas no experimento foram, 25, 35, 45 e 55

Gy e o controle não irradiado. As doses aplicadas foram estabelecidas levando-

se em consideração trabalhos anteriores realizados no Laboratório de

Radiobiologia do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE (SILVA,

2008; CANTINHA, 2008; CANTINHA, 2010), onde os efeitos observados não

foram letais nem possíveis de serem analisados morfologicamente.

Para proceder às irradiações os moluscos foram acondicionados

em tubos de ensaio plástico de 50 mL (tipo: FALCON) (Figura 8 B), separados

por finas camadas de gazes úmidas, para evitar a dessecação dos animais, e

em seguida levados à fonte Gammacell. Todos os grupos experimentais

inclusive o grupo controle foram mantidos nas mesmas condições de

temperatura, umidade e estresse. Após a irradiação, os grupos de moluscos

foram acondicionados em recipientes contendo 250 ml de água.

36

Figura 8 (A) Fonte Gammacell® 220 Excel-MDS Nordion. (B) Tubos Falcon

contendo B. glabrata para exposição às doses de radiação.

3.4 Teste do Micronúcleo em moluscos B. glabrata

O procedimento de preparação das lâminas para análise de

micronúcleo foi realizado de acordo com o padronizado por Pavlica (2000) com

algumas modificações. Decorrido 48 horas após a irradiação dos animais,

procedeu-se a coleta da hemolinfa do molusco B. glabrata. Para a coleta da

hemolinfa, foram feitos sucessivos toques com uma micropipeta na região podal

do animal. A manipulação desta região causa uma reação de retração do corpo

do animal para a região interna da concha. Com essa retração o animal libera a

hemolinfa que é prontamente coletada com o auxílio de uma micropipeta

(PAVLICA, 2000).

A B

37

A hemolinfa coletada foi gotejada sobre a lâmina de microscopia

(marca Bioslide) e em seguida foi adicionado o mesmo volume de solução de

EDTA a 10 mM com Ringer e incubadas por 30 minutos em câmara úmida.

Decorrido o tempo de espera, as células foram fixadas com uma solução de

glutaraldeido a 1% com Ringer, ficando nessa solução por 5 minutos. Em seguida

as células foram enxaguadas com Ringer. Para proceder a observação das

células foi utilizado os métodos de coloração Giemsa e por fluorescência.

3.4.1. Coloração Giemsa (convencional)

Utilizou-se uma solução de corante Giemsa (Merck) em tampão

fosfato de pH 6.8, com concentração final de 5%. As lâminas foram submersas

nesta solução por 5 minutos, posteriormente lavadas com água destilada e

colocadas para secagem em temperatura ambiente. A observação das lâminas já

coradas foi realizada no microscópio óptico (Medilux) (Figura 9) com aumento de

1000 vezes.

38

Figura 9 Microscópio óptico Medilux do laboratório de Radiobiologia

(DBR-UFPE)

3.4.2. Coloração por fluorescência

Para realizar a análise dos hemócitos por fluorescência as lâminas

observadas na microscopia óptica foram descoradas com solução de etanol e

ácido acético (3:1). Em seguida as lâminas descoradas foram coradas por corante

Hoechst 33258 na concentração de 1µg/ml.

Primeiramente foram gotejadas 20 µL da solução do Hoechst sobre a

lâmina e, em seguida, a lâmina foi coberta com uma lamínula que proporcionou

39

um espalhamento uniforme do corante sobre a lâmina. Após estes procedimentos,

as lâminas foram colocadas em câmara escura por 30 minutos. Terminado este

período a lamínula foi retirada e a lâmina lavada com água destilada. As lâminas

foram montadas com meio de montagem Glycerol-Mcilavaine (1:1), sendo

colocadas novamente em câmara escura a 4°C por três dias. Decorridos os três

dias as lâminas foram analisadas no microscópio de fluorescência (Leica

CW4000) (Figura 10) utilizando os comprimentos de onda de 358 nm (excitação)

e 461 nm (emissão).

Figura 10 Microscópio de Fluorescência Leica CW4000 do Lambda (DEN-UFPE).

3.5. Análise das lâminas

A avaliação da Freqüência de MN foi realizada de acordo com o

descrito por PAVLICA et al. (2000), com algumas adaptações. A freqüência de

40

MN foi obtida visualmente, por meio de microscópio com auxílio de um contador

de células. Foram analisadas em média 780 células por lâmina, sendo realizadas

cinco réplicas de cinco animais. Os micronúcleos foram identificados segundo

critérios demonstrados na Figura 11.

Figura 11 Esquema com os critérios de identificação de MN; (A) Diâmetro menor que 1/3 do tamanho do núcleo; (B) Cor e textura semelhante ao núcleo; (C) Não estar em contato direto com o núcleo.

3.6. Análise estatística

A análise estatística da frequência de MN entre os grupos foi

realizada por meio do teste do qui-quadrado, nível de significância de 5% e

p<0,05, utilizando o programa BioEstat, versão 5.0 (AYRES et al., 2007). As

análises entre as médias dos números de hemócitos por dose foram realizadas

utilizando a ANOVA e o teste de Tukey com nível de significância de 5% e p<0,05.

41

4 Resultados e Discussão

A hemolinfa de Biomphalaria glabrata expostos a alta dose de

radiação gama 60Co foi analisada quanto a radiossensibilidade e a frequência de

micronúcleos.

4.1 Análise da radiossensibilidade celular dos hemó citos de B. glabrata

Pode-se observar na Tabela 1, o número total de hemócitos

originários dos moluscos B. glabrata expostos as doses de 25, 35, 45 e 55 Gy de

radiação gama de 60Co e não expostos (controle).

Tabela 1 - Hemócitos originários dos moluscos irradiados e

não irradiados.

Conforme demonstrado na Tabela 1, a hemolinfa dos animais

irradiados com as doses de 25, 35 e 45 Gy apresentaram número de hemócitos

inferior ao grupo controle (0 Gy), sendo a dose de 35 Gy a que apresentou o

menor número de células por lâminas analisadas (≥ 1000 por lâminas). A

hemolinfa dos animais expostos a dose de 55 Gy apresentou aumento do número

Dose (Gy) Número total de Hemócitos

0 5042

25 4442

35 3334

45 4799

55 5678

42

de hemócitos em relação aos demais grupos experimentais e controle. Utilizando

o teste estatístico ANOVA percebemos que as médias do número de células para

Dose de 35 e 55 Gy são significativamente diferentes a nível de 5%.

Os resultados sugerem a existência de um comportamento de defesa

diferenciado entre os grupos de moluscos irradiados com altas doses de radiação

gama de 60Co. Cantinha et al. (2010), analisando os efeitos de altas doses de

radiação gama sobre a fecundidade B. glabrata observou que o número de

embriões produzidos por moluscos irradiados variavam de forma independente da

dose. Outro aspecto observado por Cantinha (2010) foi que a exposição a dose

de 40 Gy apresentou o menor número de embriões em relação ao controle,

enquanto que na exposição à dose de 60 Gy aconteceu o inverso, ou seja, essa

dose apresentou o maior número de células do grupo experimental em relação ao

controle. Estes dados se assemelham aos encontrados no presente trabalho que

apresentou aumento no número de hemócitos na dose de 55 Gy e uma

diminuição na dose de 35 Gy.

Pode-se observar nos presentes experimentos que apesar do

aumento do número de hemócitos após a exposição dos moluscos a dose de 55

Gy, a viabilidade destas células pode ser questionada, pois foram encontradas

diversas alterações morfológicas que a inviabilizam. Cantinha (2010) em seus

experimentos também demonstrou que a dose de 60 Gy, próxima a utilizada em

nosso experimento, também apresentou maior número de embriões e maior

inviabilidade celular.

Segundo Segreto (2000) os diferentes tipos de tecidos possuem

respostas distintas à radiação ionizante. A comparação da radiossensibilidade de

diferentes linhagens celulares indica que as células que se dividem rapidamente

são mais radiosensíveis que as de reprodução lenta (lei de Bergonié e

Tribondeau), embora esta regra tenha exceções (linfócitos e alguns melanomas).

Quando analisamos a radiossensibilidade dos hemócitos de B. glabrata irradiados

podemos verificar que todos os grupos experimentais mostraram alterações no

número de células e alterações estruturais das células. Estas modificações

seguem o princípio da lei mencionada anteriormente.

43

Durante a análise dos resultados foram observadas diferentes

alterações morfológicas nos hemócitos dos moluscos submetidos às doses de 35,

45 e 55Gy de radiação gama. Estas modificações consistem na formação de

núcleo bilobulado e pontes nucleoplasmáticas, como vistos na Figura 12

Figura 12 Alterações encontrados na hemolinfa de B. glabrata irradiados nas doses de 35, 45 e 55 Gy. (A) Núcleo bilobulado; (B) pontes nucleoplasmáticas (evidenciada pela seta vermelha).

Experimentos realizados por Zafalon-Silva (2008), com peixes

dulcícolas da especie Astyanax spp., Teleostei: Characidae expostos a poluentes

presentes no Arroio Padre Doutor (RJ) demonstraram que as células eritrocitárias,

presentes no sangue periférico apresentaram núcleo bilobulado, semelhantes as

células encontradas no nosso trabalho.

Martins (2003) encontrou anormalidades nucleares e aumento da

frequência de micronúcleo em células da mucosa bucal de indivíduos fumantes e

não- fumantes e observou que 96% dos fumantes apresentaram deformidades

nucleares, como células binucleadas, brotos nucleares e pontes

nucleoplasmáticas, resultados esses também encontrados no presente trabalho.

Fenech (2000) descreveu a formação de pontes nucleoplásmaticas

em linfócitos, originadas provavelmente quando os centrômeros de cromossomos

dicêntricos são puxados para pólos opostos durante a anáfase e o DNA resultante

A B

44

da ponte é recoberto pelo envoltório nuclear. Essa alteração celular descrita pelo

autor pode ter sido o mesmo fator que acarretou a formação de pontes

nucleoplásmaticas nos hémocitos de B. glabrata.

Sugere-se que estas alterações nucleares sejam decorrentes da ação

de agentes físicos e químicos sobre as células causando mutagenicidade.

Outra alteração celular foi exclusivamente observada durante a

análise microscópica dos hemócitos originários dos caramujos expostos a dose

de 55 Gy. Os hemócitos apresentaram núcleo disforme e inúmeros vacúolos no

citoplasma celular além de marginalização da cromatina formando densos

agregados (Figura 13).

Figura 13 Apoptose em hemócitos de Biomphalaria glabrata submetidos a 55 Gy

de radiação gama de 60Co.

Estas características são sugestivas de indução de apoptose celular.

Estudos realizados por Pavlica et al. (2000) com bivalve (D. polymorha) e o

gastropoda (P. corneus) expostos ao pentaclorofenol (PCP) nas concentrações de

450 e 600 µg/l, também detectou células com as mesmas características,

sugerindo, também, que se tratava de apoptose celular. Pavlica (2000) sugeriu

que a apoptose dos hemócitos ocorreu devido a ação do PCP inibindo as bomba

45

de Ca2+. Sabe-se que uma das causas da apoptose está ligada aos níveis de

cálcio dentro da célula (FAWTHROP, 1991; TRUMP, 1996).

O estímulo para apoptose radioinduzida parece estar relacionado ao

número de quebras produzidas no DNA, a taxa com que elas ocorrem e a rapidez

e eficiência do sistema de reparo (CARSON et al., 1986). Presumindo que o DNA

seja o alvo inicial para apoptose radioinduzida, a resposta celular ao dano na

forma de reparo do DNA pode levar à morte celular (STORY et al., 1992; KANE et

al., 1995). Desta forma, sugere-se que a apoptose surgida nos hemócitos

irradiados ocorreu devido a ação da radiação sobre o DNA da célula.

As diversas alterações nucleares citadas, não foram os únicos

achados experimentais neste trabalho. Observamos também que a radiação

ionizante induziu outras alterações no DNA, demonstrada a seguir, pela análise

da frequência de MN.

4.2. Análise da frequência de micronúcleo

Na tabela 2 observa-se a frequência de MNs detectada nos hemócitos

dos moluscos irradiados e não-irradiados.

Tabela 2 – Dados da Frequência de Micronúcleos de B. glabrata submetidos a radiação gama de 60Co

Dose (Gy) Frequência de Micronúcleo

0 0,007019

25 0,024802

35 0,024583

45 0,036279

55 0,023070

46

Foi observado um aumento da frequência de micronúcleo em todos os

moluscos expostos a radiação gama em relação ao controle. O teste do qui-

quadrado (χ2) demonstrou diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre

a freqüência de micronúcleos dos hemócitos controle e os irradiados. A dose de

45 Gy apresentou a maior freqüência de micronúcleo quando comparada às

outras doses de radiação, mostrando maior significância em relação ao controle

(p = 0,0002). Apesar de ficar demonstrado que após a irradiação observou-se um

aumento da freqüência de MN em relação ao grupo controle, este aumento não

ocorreu de maneira dose-dependente.

Estudos realizados por Wojcik (2000), irradiando cultura de linfócitos

humanos com doses de 0; 0,1; 0,25; 0,5; 1 Gy em fonte Co60, com taxa de dose

de 0,25 Gy/min, observou que houve aumento da frequência de micronúcleo de

maneira dose-dependente, comportamento diferente do encontrado no presente

trabalho. Este fato pode ter ocorrido devido a utilização de fontes com diferentes

taxas de dose. No presente trabalho foi usada uma fonte de 60Co com taxa de

dose de 6,912 kGy/h, enquanto que no experimento de Wojcik (2000) a taxa de

dose foi de 0,25 Gy/min (0,015 kGy/h). Existem princípios que regem a

radiobiologia que esclarecem os fatos acontecidos, ou seja, existe uma relação

dose-efeito, onde o surgimento de uma radiolesão depende da

radiossensibilidade da estrutura biológica e o tempo de exposição à radiação, ou

seja, quanto menor o tempo de exposição, menores serão os efeitos causados

pela radiação. A cultura de linfócito apresentou maior sensibilidade a radiação

quando comparada aos hemócitos, porém os hemócitos foram coletados de

indivíduos expostos e não de cultura de células. Podemos concluir que os

hemócitos apresentaram radiossensibilidade a exposição a radiação ionizante,

porém mostraram-se incapazes de detectar diferença entre as doses de radiação

utilizada.

Sabe-se que o sistema hematopoiético é um dos mais

radiossensíveis, por isso a exposição de indivíduos a irradiação de corpo inteiro

pode apresentar diferentes efeitos biológicos. Estudos de dosimetria biológica

utilizam linfócitos para verificar os efeitos biológicos sofridos por indivíduos

47

expostos acidentalmente ou ocupacionalmente à radiação (FERNANDES, 2005;

BRAGA, 2006; FERNANDES, 2008b). Observou-se no presente trabalho que os

moluscos apresentaram um comportamento semelhante, pois as células de

defesa (SOUZA, 2006), os hemócitos, também sofrem mudanças morfológicas e

presença de MNs quando expostas a radiação ionizante, sugerindo assim

viabilidade da sua utilização no biomonitoramento ambiental.

Nenhum dado sobre freqüência de MN em B. glabrata irradiado foi

encontrado na literatura. Porém estudos realizados com outras espécies de

moluscos expostos a diferentes agentes químicos avaliaram que a freqüência de

MN pode ser utilizada na monitoração de ambientes aquáticos (SCARPATO et al.,

1990; BATEL et al., 1994 ; AL-SABTI, 1995).

O trabalho realizado por Pavlica (2000) expôs moluscos bivalves D.

polymorpha e o gastropoda P. corneus ao agente mutagênico pentaclorofenol, na

concentração de 150 µg/L. Os resultados demonstraram que após 4 dias de

exposição, a frequência de MN em D. polymorpha e P. corneus aumentou

significativamente; concluindo que a hemolinfa de ambas as espécies representou

um teste eficaz na avaliação de genotoxicidade ambiental.

Villela (2006 b ), utilizando Limnoperna fortunei (mexilhão dourado)

para detecção da poluição (genotoxicidade) ambiental de diferentes substância

químicas na bacia do lago Guaíba no Rio Grande do Sul, percebeu em suas

análises que a frequência de micronúcleo variou entre 0,003 a 0,006

micronúcleos, concluindo que Mexilhão Dourado tem potencial para ser utilizado

como bioindicador de contaminação ambiental.

David (2007) utilizou moluscos bivalves da espécie Mytella falcata

como bioindicador de poluição, já que esse molusco é encontrado em três pontos

do estuário de Santos com diferentes níveis de substâncias potencialmente

poluidoras. Os moluscos foram analisados com a finalidade de caracterizar os

danos causados pela poluição nesses pontos. Foram utilizados diversos testes,

entre eles o teste do micronúcleo, que detectou nos três pontos altos níveis de

48

poluição. O trabalho demonstrou como a ação antrópica é bastante prejudicial ao

meio ambiente. Por isso existe a necessidade de dispormos de organismos

bioindicadores de genotoxicidade em diversos habitats para a avaliação dos

danos causados para o homem e o meio ambiente.

Outros trabalhos foram realizados utilizando o B. glabrata como

bioindicador de radiação ionizante em ambientes aquáticos, no entanto esses

trabalhos avaliaram os aspectos macroscópicos como alterações na fecundidade,

fertilidade e mortalidade dos moluscos (MELO, 1998; SILVA, 2008; CANTINHA,

2010), porém alterações celulares não foram percebidas por estes testes.

Portanto, os resultados encontrados em nossos experimentos utilizando

hemócitos de B. glabrata sugerem uma nova ferramenta que análise efeitos

biológicos sofridos pela molécula do DNA após a exposição a radiação e

provavelmente a outros agentes genotóxicos presentes em ambientes aquáticos.

4.3. Comparação entre Metodologias de Coloração

As metodologias de coloração com o corante convencional Giemsa e o

corante de fluorescência Hoechst 33258, tiveram a finalidade de identificar e

confirmar a presença de MN na hemolinfa do B. glabrata. (Figura 14).

Observamos que ambas as metodologias de coloração apresentaram

imagens que nos permitiram analisar micronúcleo e anormalidades celulares de

forma precisa. Porém, os resultados obtidos pela coloração com Giemsa foi mais

eficaz, pois além de identificar as células de forma clara, a técnica é de fácil

manuseio, baixo custo e rapidez na preparação e análise das células.

Para a confirmação de que as células observadas com a coloração

Giemsa eram de fato micronúcleos, as lâminas foram novamente coradas com o

corante Hoechst 33258. A coloração com Hoechst 33258 confirmou que os

49

corpúsculos encontrados se tratavam de micronúcleos, como mostrado na Figura

14 B.

Figura 14 (A) Hemócito corado com Giemsa; (B) Hemócito corado com

Hoechst 33258. A seta vermelha indica MN.

Um dos principais motivos de utilizar a metodologia de fluorescência é

que estes corantes se ligam a moléculas específicas dos tecidos (Dietz, 2000). O

corante Hoechst 33258 cora, especificamente, as ligações de adenina-timina do

DNA, fazendo com que essa coloração sirva de comprovação do teste, já que o

DNA está presente no núcleo das células e os MN são originários do núcleo

(www.sigmaaldrich.com).

Na tabela 3 são apresentadas as vantagens e limitações dos corantes

utilizados no teste.

A B

50

Tabela 3 - Vantagens e limitações das técnicas de coloração Giemsa e Hoechst

33258;

Técnica Vantagens Limitações

Giemsa

• Baixo custo

• Fácil manuseio

• Eficiência nas análises de

MN

• Não é DNA específico

• Forma grânulos

Hoechst

33258

• DNA específico

• Teste confirmativo

• Técnica dispendiosa

• Manuseio laborioso

• As análises causam fadiga

ocular

Pavlica (2000) utilizou também o corante Hoechst 33258, para

detecção de MN em bivalves e gastrópodes, obtendo resultados semelhantes ao

do presente trabalho.

Dietz (2000), em sua pesquisa para detecção de MN na mucosa

esofágica humana e sua relação com fatores de risco ao câncer de esôfago,

utilizou o corante fluorescente acridine orange, que cora especificamente DNA e

RNA. Em seu experimento o corante de fluorescência foi bastante eficaz, corando

as estruturas requeridas pelo autor e apresentando imagens satisfatórias,

demonstrando que a utilização de corantes fluorescência foi uma boa técnica para

testes de confirmação de MN.

Fernandes (2008a), em estudo comparativo de colorações utilizadas

na dosimetria biológica, utilizando os métodos de coloração de Giemsa,

bandeamento C, DAPI e FISH, concluiu que os métodos mais eficazes para ser

utilizado na rotina laboratorial são o método de coloração de Giemsa e o DAPI.

51

Portanto podemos observar que as colorações utilizadas neste

trabalho se mostraram eficazes na identificação dos MN’s sendo a coloração com

Giemsa a mais simples de ser realizada e menos dispendiosa.

5 CONCLUSÃO

Os dados obtidos com a irradiação dos moluscos Biomphalaria

glabrata adultos com doses de 25, 35, 45 e 55 Gy de radiação gama de 60Co,

permitiu concluir que

� Moluscos adultos de B. glabrata se mostraram

sensíveis aos efeitos da radiação gama de 60Co;

� Moluscos irradiados com 35 Gy apresentaram menor

número de hemócitos, enquanto que os expostos a 55 Gy uma maior

quantidade destas células;

� Os hemócitos dos moluscos irradiados apresentaram

alterações morfológicas e celulares nas doses de 35, 45 e 55 Gy.

� A dose de 55 Gy foi a mais radiotóxica, já que

apresentou alterações nucleares e a presença de apoptose;

� A freqüência de micronúcleo foi maior para todos

animais irradiados quando comparado ao controle, podendo ser

utilizada como indicador de radiação ambiental.

� Ambas as colorações utilizadas no presente trabalho se

mostraram eficazes na identificação dos MNs, porém a coloração com

Giemsa é mais simples de ser aplicada e de menor custo.

Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram o início da

padronização da técnica do micronúcleo em Biomphalaria glabrata como um

bioindicador ambiental da ação de agentes físicos e químicos.

52

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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