Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
EFEITO DA Abarema cochliacarpos (Gomes) NA LESÃO MUSCULAR INDUZIDA PELO VENENO DE
Bothrops leucurus
Jeison Saturnino de Oliveira
SÃO CRISTÓVÃO/SE
2014
ii
JEISON SATURNINO DE OLIVEIRA
Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus
SÃO CRISTÓVÃO/SE
2014
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe, RENORBIO/SE, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor.
iii
Jeison Saturnino de Oliveira
Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo
veneno de Bothrops leucurus
Defesa em 26/02/2014 Conceito:
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Prof. Dr. Lucindo José Quintans Junior (orientador)
Universidade Federal de Sergipe-UFS
_______________________________________
Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam
Universidade Federal de Sergipe-UFS
_______________________________________
Prof. Dra. Rosilene Calazans Soares
Universidade Federal de Sergipe-UFS
_______________________________________
Prof. Dra. Karina C. Gomes Machado de Araújo
Universidade Federal de Sergipe-UFS
_______________________________________
Prof. Dra. Deise Maria Furtado de Mendonça
DBCI – Campus Itabaiana
Universidade Federal de Sergipe-UFS
iv
Dedicatória
Eu dedico este trabalho:
A minha esposa ELIZABETH e meus
filhos INÁCIO E JOÃO, pelo carinho,
apoio e exemplos de lealdade, amor e
fraternidade.
A minha mãe MARIA CELESTINA e
meu pai JOSUÉ SATURNINO (in
memorian), pelos exemplos de vida,
pelos ensinamentos morais e pelo
apoio em todos os setores da minha
vida.
Aos meus avós OTÍLIA ALBANI e
ALCEBÍADES PEREIRA (ambos in
memorian), que me ensinaram o valor
da ética na vida de um ser humano.
Aos meus irmãos Josimeri, Josiane,
Jeferson e Jansen, pela compreensão,
torcida e carinho dedicado a mim.
v
Agradecimentos
A Deus, pela saúde e oportunidade de ampliar o conhecimento!
Ao Prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior, meu orientador, por ter aberto as portas do
seu laboratório, pela paciência, tolerância, amizade e estimável orientação.
Ao Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos, meu co-orientador, pelas sugestões
estabelecidas neste trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo de Assis Melo, pai científico de intocáveis alunos e pela colaboração
na área de toxinas ofídicas.
Ao Prof. Dr. Durvanei Maria, pelo apoio na microscopia eletrônica.
Ao Prof. Dr. Charles Santos Estevam, coordenador do RENORBIO/SE, pela amizade,
confiança e apoio a todos os doutorandos.
Aos professores e amigos Glória Maria, Miguel Lemos, José Tadeu Madeira, Norberg,
Tereza Solero, Ana Martinez, Rosangela Machado, Di Pietro, Fabrício Rios, Mércia Margoto,
Angelo Antoniolli, Anderson Marçal, Alexandre, Brancilene, Marcli e tantos outros que sempre
me incentivaram.
Aos colegas e amigos do doutorado: Magna (SE), Alana (SE), Lidiane (PE), Lorena
(SE), Marco (SE), Maria Helena (PE) e Mônica (SE) por tudo que passamos juntos. Na certeza
de que a “nossa” frase é verdadeira: “TUDO PARECE IMPOSSÍVEL ATÉ QUE SEJA FEITO
(NELSON MANDELA)”.
Aos amigos Mônica Melo, Marília, Geovana, Makson, Adriana Gibara, Aldirene,
Douglas, Simone, Michele, Juliana, Rosana, Renan,........ e tantos outros, por dividirem comigo
a alegria de ser um ALUNO LAPEC.
Ao colega Antônio Dias, pela presteza em liofilizar o extrato.
Aos professores do Departamento de Morfologia/UFS, meus colegas de trabalho, por
apostarem no sucesso da nossa equipe.
Aos meus alunos de Anatomia Humana, monitores, iniciação científica e aos
funcionários da UFS, em especial ao senhor Osvaldo (Biotério setorial da UFS), pela amizade,
simpatia e disposição em ajudar.
Um agradecimento especial à secretária da pós-graduação da RENORBIO/SE,
Jackeline Rittes, que sempre cuidou de tudo incansavelmente, inclusive funções que cabiam a
mim e aos meus colegas.
E finalmente, quero agradecer a todos que de alguma forma colaboraram para a
realização deste trabalho: MUITO OBRIGADA!
vi
RESUMO
SATURNINO-OLIVEIRA, J. Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus. 2014. 100f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju/SE, 2014.
O ofidismo é um problema de saúde pública em todo o mundo, especialmente nos
países tropicais. O objetivo deste trabalho foi de investigar os mecanismos envolvidos
no efeito do extrato hidroetanólico da entrecasca da Abarema cochliacarpos (EAc)
(popularmente conhecida como “barbatimão”) na lesão muscular induzida pelo veneno
de Bothrops leucurus (BlV). Foram utilizados camundongos Swiss machos (28-32 g;
n=6 por grupo), que receberam injeção perimuscular do veneno Bothrops leucurus (BlV
– 1 mg/Kg/pata – Volume 50µl) no membro posterior direito, tratados por via oral
(v.o.), com veículo (solução salina) ou EAc (100, 200 ou 400 mg/kg). Na
hipernocicepção mecânica os animais foram avaliados nos tempos 2, 4 e 6 horas,
utilizando o analgesímetro digital (Von Frey). Na atividade edematogênica os animais
foram avaliados nos tempos 15, 30, 60 e 90 minutos, utilizando o paquímetro digital. Já
atividade motora foi avaliada pelo teste de rota-rod e os animais foram avaliados em 1,
3 e 7 dias. Na avaliação histológica o músculo Extensor digitorum longus (EDL) foi
isolado, retirado, fixado, emblocado com parafina (Microscopia óptica) e resina
(Microscopia eletrônica) e cortados. Os tecidos foram corados com hematoxilina-
eosina e observados ao microscópio óptico e eletrônico e posteriormente fotografados.
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa com
animais da UFS (CEPA: 61/12). Os resultados foram analisados utilizando o teste
StudentʼS t-test. O tratamento, por v.o, com EAc (400 mg/Kg) inibiu a hipernocicepção
mecânica, (2h 5,1±0,76; 4h 5,70±0,65; 6h 5,93±0,49; p
vii
ABSTRACT
SATURNINO-OLIVEIRA, J. Effect of Abarema cochliacarpos (Gomes) in muscle
injury induced by Bothrops leucurus. 2014. 100f. Thesis (Ph.D. in Biotechnology) -
Federal University of Sergipe, Aracaju / SE, 2014.
The snakebite is a public health problem worldwide, especially in tropical countries.
The objective of this study was to investigate the mechanisms involved in the effect of
hydroethanolic extract of the stem bark Abarema cochliacarpos (EAc) in muscle injury
induced by Bothrops leucurus. Male swiss mice were used (28-32g ; n= 6 groups),
where they received perimuscular injection Bothrops leucurus venom (BlV – 1
mg/Kg/paw – Volume 50 µl) the right hind limb, treated orally (po), with vehicle
(saline) or EAc (100, 200 or 400 mg / kg). In the mechanical hypernociception animals
were evaluated in time 2, 4 and 6 hours using digital analgesymeter (von Frey). Edema
activity in the animals were evaluated at 15, 30, 60 and 90 minutes, using a digital
caliper. Have motor activity was assessed by the rota -rod test and the animals were
evaluated at 1, 3 and 7 days. Histological evaluation extensor digitorum longus muscle (EDL) was isolated, removed, fixed, paraffin emblocado (Optical Microscopy) and resin
(Electron Microscopy) and cut. Tissues were stained with hematoxylin and eosin and
observed under optical and electron microscopy and subsequently photographed. The
experimental protocols were approved by the ethical committee for animal research at
UFS (CEPA: 61/12). The results were analyzed using followed by Studentʼs t-test. The
treatment orally with EAc (400 mg / kg
) inhibited mechanical hypernociception (2h 5.1 ± 0.76, 5.70 ± 0.65 4h, 6h 5.93 ± 0.49,
(p < 0, 05) compared with the BlV venom group (2h 2.08 ± 0.33; 4h 2.28 ± 0.18; 6h
2.52 ± 0.24). The inhibition of edema was also seen in activity with EAc (400 mg / kg)
(15 min 15.35 ± 0.27; 30 min 12.63 ± 0.69; 60 min 9.38 ± 0,29 and 90 min 6.83 ± 0.66,
p < 0.05) compared with the BlV venom group (15 min 29.7 ± 0.17; 30 min 25.8 ± 0.26;
60 min 20.15 ± 0.24 and 90 min 14.76 ± 0.21). Regarding motor activity, the EAc (400
mg / kg) preserved motor ability (1day 83.22 ± 0.46; 3 days 98.02 ± 0.20 and 7 days
119.24 ± 0.48, p < 0.05) compared to the BlV venom group (1 day 20.03 ± 0.26, 3 days
35.22 ± 0.36 and 7 days 111.21 ± 0.18). Histological analysis showed an protection of
muscle injury after administration of EAc (400 mg / kg), maintaining muscle fibers. Our
results demonstrated that EAc inhibited the harmful effects of the venom, suggesting
that this compound has biotechnological potential in adjuvant treatment of snakebite.
Key-words: Bothrops leucurus, Abarema cochiliacarpos, snakebite, inflammation,
muscle injury.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AAI- Antioxidant activity index
AAPH – Diidrocloreto de 2,2 azobis (2-amidinopropano)
ACN- Acetonitrila
ANOVA- Análisedevariância
BlV- Veneno Bothrops leucurus
CaCL2 – Cloreto de Cálcio
CF- chloroform fraction
CK- Creatino kinase
CO2- Gás Carbônico
COX2- cyclooxygenase-2
DPPH- 2,2’-difenil-1-picril-hidrazil
EAc- Extrato Abarema cochliacarpos
EAF- ethyl acetate fraction
EAFS- ethyl acetate subfraction
EC- Eletroforesecapilar
EDL- Extensor digitorum longus
EE- hidroetanolic extract
ELISA- Enzyme Linked Immunono Sorbent Assay
EM- Espectro de massa.
ESI- Espectroscopia de ionização.
FeSO4- Ferrous sulfate
FGF- Fatores de crescimento fibroblásticos
GSPHx- Gluthatione peroxidase
GSR- Gluthatione reductase
H2O- Água
HF- hexane fraction
HMF- hidromethanol fraction
HPLC- High Performance/Pressure Liquide Chromatography
IL-1 – Interleucina 1
iNOS- Óxido Nítrico
IP- Inhibition percentage
ix
KCL- Cloreto de Potássio
LOO- Peroxyl
MgCL2- Cloreto de Magnésio
NaCL- Cloreto de Sódio
NaHCO3- Bicarbonato de Sódio
NaHPO4- Fosfato de Sódio
NO- Óxido de nítrico.
O2- Oxigênio
PBS- Solução Tampão Fosfato
PDGF- Platelet derived growth factor
PLA2- Fosfolipase A2
PSS- Solução Salina
PTT- Tempo Parcial de tromboplastina
RMN- Ressonância magnética nuclear.
RNS- Reactive nitrogen species
ROS- Reactive oxygen species
SAB- Soro Antibotrópico.
SOD- Superoxide dismutase
TAR- Total antioxidante reactivity
TBA- Thiobarbituric Acid
TBARS- Thiobarbituric acid-reactive substance
TC- Tempo de Coagulação
TCA- Trichloroacetic Acid
TLC- Thin layer chromatography
TNF-α- Fator de necrose tumoral
TRAP- Total reactive antioxidante potential
TS- Tempo de Sangramento
x
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 3
3 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 4
3.1 – AS SERPENTES PEÇONHENTAS DO BRASIL..................................... 4
3.1.1 Gênero Bothrops......................................................................................... 4
3.1.2 Análise Epidemiológica dos Acidentes Ofídicos.........................................
3.1.3 Composição e Atividades Biológicas dos Venenos Botrópicos..................
3.1.4 Resposta Inflamatória..................................................................................
3.1.5 Lesão Músculo-Esquelética.........................................................................
3.1.6 Manifestações Clínicas, Diagnóstico e Prognóstico....................................
7
11
12
16
20
3.2 – AGENTES ANTIOFÍDICOS...................................................................... 22
3.2.1 Soroterapia...................................................................................................
3.2.2 Potencial antiofídico de plantas medicinais.................................................
3.2.3 Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby e Grimes..................................
22
24
27
4 CAPÍTULO I – Artigo Científico – Abarema cochliacarpos extract inhibited
the inflammatory process and skeletal muscle injury induced by Bothrops
leucurus venom...................................................................................................
30
5 CAPÍTULO II – Prospecção e Patente – Plantas medicinais no tratamento
do acidente ofídico: Uma prospecção tecnológica.................................................
6 CONCLUSÃO.....................................................................................................
7 PERSPECTIVA..................................................................................................
53
64
65
8 REFERÊNCIAS.................................................................................................. 66
9 APÊNDICE........................................................................................................ 76
10 ANEXOS............................................................................................................ 80
1
___ 1 Introdução
Os acidentes ofídicos apresentam elevada frequência e altas taxas de morbi-
mortalidade, logo é um sério problema de saúde pública no mundo, principalmente
nos países tropicais.
O Brasil tem o maior número de ataques de serpentes venenosas da América
do Sul, com 20.000 casos notificados a cada ano e uma taxa de letalidade de 0,45%.
A maioria desses casos são por serpentes do gênero Bothrops e com menor
frequência as do gênero Crotalus, Lachesis e Micrurus. A região Nordeste apresenta
43% das serpentes de maior importância médica, incluindo 12 do gênero Bothrops
(B.atrox, B.brasili, B.eritromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. leucurus, B. lutzi, B.
marajoensis, B. moojeni, B. muriciensis, B. neuwiedi e B. pirajai) (OLIVEIRA et al.,
2010).
A serpente Bothrops leucurus é uma espécie pouco investigada e pode ser
encontra do Sul do Espírito Santo ao Ceará, tratando-se da serpente peçonhenta
mais comum em lavouras de cacau e canaviais onde provavelmente produz também
o maior número de mordeduras. Sua mordedura produz dor local, edema,
hemorragia e necrose que, após algum tempo, pode evoluir para a completa
degeneração do músculo, nervos e vasos, podendo ser irreversível, tendo como
consequência a amputação do membro atingido.
O único medicamento oficialmente aprovado pelo Ministério da Saúde para o
tratamento de acidentes ofídicos é o soro antiofídico ou antiveneno, apropriado para
cada tipo de serpente. O antiveneno usado no tratamento do empeçonhamento por
serpentes do gênero Bothrops é o soro antibotrópico (SAB). É necessário considerar
2
a possibilidade de ocorrer reações adversas devido à administração de proteínas
estranhas, como reação alérgica e até mesmo o choque anafilático. O soro
antibotrópico é eficiente em antagonizar os efeitos hemorrágicos do veneno e
previne a letalidade, entretanto, não previne completamente o dano tecidual, como a
mionecrose.
Apesar das estratégias do Ministério da Saúde em distribuir imunobiológicos
para as Secretarias Estaduais de Saúde, frequentemente os casos de
envenenamentos por serpentes (e outros animais) são tratados com preparados
populares feitos com plantas medicinais regionais. Já existem muitos estudos
biológicos para investigar a eficácia das plantas em neutralizar as ações dos
venenos de serpentes, porém nenhum deles foi patenteado.
A Abarema cochliacarpos é uma planta da família Fabaceae
(Leguminoseae), que contém seus princípios ativos principalmente no caule e
apresenta no seu perfil fitoquímico saponinas, catequinas, taninos, fenóis e
antraquinonas. Conhecida popularmente como barbatimão essa espécie vegetal tem
grande uso nas comunidades tradicionais. Entre as aplicações clínicas desta
espécie destacam-se suas propriedades antisséptica, antiinflamatória, analgésica e
cicatrizante (DIAS et al., 2012).
Desta forma, a pesquisa por novas propostas terapêuticas para o tratamento
do acidente ofídico continua sendo uma incessante busca dos pesquisadores e um
grande desafio na área biotecnológica. Logo, justifica-se a condução de trabalhos de
pesquisa que possibilitem uma avaliação mais precisa dos mecanismos envolvidos
no efeito do extrato hidroetanólico da entrecasca da Abarema cochliacarpos e seus
derivados na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus.
3
2 Objetivos
Objetivo Geral:
Investigar os efeitos do extrato hidroetanólico da entrecasca da Abarema
cochliacarpos (EAc) como agente antiinflamatório, antinociceptivo e antimiotóxico
na lesão do músculo esquelético Extensor digitorum longus de camundongos
induzida pela injeção do veneno bruto de Bothrops leucurus.
Objetivos Específicos:
Avaliar o efeito do EAc na atividade edematogênica em camundongos injetados
com o veneno bruto de Bothrops leucurus;
Avaliar a hiperalgesia de camundongos injetados com o veneno bruto de
Bothrops leucurus e tratados com EAc;
Avaliar a atividade motora de camundongos injetados com o veneno bruto de
Bothrops leucurus e tratados com EAc;
Avaliar qualitativamente o aspecto morfológico (Microscopia óptica e eletrônica)
da lesão do músculo Extensor Digitorum Longus de camundongos injetado com o
veneno bruto de Bothrops leucurus e tratado com EAc;
Traçar uma prospecção tecnológica dos pedidos de patentes referentes à
utilização e aplicação das plantas medicinais no tratamento do acidente ofídico;
Descrever e depositar a patente “Extrato da Abarema cochliacarpos no
tratamento coadjuvante do acidente ofídico causado por serpentes do gênero
Bothrops”, juntamente ao INPI.
4
3 Revisão de Literatura
3.1 As Serpentes Peçonhentas do Brasil
3.1.1. Gênero Bothrops
No Brasil existem alguns gêneros de serpentes conhecidas popularmente por
“serpente de quatro ventas” consideradas peçonhentas, por apresentarem dentes
inoculadores bem desenvolvidos e móveis, situados na porção anterior do maxilar
(fig. 2) e fosseta loreal que é um orifício entre o olho e a narina (fig. 1), um órgão
termorreceptor, encontradas nas serpentes do gênero Bothrops, Crotalus e
Lachesis, exceto nas serpentes do gênero Micrurus (fig.3), que possuem dentes
inoculadores pouco desenvolvidos e fixos na região anterior da boca (fig.4). Esses
gêneros também podem ser identificados pelo tipo de cauda que são classificadas
como: lisa, guizo ou chocalho e escamas eriçadas (fig. 5, 6,7) (BRASIL, 2001;
BERNARDE, 2013).
Fig.1 Fig.2
nariz
Fosseta loreal nariz
presas
5
Fig. 3 Micrurus Fig. 4 Micrurus
Distribuídas por todo o território nacional as serpentes do gênero Bothrops
pertencem a Família Viperidae e compreendem cerca de 30 espécies. As mais
conhecidas são Bothrops pirajai, endêmica do sudeste da Bahia e de algumas áreas
do recôncavo baiano, Bothrops muriciencis, endêmica do Alagoas, ambas restritas a
áreas de Mata Atlântica e Bothrops erythromelas encontrada em ambientes áridos e
semiáridos que circundam florestas tropicais secas, áreas rochosas, vegetações
rasteiras de bromélias terrestres e ao longo de margens de rios, também registraram
a sua ocorrência na Região Metropolitana do Salvador (Lauro de Freitas e Salvador,
municípios litorâneos caracterizados por apresentarem formações secundárias de
Mata Atlântica e restingas). As espécies não estão restritas à Bahia, mas também
podem ser encontradas em Sergipe, Alagoas, Paraíba e Rio Grande do Norte,
ressaltando que, neste último, a caatinga atinge o litoral, assim ampliando sua
distribuição (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009; BRASIL, 2001 e 2010; ARGOLO, 2006).
olho
nariz presas
Cauda lisa
Guizo ou Chocalho
Escamas eriçadas
Fig. 5 Bothrops Fig. 6 Crotalus Fig. 7 Lachesis
6
As Bothrops são popularmente conhecidas como jararaca, ouricana,
jararacuçu, urutu-cruzeira, jararaca-do-rabo-branco (filhotes), malha-de-sapo,
cabeça-de-patrona (ou simplesmente “patrona”), surucucurana, combóia, surucucu-
pingo-de-ouro, surucucu-de-ouricana, surucucu-pico-de-jaca (ou simplesmente
“pico-de-jaca”) patioba, jaracuçu-tapete, jaracuçu-quatro-ventas (ou simplesmente
“quatro-ventas”) e caissaca (jovens). Possuem cauda lisa, não tem chocalho e as
suas cores variam muito, dependendo da espécie e da região onde vivem,
preferindo ambientes úmidos como matas e áreas cultivadas e locais onde haja
facilidade para proliferação de roedores (paióis, celeiros, depósitos de lenha). Tem
hábitos predominantemente noturnos ou crepusculares, quando se sentem
ameaçadas apresentam comportamento agressivo desferindo botes sem produzir
ruídos (CARDOSO, 2009; FENWICK, 2009).
A serpente Bothrops leucurus (Fig.8) é vista com frequência da região do
Ceará até o Espírito Santo, sendo a mais importante espécie causadora de
acidentes nessa região. Essa constatação, no entanto, ainda carece de dados sobre
a abundância, aspectos da biologia e etologia das espécies (LIRA-DA-SILVA, et al.
2009; ARGOLO, 2006).
Fig. 8: Bothrops leucurus Foto: Breno Hamdan.
7
3.1.2 Análise epidemiológica dos acidentes ofídicos
Em 1901 foi realizado o primeiro estudo epidemiológico de acidentes ofídicos
por Vital Brazil, quando registrou-se o número de óbitos por mordeduras de
serpentes peçonhentas no Estado de São Paulo, registrando 63, 88 e 104 óbitos em
1897, 1899 e 1900, respectivamente. Após esse registro Vital Brazil entregou os
primeiros tubos de soros antipeçonhentos para o consumo em 14 de agosto do
mesmo ano e a partir daí passou a distribuir, junto com as ampolas de soro, o
Boletim para Observação de Accidente Ophidico, para ser preenchido com dados
referentes ao acidente que levou ao uso desses antivenenos. Os estudos
epidemiológicos sobre acidentes ofídicos realizados no Brasil apresentados por Vital
Brazil em seu Boletim para observação de Accidente Ophídico, analisam sexo e
idade da vítima, mês de ocorrência do acidente, local da picada, gênero da serpente,
tempo decorrido entre o acidente e o atendimento e evolução (FRANÇA et al., 2009).
A consolidação do controle do acidente ofídico no Brasil veio a partir de 1987,
com o Programa Nacional de Controle de Acidentes por Animais Peçonhentos, onde
implantou-se uma política de coordenação da produção, distribuição de antiveneno,
capacitação de recursos humanos e vigilância epidemiológica a nível nacional.
Porém, nas primeiras ações de sistematização verificou-se ausência de informações
atualizadas das equipes de saúde, tanto em referência ao diagnóstico e tratamento,
quanto à identificação do agente agressor. Com o intuito de melhorar o atendimento,
a Coordenação Nacional de Zoonoses e Animais Peçonhentos (CNCZAP-MS)
passou a coordenar as ações envolvendo as Secretarias Estaduais e Municipais,
Centros de Controle de Zoonoses e Animais Peçonhentos, Núcleos de Ofiologia e
Laboratórios Produtores. Dentre essas ações, foram apoiados os primeiros projetos
8
regionalizados sobre a distribuição das serpentes no país. Em 1998 foi implantado o
VIGISUS – Estruturação do Sistema Nacional de Vigilância em Saúde,
primeiramente direcionado para a região Sul e Sudeste e o segundo, para a região
Nordeste (LIRA-DA-SILVA, et al., 2009).
Em conseqüência nesta ação foi realizada uma atualização da distribuição
geográfica, com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre as espécies de
serpentes de importância médica do Nordeste do Brasil que possibilitou a
fundamentação necessária às ações da vigilância ambiental pelos órgãos públicos
da região, bem como permitiu o diagnóstico presuntivo da etiologia destes acidentes
e subsidiou as políticas de produção e distribuição de soro antiofídico (IBGE, 2011).
Hoje os acidentes por serpentes representam problema de Saúde Pública
especialmente em países tropicais, devido à morbi-mortalidade e por algumas
informações colhidas com omissões, subnotificações de dados e deficiências na
coleta subestima a real magnitude dos acidentes ofídicos no país (LIMA, et al. 2009;
MELGAVAREJO, 2009).
A definição de medidas de prevenção e controle, bem como para explicar o
porquê de um município apresentar mais ou menos casos que seus vizinhos esta
associada uma análise da relação entre variáveis ambientais e sócio-econômicas
com a incidência deste tipo de acidente, de forma a apontar possíveis fatores de
risco ou mesmo de proteção (WALDEZ & VOGT, 2009).
Cerca de 21.000 acidentes por serpentes são registrados no Brasil
anualmente. Foram notificados 81.611 acidentes, o que corresponde ao coeficiente
de incidência de 13,5 acidentes/100.000 habitantes de janeiro de 1990 a dezembro
de 1993 no Brasil. Na região nordeste registrou-se a maior letalidade (0,81%), cerca
9
do dobro da média nacional (0,45%), apesar de apresentar o menor coeficiente de
incidência do País (6,84 acidentes/100.000 habitantes) (SIAN, 2009).
No período de 1999 a 2003, foram notificados 15.345 acidentes ofídicos, o
que corresponde a uma média de 3.069 casos por ano. A incidência média para a
Região foi de 4,57/100.000. A Bahia mostrou maior número de casos (8.599, média
de 1.719,8 casos por ano) e maior incidência média (13,16 casos/100.000hab.) no
período (Tabela 1) (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009).
Tabela 1: Incidência do acidente ofídico no Nordeste (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009).
Existem aproximadamente 250 espécies de serpentes no mundo, sendo 70
são peçonhentas, devem-se as serpentes do gênero Bothrops (jararaca, jararacuçu,
urutu e outros) e Crotalus (cascavel), sendo raros os Lachesis (surucucu,
surucutinga) e Micrurus (coral). Dentre os acidentes por serpentes, o acidente
botrópico destaca-se pela sua elevada incidência, onde se observou um maior
percentual de acidentes por Bothrops (78,6%), seguida por Crotalus (20,8%) e
Micrurus (6%) (RIBEIRO, 2008).
Em 2001, aspecto epidemiológico CIAVE-BA atendeu e/ou notificou 740
acidentes ofídicos; destes, 665 (89,9%) foram acidentes botrópicos perfazendo uma
10
incidência de 5,0 acidentes botrópicos/100.000 habitantes. Apenas 11 (1,7%) dos
casos foram confirmados com a identificação da serpente causadora do acidente,
sendo todos exemplares da espécie Bothrops leucurus (MISE, 2007). Já em agosto
de 2003 a agosto de 2004, foi feito uma distribuição das espécies de serpentes de
importância médica nos Estados do Nordeste brasileiro, onde foram identificadas 25
espécies de serpentes, das quais doze do gênero Bothrops (LIRA-DA-SILVA, 2009).
A ocorrência do acidente ofídico está, em geral, relacionada a fatores
climáticos e aumento da atividade humana nos trabalhos no campo. A maior
ocorrência de acidentes com pessoas do sexo masculino tem sido referida em todas
as casuísticas nacionais e provavelmente deve-se à maior frequência com que os
homens realizam atividades no campo. Já foi referida também a acentuada
frequência de acidentes com indivíduos entre 15 e 49 ou 50 anos de idade
(GRACIANO, et al., 2013). Na Bahia, os acidentes botrópicos registrados
predominaram nos meses de março a agosto, devido provavelmente à inundação
dos abrigos e outros esconderijos, tornando-as mais susceptíveis a atacarem suas
presas (MISE, 2007).
A predominância de acidentes ofídicos acometendo membros inferiores
(75,2%) reflete o hábito terrícola da maioria das espécies do gênero Bothrops.
Seguido por membros superiores (22,8%), cabeça e pescoço (0,5%) e tronco
(0,3%). Essa situação, observada em todas as regiões do Brasil, denota a não
utilização de equipamentos de proteção, em especial nas zonas de agricultura não
mecanizada (PAULA, 2010).
11
3.1.3 Composição e atividades biológicas dos venenos botrópicos
O veneno da serpente contém vinte ou mais componentes da peçonha
botrópica, e é mais complexa de que outros gêneros. Mais de 90% do peso seco do
veneno é composto por proteínas (proteínas não-tóxicas), tem uma grande
variedade de toxinas não-enzimáticas como as fosfolipases, fosfodiesterases,
fosfatases, acetilcolinesterases e enzimas proteolíticas (CALVETE, 2013).Conforme
a origem geográfica a toxicidade da complexa mistura de compostos dos venenos
ofídicos contém componentes protéicos (enzimáticos e não enzimáticos) e não-
protéicos (orgânicos e inorgânicos), (HIDALGO, 1999; CAMARGO et al., 2012).
Segundo Gutiérrez, 2009, no veneno botrópico não-protéico encontram-se
substâncias inorgânicas e orgânicas, onde desempenha um papel importante
ajudando na ação enzimática, que é menos expressivo em quantidade e ativo
biologicamente. As substâncias inorgânicas são encontradas nos metais (cátions e
ânions), pode variar de um veneno pra o outro a fração de metais (cálcio, zinco,
magnésio, sódio, potássio, cobre, ferro e níquel), que agem como neutralizadores de
cargas que compõem os protéicos do veneno, principalmente os cátions
monovalentes, em maior quantidade o sódio, já os íons monovalentes não
apresentam nenhuma significância em termos biológicos nas atividades enzimáticas.
No entanto, na constituição de metaloproteínas e diferentes atividades biológicas e
enzimáticas, alguns metais bivalentes atuam como co-fatores. O cálcio por ser um
metal bivalente é utilizado para a ativação da fosfolipase A2, em concentrações
moderadas nos venenos ofídicos.
O veneno pertencente das espécies do gênero Bothrops tem efeito
proteolítico, coagulante, hemorrágico, inflamatório, edematogênico e miotóxico
12
(MELO, et al., 2010; CINTRA-FRANCISCHINELLI, et al., 2010; MOREIRA, et al.,
2011; PATRÃO-NETO, et al., 2013). Com as técnicas bioquímicas de separação,
cerca de 70 proteínas foram encontradas, com ou sem ação enzimática, e
peptídeos, que são constituídos em um único veneno e com ampla variação de
ações farmacológicas e tóxicas (TASHIMA, et al., 2012).
Vários componentes foram isolados das secreções dos venenos botrópicos,
apresentando um fator clínico hemorrágico (HIGUCHI, et al., 2011), proteases que
atuam na coagulação sangüínea causando distúrbios de coagulação (NAUMANN,
et al., 2011), enzimas proteolíticas (GOMES, et al., 2011) e as miotoxinas, que
encontradas nas enzimas proteolíticas e as fosfolipases nas atividades miotóxicas
dos venenos ofídicos. (CACCIN, et al., 2013; SARAVIA-OTTEN, et al., 2013;
TONELLO, et al., 2012; SCHAFFAZICK, et al., 2010; TOMAZ, et al., 2008).
3.1.4 Resposta Inflamatória
O processo inflamatório ocorre devido principalmente à presença de agentes
que lesam os tecidos e a reação pode ser desencadeada por bactérias, agentes
físicos como corpo estranho, a luz solar em alta intensidade, o calor e mesmo a
corrente elétrica. A intensidade da resposta inflamatória irá depender da capacidade
do agente em estimular a liberação de citocinas, quimiotaxinas e da grande
mobilização de células que resultará em vasodilatação, transudação, edema, calor
local e dor (COTRAN, 2012).
Os leucócitos aderem aos vasos sangüíneos e deixam a corrente sangüínea
para exercerem influências protetoras nos tecidos vizinhos. Para isto, ocorrem
interações complexas entre o endotélio e diferentes categorias de leucócitos.
13
Participam deste processo mediadores como as citocinas. As citocinas são
polipeptídeos produzidos por diversos tipos celulares e têm uma grande variedade
de propriedades biológicas na resposta inflamatória. O fator de necrose tumoral
(TNF-α) e a interleucina 1 (IL-1) são exemplos destas moléculas solúveis que agem
através da ligação com receptores específicos, na superfície das células alvo (ROCK
& KONO, 2008).
Quando os leucócitos são recrutados para a área da inflamação, eles passam
pelas seguintes etapas: rolagem, ativação, adesão e transmigração. Para que estas
etapas ocorram, é preciso que as células mudem sua localização no vaso. E é
exatamente o que acontece no evento chamado de marginação. Ou seja, o aumento
da permeabilidade vascular leva à diminuição do fluxo sanguíneo e modificação no
curso das células que normalmente seguiam o fluxo no centro do vaso e passam
para a posição periférica, próximas às células endoteliais que revestem o vaso. O
aumento da expressão das moléculas de adesão na superfície do endotélio e nas
células pode ser induzido por TNF-α e IL-1, sintetizados por macrófagos. Isto faz
com que as células rolem pelo endotélio, se tornem ativadas, sofram adesão firme e
migrem para o local da inflamação (MEDZHITOV, 2008; COTRAN, 2012).
Neutrófilos e macrófagos são capazes de fagocitar e destruir o antígeno e
este fato, em parte, explica o recrutamento destas células para o local da
inflamação. A fagocitose também leva à produção do óxido nítrico (NO) por
macrófagos e este gás solúvel, que é radical livre, é citotóxico para
microorganismos. Além disso, causa vasodilatação contribuindo para o edema e
recrutamento de outras células. Tanto o TNF-α quanto a IL-1 estimulam
macrófagos e em conseqüência deste estímulo há o aumento da produção do NO e
a liberação de enzimas proteolíticas (proteases, colagenases, elastases) e
14
metabólitos reativos do oxigênio que podem induzir destruição tecidual (KING,
2007).
A inflamação é reação característica do envenenamento pelos venenos de
serpentes Viperidae e Crotalidae, apresentando fase aguda e crônica. Durante a
fase aguda ocorre intenso edema seguido de infiltração do tecido lesado de
polimorfonucleares, mastócitos e plaquetas. Naqueles empeçonhamentos em que o
veneno possui componentes hemorrágicos além do edema e infiltrados inflamatório
aparecem hemácias e plaquetas, que demonstram a ocorrência de lesão vascular.
Nestes casos, a reação inflamatória é mais intensa e o dano celular é muito maior. O
aparecimento de macrófagos caracteriza a fase crônica do processo inflamatório
(Fig. 9) (GALVÃO, et al., 2010; TEIXEIRA, et al., 2009).
Fig. 9: Inflamação induzida por serpente do gênero Bothrops (TEIXEIRA, et al., 2009).
15
A hipernocicepção inflamatória depende da ativação de nociceptores
quimiossensíveis a mediadores inflamatórios. No teste da pressão de pata,
carragenina e lipopolissacarídeos estimula a hipernocicepção resultante da liberação
de uma cascata de vários mediadores. A Bradicinina, que inicia a cascata, estimula
a liberação de fator de necrose tumoral (TNF-α) que, por sua vez, induz a liberação
interleucina-1-β (IL-1-β), a interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8).
Posteriormente, a IL-1 e IL-6 estimulam a produção de eicosanóides, enquanto que
a IL-8 estimula a produção de aminas simpatomiméticas (CUNHA et al. 1991 e 1992;
FERREIRA et al. 1993; POOLE et al. 1999).
Teixeira e colaboradores, (1994) demonstraram primeiramente que a
hipernocicepção causada pelo veneno botrópico é independente de respostas
edematogênicas induzidas pelo veneno e é mediada por prostaglandinas e
leucotrienos. Rocha e colaboradores, (2000) mostraram a participação de aminas
biogênicas e metaloproteases na hipernocicepção induzida pelo veneno de Bothrops
jararaca. Chacur e colaboradores, (2002) sugeriram que receptores de bradicinina
B2 estariam envolvidos na hipernocicepção induzida pelo veneno de Bothrops
jararaca.
16
Fig.10: Hipernocicepção induzida pelo veneno Bothrops (CHACUR et al., 2002; Adaptação
Adriana Gibara).
3.1.5 Lesão Músculo-Esquelética
No tecido muscular lesado, imediatamente após a lesão, inicia-se o processo
degenerativo do segmento afetado. A primeira etapa deste processo é marcada pela
autólise celular em resposta à perda da homeostasia intracelular e á entrada de íons
cálcio e consequente ativação de proteases cálcio-dependentes (BYRD, 1992;
TIDBALL, 2008). Em seguida, os fibroblastos que se encontram em estado
quiescente no músculo, são ativados e atraídos para o sítio de lesão pela ação de
fatores de crescimento como o FGF(Fibroblast growth factors) e o PDGF(platelet-
derived growth fator), liberados pelo tecido necrótico. Após serem sensibilizados, os
fibroblastos causam a degradação da matriz extracelular próximo às células lesadas,
e os fragmentos proteolíticos produzidos são quimiotáxicos para outros fibroblastos
HIPERALGESIA Veneno Bothrops
TNF-α
IL-1β KC
Ácido Araquidônico
COX
Prostaglandinas
Aminas
simpatomiméticas
17
e células inflamatórias, e podem estimular a atividade fagocítica de neutrófilos e
macrófagos (TIDBALL, 2008). Com a sinalização quimiotáxica, células
mononucleares são atraídas para o sítio de lesão, tendo papel fundamental na
liberação de proteases e remoção dos componentes celulares lesados. A fagocitose
das fibras lesadas é um evento muito importante, uma vez que a presença de tecido
necrótico inibe o início da regeneração (SUMMAN, et al., 2006; SERRANO &
MUÑOZ-CÁNOVES, 2010).
Segundo TIDBALL (2008), os neutrófilos são as primeiras células
inflamatórias que aumentam substancialmente em número entre 1 a 6 horas pós –
lesão. Em seguida, observa – se o aumento da população de macrófagos, enquanto
que a de neutrófilos diminui. O acúmulo de macrófagos no sítio de lesão é muito
importante, já que são responsáveis, além da fagocitose, pela liberação de
mediadores quimiotáxicos para linfócitos e polimorfonucleares, e também pela
estimulação da angiogênese.
As alterações das células musculares produzidas pelas miotoxinas dos
venenos caracterizam-se por hipercontração dos miofilamentos levando à agregação
das miofibrilas, acompanhada por despolarização e necrose da célula. O mecanismo
proposto para explicar essas alterações tem sido o de que haveria hidrólise dos
fosfolipídios da membrana devido à atividade enzimática, ruptura do sarcolema e
perda da habilidade da célula em regular o fluxo de cálcio extracelular, o que levaria
às alterações patológicas observadas (Fig. 11) (GUTIÉRREZ & OWNBY, 2003;
GUTIÉRREZ et al., 2010). Mitocôndrias também mostram sinais de danos, como o
intumescimento, cristas anormais, densidades floculantes e ruptura. Algumas
enzimas, tais como a creatino kinase (CK) são rapidamente liberadas das fibras
necróticas. O processo degenerativo é acompanhado por edema tecidual e
18
infiltração de células fagocitárias. Aproximadamente, entre 12 e 24 horas após a
inoculação do veneno, as fibras musculares encontram-se totalmente destruídas
com aparência amorfa e hialina (EVANS & OWNBY, 1999; CALIL-ELIAS et al.,
2002a ; 2002b).
Fig. 11: Características da Mionecrose induzida pelo veneno Botrópico (GUTIÉRREZ
& OWNBY, 2003).
Estudos realizados por Melo e colaboradores (2010) sobre as diferentes
etapas da mionecrose em experimentos com venenos de Crotalus viridis, Naja naja
e Crotalus atrox mostraram que estas etapas se manifestam em quatro períodos:
fase inicial (15 min a 3 horas), fase intermediária (3 a 72 horas), fase tardia (72 a 96
horas) e fase final (após 96 horas). O início do processo caracteriza-se pelas
chamadas lesões “delta” (MURAKAMI et al., 2005), que são lesões das fibras
musculares em forma triangular→ originada por lise focal da membrana plasmática.
19
Além disso, há o aparecimento de vacúolos claros, miofibrilas em diferentes
graus de condensação, intercaladas com áreas claras irregulares, de aparência
amorfa no citoplasma (o que levou pesquisadores estrangeiros a usar a expressão
“moth-eaten lesions“ por assemelharem-se essas regiões da fibra como se tivessem
sido comidas por traças). Em uma fase intermediária, durante a patogênese do
processo mionecrótico predominam pelo menos dois estágios patológicos
caracterizados por miofibrilas condensadas, que se assemelham às da fase inicial, e
por células com aparência amorfa, e, em uma terceira fase, a presença de intenso
infiltrado de células fagocíticas, e na fase final, áreas de células musculares
pequenas, em fase de regeneração, intercaladas com áreas de tecido fibrótico
(Fig.12) (SATURNINO-OLIVEIRA, et al., 2012).
Fig. 12: Exemplo da lesão mionecrótica induzida pelo veneno Bothrops (SATURNINO-OLIVEIRA, et al., 2012).
20
3.1.6 Manifestações clínicas, diagnóstico e prognóstico.
As Manifestações sistêmicas se apresentam em forma de sangramentos em
ferimentos cutâneos preexistentes, hemorragias à distância como gengivorragias,
epistaxes, hematêmese e hematúria, náuseas, vômitos, sudorese, hipotensão
arterial sendo mais raro o choque e nefrotoxicidade. Já as manifestações locais são
caracterizadas por dor e edema endurecido no local da mordedura de caráter
precoce e progressivo. Com mais freqüência surgem equimoses, lesões bolhosas e
sangramentos no local da mordedura. No estado mais grave, pode ocorrer necrose
de tecidos moles com formação de abscessos e desenvolvimento de síndrome
comportamental, podendo deixar seqüelas e perda funcional do membro acometido
(MANUAL, 2001, PINHO, 2001; PITTA, 2003).
Essas manifestações aparecem devido às serpentes possuírem
importantes atividades fisiopatológicas de ações proteolíticas, coagulante e
hemorrágica. As ações proteolíticas do veneno causam processo inflamatório onde
estão envolvidos a histamina, bradicinina, prostaglandina, leucotrienos e
eicosanóides, levando o tecido afetado à necrose tecidual. As ações anticoagulantes
e hemorrágicas também influenciam na evolução da atividade inflamatória
(HERRERA, 2009).
A ação coagulante ativa os fatores da coagulação sangüínea onde forma um
coágulo visível in vitro sendo tidos como coagulantes. O veneno botrópico, pró-
coagulante, ativa o fator X ou o fator II (protrombina) da cascata de coagulação,
gerando trombina, que por sua vez hidrolisa diretamente o fibrinogênio em fibrina
podendo induzir incoagulabilidade sanguínea por consumo de fibrinogênio. Este
processo promove liberação de substâncias hipotensoras e provoca lesões na
membrana basal dos capilares por ação das hemorraginas (ação hemorrágica), que
21
associada à plaquetopenia e alterações da coagulação, induz a hemorragia,
freqüentemente disseminada (OLIVEIRA, et al. 2003; HERRERA, 2009).
Os acidentes botrópicos são classificados em casos leves, moderados e
graves de acordo com alterações clínicas e laboratoriais. Manifestações sistêmicas
que definem o caso como grave independentemente do quadro local são hipotensão
arterial, choque, oligoanúria ou hemorragias intensas (BRASIL, 2001; PINHO, 2001;
PITTA, 2003).
A avaliação laboratorial é realizada através do tempo de coagulação (TC),
exame de baixo custo e de fácil execução, que é importante para o
acompanhamento dos casos, geralmente está aumentado, bem como o tempo
parcial de tromboplastina (PTT), ambos são importantes para diagnóstico, conduta e
evolução clínica. O valor poderá estar normal (até 10 min), prolongado (entre 10 e 30
min) ou incoagulável (>30 min). Após a terapia com soro antibotrópico deve-se fazer
o controle até a sua normalização. É interessante salientar, que o tempo de
sangramento (TS) não se altera (BRASIL, 2001; AZEVEDO-MARQUES, 2003;
PITTA, 2003).
Outros exames também podem ser solicitados como hemograma que
geralmente revela leucocitose com neutrofilia e desvio à esquerda,
hemossedimentação elevada nas primeiras horas do acidente e plaquetopenia de
intensidade variável. O exame sumário de urina pode apresentar proteinúria,
hematúria e leucocitúria. Outros exames complementares importantes incluem
dosagem de eletrólitos, uréia e creatinina, com a finalidade de detectar
precocemente distúrbios hidroeletrolíticos e insuficiência renal aguda. A confirmação
laboratorial do acidente pode ser feita através do Método de imunodiagnóstico
(técnica de ELISA), onde antígenos do veneno botrópico podem ser detectados no
22
sangue ou outros líquidos corporais do paciente (BRASIL, 2001; AZEVEDO-
MARQUES, 2003; PITTA, 2003).
3.2 Agentes Antiofídicos
3.2.1 Soroterapia
A soroterapia é uma imunização passiva artificialmente adquirida pela
transferência de anticorpos de um indivíduo sensibilizado (doador) para outro
indivíduo (receptor). Pode ser homóloga quando ambos doadores e receptores na
mesma espécie animal, e heteróloga quando espécies diferentes (GUIDOLIN, 1989).
Nos estudos pioneiros de dois pesquisadores, o francês Albert Calmette e o
brasileiro Vital Brazil foram evidenciados os princípios da soroterapia sendo o
procedimento mais efetivo no tratamento da mordedura de serpente (BRASIL, 1998;
ROSENFELD, 1969; BRAZIL, V. 1987; SCHVARTSMAN, 1992).
Os primeiros soros antiofídicos que chegaram ao Brasil, através do médico
Vital Brazil em 1905, para combater o veneno foram os de Bothrops, Lachesis
lanceolatus (hoje classificada como Bothrops jararaca) e contra o veneno de
Crotalus, Crotalus terrificus (hoje, Crotalus durissus terrificus) (SCHVARTSMAN,
1992). Vital Brazil, iniciou preparando no Brasil os antivenenos (1901) mono e
polivalentes, demonstrando sua especificidade. Foi criada assim a soroterapia
heteróloga com o desenvolvimento de uma terapia efetiva para vítimas de acidentes
ofídicos e o antiveno monovalente, que já existia, incluía o soro anticrotálico e
antibotrópico (IHERING, 1911; ROSENFELD, 1969; BÜCHERL, 1980; GUIDOLIN,
1989; WATT, 1989).
23
No Brasil, a produção de antivenenos é feita pelo Instituto Butantan (SP),
Instituto Vital Brazil (RJ) e Fundação Ezequiel Dias (MG), sendo distribuído para
todo o país pelo Ministério da Saúde. A preparação do antiveno é obtida através de
solução purificada de imunoglobulinas específicas do soro de eqüinos
hiperimunizados com venenos de serpentes ou aracnídeos e escorpiões
(SCHVARTSMAN, 1992; CAMEY et al., 2002). A comercialização no Brasil da
maioria dos antivenenos (AV) é de origem equina e a imunização é realizada de
maneira que possa aumentar o espectro de neutralização do antisoro com venenos
de várias espécies de serpentes de mesmo gênero, ou de diferentes gêneros
(RUSSELL, 1988).
Ménez, 1985, demonstrou que a neutralização de diferentes espécies de
venenos usadas na imunização pode ocorrer devido à reatividade antigênica
cruzada, podendo estar relacionadas entre si, farmacológica e/ou estruturalmente, o
que permite a consequente neutralização por AV heterólogo.
O tratamento fundamental quando indicado para os pacientes acidentados
pela maioria dos animais peçonhentos é a soroterapia AV. O objetivo do tratamento
é neutralizar a maior quantidade possível de veneno circulante independente de ser
em adultos ou crianças, a dose utilizada independentemente do peso do paciente e
aplicação deve ser feita, preferencialmente, na unidade de emergência ou de
internação (BRASIL, 1993).
A patogenia da doença deve-se à formação do complexo imune AV/veneno,
com ativação e consumo de complemento, embora seja a única abordagem
terapêutica a soroterapia heteróloga usada nos acidentes ofídicos, pode acarretar
reações adversas, como reações anafiláticas, anafilactóides e a doença do soro,
além disso, os pacientes podem apresentar febre, artralgia, linfadenomegalia,
24
hepatoesplenomegalia, urticária e proteinúria. (MALASIT et al., 1986; JURKOVICH
et al., 1988; CARDOSO et al., 1993; BRASIL, 1993; DART & HOROWITZ, 1996;
OTERO-PATIÑO et al., 1998).
Os venenos de cinco espécies botrópicas brasileiras tem o efeito
farmacológico letal, atividade hemorrágica, necrotizante, proteolítica da fosfolipase,
coagulante e fibrinolítica. A eficácia de um antiveneno produzido in vitro e in vivo a
partir de um “pool” neutralizador no veneno atividade tóxica e enzimática dos
mesmos, indica que o antiveneno foi efetivo na neutralização sistêmica da atividade
tóxica de todos os venenos testados. Entretanto, os efeitos locais ainda não são
neutralizados pelo uso dos antivenenos, verificados na Fundação Ezequiel Dias
(FUNED) contra veneno botrópico (CAMEY et al. 2002; DA SILVA et al. 2007;
WILLIAMS, et al. 2010).
3.2.2 Potencial Antiofídico de Plantas Medicinais
Desde época dos egípcios, assírios e hebreus (2.300 a.c.) cultivavam e
utilizavam diversas ervas em suas atividades diárias, como embalsamento de
múmias, que com o decorrer da história do homem ainda utilizamos plantas como
medicamento, por apresentar propriedades terapêuticas ou tóxicas importância na
medicina popular. A flora brasileira é considerada uma ampla fonte de material com
potencial farmacológico e biotecnológico do mundo devido à diversidade de
espécies e aos conhecimentos oriundos da medicina tradicional, torna-se cada vez
maior o interesse pelas plantas medicinais nativas do Brasil e em outros países (DE
FÁTIMA, et al., 2008).
25
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 65 a
80% da população mundial que vive em países em desenvolvimento dependem
essencialmente de plantas que são os primeiros cuidados de saúde e uma
alternativa para tratar diversas enfermidades, devido da falta de acesso pela
pobreza a medicamentos industrializados (ARAÚJO, et al., 2002).
Todas as populações nativas do mundo vêm usando plantas no combate aos
efeitos dos acidentes ofídicos, utilizando o sulco da maceração destas plantas
aplicando-o sobre o local da mordedura ou mesmo fazendo ingestão oral,
principalmente nas regiões onde o acesso à soroterapia é limitado. Através desses
conhecimentos, surgiram evidências científicas sobre as propriedades antiofídicas
destes extratos, sendo que nos meios científicos só foram dar atenção nos últimos
vinte anos (MARTZ, 1992; RIZZINI, et al., 1988; PEREIRA, et al., 1984).
No Brasil são utilizados como foco medicinal 152 espécies de plantas com
potencial terapêutico, sendo que cerca de 578 plantas apresentam potencial
terapêutico antiofídico, distribuídas em 94 famílias, principalmente Asteraceae (9%),
Leguminosae (7,8%) e Euphorbiaceae (4,5%) (MARCUSSI, et al., 2007; SOARES,
et al., 2004).
As que possuem validação científica são 18 espécies (12%) onde mostram
uma pequena fração de plantas documentadas cientificamente. Sendo assim, vários
estudos estão sendo realizados com o intuito de investigar o isolamento e
caracterização dos princípios ativos presentes nos extratos vegetais como agentes
terapêuticos, destacando alguns extratos de plantas e seus princípios ativos com
propriedades antiofídicas (MARCUSSI, et al,. 2007).
Apesar de poucos relatos sobre o possível mecanismo de ação de diversas
plantas das mais diferentes regiões do planeta capazes de neutralizar os venenos
26
de diversas serpentes, poucos autores atribuem esta propriedade a uma
determinada classe de substâncias (PEREIRA, et al.,1984; SILVA, et al., 2004).
Uma alternativa no tratamento ofídico, por conter um grande número de
componentes químicos com diversas propriedades farmacológicas de interesse
medicinal destas plantas é atribuída a classes de constituintes ativos, incluindo
flavonóides, alcalóides, taninos e outras (MAIORANO, et al., 2005). Tem sido
testado e demonstrado excelente atividade antiofídica nos extratos de plantas,
principalmente o extrato aquoso de Mandevilla veluntina e o Mikonia glomerata que
foram capazes de inibir atividades farmacológicas de diversos venenos de
serpentes. (SOARES, et al., 2004; MELO, et al., 1994, OLIVEIRA, et al., 2005;
BIONDO, et al., 2003; MAIORANO, et al., 2005).
Borges e colaboradores, (2000) relataram que o extrato aquoso de Casearia
sylvestris (Flacourtiaceae), uma espécie vegetal nativa encontrada em pastos
abertos brasileiros, tem a capacidade de inibir os efeitos miotóxicos,
edematogênicos e hemorrágicos dos venenos de Bothrops moojeni, B. pirajai, B.
neuwiedi e B. Jararacussu e suas toxinas isoladas Lys49 e Asp49-PLA2. Já
Cavalcante e colaboradores, (2007) demonstraram que o extrato aquoso de C.
sylvestris apresentou efeito protetor na lesão muscular induzida por duas
fosfolipases isoladas do veneno botrópico (Lys49-PLA 2 - PrTX-I de B. pirajai e
BthTX-I de B. jararacussu).
As principais classes de inibidores da PLA2 são os compostos fenólicos, os
quais incluem flavonóides (Primetina), cumestanos (wedelolactona), alcalóides (12-
Metoxi-Nb-metil-voacalotina), esteróides (sitosterol e estigmasterol) e os terpenóides
(mono-, di-, e triterpenos), e polifenóis (taninos vegetais) (CARVALHO, et al., 2013).
27
3.2.3 Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby e Grimes
Uma espécie de árvore na família das Fabaceae (Leguminoseae) (IUCN,
2009) planta nativa do Brasil, principalmente no Nordeste Sergipano na cidade de
Lagarto, encontrada na Mata Atlântica e nos biomas da Caatinga chamada de
A.cochiliacarpos (Fig.13) popularmente conhecida “barbatimão”, representada por
uma espécie vulnerável à extinção, devido à classificação à fragmentação de sua
área de ocorrência e ainda é pouco estudada as suas propriedades farmacológicas
(DA SILVA et al., 2010; SILVA, 2003).
Fig.13: Árvores de A.cochliacarpos (Gomes).Fonte: SILVA, 2013.
No Brasil existem outras quatro diferentes espécies de plantas que possuem
o mesmo nome popular (barbatimão). São as espécies Stryphnodendron
adstringens, S. poliphylum, S. obovatum e Imorphandra mollis, que são utilizadas
para os mesmos propósitos terapêuticos. Estudos têm demonstrado que extratos
das cascas de S.adstringens possuem propriedades como cicatrizantes,
antisséptica, anti-inflamatória e propriedades antiulcerogênicas (MIGLIATTI, 2003).
Lopes e colaboradores, (2005) destacaram que cascas de S. adstringens, S.
28
obovatum e S. polyphylum têm sido utilizadas na medicina popular para o tratamento
de feridas, queimaduras e outras injúrias da pele.
Já a Abarema cochliacarpos é muito utilizada na medicina tradicional na
forma de chá como cicatrizante, analgésica, antiulcerogênica, antiinflamatória,
antisséptica, dentre outros usos. Suas atividades biológicas vêm sendo
comprovadas em laboratório, seu extrato aquoso reduziu significamente as lesões
gástricas (SILVA, 2003 e 2009) e o extrato hidroetanólico apresentou atividade
antimicrobiana frente às bactérias Gram-positivas (ARAÚJO et al., 2002; SANTOS et
al., 2007).
Silva, (2006) avaliou a atividade antinociceptiva e o perfil fitoquímico dos
extratos aquosos e metanólico produzidos a partir de cascas do caule de
A.cochliacarpos. Os extratos apresentaram atividade analgésica quando avaliado
pelo teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético por via
intraperitoneal, apresentando respostas superiores às drogas usadas como
referência acetominofeno e ácido acetil salicílico, bem como no modelo de dor
induzida por capsaicina. Já a avaliação fitoquímica demonstrou a presença de
saponinas, catequinas, taninos, fenóis e antraquinonas.
Da Silva e colaboradores, (2010), com a técnica de espectroscopia de
ionização (ESI) acoplado ao espectro de massa (EM), encontraram na fração
butanólica um elevado conteúdo de polifenóis, tais como taninos, proantocianidinas,
destacando-se como majoritários, catequinas e em menor proporção seus dímeros e
trímeros. Tais constituintes foram confirmados através de espectrospia de
ressonância magnética nuclear (RMN).
Sánchez-Fidalgo, (2013) após ter caracterizado a fração butanólica do extrato
da Abarema cochliacarpos - BFAC, também identificou a (+) – catequina como seu
29
principal componente (Fig.14). Após o teste de indução do processo inflamatório por
bactéria lipossacarídea (Escherichia coli) - LPS em macrófagos peritoneais,
verificou-se que ambos BFAC e (+) - catequina apresentaram efeito antioxidante e
antiinflamatório. Reduzindo significativamente a expressão de proteínas pró-
inflamatórias, provavelmente através das vias de sinalizações: c-Jun N-terminal
quinase e MAPK p38.
Fig.14. Identificação por UPLC/MS dos componentes presentes na fração butanólica da Abarema cochliacarpos (SÁNCHEZ-FIDALGO, S. 2013).
30
Capítulo I
Artigo científico:
Abarema cochliacarpos extract inhibited the inflammatory process
and skeletal muscle injury induced by Bothrops leucurus venom
31
Title: Abarema cochliacarpos extract inhibited the inflammatory process and skeletal muscle
injury induced by Bothrops leucurus venom
Authors:
Jeison Saturnino de Oliveira1,3,4
Daiana Do Carmo Santos1; [email protected]
Adriana Gibara Guimarães1; [email protected]
Antônio Santos Dias2; [email protected]
Marcelo Amorim Tomaz5; marcelotomaz.fisio@gmail
Marcos Monteiro-Machado5; [email protected]
Charles Santos Estevam2; [email protected]
Waldecy De Lucca Júnior3; [email protected]
Durvanei Augusto Maria6; [email protected]
Paulo de Assis Melo5; [email protected]
Adriano Antunes de Souza Araújo7; [email protected]
Márcio Roberto Viana Santos8; [email protected]
Lucindo José Quintans Júnior1; [email protected]
1 Laboratório de Farmacologia Pré-clínica de Produtos Naturais, Departamento
de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil
2 Laboratório de Bioquímica e Química de Produtos Naturais, Departamento de
Fisiologia, SE, Brasil
3 Departamento de Morfologia - Laboratório de Biologia Celular e Estrutura – Universidade Federal de Sergipe,
SE, Brasil
4 Programa de Pós-Graduação RENORBIO – Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil
5 Instituto de Ciências Biomédicas – Laboratório de Toxinas Ofídicas – Universidade Federal do Rio de Janeiro,
RJ, Brasil
6 Instituto Butantan - Laboratório de Ciências Fisiológicas e Química - São Paulo, SP, Brasil
7 Departamento de Fisiologia - Laboratório de Ensaios e de toxicidade farmacêutica – Universidade Federal de
Sergipe, SE, Brasil
8 Departamento de Fisiologia - Laboratório Cardiovascular e Produtos Naturais – Universidade Federal de
Sergipe, SE, Brasil
Corresponding author:
Department of Physiology - Laboratory Preclinical Pharmacology of Natural Products - Federal University of
Sergipe, S/N Marechal Rondon Ave – ZIP Code: 49.100-000, São Cristovão, SE - Brazil.
Phone: + 55 (79) 2105-6645 / Fax: + 55 (79) 3212-6640,
E-mail: [email protected]; [email protected]
mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:marcelotomaz.fisio@gmailmailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]
32
Abstract
Snakebites are a public health problem, especially in tropical countries. However,
treatment with antivenom has limited effectiveness against venoms’ local effects. Here we
investigated the ability of Abarema cochliacarpos hydroethanolic extract (EAc) to protect
mice against injection of Bothrops leucurus venom. Swiss mice received perimuscular venom
injection and were subsequently treated orally with EAc in different doses. Treatment with
EAc 100, 200 and 400 mg/kg reduced the edema induced by B. leucurus in 1%, 13% and
39%, respectively. Although lower doses showed no anti-hypernociceptive effect in the Von
Frey test, the higher dose significantly reduced hypernociception induced by the venom.
Antimyotoxic activity of EAc was also observed by microscopy assessment, with treated
muscles presenting preserved structures and decreased edema and inflammatory infiltrate as
compared to untreated ones. Finally, on the rotarod test the treated mice showed better motor
function, once muscle fibers were preserved and there was less edema and pain. Treated mice
could stand four times more time on the rotating rod than untreated ones. Our results have
shown that EAc presented relevant activities against injection of B. leucurus venom in mice,
suggesting that it can be considered as an adjuvant in the treatment of envenomation.
Keywords: Bothrops leucurus, Abarema cochiliacarpos, antiophidic plants, myotoxicity.
1. Introduction
Accidents with venomous snakes represent a significant health problem, especially in
tropical countries, where they frequently affect young and economically active men working
in the countryside. In Brazil, most accidents are caused by snakes belonging to Bothrops
genus, which induce extensive local damage, such as myonecrosis and edema [1, 2].
Particularly, the snake Bothrops leucurus is present in the Northeastern region of Brazil [3],
being related to accidents with rural workers who often have difficult access to health services
to receive the antiophidic treatment proposed by the Health Ministry, i.e. the antibothropic
antivenom.
Antibothropic antivenom is the only official treatment available, but it has low and
limited effectiveness against the local effects of venoms [1]. The antivenom therapy is often
applied late after the accident, when tissue destruction is already in process, potentially
33
causing irreversible and disabling damage [4, 5, 6]. The use of plants and other alternative
approaches to halt the effect of snake venoms or to accelerate tissue recovery has been
proposed by previous studies [7, 8, 9, 10, 11]. Therefore, our group has been particularly
concerned with the search for new and effective pharmacologically active principles from
plants used in folk medicine to treat or prevent damage caused by accidents with venomous
snakes.
Many traditional communities of Northeastern Brazil make use of the bark of Abarema
cochliacarpos in popular medicine. A. cochliacarpos is an ornamental tree native to Brazil,
occurring mainly in the Atlantic Forest and in the Caatinga biomes. It belongs to the
Mimosaceae family, being popularly known as “barbatimão” [12, 13]. An
ethnopharmacological survey accomplished in a rural community in the Caatinga in the state
of Sergipe, Northeastern Brazil, identified popular applications of the bark of A.
cochliacarpos [12]. In this community, the decoction of the bark is used to wash external
ulcers while its tincture, made by placing the bark in the Brazilian beverage known as
“cachaça”, is used against inflammation and gastric ulcers, among other uses [12, 13]. Other
authors also observed similar applications in different traditional communities [14, 15].
According to previous studies, the hydroethanolic extract presents phenolics such as aurones,
catechins, chalcones, flavanols, flavones, flavonols, leucoanthocyanidins, tannins and
xanthones, besides saponins and steroids [30].
In our study we assessed the antiophidic ability of A. cochliacarpos extract, in order to
propose a new option for the treatment of envenoming, besides the antivenom, by using a
plant that is abundant in Brazil, and compared the extract activity with dexamethasone, a
steroidal anti-inflammatory drug previously described to be active against some Bothrops
venoms’ effects [11].
34
2. Material and Methods
2.1 Material
B. leucurus snake venom was obtained from CEPLAC (Bahia, Brazil). B. leucurus
venom and hydroethanolic extract of A. cochliacarpos were dissolved in physiological saline
solution (PSS); PSS was composed of (mM): NaCl, 135; KCl, 5; CaCl2, 2; MgCl2, 1; NaHPO4,
1; NaHCO3, 15 and dextrose, 11. The pH of this solution was equilibrated to 7.3 with 5% CO2
/ 95% O2. Dexamethasone was obtained from Aché (São Paulo, Brazil).
2.2 Plant material and extract preparation
Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby & Grimes stem barks were collected in São
Cristóvão, state of Sergipe, Brazil (230 m, 11° 01′ 63.2″ South, 37° 15′ 86.6″ West). The plant
material was identified by Dr Ana Paula Prata and a voucher specimen was deposited at the
herbarium of the Federal University of Sergipe under the number ASE 014639. Plant material
(5 kg) was dried at 370C with air circulation and renewal until complete dehydration. Then, it
was reduced to powder and subsequently subjected to extraction in 90% ethanol for 5 days
with exhaustive maceration. After this period, the extract was filtered and concentrated in a
rotary evaporator under reduced pressure at 50°C yielding 533.4 g of hydroethanolic extract.
The phytochemical analysis of Abarema cochliacarpos has been recently performed and
described [30].
2.3 Animals
Male Swiss mice (25.0 ± 5.0 g), 2-3 months of age, were used throughout this study.
The animals originated from the Central Bioterium of the Federal University of Sergipe. The
animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2ºC on a 12h light/dark cycle with
35
free access to food and water. Experimental protocols were approved by the Animal Care and
Use Committee (CEPA/UFS # 10/11) at the Federal University of Sergipe.
2.4 Experimental Design
Mice were divided into six groups of 6 animals. They were anesthetized with
ketamine (100 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) and then injected with crude venom of
Bothrops leucurus (BlV) 1.0 mg/kg in PSS by applying 50 µL of the solution next to the
extensor digitorum longus (EDL) muscle of the right hind limb (EDL perimuscular
injection, in order to prevent direct mechanical damage to the muscle), as described
previously [9, 16].
Group I (Control group): Mice were not subjected to muscle injury induced by venom and
instead they received PSS in order to check for any changes in the parameters analyzed.
Group II (BlV group): Mice received 1.0 mg/kg of B. leucurus venom injection (50 µL) into
the right paw.
Group III (BlV + Dexamethasone – Dexa): 10 minutes after venom injection, intravenous
dexamethasone (2 mg/kg) was administered.
Group IV (BlV + EAc 100 mg/kg): 10 minutes after venom injection, mice received oral
hidroethanolic extract of A. cochliacarpos (Eac, 100 mg/kg in 100 L).
Group V (BlV + EAc 200 mg/kg): 10 minutes after venom injection, mice received oral
hidroethanolic extract of A. cochliacarpos (Eac, 200 mg/kg in 100 L).
Group VI (BlV + EAc 400 mg/kg): 10 minutes after venom injection, mice received oral
hidroethanolic extract of A. cochliacarpos (Eac, 400 mg/kg in 100 L).
36
2.5 Edematogenic activity
The induction of edema was evaluated in all groups. Measurements were made at 0,
15, 30, 60, and 90 min after venom injection. An analog caliper rule was used to measure the
mediolateral and anteroposterior widths of the paw, and the product of these values is
reported as mm2.
2.6 Motor functional activity: rotarod test
Motor activity was assessed using the rotarod test to analyze the riding time as
previously described [9]. The mice were trained daily for a period of 120 s for 5 days on the
rotating cylinder (8 rpm). One, three and seven days after injection of 1.0 mg/kg venom alone
or with treatments, the animals were submitted to the rotarod test and the time spent by the
animal on the apparatus was recorded. Each animal underwent three trials, and the mean time
spent on the rod was determined for each group.
2.7 Hypernociception induced by B. leucurus venom
Mechanical sensation of the hind paw as an index of mechano-hypernociceptive test
was assessed by pressure stimulation method as described by [17]. Briefly, the nociceptive
threshold was measured at different times after venom injection and treatments using an
electronic anesthesiometer (Insight®, Brazil). A force (in g) of increasing magnitude was
applied to the paw. When the animals reacted by withdrawing the paw, the force needed to
induce such response was recorded and represented the nociceptive threshold.
37
2.8 Histological examination
Light microscopy: Twenty-four hours after the venom injection and respective
treatments, the animals were killed under anesthesia; their EDL muscles were gently
removed, fixed in standard paraformaldehyde, embedded in paraffin, longitudinally sectioned,
and stained with hematoxylin and eosin (HE) for light microscopy analysis.
Scanning electron microscope (SEM): Some mice had their EDL muscles studied by
scanning electron microscopy after the removal of connective tissue matrices using
collagenase. Muscles were rinsed twice in PBS and fixed in 2.5% glutaraldehyde and 2%
paraformaldehyde in phosphate buffer overnight at room temperature. After being washed
three times in PBS, samples were fixed in 1% osmium tetroxide (pH 7.4) at 4 °C for 1 h. They
were then dehydrated, dried in a critical point dryer and gold sputtered. Scanning electron
microscope (SEM) images were taken on a LEO 435 VP SEM (Carl Zeiss, Oberkochen,
Germany).
2.9. Statistical Analysis
Data were expressed as mean ± SEM, and Student’s t-test was used for statistical
analysis. The p value
38
inhibited by increasing doses of A. cochliacarpos extract and by dexamethasone (figures 1A
and 1B). Treatment with dexamethasone (2.0 mg/kg) reduced the overall edema in 52%,
while 100, 200 and 400 mg/kg A. cochliacarpos extract reduced the edema induced by B.
leucurus in 1%, 13% and 39%, respectively (figure 1B).
Time (min.)
0 15 30 60 90
Are
a v
aria
tio
n (
mm
2)
0
5
10
15
20
25
30
*
*
*
*
*
*
*
*
BlV
BlV + Dexa
BlV + EAc 100 mg/kg
BlV + EAc 200 mg/kg
BlV + EAc 400 mg/kg
Control
AU
C (
mm
2.m
in.)
300
600
900
1200
1500
1800
A
Control BlV BlV + Dexa BlV + EAc 100 mg/kg BlV + EAc 200 mg/kg BlV + EAc 400 mg/kg
*
**
B
Figure 1. Effect of A. cochliacarpos extract (EAc) on B. leucurus venom’s edematogenic activity. Mice received perimuscular injection of PSS or B. leucurus venom (1 mg/kg). The animals were treated
with oral EAc oral at 100 mg/kg, 200 mg/kg and 400 mg/kg and i.v. dexamethasone (2 mg/kg) 5 min
after venom injection. Results show hind limb edema measured with a caliper rule until 90 minutes after
venom injection (panel A). Panel B shows the area under the curve analysis with the data observed in A.
Data report means ± SEM (n=6). * p < 0.05 vs venom group (Student’s t-test).
The injection of BlV (1 mg/kg) into the mice hind limbs caused a significant
decrease in nociceptive threshold (hypercociception), besides the increase in limb volume. In
our protocol, the peak of the hypernociceptive response occurred 2 h after venom injection,
and after this time the phenomenon started to decrease and completely disappeared at 24 h
(data not shown). When animals were treated with 400 mg/kg A. cochliacarpos extract or
39
with dexamethasone, the hypernociceptive response was significantly reduced. Lower doses
of the extract showed no anti-hypernociceptive effect (figure 2).
Time (h)0 2 4 6
Inte
nsity o
f stim
ulu
s (
g)
2
4
6
8
**
*
** **
**
Control
BlV
BlV + Dexa
BlV + EAc 100 mg/kg
BlV + EAc 200 mg/kg
BlV + EAc 400 mg/kg
Figure 2. Effect of A. cochliacarpos extract (EAc) on B. leucurus venom’s mechanical hypernociception response. Mice received perimuscular injection of PSS or B. leucurus venom (1
mg/kg). The animals were treated with oral EAc at 100 mg/kg, 200 mg/kg and 400 mg/kg and i.v.
dexamethasone (2 mg/kg) 5 min after venom injection. Results show in g the force needed to cause
paw withdraw (pain threshold). Data report means ± SEM (n=6). * p < 0.05 and ** p < 0.01 vs venom
group (Student’s t-test).
After B. leucurus venom injection, all animals, including those receiving treatment,
showed a decrease in functional ability to stand on the rotarod. However, on the first and third
days after injection, mice receiving venom only or venom treated with 100 mg/kg and 200
mg/kg EAc showed a more pronounced decrease, compared to animals treated with Dexa or
400 mg/kg EAc. This result shows that EAc decreased the impact of venom on motor
40
functional activity. On the seventh day, all animals were able to remain on the rod as long as
the control mice, showing recovered function (Fig. 3).
Time (days)
0 1 3 7
Tim
e o
n r
ota
rod (
s)
20
40
60
80
100
120
Control
BlV
BlV + Dexa
BlV + EAc 100 mg/kg
BlV + EAc 200 mg/kg
BlV + EAc 400 mg/kg
* **
*
Figure 3. Functional activity. Time spent by mice on the rotarod (8 rpm) before and after receiving
B. leucurus venom (1.0 mg/kg). The animals were treated with oral EAc at 100 mg/kg, 200 mg/kg and
400 mg/kg and i.v. dexamethasone (2 mg/kg) 5 min after venom injection. Time zero represents data
obtained before venom injection. Data report means ± SEM (n=6). * p < 0.05 vs venom group
(Student’s t-test).
Light microscopy of the EDL muscles 24 h after injection of B. leucurus venom showed
structural disorganization of muscle fibers with cellular damage and inflammatory cellular
infiltration, characteristics of a typical inflammatory reaction. Treatment with 400 mg/kg A.
cochliacarpos extract and with dexamethasone preserved the muscle fibers and seemed to
reduce the presence of inflammatory cells (figure 4).
Ultrastructural study of EDL muscle fibers confirmed the observations of light
microscopy (figure 5). Control muscles injected with PSS had a constant diameter of about 20
41
µm and showing long cylindrical forms, occasionally splitting or dividing to provide branches
within the muscle (figure 5A). On the other hand, in the muscles injected with B. leucurus
venom (1.0 mg/kg) focal areas of myonecrosis were abundant after 24 h. Injured fibers
presented dilated sarcoplasmic reticulum, disoriented and condensed myofibrils (figures 5B
and 5C). Furthermore, as shown in figure 5D, hemorrhage was apparent in the endomysial
connective tissue, and hemolysis was discernible. Degeneration was pronounced in areas
where the erythrocytes were tightly packed between the muscle fibers. Myofibrils were
hypercontracted leaving, as a consequence, areas of overstretched myofibrils as well as empty
spaces. On its turn, muscles of mice treated with i.v. dexamethasone showed no damage or
extensive hemorrhage (figure 5E). Finally, the oral administration of A. cochliacarpos
hydroalcoholic extract (400 mg/kg) also decreased the myonecrotic effect of B. leucurus
venom, with fewer areas of hypercontracted myofilaments or hemorrhagic components (figure
5F).
42
Figure 4. Light microscopy of mouse EDL muscle 24 h after perimuscular injection of B. leucurus venom: effect A. cochliacarpos extract (EAc). Longitudinal sections stained with
hematoxylin and eosin: (A) PSS; (B) venom (1.0 mg/kg); (C) venom + dexamethasone (2 mg/kg, i.v);
(D) venom + EAc 100 mg/kg; (E) venom + EAc 200 mg/kg; and (F) venom + EAc 400 mg/kg (n= 6
per group). In panel A, panoramic view of control muscle showing normal multinucleated myofibers
with peripheral nuclei (arrow) and no morphological changes. Panels B, D and E show necrotic
myofibers in different stages of degeneration (arrowheads), edema between the fibers (stars) and
intense inflammatory infiltrate (asterisks) that reaches the internal portions of the muscle (arrow). In C
and F, observe preserved muscle fibers with peripheral nuclei (arrows). Magnification: 40x.
43
Figure 5. The cytoarchitecture of mouse EDL muscle 24 h after perimuscular injection of B. leucurus venom: effect of A. cochliacarpos extract (EAc). Muscles were studied by
scanning electron microscopy after the removal of connective tissue matrices using a
modified KOH-collagenase digestion method. (A) PSS; (B), (C) and (D) venom (1.0 mg/kg); (E) venom + dexamethasone (2 mg/kg, i.v); (F) venom + EAc 400 mg/kg (n= 6 per group).
4. Discussion
Our study confirmed the ability of Bothrops leucurus venom injection to induce
muscle damage, edematogenic activity, hypernociception and motor function impairment.
Among the important components of this venom are several metalloproteinases and
44
phospholipases A2 (PLA2) which present cytotoxic and proinflammatory properties [3, 18, 19,
20, 21, 22]. Our results provide for the first time an experimental and scientific support for the
use of A. cochliacarpos extract in cases of accidents with B. leucurus snake venom, which
had some important activities inhibited in experimental conditions by the plant’s crude
extract.
Edema is an important effect of Bothrops venoms, which along with tissue necrosis
can be severe enough to cause functional loss or even compartment syndrome [23]. As part
of the classical inflammatory reaction, the edema generation was rapidly set following venom
injection. Venom-induced edema has been described as an inflammatory process induced by
components that involve local mediators derived from arachidonic acid and autacoids such as
histamine and serotonin, and is not substantially antagonized by antivenom [24, 25],
constituting a major complication related to accidents caused by Bothrops in large animals. In
agreement with previous studies [11, 26], the anti-inflammatory properties of dexamethasone
were able to partially inhibit the edema induced by venom injection, strongly supporting that
at least in part the venom activity depends on inflammation. Interestingly, the crude extract of
A. cochliacarpos was also able to reduce the edematogenic effect of B. leucurus venom
injection, confirming early observations showing that this plant presents some anti-
inflammatory properties [27, 28, 29, 30, 31].
Inflammation is frequently associated with pain and hypernociception [32, 33].
Inflammatory hypernociception follows alterations in transduction sensitivity in the peripheral
terminals (nociceptors) and in excitability in the central nervous system. Such alterations are
secondary to the activation of chemosensitive nociceptors by inflammatory mediators, which
are extensively induced by snake venom injection [33, 34, 35]. It has been shown that
hyperalgesia induced by Bothrops sp venoms is not neutralized when antivenoms are
administered after envenomation [35], and the clinical relevance of pain following
45
envenomation points to the need to develop pain-controlling therapeutic strategies. The
known anti-hyperalgesic actions of dexamethasone [36] were confirmed in our study. Again,
oral administration of A. cochliacarpos extract successfully decreased the hypernociceptive
action of B. leurucus venom.
As previously shown, i.m. injection of the Bothrops venoms induces extensive
myonecrosis in mice [37, 38, 39, 40, 41, 42]. Our study showed the important in vivo
myotoxicity of B. leucurus venom, which was inhibited by both dexamethasone and A.
cochliacarpos extract. This is of great importance considering the high myotoxicity of
Bothrops venoms and the lack of protection from this activity by the available treatment, the
antibothropic antivenom, leading to functional disabilities due to poor muscle regeneration
[43].
Local and systemic skeletal muscle degeneration is a common consequence of
envenomations due to snakebites. PLA2s are important myotoxic components in Bothrops
venoms, inducing a similar pattern of degenerative events in muscle cells. Myotoxic PLA2s
bind to acceptors in the plasma membrane, which might be lipids or proteins and which may
differ in their affinity for the PLA2s. Upon binding, myotoxic PLA2s disrupt the integrity of
the plasma membrane by catalytically dependent or independent mechanisms, provoking a
pronounced Ca2+
influx which, in turn, initiates a complex series of degenerative events
associated with hypercontraction, activation of calpains and cytosolic Ca2+
-dependent PLA2s,
and mitochondrial Ca2+
overload [6, 44]. Our experiments showed dose-dependent inhibition
of B. leucurus myotoxic activity by A. cochliacarpos extract, which could be related to
inhibition of the venom’s PLA2s, besides decreasing muscle damage by the inflammatory
reaction itself.
Finally, mice receiving treatment with dexamethasone or A. cochliacarpos extract
showed better functional performance, i.e. because the morphological and biochemical
