Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado em Biociência Animal

GABRIELA MOLINARI DAROLD

DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE

CUIABÁ, MATO GROSSO

Cuiabá, 2017

GABRIELA MOLINARI DAROLD

DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE

CUIABÁ, MATO GROSSO.

Cuiabá 2017

Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-graduação em Biociência Animal da Universidade de Cuiabá - UNIC, como requisito parcial para obtenção do título de mestre.

Orientadora: Prof ª. Drª. Michele Lunardi

FICHA CATALOGRÁFICA

Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP) Bibliotecária Elizabete

Luciano /CRB1-2103 D224d Darold, Gabriela Molinari

Detecção Molecular de Paramixovírus em Gatos Domésticos de Cuiabá, Mato Grosso./ Gabriela Molinari Darold. Cuiabá-MT, 2017. 53p.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-graduação em Biociência Animal da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.

Orientadora: Profª. Drª. Michele Lunardi

1.Felinos. 2.Doença Renal. 3.Morbilivírus Felino. 4.RT-PCR. Sequenciamento. Brasil.

CDU 619

GABRIELA MOLINARI DAROLD

Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-graduação em Biociência

Animal da Universidade de Cuiabá - UNIC, como requisito parcial para obtenção do

título de mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores.

Orientadora: Profa. Dra. Michele Lunardi

BANCA EXAMINADORA

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Profa. Dra. Michele Lunardi

UNIC – Universidade de Cuiabá

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Profa. Dr. Alexandre Mendes Amude

UNIC – Universidade de Cuiabá

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Prof. Dr. Daniel Moura Aguiar

UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso

Cuiabá, 10 de maio de 2017

Dedico este trabalho à

Todos aqueles que de alguma forma estiveram е estão próximos de mim,

fazendo esta vida valer cada vez mais а pena.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente quero agradecer à minha família, pоr sua capacidade dе acreditar е investir еm mim. Mãe, sеυ cuidado е dedicação deram-me, еm alguns momentos, а esperança pаrа seguir. Pai, sυа presença significou segurança е certeza dе qυе não estou sozinha nessa caminhada. Agradeço imensamente à minha orientadora pela brilhante ideia deste trabalho e também pelo incentivo à Virologia e a Biologia Molecular. Agradeço também aos meus amigos, pelas alegrias, tristezas e dores compartilhadas. Com vocês, as pausas entre um parágrafo e outro de produção melhora tudo o que tenho produzido na vida. Um agradecimento especial à todas do laboratório de Análises Clínicas do HOVET-UNIC, Lívia, Rubi, Janine... Vocês foram excepcionais, desde a manipulação “chata” até o processamento de todas as amostras, principalmente aos finais de semana. Agradeço também à minha colega de mestrado e amiga Káryta e também aos meus estagiários, Patricia, Moisés, Kae, Joaquim, Daniel Bica, Aline, Paulo Victor e Raphael que colaboraram grandemente nas coletas a campo. Além deles, agradeço ao enfermeiro Ednaldo pela enorme ajuda nas venopunções. Um agradecimento exclusivo a Glaucenyra (Glau) pela ajuda, paciência e ensinamentos durante a análise estatística deste trabalho. Desejo agradecer aos responsáveis pelo Laboratório de Virologia Animal da Universidade Estadual de Londrina, Dra. Alice e Dr. Amauri, pela enorme ajuda na purificação e sequenciamento das amostras. Um sincero agradecimento aos proprietários e protetores que ajudaram disponibilizando seus gatos para este trabalho. Quero agradecer a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos para realização do curso de mestrado. De forma geral, agradeço a todos que contribuíram de forma direta e indireta na execução deste trabalho, pois sem vocês nada seria feito de forma excelente.

DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE CUIABÁ, MATO GROSSO.

RESUMO

DAROLD, G. M. Detecção molecular de paramixovírus em gatos domésticos de Cuiabá, Mato Grosso. 2017. Dissertação (Mestrado em Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2017. O gênero Morbillivirus, incluído na família Paramyxoviridae, compreende patógenos de extrema importância em Medicina Veterinária. Em 2012 um novo morbilivírus foi identificado em gatos domésticos em Hong Kong, sendo caracterizado como morbilivírus felino (FeMV). Após essa primeira identificação, novas pesquisas foram realizadas no Japão, Itália, Alemanha, Estados Unidos, Turquia, e mais recentemente no Brasil, onde foi comprovada a circulação do vírus em todas as regiões descritas. Existem contradições acerca da infecção pelo vírus sobre uma provável associação com a doença renal em felinos. Devido à falta de dados no Brasil, surge a necessidade de maiores investigações sobre o vírus na região para levantar dados epidemiológicos e caracterizar o vírus circulante. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência e analisar a diversidade genética de paramixovírus excretados por gatos domésticos, além de associar os dados com os achados laboratoriais compatíveis com alterações renais. Neste estudo, foram coletadas amostras de urina e sangue de 276 gatos, independentemente do estado clínico, provenientes de abrigos, de protetores e de animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá. Dos 276 gatos avaliados, a presença do vírus em amostras de urina foi detectada por RT-snPCR em 95 (34,4%) animais, sendo que oito animais apresentavam evidências de alterações renais e 87 não apresentavam alterações compatíveis com uropatias. Com esta investigação foi possível demonstrar uma alta prevalência da infecção nos gatos na região, levantando dados epidemiológicos locais e, além disso, não pode ser observada a associação da excreção do paramixovírus pela urina com alterações renais nos felinos domésticos, demonstrando a necessidade da realização de estudos complementares sobre essa virose no país, para maiores esclarecimentos acerca da patogenia do vírus.

Palavras-chave: Felinos. Doença Renal. Morbilivírus felino. RT-PCR. Sequenciamento. Brasil.

ABSTRACT

DAROLD, G. M. Molecular detection of feline paramixovirus in domestic cats of Cuiaba, Mato Grosso. 2017. Dissertation (Master Science in Animal Bioscience) – Faculty of Veterinary Medicine, University of Cuiaba, Cuiaba, 2017.

The genus Morbillivirus, included in the family Paramyxoviridae comprises pathogens of importance in Veterinary Medicine. A new morbillivirus was identified in domestic cats in Hong Kong in 2012, being characterized as a feline morbillivirus (FeMV). After the initial identification, new investigations carried out in Japan, Italy, Germany, United States, Turkey, and more recently in Brazil, confirmed the viral circulation in all the regions cited. However, contradictions about viral infection and a likely association with a feline kidney disease remains. Due to the lack of data in Brazil, investigations aiming at studying epidemiological aspects of the infection and molecular characterization of viral strains are necessary. The aim of this study was to verify the prevalence and analyze the genetic diversity of paramixovirus excreted by domestic cats, as well as to relate the data with laboratorial findings compatible with renal disorders. In this work, urine and blood samples were collected from 276 cats regardless of clinical status, from shelters, multi-cat household and client-owned admitted to the Department of Small Animal Medicine of the University of Cuiaba Teaching Veterinary Hospital. Of the 276 cats evaluated, the presence of the virus in urine samples was detected by RT-snPCR in 95 (34,4%) cats, eight presenting loss of renal function and 87 without any alteration compatible with uropathies. Through this investigation, it was possible to demonstrate a high prevalence of the viral infection within cats from the region, adding new epidemiological data, demonstrating the necessity to carry out complementary studies on this virus in the country, for better clarification about the pathogenesis of the virus. Keywords: Cats. Kidney disease. Feline morbillivirus. RT-PCR. Sequencing. Brazil.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO………………………………………………………………... 10

2 REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………… 12

2.1 AGENTE ETIOLÓGICO……………………………………………………… 12

2.1.1 Classificação taxonômica………………………………………………….. 12

2.1.2 Propriedades biológicas do virus………………………………………… 12

2.2 EPIDEMIOLOGIA…………………………………………………………….. 14

2.3 DIAGNÓSTICO……………………………………………………………….. 16

2.4 FeMV versus DOENÇA RENAL CRÔNICA............................................... 18

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 21

3 OBJETIVOS…………………………………………………………………… 26

3.1 OBJETIVO GERAL…………………………………………………………… 26

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………… 26

4 ARTIGO……………………………………………………………………...... 27

FIRST REPORT OF FELINE MORBILLIVIRUS IN SOUTH AMERICA… 28

ABSTRACT…………………………………………………………………… 28

INTRODUCTION……………………………………………………………… 29

MATERIAL AND METHODS………………………………………………... 30

RESULTS……………………………………………………………………… 33

DISCUSSION…………………………………………………………………. 37

REFERENCES………………………………………………………………... 39

5 ARTIGO………………………………………………………………………... 42

DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS

DOMÉSTICOS DE CUIABÁ, MATO GROSSO........................................ 43

RESUMO.................................................................................................. 43

ABSTRACT.............................................................................................. 44

INTRODUÇÃO......................................................................................... 45

MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 46

RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 48

CONCLUSÃO........................................................................................... 51

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 52

10

INTRODUÇÃO

A família Paramyxoviridae é composta por vírus envelopados cujo genoma é

constituído de RNA fita simples com polaridade negativa. De acordo com o ICTV

(International Committee on Taxonomy of Viruses), esta família compreende sete

gêneros, sendo o Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus,

Aquaparamyxovirus, Ferlavirus e Avulavirus, além de outros que ainda não

possuem classificação (KING et al., 2011).

Os paramixovírus são patógenos cosmopolitas, com potencial zoonótico, e já

foram identificados em diversas espécies domésticas e silvestres, incluindo

pássaros, animais aquáticos, roedores, cães, gatos, ovinos, répteis, equinos,

bovinos, suínos, macacos e humanos (DREXLER, 2012; TONG et al., 2008).

Dentro do gênero Morbillivirus tem-se diversos patógenos de importância,

como o vírus da cinomose canina (canine distemper vírus - CDV). Este vírus tem

uma ampla gama de hospedeiros em condições naturais e experimentais, inclusive

já foi relatada a suscetibilidade de felídeos silvestres mantidos em cativeiros ou em

seu ecossistema natural ao CDV, representando uma ameaça às espécies em

extinção (APPEL et al., 1994; HARDER et al., 1996). Outras investigações foram

realizadas em diversas regiões da Ásia para identificação de anticorpos anti-CDV

em amostras de soros de felinos domésticos, a qual teve variações nos resultados

de acordo com a região (IKEDA et al., 2001).

Apesar da presença de paramixovírus em uma variedade de animais,

nenhum foi observado infectando naturalmente os gatos, e devido à proximidade

com os cães, um grupo de pesquisadores chineses levantaram a hipótese da

ocorrência de um paramixovírus em gatos. Um estudo epidemiológico foi realizado

em Hong Kong para esclarecer a hipótese de que os gatos são hospedeiros de

morbilivírus ainda não descritos, o que culminou na identificação de um morbilivírus

felino (FeMV) que possa estar associado a diversas uropatias, como a nefrite túbulo-

intersticial (WOO, 2012).

11

Para confirmar a ocorrência da infecção pelo FeMV, outras investigações

foram feitas e detectaram a presença do vírus no Japão, Itália, Alemanha, Estados

Unidos e, mais recentemente, na Turquia, levando-se em consideração a ausência

ou manifestação de uropatias, utilizando a técnica de RT-PCR (transcrição reversa

seguida da reação em cadeia pela polimerase) para amplificação do gene L.

(SAKAGUCHI et al., 2014; LORUSSO et al., 2015; SIEG et al., 2015; FURUYA et

al., 2013; PARK et al., 2014; SHARP et al., 2016; YILMAZ et al., 2017).

Entretanto, a relação entre a infecção pelo FeMV e as doenças do trato

urinário em felinos não foi comprovada. Yilmaz et al (2017) relataram achados

histopatológicos renais em animais com FeMV e coronavírus felino (FCoV), além de

colangio-hepatite e necrose hepática, sugerindo que o FeMV também pode replicar-

se no tecido hepático.

Devido à carência de informações sobre o FeMV no Brasil, surge a

necessidade de maiores investigações sobre o vírus na região para levantar dados

epidemiológicos e caracterizar o vírus circulante, e devido a isto o objetivo deste

estudo foi identificar a presença do vírus utilizando amostras de urinas de gatos

domésticos e investigar a diversidade genética do FeMV no Brasil, além de

colaborar com as pesquisas sobre a provável relação entre as doenças do trato

urinário e a infecção por este agente viral.

12

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 AGENTE ETIOLÓGICO

2.1.1 Classificação taxonômica

A família Paramyxoviridae está incluída na ordem Mononegavirales e existem

atualmente sete gêneros classificados nesta família, sendo eles Morbillivirus,

Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus, Aquaparamyxovirus, Ferlavirus e

Avulavirus, e outros que permanecem sem classificação definida até o presente

momento. O gênero Morbillivirus é altamente patogênico para os mamíferos sendo

responsável por doenças em humanos e animais nas últimas duas décadas (LAMB;

PARKS 2013), como sarampo, caxumba, cinomose canina e peste bovina (KING et

al., 2011; WOO, 2012).

De acordo com a classificação do ICTV o gênero Morbillivirus compreende

sete espécies, que incluem o CDV (vírus da cinomose canina), CeMV (morbilivírus

de cetáceos), FeMV (morbilivírus felino), MV (vírus do sarampo), PPRV (vírus da

peste dos pequenos ruminantes), PDV (vírus da cinomose das focas) e RV (vírus

da peste bovina).

2.1.2 Propriedades biológicas do vírus

A família Paramyxoviridae tem uma relação especial com outras duas

famílias de vírus RNA fita simples polaridade negativa que são a família

Orthomyxoviridae, devido as propriedades biológicas das glicoproteínas de

envelope, e a família Rhabdoviridae pela similaridade da organização genômica

não-segmentada e sua expressão (LAMB; PARKS, 2013).

Os morbilivírus são vírus envelopados, com simetria helicoidal à esquerda,

possuem genoma não segmentado e com extensão variável entre 15690 a 16050

nucleotídeos, cuja replicação ocorre inteiramente no citoplasma. Esse gênero

possui seis unidades de transcrição (N, P / V / C, M, F, H e L), tendo uma região

13

extensa não traduzida entre os quadros de leitura abertos (open reading frame –

ORF) codificando a proteína de matriz (M) e glicoproteína de fusão (F) (LAMB;

PARKS, 2013; TAPPAREL; MAURICE; ROUX, 1998). Internamente ao envelope,

encontra-se o núcleo contendo o genoma e as proteínas N (nucleocapsídeo), P

(fosfoproteína) e L (polimerase). O envelope lipídico contém duas glicoproteínas de

superfície, F (proteína de fusão) e H (hemaglutinina) envolvendo os vírions. Entre o

envelope e o núcleo está a proteína de matriz viral (M), sendo uma importante

estrutura para o vírion onde é liberada durante a entrada do vírus (LAMB; PARKS,

2013).

O gene L é amplamente utilizado nos diagnósticos moleculares devido ao

fato de constituir uma sequência conservada no genoma (WOO et al., 2012;

FURUYA et al., 2014).

Os morbilivírus partilham de diversas características biológicas que devem

ser consideradas quando novos vírus são descobertos em amostras clínicas

durante inquéritos epidemiológicos. Acima de tudo, este gênero compreende

viroses altamente linfotrópicas e o CD150 (molécula de ativação de linfócitos de

sinalização) é o receptor universal, sendo este essencial para iniciar uma infecção.

Esta molécula está presente na superfície celular de linfócitos T e B, células

dendríticas e macrófagos (TATSUO; ONO; YANAGI, 2001).

Uma característica biológica pertencente ao FeMV é a infectividade do vírus

em cultivos celulares. Pesquisas realizadas para detecção da infecção viral, através

da inoculação do vírus em células hospedeiras de diversos animais, comprovaram

um maior grau de infectividade apenas em células de origem felina (Crandell-Reese

feline kidney - CRFK) e de primatas (célula Vero), não podendo descartar, a partir

disto, a possibilidade de uma infecção futura por FeMV em outras espécies animais

(WOO et al., 2012; SAKAGUCHI et al., 2015).

Koide; Sakaguchi; Miyazawa (2015) realizaram ensaios quantitativos para

diferenciação das características biológicas do FeMV a partir do isolamento viral em

células CRFK seguido de imunofluorescência, utilizando polibreno e tripsina TBCK

tratada (L-1-tosilamida-2-feniletilo clorometil cetona). Foi possível afirmar que os

tratamentos com polibreno e tripsina não são necessários para determinação da

14

titulação e isolamento viral, enquanto outros morbilivírus usam a tripsina para

clivagem da proteína F (Woo et al., VON MESSLING et al., 2001).

Métodos de inativação viral através do tratamento térmico são comuns e

eficazes tanto para vírus envelopados ou não envelopados (BURNOUF;

RADOSEVICH, 2000), e todos os membros da família Paramyxoviridae são

relativamente sensíveis ao aquecimento (ENDERS, 1996). Esse mecanismo ocorre

através da desmontagem de partículas virais pelo calor em proteínas únicas ou

subunidades virais não infecciosas (SCHLEGEL; IMMELMANN; KEMPF, 2001).

Os procedimentos para inativação viral foram pesquisados por Koide;

Sakaguchi; Miyazawa (2015) que puderam comprovar que o FeMV permanece

estável a 4°C por pelo menos 12 dias, o que favorece o armazenamento a longo

prazo do vírus para a detecção e isolamento viral. Além disso, incubação por 12

dias a 37°C também manteve a infectividade do vírus e a 25°C houve diminuição do

título viral, conferindo sobrevivência ao FeMV em temperaturas ambientes. Já a

incubação a 60°C durante 10 minutos foi suficiente para reduzir os títulos virais para

níveis indetectáveis, ocorrendo o mesmo quando o vírus foi submetido a

temperatura de 70°C, tendo uma queda drástica nos títulos virais com apenas 2

minutos, sendo esta última temperatura uma medida confiável para inativação viral,

minimizando os riscos de infecção e contaminação pelo FeMV.

2.2 EPIDEMIOLOGIA

De acordo com Visser e colaboradores (1993), os diferentes morbilivírus

evoluíram provavelmente de um vírus ancestral comum que se adaptou aos seus

respectivos hospedeiros mamíferos, apontando que estes patógenos tem uma

capacidade intrínseca de se adaptarem a novos hospedeiros.

Nos últimos anos, novos paramixovírus provenientes de animais silvestres e

domésticos foram detectados, presumindo que a maioria dessas infecções ocorrem

atravessando as barreiras interespécies (DREXLER, 2012). Acredita-se que o

FeMV seja cosmopolita assim como outros vírus deste gênero, como o vírus do

15

sarampo e o CDV, porém a falta de sequências genômicas completas de espécies

virais de outras regiões impossibilita o levantamento de dados epidemiológicos, a

relevância clínica do agente e a diversidade genética (NAMBULLI et al., 2016).

Em 2012, na China, houve a primeira descrição da ocorrência de um

paramixovírus de felinos, com proximidade filogenética dentre os morbilivírus,

ficando assim classificado como um morbilivírus felino (FeMV). Este estudo

envolveu a avaliação de 427 gatos, sendo 12,3% (56/427) classificados como

positivos para a presença do agente viral em amostras de urina, swab retal e sangue

(WOO et al., 2012).

A próxima descrição do FeMV foi realizada no Japão em 2013, envolvendo

82 amostras de urina, 10 alíquotas de sangue selecionados de forma randomizada

e 10 tecidos renais de gatos domésticos com nefrite fixados em parafina. O

percentual de animais positivos foi 6,1% (5/82), 10% (1/10) e 40% (4/10) para

amostras de urina, sangue e tecidos renais, respectivamente (FURUYA et al., 2014).

De acordo com a classificação filogenética, os morbilivírus descritos na China e

Japão se mostraram geneticamente diferentes de outros já descritos (WOO et al.,

2012; DE VRIES; DUPREX, DE SWART, 2015), e pertencentes à uma classe de

paramixovírus não classificados (FURUYA et al., 2014; SAKAGUCHI et al., 2014).

Após as descobertas na China e no Japão, deu-se a primeira evidência do

FeMV na Europa, na Alemanha. Tal relato foi conduzido com um grupo de gatos

afetados por diversas uropatias e um grupo controle, sendo observada a presença

do vírus apenas em gatos doentes (6,7%). Além disso, foi encontrado um

paramixovírus diferente dos previamente detectados na China e Japão, com apenas

86% de homologia a outros morbilivírus felinos conhecidos (SIEG et al., 2015).

Posteriormente, foi realizada a detecção do vírus na Itália em uma amostra de urina

de um felino de 15 anos de idade com sinais compatíveis de nefropatia (LORUSSO

et al., 2015).

Um estudo conduzido nos Estados Unidos por Sharp e colaboradores (2016)

detectou a presença do FeMV em apenas 3% das amostras de urina de gatos

domésticos, incluindo animais com presença ou ausência de uropatias, e as

sequências encontradas semelhantes às detectadas na China e Japão. Outro dado

16

obtido neste estudo foi o monitoramento de um gato saudável, onde observou-se

que por 15 meses permaneceu excretando o vírus, sugerindo uma cronicidade da

infecção.

Mais recentemente, na Túrquia, o FeMV foi investigado em 110 amostras de

urina e 15 amostras de tecidos fixados em formol, sendo detectado o vírus na urina

de 6 gatos (5,4%) e em 4 gatos houve a detecção do agente em tecidos como rins,

fígado, pulmão, baço, intestino e linfonodos (YILMAZ et al., 2017).

De fato, além da presença de morbilivírus felino, também foram descritos

paramixovírus felino (FPaV), sendo este último mais intimamente relacionado a

paramixovírus de roedores e morcegos (SIEG et al., 2015). Indubitavelmente, a

descoberta de novos paramixovírus em gatos ressalta ainda mais a importância de

se ter um plano de vigilância adequado para infecções virais em animais domésticos

que possam potencialmente infectar seres humanos, como proposto pela One

Health (MARCACCI et al., 2016).

2.3 DIAGNÓSTICO

Desde a primeira descoberta do vírus, diversos métodos diagnósticos foram

implantados, incluindo técnicas indiretas e diretas para detecção do FeMV. O

método de diagnóstico direto mais utilizado é a RT-PCR, através do uso de primers

consensuais ou específicos para amplificação de determinado fragmento do RNA

viral. Além da RT-PCR convencional, pode-se utilizar a RT-qPCR (Real Time RT-

PCR), que além de quantificar, traz também maiores taxas de detecção do vírus. As

amostras para execução de tal técnica podem ser desde fluídos como urina e

sangue, swab nasal e/ou retal e, até mesmo tecidos parafinados (WOO et al., 2012;

YILMAZ et al., 2017; SIEG et al., 2015; SAKAGUCHI et al., 2014; LORUSSO et al.,

2015; SHARP et al., 2016; FURUYA et al., 201; PARK et al., 2014).

Apesar da RT-PCR ser um dos métodos mais confiáveis para detecção do

FeMV, este teste passa por diversas etapas de amplificação e o uso de

termocicladores para submissão da reação a diferentes temperaturas. Por isso, a

17

nova técnica RT-LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal

amplification) foi testada com sucesso (KOIDE et al., 2016). Essa técnica recém-

desenvolvida é um método de amplificação que combina rapidez, simplicidade e alta

especificidade desde a extração de ácidos nucléicos até a detecção do agente,

sendo possível a amplificação de um DNA em 1000 vezes em até 60 minutos

(NOTOMI et al., 2015).

Outros métodos para detecção viral também são utilizados com frequência,

não somente para o FeMV, mas também para relacionar os animais positivos para

o FeMV com FIV, FeLV (vírus da leucemia felina), coronavírus e outras doenças. A

principal técnica de diagnóstico indireto utilizada é a imunofluorescência indireta

(IFA), através da detecção de anticorpos anti-FeMV em amostras de soros de felinos

(WOO et al., 2012; SAKAGUCHI et al., 2014; SHARP et al., 2016; KOIDE;

SAKAGUCHI; MIYAZAWA, 2015; YILMAZ et al., 2017).

Outro método indireto empregado para a detecção de anticorpos contra a

proteína N do FeMV é o immunoblot, utilizando amostras de plasma de felinos. Este

método foi utilizado pelos pesquisadores de modo a comparar as amostras positivas

utilizando técnicas moleculares, como a RT-PCR, com amostras reagentes ao

immunoblot, sendo possível indicar que alguns gatos, individualmente, têm

anticorpos contra o agente com duração prolongada. Na pesquisa realizada por

Woo e colaboradores (2012) envolvendo 56 gatos positivos para o FeMV na RT-

PCR, apenas cinco reagiram positivamente ao teste. Outra pesquisa realizada no

Japão obteve apenas um felino positivo no immunoblot dos três gatos positivos na

RT-PCR, porém dos 10 gatos negativos na RT-PCR, dois deles reagiram

positivamente ao teste sorológico (SAKAGUCHI et al., 2014).

Em geral, o isolamento viral é considerado uma técnica padrão ouro, sendo

um dos métodos mais confiáveis para a detecção do vírus. Porém, este teste requer

múltiplas passagens e o efeito citopático induzido pelo FeMV é pequeno e ainda

pouco esclarecido (KOIDE; SAKAGUCHI; MIYAZAWA, 2015). Diante disto,

Sakaguchi e colaboradores (2015) realizaram um estudo infectando diversas

linhagens de células cultivadas, de diversas espécies, durante duas semanas para

18

avaliação da eficácia de replicação do vírus em cada tipo de célula, tendo melhores

resultados nas células CRFK e Vero.

Para a detecção de antígenos do FeMV em tecidos fixados realiza-se a

técnica de imunohistoquímica, utilizando o anticorpo policlonal proveniente do soro

de porquinhos-da-índia infectados com a proteína N do FeMV, em tecidos fixados

em formol, os quais podem ser rins, fígado e linfonodos (WOO et al., 2012; YILMAZ

et al., 2017).

Técnicas complementares para relacionar lesões renais com animais

infectados pelo FeMV podem ser utilizadas, como análises hematológicas e

bioquímicas séricas e urinárias, urinálise e histopatológico de fragmentos de tecidos

renais (WOO et al., 2012; YILMAZ et al., 2017).

2.4 ASSOCIAÇÃO DO FeMV COM A DOENÇA RENAL CRÔNICA

A doença renal crônica (DRC) é comumente encontrada em felinos idosos

(com idade superior a 10 anos) e definida como um declínio irreversível da função

renal acima de 50% da taxa de filtração glomerular, durante pelo menos três meses

(PIYARUNGSRI; PUSOONTHORNTHUM, 2016; FINCH; SYME; ELLIOTT, 2016).

A DRC nos animais não se trata de uma síndrome única, mas heterogênea,

resultando em perda de massa renal funcional devido ao surgimento de desordens

congênitas ou adquiridas. Além disso, danos renais agudos podem ocorrer, como

os casos de obstrução urinária, depósito de nefrotoxinas, pielonefrite ou lesão

isquêmica evoluindo para a DRC (FINCH; SYME; ELLIOTT, 2016).

Existem dados limitados acerca da prevalência da DRC em gatos mesmo

com uma alta casuística de diagnósticos dessa síndrome nos felinos domésticos

(BROWN et al., 2016). Por ser uma doença com alta morbidade e mortalidade em

gatos, tem-se muito interesse em identificar fatores de risco e etiológicos para esta

síndrome, os quais podem ajudar, não somente, no diagnóstico precoce, mas

também no entendimento da patogênese e no desenvolvimento de novas medidas

terapêuticas (LULICH et al., 1992).

19

Dentre os fatores de risco da DRC estão incluídas diversas alterações

fenotípicas, metabólicas, nutricionais e clínicas como perda de peso, desidratação,

histórico recente de anestesia geral, diagnóstico prévio de doença periodontal,

cistite em machos (GREENE et al., 2014), hipertireoidismo, doença do trato urinário

inferior, vômitos frequentes, alterações no apetite (BARTLETT et al., 2010), dieta

com baixa quantidade de fibras (HUGHES et al., 2002) e gatos infectados com FIV

(vírus da imunodeficiência felina) (WHITE et al., 2010). Além disso, existem raças

predispostas ao desenvolvimento da DRC como Maine Coon, Abissínio, Siamês,

Azul Russo e Birmanês (LULICH et al., 1992)

Estudos sugerem que não existe um único fator de risco ou exposição que

possa explicar o desenvolvimento da DRC em gatos, mas deve-se considerar que

os efeitos cumulativos de múltiplos fatores de risco e fatores interativos podem

contribuir para uma diminuição da função renal (FINCH; SYME; ELLIOTT, 2016).

A severidade da DRC em gatos é variável e pode ser estagiada de acordo

com as recomendações da IRIS (International Renal Interest Society). Mudanças

adaptativas na estrutura e função renal, como hiperfiltração, hipertensão e

hipertrofia glomerulares ocorrem quando a função renal é reduzida devido a

hipótese de que todas as doenças renais são autoperpetuantes e inerentemente

progressivas (BROWN et al., 1997). Alterações extrarrenais como hiperfosfatemia,

hiperparatireoidismo secundário renal, hipocalemia, anemia, proteinúria,

hipertensão sistêmica, acidose metabólica e uremia podem contribuir para a

progressão da doença dificultando o tratamento (ELLIOTT; WATSON, 2014) e o

prognóstico (BOYD et al., 2008).

A maioria dos gatos geriátricos com DRC não possuem evidências

histológicas de doença glomerular primária, como a glomerulonefrite

imunocomplexa e a amiloidose, apesar de serem achados descritos em gatos

resultando em lesões túbulo-intersticiais crônicas. Alternativamente, na maioria dos

gatos com DRC, as lesões primárias estão dentro do compartimento túbulo-

intersticial apresentando lesões escleróticas secundárias (CHAKRABARTI et al.,

2013; McLELAND et al., 2015).

20

De maneira geral, os rins afetados com a DRC são diminuídos de tamanho

com superfície irregular. Histologicamente, as lesões renais são multifocais a

segmentares, além da fibrose intersticial, degeneração tubular e atrofia,

mineralização das cápsulas de Bowman e membranas basais tubulares e

glomerulosclerose (CHAKRABARTI et al., 2013; McLELAND et al., 2015).

Complementarmente, o FeMV possui patogenia diferente de outros

morbilivírus, sendo que este pode estar associado à uropatias como a nefrite túbulo-

intersticial, sendo muitas vezes questionado com relação a sua taxonomia (DE

VRIES; DUPREX, DE SWART, 2015). Ainda é incerto se este vírus é emergente ou

se sempre existiu e nunca foi detectado, e também se ele provoca doenças em

outras espécies de felídeos (PARK et al., 2014).

Segundo Woo e colaboradores (2012) o morbilivírus felino está relacionado

a nefrite túbulo-intersticial, a qual compreende uma lesão primária aos túbulos

renais e interstício, sendo esta a causa mais comum de insuficiência renal e uma

das principais causas de mortes em gatos (PITTARI et al., 2009). Cerca de 30% dos

gatos com idade superior a 15 anos sofrem de insuficiência renal crônica (LULICH

et al., 1992).

Outros estudos corroboram com os achados de Woo e colaboradores (2012),

como a detecção do agente viral por RT-PCR na Itália em uma amostra de urina de

um gato com nefropatia severa (LORUSSO et al., 2015). Da mesma maneira, no

Japão, amostras de urina, sangue e tecidos parafinados foram positivas para o

vírus, sendo maior a prevalência nesta última amostra, sustentando a hipótese de

que existe uma alta infecção por FeMV em gatos com nefrite (FURUYA et al., 2013).

Um estudo de caso controle realizado na Alemanha detectou o vírus apenas em

gatos que apresentavam sinais clínicos compatíveis com uropatias, cuja prevalência

foi de 6,7% de gatos positivos dentre 120 amostras de urina coletadas (SIEG et al.,

2015).

De modo contrário, Sharp e colaboradores (2016), nos Estados Unidos, não

relacionaram a presença do FeMV à doença renal, pois foram avaliadas 327

amostras de urina, sendo realizada a detecção do vírus em 10 felinos, dos quais

sete eram clinicamente saudáveis e três tinham doença renal crônica. Além disso,

21

um gato foi acompanhado durante 15 meses e manteve-se clinicamente saudável,

mesmo com a excreção contínua do vírus neste intervalo de tempo.

Uma pesquisa realizada recentemente na Turquia, também não pode

comprovar a relação de animais com alterações no trato urinário com a presença

do vírus. Foram analisadas 110 amostras, sendo 95 de urina e 15 fragmentos de

tecido renal e o RNA viral foi detectado em 6 amostras de urina enquanto que nos

tecidos renais apenas três amostras apresentavam o genoma viral. Além disso, os

achados clínico-patológicos foram semelhantes tanto em gatos infectados quanto

não-infectados para o FeMV (YILMAZ et al., 2017).

Diante disto, ressalta-se a necessidade de estudos epidemiológicos

adicionais e mais abrangentes, e infecções experimentais para determinar se o vírus

causa a DRC ou se apenas se beneficia dos tecidos renais inflamados ou da falha

imunológica dos rins como base para a infecção (SAKAGUCHI et al., 2014 SIEG et

al., 2015).

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26

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Investigar a ocorrência da infecção pelo paramixovírus em gatos

domésticos e sua provável relação com alterações renais em animais

excretando o vírus.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a frequência de infecção pelo paramixovírus em gatos

domésticos através da detecção do RNA viral em amostras de urina

por meio da técnica de RT-snPCR

Relacionar o percentual de animais excretando o vírus quanto à perda

da função renal

Caracterizar geneticamente o agente viral identificado através da RT-

PCR seguida de sequenciamento direto dos amplicons obtidos

27

4 ARTIGO

FIRST REPORT OF FELINE MORBILLIVIRUS IN SOUTH AMERICA

28

First report of feline morbillivirus in South America

Gabriela Molinari Darold1,*, Amauri Alcindo Alfieri4, Lívia Saab Muraro2, Alexandre Mendes Amude3,

Rosana Zanatta3, Kelly Cristiane Ito Yamauchi3, Alice Fernandes Alfieri4, Michele Lunardi1,*, #

1Laboratories of Veterinary Microbiology and 2Veterinary Clinical Pathology, 3Department of Small Animal

Medicine, Teaching Veterinary Hospital, University of Cuiabá, 3100 Ave Beira Rio, 78065-900 Cuiabá, MT,

Brazil 4Laboratory of Animal Virology, Department of Veterinary Preventive Medicine, Universidade Estadual de

Londrina, Celso Garcia Cid Road, PR 445 Km 380, 86051-990 Londrina, PR, Brazil

*Both authors contributed equally to the development of this paper.

# Corresponding author. Tel.: +55 65 3363 1271; fax: +55 65 3363 1271. E-mail address:

michelelunardi@gmail.com (M. Lunardi)

Received: 27 July 2016/ Accepted: 17 October 2016/ Published Online: 2 November 2016

© Springer-Verlag Wien 2016

Abstract. The first identification of feline morbillivirus occurred in healthy and diseased

stray cats captured in Hong Kong. Recently, viral circulation was demonstrated within cat

populations from Japan, Italy, Germany, and US. Importantly, association between feline

morbillivirus infection and chronic kidney disease was suggested by histological analyses in

kidney tissue of infected cats. The aim of this study was to verify the presence and genetic

diversity in feline morbilliviruses that might be associated with infections in domestic cats in

Brazil. Seventeen cats without clinical manifestation of urotract diseases from a multi-cat

household and 35 random client-owned cats admitted to the Teaching Veterinary Hospital

for a variety of reasons were evaluated for paramyxoviral infection and the presence of

uropathies. A partial fragment of the paramyxoviral L gene was amplified from urine samples

using a reverse transcription semi-nested PCR assay. For the first time, we detected a feline

morbillivirus strain genetically related to viral strains previously characterized in Japan, from

urine samples of cats from South America, Brazil. Altogether, with the recent description of

feline morbillivirus identification within cat populations in the US, we suggest a possible

widespread distribution of this viral agent in the American continent. Our data demonstrated

feline morbillivirus RNA shedding mostly in the urine of cats without clinical, laboratorial,

or ultrasonographic signs of urotract diseases. Diversely from findings previously published

which associated feline morbillivirus infection with chronic kidney disease, we could not

observe a clear relationship between feline morbillivirus RNA shedding in urine and kidney

disease in cats evaluated.

Keywords: Cats; Chronic kidney disease; Paramyxoviruses; RT-PCR; Phylogeny; Brazil.

29

Introduction

Members of the Paramyxoviridae family are enveloped, negative-sense single-

stranded RNA viruses that are classified into subfamilies Paramyxovirinae and

Pneumovirinae. Currently, the subfamily Paramyxovirinae groups five genera,

Morbillivirus, Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and Rubulavirus, together with some

members that remain unclassified [1]. Paramyxoviruses infect many species such as humans

and domestic and wild animals, and have been correlated with serious diseases with zoonotic

potential or significant economic impact. In the past two decades, new unclassified

paramyxoviruses have been described from either disease outbreaks or subclinical infections

of both humans and animals. This raises the concern that viruses have crossed over from their

original hosts to other species [2-6].

Within Morbillivirus, which includes pathogens that are significant to the medical and

veterinary fields, canine distemper virus (CDV) has been recognized for its importance as an

infective agent of carnivores. Despite being well known for its high potential to affect

domestic and wild canids, CDV infections have been observed among large felids. Outbreaks

involving diverse species maintained in captivity or in natural ecosystems have been

documented worldwide [7-10]. This represents a threat to the endangered feline species.

Investigations have identified neutralizing antibodies against CDV in serum samples

from cats living in diverse geographical locations [11, 12]. To test the hypothesis that cats

also represent a host species for previously undescribed morbilliviruses, one research group

recently performed a molecular epidemiological study of a large number of stray cats

captured in Hong Kong. This culminated in the identification of feline morbillivirus (FeMV)

in both healthy and diseased animals [13].

To confirm the occurrence of FeMV infection in domestic cats with or without

manifestation of uropathies, from other geographical regions, diverse surveys based on RT-

PCR analysis, employing several primer sets for amplification of the FeMV L gene, revealed

viral circulation within cat populations from Japan, Italy, Germany, and more recently, from

the US [14-19].

30

In an attempt to verify diseases related to FeMV infection in cats from Hong Kong,

histopathological examination of tissues from two euthanized RT-PCR positive animals

showed interstitial inflammatory infiltrates and renal tubular degeneration or necrosis. In

addition, viral replication in this organ was confirmed by immunohistochemical staining of

renal tubular cells [13]. However, the association between FeMV infection and feline chronic

kidney disease (CKD) was not proven by studies in FeMV-naive cats. Therefore, systematic

research of cat populations and studies based on experimental infection are needed to

elucidate the correlation of FeMV with renal disease [16, 18, 19].

The aim of this study was to verify the presence and genetic diversity in FeMV that

might be associated with infections in cats in Brazil. We evaluated shedding of viral RNA in

urine samples from domestic cats presenting chronic kidney disease and without any apparent

uropathy.

Materials and methods

Animals and clinical samples

In this study, 17 cats without clinical manifestation of urotract diseases from a multi-

cat household in Cuiabá, Western Brazil, wherein 23 stray cats were housed in close contact,

were evaluated for paramyxoviral infection and the presence of uropathies. In addition, 35

random client-owned cats admitted to the Department of Small Animal Medicine of the

University of Cuiabá Teaching Veterinary Hospital for a variety of reasons including

uropathies, were also investigated for paramyxovirus infection. The group of animals was

composed of the same proportion of males (n = 26) and females (n = 26), with ages ranging

from 1 month to 15 years, with an average age of five years. Blood and urine samples were

collected from all animals, the latter being obtained by cystocentesis, with ultrasound

guidance. Sample collection was performed based on ethical and animal welfare

considerations.

Clinical pathology evaluation and immunochromatographic tests

31

Serum biochemistry screening included tests for creatinine, total protein, globulin,

and albumin concentrations for all cats; normal ranges were considered to be < 1.8 mg/dl,

5.4–7.6 g/dl, 2.6–5.1 g/dl, and 2.1–3.9 g/dl, respectively. Urine samples of all cats from the

multi-cat household and most animals that were brought to the hospital were evaluated by

standard urinalysis including urine specific gravity (USG), dipstick analysis, urine sediment

analysis, and urine protein to creatinine concentration ratio (UPCR).

In this study, some cats were diagnosed with chronic kidney disease (CKD) based on

the detection of functional kidney damage observed by means of proteinuria, and indicated

by UPCR values 0.4 and/or USG 1035 and/or evidence of structural kidney change

demonstrated by ultrasound examination, irrespective of the presence of azotemia.

In addition, serum samples from all cats were simultaneously tested by rapid

immunoassay to detect the feline leukemia virus (FeLV) antigen and antibodies against feline

immunodeficiency virus (FIV) using a FIV/FeLV Combo Test (IDEXX, Westbrook, USA).

Ultrasonography evaluation

Ultrasound images were obtained using real-time ultrasonographic equipment with

linear array transducer frequencies of 7.5–12 MHz. Sagittal and transverse ultrasonography

images of the kidney were obtained to evaluate echogenicity, size, shape, position,

corticomedullary differentiation, and to determine focal or diffuse abnormalities of the renal

parenchyma and renal pelvis, collecting system, and proximal ureters. The bladder was

scanned from left to right in the longitudinal plane and cranial to caudal in the transverse

plane to evaluate wall thickness and regularity, distention, shape, location, and content.

Reverse transcription semi-nested PCR assay

Viral RNA was extracted from urine samples using the QIAamp Viral RNA Mini Kit

(Qiagen, Hilden, Germany), following the manufacturer’s instructions. To amplify a partial

fragment of the paramyxoviral L gene, which is the most conserved gene in the viral genome,

a reverse transcription semi-nested PCR (RT-snPCR) system was used. Initially, viral RNA

32

was amplified using SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, USA) with a specific forward

primer, whereas semi-nested PCR was performed with primers that anneal to a conserved

region of L gene in Respirovirus, Morbillivirus, and Henipavirus genera, as described

previously, with Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Sao Paulo, Brazil) [20].

Aliquots from the PCR-amplified products were analyzed by electrophoresis in a 2% agarose

gel stained with ethidium bromide (0.5 mg/ml) and examined under UV light.

Direct sequencing

All PCR products were purified using the PureLink Quick Gel Extraction and PCR

Purification Combo Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Direct sequencing was performed using

the BigDye Terminator v.3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Carlsbad, USA)

with forward and reverse primers and the 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

Carlsbad, USA), according to the manufacturer’s instructions.

All sequences obtained were examined with the Phred application for quality analysis

of chromatogram readings. The sequences were accepted if the base quality was 20. The

consensus sequences were determined using CAP3 software, and the sequence identities

were compared with all sequences deposited in GenBank using the BLAST program.

Phylogenetic analyses

Pairwise and multiple sequence alignments at the nucleotide and amino acid levels

and sequence similarities were calculated using ClustalW in MEGA v5 software [21]. The L

gene nucleotide sequences of previously reported FeMV strains, representatives of

Morbillivirus, Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and Rubulavirus genera, as well as

some unclassified paramyxoviruses, were included in the analyses. Phylogenetic trees were

reconstructed from a partial fragment of the L gene nucleotide sequence alignment using the

Maximum-likelihood method with the Kimura two-parameter model using MEGA v5

software.

33

The partial sequences of L gene of FeMVBR1 strain were deposited in GenBank

database, developed by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), with the

accession numbers KX452069, KX452070, KX452071, KX452072, KX452073, KX452074,

KX452075, KX452076, and KX452077.

Results

RT-snPCR for paramyxovirus detection in urine samples revealed positive rates of

52.9% (9/17) for cats belonging to the multi-cat household, whereas 8.6% (3/35) of cats

individually admitted to the Teaching Veterinary Hospital were shedding paramyxovirus

RNA through their urine. Five of the 17 cats from the multi-cat household were diagnosed

with non-azotemic CKD. Only two of these cats, in which viral RNA was detected in the

urine, presented with preserved renal function as indicated by normal serum creatinine levels,

USG, and UPCR, with evidence of structural changes in the kidney based on ultrasound

evaluation, demonstrated by the loss of corticomedullary distinction and increased

echogenicity of the renal cortex (Table 1). Of the 35 cats brought to the hospital for a variety

of reasons, 17 were diagnosed with CKD, whereas only one was experiencing urethral plugs.

Among patients attended at the veterinary hospital experiencing uropathies, paramyxoviral

RNA was detected in the urine sample of only one animal. This cat presented with normal

kidney function as suggested by normal level of serum creatinine, USG, and UPCR.

However, upon ultrasound examination, the kidneys were shown to have hyperechoic

cortices (Table 1).

FIV infection was identified by rapid immunoassay in three paramyxovirus-positive

cats, two being from the multi-cat household. Two of the three cats having paramyxoviral

and retroviral infections were also diagnosed with non-azotemic CKD based on evidence of

structural kidney changes upon ultrasound evaluation (Table 1). Among the paramyxovirus-

negative cats, four and two were infected with FIV and FeLV, respectively.

34

Table 1 Characteristics of domestic cats that were shedding FeMV RNA in urine samples

evaluated in this investigation

Animal Agea Genderb Origin Renal

functionc

Kidney

structural

changesd

Health

status

FIV

statuse

FeLV

statuse

FeMV GenBank

accession numberf

1 7 y F veterinary

hospital preserved absent normal - - KX452069

2 adult M veterinary

hospital preserved present

non-

azotemic

CKD

+ - KX452070

3 8 y F multi-cat

household preserved absent normal + - KX452071

4 8 y M multi-cat

household preserved present

non-

azotemic

CKD

+ - KX452072

5 6 m M multi-cat

household preserved absent normal - - KX452073

6 5 y F multi-cat

household preserved present

non-

azotemic

CKD

- - KX452074

7 6 y F multi-cat

household preserved absent normal - - KX452075

8 4 y F multi-cat

household preserved absent normal - - KX452076

9 5 y F multi-cat

household preserved absent normal - - KX452077

10 1,5 y M multi-cat

household preserved absent normal - - NS

11 6 y F multi-cat

household preserved absent normal - - NS

12 9 y F veterinary

hospital preserved absent normal - - NS

a y, year(s); m, months b F, female; M, male c Renal function was evaluated through serum biochemistry and standard urinalysis d Renal structure was evaluated by ultrasonography evaluation e -, negative; + positive f NS, not sequenced

Direct sequencing of amplicons obtained from nine cats, from the first and second

rounds of RT-snPCR, confirmed that amplified L gene fragments corresponded to previously

published feline morbillivirus. Despite several attempts, PCR products amplified from the

urine of three paramyxovirus-positive cats could not be sequenced because of limited

amounts of sample. The FeMV strain identified in this study, referred to as FeMVBR1, was

shown to be 98% identical to the Japanese strains SS1 and OtJP001 based on partial L gene

35

nucleotide sequences. Pairwise comparisons of the partial L gene nucleotide and amino acid

sequences of FeMVBR1, with the corresponding sequences of previously reported FeMV

strains, are demonstrated in Table 2. In this investigation, FeMV sequences detected in nine

cats with or without urinary tract diseases, were closely related to each other with nearly

100% identity based on partial L gene nucleotide sequences.

Table 2 Pairwise comparison of nucleotide (bottom left) and amino acid (upper right)

partial sequences of FeMV L gene

Similarity in percentage

Strains FeMVBR1* US1 M252A SS2 OtJP001

FeMVBR1* 95.1 96.2 95.6 99.4

US1 88.5 97.8 98.3 95.6

M252A 89.9 93.0 98.3 96.7

SS2 89.9 92.8 95.3 96.2

OtJP001 98.0 89.0 90.5 90.1

* Feline morbillivirus strain identified in this study.

For the maximum-likelihood phylogenetic tree, based on partial L gene nucleotide

sequences, the FeMVBR1 strain clustered with other previously reported FeMV strains

identified from diverse geographical locations around the world, indicating that they form a

distinct clade apart from the cluster containing other morbilliviruses. FeMVBR1 was shown

to be only distantly related to representatives of Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and

Rubulavirus genera and other paramyxoviruses that remain unclassified (Fig. 1).

36

Fig. 1 Maximum-likelihood phylogenetic tree constructed based on partial L gene nucleotide

sequences of FeMVs, Morbillivirus, Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and Rubulavirus

genera, and unclassified paramyxoviruses. Brazilian FeMVBR1 strain identified in this study is

represented by a black circle symbol. Numbers at internal nodes represent the bootstrap support

values (percentages) determined for 1,000 replications (values less than 60 are not shown). The

scale bar indicates the number of nucleotide substitutions per site. GenBank accession numbers

of paramyxoviral sequences included in the phylogenetic analysis are stated in parentheses

37

Discussion

For the first time, we detected a FeMV strain genetically related to viral strains

previously characterized in Japan, from urine samples of cats from South America, Brazil,

through RT-snPCR and direct sequencing. Altogether, with the recent description of FeMV

identification within cat populations in the US, we suggest a possible widespread distribution

of this viral agent in the American continent [19].

In our study, the positive rate for shedding of FeMV RNA in the urine of cats living

in a multi-cat household was higher (52.9%) than the frequencies observed in other

investigations. In contrast to our data which demonstrated that only three of 23 cats with

uropathies were eliminating virus in urine, previously obtained FeMV positive rates were

high, ranging from 6.7–40%, only for cats suffering from kidney disease, as demonstrated by

testing kidney tissues from cats with nephritis or urine from cats with other urotract diseases

[14, 18]. In a recent investigation of urine samples from German cats attended at a veterinary

hospital, sequences from paramyxoviral L gene could not be amplified from 86 evaluated

cats without clinical or laboratory evidence of urotract diseases. Differently, FeMV strains

were identified exclusively in urine samples from cats aging from seven to 18 years old and

suffering from diverse uropathies as feline lower urinary tract disease (FLUTD), urostasis,

urolithiasis, cystitis and CKD [18]. Recently, a RT-nested PCR for FeMV partial L gene

amplification revealed that 40% of archival kidney tissues of Japanese cats with nephritis,

collected at veterinary clinics, tested positive for the presence of FeMV RNA while only

6.1% of urine samples from patients randomly choosen, had FeMV L gene detected based on

this assay [14]. A hypothesis that could explain the higher rate of feline paramyxovirus

detection in Brazilian cat urine could be the occurrence of long-term viral shedding through

the urine, as previously suggested for FeMV infections [19]. However, testing additional

groups of cats will be required to support this hypothesis.

In this study, we used the nucleotide sequences of partial fragments of the L gene,

from paramyxovirus species isolated from cats of diverse countries and other members of

Paramyxoviridae, in the construction of maximum-likelihood phylogenetic trees.

Phylogenetic analyses of paramyxoviral sequences identified in domestic cats from Brazil

demonstrated that feline morbillivirus was detected. The herein identified strain, named

38

FeMVBR1, was shown to be closely related to the previously characterized Japanese strains

SS1 and OtJP001, which were detected from urine samples of domestic cats. These FeMV

sequences formed a distinct cluster in the phylogenetic tree, apart from the group consisting

of Morbillivirus, and being only distantly related to Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus,

Rubulavirus, and other unclassified paramyxoviruses. However, it is still uncertain whether

FeMV strains identified from domestic cats from different geographical regions represent a

new species of the Morbillivirus genus or whether they are also unclassified paramyxoviruses

within this viral family [16]. Accordingly, it seems that these phylogenetically related viruses

most likely present a ubiquitous distribution within domestic cat populations worldwide.

Whether FeMV is able to infect and cause disease in other representatives of Felidae is

uncertain. The example of CDV, which has a well-known tendency for host switching, has

raised concerns about its potential threat to endangered animal species. This might justify

further investigations attempting to identify these new morbilliviruses in healthy and diseased

individuals in this and other families of wildlife.

The association between FeMV infection and tubulointerstitial nephritis in domestic

cats, one of the leading causes of death in older cats with a prevalence of 1.6–20%, was

examined through a case-control study involving 27 stray cats from Hong Kong. The ratio of

cats affected by renal disease was confirmed to be higher in the group of infected cats (7/12)

than in the group of uninfected animals (2/15) [13, 22, 23]. In contrast, our data demonstrated

FeMV RNA shedding mostly in the urine of cats without clinical, laboratorial, or

ultrasonographic signs of urotract diseases (9/12), with the exception of three cats with

preserved kidney function but ultrasound findings compatible with CKD. It is noteworthy to

highlight that two of these three FeMV positive-cats with non-azotemic CKD were also

infected with FIV, which is also associated with this renal disease, making it difficult to

correlate the observed CKD with FeMV infection [24, 25]. However, data obtained in this

study was contrary to previous findings obtained in other investigations, which highlighted

an association between FeMV infections and CKD in domestic cats [13, 18, 14]. A reasonable

hypothesis to explain this difference could be that in our study, the evaluation of cats occurred

during the early stages of infection when no damage to kidney function and structure had

occurred. Thus, it is clear that further epidemiological studies, with larger numbers of cats

39

affected and unaffected by kidney disease, as well as investigations based on experimental

infection, will clarify the pathogenesis of FeMV in domestic cats.

According to data presented recently, there is substantial evidence that FeMV can

chronically infect healthy cats, being shed persistently in the urine for a period of at least 15

months [19]. Based on this finding, a follow-up of paramyxovirus-infected cats is ongoing to

confirm the long term shedding of this viral agent and to verify the development of renal

disease or FLUTD.

In the present study, we report the first evidence of FeMV infection in cat populations

from South America (Brazil). Additionally, diversely from findings previously published

which associated FeMV infection with CKD in domestic cats, we could not observe any clear

relationship between FeMV RNA shedding in urine and kidney disease in cats that were

evaluated herein. Detailed molecular epidemiological investigations involving larger

numbers of cats with and without urotract diseases from different geographical areas within

South America are required to define the prevalence of FeMV infection in healthy and

diseased cats and the genetic diversity of viral strains that are circulating in cat populations

from this region.

Acknowledgments

This study was supported by University of Cuiabá and the Brazilian funding agencies National

Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq) and Brazilian Innovation Agency

(FINEP). A.A.A. and A.F.A. are supported by research fellowships and grants from CNPq.

Conflict of interest

The authors declare that they have no conflict of interest.

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42

5 ARTIGO

DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS

DE CUIABÁ, MATO GROSSO

43

DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE CUIABÁ, MATO GROSSO

Gabriela Molinari Darold1,*, Amauri Alcindo Alfieri4, Lívia Saab Muraro2, Alexandre Mendes Amude3, Káryta Maria de Lima Bezerra Bertti1, Janine Cruvinel de Lima2, Alice Fernandes Alfieri4, Michele Lunardi1,*

1Laboratório de Biologia Molecular e Virologia Animal, 2Laboratório de Patologia Clínica e 3Departamento Clínico de Pequenos Animais - Faculdade de Medicina Veterinária - Universidade de Cuiabá, Avenida Beira Rio, 3100, 78065-900, Cuiabá, MT, Brasil, 4Laboratório de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380, 86051-990 Londrina, PR, Brasil *Both authors contributed equally to the development of this paper.

RESUMO

O gênero Morbillivirus, incluído na família Paramyxoviridae, compreende patógenos de extrema importância em Medicina Veterinária. Em 2012 um novo morbilivírus foi identificado em gatos domésticos em Hong Kong, sendo caracterizado como morbilivírus felino (FeMV). Após essa primeira identificação, novas pesquisas foram realizadas no Japão, Itália, Alemanha, Estados Unidos, Turquia, e mais recentemente no Brasil, onde foi comprovada a circulação do vírus em todas as regiões descritas. Existem contradições acerca da infecção pelo vírus sobre uma provável associação com a doença renal em felinos. Devido à falta de dados no Brasil, surge a necessidade de maiores investigações sobre o vírus na região para levantar dados epidemiológicos e caracterizar o vírus circulante. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência e analisar a diversidade genética de paramixovírus excretados por gatos domésticos, além de associar os dados com os achados laboratoriais compatíveis com alterações renais. Neste estudo, foram coletadas amostras de urina e sangue de 276 gatos, independentemente do estado clínico, provenientes de abrigos, de protetores e de animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá. Dos 276 gatos avaliados, a presença do vírus em amostras de urina foi detectada por RT-snPCR em 95 (34,4%) animais, sendo que oito animais apresentavam evidências de alterações renais e 87 não apresentavam alterações compatíveis com uropatias. Com esta investigação foi possível demonstrar uma alta prevalência da infecção nos gatos na região, levantando dados epidemiológicos locais e, além disso, não pode ser observada a associação da excreção do paramixovírus pela urina com alterações renais nos felinos domésticos, demonstrando a necessidade da realização de estudos complementares sobre essa virose no país, para maiores esclarecimentos acerca da patogenia do vírus.

Palavras-chave: Felinos. Doença Renal. Morbilivírus felino. RT-PCR. Sequenciamento. Brasil.

44

ABSTRACT

The genus Morbillivirus, included in the family Paramyxoviridae comprises pathogens of importance in Veterinary Medicine. A new morbillivirus was identified in domestic cats in Hong Kong in 2012, being characterized as a feline morbillivirus (FeMV). After the initial identification, new investigations carried out in Japan, Italy, Germany, United States, Turkey, and more recently in Brazil, confirmed the viral circulation in all the regions cited. However, contradictions about viral infection and a likely association with a feline kidney disease remains. Due to the lack of data in Brazil, investigations aiming at studying epidemiological aspects of the infection and molecular characterization of viral strains are necessary. The aim of this study was to verify the prevalence and analyze the genetic diversity of paramixovirus excreted by domestic cats, as well as to relate the data with laboratorial findings compatible with renal disorders. In this work, urine and blood samples were collected from 276 cats regardless of clinical status, from shelters, multi-cat household and client-owned admitted to the Department of Small Animal Medicine of the University of Cuiaba Teaching Veterinary Hospital. Of the 276 cats evaluated, the presence of the virus in urine samples was detected by RT-snPCR in 95 (34,4%) cats, eight presenting loss of renal function and 87 without any alteration compatible with uropathies. Through this investigation, it was possible to demonstrate a high prevalence of the viral infection within cats from the region, adding new epidemiological data, demonstrating the necessity to carry out complementary studies on this virus in the country, for better clarification about the pathogenesis of the virus. Keywords: Cats. Kidney disease. Feline morbillivirus. RT-PCR. Sequencing. Brazil.

45

INTRODUÇÃO

A família Paramyxoviridae é composta por vírus envelopados cujo genoma é

constituído de RNA fita simples com polaridade negativa, compreendendo sete

gêneros: Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus, Aquaparamyxovirus,

Ferlavirus e Avulavirus. Outros que não possuem classificação definida também

estão agrupados nesta família viral, sendo que os vírus classificados no primeiro

gênero são altamente patogênicos em mamíferos, responsáveis por doenças em

humanos e animais (LAMB; PARKS 2013), como sarampo, cinomose canina e peste

bovina (KING et al., 2011; WOO et al., 2012).

Recentemente, novos vírus emergentes classificados no gênero Morbillivirus,

foram identificados como o phocine distemper virus (PDV) em focas e o morbilivírus

dos cetáceos (CMV) (MAZZARIOL et al., 2012; RUBIO-GUERRI et al., 2013). Além

destes, sabe-se que o vírus da cinomose canina (canine distemper vírus - CDV),

classificado neste gênero, possui uma ampla gama de hospedeiros, incluindo

felídeos silvestres, mamíferos marinhos e primatas (ROELKE-PARKER et al., 1996;

SAKAI et al., 2013).

Em 2012, na China, houve a primeira descrição da ocorrência de um

paramixovírus em felinos domésticos com classificação filogenética no gênero

Morbillivirus, sendo assim designado como morbilivírus felino (FeMV). Após isso,

novas investigações foram realizadas em populações de gatos domésticos de

diversos países, como Japão, Itália, Alemanha, Estados Unidos, Turquia e Brasil

(WOO et al., 2012; FURUYA et al., 2013; LORUSSO et al., 2015; SIEG et al., 2015;

DAROLD et al., 2016; YILMAZ et al., 2017).

De fato, além da presença do morbilivírus felino, também foi descrito o

paramixovírus felino (FPaV), sendo este último mais intimamente relacionado aos

paramixovírus isolados a partir de outras espécies animais, ainda sem classificação

definitiva na família (SIEG et al., 2015).

Além da detecção viral, existem estudos relacionando a presença da infecção

pelo vírus com uropatias e, por isso, este trabalho teve como objetivo o estudo da

46

frequência da infecção pelo agente viral em gatos domésticos de Cuiabá, assim

como verificar a sua provável relação com achados laboratoriais compatíveis com

alterações renais.

MATERIAL E MÉTODOS

ANIMAIS E AMOSTRAS

Neste estudo, foram incluídos 276 gatos domésticos, independentemente da

apresentação de algum sinal clínico, provenientes de atendimentos no Hospital

Veterinário da Universidade de Cuiabá – UNIC (n = 59), de abrigos (n = 136) e de

acumuladores (n = 81). Entre os animais avaliados, 161 eram machos e 115 fêmeas,

com idades variando entre 3 meses e 12 anos e pertencentes a diversas raças entre

persa (n = 8), siameses (n = 5) e sem raça definida (n = 263).

Amostras de sangue e urina foram coletadas de todos os animais, sendo esta

última coletada por meio de cistocentese, ambas respeitando os conceitos éticos e

de bem-estar animal durante a contenção e coleta.

ANÁLISE CLÍNICO-LABORATORIAL

A análise bioquímica sérica de todos os gatos incluiu testes de dosagem de

creatinina, proteínas totais, albumina e globulina, cujos valores de referência

considerados foram de 0,8 – 1,8 mg/dl; 5,4 – 7,6 g/dl; 2,1 – 3,9 g/dl; 2,6 – 5,1 g/dl,

respectivamente (MEYER; HARVEY, 1998). As amostras de urina foram avaliadas

através da urinálise (avaliação física, química e de sedimentos) e testes bioquímicos

para obtenção da relação proteína-creatinina (UPC).

Os animais do estudo foram classificados quanto a presença ou ausência de

uma ou mais alterações urinárias segundo a presença de alterações na densidade

urinária (valores abaixo de 1035), presença de cilindros na avaliação microscópica,

47

valores de UPC acima de 0,4 e aumento na concentração sérica de creatinina acima

de 1,8 mg/dl.

Entre os felinos analisados, foram considerados doentes renais não-

insuficientes os que apresentavam forte evidência de lesão renal, sendo possível a

detecção de cilindros na urinálise. Os animais classificados como insuficientes

renais apresentavam azotemia e densidade inferior ou igual a 1035. Além disso, os

gatos que demonstraram apenas densidade urinária inferior ou igual a 1035 foram

classificados como candidatos a doença renal.

TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DE SEMI-NESTED PCR

O RNA viral foi extraído das amostras de urina de 276 gatos utilizando o kit

QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, Hilden, Germany), de acordo com o manual de

instruções. Após a obtenção do RNA viral, a transcrição reversa foi realizada

utilizando a enzima SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, USA) com primer positivo.

A técnica de semi-nested RT-PCR (RT-snPCR) foi realizada com primers que

amplificam um fragmento parcial do gene L de membros dos gêneros Respirovirus,

Morbillvirus e Henipavirus, utilizando a enzima Platinum Taq DNA Polymerase

(Invitrogen, Carlsbad, USA) (TONG, et al. 2008). Em cada RT-snPCR foi incluída

uma alíquota de água ultrapura e RNA proveniente de material encefálico de cão

diagnosticado com cinomose canina como controles negativo e positivo,

respectivamente. Uma alíquota de 5µl do produto obtido na PCR foi submetida a

eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio (0,5mg/ml), e

avaliado sob luz UV em transiluminador (Loccus, São Paulo, Brasil).

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para elucidar a ocorrência da associação entre excreção viral e alteração

renal, os dados foram tabulados e avaliados pelo Teste Exato de Fisher e/ou Qui-

quadrado, quando apropriado, considerando nível de confiança de 95% e

significância menor que 0,05 (p<0,05), no software Epi Info™ versão 7.2. As

48

variáveis avaliadas foram: sexo, origem dos gatos, infecção pelo paramixovírus e

achados nos exames laboratoriais.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Através da RT-snPCR para detecção do paramixovírus, amostras de urina

foram avaliadas a partir de 276 gatos, dos quais 95 (34,4%) estavam excretando o

vírus, sendo 15 (15,8%) provenientes de proprietários, 58 (61%) de abrigos e 22

(23,1%) de acumuladores. Dentre os animais infectados, 64 (67,4%) eram machos

e 31 (32,6%) eram fêmeas.

Dos animais avaliados, 28 apresentaram alterações nos exames bioquímicos

séricos e/ou urinálise compatíveis com uropatias. Três foram classificados como

doentes renais, nove como insuficientes renais e 16 candidatos a doença renal. Os

demais 248 gatos não demonstraram alterações compatíveis com perda da função

renal em nenhum dos exames laboratoriais realizados.

Entre os 95 gatos excretando o FeMV na urina, apenas oito apresentavam

alterações renais, sendo um doente renal, um insuficiente renal e seis com

incapacidade em concentrar a urina. Com relação aos felinos não infectados, foram

20 animais detectados com alterações renais, sendo dois doentes renais, oito

insuficientes renais e 10 candidatos a doença renal.

Neste estudo, foi verificada a infecção pelo vírus em 34,4% dos gatos

avaliados, dado que diverge do apresentado em outros estudos que também

avaliaram elevado número de animais. Entre as investigações anteriores, a maior

prevalência encontrada foi de 12,3% na China em estudo envolvendo 427 gatos

(WOO et al., 2012). Outros estudos de detecção do vírus mostraram número

reduzido de animais excretando o vírus, como o estudo conduzido no Japão

envolvendo 82 gatos e na Alemanha com 206 gatos, onde foram demonstradas

prevalências de apenas 6,1% e 6,7%, respectivamente (FURUYA et al., 2013; SIEG

et al., 2015). Além disso, outras pesquisas mostraram percentuais mais baixos,

49

como o estudo realizado na Turquia com 96 amostras de urina de felinos, e de

maneira similar, nos Estados Unidos, cujo percentual de detecção viral foi de 3%

em ambos (YILMAZ et al., 2017; SHARP et al., 2016).

No presente trabalho houve diferença estatística na excreção viral segundo

o sexo dos animais. A frequência da infecção observada em machos foi de 39,75%

enquanto nas fêmeas foi de 26,96% (p=0,03) (Tabela 1). Em trabalho anterior,

conduzido por Sieg e colaboradores (2015) na Alemanha, foi observada maior

frequência de infecção pelos paramixovírus em gatos machos, no qual sete eram

machos dentre os oito que estavam excretando o vírus na urina. Porém, devido a

uma maior representação desse sexo entre os animais avaliados, não foi possível

verificar a associação entre a virose e o sexo com maior acurácia.

Tabela 1 – Distribuição da infecção pelo paramixovírus segundo o sexo dos animais.

Sexo Avaliados Positivos Frequência (%) Intervalo de confiança

95%

Valor de p

Fêmeas 115 31 26,96 18,85-35,07 0,03

Machos 161 64 39,75 32,19-47,31

Na análise estatística, foi mostrada a associação da infecção pelo vírus

apenas com relação a origem dos animais, cuja frequência foi de 42% em animais

provenientes de abrigos (p=0,03) (Tabela 2). Essa alta frequência poderia ser

justificada por diversos fatores tais como más condições higiênico-sanitárias dos

abrigos, ausência de controle sanitário, manutenção de alta densidade populacional

e considerável rotatividade de animais, sendo que, a associação de tais fatores

provavelmente favoreça a disseminação da infecção.

Tabela 2 – Distribuição da infecção pelo paramixovírus segundo a origem dos animais.

Origem Testados Positivos Frequência (%)* Intervalo de

confiança 95%

Abrigo 138 58 42,03a 33,79-50,26

Proprietário 57 15 26,32a,b 14,88-37,75

Protetor 22 81 27,16b 17,47-36,85

* valores com letras sobrescritas distintas indicam diferença estatística (p<0,01) pelo teste de Qui-quadrado.

50

Os achados encontrados em nosso estudo, que incluiu gatos com origem

diversificada, diferiram dos encontrados em estudos realizados anteriormente em

outros países, envolvendo gatos errantes e domiciliados, cuja prevalência foi de

12,3% e 6,1%, respectivamente (WOO et al., 2012; FURUYA et al., 2013).

Os dados levantados pela presente investigação diferem dos achados

demonstrados na China, Japão, Itália e Alemanha, onde foi possível correlacionar a

infecção viral com alterações renais. Woo e colaboradores (2012), na China,

associaram a presença do vírus no tecido renal à nefrite túbulo-intersticial, a partir

da técnica de imunohistoquímica. Similarmente, a detecção do agente viral por RT-

PCR em uma amostra de urina de um gato com nefropatia severa na Itália também

reforçou tal associação (LORUSSO et al., 2015). Da mesma maneira, no Japão,

amostras de urina, sangue, e tecidos parafinados de rins de gatos com nefrite,

revelaram a presença do vírus, sendo maior a prevalência nesta última amostra,

sustentando a hipótese de que existe uma frequência da infecção pelo FeMV em

gatos com nefrite (FURUYA et al., 2013). Um estudo caso controle realizado na

Alemanha detectou o vírus apenas em gatos que apresentavam sinais clínicos

compatíveis com uropatias, cuja prevalência foi de 6,7% dentre os 120 animais com

alterações renais que tiveram a urina avaliada por RT-PCR (SIEG et al., 2015).

No presente estudo não houve associação da infecção pelo vírus com a

doença renal, pois a frequência de gatos excretando o vírus com ausência de

alterações renais foi de 91,6% (IC:95%: 85,99–97,16), enquanto apenas 8,4% dos

animais infectados apresentavam alterações renais (p=0,63). Sharp e

colaboradores (2016), nos Estados Unidos, também não relacionaram a presença

do FeMV à doença renal na avaliação de 327 amostras de urina de gatos

domésticos, onde foi realizada a detecção do vírus em apenas 10 felinos, dos quais

sete eram clinicamente saudáveis e três tinham doença renal crônica. Além disso,

um gato foi acompanhado durante 15 meses e manteve-se clinicamente saudável,

mesmo com a excreção contínua do vírus neste intervalo de tempo.

Outra pesquisa demonstrou resultados semelhantes ao presente trabalho, a

qual foi realizada recentemente na Turquia, não relacionando a infecção pelo FeMV

com alterações no trato urinário. Neste trabalho, 110 amostras foram testadas,

51

sendo 95 de urina e 15 fragmentos de tecido renal, cujos achados clínico-

laboratoriais não foram estatisticamente significantes, pois a excreção viral não

variou diferentemente no grupo de animais com manifestações clínicas de trato

urinário (YILMAZ et al., 2017).

Outros achados laboratoriais como hematúria, leucocitúria, cristalúria,

proteinúria e hipoalbuminemia foram comparados quanto a infecção pelo

paramixovírus, sendo observado significância estatística apenas na proteinúria

associada de hematúria, cuja frequência encontrada foi de 4,21% (IC95%: 1,65 –

10,33; p:0,01).

Apesar da alta casuística de diagnósticos de doença renal em gatos, ainda

são escassos os dados acerca da prevalência dessa síndrome em gatos no Brasil.

Com isso, este estudo pôde colaborar com dados a respeito desta enfermidade, o

qual mostrou uma baixa prevalência da doença nos felinos avaliados neste

município.

Em virtude da distribuição difundida do FeMV, o qual está presente na Ásia,

Europa e Américas, são necessários estudos mais abrangentes para melhor

compreensão a respeito da patogenia e transmissibilidade do vírus, além da

realização de estudos caso-controle para esclarecimento da provável correlação do

vírus com a doença renal em gatos domésticos.

CONCLUSÃO

Os paramixovírus felinos estão circulando na população de gatos da região,

com alta prevalência (34,4%), sendo necessária a realização de estudos mais

abrangentes a respeito deste agente nas demais regiões do país. Além disso, não

pôde ser observada a associação da excreção do paramixovírus pela urina com a

ocorrência de alterações renais nos felinos domésticos, cuja frequência de gatos

com alterações renais excretando o vírus foi de apenas 8,4%, demonstrando a

necessidade de maiores esclarecimentos acerca da patogenia do vírus.

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