PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL

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PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCINCIAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

PROJETO DE TESE DE DOUTORADO

AVALIAO DOS EFEITOS DA CERVEJA NA MODULAO DE INSUFICINCIA CARDACA INDUZIDA POR MONOCROTALINA

Orientador

Dr. Jarbas Rodrigues de Oliveira

Aluno do PPG-BCM

Mrcia Keller Alves

Porto Alegre RS Brasil

2009APRESENTAO

O presente Projeto de Pesquisa (PP) faz parte das atividades do Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular (PPGBCM) da PUCRS, e ser executado no Laboratrio de Biofsica Celular e Inflamao.

Entre as reas de estudo do laboratrio est o estudo de novas drogas com potencial antiinflamatrio, alm da linha de Biofsica Celular e Molecular, que estuda mecanismos celulares de inflamao. Dentre os projetos e trabalhos cientficos desenvolvidos encontram-se diversos experimentos na rea de anlise de Frmacos e Medicamentos, incluindo a frutose-1,6-bisfosfato e o paracetamol, alm de estudo de drogas em potencial (extrato de Capsicum baccatum e extrato de Baccharis trimera).

O PPGBCM tem conceito 4 na avaliao da CAPES e seu objetivo fornecer formao avanada e qualificao para a elaborao e a execuo de propostas cientficas, tecnolgicas e polticas relacionadas ao estudo e manipulao de mecanismos e estruturas celulares.

SUMRIO2APRESENTAO

4RESUMO

51.Introduo

51.1. Tipos de Cerveja

61.2. Ingredientes utilizados na produo da cerveja (de acordo com a Lei de Pureza Alem de 1516)

61.3. Etapas da Fabricao da Cerveja

91.4. - Cerveja Importncia Nutricional e Aes Fisiolgicas

101.5. Patognese da Insuficincia Cardaca

111.6. Diagnstico da Insuficincia Cardaca

111.7. Tratamento da Insuficincia Cardaca

122. JUSTIFICATIVA E HIPTESE

123. OBJETIVOS

123.1. Objetivo Geral

123.2. Objetivos Especficos

134. METODOLOGIA

134.1. Materiais

134.2. Protocolo Experimental

144.3. Mtodos

185. ANLISE ESTATSTICA

196. CRONOGRAMA

207. ORAMENTO

228. REFERNCIAS

RESUMO

A principal causa de mortalidade no Brasil a doena cardiovascular que apresenta uma das taxas mais elevadas, quando comparada a de outros pases. Segundo dados do Sistema nico de Sade (SUS) a insuficincia cardaca acomete 2 milhes de pacientes, com uma incidncia de 240 mil casos por ano. Na populao mundial, a prevalncia da doena de 1 a 2% e a mortalidade oscila em torno dos 10%. A insuficincia cardaca definida como a incapacidade do corao em manter um dbito cardaco adequado s necessidades metablicas tissulares e caracteriza-se pela elevao das presses pulmonar e venosa sistmica. Embora cerca de 14% a 34% dos casos de insuficincia cardaca sejam devidos ao desenvolvimento de insuficincia cardaca direita, os mecanismos envolvidos no seu desenvolvimento ainda no so bem conhecidos. Determinados alimentos e bebidas contm compostos que podem oferecer um papel protetor frente s doenas cardiovasculares. No que diz respeito insuficincia cardaca, a presena de substncia bioativas como flavonides e outros compostos fenlicos tem grande importncia na proteo do miocrdio tanto em termos estruturais, quanto em relao proteo, quanto ao dos radicais livres. Entre estas bebidas, encontra-se a cerveja, uma bebida mundialmente popular h mais de quatro mil anos, cuja produo se d atravs da transformao de produtos alimentcios naturais em uma bebida de sabor e aroma caractersticos.

Entre os ingredientes utilizados, o malte e o lpulo tm se mostrado ricos em flavonides com atividades biolgicas importantes. Alguns destes compostos podem ser encontrados na cerveja pronta, parcialmente modificados. Alm disso, estudos tm mostrado que o consumo moderado de lcool pode reduzir o risco de doenas cardiovasculares atravs da reduo da inflamao e do aumento do HDL-colesterol.

Devido ao dos compostos fenlicos presentes na cerveja, e da ao benfica do consumo moderado de lcool (presente na cerveja), pode-se sugerir um papel protetor desta bebida frente a doenas cardacas.

Palavras-chave: cerveja; compostos fenlicos, insuficincia cardaca, oxidao.

1.Introduo

A cerveja uma das bebidas mais antigas e mais consumida no mundo. Basicamente, uma bebida fermentada, na qual o amido derivado de gros maltados (cevada, trigo, arroz, etc) transformado em acares fermentescveis1. Uma proporo de carboidrato convertida em etanol e dixido de carbono, pela adio do fermento ao mosto, usualmente Saccharomyces cerevisiae2.

De acordo com a Lei de Pureza de 1516, promulgada pelo prncipe William IV da Bavria, a primeira regulamentao do processo de fabricao da cerveja, estes devem ser os nicos ingredientes usados nas cervejas tradicionais alems: gua, cevada (cereal que sofreu o processo de malteao), fermento e lpulo3. No Brasil permitido o uso de, no mximo, 30 % de complemento de malte ou adjuntos, como milho, arroz, xarope de milho com o objetivo de diminuir o custo final do produto4.

Embora os ingredientes sejam constantes, vrios parmetros influenciam o tipo e a qualidade da cerveja, entre eles a variedade do malte e processo de malteao, temperatura e pH durante mostagem (cozimento do malte em gua), a variedade de lpulo utilizada e a levedura de fermentao5.

A cerveja pode contribuir para a dieta, por ser uma bebida rica em nutrientes aminocidos, carboidratos, minerais e compostos fenlicos6. O lpulo, bem como os diferentes tipos de malte, tem se mostrado uma fonte importante de compostos fenlicos na cerveja, pois contm principalmente cidos fenlicos, flavonides, catequinas e proantocianidinas. Estas substncias podem ser encontradas na cerveja e apresentam aes medicinais importantes7.

O consumo da cerveja no Brasil, em 2007, totalizou 10,34 bilhes de litros. Quanto ao consumo per capita, o pas est acima do total registrado por pases como Frana, Argentina e China, com uma mdia de 55,99 litros/ano por habitante. A produo no Brasil em 2004 foi de 8,5 bilhes de litros8.

1.1. Tipos de Cerveja

De modo geral, as cervejas so classificadas em dois grandes grupos pela fermentao cervejas tipo Ale e cervejas tipo Lager. Estima-se que existam atualmente mais de 20 mil variedades de cervejas no mundo. Pequenas mudanas no processo de fabricao, como diferentes tempos e temperaturas de cozimento, fermentao e maturao, e o uso de outros ingredientes, alm dos quatro bsicos - gua, lpulo, cevada e malte - so responsveis por uma variedade muito grande de tipos de cerveja9.

1.2. Ingredientes utilizados na produo da cerveja (de acordo com a Lei de Pureza Alem de 1516)1.2.1 gua

Fator importantssimo no processo de fabricao da cerveja. O ideal de gua : no clorada, potvel, pH entre 6,5 e 7,0; menos de 100mg/litro de carbonato de clcio ou magnsio; traos de magnsio na forma de sulfatos; 250 a 500mg/litro de sulfato de clcio; 200 a 300mg/litro de cloreto de sdio e menos de 1mg/litro de ferro4.

1.2.2 MalteA escolha da cevada como matria-prima devido a suas caractersticas qumicas e fsico-qumicas e valor econmico. Quando no h indicao, subentende-se o uso de malte de cevada. Em caso da cerveja com trigo, por exemplo, deve-se indicar o uso de malte de trigo. No Brasil, permite-se o uso de complementos de malte (milho, arroz e xarope de milho) objetivando diminuir o custo e obter uma cerveja mais clara.

O processo de fabricao do malte chama-se malteao e envolve o controle do umedecimento com gua e posterior germinao sob condies controladas de temperatura com o intuito de obter mudanas fsicas e qumicas desejadas, com uma perda mnima de energia pelo processo de respirao10.

1.2.3 Fermento Cervejeiro

As leveduras mais utilizadas so espcies do gnero Saccharomyces especficas para cada tipo de fermentao4.

1.2.4 Lpulo Lpulo o nome dado s flores fmeas maduras da planta (Humulus lupulus) e responsvel pelo amargor, sabor e aroma da cerveja, sendo parte essencial no impacto sensorial total do produto. O lpulo pode ser comercializado na forma de flores secas, p, pellets e extrato. As duas ltimas so mais adequadas por proporcionar maior densidade e, portanto, menor volume a ser transportado4.

1.3. Etapas da Fabricao da Cerveja

1.3.1 Recebimento e Armazenagem do Malte: Em grandes empresas o malte recebido granel (1) e armazenado em silos (2).

1.3.2 Moagem do Malte (3): O malte modo de modo que a moagem no fique muito fina (o que torna lenta a filtragem do mosto) nem muito grossa (o que dificulta a hidrolise do amido). O objetivo desta etapa tornar o contedo do gro acessvel a ao enzimtica. O contedo fibroso servira posteriormente como elemento filtrante11. O contedo total ser transferido para sofrer a mosturao.

1.3.3 Mosturao (4): Nesta fase ocorre a mistura de malte modo com gua e a fase na qual deve ser feita a adio do complemento de malte. O processo de mosturao inicia com baixa temperatura e vai aquecendo por etapas at 75C. O objetivo gomificar o amido para facilitar a hidrlise deste por parte das enzimas do malte (protesases, -amilase e -amilase)12. Alm disso, nesta etapa ocorre degradao das protenas em peptdeos ou aminocidos, que ira afetar o sabor, propriedades fsicas e estabilidade da cerveja13.

1.3.4 Filtragem (5): A filtragem feita em leito filtrante formado pelos slidos (bagao com cascas) do malte, e tem por funo separar a casca da mistura. Depois de filtrada, a mistura passa a denominar-se mosto. O mosto passa para uma tina de cozimento14.

1.3.5 Cozimento (7): Esta etapa e responsvel pela inativao de amilases e proteases e tem durao aproximada de 1 hora. Durante a fervura, adiciona-se o lpulo (6), que e responsvel pelo amargor (quando adicionado na fase inicial da fervura) e aroma (quando adicionado na fase final da fervura) da cerveja. Na seqncia, realizado o trub em um tanque decantador, em que a parte slida e separada por gravidade14.

1.3.6 Resfriamento (8): Esta a fase de precipitao de complexos de protenas com resinas e taninos ou cold break. A temperatura deve descer de 80C para aproximadamente 10C13.

1.3.7 Fermentao (9): Nesta fase ocorre a inoculao do fermento em equipamento fechado para evitar contaminao e perda de CO2. Como resultado tem-se o consumo de acares fermentescveis pela levedura e a produo de lcool etlico e CO2. No final da fermentao, as leveduras floculam e comeam a decantar, o que se denomina quebra13. Encerrada a fermentao, retira-se o fermento a cerveja entra no processo de maturao.

1.3.8 Maturao (10): Durante este perodo, ocorre uma lenta fermentao complementar, modificando aroma e sabor. O tempo de maturao depender do tipo de cerveja que esta sendo produzida. Durante o perodo de armazenamento so formados steres, dando origem ao aroma e sabor da cerveja madura ou chope13. A principal diferena entre a cerveja e o chope que este ltimo no passa por processo de pasteurizao, como a cerveja.

1.3.9 Segunda Filtrao (12) e acabamento (13): nesta segunda filtrao, acrescenta-se terra diatomcea para remover partculas em suspenso e tambm adsorver certas substncias que conferem cor desagradvel para a cerveja. Aps, a cerveja passa por uma fase de acabamento onde ir receber dixido de carbono (que aps de ser obtido da fermentao armazenado) e outras substncias (estabilizantes e antioxidantes)13,14.

1.3.10 Engarrafamento (15 e 16)1.3.11 Pasteurizao (17): O objetivo da pasteurizao eliminar microorganismos que iro prejudicar as caractersticas originais da cerveja. Assim, a pasteurizao costuma ser realizada a temperaturas por volta de 70C, de modo que essa seja a temperatura letal dos microorganismos em questo13.1.4. - Cerveja Importncia Nutricional e Aes Fisiolgicas

Os compostos fenlicos desempenham um papel importante nas caractersticas sensoriais (cor, aroma e sabor) e nutricionais da cerveja, devido a sua influncia na estabilidade coloidal, sendo responsvel pela turbidez originada pela interao com as protenas da cerveja15.

Os principais polifenis presentes na cerveja so cidos fenlicos, flavonides de trs tipos: flavanis (catequinas e epicatequinas), as antocianinas (pelargonidina, malvidina, leucocianidinas e leucopelargonidina) e seus produtos derivados de oxidao (chalconas xantohumol, xantogalenol, e flavonas - 8-prenil-naringenina) e os flavonols (quercitina, kampferol, mircetina). Tambm aparecem compostos mais complexos como os taninos sendo os mais importantes as proantocianidinas de diversos graus de polimerizao15.

Outros compostos importantes so os -cidos e os -cidos, cidos amargos presentes no lpulo (5% e 20% do peso do lpulo maduro). Os -cidos, particularmente o humuleno (35-70% do total de -cidos), o cohumuleno (20-65%), e o adhumuleno (10-15%) so considerados como os mais importantes componentes para determinar a qualidade do lpulo16. O humuleno tem sido usado como agente antimicrobiano, primeiramente para preservao da cerveja17. O -humuleno o princpio ativo antiinflamatrio encontrado na erva baleeira, e se encontra em formulao de medicamento de uso tpico para dores musculares.

Cerca de 20% a 30% dos polifenis encontrados na cerveja so provenientes do lpulo, especialmente os flavonides prenilados18. A bebida uma das principais fontes dietticas destes flavonides, incluindo xantohumol e xantogalenol. O xantohumol e seu ismero isoxantohumol tm exibido efeitos quimiopreventivo, antiproliferativo e citotxico19,20. O xantogalenol foi descrito recentemente21 e no h relatos de aes fisiolgicas.

A atividade antioxidante da cerveja similar a do vinho embora seus antioxidantes especficos presentes no lpulo e na cevada sejam diferentes dos compostos antioxidantes presentes na uva22. A cerveja contm componentes, entre eles, cido flico, vitaminas do complexo B (B1, B2, B12) e polifenis, que so os elementos antioxidantes naturais presentes na bebida e nas matrias primas utilizadas na sua elaborao (casca do malte e lpulo)15.

Alm dos compostos fenlicos derivados a partir de seus ingredientes, a composio da cerveja inclui carboidratos, protenas e aminocidos, fibras, minerais e algumas vitaminas8. A bebida contm, ainda, lcool proveniente da fermentao e estudos tem mostrado que o consumo moderado de lcool tem ao protetora contra doena cardiovascular oclusiva23 e aterosclerose carotdica24. Para o homem, o consumo de cerveja deve ficar em at 720ml/dia e para mulheres, 360ml/dia25.

No que diz respeito reduo de riscos de doenas cardiovasculares, igualmente importante o efeito que os flavonides exercem sobre a hipertenso arterial26. Alm disso, os compostos fenlicos inibem as reaes de oxidao das lipoprotenas de baixa densidade (LDL-c) e a formao da LDL-oxidada, altamente aterognica, mostrando um potencial antioxidante importante27-29.

Fica evidente a necessidade de estudos utilizando esta bebida para obtermos conhecimento dos provveis mecanismos de ao e de potenciais aplicaes sade humana. 1.5. Patognese da Insuficincia Cardaca

A insuficincia cardaca definida como a incapacidade do corao em manter um dbito cardaco adequado s necessidades metablicas tissulares e caracteriza-se principalmente pela elevao das presses pulmonar e venosa sistmica. Nesta patologia, ocorre importante estimulao neurohumoral, como ativao do sistema nervoso simptico e do sistema renina-angiotensina-aldosterona, alm de alteraes na musculatura esqueltica30.

uma sndrome clnica complexa, cujos sinais e sintomas incluem: dispnia de repouso, intolerncia ao esforo, fadiga, palidez, cianose, hepatomegalia e, freqentemente, por edema de membros inferiores, resultantes de uma disfuno (hipertrofia) ventricular. Embora o grau dessa disfuno possa ser quantificado atravs de mtodos diagnsticos invasivos e no invasivos, a gravidade dos sintomas difcil de ser avaliada devido a sua subjetividade31. Estudos em animais tm contribudo para o esclarecimento dos mecanismos responsveis pelo desenvolvimento da insuficincia cardaca. A doena pode ser causada por diversos fatores como hipertenso, infarto do miocrdio, distrbios da contratilidade ventricular, disfuno sistlica, diastlica ou ambas32. Estudos experimentais tm demonstrado o aumento na formao de radicais livres e a associao do estresse oxidativo com o dficit na reserva antioxidante endgena na insuficincia cardaca33. Recentemente, evidncias substanciais tm apontado o estresse oxidativo como uma das vias importantes no remodelamento cardaco (adaptao do miocrdio sobrecarga de presso) e no processo de transio da hipertrofia cardaca compensada para a insuficincia cardaca34,35. O esquema abaixo representa os diversos indutores de insuficincia cardaca em modelos animais e sua relao com o estresse oxidativo. AO = antioxidante, EAO = espcies ativas de oxignio36.

1.6. Diagnstico da Insuficincia Cardaca

O diagnstico de insuficincia cardaca (em humanos) pode ser feito atravs de: avaliao laboratorial (hemograma, sdio, potssio, creatinina, uria, glicemia, peptdio natriurtico tipo B); raio X; eletrocardiograma, holter, ecodopplercardiograma, medicina nuclear, estudo hemodinmico, estudo eletrofisiolgico, bipsia endomiocrdica e/ou angiotomografia32. 1.7. Tratamento da Insuficincia CardacaO tratamento visa estabilizao clnica e hemodinmica do paciente e ser guiado pelos sintomas (presso, perfuso perifrica, alterao de funo renal, etc). Dentro de otimizao teraputica usa-se: diurticos, antagonistas de aldosterona, digitlicos, inibidores da ECA, vasodilatadores, betabloqueadores, antiarrtmicos e anticoagulantes32. 2. JUSTIFICATIVA E HIPTESEOs compostos fenlicos fazem parte de um amplo grupo de metablitos encontrado na maioria das plantas. Estes compostos apresentam atividades antioxidantes, antiinflamatria e anticarcinognica, aumentando o interesse por efeitos protetores contra diversas doenas, como o cncer, os distrbios cardiovasculares e as inflamaes.

Levando-se em considerao que substncias bioativas como flavonides e outros compostos fenlicos tm grande importncia na proteo do miocrdio tanto em termos estruturais quanto de estresse oxidativo, pretende-se verificar a eficincia dos compostos fenlicos na cerveja no que diz respeito modulao de insuficincia cardaca.O presente estudo foi elaborado com a inteno de testar a hiptese de que animais submetidos ingesto de cerveja melhoram o quadro de insuficincia cardaca induzida por monocrotalina atravs da modulao do dano oxidativo e/ou de outros possveis mecanismos que sero analisados.3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

3.1.1 Avaliar a ao da cerveja na modulao de insuficincia cardaca induzida por monocrotalina.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

3.2.1. Determinar a concentrao de compostos fenlicos totais na cerveja;3.2.2. Determinar a capacidade antioxidante da cerveja in vitro e em tecido biolgico (fgado);3.2.3. Observar a aparncia geral (sinais clnicos) e quantificar o ndice de mortalidade dos animais tratados, aps injeo de monocrotalina;

3.2.4. Avaliar as alteraes heptica e cardaca nos animais insuficientes cardacos;3.2.5. Avaliar as medidas hemodinmicas e morfomtricas de corao, pulmes e fgado;3.2.6. Avaliar a atividade de enzimas antioxidantes em tecido biolgico;

3.2.7. Quantificar o nvel de metablitos de xido ntrico (nitratos e nitritos) no plasma e em tecido cardaco;3.2.8. Avaliar do efeito da cerveja sobre parmetros hematolgicos avaliao in vivo;4. METODOLOGIA4.1. Materiais

4.1.1. Matria prima e drogasA cerveja utilizada neste estudo ser adquirida diretamente da indstria responsvel pela sua produo. Ser uma cerveja comercial, tipo pilsen, orgnica. Para todos os testes, in vivo e in vitro, a cerveja ser previamente degaseificada. A monocrotalina (Crotaline C240) ser comprada da Sigma Aldrich Qumica Brasil Ltda. O carvedilol, medicamento amplamente utilizado no tratamento da insuficincia cardaca em humanos, ser comprado em farmcia comercial (Ictus, Biolab Farmacutica). 4.1.2. Animais

A manipulao dos animais obedecer aos princpios ticos determinados pelo Comit de tica para o Uso de Animais em Pesquisa (CEUA-PUCRS). Sero utilizados Rattus norvegicus (Wistars, 180220g) machos, que sero mantidos em caixas apropriadas, com controle cclico claro-escuro e acesso livre gua e rao. 4.2. Protocolo Experimental Os animais sero separados aleatoriamente em 8 grupos experimentais, agrupados em caixas. A quantidade de cerveja com lcool administrada via gavagem ser calculada de forma a oferecer 0,570g de etanol/kg de peso do animal, a fim de testar o efeito do consumo moderado de cerveja37. A mesma quantidade de cerveja sem lcool ser administrada, ambas uma vez ao dia, diariamente, at o final do tratamento. Os animais tratados com carvedilol recebero a droga via oral (gavagem) na dose de 1mg/kg38, somente aps induo de insuficincia cardaca. 4.2.1. Grupos ExperimentaisGrupo controle: sem IC, receber gua.Grupo insuficiente: com IC induzida por MCT, receber gua no perodo pr e ps IC.

Grupo cerveja: sem IC, receber cerveja.Grupo cerveja sem lcool: sem IC, receber cerveja sem lcool..

Grupo carvedilol: sem IC, receber carvedilol. Grupo cerveja insuficiente: com IC induzida por MCT, receber cerveja no perodo pr e ps IC.

Grupo cerveja sem lcool insuficiente: com IC induzida por MCT, receber cerveja sem lcool no perodo pr e ps IC.

Grupo carvedilol insuficiente: com IC induzida por MCT, receber carvedilol no perodo ps IC.

4.2.1. Induo da insuficincia cardaca

A induo da insuficincia cardaca (IC) ser atravs de uma nica injeo intraperitoneal de monocrotalina (MCT, 60mg/kg de peso corporal)39,40 na 4 semana de tratamento com as cervejas. Aps 21 dias a partir da induo de IC os animais sero eutanasiados e sero iniciadas as anlises das amostras (sangue e tecido).

Animais do grupo controle, cerveja, cerveja sem lcool e carvedilol (grupos no insuficientes) recebero uma injeo com o mesmo volume de soluo salina nas mesmas condies e tempos experimentais. Anterior a induo da insuficincia, bem como nos animais no-insuficientes, ser retirado sangue do plexo venoso retro-orbital para anlises diversas.Este experimento ser realizado duas vezes, com os mesmos grupos experimentais a fim de possibilitar a anlise de todos os parmetros desejados.

4.3. Mtodos 4.3.1. Determinar a concentrao de compostos fenlicos totais na cerveja:

O ndice de polifenis totais ser determinado pelo mtodo espectrofotomtrico de Folin-Ciocalteu41. Ser feita a determinao qualitativa de outros compostos, tais como catequinas, cumarinas, esteris, triterpenos, saponinas, taninos, quinonas, flavonides diversos, glicosdios cardiotnicos, alcalides42,43. A partir da anlise qualitativa, ser feita a anlise quantitativa, a fim de determinar a quantidade destes compostos presentes na cerveja. Esta anlise ser realizada em parceria com a Faculdade de Qumica da PUCRS, representando o Trabalho de Concluso de Curso do aluno de Qumica Industrial Daniel Janke Faustino da Silva.4.3.2. Determinar a capacidade antioxidante da cerveja in vitro e ex vivo.Para fins comparativos, os mesmos testes sero realizados com o carvedilol.

In vitro: Mtodo ABTS (cido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-cido sulfnico): O mtodo ABTS utilizado ser o mtodo descrito por Re44 e modificado por Kuskoski45. O mtodo consiste em gerar radicais ABTS+ por reao com 2,2'-azo-bis (2-amidinopropano (ABAP), de modo a avaliar espectrofotometricamente a descolorao que ocorre quando o radical ABTS+ reduzido a ABTS. Desta maneira, mede-se a capacidade que o objeto de estudo (cerveja) tem de ser scavenger de radicais em meio hidrossolvel. Mtodo DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo): O mtodo consiste em medir espectrofotometricamente o consumo de DPPH atravs da reduo da absorbncia na regio visvel de comprimento de onda de 515nm do radical DPPH por antioxidantes. Desenvolvido por Brand-Willams46 e modificado por Kim47, Desta maneira, mede-se a capacidade que o objeto de estudo (cerveja) tem de ser scavenger de radicais em meio lipossolvel.Capacidade antioxidante total (TRAP): representa a capacidade antioxidante no enzimtica, determinada atravs da medida da intensidade de quimioluminescncia do luminol (LH2) induzida pela adio de ABAP temperatura ambiente. Seu princpio est baseado na peroxidao de lipdeos endgenos e exgenos a azo-iniciadores, como o ABAP. Pode ser aplicado a todos os fluidos biolgicos e determinado atravs do consumo de O2 e/ou atravs da deteco direta de radicais peroxil por quimioluminescncia48. Reatividade antioxidante total (TAR): a TAR mede a qualidade dos antioxidantes presentes na amostra em estudo. O fundamento do mtodo o mesmo da TRAP, diferentes nas concentraes de liminol, AZO e amostras adicionadas. medida a queda na emisso de luz, mostrando o quanto a amostra consegue neutralizar esta reao quimioluminescente49. Formao e monitoramento dos radicais nion superxido (O2-): O radical nion superxido gerado atravs da reao catalisada pela enzima xantina oxidase que utiliza a xantina como substrato, levando formao de radical nion superxido e cido rico. O monitoramento da produo deste radical realizado espectrofotometricamente a 560 nm, pela reduo do tetrazlio nitroazul (NBT). A atividade da xantina oxidase avaliada pela medio colorimtrica da formao de cido rico a partir da xantina, a 295nm50.

Formao e monitoramento de radicais hidroxila (OH): Este mtodo baseia-se na oxidao da deoxirribose provocada por radicais hidroxila, produzidos pela reao do perxido de hidrognio com o ferro, levando a formao de substncias que reagem com o cido tiobarbitrico (TBA), monitoradas espectrofotometricamente a 532 nm51.In vivo: Mtodo TBARS: A determinao da capacidade antioxidante em tecido biolgico (fgado) ser feito atravs da avaliao das substncias reativas ao cido barbitrico (TBARS)52. A medida destas substncias usada como marcador de peroxidao lipdica em sistemas biolgicos. Este mtodo detecta de forma inespecfica as substncias capazes de reagir com o cido barbitrico, que corresponde, em sua maioria, ao malondialdedo. Os resultados sero expressos em nmoles de MDA/g de protena. Ser determinada a concentrao de protenas no homogeneizado de fgado utilizando-se a albumina srica bovina (BSA) como padro. 4.3.3. Observar a aparncia geral (sinais clnicos) e quantificar o ndice de mortalidade dos animais aps injeo de monocrotalinaSer feita uma curva de crescimento atravs da aferio individual do peso do animal, trs vezes por semana a contar do primeiro dia de experimento. Sero verificados sinais clnicos clssicos de insuficincia cardaca, como respirao alterada, bem como cor das patas e focinho. Ser verificada e registrada tambm a incidncia de mortes durante o perodo experimental. 4.3.4. Avaliar as funes heptica e cardaca nos animais insuficientes;

Dentre os testes de funo heptica sero utilizados: nveis sricos de albumina, uria, amnia, glicose em jejum, fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e gama glutamil-transferase (gama-GT). Estes testes sero realizados no soro dos animais atravs de anlises bioqumicas.Os biomarcadores para doenas cardiovasculares que sero determinados so: albumina modificada pela isquemia (IMA)53, Creatina Kinase e sua isoenzima CK-MB54, Troponinas I55 e peptdio natriurtico tipo B (BNP)56.4.3.5. Avaliar as medidas hemodinmicas e morfomtricas de corao, pulmes e fgado.Medidas Hemodinmicas: As medidas de presso ventricular sistlica direita e presso ventricular diastlica final direita sero feitas atravs de medida direta, por meio de uma cnula introduzida no corao, de acordo com protocolo utilizado no laboratrio em que ser realizada a anlise (Laboratrio de Fisiologia, UFRGS). Antes do acesso s medidas hemodinmicas, os animais sero pesados, e depois das medidas, ainda anestesiados, sero eutanasiados por exanginao para retirada dos rgos. O corao ser retirado imediatamente, os trios sero separados e pesados a fim de observar o peso dos ventrculos, que tambm sero separados. A hipertrofia direita ser avaliada pelo peso do ventrculo direito sobre o peso corporal (mg/g) e a hipertrofia cardaca pelo peso do corao sobre o peso corporal do rato (mg/g). Do mesmo modo ser feito com o fgado (peso do fgado sobre peso corporal mg/g)57. Com relao congesto pulmonar e heptica, para obteno das relaes peso mido/peso seco dos pulmes e do fgado, os rgos sero removidos e liberados de tecidos aderentes. Em cada caso, os tecidos sero pesados e colocados em estufa a 70C at peso constante58.4.3.6. Dosagens da atividade de enzimas antioxidantes em tecido biolgico;

As enzimas antioxidantes tm papel fundamental na proteo do organismo, pois constituem a primeira linha de defesa contra as espcies ativas de oxignio59.Superxido dismutase (SOD): A atividade da SOD, enzima antioxidante que reduz o radical superxido a perxido de hidrognio, ser determinada em homogeneizados de fgado pela taxa de inibio da reao do radical superxido com o pirogalol. A atividade da enzima expressa em U/mg de protena60 Glutationa peroxidase (GPx): uma enzima que catalisa a reao de hidroperxidos com a glutationa reduzida (GSH) formando glutationa oxidada (GSSG) e o produto da reduo do hidroperxido. A atividade da GPx ser determinada em espectrofotmetro, medindo-se a oxidao do NADPH em um meio de reao contendo soluo reguladora de fosfatos. A atividade da enzima expressa em nmoles/min/mg de protena61. Catalase (CAT): uma hemoprotena altamente especfica que catalisa a decomposio do perxido de hidrognio gua e oxignio. Sua atividade ser medida pela diminuio da absoro do perxido de hidrognio a 240 nm, sendo expressa em nmoles/mg de protena62.

4.3.7. Quantificar o nvel de metablitos de xido ntrico (nitratos e nitritos) no plasma e tecido cardacoOs nveis de nitrato e de nitritos no plasma e tecido cardaco sero medidos pela reao das amostras com o reagente de Griess. Os compostos formados pela reao sero medidos em espectofotmetro no comprimento de onda de 540 nm e espresso em nmol/L63.4.3.8. Avaliao do efeito da cerveja sobre parmetros hematolgicos.O efeito sobre o perfil lipdico ser avaliado atravs de anlise bioqumica. Os animais ficaro em jejum por 12 horas antes da retirada do sangue, que ser retirado do plexo venoso retro-orbital para anlises diversas Os marcadores bioqumicos para colesterol total (COD-ANA), colesterol HDL, colesterol LDL, colesterol VLDL, triglicerdios (GPO-ANA) sero analisados utilizando os kits comerciais Labtest Diagnstica S.A., Brasil.

5. ANLISE ESTATSTICA

Os resultados sero submetidos anlise estatstica usando o software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). Teste post hoc Bonferroni para comparaes entre os grupos. Os resultados sero apresentados como mdia desvio padro, onde ssero consideradas diferenas significativas quando P < 0,05. 6. CRONOGRAMA

Atividades Programadas

(2009/2012)Jan

09Mar

09Abr

09Mai09Julh 09Jan

10Abr

10Jul

10Nov

10Fev

11Jul

11Nov

11Mar

12

Reviso bibliogrficaxxxxxxxxxxxxx

Apresentao do projeto ao PPGBCMx

Defesa pblica do projetox

Envio ao Comit de ticax

Incio dos trabalhos in vitrox

Anlise dos resultados obtidos in vitrox

Elaborao de artigo para publicaox

Experimentos piloto in vivox

Incio dos experimentos in vivo 1x

Anlise dos resultados obtidos in vivox

Incio dos experimentos in vivo 2x

Anlise dos resultados obtidos in vivox

Elaborao de artigos para publicaox

Elaborao da tese x

Entrega da tese ao PPGBCMx

7. ORAMENTO

DescrioQuantidadePreo (R$)

Ratos de laboratrio200 animais1600,00

Rao padro100 kg250,00

Maravalha50 kg50,00

Luvas para procedimento (caixa com 100 unidades)20 caixas600,00

Ponteiras descartveis 200 l 10 pacotes500,00

Ponteiras descartveis 1.000 l 10 pacotes500,00

Ponteiras descartveis 5.000 l 10 pacote500,00

Seringa de insulina 1mL250 un200,00

Seringas descartveis 20 mL250 un200,00

Agulha para gavagem1 unidade35,00

Heparina (5000uni/mg)1 unidade300,00

Tampo Salina Fosfato pH 7,4 SIGMA (10 L)1100,00

Microtubo de 1,5mL (Ependorf) 4 pacotes 400,00

Monocrotalina (Crotaline 2401 - Sigma, 500mg)1 unidade650,00

Carvedilol (Ictus, Biolab Farmacutica) (caixa com 30 cp)1 caixa20,00

Soluo de Cloreto Sdio 0,9% (frasco 500mL)5 un10,00

ABTS (Fluka)1g200,00

DPPH (Aldrich) 1g300,00

Metanol (Sigma)1 litro135,00

Tetrazolio nitroazul (NBT, Sigma).2,5mL160,00

KCl (Sigma)500g100,00

Hidroperxido de tert-butil (T-BOOH Sigma)25mL180,00

cido fosfotngstico 10% (Sigma)250mL200,00

Quetamina 10mL40,00

Xilasina30,00

Luminol (Fluka)1g55,00

Xantina (Sigma)10g150,00

Xantina oxidase (Sigma)5UN160,00

cido nitrilotriactico (NTA) (Sigma)5g100,00

Deoxirribose (Sigma)25mg250,00

Perxido de hidrognio (Sigma)500mL190,00

cido tricloroactico (TCA) (Sigma) 500g200,00

BNP (rat Sigma)0,5mg1500,00

t-BuOOH (Aldrich)25mL180,00

Dietilenotriaminopentaactico (DTPA) (SigmaAldrich)5g140,00

Pirogalol (SigmaAldrich)10g70,00

Reagente de Griess (Fluka)100mL150,00

Kit glutationa S-Transferase (GST) (Sigma)1 kit1600,00

Kit colesterol total (COD-ANA) Labteste Diagnstica S.A., Brasil3 kit120,00

Kit colesterol HDL (GPO-ANA) Labteste Diagnstica S.A., Brasil3 kit120,00

Kit VLDL Labteste Diagnstica S.A., Brasil3 kit120,00

Papel A4 75g/m2 (relatrios pacote 500 folhas)1 unidade16,00

Cartucho para impressora (preto)2 unidades120,00

Cartucho para impressora (cores)1 unidade150,00

Total de gastos estimados-12651,00

8. REFERNCIAS

1. Klesper E, Corwing AH., Turner DA. J. Org. Chem. 27 (1962) 700.

2. Hornsey IS. Brewing, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 1999, chapters 1 and 2.

3. Kunze W. Technology brewing and malting. Berlim: VLB, 1997.

4. Aquarone E; Almeida Lima U; Borzani W. Alimentos e bebidas produzidos por fermentao. So Paulo: Edgard Blcher, 1983.

5. Gerhauser C. Beer constituents as potential cancer chemopreventive agents. Eur J Cancer 41 (2005) 19411954.

6. Piendl A. Uber den Stellenwert des Biers in der heutigen Ernahrung. Brauwelt, 14 (1989) 546552.

7. Stevens JF, Miranda CL, Wolthers KR, et al. Identification and in vitro biological activities of hop proanthocyanidins: inhibition of nNOS activity and scavenging of reactive nitrogen species. J Agric Food Chem 50 (2002) 3435-3443.

8. SINDICERV Sindicato Nacional da Indstria da Cerveja. Disponvel em http://www.sindicerv.com.br/mercado.php.

9. Hardwick WA. Handbook of Brewing. New York: Dekker, 1995.

10. Kalnin JL. Avaliao estratgica para a implantao de pequenas cervejarias. 1999. 126f. Dissertao (Mestrado em Engenharia de Produo e Sistemas), Curso de Ps-graduao em Engenharia de Produo e Sistemas, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Florianpolis, 1999.

11. Rabin D; Forget C. The Dictionary of Beer and Brewing. EUA: Brewers Publications, 1998.

12. Kramer B. Processo de fabricao da cerveja. 1999. Disponvel em: http://www.geocities.com/Colosseum/Park/4053/cerveja.html.

13. Fix G. Principles of Brewing Science. EUA: Brewers Publications, 1998.

14. Behre KE. The history of beer additives in Europe - a review. Veget Hist Archeobot. 8 (1999) 3548.

15. San Jos MLG; Rodriguez PM; Bells YVV. Actividad antioxidante de la cerveza: estdios in vitro e in vivo (1 parte). Cerveza e Salud. 154, (2001) 47-54,.

16. Simpson WJ, Smith AR. Factors affecting antibacterial activity of hop compounds and their derivatives. J Appl Bacteriol 72 (1992) 327-334.

17. Mizobuchi S; Sato Y. Antifungal activities of hop bitter resins and related compounds. Agric Biol Chem 49 (1985) 399-403.

18. Gerhuser C, Alt A, Klimo K, Heiss E, Gamal-Eldeen A, Neumann I, Knauft J, Scherf H, Frank N, Bartsch H, Becker H. Xanthohumol from hop (Humulus lupulus) as a novel potential cancer chemopreventive agent. Proc Am Assoc Cancer Res. 42 (2001b)18.

19. Miranda CL, Stevens JE Helmrich A, et al. Antiproliferative and cytotoxic effects of prenylated flavonoids from hops (Humulus lupulus) in human cancer cell lines. Food Chem Toxicol 37 (1999) 271-285.

20. Gerhuser C, Alt A, Heiss E, Gamal-Eldeen A, Klimo K, Knauft J, Neumann I, Scherf HR, Frank N, Bartsch H, Becker H. Cancer chemopreventive activity of Xanthohumol, a natural product derived from hop. Mol Cancer Ther. 1 (2002) 959969.

21. Stevens JF; Taylor AW; Nickerson G B : Ivancic, M : Henning, J : Haunold, A; Deinzer ML. Prenylflavonoid variation in Humulus lupulus: distribution and taxonomic significance of xanthogalenol and 4'-O-methylxanthohumol. Phytochemistry. 53(7) (2000) 759-75.

22. Denke MA. Nutritional and health benefits of beer. Am J Med Sci. 5 (2000) 320-326.

23. Salonen JT, Seppnen K, Raurama AR, Salonen R. Risk for carotid atherosclerosis: the Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study Ann Med 21 (1989) 227-229.

24. Silva JM, Mendez MM, Gonzalo M, Pinto E. J-curve between alcohol consumption and carotid atherosclerosis in patients with dyslipidemia. Ann Med Intern 17 (2000) 582-587.

25. Mion D. V Diretrizes Brasileiras de Hipertenso Arterial. 2006. Disponvel: http://www.diabetes.org.br/educao/documentos/documentos/V_DBHA_2006.pdf

26. Arajo PWB; Jnior, LJQ; Vasconcelos, HD; Almeida, JRGS. Flavonides e Hipertenso. Revista Brasileira de Hipertenso 12(3) (2005) 188-189.

27. Frankel EM, Kanner J, German JB, Parks E, Kinsella JE. Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine. Lancet 7 (1993) 341-454.

28. Miranda CL; Stevens JF; Ivanov V; Mccall M; Frei B; Veinzer ML; Uhler DR. Antioxidant and prooxidant actions of prenylated and non-prenylated chalcones and flavanones in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48(9) (2000) 3876-3884.

29. Rodrguez RJ, Miranda CL, Stevens JF, Deinzer ML; Buhler D. Influence of prenylated and non-prenylated flavonoids on liver microsomal lipid peroxidation and oxidative injury in rat hepatocites. Food and Chemical Toxicology, 39(5) (2001) 437-445.

30. Negro, C.E. & Barretto, A.C.P.. Efeito do Treinamento Fsico Na Insuficincia Cardaca: Implicaes Autonmicas, Hemodinmicas e Metablicas. Revista SOCESP. 8(2) (1998) 273 - 284.

31. Kamel CS, Siqueira-Filho AG, Barreto LFM, Benchimol M. Insuficincia Cardaca Congestiva. Correlao entre a Classe Funcional e as Funes Sistlica e Diastlica Avaliadas pela Ecocardiografia com Doppler. Arq Bras Cardiol.76 (2001) 127-31.32. Cantarelli, MJC; Salemi, VMC. Diagnstico e tratamento da insuficincia cardaca descompensada grave. Diretrizes Assistenciais do Hospital Srio Libans. 2004.

33. Hill MF; Singal PK. Antioxidant and oxidative stress changes during heart failure subsequent to myocardial infarction in rats. Am J Pathol. 148 (1996) 291-300.34. Kaul N, Siveski-Iliskovic N, Hill M, Slezak J & Singal K. Free radicals and the heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 30 (1993) 55-67.

35. Singal PK, Khaper N, Bell-Klein A, Bhayana M. Oxidative stress status in the transition of hypertrophy to heart failure. Heart Failure Reviews 4 (1999) 353-360.

36. Bell-Klein A; Souza-Rabbo MP; Barp J; Llesuy S. Espcies Ativas de Oxignio como Mediadoras da Hipertrofia e insuficincia Cardaca. Revista da Sociedade de Cardiologia do Rio Grande do Sul - Ano XIII n 03 Set/Out/Nov/Dez 2004.

37. Degrace P, Moindrot B, Mohamed I, Gresti J, Clouet P. Moderate consumption of beer reduces liver triglycerides and aortic cholesterol deposit in LDLr / apoB100/100 mice. Atherosclerosis 189 (2006) 328335.

38. Neto ML; Pascoal LADB; Balieiro JCC; Larsson MHMA; et al. O carvedilol no tecido conjuntivo cardaco de ratos durante o desenvolvimento da hipertrofia miocrdica concntrica. Cincia Rural, Santa Maria, 36 (2006) n.4, jul-ago.

39. Baybutt RC, Rosales C, Brady H, Molteni A. Dietary fish oil protects against lung and liver inflammation and fibrosis in monocrotaline treated rats. Toxicology. 14 (2002) 175:1-13.

40. Singal PK, Khaper N, Palace V, Kumar D. The role of oxidative stress in genesis of heart disease. Cardiovasc Res. 40 (1998) 426-32.

41. Rossi, J. A. Jr.; Singleton, V. L. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents. American Journal Enol. Vitic. 16 (1965) 144-158.

42. Martnez, M. Metodos de Analisis de drogas y extratos. Editorial Flix Varela. Havana, 1996.

43. Martnez, M. Farmacognosia y productos naturales. Editorial Flix Varela. Havana, 2001.

44. Re R; Pellegrini N; Proteggente A; Pannala A; Yang M; Rice-Evans C; Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free radical biology & medicine 26 (1999) 231-7.

45. Kuskoski, E. Marta et al. Actividad antioxidante de pigmentos antocinicos. Cinc. Tecnol. Aliment. 24 (2004) 4.

46. Brand-Williams,W.; Cuvelier, M.E.; Berset, C. Use of free radical method to evaluuate antioxidant activity. Lebensm. Wiss. Technol. 22 (1995) 25-30.

47. Kim D-O.; Lee KW; Lee HJ; Lee CY. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolics phytochemicals. J. Agric. Food Chem. 50 (2002) 3713-3717.

48. Lissi E; Pascual C; Del Castillo MD. Luminol Luminescence Induced by 2,2'-Azo-Bis(2-Amidinopropane) Thermolysis. Free Radical Research, 17 (1992) 299 311.

49. Repetto MG; Llesuy SF. Antioxidant properties of natural compounds used in popular medicine for gastric ulcers. Braz J Med Biol Res 35 (2002) 523-34

50. Robak J; Gryglewski R J. Flavonoids are scavengers of superoxide anions. Biochemical pharmacology 37 (1988) 837-41.

51. Halliwell B; Gutteridge JMC. Formation of a thiobarbituric-acid reactive substance from deoxyribose in the presence of iron salts the role of superoxide and hydroxyl radicals. FEBS Lett., 28 (1981) 347-352.

52. Winterbourn C C; Gutteridge J M; Halliwell B. Doxorubicin-dependent lipid peroxidation at low partial pressures of O2. Journal of free radicals in biology & medicine 1 (1985) 43-9.

53. Bhagavan NV, Lai EM, Rios PA, Yang J, Ortega-Lopez AM, Shinoda H, Honda SA, Rios CN, Sugiyama CE, Ha CE. Evaluation of human serum albumin cobalt binding assay for the assessment of myocardial ischemia and myocardial infarction. Clin Chem. 49 (2003) 581-585.

54. Adams JE, Abendschein DR, Jaffe AS. Biochemical markers of myocardial injury. Is MB creatine kinase the choice for the 1990s? Circulation. 88(2) (1993) 750-763.

55. Hillis WS, BirnieD, Docherty A. Troponin T and myocardial damage. Br J Cardiol 22 (1993) 16-21.

56. de Bold AJ, Borenstein HB, Veress AT, Sonnenberg H. A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats. Life Sci 28 (1981) 89-94.

57. Singal PK, Khaper N, Farahmand F, Bell-Klein A. Oxidative stress in congestive heart failure. Curr Cardiol Rep. 2(3) (2000) 206-11.

58. Silva FL et al. Infarto do miocrdio experimental e aumento do estresse oxidativo em diafragma de ratos. J. bras. pneumol. [online]. 31(6) (2005) 506-510.

59. Bello-Klein A, Bock PM, Travacio M, Senna SM, Llesuy S, Bittencourt PI Jr, et al. Myocardial oxidative stress and antioxidants in hypertension as a result of nitric oxide synthase inhibition. Cardiovasc Toxicol. 1(1) (2001) 43-50.

60. Stefan L, Marklung S. Pyrogallo autoxidation. In: Marklund S. Handbook of methods for oxygen radical research. Boca Raton CRC Press; (1985) 243-7.

61. Floh L, Gunzler WA. Assay of glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 105 (1984) 114-21.

62. Boveris A, Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J. 134(3) (1973) 707-16.

63. Granger DL, Anstey NM, Miller WC, Weinberg JB. Measuring nitric oxide production in human clinical studies. Methods Enzymol. 301 (1999) 49-61