Laboratrio de Gentica Molecular Humana PPG em Biologia Celular e Molecular

Aplicada Sade (PPGBioSade) Universidade Luterana do Brasil (ULBRA)

Laboratrio de Biologia Molecular Servio de Endocrinologia Hospital de Clnicas de

Porto Alegre (HCPA)

O Papel dos MicroRNAs na Patognese da Retinopatia Diabtica em

Pacientes com Diabetes Mellitus Tipo 2:

Estudo de Associao de Polimorfismos Genticos e Nveis Plasmticos

Coordenadora: Profa. Dra. Ktia Gonalves dos Santos

Pesquisadores: Lus Henrique Canani (professor), Daisy Crispim Moreira (professora),

Naiana Silvia Soares Corra (aluna de graduao IC), Renan Csar Sbruzzi (aluno de

graduao IC)

EDITAL FAPERGS n. 001/2013

PROGRAMA PESQUISADOR GACHO PqG

Junho, 2013

2

SUMRIO

1. Fundamentao Terica ................................................................................................ 3

1.1. Diabetes Mellitus............................................................................................... 3

1.2. Complicaes Crnicas do Diabetes Mellitus .................................................. 4

1.3. Retinopatia Diabtica ........................................................................................ 5

1.4. MicroRNAs ....................................................................................................... 7

1.4.1. Biognese e Funo ............................................................................ 7

1.4.2. Perfil de Expresso de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica ........... 8

1.4.3. Polimorfismos de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica ................. 10

2. Justificativa de Pesquisa ............................................................................................... 11

3. Hipteses Conceituais ................................................................................................... 11

4. Objetivos ........................................................................................................................ 12

4.1. Objetivos Gerais ............................................................................................... 12

4.2. Objetivos Especficos ....................................................................................... 12

5. Materiais e Mtodos ..................................................................................................... 13

5.1. Populao de Estudo e Grupos Experimentais ................................................ 13

5.2. Diagnstico da Retinopatia Diabtica.............................................................. 14

5.3. Anlises Moleculares ...................................................................................... 14

5.3.1.Genotipagem (Extrao de DNA, PCR-RFLP e qPCR) ................... 14

5.3.2. Expresso Gnica (Extrao de RNA e qRT-PCR) ......................... 15

5.4. Anlises Estatsticas ........................................................................................ 15

5.5. Aspectos ticos ............................................................................................... 16

6. Cronograma do Estudo ............................................................................................... 17

7. Oramento Detalhado .................................................................................................. 18

8. Referncias Bibliogrficas ........................................................................................... 22

9. Adequao e Descrio da Equipe de Pesquisa ......................................................... 28

10. Infra-estrutura e Apoio Tcnico Disponvel ............................................................. 29

11. Resultados Esperados e Contribuies Cientficas .................................................. 30

3

1. FUNDAMENTAO TERICA

1.1. Diabetes Mellitus

O diabetes mellitus (DM) uma sndrome metablica caracterizada por hiperglicemia

resultante de defeitos na secreo e/ou na ao da insulina. A hiperglicemia crnica no DM

est associada disfuno e falncia, a longo prazo, de mltiplos rgos, afetando

principalmente os olhos, rins e corao (American Diabetes Association, 2013; Trisha

Dunning, 2013). O DM pode ser etiologicamente classificado em quatro categorias, que so:

DM tipo 1 (DM1), DM tipo 2 (DM2), outros tipos de DM e DM gestacional. Apesar de

apresentarem etiologias distintas, os quatro tipos de DM tm como alterao em comum a

incapacidade de manter a homeostase glicmica (American Diabetes Association, 2013).

O DM2 corresponde a 80-90% dos casos de DM e ocorre principalmente em adultos

aps os quarenta anos de idade. Os pacientes com DM2 apresentam diferentes graus de

deficincia insulnica, variando desde uma pequena intolerncia glicose at a forma

insulinopnica similar ao DM1, que requer tratamento com insulina exgena (American

Diabetes Association, 2013). A hiperglicemia crnica observada nos pacientes com DM2

resultante dos efeitos combinados da resistncia ao da insulina (que pode preceder o

incio do quadro clnico) e de uma deficincia das clulas beta em compensar para a elevada

demanda de insulina (que se acentua com o decorrer dos anos de evoluo da doena). Um

terceiro fator agravante, sempre associado, o aumento da produo heptica de glicose

decorrente das duas primeiras alteraes (DeFronzo, 2004). A obesidade, o sedentarismo, a

hipertenso, a dislipidemia, a idade avanada, a histria familiar de DM e o DM gestacional

prvio so alguns dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de DM2 (Oliveira,

2004; Murea et al., 2012; American Diabetes Association, 2013).

O DM2 constitui um grave problema de sade pblica em razo de sua elevada

prevalncia, acentuada morbidade e mortalidade e das repercusses econmicas e sociais

decorrentes do impacto das complicaes vasculares, que comprometem a qualidade de vida

e a produtividade dos indivduos afetados, alm dos elevados custos do seu tratamento

(Oliveira, 2004). Anlises globais estimaram uma prevalncia mundial de diabetes de 6,4%

em 2010. Entre 2010 e 2030, estima-se que haja um aumento de 69% no nmero de adultos

com diabetes nos pases em desenvolvimento. Entre os fatores que explicariam essa

prevalncia crescente esto o aumento da populao mais idosa (como consequncia da maior

expectativa de vida da populao) e as mudanas no estilo de vida (Shaw et al., 2010).

4

1.2. Complicaes Crnicas do Diabetes Mellitus

No incio do DM2, os indivduos podem apresentar nveis de insulina prximos ou at

mesmo mais elevados do que os nveis de um indivduo normoglicmico. Com o passar do

tempo, as clulas beta entram em exausto e cessam a produo de insulina (DeFronzo, 2004;

American Diabetes Association, 2013). Como a hiperglicemia geralmente se desenvolve de

forma gradual, o DM2 frequentemente assintomtico em seus estgios iniciais. Assim, o

paciente pode permanecer sem diagnstico por vrios anos. No entanto, medida que se

desenvolve, a hiperglicemia crnica provoca danos em diversos rgos, levando ao

desenvolvimento de complicaes vasculares crnicas que muitas vezes so detectadas no

momento do diagnstico do DM2 (DeFronzo, 2004; Oliveira, 2004). As complicaes micro-

e macroangiopticas so as causas mais comuns de morbidade e mortalidade nos pacientes

com DM (Forbes e Cooper, 2013).

Quanto s complicaes microvasculares, os rgos afetados so aqueles que no

dependem de insulina para a absoro da glicose. De acordo com a intensidade e o tempo de

exposio hiperglicemia, ocorrem leses estruturais no endotlio de pequenos vasos

sanguneos, provocando alteraes funcionais de vrios rgos e tecidos. Morfologicamente,

estas alteraes se caracterizam pela constrio progressiva dos vasos sanguneos, pelo

espessamento da membrana basal dos capilares e pelo aumento da permeabilidade s

protenas plasmticas (Roy et al., 2010). Clinicamente, os maiores problemas so a

retinopatia (DM a causa no-traumtica mais frequente de cegueira em adultos), a

nefropatia (DM a principal causa de falncia e transplante renal) e a neuropatia (DM a

principal causa de amputao dos membros inferiores nos pases em desenvolvimento)

(Forbes e Cooper, 2013).

A hiperglicemia induz a disfuno endotelial por meio de efeitos txicos diretos e

tambm indiretamente pela perturbao de rotas de sinalizao intracelular inter-relacionadas

(via do poliol, via da hexosaminase, formao dos produtos finais de glicao avanada e

ativao de isoformas da protena cinase C) (Giacco e Brownlee, 2010; Chistiakov, 2011;

Murea et al., 2012; Ola et al., 2012). Essas alteraes resultam na amplificao dos fatores

endoteliais que promovem a proliferao celular e a inflamao (Murea et al., 2012). Apesar

disso, as bases moleculares e celulares da fisiopatologia das complicaes vasculares do DM

so muito mais complexas e existem vrias outras rotas bioqumicas implicadas (Forbes e

Cooper, 2013).

5

Recentemente, vrios estudos tm identificado uma classe de RNAs no-codificantes

com funes regulatrias, conhecidos como microRNAs (miRNAs ou miRs), que controlam

aproximadamente 60% dos genes codificadores de protenas em humanos (Bartel, 2009). As

evidncias mostram que os microRNAs podem exercer um papel essencial na patognese do

diabetes e suas complicaes crnicas por meio de sua capacidade de regular os nveis de

expresso dos genes que atuam na diferenciao, crescimento e proliferao celular, assim

como na apoptose (Kantharidis et al., 2011; Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012;

Shantikumar et al., 2012), como ser visto na seo 1.4.

1.3. Retinopatia Diabtica

A retinopatia diabtica (RD) uma complicao crnica do diabetes, que ocorre em

mais de 60% dos pacientes com DM2. A RD constitui a principal causa no-traumtica de

novos casos de cegueira, em adultos de 20 a 74 anos de idade, nos pases ocidentais

(Chistiakov, 2011; Sivaprasad et al., 2012). Um estudo realizado pelo nosso grupo de

pesquisa com pacientes com DM2 atendidos nos ambulatrios de trs centros mdicos

gachos verificou que a frequncia de RD foi de 48%, sendo que 15% apresentavam RD

proliferativa. Essa complicao tambm estava presente em uma proporo considervel de

pacientes com tempo de DM inferior a 5 anos (27%) (Scheffel et al., 2004).

A RD se caracteriza por alteraes gradualmente progressivas na microvasculatura da

retina que, ao atingirem sua forma mais grave, podem resultar na perda irreversvel da viso

(Chistiakov, 2011). Alm disso, a RD tambm est associada com um aumento no risco de

doena cardiovascular (Kawasaki et al., 2011; Kramer et al., 2011) e com a mortalidade por

todas as causas (Kramer et al., 2011) nos pacientes com diabetes.A RD pode ser classificada

em diferentes estgios de acordo a gravidade das alteraes na vasculatura retiniana (Agardh

e Agardh, 2004; Chistiakov, 2011). A classificao mais simples e comumente utilizada na

literatura agrupa a RD em trs categorias: ausente, no-proliferativa (presena de

microaneurismas, hemorragias retinianas, edema retiniano e exsudatos duros) e proliferativa

(neovascularizao no disco ptico ou em outras regies) (Wilkinson et al., 2003; Kollias e

Ulbig, 2010; Chistiakov, 2011).

O capilar retiniano formado pelas clulas endoteliais, pelas clulas intramurais (ou

pericitos) e pela membrana basal (Agardh e Agardh, 2004). Na etapa inicial da RD, ocorre a

degenerao seletiva dos pericitos e o espessamento da membrana basal, resultando na

formao de capilares acelulares e no enfraquecimento da parede vascular.

6

Consequentemente, as clulas endoteliais proliferam-se, levando formao de capilares

dilatados (microaneurismas). Com o subsequente desequilbrio na autorregulao do fluxo

sanguneo ocorre um aumento da presso hidrosttica nos capilares retinianos, levando ao

rompimento da barreira hematorretiniana. Com isso, aumenta a permeabilidade vascular, que

resulta em hemorragias retinianas e no acmulo extracelular de fluidos, lipdios e

lipoprotenas (que so clinicamente denominados de exsudatos duros). A ocluso dos

capilares, causada pelo espessamento da membrana basal, pela agregao plaquetria, pela

ativao de leuccitos e/ou migrao das clulas gliais atravs das paredes vasculares, resulta

em reas de no-perfuso e hipxia, com a subsequente dilatao dos capilares pr-existentes

ou formao de vasos em forma de colar. A ocluso dos capilares tambm resulta em

anormalidades microvasculares intrarretinianas e no extravasamento generalizado de fluidos.

As reas de no-perfuso estimulam o crescimento de novos vasos que se formam na

superfcie da retina, no disco ptico ou em outras regies. Por serem anmalos e frgeis, estes

neovasos so propensos a extensas hemorragias. A neovascularizao pode permanecer

estvel e sofrer regresso espontnea, ao passo que, em alguns casos, ocorre uma rpida

progresso que confere um elevado risco para a subsequente perda visual. Alm disso, o

tecido conjuntivo que se forma ao redor dos neovasos pode contrair, levando trao e ao

descolamento da retina. Assim, as hemorragias, o descolamento da retina e o tecido fibroso

residual contribuem para a perda irreversvel da viso (Agardh e Agardh, 2004; Kollias e

Ulbig, 2010; Antonetti et al., 2012).

Alm disso, em qualquer estgio da RD, os pacientes com DM podem tambm

desenvolver edema macular, que envolve o espessamento da retina na regio macular. O

edema ocorre aps o rompimento da barreira hematorretiniana como consequncia do

extravasamento de fluidos dos capilares e microaneurismas (Kollias e Ulbig, 2010;

Chistiakov, 2011). Indivduos com retinopatia moderada a grave podem ter sensibilidade e

acuidade visual prejudicada causando dificuldade para ler, dirigir e realizar outras atividades

do dia a dia (Antonetti et al., 2012).

Os principais fatores de risco para o desenvolvimento e a progresso da RD so o mau

controle glicmico, o tempo de durao do DM e a hipertenso (Kollias e Ulbig, 2010; Ding e

Wong, 2012). Porm, reconhecido que a RD uma doena multifatorial, com o

envolvimento de fatores genticos (Abhary et al., 2009; Liew et al., 2009; Ng, 2010). Estudos

familiares e ensaios clnicos tm demonstrado que a etnia um fator de risco independente

para essa complicao. A prevalncia e a gravidade da RD so maiores nos afro-americanos,

hispnicos e sul-asiticos do que nas populaes caucasianas. Essa diferena no pode ser

7

atribuda exclusivamente alta frequncia do DM ou dos fatores de risco para a RD nessas

populaes (Cheung et al., 2010; Ding e Wong, 2012).

Alm disso, vrios estudos observaram que ocorre uma agregao familiar de casos de

RD em diferentes grupos tnicos. Ainda, existem pacientes que no desenvolvem RD, a

despeito de um controle glicmico deficiente, ao passo que outros desenvolvem complicaes

crnicas apesar de controlarem a glicemia de forma adequada (Liew et al., 2009; Ng, 2010;

Murea et al., 2012). Neste contexto, inmeros estudos tm sido realizados com o intuito de

identificar os genes que conferem suscetibilidade RD, principalmente por meio dos estudos

de associao do tipo caso-controle, em diferentes populaes. Os potenciais genes

candidatos para essa complicao incluem os genes que codificam produtos envolvidos no

metabolismo da glicose e na funo endotelial. Porm, at o momento, poucos estudos tm

demonstrado uma associao significativa entre um gene candidato e a ocorrncia ou a

gravidade da RD (Abhary et al., 2009; Liew et al., 2009; Ng, 2010).

1.4. MicroRNAs

1.4.1. Biognese e Funo

Os microRNAs (miRNAs ou miRs) so pequenos RNAs endgenos (com

aproximadamente 20-22 nucleotdeos), no-codificantes, que regulam a expresso gnica ao

nvel ps-transcricional pela degradao ou inibio dos seus genes-alvo. A variao

significativa no grau de complementariedade das sequncias permite que um nico

microRNA atinja vrios mRNAs, regulando mltiplos genes, enquanto cada mRNA pode ser

regulado por vrios microRNAs (Kim, 2005; Filipowicz et al., 2008). Em 2007, mais de

1.500 microRNAs j tinham sido descritos (Beuvink et al., 2007). Os estudos sobre os

microRNAs predominam na Oncologia (Srivastava e Srivastava, 2012; Baer et al., 2013),

enquanto seu padro de expresso em outras doenas, especialmente no diabetes e suas

complicaes crnicas, comearam a ser objeto de investigao apenas recentemente

(Kantharidis et al., 2011; Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012).

Os microRNAs so transcritos primeiramente pela RNA polimerase II em transcritos

primrios (pri-miRs) no ncleo. Os pri-miRs so relativamente longos e podem conter uma

ou mais estruturas em forma de grampo. Um complexo formado por uma ribonuclease

(Drosha) associada protena DGCR8 processa o pri-miR em pr-miR (precursor), que

possui uma estrutura secundria em forma de grampo deaproximadamente 70 nucleotdeos.

8

Posteriormente, esse pr-miR exportado para ocitoplasma, atravs da exportina-5, onde

reconhecido e clivado pela ribonuclease Dicer e seus cofatores, gerando a molcula madura

de microRNA, composta de cerca de 22 nucleotdeos. Aps, a protena argonauta, da famlia

das endonucleases, interage para formar o complexo de silenciamento induzido por RNA

(RISC), essencial para direcionar o microRNA at o mRNA-alvo. O reconhecimento do alvo

pelo microRNA ocorre na regio 3' do mRNA-alvo, devido complementariedade com a

sequncia seed presente na regio 5 do microRNA. Dependendo do grau de

complementariedade, o mRNA-alvo clivado ou sua traduo inibida, ou ainda,

direcionado para a degradao nos corpsculos P (Kim, 2005; Filipowicz et al., 2008).

Considerando que os miRNAs podem modular processos fisiolgicos e a

patofisiologia de diversas doenas, reconhecido que existe a necessidade de identificar os

microRNAs (e seus alvos) associados com as complicaes do diabetes, pois isto propiciaria

a identificao de novos biomarcadores e alvos teraputicos (Kantharidis et al., 2011;

Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012; Shantikumar et al., 2012; Guay e Regazzi,

2013). Alm da sua funo intracelular, estudos recentes demonstraram que os microRNAs

podem ser exportados ou liberados pelas clulas na circulao em uma forma estvel. A

descoberta dos microRNAs circulantes sugeriu a possibilidade intrigante de utilizao dos

padres de expresso destas molculas como biomarcadores, avaliados de forma no-

invasiva, para a deteco precoce das complicaes diabticas, o que poderia auxiliar no

manejo clnico dos desfechos de longo prazo (Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012;

Shantikumar et al., 2012; Guay e Regazzi, 2013).

1.4.2.Perfil de Expresso de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica

Estudos recentes tm mostrado o papel dos microRNAs no desenvolvimento do

diabetes, nefropatia diabtica e doenas cardiovasculares (Kantharidis et al., 2011; Lorenzen

et al., 2012; Natarajan et al., 2012). Um estudo prospectivo com 800 pacientes diabticos do

tipo 2 identificou uma assinatura capaz de predizer o diabetes, baseada em 10 microRNAs

plasmticos, incluindo uma reduo nos nveis do miR-126 (Zampetaki et al., 2010). Porm,

somente nos ltimos trs anos os microRNAs passaram a ser objeto de investigao no que

diz respeito aoseu envolvimento na patognese da RD, como pode ser visualizado a seguir.

Em 2011, McArthur e colaboradores analisaram o perfil de expresso de microRNAs

na retina de ratos com diabetes induzido por estreptozotocina. Os pesquisadores avaliaram os

nveis de RNAm e de protena nas clulas endoteliais dos grandes vasos e nos capilares

9

retinianos, com ou sem injeo de um mimtico ou de um antagonista do miR-200b. O miR-

200b foi hipoexpresso na retina de ratos diabticos e nas clulas endoteliais incubadas em

glicose. A transfeco das clulas endoteliais e a injeo dentro do vtreo do mimtico do

miR-200b preveniu o aumento nos nveis do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)

e tambm a permeabilidade e a angiognese. Da mesma forma, a transfeco das clulas com

o antagomir levou ao aumento na produo de VEGF. Um estudo recente realizado em

camundongos Akita (um modelo gentico de diabetes tipo 1) mostrou que o miR-200b estava

hiperexpresso na retina destes animais (Murray et al., 2013). Nesse mesmo estudo, a

transfeco de clulas de Mller humanas com um inibidor do miR-200b atenuou o estresse

oxidativo e a apoptose. Da mesma forma, a transfeco celular com um mimtico do miR-

200b aumentou o nmero de clulas que entraram em apoptose.

Em outro estudo de 2011, Kovacs e colaboradores avaliaram o perfil de expresso de

microRNAs na retina e clulas endoteliais retinianas em ratos com diabetes induzido por

estreptozotocina, trs meses aps o desenvolvimento do diabetes. Aproximadamente

100microRNAs foram diferencialmente expressos nos ratos diabticos e controles. Entre eles,

o miR-146, miR-155, miR-132 e miR-21estavamhiperexpressos nas clulas endoteliais dos

ratos diabticos. Devido retroalimentao negativa do miR-146 na ativao do fator nuclear

kappa B (NF-kB) nas clulas endoteliais, os autores sugeriram que o miR-146 poderia servir

como um potencial alvo teraputico para a RD por meio da inibio do NF-kB.Por outro

lado, em outro estudo (Feng et al., 2011), observou-se que a expresso do miR-146a estava

diminuda na retina e nas clulas endoteliais de animais com diabetes tipo 1 e 2 (ratos com

diabetes induzido por estreptozotocina e camundongos db/db, respectivamente).O ensaio

funcional de transfeco com um mimtico e com um antagonista do miR-146a mostrou que

a diminuio dos nveis deste microRNA provocam o aumento na expresso de fibronectina,

o que pode contribuir para a hipertrofia e fibrose.

Alm destes estudos, Silva e co-autores (2011) demonstraram que o miR-29b estava

hiperexpresso cerca de 30 dias aps a induo de diabetes por estreptozotocina na retina de

ratos diabticos em comparao aos controles. O resultado obtido pelos pesquisadores sugere

que o aumento na expresso do miR-29 nos estgios iniciais do diabetes pode ter um efeito

protetor contra a apoptose das clulas retinianas. Em um modelo de neovascularizao

retiniana induzida por isquemia em camundongos, Bai e colaboradores (2011) avaliaram o

efeito do miR-126 neste processo. Os autores observaram que os nveis do miR-126 estavam

diminudos na retina dos camundongos com retinopatia induzida por oxignio e que a

restaurao do miR-126 (por injeo intra-vtreo) superou os nveis aumentados de VEGF,

10

assim como reduziu a neovascularizao retiniana neste modelo de retinopatia induzida.

No ano passado, Wu e colaboradores (2012) avaliaram o perfil de expresso de

microRNAs na RD em ratos com diabetes induzido por estreptozotocina. Os resultados

demonstraram que 11 microRNAs estavam hiperexpressos, enquanto 6 microRNAs

estavamacentuadamente hipoexpressos nos ratos com RD. Os nveis do miR-182, miR-96,

miR-183, miR-211, miR-204 e miR-124 estavam aumentados durante o progresso da RD, ao

passo que os nveis do miR-10b, miR-10a, miR-219-2-3p, miR-144, miR-338 e miR-199a-3p

estavam diminudos. Porm, at o momento, nenhum estudo avaliou o perfil de expresso de

microRNAs na RD em humanos.

1.4.3.Polimorfismos de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica

A maior parte dos estudos de associao gentica tm avaliado a ocorrncia de

polimorfismos nas regies codificadoras dos genes. Porm, as evidncias sugerem que

polimorfismos nas regies no-codificadoras, incluindo o promotor, os acentuadores e as

regies seed dos microRNAs, podem ter um efeito significativo na patognese de diversas

doenas (Natarajan et al., 2012). Considerando que os microRNAs podem afetar a expresso

gnica por almejar a regio 3-UTR dos genes-alvo, qualquer variao de sequncia presente

prximo aos stios de processamento de microRNA ou na sequncia seed do microRNA

maduro poderia alterar a biognese assim como suas funes e seus genes alvo, alterando o

perfil de expresso destes genes (Sun et al., 2009; Bruno et al., 2012). Essa modificao, por

sua vez, poderia afetar a suscetibilidade doena, como tem sido demonstrado para a doena

de Parkinson, asma, doena cardiovascular e vrios tipos de cncer, entre outros. Por essa

razo, foi reconhecido que mais ateno deveria ser dada aos polimorfismos nos genes

codificadores dos microRNAs (Mishra e Bertino, 2009; Bruno et al., 2012).

Porm, at o momento, apenas um estudo de caso-controle investigou a ocorrncia de

variantes genticas em genes de microRNAs em pacientes diabticos (Ciccacci et al., 2013).

Estes pesquisadores avaliaram 13 locos diferentes em 163 italianos com DM2 e 185

indivduos saudveis. Os dados mostraram que dois polimorfismos estavam associados com a

suscetibilidade ao DM2. O alelo G do polimorfismo rs895819 (A>G) no gene do miR-27a

estava associado reduo no risco, enquanto o alelo G do polimorfismo rs531564 (C>G) do

gene do miR-124a estava associado ao risco aumentado de DM2. No entanto, com relao

RD, nenhum estudo investigou a relao de polimorfismos nos genes codificadores dos

microRNAs com esta complicao.

11

2. JUSTIFICATIVA DE PESQUISA

Como descrito nas sees anteriores, o DM e suas complicaes crnicas

representam, atualmente, uma questo de sade pblica de grande impacto ao nvel mundial,

devido aos elevados custos e crescente prevalncia.Evidncias recentes e cada vez mais

numerosas mostram que os microRNAs podem exercer um papel essencial na patognese do

diabetes e suas complicaes crnicas por meio de sua capacidade de regular os nveis de

expresso dos genes que atuam na diferenciao, crescimento e proliferao celular, assim

como na apoptose. Apesar disso, at o momento, poucos estudos investigaram o perfil de

expresso de microRNAs na RD, sendo que todos foram realizados em modelos animais.

Alm disso, diversos investigadores avaliaram a possibilidade de utilizar a

mensurao plasmtica de microRNAs como biomarcadores de patologias especficas,

fornecendo uma alternativa anlise tecidual (obtida por mtodo invasivo) e servindo para

fins diagnsticos e/ou prognsticos. Outro aspecto importante a demonstrao de que

polimorfismos presentes prximos aos stios de processamento do microRNA ou na

sequncia seed do microRNA maduro podem alterar a biognese ou a sua funo, alterando

o perfil de expresso destes genes o que, por sua vez, poderia afetar a suscetibilidade

doena, como tem sido demonstrado para as doenas cardiovasculares e vrios tipos de

cncer, entre outros.

At o momento, nenhum estudo em humanos se props a avaliar os polimorfismos

nos genes codificadores de microRNAs e sua expresso na suscetibilidade RD. No presente

estudo, avaliaremos a ocorrncia de trs polimorfismos eo perfil de expresso de cinco

microRNAs plasmticos, em pacientes diabticos do tipo 2, com ou sem RD. Assim, os

resultados do presente estudo permitiro uma melhor compreenso dos mecanismos

regulatrios e do impacto dos microRNAs na patognese da RD, alm de possibilitar o

auxlio na identificao do paciente suscetvel a esta complicao e potencial proposio de

estratgias de tratamento especficas para o manejo da RD.

3. HIPTESES CONCEITUAIS

H1. O perfil de expresso de microRNAs plasmticos est alterado nos pacientes com

RD, particularmente naqueles com a forma proliferativa da doena, em relao aos pacientes

sem esta complicao, potencialmente servindo como biomarcadores no-invasivos para fins

diagnsticos e prognsticos.

12

H2. Os nveis de expresso dos microRNAs esto associados aos polimorfismos nos

genes que codificam estes microRNAs.

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo Geral

O presente estudo de caso-controle tem por finalidade avaliar a associao de trs

polimorfismos em genes codificadores de microRNAs e do perfil de expresso de cinco

microRNAs plasmticos com a RD em pacientes ambulatoriais com DM2.

4.2. Objetivos Especficos

Subprojeto 1

1. Determinar as frequncias gnicas e genotpicas de trs polimorfismos em genes

codificadores de microRNAs em pacientes ambulatoriais com DM2 e comparar com a

prevalncia destes polimorfismos em um grupo de indivduos da populao em geral, a saber:

rs531564 (miR-124a), rs4636297 (miR-126) e rs2910164 (miR-146a).

2. Avaliar a associao dos trs polimorfismos acima mencionados com a presena e a

gravidade da RD nos pacientes com DM2.

Subprojeto 2

3. Mensurar o nvel de expresso de cinco microRNAs no plasma de pacientes

ambulatoriais com DM2 e verificar se os nveis de expresso esto associados com a presena

e a gravidade da RD, a saber: miR-29b, miR-124a, miR-126, miR-146a e miR-200b.

4. Avaliar a relao dos polimorfismos rs531564 (miR-124a), rs4636297 (miR-126) e

rs2910164 (miR-146a) com os nveis plasmticos dos respectivos microRNAs nos pacientes

com DM2.

13

5. MATERIAIS E MTODOS

5.1. Populao de Estudo e Grupos Experimentais

Este estudo ser realizado na Universidade Luterana do Brasil (ULBRA) e no

Hospital de Clnicas de Porto Alegre (HCPA) com pacientes ambulatoriais com diagnstico

de DM2 e indivduos saudveis da populao em geral, arrolados entre os doadores de banco

de sangue.

Para contemplar os objetivos especficos do Subprojeto 1, sero elegveis para o

estudo os pacientes com DM2 atendidos nos ambulatrios dos Servios de Endocrinologia

dos seguintes hospitais: Hospital de Clnicas de Porto Alegre (HCPA), Grupo Hospitalar

Conceio (Porto Alegre/RS), Hospital So Vicente de Paulo (Passo Fundo/RS) e Fundao

Universitria de Rio Grande (Rio Grande/RS). Sero selecionados 800 indivduos a partir de

um banco de dados de aproximadamente 2500 pacientes com DM2, que so participantes de

um estudo multicntrico que teve incio em 2002 no Estado do Rio Grande do Sul. Este

estudo tem por objetivo investigar os fatores de risco genticos associados com a

predisposio ao DM e suas complicaes crnicas (Canani et al., 2005; Santos et al., 2005;

Santos et al., 2006; Errera et al., 2007; Crispim et al., 2010; Santos et al., 2011; Santos et al.,

2012).

Os pacientes com DM2 sero classificados em casos (n=400) ou controles (n=400), de

acordo com a presena ou ausncia de RD. Os controles devem ter, no mnimo, 10 anos de

DM para serem includos no estudo. Os pacientes avaliados neste estudo realizaram exames

clnicos, laboratoriais e uma entrevista (por meio de questionrio padronizado), para o

registro da histria clnica, incluindo o tabagismo, uso de medicamento e presena de

comorbidades. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento informado, cujo

protocolo foi aprovado pelos comits de tica de todas as instituies envolvidas e pelo

CONEP (processo n 25000.001632/2003-72, parecer 258/2003).

Alm disso, tambm sero includos neste estudo, 100 indivduos doadores de banco

de sangue do HCPA, sem histria pessoal ou familiar de DM, avaliados por meio de uma

entrevista com questionrio padronizado, que constituiro uma amostra que servir como

referncia da distribuio dos trs polimorfismos na populao em geral.

14

Para contemplar os objetivos especficos do Subprojeto 2, sero selecionados 100

pacientes sem RD (com pelo menos 10 anos de diabetes), 50 pacientes com RD no-

proliferativa e 50 pacientes com RD proliferativa, todos provenientes do ambulatrio do

Servio de Endocrinologia do HCPA. Os pacientes sero selecionados durante os turnos de

atendimento ambulatorial e atendero aos mesmos critrios de incluso dos pacientes

includos no Subprojeto 1. Aps a identificao dos pacientes que atenderem aos critrios de

incluso, ser aplicado o consentimento informado para aqueles que aceitarem participar do

estudo e ser coletada uma amostra de sangue (10 mL). A amostra ser processada e

armazenada para as anlises moleculares.

5.2. Diagnstico da Retinopatia Diabtica

A presena de RD avaliada por meio da fundoscopia direta aps dilatao pupilar, e

classificada,considerando o olho mais gravemente afetado,como: (1) ausente; (2) RD no-

proliferativa (microaneurismas, hemorragia, exsudatos duros); ou (3) RD proliferativa

(presena de neovasos e/ou tecido fibroso na cavidade vtrea) (Wilkinson et al., 2003).

5.3. Anlises Moleculares

5.3.1. Genotipagem (Extrao de DNA, PCR-RFLP e qPCR)

O DNA ser extrado de leuccitos do sangue perifrico por um mtodo de salting out

(Lahiri e Nurnberger Jr., 1991). A genotipagem ser realizada por meio da tcnica de PCR-

RFLP ou por PCR em tempo real. Para a genotipagem do polimorfismo rs2910164 (miR-

146a), as amostras de DNA sero amplificadas por PCR, utilizando-se primers e condies

de amplificao especficos para esta variante, como descrito por Rah et al. (2013). Aps a

confirmao da amplificao, os produtos de PCR sero submetidos digesto com a

endonuclease de restrio SacI, segundo as instrues do fabricante. Os produtos da digesto

sero separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%, corados com brometo de

etdeo e diretamente visualizados sob luz ultravioleta. Os polimorfismosrs531564 (miR-124a)

e rs4636297 (miR-126) sero identificados por meio de PCR em tempo real, utilizando-se

primers e sondas contidos em ensaios comerciais de discriminao allica especficos para

a genotipagem destas variantes (TaqMan, Life Technologies, Carlsbad, EUA).

15

5.3.2. Expresso Gnica (Extrao de RNA e qRT-PCR)

Para a extrao dos microRNAs do plasma ser utilizado o kit comercial miRvana

PARIS (Ambion), conforme as orientaes do fabricante. Na etapa inicial do protocolo sero

adicionados 50pM de um microRNA sinttico, proveniente do nematdeo Caenorhabditis

elegans (cel-miR-39) (Qiagen), que ser utilizado posteriormente como normalizador da

reaode transcrio reversa seguida pela reao em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-

PCR). A reao de converso dos microRNAs em cDNA ser feita utilizando-se o kit

TaqManmicroRNA Reverse Transcription (Life Technologies) com primers especficos

para cada microRNA. Para o PCR em tempo real ser utilizado o ensaio comercial TaqMan

microRNAassay (Life Technologies), que contm sondas especficas para cada microRNA a

ser estudado. Como no h um consenso na literatura sobre um microRNA que seja o

normalizador ideal para a anlise da expresso gnica de microRNAs no plasma, utilizaremos

o cel-miR-39 como controle endgeno da reao de qRT-PCR. O nvel relativo de expresso

ser calculado a partir da seguinte equao: expresso gnica relativa = 2 (Ct amostra

Ct controle).

5.4. Anlises Estatsticas

As comparaes entre os grupos de indivduos sero feitas por meio de testes

paramtricos e no-paramtricos no pacote estatstico SPSS (verso 18.0). As freqncias

allicas sero determinadas pela contagem direta dos alelos e o equilbrio de Hardy-Weinberg

ser verificado por meio do teste de qui-quadrado. As diferenas nas distribuies gnicas e

genotpicas entre os grupos de indivduos sero avaliadas por meio do teste de qui-quadrado

ou do teste exato de Fisher. As diferenas nos nveis de expresso entre os grupos de

pacientes sero comparadas pelo teste t de Student ou pelo teste de Mann-Whitney. A anlise

de regresso logstica ser realizada para avaliar a relao de cada varivel com a presena

e/ou a gravidade da RD, para controlar o efeito dos diversos fatores de confuso, bem como

para identificar possveis fatores de interao entre as variveis. Um valor de p < 0,05 ser

considerado como estatisticamente significativo.

16

5.6. Aspectos ticos

Para contemplar os objetivos especficos do Subprojeto 1, sero utilizadas as

informaes constantes do banco de dados e as amostras de DNA j coletadas no estudo

transversal multicntrico que teve incio em 2002. Foi explicado, durante a apresentao do

termo de consentimento informado aos pacientes, que as informaes clnicas e a coleta de

sangue para a extrao de DNA seriam utilizadas para a anlise clnica e gentica de novos

polimorfismos analisados pelo nosso grupo de pesquisa, desde que aprovados por uma

comisso de tica. Para executar o Subprojeto 2, o projeto de pesquisa ser submetido ao

Comit de tica em Pesquisa do HCPA e da ULBRA e somente ter incio aps a avaliao e

aprovao pelos mesmos.

17

6. CRONOGRAMA DO ESTUDO

Atividades Previstas 01/2014-

06/2014

07/2014-

12/2014

01/2015-

06/2015

07/2015-

12/2015

Seleo dos pacientes e dos doadores de banco de

sangue

X

Coleta de dados e/ou de amostras X

Genotipagem (extrao de DNA, PCR-RFLP e

PCR em tempo real)

X X X

Mensurao da expresso gnica (extrao de

RNA e qRT-PCR)

X X X X

Atualizao do banco de dados e anlise dos

dados

X X

Redao do(s) artigo(s) cientfico(s) X

Atividades Previstas Valor em R$

(% Total)

01/2014-

06/2014

07/2014-

12/2014

01/2015-

06/2015

07/2015-

12/2015

Seleo dos pacientes e dos doadores

de banco de sangue

0,00

-

0,00

Coleta de dados e/ou de amostras 0,00

0,00

Genotipagem (extrao de DNA,

PCR-RFLP e PCR em tempo real)

8.666,78

(19,7%)

2.566,78 4.300,00 1.800,00

Mensurao da expresso gnica

(extrao de RNA e qRT-PCR)

35.351,83

(80,3%)

18.809,73 6.616,84 6.616,84 3.308,42

Atualizao do banco de dados e

anlise dos dados

0,00

0,00 0,00

Redao do(s) artigo(s) cientfico(s) 0,00 0,00

Total 44.018,61

(100%)

21.736,51

(48,6%)

10.916,84

(24,8%)

8.416,84

(19,1%)

3.308,42

(7,5%)

18

7. ORAMENTO DETALHADO

Material de Consumo - Item Valor

Unitrio

(R$)

Quantidade Valor

Total

(R$)

rgo de

Fomento

Coleta de Material e Exames

Coleta de sangue 5,00 200 1.000,00 FIPE

Materiais Plsticos Diversos

Tubos cnicos para centrfuga (15

mL) (100 unidades)

32,19 2 64,38 FIPE

Ponteira azul sem filtro P1000 (1000

unidades)

54,52 1 54,52

FIPE

Ponteira amarela sem filtro P200

(1000 unidades)

48,50 20 970,00 FIPE

Ponteira sem filtro P10 (1000

unidades)

50,62 5 253,10 FIPE

Ponteira azul com filtro P1000 (1000

unidades)

216,62 5 1.083,10 FIPE

Ponteira amarela com filtro P200

(1000 unidades)

207,35 1 207,35 FIPE

Ponteira com filtro P100 (1000

unidades)

217,85 1 217,85 FIPE

Ponteira com filtro P10 (1000

unidades)

207,35 1 207,35 FIPE

Microtubos 2 mL (500 unidades) 47,00 2 94,00 FIPE

Microtubos 1,5 mL (500 unidades) 46,15 1 46,15 FIPE

Microtubos para PCR 0,6 mL (1000

unidades)

83,50 3 250,50 FIPE

Microtubos para PCR 0,2 mL (1000

unidades)

155,60 2 311,20 FIPE

19

Reagentes para Extrao de DNA

Tris-HCl (250g) 188,00 1 188,00 FIPE

Cloreto de potssio (500g) 33,57 1 33,57 FIPE

Cloreto de magnsio (500g) 59,99 1 59,99 FIPE

EDTA (500g) 595,10 1 595,00 FIPE

SDS (100g) 258,00 1 258,00 FIPE

Etanol absoluto (1L) 68,50 1 68,50 FIPE

Reagentes para PCR-RFLP

Oligonucleotdeos (bases) 1,70 48 81,60 FAPERGS

Mix de dNTPs (2 mM) (5 x 1mL) 549,25 1 549,25 FAPERGS

Taq DNA polimerase (500U) 240,19 3 720,57 FAPERGS

Enzima de restrio SacI (2000U) 405,12 3 1.215,36 FAPERGS

Reagentes para eletroforese

Agarose (500g) 234,25 1 234,25 ***

Acrilamida (500g) 102,27 1 102,27 ***

Bis-acrilamida (10g) 25,96 1 25,96 ***

TEMED (30 mL) 141,00 1 141,00 ***

Persulfato de amnio (100g) 502,00 1 502,00 ***

Tris (1 kg) 239,06 1 239,06 ***

cido brico (1 kg) 85,26 1 85,26 ***

EDTA (500g) 181,71 1 181,71 ***

GelRedcorante para gel (0,5 mL) 602,00 1 602,00 ***

Tampo de corrida (1 mL) 50,00 1 50,00 ***

Marcador de peso molecular 50 pb

(50 ug)

450,00 1 450,00 ***

20

Reagentes e plsticos para qPCR

Custom TaqMan SNP Genotyping

kit (1200 reaes)

1.800,00 2 3.600,00 FAPERGS

TaqMan Genotyping Master Mix

(4000 reaes)

2.500,00 1 2.500,00 FAPERGS

Tubos pticos em tiras de 8 unidades 421,00 5 2.105,00 ***

Tampas pticas em tiras de 8

unidades

407,50 2 815,00 ***

Reagentes para Extrao de RNA

Kit miRvana PARIS (Ambion) (20

reaes)

932,97 10 9.329,70 FAPERGS

RNA sinttico de C. elegans (cel-

miR-39)

550,10 1 550,10 ***

Reagentes para qRT-PCR

TaqMan microRNA RT kit (200

reaes)

910,98 6 5.465,88 FAPERGS

TaqMan Gene Expression Master

Mix (2000 reaes)

6.171,61 1 6.171,61 FAPERGS

TaqMan microRNA assay (50

reaes)

599,36 24 14.384,64 FAPERGS

Tubos e tampas pticas Material j computado no item anterior

Outros materiais

Luvas de ltex (caixa com 50 pares) 14,50 50 725,00 FIPE

Resumo do Oramento

Valor Total 56.852,78

Valor do Material J Adquirido 6.083,61

Valor Solicitado ao FIPE-HCPA 6.687,56

Valor Total Solicitado FAPERGS 44.018,61

21

FIPE-HCPA: Fundo de Incentivo Pesquisa e Eventos do Hospital de Clnicas de Porto

Alegre. O valor correspondente ser solicitado a este rgo de fomento (o FIPE-HCPA

concede at R$ 8.000,00 para os projetos que envolvem seres humanos).

FAPERGS: Valor solicitado neste edital.

***: Material j adquirido pelo grupo de pesquisa por ocasio do desenvolvimento de outros

projetos de pesquisa.

22

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Abhary S, Hewitt AW, Burdon KP, Craig JE. A systematic meta-analysis of genetic

association studies for diabetic retinopathy. Diabetes (2009) 58: 2137-2147.

Agardh E, Agardh CD. Diabetic retinopathy. In: De Fronzo RA, Ferrannini E, Keen H e

Zimmet P (eds) International Textbook of Diabetes Mellitus (2004) 3 ed. John Wiley &

Sons, West Sussex, p. 1187-1206.

American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes

Care (2013) 36: S67-S74.

Antonetti DA, Klein R, Gardner TW. Diabetic retinopathy. New England Journal of

Medicine (2012) 366: 1227-1239.

Baer C, Claus R, Plass C. Genome-wide epigenetic regulation of miRNAs in cancer. Cancer

Research (2013) 73: 473-477.

Bai Y, Bai X, Wang Z, Zhang X, Ruan C, Miao J. MicroRNA-126 inhibits ischemia-induced

retinal neovascularization via regulating angiogenic growth factors. Experimental and

Molecular Pathology (2011) 91: 471-477.

Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell (2009) 136: 215-

233.

Beuvink I, Kolb FA, Budach W, Garnier A, Lange J, Natt F, Dengler U, Hall J, Filipowicz

W, Weiler J. A novel microarray approach reveals new tissue-specific signatures of

known and predicted mammalian microRNAs. Nucleic Acids Research (2007)

35:e52.doi: 10.1093/nar/gkl1118.

Bruno AE, Li L, Kalabus JL, Pan Y, Yu A, Hu Z. miRdSNP: a database of disease-

associated SNPs and microRNA target sites on 3'UTRs of human genes.BMC Genomics

(2012) 13:44. doi: 10.1186/1471-2164-13-44.

Canani LH, Capp C, Ng DPK, Choo SGL, Maia AL, Nabinger GB, Santos K, Crispim D,

Roisenberg I, Krolewski AS, Gross JL. The fatty acid-binding protein-2 A54T

polymorphism is associated with renal disease in patients with type 2 diabetes. Diabetes

(2005) 54: 3326-3330.

Cheung N, Mitchell P, Wong TY. Diabetic retinopathy. Lancet (2010) 376: 124-136.

Chistiakov DA. Diabetic retinopathy: Pathogenic mechanisms and current treatments.

Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews (2011) 5: 165-172.

23

Ciccacci C, Di Fusco D, Cacciotti L, Morganti R, D'Amato C, Greco C, Rufini S, Novelli G,

Sangiuolo F, Spallone V, Borgiani P. MicroRNA genetic variations: association with

type 2 diabetes. Acta Diabetologica (2013) (no prelo)

Crispim D, Fagundes NJR, Santos KG, Rheinheimer J, Bouas AP, de Souza BM, Macedo

GS, Leiria LB, Gross JL, Canani LH. Polymorphisms of the UCP2 gene are associated

with proliferative diabetic retinopathy in patients with diabetes mellitus. Clinical

Endocrinology (2010) 72:612-619.

DeFronzo RA. Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. The Medical Clinics of North

America (2004) 88: 787-835.

Ding J, Wong TY. Current epidemiology of diabetic retinopathy and diabetic macular edema.

Current Diabetes Reports (2012) 12: 346-354.

Errera FIV, Canani LH, Silva MER, Yeh E, Takahashi W, Santos KG, Souto KEP, Tschiedel

B, Roisenberg I, Gross JL, Passos-Bueno MR. Functional vascular endothelial growth

factor 634G>C SNP is associated with proliferative diabetic retinopathy: a case-control

study in a Brazilian population of European ancestry. Diabetes Care (2007) 30: 275-279.

FengB, Chen S, McArthur K, Wu Y, Sen S, Ding Q, Feldman RD, Chakrabarti S. miR-146a-

mediated extracellular matrix protein production in chronic diabetes complications.

Diabetes (2011) 60: 2975-2984.

Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional

regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nature Reviews Genetics (2008) 9:

102-114.

Forbes JM, Cooper ME. Mechanisms of diabetic complications. Physiology Reviews (2013)

93:137-188.

Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research

(2010) 107: 1058-1070.

Guay C, Regazzi R. Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.

Nature Reviews Endocrinology (2013) doi: 10.1038/nrendo.2013.86.

Kantharidis P, Wang B, Carew RM, Lan HY. Diabetes complications: the microRNA

perspective. Diabetes (2011) 60: 1832-1837.

Kawasaki R, Cheung N, Islam FM, Klein R, Klein BE, Cotch MF, Sharrett AR, O'Leary D,

Wong TY, for the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Is diabetic retinopathy related

to subclinical cardiovascular disease? Ophthalmology (2011) 118: 860-865.

24

Kim VN. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nature Reviews

Molecular Cell Biology (2005) 6: 376-385.

Kollias AN, Ulbig MW. Diabetic retinopathy: early diagnosis and effective treatment.

Deutsches rzteblatt International (2010) 107: 75-84.

Kovacs B, Lumayag S, Cowan C, Xu S. MicroRNAs in early diabetic retinopathy in

streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science

(2011) 52:4402-4409.

Kramer CK, Rodrigues TC, Canani LH, Gross JL, Azevedo MJ. Diabetic retinopathy predicts

all-cause mortality and cardiovascular events in both type 1 and 2 diabetes: meta-analysis

of observational studies. Diabetes Care (2011) 34: 1238-1244.

Lahiri DK, Nurnberger JI. A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA

from blood for RFLPs studies. Nucleic Acids Research (1991) 19: 5444.

Liew G, Klein R, Wong TW. The role of genetics in susceptibility to diabetic retinopathy.

International Ophthalmology Clinics (2009) 49: 35-52.

Lorenzen J, Kumarswamy R, Dangwal S, Thum T. MicroRNAs in diabetes and diabetes-

associated complications. RNA Biology (2012)9:820-827.

McArthur K, Feng B, Wu Y, Chen S, Chakrabarti S. MicroRNA-200b regulates vascular

endothelial growth factor-mediated alterations in diabetic retinopathy. Diabetes (2011)

60: 1314-1323.

Mishra PJ, Bertino JR. MicroRNA polymorphisms: the future of pharmacogenomics,

molecular epidemiology and individualized medicine. Pharmacogenomics (2009) 10:

399-416.

Murea M, Ma L, Freedman BI. Genetic and environmental factors associated with type 2

diabetes and diabetic vascular complications. The Review of Diabetic Studies (2012) 9:

6-22.

Murray AR, Chen Q, Takahashi Y, Zhou KK, Park K, Ma J-X. MicroRNA-200b

downregulates oxidation resistance 1 (Oxr1) expression in the retina of type 1 diabetes

model. Investigative Ophthalmology & Visual Science (2013) 54: 1689-1697.

Natarajan R, Putta S, Kato M. MicroRNAs and diabetic complications. Journal of

Cardiovascular Translational Research (2012) 5: 413-422.

Ng DPK. Human genetics of diabetic retinopathy: current perspectives. Journal of

Ophthalmology (2010) doi:10.1155/2010/172593.

25

Ola MS, Nawaz MI, Siddiquei MM, Al-Amro S, El-Asrar AMA. Recent advances in

understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic retinopathy.

Journal of Diabetes and Its Complications (2012) 26: 56-64.

Oliveira JEP. Conceito, classificao e diagnstico do diabetes mellitus. In: Oliveira JEP e

Milech A. (eds) Diabetes Mellitus: Clnica, Diagnstico, Tratamento Multidisciplinar

(2004) 1 ed. Atheneu, So Paulo, p. 7-18.

Rah H, Jeon YJ, Shim SH, Cha SH, Choi DH, Kwon H, Kim JH, Shin JE, Kim NK.

Association of miR-146aC>G, miR-196a2T>C, and miR-499A>G polymorphisms with

risk of premature ovarian failure in Korean women. Reproductive Sciences (2013) 20:

60-68.

Roy S, Trudeau K, Roy S, Behl Y, Dhar S, Chronopoulos A. New insights into

hyperglycemia induced molecular changes in microvascular cells. Journal of Dental

Research (2010) 89:116-127.

Santos KG, Tschiedel B, Schneider JR, Souto KEP, Roisenberg I. Prevalence of retinopathy

in Caucasian type 2 diabetic patients from the South of Brazil and relationship with

clinical and metabolic factors. Brazilian Journal of Medical and Biological Research

(2005a) 38: 221-225.

Santos KG, Canani LH, Gross JL, Tschiedel B, Souto KEP, Roisenberg I. The 374 allele of

the receptor for advanced glycation end products gene is associated with a decreased risk

of ischemic heart disease in African-Brazilians with type 2 diabetes. Molecular Genetics

and Metabolism (2005b) 85: 149-156.

Santos KG, Canani LH, Gross JL, Tschiedel B, Souto KEP, Roisenberg I. The 106CC

genotype of the aldose reductase gene is associated with an increased risk of proliferative

diabetic retinopathy in Caucasian-Brazilians with type 2 diabetes. Molecular Genetics

and Metabolism (2006a) 88: 280-284.

Santos KG, Canani LH, Gross JL, Tschiedel B, Souto KEP, Roisenberg I. The catalase

262C/T promoter polymorphism and diabetic complications in Caucasians with type 2

diabetes. Disease Markers (2006b) 22: 355-359.

Santos KG, Crispim D, Canani LH, Ferrugem PT, Gross JL, Roisenberg I. Association of

eNOS gene polymorphisms with renal disease in Caucasians with type 2 diabetes.

Diabetes Research and Clinical Practice (2011) 91:353-362.

26

Santos KG, Crispim D, Canani LH, Ferrugem PT, Gross JL, Roisenberg I. Relationship of

endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene polymorphisms with diabetic retinopathy

in Caucasians with type 2 diabetes. Ophthalmic Genetics (2012) 33:23-27.

Scheffel RS, Bortolanza D, Weber CS, Costa LA, Canani LH, Santos KG, Crispim D,

Roisenberg I, Lisboa HR, Tres GS, Tschiedel B, Gross JL. Prevalncia de complicaes

micro e macrovasculares e de seus fatores de risco em pacientes com diabetes melito do

tipo 2 em atendimento ambulatorial. Revista da Associao Mdica Brasileira (2004) 50:

263-267.

Shantikumar S, Caporali A, Emanueli C. Role of microRNAs in diabetes and its

cardiovascular complications. Cardiovascular Research (2012) 93: 583-593.

Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. Global estimates of the prevalence of diabetesfor 2010 and

2030. Diabetes Research and Clinical Practice (2010) 87: 4-14.

Silva VA, Polesskaya A, Sousa TA, Corra VM, Andr ND, Reis RI, Kettelhut IC, Harel-

Bellan A, de Lucca FL. Expression and cellular localization of microRNA-29b and

RAX, an activator of the RNA-dependent protein kinase (PKR), in the retina of

streptozotocin-induced diabetic rats. Molecular Vision (2011) 17: 2228-2240.

Sivaprasad S, Gupta B, Crosby-Nwaobi R, Evans J. Prevalence of diabetic retinopathy in

various ethnic groups: a worldwide perspective. Survey of Ophthalmology (2012) 57: 347-

370.

Srivastava K, Srivastava A. Comprehensive review of genetic association studies and meta-

analyses on miRNA polymorphisms and cancer risk. PLoS One (2012) 7:e50966.doi:

10.1371/journal.pone.0050966.

Sun G, Yan J, Noltner K, Feng J, Li H, Sarkis DA, Sommer SS, Rossi JJ. SNPs in human

miRNA genes affect biogenesis and function. RNA (2009) 15: 1640-1651.

Trisha Dunning AM. Brief overview of diabetes, the disease. In: Trisha Dunning AM (ed)

Diabetes Education: Art, Science and Evidence (2013) 1st ed. John Wiley & Sons, West

Sussex, p. 1-11.

Wilkinson CP, Ferris FL 3rd, Klein RE, Lee PP, Agardh CD, Davis M, Dills D, Kampik A,

Pararajasegaram R, Verdaguer JT; Global Diabetic Retinopathy Project Group.Global

Diabetic Retinopathy Project Group. Proposed international clinical diabetic retinopathy

and diabetic macular edema disease severity scales. Ophthalmology (2003) 110:1677-

1682.

27

Wu JH, Gao Y, Ren AJ, Zhao SH, Zhong M, Peng YJ, Shen W, Jing M, Liu L.

Altered microRNA expression profiles in retinas with diabetic retinopathy. Ophthalmic

Research (2012) 47: 195-201.

Zampetaki A, Kiechl S, Drozdov I, Willeit P, Mayr U, Prokopi M, Mayr A, Weger S,

Oberhollenzer F, Bonora E, Shah A, Willeit J, Mayr M. Plasma microRNA profiling

revealsloss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes. Circulation

Research (2010) 107: 810-817.

28

9. ADEQUAO E DESCRIO DA EQUIPE DE PESQUISA

Profa. Dra. Ktia Gonalves dos Santos: Bacharel em Cincias Biolgicas (1999) pela

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), tem mestrado (2001) e doutorado

(2005) em Gentica e Biologia Molecular pela UFRGS. Desde 2007 professora adjunta da

Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), onde atua como orientadora no Programa de Ps-

Graduao em Biologia Celular e Molecular Aplicada Sade (PPGBioSade). O

PPGBioSade foi aprovado em 2011 pela CAPES, resultando da fuso do PPG em Gentica

e Toxicologia Aplicada (PPGGTA) e do PPG em Diagnstico Gentico e Molecular

(PPGDGM). Atua tambm como professora colaboradora do Programa de Ps-Graduao em

Cincias da Sade: Cardiologia e Cincias Cardiovasculares da UFRGS, exercendo

atividades de pesquisa junto ao Grupo de Insuficincia Cardaca e Transplante do Hospital de

Clnicas de Porto Alegre (HCPA). Tem experincia na rea de Gentica, com nfase em

Gentica Humana e Mdica, atuando principalmente nos seguintes temas: insuficincia

cardaca, hipertrofia cardaca, microRNAs, diabetes mellitus, complicaes crnicas do

diabetes e polimorfismos genticos.

Prof. Dr. Lus Henrique Canani: Graduado em Medicina pela Universidade Federal do

Rio Grande do Sul (1989), mestrado em Medicina: Cincias Mdicas pela Universidade

Federal do Rio Grande do Sul (1996) e doutorado em Cincias Mdicas: Endocrinologia pela

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (1999). Ps-Doutorado na Joslin Diabetes Center

- Harvard University, Boston, EUA. Atualmente Professor Adjunto da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul. Coordenador substituto da Ps-Graduao em Cincias

Mdicas: Endocrinologia da UFRGS nos anos de 2009 e 2010. Coordenador eleito da Ps-

Graduao em Cincias Mdicas: Endocrinologia da UFRGS - 2011. Tem experincia na

rea de Medicina, com nfase em Endocrinologia, atuando principalmente nos seguintes

temas: diabetes melito, nefropatia diabtica, retinopatia diabtica e gentica. Pesquisador

CNPq 1C. ndice H = 19 em maro de 2013.

Profa. Dra. Daisy Crispim Moreira: Graduao em Cincias Biolgicas - nfase em

Gentica e Biologia Molecular, pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (1998).

Mestrado em Gentica e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul

(2000). Doutorado em Gentica e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio

Grande do Sul (2005). Ps-doutorado em Biologia Molecular e Celular pela Universit Libre

de Bruxelles, Bruxelas, Blgica (2006). Atualmente trabalha como Pesquisadora - Biloga II

29

contratada pelo Servio de Endocrinologia do Hospital de Clnicas de Porto Alegre, onde a

responsvel pelo desenvolvimento do novo Laboratrio de Biologia das Clulas-Beta

Humanas para isolamento de ilhotas pancreticas para pesquisa e transplante em pacientes

com diabetes mellitus tipo 1. Tambm Professora Permanente do Programa de Ps-

Graduao em Cincias Mdicas: Endocrinologia da Universidade Federal do Rio Grande do

Sul, desde Julho de 2007. Tem experincia na rea de Gentica e Biologia Molecular e

Celular, com nfase em Gentica Humana e Mdica, atuando principalmente nos seguintes

temas: Gentica do diabetes mellitus e de suas complicaes crnicas; Isolamento de ilhotas

pancreticas humanas para transplante em pacientes com diabetes mellitus tipo 1; e Biologia

celular das ilhotas pancreticas. Bolsista de Produtividade CNPq - Nvel 2.

Graduanda Naiana Slvia Soares Corra: Acadmica de Biomedicina da Universidade

Luterana do Brasil. bolsista de iniciao cientfica PROBIC/FAPERGS/ULBRA e

desenvolve atividades de pesquisa junto ao Laboratrio de Gentica Molecular Humana da

ULBRA, sob a orientao da Profa. Ktia Gonalves dos Santos. Tem experincia na rea de

Gentica Humana e Mdica, atuando principalmente nos temas: insuficincia cardaca,

metalloproteinases de matriz e polimorfismos genticos.

Graduando Renan Csar Sbruzzi: Acadmico de Biomedicina da Universidade Luterana

do Brasil, possui bolsa PROUNI. aluno de iniciao cientfica voluntrio no Laboratrio de

Gentica Molecular Humana da ULBRA, sob a orientao da Profa. Ktia Gonalves dos

Santos.

10. INFRA-ESTRUTURA E APOIO TCNICO DISPONVEL

Todos os recursos fsicos e laboratoriais necessrios para a execuo deste projeto de

pesquisa esto disponveis no Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular

Aplicada Sade da ULBRA e no Servio de Endocrinologia do HCPA. Alm disso, a

equipe de profissionais (professores e alunos de iniciao cientfica) possui experincia em

estudos genticos de associao, nas tcnicas previstas neste projeto e/ou na anlise de dados

epidemiolgicos envolvendo as complicaes crnicas do diabetes. Porm, para a realizao

deste projeto de pesquisa, necessrio um novo aporte de recursos financeiros para a

aquisio dos materiais de consumo a serem utilizados na avaliao dos polimorfismos e da

expresso gnica, conforme indicado no oramento detalhado (seo 7).

30

11. RESULTADOS ESPERADOS E CONTRIBUIES CIENTFICAS

Diversas evidncias recentes sugerem que os microRNAs podem representar uma

pea-chave na regulao das vias intracelulares envolvidas na fisiopatologia do diabetes e

suas complicaes crnicas. Porm, at o momento, poucos estudos investigaram os nveis de

expresso de microRNAs como marcadores de progresso para a RD, sendo que todos os

estudos foram conduzidos em modelos animais. Alm disso, a avaliao de polimorfismos

em genes codificadores de microRNAs como marcadores da ocorrncia ou da gravidade da

RD ainda indita. Por isso, no presente estudo pretendemos avaliar a associao de

diferentes microRNAs polimorfismos e nveis de expresso com a presena e a gravidade

da RD. Assim, os resultados do presente estudo permitiro uma melhor compreenso dos

mecanismos regulatrios e do impacto dos microRNAs na patognese da RD, alm de

possibilitar o auxlio na identificao do paciente suscetvel a esta complicao e potencial

proposio de estratgias de tratamento especficas para o manejo da RD.

Alm do conhecimento cientfico e do melhor entendimento dos marcadores

biolgicos que esto associados ao desenvolvimento e agravamento da RD, as contribuies

cientficas desta proposta de pesquisa envolvem a: (1) formao de capital humano, com a

participao direta de alunos de doutorado, mestrado e iniciao cientfica; (2) a possibilidade

de expanso da equipe do laboratrio, uma vez que o volume de trabalho e o aporte de

recursos financeiros permitiro o acesso e o envolvimento de novos alunos neste projeto; e,

(3) o fortalecimento da colaborao j estabelecida entre os pesquisadores das duas

instituies executoras deste projeto de pesquisa (Laboratrio de Gentica Molecular

Humana do PPG em Biologia Celular e Molecular Aplicada Sade da ULBRA e

Laboratrio de Biologia Molecular do Servio de Endocrinologia do HCPA).

A expectativa inicial dos investigadores de que os resultados obtidos com a

realizao deste projeto de pesquisa permitam a publicao de artigo(s)original(is) em

peridicos cientficos com maior fator de impacto (Qualis A1 ou A2). Alm disso, os

resultados parciais obtidos ao longo do desenvolvimento do projeto sero apresentados em

eventos cientficos.