PROPAGAÇÃO IN VITRO DE Himatanthus sucuuba WOOD., UMA … · 2017-08-14 · vitro em diluição do meio de cultura MS/4 mostrou maior da taxa de explantes obtidos em curto espaço

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS ESCOLA SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS DA AMAZÔNIA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE Himatanthus sucuuba WOOD.,

UMA ESPÉCIE MEDICINAL DA AMAZÔNIA

KATIANE PEREIRA DE SOUZA

MANAUS 2017

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KATIANE PEREIRA DE SOUZA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE Himatanthus sucuuba WOOD.,

UMA ESPÉCIE MEDICINAL DA AMAZÔNIA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia da Universidade do Estado do Amazonas, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia.

Orientador: Prof. Dr. Paulo de Tarso Barbosa Sampaio

MANAUS 2017

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iv

Dedicatória.

Dedico este trabalho aos meus pais, Natalino Moraes de Souza e Francisca Lucilene

Pereira de Souza que através dos seus exemplos de educadores, me despertaram a

importância da educação intelectual e moral, como base angular no progresso da

humanidade.

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“Epígrafe”.

“As almas, no fundo, são semelhantes às plantas no campo imenso da vida. Repara, desse modo, o que produzes”.

Emmanuel

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus e ao nosso Senhor Jesus, pela sua infinita misericórdia a nos

conceder a oportunidade necessária de progresso.

A minha família, pela base moral que direciona o meu caminhar.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais da

Amazônia da UEA, pela oportunidade do desenvolvimento profissional no Ensino

Superior.

O CNPq e FAPEAM pelo auxílio financeiro, que além de proporcionar

recursos para moradia, transporte e alimentação, foi responsável pela aquisição de

reagentes utilizados neste trabalho.

Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo de Tarso de Barbosa Sampaio, pela

oportunidade e confiança em desempenhar o ensino e pesquisa.

A Dra. Angela Imakawa, pela constante companhia e auxílio nas atividades de

laboratório e principalmente nos momentos de dificuldades pessoais.

Aos professores Fábio Bassini e Maria da Glória Gonçalves de Melo pela

oportunidade da experiência de docência e pela cooperação nas atividades de

obtenção e identificação do material vegetal deste trabalho.

A Fundação Allan Kardec pelo amparo no meu equilíbrio psico-espiritual

durante esta jornada.

A todos os amigos e familiares que direta e indiretamente apoiaram e

cooperaram na realização deste trabalho.

Minha eterna gratidão!

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RESUMO

As técnicas de propagação vegetativa, dentre elas a micropropagação, são alternativas de superação de dificuldades na propagação de espécies nativas, auxiliando em atividades de fim comercial e no resgate e conservação de recursos genéticos florestais. O princípio da técnica usada na propagação in vitro é baseada na multiproliferação e crescimento de gemas axilares, que normalmente permaneceriam dormentes na presença da gema terminal, devido à dominância apical. Há importância prática dessas técnicas para o setor agrícola e florestal, através da recuperação de espécies livres de doenças; na propagação comercial de plantas; no melhoramento genético; no manejo, no intercâmbio e na conservação de germoplasma, além de outras aplicações com pesquisas em fisiologia vegetal e produção industrial in vitro de metabólitos secundários. A Himatanthus sucuuba, conhecida como sucuuba verdadeira, se distribui predominantemente na bacia amazônica, sendo bastante utilizada na medicina popular, também como ornamental e na construção civil de pequeno porte, com destaque para fins fitoterápicos, onde estudos farmacológicos demonstraram atividade antimicrobiana, antiinflamatória e analgésica. Todas as fases deste estudo foram desenvolvidas como teste experimental, realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Escola Superior de Tecnologia- UEA. O presente estudo objetivou elaborar metodologia para obtenção de protocolo na propagação in vitro da espécie medicinal Himatanthus sucuuba via sementes, como fonte de explantes para rápida regeneração desta planta medicinal podendo, assim, contribuir em novas pesquisas em conservação e uso sustentável dos recursos genéticos vegetais da Amazônia brasileira. A assepsia de explantes com o uso do hipoclorito de sódio na concentração de 0,10% se mostrou eficiente, promovendo a desinfestação de sementes de H. sucuuba de uma forma rápida e de baixo custo. A germinação in vitro em diluição do meio de cultura MS/4 mostrou maior da taxa de explantes obtidos em curto espaço de tempo, garantindo a efetividade do uso de sementes como explante no cultivo in vitro desta espécie. A multiplicação de explantes de H. sucuuba é dependente de fitorreguladores, sendo a citocinina BAP em baixas concentrações a mais indicada. Explantes em diferentes posições da gema e a citocinina presente no meio MS basal mostrou que a posição 1 correspondente a gema apical de H. sucuuba é a mais adequada para multiplicação in vitro. Os explantes do tipo segmento nodal desenvolvem-se melhor em meio de cultura MS na concentração original. Os resultados obtidos com os experimentos das auxinas não foram eficientes para o enraizamento in vitro de H. sucuuba. Contudo, apontam a necessidade de novos estudos quanto ao tipo e concentração das auxinas relacionadas ao enraizamento in vitro desta espécie, a fim de permitir a sua inserção em fases de aclimatização em sistema ex vitro. Os resultados obtidos neste trabalho tende a corroborar com a otimização da metodologia para novas pesquisas desta espécie florestal com atividade medicinal comprovada. Palavras-chave: Biotecnologia Vegetal. Propagação in vitro. Planta medicinal. Apocynaceae. Himatanthus sucuuba.

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ABSTRACT

The techniques of vegetative plant propagation, among them the micropropagation, are alternatives to overcome difficulties in the propagation of native species, giving assistance to commercial activities and to the rescue and conservation of forest genetic resources. The principle of the technique used in vitro propagation is based on the multiproliferation and growth of axillary buds, which would normally remain dormant in the presence of terminal bud due to the apical dominance. There is practical importance of these techniques for the agricultural and forestry sector, through the recovery of disease-free species; in the commercial propagation of plants; in genetic improvement; in management, interchange and conservation of germplam, as well as other uses like research in plant physiology and in vitro industrial production of secondary metabolites. Himatanthus sucuuba, known as true sucuuba, is predominantly distributed in the Amazonian basin, being widely used in folk medicine, also used as ornamental plant and in small-scale civil construction, with emphasis on phytotherapeutic purposes, where pharmacological studies demonstrated antimicrobial, anti-inflammatory and analgesic activity. All the phases of this study were developed as an experimental test, carried out at the Plant Tissue Culture Laboratory of the Superior School of Technology - UEA. The present study aimed to elaborate a methodology to obtain a protocol for in vitro propagation of the medicinal species Himatanthus sucuuba by seeds as a source of explants for the rapid regeneration of this medicinal plant, thus contributing to new research on the conservation and sustainable use of plant genetic resources of the Brazilian Amazon. Asepsis of explants using 0.10% of sodium hypochlorite was efficient, promoting the disinfestation of H. sucuuba seeds in a fast and low cost way. The in vitro germination in dilution of the MS/4 culture medium showed a higher rate of explants obtained in a short period of time, guaranteeing the effectiveness of the use of seeds as an explant in the in vitro culture of this species. The multiplication of H. sucuuba explants is dependent on phytoregulators, with the cytokinin BAP at low concentrations being the most indicated. Explants at different positions of the bud and the presence of cytokinin in the basal MS medium showed that the position 1 corresponding to the apical bud of H. sucuuba is the most suitable for multiplication in vitro. Nodal segment explants developed best in MS culture medium at the original concentration. The results with the auxin experiments were not efficient for the in vitro rooting of H. sucuuba. However, these results point out the need for further studies on the type and concentration of auxins related to the in vitro rooting of this species, in order to allow their insertion into acclimatization phases in an ex vitro system. The results from this work tend to corroborate to the optimization of the methodology for future researches of this forest species with proven medicinal activity. Key words: Plant Biotechnology. In vitro propagation. Medicinal plant. Apocynaceae. Himatanthus sucuuba.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação taxonômica da planta Himatanthus sucuuba ...................... 14

Tabela 2. Reclassificação por sinonímia daHimatanthus sucuuba ........................... 15

Tabela 3. Composição dos meios basais MS de Murashige & Skoog (1962), B5 de

Gamborg et al. (1968) e WPM de Lloyd & McCown (1980)....................................... 25

Tabela 4. Efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de sódio na

desinfestação de sementes de H. sucuuba. Manaus-AM, 2016................................ 33

Tabela 5. Taxa de germinação de sementes de H. sucuuba sob os meios basais MS

e WPM e suas diluições pela metade e quarta parte. Manaus-AM, 2016. ................ 35

Tabela 6.Efeitos de diferentes concentrações e tipos de citocininas no

desenvolvimento in vitro de explantes de H. sucuuba. Manaus-AM, 2016. .............. 38

Tabela 7. Efeito das diferentes posições da gema no desenvolvimento in vitro de

explantes de H. sucuuba. Manaus – AM, 2016. ........................................................ 40

Tabela 8: Efeito de diferentes diluições dos meios de cultura basais, MS, B5 e WPM

e suas diluições pela metade e pela quarta parte, no desenvolvimento in vitro de

explantes H. sucuuba. Manaus-AM, 2016. ................................................................ 42

Tabela9. Efeitos de diferentes concentrações e tipos de citocininas no

desenvolvimento in vitro de explantes de H. sucuuba. Manaus-AM, 2016. .............. 45

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Aspectos morfológicos da H. sucuuba. ................................................ 16,17

Figura 2. Sementes de H. sucuuba .......................................................................... 18

Figura 3. Estruturas químicas dos iridóides (A)plumericina e (B) isoplumericina

isolados de H. sucuuba ............................................................................................. 20

Figura 4. Estruturas químicas dos triterpenos (A)cinamato de lupeol, (B)cinamato de

α-amirina e (C)acetato de lupeol ............................................................................... 20

Figura 5. Etapas da micropropagação ...................................................................... 22

Figura 6. Sementes de H. sucuuba cultivadas em tubos de ensaios com meio MS

basal, suplementado com sacarose e ágar. .............................................................. 33

Figura 7. Germinação de sementes em meio MS/4 (A) com 16 dias e (B) Plântulas

de H. sucuuba in vitro 30 dias após germinação ....................................................... 35

Figura 8. Plântulas de H. sucuuba: (A)obtidas na [ ] de 0,1mg/L de BAP e

(B)obtenção de calos na [ ] de 5,0mg/L de TDZ ........................................................ 37

Figura 9. Localização das gemas nas plântulas obtidas in vitro de H. sucuuba ....... 39

Figura 10. Plântulas in vitro de H. sucuuba: (A) formação de raízes na [ ] de 3,0mg/L

e (B) na [ ] de 5,0mg/L de AIA ................................................................................... 44

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LISTA DE ABREVIATURAS

2,4-D: Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético

2ip: Isopenteniladenina

AIA: Ácido 3-Indol-acético

ANA: Ácido Naftalenoacético

ApCFA: Ácido p-clorofenoxiacético

B5: Meio de Cultura de Gamborg (1968)

BAP: 6-benzilaminopurina

IBA: Ácido 3-indol-butírico

KIN: 6-furfurilaminopurina ou cinetina

MS: Meio de Cultura de Murashige&Skoog (1962)

TDZ: Tidiazuron ou N-fenil-N´-1,2,3-tiadizol-5,1-uréia

WPM: Meio de cultura Woody Plant de lloyd&McCown (1980)

ZEA: Zeatina

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SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 12 2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................... 14 2.1. Descrição da Espécie .................................................................................... 14 2.1.2 Classificação taxonômica da Himatanthus sucuuba ................................... 14 2.1.3 Família ......................................................................................................... 14 2.1.4 Gênero Himatanthus ................................................................................... 15 2.1.5 Aspectos Morfológicos da Himatanthus sucuuba ........................................ 16 2.1.6 Distribuição .................................................................................................. 17 2.1.7 Fenologia ..................................................................................................... 17 2.1.8 Uso e Comercialização................................................................................ 18 2.1.9 Princípios Ativos e Atividade Biológica ........................................................ 19 2.2. Propagação in vitro ....................................................................................... 21 2.3. Meio Nutritivo ................................................................................................ 24 2.4. Reguladores de Crescimento ........................................................................ 26 3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 27 3.1. Objetivo Geral ............................................................................................... 27 3.2. Objetivos Específicos .................................................................................... 27 4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 28 4.1. Obtenção das sementes de Himatanthus sucuuba ....................................... 28 4.2. Desinfestação das sementes in vitro de H. sucuuba ..................................... 28 4.3. Diluição dos meios basais na taxa de germinação das sementes ................ 29 4.4. Efeito de diferentes concentrações e tipos de citocininas ............................. 29 4.5. Efeito posição gema na haste sobre nº médio e altura média brotações ...... 29 4.6. Diluição dos meios basais no nº médio e na altura média das brotações ..... 29 4.7. Efeito de diferentes concentrações e tipos de auxinas ................................. 30 4.8. Coleta de Dados e Análise Estatística .......................................................... 30 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 31 5.1. Desinfestação de sementes in vitro de Himatanthus sucuuba ...................... 31 5.2. Diluição dos meios basais na taxa de germinação das sementes ................ 33 5.3. Efeito de diferentes concentrações e tipos de citocininas ............................. 36 5.4. Efeito posição gema na haste sobre nº médio e altura média brotações ...... 39 5.5. Diluição dos meios basais no nº médio e na altura média das brotações ..... 40 5.6. Efeito de diferentes concentrações e tipos de auxinas ................................. 42 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 47 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 48

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1. INTRODUÇÃO

A Floresta Amazônica constitui um verdadeiro banco de informações genéticas,

químicas e ecológicas, representando cada vez mais uma promissora fonte de exploração

econômica para as indústrias de alta tecnologia, farmacêutica, de defensivos agrícolas,

dentre outras (ALBAGLI, 2001).

Uma das preocupações com a perda de biodiversidade em áreas da Amazônia é

que pelo menos parte da diversidade perdida tem potencial econômico comprovado,

havendo a necessidade da formação de bancos de germoplasma “in situ” (na natureza) e

“ex situ” (em estações experimentais e geladeiras), promovendo assim, o uso sustentável

desse potencial e a promoção da conservação da biodiversidade amazônica (CLAY,

2000).

A Região Amazônica vem ao longo das décadas sendo degradada, principalmente

pela atividade agrícola e pela exploração madeireira, onde esse impacto ambiental resulta

do desmatamento desordenado e das queimadas, como prática de preparo da terra para

agricultura e pecuária (PAIVA, 1998).

No que se refere ao uso sustentável de plantas medicinais, a adoção de técnicas

biotecnológicas é de extrema importância, visto que estas são capazes de multiplicar e

conservar plantas em laboratórios, de modo que se torna desnecessário o uso de grandes

áreas de solo para conservar a variabilidade genética de uma espécie vegetal (SERAFINI

et al., 2001). Uma estratégia importante de conservação in vitro é o estabelecimento de

bancos de germoplasma, onde os propágulos são cultivados em meio de cultura estéril e

multiplicados (TORRES et al., 1998), técnica esta que recebe o nome de

micropropagação.

O extrativismo praticado de maneira indiscriminada das populações de plantas

medicinais no Brasil promove a erosão genética, além de contribuir para a destruição do

seu habitat, o que indica a necessidade da obtenção de mudas para o cultivo comercial e

para programas de melhoramento genético, por meio da biotecnologia vegetal

(BENEDITO et al., 2012).

As técnicas de cultura de tecidos vegetais são bastante aplicadas em pesquisas

com plantas medicinais, com ênfase na micropropagação, cujos protocolos permitem o

estabelecimento de padrões de multiplicação em grande escala de várias espécies

(MORAIS et al., 2012).

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A propagação in vitro ou micropropagação visa à alta produção de mudas em curto

espaço de tempo e área física reduzida, quando comparada às técnicas de produção de

mudas convencionais, com eficiente fitossanidade das mudas, garantindo um material

vegetal de qualidade superior ao obtido pelos métodos tradicionais (ROCHA, 2009;

JUNGHANS e SOUZA, 2013), representando uma alternativa para a propagação

comercial de espécies de interesse econômico, entre as quais estão as medicinais com

valor farmacológico reconhecido (LIMA et al., 2007).

O sucesso de um protocolo de micropropagação depende de vários fatores: como

o estado fisiológico da planta matriz, a coleta de explantes, a esterilização dos meios de

cultura, as condições de incubação, a manipulação de subculturas (GONZÁLES et al.,

2004), o uso de reguladores de crescimento, o meio de cultura, dentre outros. No entanto,

a propagação in vitro ainda carece do desenvolvimento de protocolos de

micropropagação de espécies florestais brasileiras, dentre elas as medicinais (OLIVEIRA

et al., 2013).

Após a multiplicação da espécie medicinal de interesse, pode-se proceder à etapa

de enraizamento in vitro para posterior aclimatização e comercialização das mudas

produzidas (MORAIS et al., 2012).

Neste contexto, as aplicações biotecnológicas na área agrícola e na silvicultura de

espécies florestais com potencial medicinal têm destaque garantido, onde a cultura de

células e tecidos vegetais por meio da micropropagação, permite resolver ou minimizar os

desafios na multiplicação sistematizada de plantas elites, a formação de bancos de

germoplasma in vitro para fins comerciais e conservacionistas, além de ser empregada na

produção de metabólitos secundários com relevância terapêutica (TORRES e CALDAS,

1998; MORAIS et al., 2012).

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2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1.Descrição da Espécie

2.1.2 Classificação Taxonômica da H. sucuuba

Conforme o sistema de classificação de Cronquist de 1981, segue o

enquadramento taxonômico da sucuuba na Tabela 1.

Tabela 1 – Classificação taxonômica da planta Himatanthus sucuuba

Taxonomia

Reino Plantae

Classe Dicotyledonae

Subclasse Asteridae

Ordem Gentianales

Família Apocynaceae

Espécie Himatanthus sucuuba

2.1.3 Família

A família Apocynaceae descrita por Antoine Laurent (DI STASI e HIRUMA-LIMA,

2002), pode ser considerada uma das mais importantes fontes de constituintes químicos

utilizados na medicina moderna (JUDD et al., 2009), possuindo cerca de 400 gêneros e

3700 espécies, sendo que no Brasil ocorrem 95 gêneros e 850 espécies (CAMPOS e

FARINACCIO, 2011), dentre estas espécies arbustivas, herbáceas, arbóreas, muitas das

quais trepadeiras e suculentas (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002).

É considerada uma família amplamente distribuída em regiões tropicais e

subtropicais, com poucos gêneros atingindo as regiões temperadas (CAMPOS e

FARINACCIO, 2011).

Muitas espécies desta família apresentam grande importância econômica, como

fornecedoras de madeira e de alimentação sendo que algumas são utilizadas com

finalidades medicinais (JUDD, 2009). É objeto de estudos químicos, botânicos e

farmacêuticos, devido à sua etnofarmacologia no tratamento de diversas doenças, com a

presença de algumas classes químicas importantes como os alcalóides, glicosídeos

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cardiotônicos e iridóides (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002), sendo considerada uma das

famílias com maior representatividade dentro das Angiospermas (PAZ et. al., 2013).

2.1.4 Gênero Himatanthus

Um gênero pertencente à família Apocynaceae de grande relevância química e

farmacológica é o gênero Himatanthus, descrito por Carl Willdenov e Josef Schultes (DI

STASI; HIRUMA-LIMA, 2002).

Este gênero se encontra exclusivamente na América do Sul (MARATTO et al.,

2002), possuindo cerca de 13 espécies, entre as quais, várias destas descritas

inicialmente por Mueller Argoviensis foram reclassificadas por sinonímia por Woodson

(OLIVEIRA, 2013), conforme apresenta a Tabela 2.

Tabela 2 – Reclassificação por sinonímia da Himatanthus sucuuba

Sinonímia

Obovatus

Stenophyllus

drasticus (H. fallax),

lancifolius (H. fallax)

Fallax

Phagedaenicus

Himatanthus articulatus (H. sucuuba)

Speciosus

Sucuuba

bracteatus (H. speciosus)

Tarapotensis

Semilunatus

Attenuatus

O gênero Himatanthus é considerado monofilético, cujas espécies possuem poucas

diferenças morfológicas e moleculares, o que caracteriza uma provável origem recente.

Apesar de reduzidos, os caracteres morfológicos que permitem a diferenciação das

espécies utilizados no reconhecimento destas, têm sido a presença e tamanho do pecíolo,

a morfologia das folhas, padrão e quantidade de nervuras e a morfologia do gineceu

(CAMPOS e FARINACCIO, 2011).

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Devido apresentar características morfológicas semelhantes Mueller Argoviensis

classificou os gêneros Himatanthus e Plumeria como sinônimos. Posteriormente,

Woodson em 1938, em revisão ao trabalho de Mueller, confirmou a proposta de autoria de

Willdenow, que previa a separação destes gêneros. Após examinar todos os dados e

referências bibliográficas das espécies, Plumel em 1991, confirmou a separação dos

gêneros Himatanthus e Plumeria, fornecendo informações adicionais baseando-se na

pesquisa de abundante material botânico (SOUSA, 2009).

2.1.5 Aspectos morfológicos da H. sucuuba

A Himatanthus sucuuba (Spruce) Woodson, é uma árvore de grande porte,

conhecida popularmente como sucuuba, sucuba, janaguba agoniada e sucuuba-

verdadeira (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002; OLIVEIRA, 2013). Apresenta árvores

lactescentes (Fig.1-A), que podem atingir entre 8 a 20metros de altura, com troncos

vultuosos e casa gretada, folhas simples, alternas espiraladas, glabras coriáceas e de

margens inteiras (PLUMEL, 1991). Além disso, possui flores brancas em campânulas de

base amarela, os frutos são alongados verdes quando imaturos, e marrons escuros

quando maduros, são deiscentes e com numerosas sementes elipsóides secas, envoltas

por uma ala membranosa circular bem desenvolvida (LORENZI e MATOS, 2002).

A

B

C

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2.1.6 Distribuição

O gênero Himatanthus possui distribuição restrita, sendo nativo na América do Sul,

ocorrendo principalmente na Amazônia (SPINA, 2004).

A Himatanthus sucuuba apresenta distribuição geográfica no Brasil, nos estados de

Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Tocantins, Acre, Rondônia, Maranhão, Mato Grosso,

Goiás, Distrito Federal e Mato Grosso do Sul (SANTOS et al., 2013). No entanto, esta

espécie se distribui predominantemente na bacia amazônica, habitando significativamente

ambiente de terra firme (PLUMEL, 1991), e sujeita a períodos prolongados de saturação

de água no solo e ambientes alagados, ocorrendo em regiões de várzea baixa, onde se

desenvolve nos dois ambientes em áreas abertas de bordos das florestas, consistindo em

um mecanismo adaptativo (FERREIRA et al., 2005; 2006).

2.1.7 Fenologia

Conforme observações fenológicas, espécies deste gênero apresentam

florescência entre os meses de janeiro a maio e de agosto a novembro, e frutificam nos

meses de janeiro, março, agosto e novembro (CAMPOS e FARINACCIO, 2011).

A dispersão da Himatanthus sucuuba se dá por suas sementes aladas (Fig. 2)

levadas pelo vento, por anemocoria (PLUMEL, 1991), e também pela água, por

hidrocoria, onde a estrutura que reveste inteiramente as sementes protegendo-as, facilita

a sua dispersão (FERREIRA et al., 2005), servindo também de alimento para algumas

aves da região (RIOS et al., 2011).

Figura 1. Aspectos morfológicos da H. sucuuba: (A) planta adulta (B) Detalhe fruto imaturo e galho

(C) Detalhe da folha (D) Detalhe da flor (E) Detalhe fruto maduro e sementes. Fonte: Próprio autor.

D E

18

De acordo comas Regras para Análise de Sementes - RAS Brasil (2009), ainda não

há uma classificação de sementes desta espécie para fins de armazenamento, o que

dificulta aferir a viabilidade e maturidade fisiológica das sementes.

2.1.8 Uso e Comercialização

A Himatanthus sucuuba é bastante utilizada na medicina popular em diferentes

localidades na Amazônia, Peru e Colômbia, também como ornamental e na construção

civil de pequeno porte (SPINA, 2004).

Esta espécie nas últimas décadas tem despertado grande interesse na economia

regional, especialmente pelo seu valor fitoterápico atribuído ao seu látex (FERREIRA e

PIEDADE et al., 2006).

As partes da planta utilizadas na medicina popular são as folhas, a casca, a raiz e o

látex, para fins fitoterápicos no tratamento de gastrites, hemorróidas, anemia, dor nas

costas, pancadas, dor de dente, inflamações, feridas, vermes, artrites, tumores, úlceras,

gripe, herpes, leishmaniose, inflamação no útero, e diarréia (LORENZI e MATOS, 2002;

RAPINI et al., 2010; RODRIGUES et al. 2010), sendo as folhas empregadas na forma de

decocção e o látex extraído de forma artesanal empregado topicamente contra afecções

de pele (LARROSA e DUARTE, 2005).

Infusões feitas com a casca do caule têm sido empregadas no tratamento de

tumores, furúnculos, edemas, artrites, também como vermífugos e laxativos

(FERNANDES et al., 2000).

No Peru, a Himatanthus sucuuba é empregada no tratamento de Leishmaniose

cutânea (CASTILLO et. al, 2007).

A H. lancifolius, é empregada no tratamento de doenças da pele, asma, sífilis,

estimulante de contrações uterinas e para regulação menstrual. Assim como, o látex

Figura 2.Sementes de H. sucuuba. Fonte: próprio autor

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exsudado de H. articulatus é utilizado como antifúngico, antibacteriano e no tratamento de

úlceras, tumores, inflamações, sífilis, câncer e malária (OLIVEIRA, 2013). O látex da H.

drasticus apresenta uma longa história de emprego popular no tratamento do câncer no

nordeste do Brasil, porém, com pouco registro na literatura (SOUSA et al, 2010), cujo

após a extração, tem o látex diluído em água na proporção de 1:10, armazenado em

recipiente de vidro para ser comercializado na medicina popular nordestina (SOUSA,

2009).

Além do potencial medicinal, estudos têm observado a resistência e adaptabilidade

desta espécie às variações ambientais, com tolerância ao alagamento, alternando quanto

à duração da inundação, demonstrando uma resistência às condições de ambiente de

várzea (FERREIRA, 2006), característica esta que pode ser bem aproveitada em

programas de silvicultura na recuperação de áreas degradadas na Amazônia. No entanto,

a excessiva exploração tradicional com a retirada da casca e extração do látex desta

espécie na forma artesanal, tem comprometido sua prevalência, podendo levá-la à

extinção (REBOUÇAS et. al., 2012).

2.1.9 Princípios ativos e Atividade Biológica

Estudos farmacológicos demonstraram evidências no tratamento de feridas

externas, atividade antimicrobiana, antiinflamatória e analgésica, aumento da

permeabilidade capilar, citotóxica e cicatrizante, devido à presença de componentes

químicos importantes, como alcalóides, cumarinas, compostos fenólicos, flavonóides,

taninos, iridóides e triterpenóides (SANTOS et al., 2013). Os alcaloides indólicos

apresentam diversas atividades farmacológicas, entre elas antimicrobiana, antitumoral,

antiprotozoária e anti-inflamatória (BARATTO et. al., 2010), sendo os iridóides os

metabólitos mais isolados de Himatanthus (SOUSA et al., 2010).

Estudos realizados com a decocção da casca do caule da H. sucuuba sugerem

uma baixa toxicidade reprodutiva e teratogênica (GUERRA e PETERS et al., 1991). No

entanto, foi relatado popularmente que a H. sucuuba pode ser abortiva (RODRIGUES et

al, 2011).

Rebouças et al., (2012), evidenciou em isolados do látex metabólitos

correspondentes aos medicamentos anticancerígenos, destacando a presença dos

iridóides fulvoplumierina, plumericina e isoplumericina (Fig. 3) que correspondem a

atividade antifúngica, antibiótica e citotóxica, atividades estas que tem despertado mais o

interesse sobre esta espécie (OLIVEIRA, 2013).

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Figura 3. Estruturas químicas dos iridóides: (A) plumericina e (B) isoplumericina isolados de H. sucuuba. Fonte: Rebouças (2012).

Miranda et. al., (2000), obteve através da casca e do látex os triterpenos isolados,

cinamato de lupeol, cinamato de α-amirina, cinamato de β-amirina e acetato de lupeol

(Fig.4), que possuem atividades antiinflamatória e analgésica.

Figura 4. Estruturas químicas dos triterpenos: (A) cinamato de lupeol, (B) cinamato de α-amirina e (C) acetato de lupeol isolados de H. sucuuba. Fonte: Miranda et. al (2000).

21

Outro iridóide isolado e determinado do látex desta espécie foi o ácido 15-

desmetilisoplumierídeo (BARRETO et al., 2007).

Sua atividade antifúngica, observada para o fungo Cladosporium shaerospermum,

apresentou halo de inibição satisfatório, cuja porção bioativa, encontra-se nos iridóides,

plumericina e isoplumericina com atividade cinco vezes maior que a observada na droga

padrão, o antibiótico nistatina (PAZ et. al., 2013).

Soares et. al (2010), evidenciou ação inibidora do extrato obtido do látex da H.

sucuuba no tratamento da Leishmania amazonensis, que é o agente causador da

leishmaniose cutânea, demonstrando a redução de 74% da carga parasitária. Tal

evidência desencadeou a estudos quanto à antigenicidade de uma vacina contra a

leishmaniose (baseada na proteína recombinante de Leishmania braziliensis

peroxidoxina) durante a gravidez e possíveis resultados reprodutivos maternos e

anomalias fetais após imunização com uma vacina leishmaniana (SILVA et al., 2017).

Estudos empregando o látex da H. drasticus na atividade antineoplásica de

carcinoma de Ehrlich, evidenciaram uma redução significativa dos tumores com

percentual de 76,9% de inibição (SOUSA et al, 2010).

2.2. Propagação in vitro

A cultura de tecidos vegetais consiste em um conjunto de técnicas utilizadas para

cultivar in vitro células e tecidos vegetais em meio nutritivo de composição definida, sob

condições adequadas de assepsia, nutrição e fatores ambientais visando produzir uma

nova planta (RIBEIRO, 2010; CARVALHO et al., 2011), isso devido ao fenômeno

denominado de totipotência que equivale a capacidade de regenerar qualquer tecido

vegetal, onde qualquer célula no organismo vegetal contém toda a informação genética

necessária à regeneração de uma planta completa (TERMIGNONI, 2005; RIBEIRO e

BASTOS, 2008).

No Brasil, a cultura de tecidos vegetais, é uma realidade não apenas em laboratórios

acadêmicos de pesquisa e ensino em instituições públicas, senão também em empresas

do setor privado, de forma articulada comercialmente e relacionadas com cultivares de

importância econômica, como a cana-de-açúcar, flores, eucaliptos, pinheiros e bananeiras

(CID, 2010), principalmente com a implantação de Biofábricas visando à produção em

escala comercial (JUNGHANS e SOUZA, 2013).

22

A prática dessas técnicas para o setor agrícola e florestal é de fundamental

importância, permitindo a recuperação de espécies livres de doenças, a propagação

comercial de plantas, o melhoramento genético, o manejo, o intercâmbio e a conservação

de germoplasma, além de outras aplicações com pesquisas em fisiologia vegetal e

produção industrial in vitro de compostos secundários (JUNGHANS e SOUZA, 2013).

O princípio da técnica usada na propagação in vitro é baseada na multiproliferação

e crescimento de gemas axilares, que normalmente permaneceriam dormentes na

presença da gema terminal, devido a dominância apical (SILVA NETO et al., 2011).

Há o interesse que cultivares de importância agronômica sejam propagadas

assexuadamente, visto a padronização resultante em plantas uniformes quanto ao seu

fenótipo crescimento, floração, frutificação, e etc., o que do ponto de vista comercial, são

características desejáveis (CID et al., 2014).

A técnica da propagação in vitro, ou micropropagação (Fig. 5), permite a produção

massal em meio nutritivo de indivíduos com características genéticas desejáveis, com alto

padrão de sanidade das mudas (GEORGE, 1993), em ambiente asséptico e controlado

(PAIVA e GOMES, 2005), permitindo assim, fornecer ao produtor mudas de alto padrão

genético e fitossanitário em quantidades suficientes para suprir a necessidade do

mercado em curto espaço de tempo (TOMBOLATO e COSTA, 1998).

Figura 5.Etapas da técnica de micropropagação Fonte: Ribeiro (2010)

23

O uso da propagação in vitro para fins de regenerar uma espécie a partir de uma

planta matriz é conhecida como um dos processos importantes e revolucionários dentro

da biotecnologia vegetal, porém pouco ainda se conhece a respeito dos mecanismos

envolvidos nesse processo de regeneração (PERES, 2002).

Qualquer parte separada da planta destinada ao uso in vitro denomina-se explante

(CID et al., 2014).

A análise de alguns parâmetros, tais como o tipo de explante, a assepsia,

composição do meio nutritivo, o pH ajustado, tipo e concentração de reguladores de

crescimento, representam fatores determinantes no crescimento e no padrão de

desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultivo in vitro (CID et al., 2014; HARTMANN

et al., 2004).

Uma dificuldade comum no cultivo in vitro de espécies lenhosas é o escurecimento

dos explantes pela oxidação (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998), visto que o acúmulo

de polifenóis e produtos da oxidação modificam a composição do meio de cultura e

alteram a absorção de metabólitos, prejudicando o desenvolvimento da plântula

(ANDRADE et al., 2000).

No cultivo in vitro também a ocorrência de contaminações é mais frequente quando

se realiza a micropropagação de espécies lenhosas ou quando a assepsia é difícil de ser

executada devido às características do explante ou por este estar localizado em regiões

da planta matriz próximas do solo, portanto, mais exposto à ação de agentes endofíticos

(SUZIN, 2004).

Segundo Esposito-Polesi (2011), é impossível obter culturas totalmente assépticas,

visto que existe uma comunidade endofítica onipresente nas culturas e que na sua grande

maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e

aclimatização dos cultivos in vitro.

A desinfestação do explante é um passo inevitável no cultivo in vitro, sendo este

processo de assepsia superficial frequentemente realizado por meio de alvejantes

comerciais à base de cloro, tais como os hipocloritos (CID at al., 2014).

O uso de sementes no cultivo in vitro facilita a obtenção de material propagativo

asséptico através da germinação em condições artificiais para desenvolver um protocolo

de propagação de espécies lenhosas, possibilitando maior variabilidade genética nos

explantes obtidos in vitro (ANDRADE et al., 2000). Entre as principais vantagens do

cultivo in vitro a partir de sementes germinadas, é a velocidade de germinação quando

24

comparadas ao processo convencional e a possibilidade de gerar um grande número de

plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, além de servir como

doadoras de explantes visando à clonagem em larga escala, auxiliando na redução

extrativista e no abastecimento do mercado paisagístico e floricultor (JUNGHANS e

SOUZA, 2013).

Após a seleção e preparo das sementes, a escolha do meio de cultivo é

considerada uma etapa crucial para a eficiência do desenvolvimento das plântulas, uma

vez que a quantidade ideal de nutrientes unido ao balanceado osmótico adequado são

elementos que definição a germinação e as demais etapas subsequentes para o

estabelecimento das cultivares in vitro (PINHAL et al., 2011).

Nicoloso et. al., (2008), destaca que o pH pode influenciar no desenvolvimento do

explante, sendo que valores próximos a 6.0, ajustados antes da autoclavagem são

considerados ideais para a obtenção do cultivo in vitro.

Dessa forma, as técnicas de propagação vegetativa, dentre elas a micropropagação,

são alternativas de superação de dificuldades na propagação de espécies nativas,

auxiliando em atividades de fim comercial, além do resgate e conservação de recursos

genéticos florestais (DIAS et al., 2012).

2.3. Meio Nutritivo

Os meios nutritivos utilizados na propagação in vitro, quanto aos nutrientes,

baseiam-se nas exigências de crescimento e desenvolvimento das plantas, com algumas

modificações para atender às necessidades específicas das condições in vitro (SANTOS-

SEREJO et al., 2006; FICK, 2007).

Basicamente, os meios consistem em uma mistura balanceada de macronutrientes e

micronutrientes, carboidratos, fontes orgânicas de nitrogênio, vitaminas e reguladores de

crescimento importantes para o desenvolvimento da planta (SOUZA et al., 2006).

Os meios MS de MURASHIGE e SKOOG (1962), B5 de GAMBORG et al., (1968) e

WPM (WOODY PLANT MEDIUM) de LLOYD e McCOWN (1981), são utilizados na cultura

de tecidos da maioria das espécies, com algumas alterações na composição do meio de

cultura básico, como diluições para a otimização de protocolos de micropropagação

(GAMBORG et al., 1980). Entretanto, somente o meio MS e o WPM, correspondem a

espécies florestais, destacando-se este último, desenvolvido especialmente para espécies

lenhosas (CALDAS et al., 2008).

25

O meio MS é mais utilizado especialmente para morfogênese, cultura de meristemas

e regeneração de plantas e caracteriza-se pela elevada concentração em sais minerais

(QUISEN et al., 2008), conforme a representação da Tabela 3 para os demais meios

utilizados.

Tabela 3. Composição dos meios basais MS de Murashige&Skoog (1962), B5 de Gamborg et al. (1968) e WPM de Lloyd &McCown (1980).

Concentração dos Componentes para 1 Litro de Meio de Cultura

Componentes Meio MS Meio B5 Meio WPM

Macronutrientes (mg/L)

Ca (NO3)2.4H2O - - 556 NH4 NO3 1,650 - 400 (NH4)2 SO4 - 134 - KNO3 1,900 2,500 2,500 CaCl2.H2O 440 150 96 MgSO4.7H2O 370 250 300

KH2PO4 170 - 170 KCl - - - Na2SO4 - - - NaH2PO4.H2O - 150 - K2SO4.4H2O - - 990

Micronutrientes (mg/L)

MaSO4.4H2O 22,3 - - MnSO4.H2O - 10 22,3 ZnSO4.7.H2O 8,6 2,0 8,6 H3BO3 6,2 3,0 6,2

KI 0,83 0,75 0,83 MoO3 - - - Na2MoO4.H2O 0,25 0,25 -

CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 -

FeEDTA (mg/L)

Na2EDTA.2H2O 37,3 - 37,7 FeSO4.7H2O 27,8 - 27,8 Fe2(SO4)3 - - -

Vitaminas e Aminoácidos (mg/L)

Ácido nicotínico 0,5 1,0 0,5

Piridoxina.HCl 0,5 1,0 0,5

Tiamina.HCl 0,1 1,0 1,0

Glicina 2,0 - 2,0

Mio-inositol (mg/L)

Mio-inositol 100 100 100

Sacarose (g/L)

Sacarose 30 20 30

pH

pH 6,0 6,0 6,0

26

2.4. Reguladores de Crescimento

A concentração de reguladores de crescimento vegetal no meio nutritivo in vitro são

fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos

sistemas de cultura de tecidos, visto que segundo Pasqual (2001), estes fitorreguladores

direcionam o metabolismo do explante para o processo desejado, onde os efeitos

observados quanto às respostas das células, tecidos e órgãos in vitro, variam de acordo

com as condições ambientais, o tipo do explante e o genótipo da planta (SERAFINI et al.,

2001).

Os fitorreguladores podem ser definidos como substâncias sintéticas que são

adicionados ao meio nutritivo, com a finalidade de induzir modificações nos padrões de

crescimento e desenvolvimento do explante (TERMIGNONI, 2005), e como forma de

suprir deficiências hormonais da planta durante todo o processo de micropropagação

(WERBROUCK e DEBERGH, 1994).

As auxinas estão envolvidas no crescimento e desenvolvimento das plantas e são

utilizadas para a indução de raízes adventícias (SAINI et al., 2013). Peixoto (2010),

descreve que as auxinas são produzidas, principalmente, nas regiões apicais (gema

apical) e translocadas de modo polar para a raiz.

As auxinas mais utilizadas na técnica de cultura de tecidos ainda são: o AIA (Ácido

3-indol-acético), o IBA (Ácido 4-indol-butírico), o 2,4-D (Ácido 2,4-diclorofenoxiacético), o

ApCFA (Ácido pclorofenexiacético) e o ANA (Ácido 1-naftalenoacético) (DIXON e

GONZÁLES, 1994).

No que se refere às citocininas, estas constituem um grupo de fitorreguladores

indispensáveis à divisão celular, quebra de dormência apical, indução e proliferação de

gemas axilares, diferenciação de gemas adventícias e indução de parte aérea em calos

(QUISEN et al., 2008; TAIZ e ZEIGER, 2009).

De modo geral, as maiores concentrações de citocininas são encontradas em

regiões meristemáticas ou em órgãos em crescimento com altas taxas de divisão celular,

como folhas jovens, sementes em desenvolvimento, frutos e raízes (COLL et al., 2001).

No entanto, o meristema apical da raiz é o principal local de síntese de citocininas em

plantas e estas são translocadas via xilema para a parte aérea da planta, porém quando

se encontram nas folhas, são relativamente imóveis (VIEIRA e CASTRO, 2004; TAIZ e

ZEIGER, 2009).

27

As citocininas mais utilizadas em cultura de tecidos descritas por Dixon e Gonzáles

(1994) são: o KIN (6-furfurilaminopurina, também conhecida como cinetina), o BAP (6-

Benzilaminopurina), o 2ip (N-Isopentinilaminopurina), o Zea (Zeatina) e o TDZ

(Thidiazuron).

Desde Skoog e Miller (1957), as auxinas e as citocininas são consideradas as

classes de reguladores de crescimento descritas mais utilizadas na cultura de tecidos

vegetais, agindo conforme a disponibilidade e interação destas duas classes de

fitorreguladores no metabolismo da planta.

A alta relação citocinina-auxina promove a formação de brotos, e o oposto ocasiona

a diferenciação da raiz (GUERRA e NODARI, 2006; MORAES et al., 2007).

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral:

Elaborar metodologia para obtenção de protocolo na propagação in vitro da

espécie medicinal Himatanthus sucuuba via sementes.

3.2. Objetivos específicos:

Determinar qual a melhor concentração de agente bactericida e fungicida para a

desinfestação de sementes.

Testar qual o melhor meio de cultura e sua diluição para a germinação de

sementes no cultivo in vitro desta espécie.

Verificar o melhor tipo e concentração de citocinina que induzirá a maior taxa de

multiplicação in vitro de explantes.

Constatar qual das posições da gema haste que produzirá a maior taxa de

multiplicação in vitro de explantes.

Testar qual o melhor meio de cultura e sua diluição para a multiplicação in vitro.

Verificar o melhor tipo e concentração de auxina que induzirá a maior taxa de

enraizamento in vitro de explantes, a fim de permitir a sua inserção em sistema de

aclimatização ex vitro.

28

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Obtenção das Sementes de Himatanthus sucuuba

A obtenção das sementes de sucuuba utilizadas neste estudo foi realizada em

parceria com o Laboratório de Sementes Florestais da Escola Superior de Tecnologia –

EST/UEA em duas coletas dos frutos maduros realizadas no mês de Setembro/2015 e a

outra em Julho/2016 na localidade do Ramal do Brasileirinho – Manaus/AM (2º95’99’’ S,

59º86’20’’ W), onde as matrizes identificadas da família Apocynaceae foram medidas,

catalogadas, e cujas exsicatas encontram-se depositadas no Herbário do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, sob o nº 276673.

Todas as fases do estudo foram desenvolvidas como teste experimental, realizado

no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Escola Superior de Tecnologia –

EST/UEA, localizado na Avenida Darcy Vargas, 1220, Parque Dez, Manaus, AM.

4.2. Desinfestação de sementes in vitro de Himatanthus sucuuba

Para a realização dos testes de assepsia, foram utilizadas sementes de sucuuba

induzidas à germinação in vitro. As sementes tiveram as alas membranosas do tegumento

de revestimento retiradas durante o enxague em água corrente, conforme recomenda

Chocorosqui (2015), e posteriormente lavadas com detergente ODD® neutro, seguida de

outro enxague em água corrente. A primeira assepsia foi realizada com a imersão dos

explantes em solução do fungicida comercial Cabrio Top (Piraclostrobina) 1% (v/v), por

uma hora, seguida de um banho em solução de álcool 70% por 1 minuto. Na sequência,

os explantes foram submetidos à imersão em solução de hipoclorito de sódio nas

concentrações de 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 e 10,0% (v/v), sob agitação magnética, por 30

minutos. Ao término das etapas de desinfestação, os explantes foram lavados quatro

vezes com água destilada e autoclavada dentro da câmara de fluxo laminar, em seguida

inoculados em meio de cultura MS na concentração original, acrescido de 30,0 g/L de

sacarose e 7,0 g/L de agar-agar com pH ideal 6.0, e mantidos em sala de crescimento à

temperatura de 25°C±2°C, 60±5% de umidade relativa e 16h de fotoperíodo com

intensidade luminosa de 2.0x107 μE.cm -2.s-2, provenientes das lâmpadas fluorescentes

brancas frias (GE.85W).

29

4.3. Diluição dos meios basais na taxa de germinação das sementes de H. sucuuba

Após a definição da melhor concentração do bactericida na desinfestação do

explante, sementes sem a membrana que reveste o tegumento foram inoculadas,

respectivamente, em meio de cultura MS e WPM acrescidos de 30,0 g/L de sacarose e

7,0 g/L de agar-agar com pH ideal 6.0, nas concentrações originais e nas concentrações

diluídas duas e quatro vezes, para avaliação da taxa de germinação.

4.4. Efeito de diferentes concentrações e tipos de citocininas de segmentos nodais

de H. sucuuba

Segmentos nodais oriundos das plântulas crescidas in vitro e inoculados em meio

de cultura MS foram suplementados com diferentes tipos e concentrações de citocininas:

a) benzilaminopurina (BAP), b) cinetina (KIN) e c) thidiazuron (TDZ) nas respectivas

concentrações de 0,0; 0,1; 1,0; 3,0 e 5,0 mg/L, para detecção dos efeitos destes

fitorreguladores no número médio e na altura média das brotações de segmento nodal de

sucuuba.

4.5. Efeito da posição da gema na haste quanto ao número médio e altura média das

brotações de H. sucuuba

Conforme a morfologia da espécie, as gemas localizadas nas três primeiras

posições (1 a 3) no caule, foram seccionadas e inoculadas em meio de cultura MS

suplementado com o melhor tipo e concentração da citocinina definida como resultado do

tratamento descrito no item 4.4.

4.6. Diluição dos meios basais no número médio e na altura média das brotações de

H. sucuuba

Segmentos nodais foram inoculados, respectivamente, em meio de cultura MS,

WPM e B5 nas concentrações originais e nas concentrações diluídas duas e quatro

vezes, todos suplementados com o melhor tipo e concentração de citocinina encontrado

no tratamento descrito no item 4.4.

30

4.7. Efeito de diferentes concentrações e tipos de auxinas no enraizamento de H.

sucuuba

Segmentos nodais inoculados em meio de cultura MS suplementados como o

melhor tipo e concentração de citocinina encontrado no tratamento descrito no item 4.4.,

foram submetidos ao suplemento de diferentes tipos e concentrações de auxinas: d)

Ácido 3-indol-acético (AIA), e) Ácido naftalenoacético (ANA) e f) Ácido 3-indol-butírico

(IBA) nas respectivas concentrações de 0,0; 0,1; 1,0; 3,0 e 5,0 mg/L, para detecção dos

efeitos na formação de raízes no cultivo in vitro.

4.8. Coleta dos dados e Análise Estatística

A coleta de dados foi realizada separadamente para os experimentos de

Himatanthus sucuuba.

Para o tratamento de assepsia, após 30 dias, os explantes foram observados

quanto à presença ou ausência de contaminantes (fungos e bactérias) e quanto à

porcentagem de sobrevivência dos explantes.

Para a avaliação da germinação das sementes nos meios basais e diluídos a

segunda e quarta parte, os explantes foram avaliados à porcentagem de germinação,

explantes com brotação, ao número de brotos por gema, ao número de gemas por haste

e a altura de brotações em condições in vitro.

Os tratamentos descritos nos itens 4.3; 4.4; 4.5; 4.6; e 4.7 foram mantidos em sala

de crescimento e, após 30 dias, os explantes foram avaliados quanto à porcentagem de

germinação, explantes com brotação, ao número de brotos por gema, ao número de

gemas por haste, a altura de brotações e a presença de calos e formação de raízes em

condições in vitro.

O delineamento experimental adotado em todas as fases dos experimentos acima

citados foi inteiramente casualizado, sendo utilizados três repetições com dez explantes

cada para todos os tratamentos.

Para o estabelecimento dos explantes in vitro, foram 30 explantes por tratamento.

Para o experimento de assepsia, foi feito um arranjo fatorial 1 x 5 (uma classe de

bactericida por cinco diferentes concentrações).

Para o experimento dos meios de cultura na germinação das sementes foi feito um

arranjo fatorial 2 x 2 (dois meios de culturas por duas diluições dos meios basais).

31

Nos experimentos sobre efeito de reguladores de crescimento de citocininas e

auxinas, foram feitos um arranjo fatorial de 3 x 5 (três tipos de hormônios de cada classe

por cinco concentrações) respectivamente.

Para o experimento dos meios de cultura no desenvolvimento dos explantes, foi

feito um arranjo fatorial 3 x 3 (três meios de culturas por três diluições dos meios basais).

Para todas as fases dos experimentos, em comparação por grupos, foi utilizado o

teste de análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de TUKEY, quando detectada

diferença significativa. Caso a distribuição dos dados se apresentasse fora da

normalidade, foi utilizado análise de variância em ranques de Kruskal-Wallis, seguido pelo

método de Dunn, para detecção da diferença. Para todas as análises foi determinado o

nível de significância p<0,05, utilizando o software ASSISTAT – Assistência Estatística -

versão 7.7 beta (SILVA, 2014).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Desinfestação de sementes in vitro de H. sucuuba

Para fins de evitar a contaminação do meio de cultura por fungos e bactérias, a

assepsia do material vegetal é de fundamental importância na propagação in vitro,

exigindo maiores cuidados desde a obtenção do material vegetal até o manuseio em

laboratório dentro da câmara de fluxo laminar (XAVIER et al., 2009).

A utilização do hipoclorito de sódio nos tratamentos para desinfestação das

sementes observados na Tabela 4, apresentaram maior eficácia na concentração de

0,10%, proporcionando 96,67% de sementes vivas e livre de contaminantes, obtendo a

porcentagem de 6,67% de contaminação fúngica e bacteriana, o que caracteriza uma

baixa taxa comparado aos demais tratamentos, assim representando a concentração

mais eficiente na assepsia destes explantes. Para os demais tratamentos, nas

concentrações de 0,05; 0,25; 0,50 e 1,0%, não houve diferença significativa entre as

concentrações de hipoclorito de sódio. Esta ação desinfestante do hipoclorito de sódio

também foi evidenciada por Malosso et. al., (2016), cujas sementes de H. sucuuba

apresentaram 100% de sementes assépticas na concentração de 0,10% de hipoclorito de

sódio.

Segundo Meyer (1994), o hipoclorito de sódio tem a capacidade de penetrar na

parede celular das bactérias, desativando enzimas que permitem a sua sobrevivência,

desta forma sendo bastante utilizado em procedimentos de assepsia no cultivo in vitro.

32

Sementes de Myrciaria dúbia (camu-camu) expostas às baixas concentrações de

hipoclorito de sódio apresentaram 0% de contaminação ao final de 35 dias após a

inoculação, demonstrando eficiência na desinfestação (SILVA et. al., 2012).

Segundo Fermino Junior et al., (2009), um dos maiores problemas na obtenção de

plantas 100% livres de contaminantes diz respeito a contaminação presente no interior

dos tecidos, conhecida como contaminação endógena, mais frequente em explantes

derivados de espécies florestais.

O tratamento na concentração de 1,0% de hipoclorito de sódio apresentou 100%

de morte das sementes, demonstrando que maiores concentrações deste agente

desinfestante é tóxico para as sementes desta espécie (Tabela 4).

Rubim et al., (2010), observou que sementes de café expostas a alta concentração

de solução de hipoclorito de sódio, reduziu significativamente a taxa de germinação.

Por outro lado, a maior porcentagem de contaminação foi observada no tratamento

com a concentração de 0,05% de hipoclorito de sódio.

Nascimento et.al., (2007), testando a desinfestação de sementes de Parapipta

deniarigida, observou 100% de contaminação quando as sementes não eram submetidas

ao tratamento com hipoclorito de sódio, o que implica a necessidade do uso deste agente

bactericida na desinfestação e controle da sanidade do material introduzido in vitro.

Os resultados relativos quanto ao percentual total de sementes germinadas em

meio MS basal (Fig. 6-B) presentes na Tabela 4 só foram evidenciados após 45 dias de

inoculação.

Mesmo retirando a membrana tegumentar das sementes, o tempo de germinação

das H. sucuuba mostrou-se longo para a eficiência do estabelecimento de um protocolo in

vitro.

Martinotto et al., (2007), demonstrou que sementes de Eugenia dysenterica DC.,

cujos tegumentos foram retirados antes da inoculação in vitro em meio MS, apresentaram

maior uniformidade e velocidade de germinação.

Com base no resultado obtido nesta fase inicial quanto à germinação das sementes

de H. sucuuba, verificaram-se a necessidade de avaliar as concentrações dos sais

minerais presentes no meio de cultura MS, visto que todas as sementes tiveram as

membranas do tegumento retiradas, portanto, não sendo uma barreira para a germinação.

33

Tabela 4. Efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de sódio na desinfestação de sementes de H. sucuuba. Manaus – AM, 2016.

Médias seguidas de mesma letra não difere estatisticamente, entre si, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade.

(*)Nesta tabela não foi feito o teste de Tukey da presença de bactérias, porque apenas o a

menor [ ] induziu esta característica. NA= não avaliado.

Figura 6. Sementes de H. sucuuba, cultivadas em tubos de ensaios com meio MS basal, suplementado com sacarose e ágar

®: (A) semente com contaminação aos 30 dias, (B) sementes

germinando aos 45 dias.

5.2 Diluição dos meios basais na taxa de germinação das sementes de H. sucuuba

Conforme orienta Caldas et. al., (2008), os meios de cultura MS e o WPM,

correspondem a espécies florestais, cujo meio WPM foi desenvolvido especialmente para

espécies lenhosas.

As sementes submetidas à assepsia na concentração de 0,10% de hipoclorito de

sódio definida no experimento anterior, apresentaram início de germinação aos 16 dias

Tratamento com NaOCl

Explantes Contaminação Germinação

Mortos (%)

Vivos (%)

Fungos (%)

Bactérias(*) (%)

Sementes (%)

0,05% 30,00 ab 70,00b 20,00 ab 23,67 40,00 b

0,10% 3,33 c 96,67 a 6,67 b * 90,00 a

0,25% 20,00 c 80,00 a 8,33 b * 80,00 a

0,50% 80,00 bc 20,00 a 10,00 a * 20,00 b

1,0% 100,00 b 0,00 a 10,00 a * 0,00b

Média Geral 34,67 65,33 30,00 0,00 62, 67

C.V (%) 23,55 20,91 29,81 0,00 22,94

A B

34

(Fig.7-A), demonstrando 100% de explante com brotação na concentração do meio de

cultura MS/4 (Fig.7-B) e 90,67% na diluição do MS/2 aos 30 dias após inoculação

conforme a Tabela 5. O resultado deste experimento condiz com a observação de Monfort

et al., (2015), cuja redução da concentração dos sais do meio básico MS favoreceu a

maior porcentagem de germinação de sementes de Ocimum selloi in vitro.

Reis et al., (2008), destaca que a concentração dos sais do meio MS e a

porcentagem de sacarose influenciaram significativamente a germinação de sementes de

Melissa officinalis.

Apesar do meio de cultura WPM ser considerado específico para espécies

florestais, apresentando eficiência na germinação in vitro do ingazeiro (Inga vera Willd.

subsp. Affinis) estudado por Stein et. al (2007), para a H. sucuuba este meio de nutritivo

não apresentou resultado eficiente comparado ao meio MS diluído, visto que o WPM

basal apresentou 63,33% de explante com brotação e apenas 6,67% na concentração de

WPM/2, enquanto que o WPM/4 não apresentou germinação aos 30 dias após a

inoculação.

Apesar desta observação, é importante ressaltar que o uso dos meios nutritivos MS

e WPM nas suas concentrações originais e diluídas para a germinação de espécies

lenhosas, equivale a ampla referência na literatura no desenvolvimento de cultivo in vitro,

bastando apenas a adequação do tipo de protocolo a ser estabelecido para a espécie em

estudo (PINHAL et. al., 2011).

Sob condições naturais, Ferreira et al., (2006), observando a germinação de

sementes e a tolerância de plântulas de H. sucuuba em condições de alagamento

evidenciou que durante 28 dias nenhuma das sementes com revestimento alado

germinou independente do tipo de substrato utilizado, enquanto que nas sementes sem a

presença deste revestimento a germinação ocorreu em um período de 15 dias, o que

corrobora com o resultado obtido na germinação in vitro para esta espécie.

Um outro ponto observado neste experimento, foi que ao final dos 30 dias após a

inoculação, nenhuma das plântulas estabelecidas in vitro apresentaram brotação de gema

por haste, visto que estas ao se libertarem das barreiras da germinação inicialmente

alongam a haste para só depois haver a abertura do cotilédone, o que demonstra a

necessidade do uso de reguladores de crescimento para a multiplicação da H. sucuuba

na propagação in vitro.

35

Tabela 5: Taxa de germinação das sementes sob os meios de cultura basais, MS e WPM e suas diluições pela metade e pela quarta parte, no desenvolvimento in vitro de explantes H. sucuuba. Manaus – AM, 2016.

Meio de Cultura basal e Diluições

Explantes com Brotações (%)

Nº deBrotos por Gema (*)

Nº de Gema por Haste (**)

Taxa de Multiplicação (*) x (**)

Altura do Broto (cm)

MS de Murashige e Skoog (1962)

MS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

MS/2 90,67 a 0,62a 0,00 0,00 3,28ab

MS/4 100,00 a 0,62 a 0,00 0,00 5,42ab

WPM de LIoyd et al (1980)

WPM 63,33 a 0,96 a 0,00 0,00 1,42 ab

WPM /2 6,67 a 0,60 a 0,00 0,00 0,33 b

WPM /4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Média Geral 65,27 0,70 0,00 2,06

C.V (%) 13,41 1,30 5,46

Médias seguidas de mesma letra não difere estatisticamente, entre si, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. (*) x (**): Taxa de multiplicação obtida pelo do número de brotos por gema multiplicado pelo número gema por haste (SANTOS et al., 2006).

Figura 7. Sementes de H. sucuuba: (A) germinação de sementes cultivadas em tubos de ensaios com meio MS/4, suplementado com sacarose e ágar

® aos 16 dias; (B) plântulas estabelecidas em meio

MS/4, suplementado com sacarose e ágar®, aos 30 dias após germinação.

A B

36

5.3 Efeito de diferentes concentrações e tipos de citocininas no número médio e na

altura média das brotações de segmento nodal de H. sucuuba

Para a estimulação da multiplicação dos explantes obtidos deH. sucuuba a adoção

dos reguladores de crescimento apresentaram diferença significativa em suas

concentrações para todas as características analisadas conforme observado na Tabela 6.

Através dos experimentos realizados com diferentes concentrações das citocininas

BAP, KIN e TDZ, o tipo de concentração que promoveu melhor resultado para a

multiplicação in vitro de H. sucuuba, foi o tratamento com 0,1 mg/L de BAP (Fig. 8-A),

proporcionando a taxa de 100% de explantes com brotações, bem como 3,37% de

números de brotos gemas, 2,70 de gemas por haste e melhor altura do broto de 1,52cm,

além de não ter induzido a produção de calos, desta forma, obtendo 9,09 de taxa de

multiplicação (nº brotos x nº gema), representando o maior valor em relação aos outros

fitorreguladores. Santos et al. (2006), destaca que a taxa de multiplicação é um parâmetro

importante para verificar a velocidade do processo de propagação in vitro, comprovando a

importância do genótipo na diferenciação celular. Segundo Grattapaglia e Machado

(1998), o BAP é a citocinina mais eficiente para promover proliferação de brotações de

parte aérea, com a vantagem de apresentar um menor custo econômico.

Sahahet al. (2012) e Diniz (2014),obtiveram semelhantes resultados ao avaliarem

diferentes citocininas na multiplicação in vitro de Ocimum gratissimum e Rosa chinensis,

ambos constatando que o maior número médio de brotos e gemas foram produzidos sob

baixas concentrações de BAP. Explantes de Eugenia uniflora tambémapresentaram a

maior taxa de brotações e gemas sob baixa concentração do BAP (SOUZA et al., 2008),

assim como para Crotonantys philiticus (OLIVEIRA et al., 2011), Stevia rebaudian

(THIYAGARAJAN e VENKATACHALAM, 2012) e Mandevilla moricandiana (CORDEIRO

et al., 2012).

Quanto a presença de calos na base dos explantes as citocininas BAP e KINna

concentração de 5,0 mg/L, e o TDZ nas concentrações de 1,0; 3,0; e 5,0 mg/L (Fig. 8-B)

promoveram as maiores porcentagem de calogênese com 90; 58,89; 6,67; 20 e 100%,

respectivamente, interferindo no desenvolvimento dos explantes in vitro, uma vez que o

TDZ, juntamente com o KIN, mostraram-se menos efetivos na taxa de multiplicação e

altura de brotações dos explantes conforme Tabela 6.

Santos et al. (2013), na multiplicação in vitro de Varroniacuras savica, Silva et al.

(2010), com explantes de Ceiba pentandra L. Gaertn, e Torres et al., (2005) com a

Heliconia rostrata, também obtiveram semelhantes resultados na exposição dos explantes

37

aos tratamentos com TDZ e KIN, respectivamente. No entanto, segundo Ribeiro et al.

(2010), Moreira (2011) e Bertoni et al. (2013), estes reguladores de crescimento vegetal

apresentam capacidade organogênica, promovendo satisfatória proliferação de brotos em

Ricinus communis, Ananas comosus e Zeyheria montana, respectivamente.

Tratamentos acrescidos de pequenas concentrações de citocininas, apresentam

menor probabilidade de indução de variação somaclonal, característica imprópria para o

desenvolvimento deum protocolo de micropropagação, a possibilidade da obtenção de

clones elites de uma determinada espécie, visto que alterações genéticas nestes

indivíduos podem levar à perda justamente da característica desejada economicamente

(REZENDE et al., 2011).

As citocininas participam ativamente dos processos de divisão, alongamento e

diferenciação celular, principalmente ao interagirem com as auxinas (TAIZ e ZEIGER,

2009; PEIXOTO, 2010). A adição de citocininas é considerada favorável em alguns casos

de desenvolvimento de explantes in vitro e a concentração utilizada depende da espécie e

tipo de explante (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998), no caso da H. sucuuba

demonstrando a essencialidade do uso de reguladores de crescimento para a eficiência

na multiplicação de explantes desta espécie medicinal.

Figura 8. Plântulas de H. sucuuba: (A) obtidas na concentração de 0,1mg/L de BAP, (B) obtenção de calos na concentração de 5,0 mg/L de TDZ.

A B

38

Tabela 6. Efeitos de diferentes concentrações e tipos de citocininas no desenvolvimento in vitro de explantes de H. sucuuba. Manaus-AM, 2016.

Regulador Vegetal


Nº de Brotos por Gema(*)

Nº de Gema por Haste

(**)



Presença de Calo (%)

Presença de Raiz(a) (%)

Controle 76,67 a 1,13 cd 2,06 ab 2,32 0,37c 0,00 d ---

BAP (mg/L)

0,1 100,00 a 3,37 a 2,70 a 9,09 1,52ª 0,00 d ---

1,0 93,00 a 2,66 a 1,76 ab 6,37 1,20 ab 0,00 d ---

3.0 93,00 a 2.56 ab 2,15 ab 4,68 1,29ab 0,00 d ---

5,0 20,00 bc 1,00 cd 1,20 bc 1,20 0,15 c 90,00 a ---

KIN (mg/L)

0,1 90,00 a 1,43 c 1,73 ab 2,47 1,21 ab 0,00 d ---

1,0 86,00 a 1,40 c 2,23 ab 3,12 0,70 bc 0,00 d ---

3.0 83,33 a 1,36 c 2.06 ab 2,80 0,80 abc 0,00 d ---

5,0 56, 67 ab 1,46 bc 1,07 bc 1,56 0,79 abc 58,89 b ---

TDZ (mg/L)

0,1 86,67 a 1,28 c 1,61 ab 2,06 0,63 bc 0,00 d ---

1,0 86,67 a 1,23 cd 1,56 ab 1,91 0,73 bc 6,67 cd ---

3.0 83,33 a 1,03 cd 1,56 ab 1,60 0,65 bc 20,00 c ---

5,0 3,33 c 0,13 d 1,30 bc 0,16 0,13 c 100,00 a ---

Média

Geral 73,84 1,54 1,65 78,03 21,28 ---

C.V (%) 23,25 24,55 25,39 29,11 29,63 ---

Médias seguidas de mesma letra não difere estatisticamente, entre si, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. (*) x (**) : Taxa de multiplicação obtida pelo do número de brotos por gema multiplicado pelo número gema por haste (SANTOS et al., 2006).

(a)Nesta tabela não foi feito o teste de Tukey da

presença de raiz, porque nenhum tratamento induziu esta característica. NA= não avaliado.

39

5.4 Efeito da posição da gema no desenvolvimento in vitro de H. sucuuba

Os explantes mais indicados para a propagação in vitro são os ápices caulinares,

gemas axilares e meristemas isolados por apresentarem crescimento vegetativo

determinado e capacidade de se desenvolverem normalmente quando supridas suas

necessidades nutricionais (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).

Estudos morfológicos de plântulas de H. sucuuba, descreve um desenvolvimento

relativamente lento na formação de gemas axilares com germinação faneroepígea

cotiledonar (AMARO et al., 2006), dessa forma demonstrando a formação de brotações

por gema conforme a Fig. 9.

Figura 9. Localização das gemas nas plântulas obtidas in vitro de H. sucuuba: (A) Plântula germinada in vitro; (B) Plântula desenvolvida com adição de 0,1mg/L de BAP.

Os experimentos realizados com as posições 1, 2 e 3 da gema de H. sucuuba

avaliados aos 30 dias apresentaram diferença estatística significativa ao nível de 5%

quanto aos números de brotos por gema, gema por haste e altura do broto demonstrada

na Tabela 7.

Gemas seccionadas nas três primeiras posições da haste foram avaliadas quanto à

capacidade de regenerar novas brotações, demonstrando que as gemas apicais

encontradas na posição 1, proporcionaram maior porcentagem de explantes com

brotação com 90%e maior taxa de multiplicação com 10,85%. Além disso, esta posição

também apresentou o maior número de brotos por gema com 4,66 e gemas na haste com

2,33 quando comparada com as demais gemas, embora não haja diferença estatística

quanto a porcentagem de explantes com brotações observada em todas as posições.

Na prática, procura-se utilizar explantes com maior proporção de tecido

meristemático ou que tenham maior capacidade de expressar a totipotência

(GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998) como as gemas apicais.

A B

1 2

3 1 2 3

4

40

Estudos realizados com a propagação in vitro de Crotonantys philiticus (OLIVEIRA

et al. 2011) e Macrosyphonia velame e MARTINS et al. (2011), verificou-se que as gemas

apicais promoveram a melhor porcentagem de explantes com brotações e, além disso,

maior altura das brotações e maior número de gemas por haste com 6,15, o que

possibilitou a obtenção de maior índice de multiplicação in vitro para estas espécies.

Entretanto, Malosso et al. (2012), observou que não houve diferença da posição dos

explantes para a multiplicação em seus estudos com a Jacaranda decurrens.

Biondo et. al., (2007), destaca em seu estudo com a espécie Mandevilla velutinaa

importância de se investigar a posição da gema para a obtenção de maior número de

brotos por explante.

Tabela 7. Efeito das diferentes posições da gema no desenvolvimento in vitro de explantes de H. sucuuba. Manaus – AM, 2016.

Posição da Gema


Nº de Brotos por Gema(*)

Nº de Gema por Haste(**)



1 90,00 a 4,66 a 2,33 a 10,85 2,73 a

2 76,67 a 2,70 b 1,93 ab 5,11 1,65 b

3 83,00 a 2,66 b 1,63 b 4,33 2,25 ab

Média Geral 83,33 3,15 1,96 2,21

C.V (%) 11,50 18,44 12,53 17, 52


5.5 Efeito de diferentes diluições dos meios de cultura no desenvolvimento in vitro

de H. sucuuba

A alta concentração de sais que constituem os meios de cultura MS, B5 e WPM

podem ser considerados inadequados ao processo morfogenético de algumas espécies,

dessa forma, muitas modificações têm sido sugeridas com intuito de melhor adaptação

das culturas in vitro e ao mesmo tempo redução dos custos (JESUS et al., 2003).

Explantes de H. sucuuba foram cultivados em meios de cultura basais MS, B5 e

WPM e avaliados quanto à porcentagem de brotação, taxa de multiplicação, altura do

broto e presença ou ausência de raiz. Conforme observado na Tabela 8, este experimento

demonstrou diferença estatística ao nível de 5% em todos os parâmetros analisados para

diferentes diluições dos meios de cultura MS, MS/2, MS/4, B5, B5/2, B5/4, WPM, WPM/2

e WPM/4.

41

O meio de cultura B5 na concentração original, bem como as diluições pela metade

e quarta parte dos meios MS e WPM, promoveram bom desenvolvimento dos explantes,

entretanto, ambos produziram calos na base das plântulas o que representa um

inconveniente para a etapa seguinte que é o enraizamento. O meio de cultura B5 na

concentração original e diluída, bem como os meios MS e WPM nas concentrações

originais e diluições pela metade e quarta parte promoveram as menores taxas de

multiplicação desta espécie. Além disso, as diluições destes dois meios de cultura MS e

WPM induziram as menores taxas de alturas do broto, sendo 0,89 (MS/4); 0,77(WPM/2) e

0,32cm (WPM/4) respectivamente, quando comparadas aos meios de cultura MS e WPM

na concentração original. Todos estes resultados evidenciam que a escolha do meio de

cultura é extremamente importante para a proposta de elaboração de um protocolo de

propagação in vitro de H. sucuuba com a finalidade de proporcionar a multiplicação do

maior número de plantas e deste modo promover ferramentas para conservação da

espécie.

Portanto, fica indicado para a multiplicação in vitro desta espécie o meio de cultura

MS na concentração original, uma vez que este tratamento induziu 90% de explantes com

brotação e ausência total de calos, além do maior número de brotos por gema com 3,36 e

gema por haste com 2,96, proporcionando também a maior taxa de multiplicação com

9,74 quando comparado aos demais tratamentos, embora este experimento não tenha

apresentado diferença estatística significativa ao nível de 5% entre os meios de cultura

MS basal e WPM na concentração original conforme observado na Tabela 8.

No entanto, estes resultados vêm a corroborar com trabalhos realizados com

plantas da região amazônica tais como, a Cissus sicyoides (ABREU et al., 2003), Acmella

oleracea (MALOSSO et a., 2008), Ananas comosus (MOREIRA et al., 2011) além das

espécies Baccharis tridentata (KAJIKI e SHEPHERD, 2006) e Alliums ativum L. (LONGO,

2009).

Um ponto importante a ser ressaltado, é que o meio de cultura MS para

germinação de sementes desta espécie só foi eficiente após diluição, enquanto que no

desenvolvimento de segmentos nodais a partir das plântulas obtidas in vitro, este meio

nutritivo se mostrou favorável na sua concentração original, resultado este também

observado por Faria et al., (2007) cujo segmentos nodais de Passiflora spp.,

apresentaram melhor desenvolvimento em meio MS na concentração original. Entretanto,

Golle et. al., (2012), em seu estudo com a espécie Eugenia involucrata destaca o meio

MS/2 o mais adequado no estabelecimento, desenvolvimento e no enraizamento de

segmentos nodais apicais.

42

Outro fato importante que pode ser observado na Tabela 8 é que nenhum dos

tratamentos até então, induziram a formação de raízes nos explantes, constatando a

necessidade da adição de outros reguladores de crescimento para esta finalidade, visto

que espécies consideradas difíceis de enraizar, após exposição a tratamentos com

auxinas sintéticas, permitem o aumento na concentração de auxinas endógenas

estimulando a formação de raízes.

Tabela 8: Efeito de diferentes diluições dos meios de cultura basais, MS, B5 e WPM e suas diluições pela metade e pela quarta parte, no desenvolvimento in vitro de explantes H. sucuuba. Manaus – AM, 2016.

Meio de Cultura basal e diluições


Nº de Brotos por Gema (*)






MS de Murashige e Skoog (1962)

MS 90,00 a 3,36 a 2,90 a 9,74 2,00 a 0,00 b ---

MS/2 66,67 ab 1,56 bc 1,36 bc 3,68 1,02 bc 20,00 a ---

MS/4 86,67 a 1,83 abc 1,56 bc 2,85 0,89 bc 6,77 ab ---

B5 de Gamborg (1968)

B5 70,00 ab 1,50 bc 1,46 bc 2,19 1,05 bc 6,6 ab ---

B5 /2 73,33 ab 1,50 bc 1,60 bc 2,40 1,09 bc 0,00 b ---

B5 /4 70,00 ab 1,56 bc 1,63 abc 2,54 1,03 bc 0,00 b ---

WPM de LIoyd et al (1980)

WPM 96,67 a 2,96 ab 2,43 ab 7,19 1,42 ab 0.00 b ---

WPM /2 66,67 ab 1,60 bc 1,26 bc 2,01 0,77 bc 0.00 b ---

WPM /4 40,00 b 0,56 c 0,50 c 0,28 0,32 c 23,00 a ---

Média Geral 73,33 1,82 1,63 1,06 0,06

C.V (%) 17,41 33.30 27.17 25,47 105,88


(a)Nesta tabela não foi feito o teste de Tukey da

presença de raiz, porque nenhum tratamento induziu esta característica. NA= não avaliado.

5.6 Efeito de diferentes concentrações e tipos de auxinas no número médio e na

altura média das brotações de segmento nodal de H. sucuuba

Conforme observado na Tabela 9, este experimento apresentou diferença

estatística significativa para as características de explantes com brotações, número de

brotos por gema, número de gemas por haste, taxa de multiplicação, altura do broto,

43

presença de calos e raízes para todos os tratamentos analisados com os reguladores de

crescimento AIA, ANA e IBA.

Nenhum dos explantes do controle (testemunha) apresentaram a formação de

raízes, além da diminuição da taxa de explantes com brotações, sendo 66,67; 56,67 e

63,67%.

Os tratamentos de AIA e ANA nas respectivas concentrações de 3,0 e 5,0 mg/L-1,

induziram a formação de calos, enquanto que o IBA em todas as concentrações

apresentou as maiores taxas de calogênese, cujo o tratamento com 5,0 mg/L-1 induziu

100% da formação de calos, resultado este indesejável para a proposta desta

metodologia de enraizamento com a finalidade de regeneração de plântulas in vitro.

Somente após 45 dias os tratamentos de 3,0 e 5,0 mg/L-1do AIA apresentaram a

formação de raízes (Fig. 10), o que indica que esta espécie leva mais tempo para

responder a indução de fitorreguladores em condições in vitro. Ainda assim, esta indução

é considerada muito baixa, sendo 10,33% na concentração de 3,0 mg/L-1e 20% na

concentração de 5,0 mg/L-1para a proposta de enraizamento desta espécie in vitro.

Apesar dos tratamentos 3,0 mg/L-1 5,0 mg/L-1 de AIA terem promovido a formação

de raízes, os demais parâmetros de avaliação apresentaram resultados ineficientes

quando comparado aos demais tratamentos observados na Tabela 9, pois ambos os

tratamentos demonstraram a taxa de explantes com brotações de 26,67 e 23,33%;

números de brotos por gemas de 1,53 e 1,26; números de gemas por haste de 0,40 e

0,67; altura do broto de 1,22 e 1,04cm; taxa de multiplicação de 0,21 e 0,05, além da alta

taxa na indução de calos com 66,67 e 73,33%.

O mecanismo de iniciação radicular em tecidos caulinares, principalmente no

aspecto da fisiologia na diferenciação celular, é ainda pouco compreendido, visto que os

reguladores de crescimento apresentam efeitos diversos no metabolismo, crescimento e

na diferenciação, afetando outros processos fisiológicos das plântulas em sistema in vitro

(ASSIS e TEIXEIRA, 1998).

Como as taxas observadas neste experimento apresentaram baixo potencial de

enraizamento, sugere-se que novos estudos com outros reguladores de crescimento

sejam realizados, objetivando o aumento considerável da taxa média de enraizamento,

como por exemplo, a auxina sintética 2,4-D (Ácido 2,4-diclorofenoxiacético) que não foi

utilizada para esta espécie. Das etal., (2013), observou que no meio de cultura MS

suplementado com 2,5 mg/L-1 de AIA, apresentou maior eficácia na brotação e no

enraizamento, quando comparados às baixas concentrações de AIA na propagação in

vitro de Dioscorea alata L.

44

Figura 10. Plântulas in vitrodeH. sucuuba: (A) Formação de raízes na concentração de 3,0 mg/L-1

; e (B) na concentração de 5,0 mg/L

-1 de 0,1 mg/L de AIA.

São vários os fatores relacionados ao enraizamento de plantas cultivadas in vitro,

tais como os níveis de auxina endógena, as condições inerentes à planta matriz como

juvenilidadee o genótipo, o meio de cultura, a presença de reguladores de crescimento e

carboidratos, a nutrição mineral, a presença de poliaminas e substâncias como carvão

ativado, a presença de compostos fenólicos, as condições ambientais como temperatura

e luz para o crescimento das plântulas in vitro, dentre outros (MORAES, 2007; SOUZA e

PEREIRA, 2007).

Carvalho et al., (2006) relata que as auxinas mais comumente empregadas nos

meios de enraizamento in vitro são o AIA, ANA e IBA. Dessa forma,a maior parte dos

trabalhos de enraizamento in vitro utiliza estas auxinas devido a estabilidade em relação a

outros fitorreguladores demonstrados em estudos na propagação in vitro. Entretanto, os

resultados quanto ao efeito positivo e/ou negativo destas auxinas, variam de modo

significativo de espécie para espécie (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; PASQUAL,

2001).

Embora o presente trabalho não tenha apresentado bons resultados quanto ao

desenvolvimento in vitro de raízes de H. sucuuba expostas a diferentes concentrações de

auxinas, há relatos na literatura da eficiência destes reguladores, demonstrando a

efetividade na propagação in vitro. Navroski (2011)cita que o IBA tem sido bastante

usado por não causar fitotoxicidade aos explantes em uma larga faixa de concentração e

ser eficiente em uma grande variedade de espécies. Segundo Asgharet al. (2013) ao

desenvolver o protocolo de propagação in vitro de cultivares de Myrica rubra utilizando as

auxinas AIA e IBA, verificaram que o IBA foi o mais eficiente no enraizamento in vitro

desta espécie. Shah et al., (2013) relata que o ANA foi mais eficaz na multiplicação in vitro

A B

45

de Aristolochia indica L. proporcionando o aumento significativo no número de brotos e

raízes. Entretanto, as auxinas promovem o enraizamento, mas nem sempre a

porcentagem de enraizamento, cujo número de raízes formadas pode ser maximizado

com o aumento nas concentrações de auxinas (NAVROSKI, 2011).

Os explantes do tipo segmento nodal utilizados neste experimento de enraizamento

foram obtidos a partir de sementes germinadas in vitro, apresentando grande variabilidade

genética. Nestes experimentos não foi possível observar o quanto a lactescência desta

espécie medicinal corrobora as suas respostas fisiológicas.

Tabela 9. Efeitos de diferentes concentrações e tipos de auxinas no desenvolvimento in vitro de

explantes de H. sucuuba. Manaus-AM, 2016.

Regulador Vegetal


Nº de Brotos por Gema (*)






Controle 66,67 a 3,10 a 1,90 a 5,89 0,37c 0,00 e 0,00 a

AIA (mg/L)

0,1 66,67 a 2,03 abc 1,70 a 3,45 1,28 abc 0,00 e 0,00 a

1,0 63,33 a 2,23 ab 1,46 ab 3,25 0,98 abc 0,00 e 0,00 a

3.0 26,67 bcd 1,53 bcd 0,40 bc 1,22 0,21 cde 66,67 bc 10,33 ab

5,0 23,33 d 1,26 d 0,67 c 1,04 0,05 de 73,33 ab 20,00 ab

ANA(mg/L)

0,1 56,67 ab 2,36 ab 1,86 a 4,38 1,45 ab 0,00 e 0,00 ab

1,0 53,33 abc 1,56 abc 1,10 abc 1,71 0,70 bcd 0,00 e 0,00 b

3.0 13,33 cd 0,30 cd 0,30 bc 0,09 0,25 cde 40,00 cd 0,00 ab

5,0 16,67 bcd 0,33 cd 0,33 bc 0,10 0,11 de 40,00 cd 0,00 ab

IBA (mg/L)

0,1 60,30 a 1,20 a 2,03 a 6,50 1,90 a 20,00 e 0,00 a

1,0 30,67 a 1,13 a 2,06 a 6,44 1,27 abc 20,00 e 0,00 b

3.0 33,33 ab 0,16 a 1,93 a 6,09 1,09 abc 80,00 de 0,00 b

5,0 0,00 d 0.00 d 0,00 c 0,00 0,00 e 100,00 a 0,00 b

Média

Geral 42,84 1,69 1,16 0,84 26,15 1,00

C.V (%) 32,86 37,66 35,66 42,53 34,63 100,00

Médias seguidas de mesma letra não difere estatisticamente, entre si, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. (*) x (**).Taxa de multiplicação obtida pelo do número de brotos por gema multiplicado pelo número gema por haste (SANTOS et al., 2006).

46

De um modo geral, o desenvolvimento do sistema radicular in vitro de espécies

florestais ainda representa um grande desafio no âmbito do desenvolvimento de

protocolos para regeneração de plantas via propagação in vitro. Sobretudo, o

enraizamento in vitro ainda apresenta uma complexidade, devido aos vários fatores

físicos e bioquímicos que estão diretamente relacionados com a formação de raízes.

47

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

1. A assepsia de explantes com o uso do hipoclorito de sódio na concentração de

0,10% se mostrou eficiente, promovendo a desinfestação de sementes de H.

sucuuba de uma forma rápida e de baixo custo.

2. A germinação in vitro em diluição do meio de cultura MS/4 mostrou maior taxa

de explantes obtidos em curto espaço de tempo, garantindo a efetividade do

uso de sementes como explante no cultivo in vitro desta espécie.

3. A multiplicação de explantes de H. sucuuba é dependente de fitorreguladores,

sendo a citocinina BAP em baixas concentrações a mais indicada.

4. Explantes em diferentes posições da gema e a citocinina presente no meio MS

basal mostrou que a posição 1 correspondente a gema apical de H. sucuuba é

a mais adequada para multiplicação in vitro.

5. Os explantes do tipo segmento nodal desenvolvem-se melhor em meio de

cultura MS na concentração original.

6. Os resultados obtidos com os experimentos das auxinas não foram eficientes

para o enraizamento in vitro de H. sucuuba. Contudo, apontam a necessidade

de novos estudos quanto ao tipo e concentração das auxinas relacionadas ao

enraizamento in vitro desta espécie, a fim de permitir a sua inserção em fases

de aclimatização em sistema ex vitro.

7. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho tende a corroborar com a

otimização da metodologia para novas pesquisas desta espécie florestal com

atividade medicinal comprovada.

48

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PROPAGAÇÃO IN VITRO DE Himatanthus sucuuba WOOD., UMA … · 2017-08-14 · vitro em diluição do meio de cultura MS/4 mostrou maior da taxa de explantes obtidos em curto espaço