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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
PROPRIEDADES CITOTÓXICAS DAβ LAPACHONA EM CÉLULAS
DE OSTEOSSARCOMA CANINOIN VITRO
Vanessa de Sousa Cruz Pimenta
Orientador: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo
GOIÂNIA
ii
2015
iii
VANESSA DE SOUSA CRUZ PIMENTA
PROPRIEDADES CITOTÓXICAS DA β LAPACHONA EM CÉLULAS
DE OSTEOSSARCOMA CANINO IN VITRO
Tese apresentada para obtenção do título
de Doutor em Ciência Animal junto à
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientador:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo – EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Profª. Drª.Maria Clorinda Soares Fioravanti - EVZ/UFG
Profª. Drª.Yandra Cássia Lobato do Prado - EVZ/UFG
GOIÂNIA
2015
iv
v
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Arthur Cruz de Barros Pimenta, Luiz Gonzaga da Cruz, Maria Teodora de
Sousa Cruz, Marcelo de Barros Pimenta e Viviane de Sousa Cruz e Silva. Obrigada família,
pelos momentos de incentivo, compreensão e apoio.
Ao Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo, pelasabedoria, dedicação, paciência,
confiança e amizade. Pelo empenho e determinação em montar e gerenciar o Laboratório
Multiusuário de Cultivo Celular do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal, sem o
qual, a fase experimental desse projeto não teria acontecido.
Ao Prof. Cesário Bianchi Filho, pelos ensinamentos,atenção e disponibilidade
constante.
À Drª.Yandra Cassia Lobato do Prado, pela coorientação, parceria e
companheirismo.
Aos professores Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti, Drª. Luciana Batalha de
Miranda Araújo, Drª. Liliana Borges de Menezes, Dr. Kleber Fernando Pereira e Drª.Marina
Pacheco Miguel e Dr. Adilson Donizeti Damasceno,pela disponibilidade, contribuição e
engrandecimento da banca examinadora.
Aos professores e funcionários do Setor de Patologia Animal e Setor de
Parasitologia Animal.
Às amigas e colegas de equipe do Laboratório Multiusuário de Cultivo Celular do
PPGCA,Fernanda Almeida Rodrigues, Fernanda Figueiredo Mendes, Karla Márcia da Silva
Braga,Patrícia de Almeida Machado e Thais Poltroniere dos Santos, pelo carinho,
convivência, troca de experiência, bons momentos e pela grandiosa colaboração durante as
fases deste trabalho.
À Wanessa Carvalho Pires e Francyelli Mariana dos Santos Mello, pelo auxílio no
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética do Instituto de Ciências Biológicas/UFG.
Às queridas Sony e Velma, por me amarem de forma incondicional.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,pela bolsa de
estudo e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,pelo
financiamento deste projeto.Sem eles seria inviável a realização deste estudo.
A Deus e a Nossa Senhora por terem permitido que tudo isso acontecesse e todas
essas pessoas fizessem parte da minha vida.
vii
“Ao longo dos séculos, quem sofre dessa doença foi
submetido a quase todas as formas concebíveis de
experiência. Os campos e florestas, a farmácia e o
templo foram saqueados em busca de algum tipo de
alívio para essa doença intratável. Quase nenhum
animal escapou de dar a sua contribuição, fosse com
pele ou pelo, dente ou unha, timo ou tireoide, fígado
ou baço, na vã busca de alívio.”
William Bainbridge
viii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS ........................................................................ 1
1. Ciclo celular, câncer e morte celular ........................................................................................ 2
2. Osteossarcoma ............................................................................................................................. 6
3. β Lapachona ............................................................................................................................... 18
4. Cultivo Celular .......................................................................................................................... 23
5. Objetivos .................................................................................................................................... 25
6. Referências ................................................................................................................................. 25
CAPÍTULO 2 – β LAPACHONA REDUZ A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE
OSTEOSSARCOMA CANINO EM CULTURA ..................................................................... 35
Resumo ........................................................................................................................................... 35
Abstract ........................................................................................................................................... 36
Introdução ....................................................................................................................................... 37
Material e métodos ........................................................................................................................ 38
Resultados e discussão .................................................................................................................. 41
Conclusão ....................................................................................................................................... 45
Referências ..................................................................................................................................... 45
CAPÍTULO 3 – β LAPACHONA BLOQUEIA O CICLO CELULAR E INDUZ
APOPTOSE EM CÉLULAS DE OSTEOSSARCOMA CANINO ........................................ 50
Resumo ........................................................................................................................................... 50
Abstract ........................................................................................................................................... 51
Introdução ....................................................................................................................................... 52
Material e métodos ........................................................................................................................ 53
Resultados e discussão .................................................................................................................. 55
Conclusão ....................................................................................................................................... 64
Referências ..................................................................................................................................... 64
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 68
ix
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
FIGURA 1 - Agentes antineoplásicos e a fase onde promovem o bloqueio do ciclo celular. ... 4
FIGURA 2 - Fotomicrografias de osteossarcoma canino forma central. A) Osteoblástico:
células blásticas, com núcleo de formato oval a alongado. 100x e 200x. B)
Condroblástico: condrócitos neoplásicos com citoplasma basofílico, núcleo
excêntrico com halo claro perinuclear. 100x. C) Fibroblástico: células
fusiformes em forma de feixes, com núcleo alongado, cromatina densa e
moderada produção de estroma conjuntivo. 100x e 200x. HE. ........................... 11
FIGURA 3- Imagem de uma espécie de ipê-amarelo, Tabebuia ochracea, localizada à
margem da Alameda Marginal Botafogo, Goiânia-GO. ..................................... 19
FIGURA 4- Estrutura química do lapachol. ............................................................................. 21
FIGURA 5 - Estrutura química da β lapachona. ...................................................................... 22
CAPÍTULO 2 - β LAPACHONA REDUZ A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE
OSTEOSSARCOMA CANINO EM CULTURA
FIGURA 1 - Ensaio da VC pelo método de exclusão do Azul de Tripan. A) Média da VC
de cada grupo por concentração e tempo de exposição à βLP. B) Cálculo da
CT de cada grupo por concentração e tempo de exposição à βLP. Análise por
contador celular automatizado LunaTM
. .............................................................. 42
FIGURA 2 - Fração de sobrevivência de cada grupo por concentração e tempo de
exposição à βLP. Nos grupos de 48 e 72 horas, o padrão observado de
redução foi similar. .............................................................................................. 44
CAPÍTULO 3 - β LAPACHONA BLOQUEIA O CICLO CELULAR E INDUZ
APOPTOSE EM CÉLULAS DE OSTEOSSARCOMA CANINO
FIGURA 1 – Imagens representativas de amostras da análise do mecanismo de morte
celular promovido pela β lapachona nas células de osteossarcoma canino,
por meio do ensaio de dupla marcação com anexina V (eixo X) e iodeto de
propídio (eixo Y). A) 0,1 μM/24h. B) 0,3 μM/24h. C) 1,0 μM/24h. D) 0,1
μM/48h. E) 0,3 μM/48h. F) 1,0 μM/48h. G) 0,1 μM/72h. H) 0,3 μM/72h. I)
1,0 μM/72h. Onde N = morte celular por necrose, AT = apoptose tardia, CV
= células viáveis e AI = apoptose inicial. Citômetro de fluxo (FACSCalibur,
BD Biosciences). ................................................................................................. 56
FIGURA 2 - Gráfico com os valores encontrados para viabilidade celular, apoptose
inicial, apoptose tardia e necrose, nas células de osteossarcoma canino, após
tratamento com a β lapachona, nas diferentes concentrações e tempos de
exposição.. ........................................................................................................... 58
x
FIGURA 3- Análise do efeito de diferentes concentrações da β lapachona em 24 horas
sobre o potencial de membrana mitocondrial nas células de osteossarcoma
canino, por meio da utilização do corante lipofílico JC-1. Nota-se acentuado
aumento da apoptose (A) e decréscimo de viabilidade celular (VC) na
concentração de 1,0 μM. FL-1 = fluorescence channel 1; FL-2 =
fluorescence channel 2. Citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD
Biosciences). ....................................................................................................... 59
FIGURA 4 - Gráfico sobre o potencial de membrana mitocondrial ao utilizar o corante
lipofílico JC-1. Valores da viabilidade celular e apoptose nas células de
osteossarcoma canino, após tratamento com a β lapachona, nas diferentes
concentrações, em 24 h. Observa-se o caráter inversamente proporcional . ....... 61
FIGURA 5 - Representação gráfica do resultado da Cinética do ciclo celular, para os
grupos com 24h (A), 48h (B) e 72h (C) de permanência das células de
osteossarcoma canino em tratamento com a β lapachona. Nota-se que a
inibição do crescimento ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 e
aumentou com o tempo de exposição. Eixo X = fases do ciclo celular; eixo Y
= número de células............................................................................................. 63
xi
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2 – β LAPACHONA REDUZ A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE
OSTEOSSARCOMA CANINO EM CULTURA
TABELA 1 - Viabilidade celular (VC) e citotoxicidade (CT) de cada grupo por
concentração e tempo de exposição à βLP, pelo método de exclusão do
corante azul de tripan. ........................................................................................ 41
TABELA 2 - Medidas de variação entre os grupos de tratamento com diferentes
concentrações e tempo de exposição à β lapachona. .......................................... 44
CAPÍTULO 3 – β LAPACHONA BLOQUEIA O CICLO CELULAR E INDUZ
APOPTOSE EM CÉLULAS DE OSTEOSSARCOMA CANINO
TABELA 1 - Média dos dados fornecidos pelo citômetro de fluxo sobre o mecanismo de
morte celular promovido pela β lapachona em células de osteossarcoma
canino. ................................................................................................................ 57
TABELA 2 - Média dos dados fornecidos pelo citômetro de fluxo sobre o potencial de
membrana mitocondrial, ao utilizar o corante lipofílico JC-1. ........................... 60
TABELA 3 - Média dos dados fornecidos pelo citômetro de fluxo sobre a análise do
bloqueio do ciclo celular da linhagem D-17, após o tratamento com a β
lapachona. ........................................................................................................... 61
xii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABS Absorbância
βLP β lapachona
CCAT Número de células contadas após o tratamento
CCGC Número de células contadas no grupo controle após o tratamento
CO2 Dióxido de carbono
CT Citotoxicidade
DMEM Meio dubelco modificado de Eagle
DMSO Dimetilsulfóxido
FS Frações de sobrevivência
G24 Grupo tratado por 24 horas
G48 Grupo tratado por 48 horas
G72 Grupo tratado por 72 horas
GC Grupo controle
GH Growth hormone(Hormômio de crescimento)
HCl Ácido clorídrico
IC50 Inhibitory concentration(Concentração de inibição)
JC-1 Iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloral 1,1’,3,3’–tetraetilbenzimidazolocarbocianina
LP Lapachol
MTT Tetrazólio (3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-diphnyl-2H-tetrazólio
N Normal, Equivalente grama
OS Osteossarcoma
OSC Osteossarcoma canino
OSH Osteossarcoma humano
PBS Phosphate buffered saline(Salina fosfato tamponada)
rcf(g) Relative centrifugal force(Força centrífuga relativa)
SDS Sodium dodecyl sulfhate (sulfato de sódio dodecyl)
SFB Soro fetal bovino
VC Viabilidade celular
xiii
RESUMO
O osteossarcoma é o tumor maligno das células ósseas primitivas mais diagnosticado em cães
e humanos. A necessidade de medicamentos mais efetivos, com menor consequência adversa,
tem gerado esforços para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos compostos por
plantas e outras fontes naturais. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos intracelulares
da β lapachona sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida, bem como
identificar mecanismos de ação que possam explicar suas propriedades citotóxicas. Células de
osteossarcoma canino foram obtidas do banco de linhagens celulares, subcultivadas e
submetidas ao tratamento com a β lapachona, de acordo com as diferentes concentrações. Os
resultados foram obtidos por meio do método de exclusão do corante azul de tripan, pelo
método deredução do tetrazólio, pelo ensaio de sobrevivência clonogênica, pelo ensaio de
dupla marcação com Anexina V-FITC e Iodeto de Propídio, pelo ensaio de marcação com o
corante JC-1 e pela análise da cinética do ciclo celular. O grupo tratado com 0,3 μM de β
lapachona apresentou melhor regressão da viabilidade celular (80,27% / 24h; 47,41% / 48h e
35,19% / 72h) e maior progressão da citotoxicidade (19,73% / 24h; 52,59% / 48h e 64,81% /
72h). O menor IC50 (0,180 μM) ocorreu no grupo tratado por 72 horas. O crescimento celular
após o tratamento foi menor de acordo com o aumento da concentração e tempo de exposição,
apresentando 0,50% de fração de sobrevivência na concentração de 1,0 µM. Não houve
diferença estatística entre as concentrações, para a proliferação celular após o tempo de
exposição à β lapachona.A apoptoseinicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos
os grupos. Foi menor no grupo de 24 horas tratado com 0,1 μM (4,26 %) e maior no grupo de
72 horas tratado com 1,0 μM (85,89 %). A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira
dose dependente, caracterizando a apoptose intrínseca. A inibição do crescimento das células
ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 conforme o tempo de exposição. Nas células de
osteossarcoma canino, a β lapachona possui efeitos citotóxicos, induz apoptose intrínsecae
promove o bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1.
Palavras-chave: Cães, cultivo celular, métodos moleculares, neoplasia óssea, quinonas.
xiv
ABSTRACT
Osteosarcoma is the most diagnosed primary bone cell tumor in dogs and humans. The need
for more effective drugs with less intense collateral effect has triggered the development of
plant-derived, natural-source chemotherapeutics. This study aimed to verify β lapachone
intracellular effects on canine osteosarcoma cultured cells, as well as identify action
mechanisms related to its antiproliferative properties. Cells were obtained from a cell line
bank, sub cultivated and subjected to treatment with different β lapachone concentrations,
followed by tetrazolium reduction, Tripan Blue dye exclusion assay, clongenic survival assay,
Annexin V-FITC and propidium iodine double-labeling, JC-1 dye labeling and cell cycle
kinetics analysis. The group treated with β lapachone for 72 hours showed the lowest cell
viability, 27,74%, and the most conspicuous citotoxic effect, 64,81%, at 0,3 μM
concentration; lower IC50, 0,180 μM and also the lowest cell growth - 0,50%- following
treatment with 1,0 µM concentration. No statistical difference for cell proliferation was
verified between concentrations after β lapachone exposure.Early apoptosis was the most
frequent type of cell death considering all groups. It was less frequent in the 24-hour group
treated with 0,1 μM (4,26 %) and more frequent in the 72-hour group treated with 1,0 μM
(85,89 %). Mitochondrial depolarization was dose-dependent. Cell growth inhibition was
carried out through cycle block at G0/G1 phase, according to exposure time. β lapachone was
shown to have antiproliferative and cytotoxic effects, to induce apoptosis and to block cell
cycle at G0/G1 phase on canine osteosarcoma cells.
Keywords:bone tumors, cell culture, dogs, molecular methods, quinones.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
O tecido ósseo é um conjunto de células especializadas, classificadas como
estáveis sob o ponto de vista da longevidade, ou seja, se diferenciam durante o
desenvolvimento embrionário e mantêm um ritmo constante de multiplicação depois do
nascimento. Forma-se a partir da cartilagem, recebendo depósitos de uma substância mineral,
constituída principalmente por fosfato e cálcio1,2
.
A cartilagem possui uma substância intercelular de consistência dura e flexível,
formada por células cartilaginosas jovens, os condroblastos, que se transformam em células
cartilaginosas adultas, os condrócitos. Quando um animal nasce, o modelo de cartilagem já foi
quase totalmente substituído por tecido ósseo, porém, próximo às extremidades dos ossos
longos, persiste uma região cartilaginosa que permite que esses ossos cresçam em
comprimento. Até uma determinada idade, que varia entre as espécies, esta cartilagem é
inteiramente substituída por tecido ósseo, encerrando a fase de crescimento1,2
.
A formação dos mecanismos envolvidos na base do processo neoplásico ocorre
quando, por uma série de fatores, algumas células passam a crescerde forma autônoma e se
diferenciam dos aspectos estruturais do seu tecido2,3
.As neoplasias ósseas primárias malignas
são relativamente comuns em cães e os osteossarcomas representam as mais prevalentes4,5
.
Por ser, também, o tumor ósseo primário mais comum em humanos e apresentar
características similares às dos cães, o estudo nesta espécie proporciona melhor entendimento
da neoplasia no ser humano6.
Atualmente, a droga de escolha para o tratamento quimioterápico do
osteossarcoma é a cisplatina, podendo ser associada com a carboplatina ou a doxorrubicina7,8
.
O tempo médio de sobrevida de cães tratados com amputação e quimioterapia é de,
aproximadamente, um ano3,4
.A importância da procura de uma melhor abordagem terapêutica
para o osteossarcoma vem ao encontro da necessidade de minimizar os efeitos adversos,
diminuir a incidência das metástases, aumentar o tempo de sobrevida e proporcionar melhor
qualidade de vida aos pacientes10
.
A quimioterapia baseada num planejamento racional de fármacos tem sido
modelo para diversos estudos. A citotoxicidade das quinonas, dentre as quais a β
lapachonaestá incluída, associada a fatores estruturais que levam à intensidade das suas ações
antitumorais, pode contribuir na busca de agentes antineoplásicos mais eficientes9.
2
1. Ciclo celular, câncer e morte celular
O ciclo celular consiste nos processos pelos quais a célula passa durante as
divisões celulares. É composto por duas etapas, a interfase e a divisão. Na interfase há
produção de diversas substâncias necessárias para o desempenho de suas funções.
Compreende as fases G0, G1, S e G2. Na fase G0 a célula não está se replicando e apresenta
atividade nuclear baixa. Na fase G1 as células crescem, diferenciam-se e produzem
substâncias como as proteínas, enzimas e RNA. Os cromossomos preparam para replicação e
ocorre a produção de constituintes celulares essenciais para a nova célula. Na fase S acontece
a síntese do DNA e os cromossomos apresentam dois cromatídeos ligados pelo centrômero. A
fase G2 representa a diferença entre a síntese do DNA e a mitose, com a produção de
substâncias necessárias para a formação de novas células11
.
A fase M está relacionada com a etapa da divisão. Ocorre a produção do fuso
mitótico, a divisão nuclear e citoplasmática, originando duas novas células. Em seguida, há a
citocinese, quando as novas células se separam com suas organelas e demais constituintes.
Após o período de replicação celular, o ciclo retorna à fase G011,12
.
Quando um grupo de células se liberta dos mecanismos de controle do
crescimento e passa a crescer, independente dos aspectos estruturais e funcionais normais do
seu tecido, tornando-se um estado rebelde autônomo, inicia-se a formação dos mecanismos
envolvidos na base do processo neoplásico. Este crescimento pode ocorrer de maneira
incoordenada, sem relação à arquitetura normal e infiltrar extensamente o tecido, ou expandir-
se como uma massa solitária de maneira a comprometer uma função vital importante. A
velocidade de crescimento varia bastante entre diferentes tipos de tumores e mesmo entre
tumores do mesmo tipo2,3
.
A primeira fase da carcinogênese é o estágio de iniciação, em que as células estão
geneticamente alteradas sob o efeito de um agente carcinogênico. Em seguida, as células
transformam-se em malignas no estágio de promoção. Já no estágio de progressão, ocorre a
multiplicação celular descontrolada e o surgimento dos primeiros sintomas da doença11,12
.
O câncer é uma doença genética cuja evolução conduz a inúmeras alterações no
DNA. Os proto-oncogenes são genes responsáveis pela regulação positiva da proliferação
celular, enquanto os genes supressores de tumor se encarregam de inibir a multiplicação das
células. Durante o desenvolvimento das neoplasias ocorre a ativação de proto-oncogenes
simultaneamenteà inativação de genes supressores de tumor. A mutação de um oncogene
3
promove divisões celulares sem restrição e a mutação de um gene supressor de tumor leva a
produção de proteínas defeituosas13,14,15
.
Os genes de reparo ao DNA controlam a integridade do genoma frente a danos
celulares, como alterações cromossômicas, depleção de metabólitos, choque térmico, hipóxia,
oncoproteínas virais e ativação de oncogenes celulares13,14,15
. Fatores como o estresse e
cofatores de transcrição podem influenciar a interação direta entre esses genes e o reparo ao
DNA16
.
Os tipos de estresse que promovem a ativação de genes reguladores incluem as
condições associadas com a iniciação e progressão das neoplasias. Tais atividades ocorrem
durante o desenvolvimento do câncer e resultam em mudanças biológicas, como o equilíbrio
entre a apoptose e a sobrevivência celular13,17
. As alterações genéticas que tenham impacto
sobre a competência das proteínas associadas à apoptose, o controle do ciclo celular e o
reparo de danos ao DNA, são capazes de modular a probabilidade da ação dos genes
reguladores, bem como o resultado da ativação biológica e suas múltiplas interações para
controlar o crescimento das células neoplásicas18
.
O controle do ciclo celular e o bloqueio em pontos de checagem são feitos por
uma rede de vias de sinalização dependentes da ação do gene supressor de tumor TP53 (tumor
protein 53) que codifica a proteína p53 (phosphoprotein 53). A sequência específica do fator
de transcrição da p53 coordena a expressão de um grande número de genes alvo e proteínas,
como p21 e Bcl-2, que participam em diferentes respostas celulares a condições de
estresse13,14,15
.
Vários genes podem ser recrutados simultaneamente dentro da mesma célula. A
escolha dos genes específicos parece ter envolvimento com a interação de uma variedade de
outras proteínas, favorecendo a transativação de genes pró-apoptóticos. Qualquer alteração
genética que tenha impacto sobre a competência de outras proteínas envolvidas com a
apoptose, o controle do ciclo celular ou o reparo aos danos do DNA, também são capazes de
modular a resposta da p53 ao estresse18
.
Existe uma ligação entre o envelhecimento e o câncer e as intervenções que
prolongam a vida podem diminuir a incidência de tumores19
. Da mesma forma, os genes que
estendem a vida, como o grupo FoxO (Forkhead Box - FoxO1, FoxO3, FoxO4 e FoxO6),
fazem parte de uma rede molecular que suprime a tumorigênese20
. Assim, tanto a senescência,
quanto a apoptose contribuem para a ação do quimioterápico e a perda de qualquer processo
promove a falha do tratamento. Diversos agentes anticancerígenos podem induzir a apoptose
4
por meio de vias comuns e, as mutações que desativam estas vias, podem promover
resistência a estes quimioterápicos21,22
.
A quimioterapia é o principal tratamento para doenças malignas sistêmicas. No
entanto, alguns tumores são insensíveis a agentes quimioterápicos e outros adquirem
resistência sobre a recidiva21
.Os fármacos ciclo-celular específicos, como os agentes
antimetabólitos, agentes hormonais, alcaloides vegetais e enzimas, exercem sua ação sobre as
células que se encontram no ciclo celular. Já os que não são específicos, como os antibióticos
naturais, alcaloides pirrolizidínicos, complexos de coordenação de platina e agentes
alquilantes, eliminam as células tumorais mesmo na fase de repouso11
.A Figura 1 mostra
alguns agentes antineoplásicos e a fase onde bloqueiam o ciclo celular.
FIGURA 1 - Agentes antineoplásicos e a fase onde promovem o bloqueio do ciclo celular.
Fonte: Almeida et al.11
Em 1960 ocorreu a primeira descrição da morte celular programada e, desde
então, inúmeras classificações têm sido feitas por meio das características morfológicas. Em
2009, a terminologia relacionada com a morte celular compreendia apoptose, necrose e
catástrofe mitótica. Desde 2012, para a morte celular, in vitro e in vivo, incluiu-se os termos
apoptose extrínseca, apoptose intrínseca, necrose regulamentada, morte celular autofágica e
catástrofe mitótica. Existe, também, os termos Anoikis, Entosis, Parthanatos, Pyroptosis,
Netosis e Cornificação (Quadro 1)23
.
5
QUADRO 1 – Classificação dos tipos de morte celular
TIPO DESCRIÇÃO D C
Apoptose
extrínseca
Morte celular induzida por sinais de estresse extracelular,
detectados e propagados por receptores transmembranares. Ocorre
por morte ou dependência dos receptores.
+ +
Apoptose
intrínseca
Inicia na membrana mitocondrial externa ou pode resultar da
transição da permeabilidade mitocondrial. A inibição da caspase
pode atrasar a execução da morte celular e apresentar
características morfológicas de necrose.
+ + / - -
Necrose
regulamentada
Ocorre de forma programada, por manipulações genéticas ou
bloqueio por agentes farmacológicos. Necroptose é um tipo de
necrose programada, onde ocorre a segmentação de agentes
patogênicos pelo sistema imunitário.
- -
Morte celular
autofágica
Acontece acompanhada pela vacuolização citoplasmática da
autofagia, com base em alterações bioquímicas e funcionais.
Ocorre em algumas células cancerígenas in vitro, pela indução da
autofagia por alguns agentes químicos.
- -
Catástrofe
mitótica
É a morte celular ou senescência executada durante a mitose ou na
interfase subsequente. Os marcadores morfológicos para esse caso
são as células com micro e multinucleação.
- -
Anoikis Termo de derivação grega utilizado para descrever a resposta
apoptótica à ausência de interações com a célula matriz.
+ +
Entosis Acontece pelo bloqueio por inibidores lisossomais, envolvendo
células homotípicas, insensível às intervenções químicas e
genéticas inibidoras da caspase.
- -
Parthanatos Significa a personificação da morte na mitologia grega. Sobrevém
em situações de acidente vascular cerebral, diabetes, inflamação e
neurodegeneração, independente da caspase.
- -
Pyroptosis Descreve a morte peculiar de macrófagos como resultado da
infecção bacteriana, seguida pela ativação das caspases.
+ +
Netosis Exibe vacuolização maciça do citoplasma, rápida descondensação
da cromatina e desagregação das membranas nucleares e
granulares. É restrita às células granulocíticas, insensível à
inibição das caspases, dependente da enzima NAPDH oxidase e
dependente de componentes autofágicos.
- -
Cornificação Morte de queratinócitos, associada com a síntese de enzimas e
substratos necessários para a geração do estrato córneo da
epiderme, alterada por meio da inibição da enzima
transglutaminase.
+
DC: Dependência da caspase. Fonte: Adaptado de GALLUZZI et al.23
6
A utilização de termos adicionais, definidos por uma série de propriedades
bioquímicas, demonstra que a presença de características morfológicas específicas não é
suficiente paraestabelecer todo o processo de morte celular. A ativação da caspase, in vitro,
deixa de ser uma exigência para a apoptose. A geração de espécies reativas de oxigênio e
espécies reativas de nitrogênio, que eram associadas à apoptose, são reconhecidas, também,
em alguns casos de necrose. Da mesma forma, a presença de fosfatidilserina, um componente
fosfolipídico, deixa de ser uma prerrogativa da apoptose e passa a constituir uma
característica precoce de parthanatos e netosis23
.
2. Osteossarcoma
2.1. Introdução
Neoplasias ósseas primárias malignas são relativamente comuns em cães e o
osteossarcoma (OS) representa a mais prevalente. Correspondem a 80% de todos os tumores
ósseos, 6% de todos os tumores caninos e estão associados a um prognóstico reservado24,25
.
Em humanos é o principal tumor ósseo maligno e a maior incidência ocorre em crianças e
adultos jovens, com frequência de 60% nas primeiras duas décadas de vida26,27
.
O OS é um tumor heterogêneo, com padrões histológicos distintos, constituído
por vários tipos celulares que são originados de uma única célula mesenquimal pluripotente
ou de osteoblastos imaturos. Pertence ao grupo de tumores primitivos que produz tecido
ósseo, sendo conhecido também como sarcoma osteogênico ou sarcoma osteoblástico28,29
.
2.2. Etiologia
A etiologia ainda é desconhecida e várias hipóteses têm sido consideradas. Sabe-
se que a transformação maligna de células mesenquimais leva ao desenvolvimento do OS,
mas as bases genéticas desses eventos ainda não são compreendidas30
. Apesar de não ter sido
isolado nenhum vírus responsável pelo surgimento dessa neoplasia, não se descarta a origem
viral.Em indução experimental de osteossarcoma por injeção de células neoplásicas em fetos
caninos, acredita-se quea transmissão teria ocorrido pela presença do vírus no genoma da
célula31
.
É possível o desenvolvimento de uma linhagem mutante pela indução de sinais
mitogênicos, por meio da sensibilização de células das regiões metafisárias dos ossos que
sustentam grandes pesos, pois tais regiões são predispostas a pequenos e múltiplos traumas
7
durante o fechamento tardio da placa epifisária31
. Existem relatos de casos após fraturas não
tratadas, processos de atraso na consolidação óssea, osteomielite crônica e sítios prévios de
fraturas associadas a implantes metálicos ou enxerto cortical. O uso da radiação, empregada
como tratamento para sarcoma de tecidos moles, tem sido apontado como uma possível causa
de osteossarcoma canino(OSC)32
.
Modificações genéticas e hormonais são listadas como possíveis causas de OSC.
Alterações em genes supressores de tumores, como o retinoblastoma e o p53, têm sido
relacionadas ao surgimento de muitos casos de OS, sendo que a mutação de p53 tem sido
expressa no OSC. O hormônio de crescimento (GH: growth hormone) possui um efeito
estimulante para o crescimento de linhagens de células de OS e OSC, porque a produção local
de RNA mensageiro do GH pode gerar um ambiente altamente favorável para o crescimento
das células tumorais33
.
2.3. Aspectos Clínicos
OOS acomete o esqueleto apendicular ou axial24,34
. A maioria dos tumores se
origina nos ossos longos, distantes do cotovelo (metáfises proximal do úmero e distal do
rádio) e ao redor do joelho (metáfises distal do fêmur e proximal da tíbia), sendo que
aproximadamente 75% dos tumores crescem na metáfise30,32,35
. O envolvimento do esqueleto
axial está presente em aproximadamente 25% dos cães portadores de OS, ou seja, o esqueleto
apendicular pode ser até quatro vezes mais afetado que o axial36,37
. Os membros torácicos são
mais acometidos que os pélvicos, na proporção de 2:132,38
. Osteossarcomas primários também
são relatados em local extraósseo como o retroperitônio, pênis e músculos da coxa,
representando apenas 1% dos sarcomas de tecido mole39
.
Em95% dos casos esta neoplasia acomete cães com peso superior a 15 kg,
sendoos mais afetados com peso superior a 36,5 kg. Cães de pequeno porte são raramente
acometidos porque as placas de crescimento se fecham precocemente. A idade média de
ocorrência é de oito anos, porém existem relatos em cães jovens com menos de dois anos de
idade25,32,33
. A maioria dos casos ocorre em cães grandes e gigantes, do gênero masculino, a
partir da meia idade, principalmente das raças Greyhound, cão dos Pirineus, São Bernardo,
Dogue Alemão, Setter Irlandês, Doberman, Pastor Alemão, Rottweiler, Golden Retriever,
Irish Setter, Boxer, Labrador e Mastiff31,32,38
. Apesar de cães machos serem uma vez e meia
mais acometidos que as fêmeas, OS do esqueleto axial apresenta incidência maior em
fêmeas36
. Animais castrados, na fase pré-pubere, têm menor incidência dessa neoplasia que os
animais não castrados33
.
8
Em humanos, o OS ocorre com maior frequência em homens do que em mulheres.
Pode surgir em qualquer idade, no entanto, tem maior incidência na segunda década de vida,
durante a fase de crescimento do adolescente. Portanto, é mais comum em áreas de
crescimento ósseo rápido, o que sugere uma relação entre a formação do tumor e o
crescimento acelerado30
.
O OS é um tumor mesenquimal maligno das células ósseas primitivas, que se
caracteriza por produzir a matriz óssea. Esta matriz extracelular de osteóide é a base
histológica para sua diferenciação. O OS pode ser classificado de acordo com o tipo e
quantidade de matriz e pelas características celulares36
. Histologicamente, predomina o
padrão morfológico puro sobre o padrão combinado29
. O sistema de classificação mais
utilizado é o proposto pela Organização Mundial de Saúde em Forma Central e Forma
Periférica28,40
.
A Forma Central é a forma clássica mais comum, com aspectos clínicos,
radiográficos e anatomopatológicos bem definidos. Cresce no interior do osso, rompe a
barreira cortical e periostal, comprimindo as partes moles adjacentes, o que permite classifica-
lo como tumor extracompartimental. Possui uma variabilidade de aspectos histológicos e,
levando em consideração o aspecto predominante, é classificada nos subtipos osteoblástico,
condroblástico, fibroblástico, telangectásico, indiferenciado ou anaplásico, do tipo células
gigantes e padrão misto ou com variantes celulares28,37,40
. Já a Forma Periférica é a menos
frequente, com caracteres clínicos, evolutivos e anatomopatológicos distintos da forma
central. Acomete a superfície óssea e também é classificada em subtipos. O subtipo periosteal
ou periostal surge na cortical óssea sob o periósteo e não invade o canal medular. Já o
parosteal ou parostal cresce na superfície óssea sobre a cortical, estando delimitado por uma
linha transparente com largura variável de 1 a 3mm28,40
.
Os sinais clínicos incluem claudicação e, ocasionalmente, febre e anorexia35
. No
exame físico é detectado tumefação dolorosa, com ou sem envolvimento dos tecidos moles11
.
Aumento de volume, edema e fraturas espontâneas também são relatados. A dor ocorre como
resultado do rompimento do periósteo induzida pela lise óssea proveniente do
desenvolvimento neoplásico. Sinais como tremores e atrofia muscular por desuso, dificuldade
em se levantar, incontinência urinária e fecal, letargia e anorexia também têm sido observados
em pacientes com OS no esqueleto axial31
. Nos casos de OSC, pode ser observado
sangramento, edema e dor, devido à destruição óssea e de tecidos adjacentes36
.
Na Forma Central, o principal sintoma é a dor intermitente e crescente, sendo o
aumento de volume da região com tempo variável entre semanas a três meses. Por outro lado,
9
na forma periférica, a observação mais importante é o aumento de volume progressivo, tendo
a dor apenas caráter leve28
. O edema, em todos os casos, é justificado pela constricção
tecidual que impede a drenagem linfática normal e promove uma obstrução linfática, podendo
ser percebido pelo sinal de Godet positivo41
. Existem sintomas característicos conforme a
região acometida. No sítio oral relatou-se disfagia. No sítio orbital ou mandíbula caudal houve
exoftalmia e dor ao abrir a boca. Nos ossos da face observa-se deformidade facial. No sítio da
cavidade e seios nasais, descargas nasais e espirros. Já no sítio da medula espinhal,
hiperestesia com ou sem sinais neurológicos. Tosse, dispnéia, perda de peso, apatia e anorexia
podem estar presentes quando há metástase pulmonar31,32
.
2.4. Diagnóstico
O diagnóstico do OS pode ser baseado na história clínica, exame físico e achados
radiográficos. Quando possível, a cintilografia óssea e a tomografia computadorizada
complementam o diagnóstico. A confirmação é feita por meio do exame histopatológico, no
entanto, a avaliação citológica por biópsia aspirativa é uma técnica menos invasiva, com
diagnóstico em curto intervalo de tempo31,36,42
.
Os parâmetros sorológicos minerais de cães com OS tendem a se distanciar da
normalidade. Geralmente as concentrações de cromo e ferro, assim como a capacidade de
ligação do ferro, apresentam-se extremamente reduzidas, quando comparadas com as de cães
sadios, o mesmo ocorre em relação ao zinco, embora com menor diferença entre as
concentrações41
.
A atividade da fosfatase alcalina atinge elevadas concentraçõesplasmáticas,
relacionada à maior ou menor atividade dos osteoblastos no tumor. Determinações repetidas
são indicadas para avaliar o índice da velocidade de crescimento da neoplasia ou de recidiva
após a ressecção do tumor primário28
.
Para confirmação do diagnóstico radiográfico, é prudente realizar um aspirado
com agulha fina, se houver lise cortical considerável, ou um aspirado da área acometida com
agulha de aspiração de medula óssea. Os aspirados revelam células mesenquimais imaturas
com osteóide intracitoplasmático ou extracelular, osteoblastos malignos, osteoblastos
benignos, osteoclastos e células inflamatórias32
. Apesar do diagnóstico por aspiração com
agulha fina encontrar limitações em virtude da natureza dos tecidos, rígidos e calcificados,
apresenta baixo custo, é pouco invasivo e, na maioria das vezes, possibilita estabelecer
diagnósticos precisos43
.
10
A biópsia incisional permite a obtenção da quantidade ideal de tecido e maior
precisão do resultado. No entanto, essa técnica apresenta como desvantagem a necessidade de
procedimento cirúrgico, o que acarreta risco de complicações pós-cirúrgicas como formação
de hematoma, infecção, disseminação do tumor e fratura patológica. Múltiplos fragmentos,
obtidos do centro da lesão, aumentam as chances de precisão do diagnóstico. A biópsia
poderá ser aberta ou fechada, sendo a principal vantagem da aberta a quantidade de material
colhido para exame. Entretanto, poderá trazer riscos de infecção e produção de hematomas,
que podem retardar a utilização da quimioterapia ou radioterapia. Já a biópsia fechada, que
utiliza a agulha de Jamshidi calibre 11 ou 13 (monoject), é feita para obter um mínimo de dois
ou preferencialmente três núcleos de tecido, tanto do centro da lesão como da área entre
lesões acometidas e não acometidas do osso. Esse tipo de biópsia fornece precisão de 91,9%
para diferenciação entre o tumor e outras desordens, e 82,3% para diagnóstico específico do
tumor31
.
Após o procedimento cirúrgico, o membro amputado ou amostras representativas
devem ser encaminhados para histopatologia34
. O diagnóstico histopatológico é definitivo e
considera o tipo celular e a natureza da matriz produzida pelas células neoplásicas. As
características histológicas dos diversos subtipos (Figura 2) estão descritas isoladamente no
Quadro 231,33,40
.
A técnica da imunohistoquímica proporciona uma melhor investigação das
características histogenéticas das células tumorais do osteossarcoma. É possível encontrar
células mesenquimais indiferenciadas e células semelhantes a histiócitos. Esta técnica é
empregada na caracterização do imunofenótipo do OS e no diagnóstico diferencial com outros
sarcomas ósseos29
.
As proteínas argirófilas (AgNORs) estão localizadas no centro fibrilar e
componentes denso fibrilar dos nucléolos. Podem se configurar apresentando-se de forma
agrupada no nucléolo das células de osteossarcoma em proliferação e distribuídas por todo o
núcleo nas células altamente malignas33
.
A survivina é uma proteína com funções de regular a divisão celular e inibir a
apoptose nas células neoplásicas. A expressão de survivina pode ser útil para determinação do
prognóstico e do grau de malignidade em muitos tipos de câncer. No OSC, marcações de
survivina se correlacionam com o grau histológico e índice mitótico44
.
11
FIGURA 2 - Fotomicrografias de osteossarcoma canino forma central. Osteoblástico: A) Aspecto
geral, 100x; B) Células blásticas, com núcleo de formato oval a alongado, 200x.
Condroblástico: C) Aspecto geral, 100x; D) Condrócitos neoplásicos com citoplasma
basofílico, núcleo excêntrico com halo claro perinuclear, 100x. Fibroblástico: E)
Aspecto geral, 100x; F) Células fusiformes em forma de feixes, com núcleo alongado,
cromatina densa e moderada produção de estroma conjuntivo.HE.
12
QUADRO2: Características histológicas observadas nos subtipos do osteossarcoma da forma central
SUBTIPOS CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS
Osteoblástico Constituído por osteoblastos anaplásicos, volumosos e células fusiformes com
citoplasma basofílico, núcleos hipercromáticos e excêntricos. De acordo com
as variações na quantidade de osteoide são subclassificados em: produtivos,
com células tumorais com quantidade abundante de matriz osteoide tumoral
dispostas em trabéculas conferindo um padrão entrelaçado com células
neoplásicas; pouco produtivos, com lesões ósseas líticas e discreta quantidade
de osteoide tumoral em permeio às células osteoblásticas atípicas com o padrão
acima descrito.
Condroblástico Possui células tumorais condroblásticas e produz matriz condroide em
abundância, além de osteóide tumoral, dispostas lado-a-lado ou entremeando-
se.
Fibroblástico Apresenta predomínio de células tumorais fusiformes e, à medida que a lesão
evolui, extensas áreas de matriz osteoide envolvendo aglomerados de células
tumorais.
Do tipo células
gigantes
Exibe escassa produção de matriz óssea e predomínio de grandes áreas
contendo inúmeras células gigantes multinucleadas tumorais e presença de
osteoide.
Telangectásico Caracterizado pela presença de canais vasculares de diâmetros variados,
revestidos por células e reduzida quantidade de osteoide.
Indiferenciado ou
anaplásico
Apresenta quantidade mínima de osteoide típico, ausência de espículas ou
trabéculas de osso tumoral, células neoplásicas volumosas e pleomórficas ou
pequenas, semelhantes às células reticulares do estroma da medula óssea.
Misto Produção de matriz óssea maligna com ausência de predomínio celular.
Periostal Exibe formação de nódulos de cartilagem circundados por células fusiformes
com atipias e formação de pouca matriz osteoide e osso tumoral, predominando
padrão cartilaginoso.
Parostal É bem diferenciado, com tecido maligno ósseo, cartilaginoso ou fibroso, ou
ainda, os três padrões no mesmo tumor.
Fonte: Adaptado de MEUTEN40
; BERSANO33
; DALECK et al.31
A osteocalcina é uma proteína de baixo peso molecular, que liga cálcio e localiza-
se no tecido ósseo. Anticorpos monoclonais ou policlonais anti-osteocalcina podem se
depositar nos osteoblastos, possibilitando a utilização desta proteína como marcador de
diferenciação celular no OSC45
.
EMMPRIN/CD147 é uma proteína transmembranar glicosilada que pertence à
família das imunoglobulinas. Promove a aderência, invasão e metástase de células
neoplásicas. Em humanos, é expresso por linhagens de células de OS e a intensidade de
13
marcação está correlacionada com o grau de patogenicidade da neoplasia. Sua expressão
também pode ser usada como um fator prognóstico para estimar a sobrevida dos pacientes46
.
O c-Flip é um homólogo da caspase-protease, com função reguladora da ativação
da caspase-8 e apoptose mediada por CD95. Sua expressão correlaciona-se com a progressão
tumoral e prognóstico desfavorável, especialmente na metástase pulmonar do OS47
.
2.5. Metástase
O desenvolvimento do ponto de metástase inicia-se com a invasão de células do
tumor primário para os tecidos circundantes e penetração na corrente linfática ou sanguínea.
Em seguida, ocorre a liberação dos êmbolos tumorais para a circulação, que podem se alojar
nos capilares ou vasos linfáticos de órgãos distantes. Os clones celulares atípicos iniciam
então a penetração da parede do vaso onde o êmbolo estacionou, infiltram-se no tecido
conjuntivo ao redor e se proliferam no novo ambiente, promovendo a vascularização do novo
sítio do tumor35,43
. O OS caracteriza-se por infiltração local agressiva dos tecidos subjacentes
e disseminação hematógena rápida34
.
A cascata metastática é um processo de múltiplos estágios e cada etapa está sujeita
a uma grande variedade de influências. O não preenchimento de qualquer passo resulta na
falha da colonização de um local distante. As células neoplásicas precisam evitar a detecção e
destruição pelo sistema imunitário e conseguir desenvolver um suprimento vascular para
sobreviver e proliferar. A escolha do local específico para metástases àdistância envolve
interações entre as células tumorais e o microambiente local do sítio secundário30
.
As metástases ocorrem nos pulmões em 80% dos casos e podem ser detectadas
em 11% a 17% de cães acometidos com OS no momento do diagnóstico43,48
. Em humanos, o
local mais comum de metástase também é o pulmão e é possível que 90% dos pacientes já
tenham disseminação microscópica neste órgão no momento do diagnóstico47
. O
desenvolvimento de metástases para pulmões representa a causa mais comum de morte em
pacientes com OS30
.
Focos de metástases podem ser observados, também, no fígado, rim, tecido ósseo,
baço, miocárdio, linfonodos, diafragma, mediastino, medula e intestinos. No entanto, a
ocorrência de metástases cutâneas de OS é um fato considerado de ocorrência
extraordinariamente rara e de patogênese ainda incerta33,49,50
.
14
2.6. Tratamento
Com relação à terapêutica, o tratamento cirúrgico de escolha é a amputação do
membro envolvido35,43
. Para as neoplasias com localização na pelve, a hemipelvectomia
parcial ou total, embora seja um procedimento cirúrgico agressivo, também pode ser realizada
com sucesso. Porém a margem de segurança pode ficar comprometida se o estágio do
comprometimento ósseo estiver avançado. Muitos proprietários se mostram relutantes em
aceitar a indicação da amputação e devem ser informados da habilidade do cão em se adaptar
à nova realidade31
. A amputação irá aliviar a dor, embora não prolongue necessariamente a
vida dos cães, a menos que seja conjugada a um programa agressivo de quimioterapia simples
ou combinada, imunoterapia e radioterapia35,43,45
. O tratamento da lesão primária somente por
amputação ou ressecção do osso doente raramente é curativo, evoluindo para metástase24
.
Pacientes com OS ainda respondem fracamente à quimioterapia intensiva e têm
risco de recidiva local ou metástases à distância27
. Além disso, tratar a metástase continua a
ser um desafio para os oncologistas. Os regimes terapêuticos que visam os tumores primários
podem não ser bem sucedidos no tratamento da metástase7. A análise e compreensão da via
molecular envolvida no processo de formação da metástase, por meio da caracterização
genômica e proteômica, pode auxiliar no desenvolvimento de biomarcadores para detectar a
progressão do osteossarcoma e permitir que as células neoplásicas parem de crescer no
microambiente pulmonar. Ao investigar o procedimento de desenvolvimento da metástase é
possível descobrir os mecanismos de resistência às drogas e desenvolver novas estratégias
terapêuticas para os pacientes47,51
.
A terapia para induzir a remissão do tumor em cães e humanos inclui a
quimioterapia. O principal objetivo é induzir a morte das células neoplásicas, de preferência,
sem atingir as células normais11
. Para o osteossarcoma, os agentes antineoplásicos utilizados
são a cisplatina, a carboplastina ea doxorubicina30,52
.
Em cães, a droga de escolha é a cisplatina que possui o efeito de prolongar
significativamente os intervalos livres da doença e a sobrevida do animal31,32
. Este
antineoplásico pertence ao complexo de coordenação de platina, o qualinibe a síntese do DNA
e possui efeito sinérgico com outros agentes antitumorais. Como efeitos colaterais, são citados
a nefrotoxicidade, ototoxicidade, distúrbios gastrointestinais e mielossupressão10,11
. A dose
recomendada de cisplatina é de 60 a 70 mg/m² de superfície corporal, sendo recomendado
protocolo de diurese salina para minimizar a nefrotoxicidade7,31,32
.
Outra forma de quimioterapia alterna a cisplatina e a doxorrubicina e proporciona
resultados satisfatórios, aumentando a taxa de sobrevida31
. A doxorubicina é um antibiótico
15
da família das antraciclinas, que induz o bloqueio da síntese do DNA e diminui a atividade da
topoisomerase II. A dose utilizada é de 30 mg/m², via intravenosa, a cada duas semanas,
totalizando quatro a seis sessões7,10,11
.
A carboplatina é um análogo da cisplatina e, também, pode ser associada às
drogas acima. É menos nefrotóxica que a cisplatina, com efeitos antimetastáticos
aparentemente semelhantes, porém com toxidez mielossupressora.Pode ser administrada por
via intravenosa, não sendo necessário induzir diurese salina. A dose utilizada é de 30 mg/m²
no dia da amputação, repetida em intervalos de 21 dias, por quatro sessões, desde que não
ocorra nenhum sinal grave de supressão de medula óssea7,11,8
.
Um paciente que for tratado com quimioterapia após a amputação, e que for
vítima de metástases pulmonares, deverá ser submetido metastasectomia seguida de protocolo
de quimioterapia adicional4.
Uma forma de auxiliar na escolha do protocolo de quimioterapia a ser adotado é o
sistema de classificação Huvos. Trata-se de uma estimativa quantitativa da percentagem de
necrose das células tumorais, observadas no tumor após a cirurgia. Os pacientes que
apresentam necrose tumoral, em pelo menos 90% da amostra do tumor ressecado, são
classificados como bons respondedores e têm prognóstico melhor. Pacientes com escores
baixos de necrose são encaminhados a receber protocolos quimioterápicos alternativos e mais
agressivos30
.
A utilização da quimioterapia antes do procedimento cirúrgico tem a vantagem de
proporcionar oportunidade de maior sucesso para ressecção do tumor primário, preservando o
membro afetado30
. O paciente que for tratado com quimioterapia após a amputação, e que for
vítima de metástase pulmonar, deverá ser submetido a metastasectomia seguida de protocolo
de quimioterapia adicional34
.
A resistência à quimioterapia pode estar associada à mutação da proteína p5345
.
Além disso, os resultados da quimioterapia para OS, na presença de metástase, continuam a
ser pouco satisfatórios53
. O atual manejo terapêutico é pouco eficaz e existe a necessidade da
descoberta de novos agentes54
.
A radioterapia pode ocasionar a remissão da dor por longos períodos e o retardo
no crescimento neoplásico, sendo um procedimento indicado em casos em que há
impossibilidade de excisão cirúrgica tumoral. Apesar de existirem casos de OS induzido por
radiação em animais, a combinação entre a radioterapia e a cirurgia pode prolongar a
sobrevida dos pacientes33,34
. A radioterapia local associada à quimioterapia, sem amputação,
pode trazer algum benefício, porém com a diminuição do limiar de dor à neoplasia, o cão
16
recobra o uso normal do membro e fraturas patológicas podem ocorrer na área, além de
osteomielite e evolução para metástases34
. O OS é um tumor ósseo relativamente
radiorresistente39
.
2.7. A busca por novos agentes antineoplásicos
Nos últimos anos, a comunidade científica tem se esforçado para desenvolver
agentes antineoplásicos mais eficazes por meio da descoberta de novos quimioterápicos, a
partir de plantas e outras fontes naturais53
.
O Própolis de abelhas, apresenta atividades antimicrobianas, antioxidante e anti-
inflamatória. Além disso, exerce efeito citotóxico em células de OSC, possuindo, então, um
grande potencial para gerar um novo agente terapêutico52
.
Os bifosfonatos são uma classe de substâncias não hormonais que evitam a perda
da massa óssea. Esta categoria terapêutica tem demonstrado atividades antineoplásicas no OS,
em modelos de camundongos, por meio da inibição da reabsorção mediada pelos osteoclastos
no local do tumor primário. Desta forma, é possível reduzir a lise e a dor óssea37
.
A baicaleína é um flavonoide utilizado na China para o tratamento de diversas
doenças. Pode inibir a proliferação celular, promover a apoptose das células do OS, dificultar
o processo de metástase, aumentar a eficácia e reduzir os efeitos colaterais de outros
quimioterápicos53
.
A survivina é uma proteína com funções de regular a divisão celular e inibir a
apoptose nas células neoplásicas. A inibição da survivina em linhagens de OSCin vitro,
mostrou diminuição do número de células malignas viáveis, aumento da apoptose,
impossibilidade mitótica e maior sensibilidade à ação da terapia utilizando carboplatina e
doxorrubicina44
.
A vitamina D tem um papel importante no desenvolvimento e manutenção dos
ossos. Possui, também, atividade antineoplásica em cultivos celulares de alguns carcinomas
humanos, como diminuição do índice de proliferação e de apoptose. Para o OS, estudos in
vitro sugerem que esta vitamina pode vir a ser um agente terapêutico adicional, melhorando a
resposta à quimioterapia e diminuindo os índices de efeitos adversos55
.
O extrato de mangostão, uma fruta tropical encontrada no sudeste da Ásia, possui
ação antiproliferativa em células de OSC. Ao induzir a apoptose, esse composto promove a
condensação e fragmentação nuclear. O mangostão apresenta, in vitro, características que
favorecem sua utilização terapêutica para o tratamento dessa neoplasia25
.
17
2.8. Prognóstico
Para avaliação do prognóstico, alguns indicadores são muito importantes: raça,
peso corporal, localização da lesão, subtipo histológico do tumor, presença de metástases,
níveis séricos de fosfatase alcalina, graduação do tumor, diâmetro e volume do tumor,
densidade vascular do tumor e grau de necrose tumoral após a quimioterapia45
. A maioria dos
animais com OS do esqueleto axial morrem ou são submetidos à eutanásia por problemas
associados ao tumor primário36
.
O tempo médio de sobrevivência de cães tratados apenas com amputação é de
aproximadamente quatro meses, sendo que para cães tratados com amputação e quimioterapia
a sobrevivência é de aproximadamente um ano. OS localizado na escápula têm prognóstico
desfavorável, havendo relatos de maior sobrevida quando acometem as articulações cárpicas e
társicas34,43
. Tumores primários localizados nas extremidades, principalmente fêmur, têm
maior atividade proliferativa quando comparados aos tumores originários em outros sítios39
.
A ocorrência de metástases cutâneas de OS em animais da espécie canina é um
fator agravante para o prognóstico desta enfermidade56
. Outro fator que torna o prognóstico
desfavorável é a atividade sérica elevada de fosfatase alcalina, funcionando como um possível
indicador de metástase e advertindo um tempo de sobrevida mais curto32
.
A combinação de agentes na quimioterapia e o avanço nas técnicas cirúrgicas
ortopédicas vêm aumentando a taxa de sobrevida em humanos. Pacientes com OS primário,
sem focos de metástase da doença na apresentação clínica, têm chance de 60% a 70% de
cinco anos de sobrevida livre de recidiva27,30,38
. A principal razão para a baixa taxa de
sobrevivência é o fato da evolução para metástase. Pacientes com metástases têm prognóstico
desfavorável, com taxa de sobrevivência entre 10% e 30% em longo prazo30,51
.
2.9.Utilização de modelos animais para o estudo do osteossarcoma
A utilização de modelos animais para o câncer humano tem evoluído na tentativa
de captar a complexidade das doenças. Enquanto os roedores se destacam como o grupo de
animais mais utilizado, há um crescente emprego do uso de cães, pois têm apresentado êxito
nas pesquisas comparativas de determinados tipos de câncer humano, tais como o OS e o
câncer de próstata57,58
.
O sistema experimental para o osteossarcoma humano inclui ratos, camundongos
e cães. Cada exemplar oferece vantagens únicas. Modelos que utilizam ratos possuem papel
importante na avaliação cirúrgica e nos métodos moleculares de tratamento para OS
apendicular. São usados para estudar a biologia do tumor e desenvolver novas abordagens
18
para o tratamento. A gestação dos ratos é de curta duração, o que faz com que o estudo em
diversas gerações seja relativamente rápido e barato, em comparação com outros mamíferos.
Exemplares de camundongos são utilizados para o estudo de tumores primários, progressão de
metástase e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Estes animais replicam muitas
características do OSH, no entanto, o comportamento biológico observado difere dos aspectos
da doença no homem. Uma das características que proporciona limitações é a ocorrência
espontânea dos tumores em seres humanos e a necessidade de indução na maioria dos
modelos de ratos e camundongos30,57
.
Dos animais de companhia, o cão é o que possui apresentação clínica, biológica,
complicações e resultados com maior semelhança ao OSH. Além da histologia do tumor
primário e o padrão de propagação de metástases, existe analogia na capacidade de resposta a
drogas, tais como a cisplatina e as antraciclinas. Isto faz do cão um modelo para o
desenvolvimento de novos agentes para o tratamento do OS. Por este motivo, os ensaios
clínicos realizados por instituições individuais e estudos multicêntricos são preferencialmente
conduzidos em cães com OS. As pesquisas possuem a intenção de integrar planos de
desenvolvimento de tratamentos comuns à espécie humana, com empresas
farmacêuticas30,37,58,59
.
Outra semelhança diz respeito à β catenina, que é expressa no citoplasma das
células neoplásicas no OSC e OSH59
. As anomalias citogenéticas do OS são parecidas entre
estas espécies, o que reforça o papel do cão como um modelo comparativo válido para o
osteossarcoma humano. Existe, também, um interesse crescente na disciplina oncologia
comparativa, que integra o estudo da ocorrência natural, biologia e terapia de neoplasias em
animais e humanos. Além disso, o estudo das neoplasias em diferentes raças de cães fornece
um contexto de diversidade genética, ausente em estudos com animais delaboratório. Os cães
têm a maior diversidade fenotípica e o maior número de doenças conhecidas, de ocorrência
espontânea, de todos os mamíferos terrestres38,57,58
.
3. β Lapachona
O Brasil possui uma flora rica em diversidade biológica. O bioma cerrado contém
plantas tropicais medicinais com potencial para o desenvolvimento de quimioterápicos com
propriedades analgésicas, tranquilizantes, diuréticas, laxativas, antimicrobianas e
antineoplásicas60
.
19
Nas plantas da família Bignoniacea, Tabebuia avellanedae; T. serratifolia; T.
heptaphyla; Zeyhera digitalis; Z. tuberculosa, são encontrados lignanas, flavonoides,
monoterpenos, triterpenos, ácidos cinâmicos, benzoicos e naftoquinonas61,62
. Localizadas na
Mata Atlântica, a Tabebuia. alba, T. chrysotricha e T. vellosoi são espécies de ipê-amarelo. A
T. ochracea é encontrada no cerrado e também é uma espécie de ipê amarelo (Figura 3). O
ipê-branco é a T. roseoalba e o ipê-roxo compreende as espécies T. heptaphylla, T.
avellanedae e T. impetiginosa63,64
. Com a designação de ipê, existem aproximadamente 46
tipos de madeiras no Brasil. Em tupi-guarani, ipê significa "árvore de casca grossa" e tabebuia
denota "madeira que flutua"9,65
.
Desde o Império Inca no século XIII, por meio do conhecimento popular, o chá da
casca do ipê é utilizado na Argentina, México, Estados Unidos e no Brasil para tratamento de
diarreia, infecções respiratórias, infecções do trato urinário, anemia, febre, alergias, artrite,
infecções bacterianas, cândida, gripe, infecções fúngicas, leucemia, doenças hepáticas,
parasitas, ulcerações cutâneas, asma, colite, cistite, gastrite e gengivite65,66
. No século XIX,
iniciou-se o interesse da comunidade científica para plantas da espécie ipê. Até a década de
1970, a substância também se destacava pela ação antineoplásica. Nessa época, o Instituto
Nacional do Câncer Norte-Americano (NCI: Nacional Cancer Institute) entendeu que a dose
imprescindível para sua utilização no paciente oncológico gerava efeitos adversos
indesejáveis e as pesquisas foram suspensas67
.
FIGURA 3- Imagem de uma espécie de ipê-amarelo, Tabebuia
ochracea, localizada à margem da Alameda Marginal
Botafogo, Goiânia-GO.
20
Após apresentar bom índice terapêutico quando comparado a outros agentes
neoplásicos, uma série de trabalhos científicos e inúmeros estudos farmacológicos passaram a
serrelatados65,68,69
. A bioquímica das suas atividades enzimáticas fez com que a mesma se
enquadrasse nas pesquisas sobre antineoplásicos com maior seletividade70
. Atualmente, as
quinonas são compostos orgânicos presentes em muitas classes de medicamentos. Muitas
quinonas estão aprovadas para consumo e outras estão em processo de avaliação em ensaios
clínicos71
. O mecanismo de citotoxicidade desses compostos está relacionado com a
estimulação do estresse e alquilação das proteínas e ácidos nucleicos72
.
Os compostos derivados das quinonas, de acordo com o sítio de redução e
conjugação, são benzoquinonas, naftoquinonas e antraquinonas. As naftoquinonas estão
presentes em várias famílias de plantas, reagem com o oxigênio molecular, geram espécies
reativas como peróxidos e superóxidos e podem reagir diretamente com DNA, lipídios e
proteínas72,73,74
. Apresentam função antitumoral68
, bactericida75
, antimalárica76
, inibidora do
HIV-177
, moluscicida78
, contra o fungo Fusarium oxysporum79
, contra a leishmaniose72
e
contra larvas do Aedes aegypti80
. Os derivados das naftoquinonas apresentam potencial
citotóxico e genotóxico, devido ao fato de interagir com as biomoléculas e interferir na ação
das enzimas celulares envolvidas no processo de proliferação celular81
.
O lapachol (LP), (2-hidroxi-3-(3-metil-butenil)-nafto-1,4-diona),é uma
naftoquinona (Figura 4) com diversas propriedades biológicas e sem efeitos secundários
graves82,83
. É isolado da serragem da madeira das Tabebuia sp. por meio de extração simples,
com bom rendimento. Ele também pode ser encontrado nas famílias Verbenaceae,
Proteaceae, Leguminosae, Sapotaceae, Scrophulariaceae e Malvaceae72
. O lapachol é
abundante na natureza e, por isso, existe o interesse no desenvolvimento de substâncias
biologicamente ativas por meio da manipulação eficiente dessa substância84
.
Sua extração baseia-se na natureza química da substância. Por ser um ácido fraco,
ao reagir com carbonato de sódio, forma um sal solúvel em água. Após uma filtração simples,
para separar os resíduos sólidos, o lapachol é regenerado ao reagir com o ácido clorídrico. Um
dos meios utilizados para a identificação do lapachol extraído é a faixa de fusão entre 141ºC e
143ºC, indicando a sua presença no pó obtido85
.
O LP possui amplo espectro de atividades biológicas antibacterianas,
antiplasmódica, antioxidante, tripanocida e antineoplásica. Seus derivados também promovem
ação no tratamento de Pneumocystis, toxoplasmose, malária e HIV84
. Apresenta a capacidade
de induzir o estresse oxidativo na via da enzima P450 redutase, promovendo a cisão do
DNA86
. Assim, por meio da formação de peróxido de hidrogênio, de superóxido e de radical
21
hidroxila, danifica componentes celulares, interferindo na divisão celular, alterando pontos
específicos da evolução morfogênica natural, inviabilizando a célula e induzindo a apoptose87
.
FIGURA 4- Estrutura química do lapachol.
Fonte: Adaptado de Castro et al.72
O LPé capaz de inibir o complexo das topoisomerases, que permite que as funções
de transcrição, reparação, replicação e estruturação do cromossomo ocorram normalmente. A
célula cancerígena não possui o mecanismo de autoavaliação dos cromossomos, responsável
pela escolha de preservar ou interromper o ciclo vital celular, evitando sua própria apoptose.
Ao inibir o complexo topoisomerase-DNA, não deixando as topoisomerases se reconectarem
ao DNA e desfazendo o complexo, ocorre a formação de pontos de checagem no processo da
divisão celular, induzindo a morte das células malignas. Por se multiplicarem com rapidez, as
células neoplásicas se tornam um alvo mais sensível aos inibidores da topoisomerase9.
A utilização do LP promoveu a diminuição da dor em pacientes com tumores no
rim, fígado, próstata, colo uterino e mama62
. No entanto, in vivo, doses elevadas de lapachol
induziram um estado de hipercoagulabilidade indesejável em pacientes com câncer e
promoveram metástase de células de melanoma B16-BL6 no pulmão. Por outro lado, a
administração oral de doses baixas de lapachol suprimiu a metástase do pulmão, sugerindo a
utilização do lapachol como agente antimetastático. No tratamento in vitro, o aumento do
número de nódulos metastáticos no pulmão foi menor que no experimento in vivo, o que pode
indicar que a promoção da metástase ocorre por fatores do hospedeiro e não por efeitos
diretos sobre as células tumorais88
.
22
No final do século XIX foi descrita a conversão de LP em α lapachona e β
lapachona (βLP)89
. As modificações no anel C da βLP são utilizadas como estratégia para
conseguir compostos mais ativos, com índice seletivo apropriado e melhor atividade72
.
A βLP (3,4-dihidro-2, 2-dimetil-2H-nafthol [1,2-b] piran-5,6-diona) foi isolada
em 1882 por meio da extração da serragem do ipê. Sua estrutura química (Figura 5) foi
desvendada em 1896, porém só passou a ser facilmente preparada em 1971. Possui peso
molecular de 243,3 KDa (Dalton-A unidade peso molecular) e ponto de fusão entre 158ºC e
159ºC. É lipofílica e não solúvel em água90
.
FIGURA 5- Estrutura química da β lapachona.
Fonte: Aires et al.98
A βLP possui atividade antibacteriana, antifúngica e antirretroviral. Por meio de
pesquisas, verificou-se que produziu bons resultados no prolongamentoda sobrevivência de
modelos com leucemia, para bloquear a multiplicação do vírus da imunodeficiência humana
(HIV-1), como terapia adjuvante na retinopatia proliferativa e como agente anti-psoriático90
.
Também são descritos resultados sobre a atividade esquistomicida da βLP91
.
O mecanismo de ação da ßLP inclui alquilação de grupos sulfidrila de enzimas,
apoptose e formação de espécies reativas de oxigênio90
. Possui ação inibidora não competitiva
da enzima indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO1), que tem como uma das suas funções a
supressão das células do sistema imune. Também é possível obter sinergismo entre sua ação
citotóxica e os efeitos imunológicos83,92
. Além disso, contribuiu com a perda de peso e
estimulou a oxidação de ácidos graxos em modelos de ratos com esteatose, após indução de
doença hepática alcoólica. A substância promoveu ação no metabolismo lipídico mediada
pela regulação positiva de lipoproteínas e mobilização de lipídios no fígado93
. Do mesmo
23
modo, a administração oral de βLP para camundongos reduziu o depósito de lipídeos no
coração e diminuiu os sintomas de insuficiência cardíaca94
.
O fato de ser inibidora da DNA topoisomerase I, enzima que desempenha
importante papel nos processos de replicação e empacotamento do DNA, desencadeou
estudos sobre sua ação antineoplásica no câncer de próstata, ovário, mama, mieloma, pulmão
e hepatoma90,95
. Nas células cancerígenas, a βLP aciona os mecanismos de apoptose,
autofagia e morte celular por necrose96
. A forma exata pela qual desencadeia a morte celular
permanece desconhecida. No entanto, sabe-se que pode induzir seletivamente a morte de
células neoplásicas em humanos, sem interferir nas células normais97
. Existe ainda a
necessidade de mais estudos para elucidar seu mecanismo de ação, efeitos terapêuticos e
atividades biológicas para o seu desenvolvimento como medicamento para diversas doenças,
inclusive as neoplasias72,98
.
4. Cultivo Celular
O cultivo de células animais teve início no século XIX e evoluiu com os
princípios científicos para uma tecnologia moderna99
. No princípio, houve a cultura primária
de células de rim de macaco e de fibroblastos de embrião de galinha, com a finalidade de
produção de vacina100
.
Em 1960, as células diplódes humanas, cujos cromossomos se organizam em
pares de cromossomos homólogos, passaram a ser utilizadas em cultura de células primárias,
a partir de pulmão fetal humano. As linhas celulares contínuas passaram a ser usadas em
1970. A partir de 1980, o DNA recombinante e os anticorpos monoclonais foram
desenvolvidos 101
. Em fevereiro de 2001, a Comissão Europeia definiu estratégias sobre a
promoção de testes sem a utilização de animais. O emprego da cultura in vitro auxilia nesse
aspecto, já que é possível cultivar células cardíacas, de músculos lisos, endócrinas, epiteliais,
tumorais e do sistema nervoso99
.
Nas últimas décadas, houve um avanço nas tecnologias da biologia celular e
molecular. O meio utilizado para expansão das células passou de soluções salinas para um
conjunto completo de nutrientes. O cultivo passou a ser uma fonte de estudo para os
mecanismos de ação dos genes reguladores do ciclo celular. Isso proporcionou uma evolução
para as áreas que envolvem a virologia, a genética de células somáticas, a endocrinologia, a
24
toxicologia, a farmacologia e a imunologia102
. As técnicas de cultivo de células têm
contribuído para os estudos da genética do câncer103
, sem indução de tumores em animais 99
.
As culturas isoladas de tecidos são primárias. Após a primeira, a cultura passa a
ser em série. As linhagens celulares são culturas em série para obtenção de um único tipo
celular. Após diversos subcultivos, a linhagem celular se torna mais homogênea e com maior
velocidade de crescimento. Os bancos celulares expandem e conservam linhagens celulares,
por meio da criopreservação99
.
As células dependem de uma superfície de cultura para a sua proliferação, no
entanto, a tendência é para a utilização de células em suspensão, por necessitarem de
procedimentos menos complexos. A produção de vacinas utiliza células de superfície
aderente, já o processo de cultura para a geração de células-tronco é feito por meio de
suspensão. É necessário um ambiente estável para que as células mantenham sua expansão e
capacidade de diferenciação celular100
. Para a sobrevivência das células é essencial o
fornecimento de condições como pH entre 7,0 a 7,4; temperatura entre 35ºC a 37ºC;
osmolalidade de 260 mOsm Kg-1
a 320 mOsm Kg-1
; concentrações de oxigênio entre 30 % a
60 % da saturação do ar; e gás carbônico entre 5 % a 10 %99
.
A forma mais simples para expansão das células é a utilização de dispositivos
moldados em poliestireno transparente, como garrafas e placas. A escolha pelo frasco ideal é
feita de acordo com a técnica a ser utilizada, da confluência e densidade celular desejada. Para
a suspensão das células aderentes, métodos mecânicos e enzimas proteolíticas, como a
tripsina, são eficientes. No entanto, as enzimas podem promover degradação das proteínas da
matriz extracelular e, por isso, a exposição à tripsina deve ter o menor tempo possível,
seguida de sua inativação com meio de cultura100
.
O cultivo celular propicia a avaliação de fármacos e agentes antineoplásicos,
pesticidas, cosméticos e aditivos alimentícios. Os testes realizados podem avaliar o efeito
tóxico, a citotoxicidade efetiva, a concentração ideal e o tempo de exposição essencial.
Estoques de células podem ser mantidos congelados com auxílio de agentes crioprotetores,
para manutenção das características da linhagem original. Dessa forma, as células são
mantidas em cultura somente enquanto for necessário99
.
25
5. Objetivos
Com este estudo objetivou-severificar os efeitos intracelulares da β lapachona
sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida, bem como identificar os
mecanismos de ação que possam explicar suas propriedades antiproliferativas.
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34
“A divisão da célula permite nosso crescimento, nossa
adaptação, nossa recuperação e nossa correção como
organismos – numa palavra, permite que vivamos. Quando
distorcida e descontrolada, ela permite que a célula cresça,
desenvolva-se, adapte-se, recupere-se e corrija-se – que
viva à custa da nossa vida. As células cancerosas podem
crescer mais rapidamente, adaptar-se melhor. São versões
mais perfeitas de nós mesmos.”
Siddhartha Mukherjee
35
CAPÍTULO 2 – β LAPACHONA REDUZ A PROLIFERAÇÃO DE
CÉLULAS DE OSTEOSSARCOMA CANINO EM CULTURA
RESUMO
O osteossarcoma é o tumor maligno das células ósseas primitivas com alta incidência em cães
e humanos, principalmente crianças. Um número significativo de pacientes ainda tem pouca
resposta à quimioterapia intensiva e apresenta risco de recidiva local. A necessidade de
medicamentos mais efetivos, com menor consequência adversa, tem gerado esforços para o
desenvolvimento de agentes quimioterápicos compostos por plantas e outras fontes naturais.
O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos citotóxicos da β lapachona, um composto
presente na serragem da madeira do ipê, sobre células de osteossarcoma canino em cultura. A
viabilidade celular e a citotoxicidade foram medidas pela exclusão do azul de tripano. A
concentração que inibe 50% da viabilidade celular(IC50) foi calculada pelo ensaio de redução
do MTT. A capacidade de proliferação celular, após o período de tratamento, foi avaliada pelo
ensaio de sobrevivência clonogênica. O grupo tratado com 0,3μM de β lapachona
apresentoumelhor regressão da viabilidade celular (80,27% / 24h; 47,41% / 48h e 35,19% /
72h) e maior progressão da citotoxicidade (19,73% / 24h; 52,59% / 48h e 64,81% / 72h). O
menor IC50(0,180 μM) ocorreu no grupo tratado por 72 horas. O crescimento celular após o
tratamento foi menor de acordo com o aumento da concentração e tempo de exposição,
apresentando 0,50% de fração de sobrevivência na concentração de 1,0 µM. Não houve
diferença estatística entre as concentrações, para a proliferação celular após o tempo de
exposição à β lapachona. Em conclusão, as células de osteossarcoma canino, após tratamento
com a β lapachona, apresentam baixa viabilidade celular, efeito citotóxico expressivo e uma
reincidência celular pouco significativa, sendo a dosagem de 0,3 μM a mais promissora.
Palavras-chave:lapachol,linhagem D-17, naftoquinona, tabebuia.
36
β LAPACHONE REDUCES CANINE OSTEOSARCOMA CELLS IN VITRO
PROLIFERATION
ABSTRACT
Osteosarcoma is the most diagnosed primary bone cell tumor in dogs and humans. A plethora
of patients still show faint response to intensive chemotherapy and risk local relapse. The
need for more effective drugs with less intense adverse effect has triggered the development
of plant-derived, natural-source chemotherapeutics. This study aimed to verify anti-
proliferative effects of β lapachone, a compound found in the ipe tree woodchucks, on canine
osteosarcoma cells in vitro. Cell viability was measured through MTT reduction and Tripan
Blue assays. Cell proliferation capacity was assessed after treatment period by clonogenic cell
survival assay. The group treated with β lapachone for 72 hours showed the slightest cell
viability, 27,74%, and the most conspicuous citotoxic effect, 64,81%, at 0,3 μM
concentration; littlest IC50, 0,180 μM and also the faintest cell growth - 0,50%- following
treatment with 1,0 µM concentration. No statistical difference for cell proliferation was
verified between concentrations after β lapachone exposure. In conclusion, canine
osteosarcoma cells treated with β lapachone present low cellular viability, marked citotoxic
effect and unremarkable cellular re-incidence. The 0,3 μM concentration is the most
promising for future patient use.
Keywords: D-17 cells, lapachol, naphthoquinone, tabebuia.
37
1. Introdução
Neoplasias ósseas primárias malignas são relativamente comuns em cães, sendo a
mais prevalente o osteossarcoma (OS). Este corresponde a 6% das neoplasias incidentes em
cães, a 80% dos tumores ósseos e está associado a prognóstico reservado1,2,3,4
. Em humanos, é
o principal tumor ósseo maligno, apresentando maior incidência em crianças e adultos jovens,
com frequência de 60% de todas as neoplasias que incidem nas primeiras duas décadas de
vida5,6
.
A terapia para induzir a remissão da neoplasia em cães e humanos inclui o
emprego de cisplatina, carboplastina, doxorubicina e metotrexato7,8
. Os efeitos adversos
refletem em cardiotoxicidade, nefrotoxicidade, ototoxicidade e hepatotoxicidade9,10
. Número
significativo de pacientes com OS ainda respondem pouco à quimioterapia intensiva e têm
risco de recidiva local ou metástases à distância6. Além disso, tratar as metástases continua a
ser um desafio para os oncologistas. Os regimes terapêuticos que visam os tumores primários
podem não ser bem sucedidos no tratamento da metástase8. O atual manejo terapêutico é
pouco eficaz enovos agentes precisam ser descobertos11
.
Nos últimos anos, a comunidade científica tem se esforçado para desenvolver
novos agentes antineoplásicos por meio da descoberta de novos quimioterápicos, da utilização
de plantas e outras fontes naturais10
. O Brasil possui uma flora rica em diversidade biológica,
e particularmente bioma cerrado contém plantas tropicais medicinais com potencial para o
desenvolvimento de quimioterápicos com propriedades analgésicas, tranquilizantes,
diuréticas, laxativas, antibióticas e antineoplásicas12
.
Nas plantas da família bignoniácea - Tabebuia avellanedae; T. serratifolia; T.
heptaphyla; Zeyhera digitalis e Z. tuberculosa - são encontrados flavonoides, lignanas,
monoterpenos, triterpenos, ácidos cinâmicos, benzóicos e naftoquinonas13,14
.Com a
designação de ipê, existem aproximadamente 46 tipos de madeiras no Brasil. Em tupi-guarani,
ipê significa "árvore de casca grossa" e tabebuia denota "madeira que flutua"15,16
.
Os derivados das naftoquinonas apresentam potencial citotóxico e genotóxico por
interagirem com as biomoléculas e interferir na ação das enzimas celulares envolvidas no
processo de proliferação celular17
. O lapachol (LP) é uma naftoquinona com diversas
propriedades biológicas e sem efeitos secundários graves18,19
. No final do século XIX, foi
descrita a conversão do lapachol em α lapachona e β lapachona (βLP)20
. A βLP (3,4-dihidro-
2, 2-dimetil-2H-nafthol [1,2-b] piran-5,6-diona) possui atividade antibacteriana, antifúngica e
antirretroviral. Sabe-se que este composto possui bons resultados no prolongamentoda
38
sobrevivência de modelos com leucemia, no bloqueio a multiplicação do vírus da
imunodeficiência humana (HIV-1), como terapia adjuvante na retinopatia proliferativa e como
agente anti-psoriático e apresenta atividade esquistomicida21,22
.
O fato de ser inibidora da DNA topoisomerase I, enzima que desempenha
importante papel nos processos de replicação e empacotamento do DNA, desencadeou
estudos sobre sua ação antineoplásica da βLP nos cânceres de próstata, ovário, mama, medula
óssea, pulmão e fígado21,23
.
Dos animais de companhia, o cão é o que possui apresentação clínica, biológica,
complicações e resultados com maior semelhança ao osteossarcoma humano. Além das
características histológicas do tumor primário e o padrão de propagação de metástases, existe
analogia na capacidade de resposta a drogas, tais como a cisplatina e as antraciclinas. Isto faz
do cão um modelo experimental para o desenvolvimento de novos agentes para o tratamento
do osteossarcoma. Por este motivo, os ensaios clínicos realizados por instituições individuais
e estudos multicêntricos são preferencialmente conduzidos em cães com OS. As pesquisas
possuem a intenção de integrar planos de desenvolvimento de tratamentos comuns à espécie
humana, com empresas farmacêuticas8,24,25,26
.
O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos citotóxicos da βLP em células de
OSC, uma vez que esta substância possui atividade antitumoral em diversos tipos de
neoplasias. A confirmação de sua ação sobre o OS pode permitir o desenvolvimento de uma
estratégia terapêutica mais eficiente e com menor efeito adverso para o paciente.
2. Material e métodos
2.1. Células e cultura
As células de OSC osteogênico metastático (D-17, BCRJ 0276, Lote 000573,
Passagem 239) foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro (UFRJ – Rio de
Janeiro, Brasil) originárias da ATCC (American Type Culture Collection- Manassas, VA,
USA). As células foram mantidas em incubadora umidificada a 37ºC com uma atmosfera de
5% de CO2. Foram cultivadas em meio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) acrescido de
10% de soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina (10.000 U.I./ml - 10 mg/ml),
anfotericina B e L glutamina (todos os reagentes da Cultilab, Campinas, Brasil), de acordo
com adaptação de YU et al.27
.
39
A βLP foi adquirida da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, EUA). Os
compostos de teste foram dissolvidos em DMSO (Dimetilsulfóxido, Cultilab, Campinas,
Brasil) estocados na concentração de1 mM e armazenadas a -200C.
2.2. Avaliação da viabilidade celular pelo método de exclusão do azul de tripan
A avaliação foi feita por meio de adaptação da técnica usada por Mosman28
e
Peres& Curi29
. Placas de 96 poços foram utilizadas para cultivar as células na concentração de
1x104células/poço por 24 horas em incubadora umidificada a 37
ºC com atmosfera de 5% de
CO2. Os tratamentos com βLP foram feitos com as dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e
grupo controle (GC) negativo por três diferentes períodos para cada concentração, por 24 h
(G24), 48 h (G48) e 72 h (G72). Em seguida, o meio de cada poço foi descartado e as células
foram suspensas com 50 μl de tripsina (Cultilab, Campinas, Brasil), após lavagem com
Phosphate buffered saline (PBS, Cultilab, Campinas, Brasil). A tripsina foi inativada com o
acréscimo de 100 μl de meio DMEM com 10% de soro fetal bovino. O material foi
centrifugado a 130 rcf(g) por 10 minutos, o meio foi novamente descartado e as células
ressuspensas em 100 μl de meio de cultura fresco. Em seguida, 40 μl por poço do volume com
células foram transferidos para eppendorfs contendo 10 μl de azul de tripan (Trypan Blue -
Sigma-Aldrich, St Louis, EUA). Foram instilados 10 μl desse preparado em lâmina para
leitura Luna. A avaliação da viabilidade celular foi feita por meio do leitor Luna automated
cell counter. A citotoxicidade (CT) foi determinada pela seguinte equação:
% CT = 100 - [(abs do tratamento/abs do controle negativo) x 100](equação 1)
na qual, CT é a citotoxicidade; e abs é a absorbância.
Os valores calculados para cada grupo, pelo Teste F, foram comparados ao F
tabelado em 5% (2,2). Para o ensaio foram realizados três experimentos independentes em
triplicata.
2.3.Ensaio da viabilidade celular pelo método de redução do tetrazólio
A técnica realizada foi adaptada de Yuet al.27
. As células foram cultivadas por 24
horas em placas de 96 poços, com concentração de 1x104células/poço, em incubadora
umidificada a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. Os tratamentos com βLP foram feitos com as
dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e grupo controle negativo, por 24 h (G24), 48 h (G48) e 72
h (G72). Ao final do período de tratamento, o meio foi descartado e foi adicionado 10 μl de
tetrazólio (MTT (3-(4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-diphnyl-2H-tetrazólio) em cada poço. As
placas foram incubadas por três horas. Com a finalidade de parar a reação, acrescentou-se 50
40
μl de sodium dodecyl sulfato (SDS – Vivantis Biochemical) a 10% diluído em HCl (0,01N)
por poço e as placas permaneceram incubadas por 24 horas em temperatura ambiente. A
densidade óptica foi quantificada em espectofotômetro (Awareness Technology Ine/ Stat Fax
2100, 425nm). O valor da concentração que inibe 50% da viabilidade celular (Inhibitory
concentration - IC50, em μM) foi determinado utilizando o programa estatístico GraphPad
Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Para o ensaio foram realizados três
experimentos independentes em triplicata.
2.4.Ensaio de sobrevivência clonogênica
O procedimento foi adaptado de Parket al.30
e Cao et al.31
. As células foram
cultivadas por 24 horas em placas de seis poços, com a concentração de 1x106células/poço,
em incubadora umidificada a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. Os tratamentos com βLP foram
feitos com as dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e GC negativo por três diferentes períodos
para cada concentração, G24, G48 e G72. Ao final do tratamento, o meio de cada poço foi
descartado e as células suspensas com 500 μl de tripsina. Decorreu o processo de
centrifugação a 130 rcf(g) por 10 minutos, o meio foi novamente descartado, as células
ressuspensas em 1ml de DMEM e cultivadas em placas de seis poços, em incubadora
umidificada a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2.
Após 10 dias, o meio foi descartado, os poços foram lavados com PBS e as
células fixadas com solução contendo álcool metílico (Impex/Labinpex), ácido acético
(Synth/Labsynth, Diadema, São Paulo, Brasil) e água destilada, na proporção 1:1:8, por 30
minutos. As células foram coradas com 500 μl de Giemsa (Giemsa stain, Sigma-Aldrich, St
Louis, EUA) por poço durante 15 minutos e lavadas com água destilada. Cada poço foi
dividido em nove campos para a quantificação das células em microscópio de luz, tendo sido
efetuada a média dos campos por poço.O cálculo das frações de sobrevivência foi
determinado pela seguinte equação:
% FS = (número de CCAT/número de CCGC) x 100 (equação 2)
na qual FS é a fração de sobrevivência; CCAT é o número de células contadas
após tratamento e CCGC é o número de células contadas no grupo controle.
Os dados foram representados por meio de gráficos e a análise estatística foi
efetivada utilizando o Teste F. Para o ensaio, foram realizados três experimentos
independentes em triplicata.
41
3. Resultados e discussão
A citotoxicidade foi medida utilizando o ensaio de viabilidade celular pelo
método de exclusão do corante azul de tripan, no qual as células viáveis não permitiram a
passagem do corante pelas suas membranas íntegras. O mesmo não ocorreu com as células
mortas, onde as membranas danificadas permitiram que o tripano penetrasse no meio
intracelular, corando-o de azul.Após análise dos relatórios da contagem celular por poço
tratado, foi estabelecida (Tabela 1) a média da VC e o cálculo da CT de cada grupo por
concentração e tempo de exposição à βLP (Figura 1).
TABELA 1 - Viabilidade celular (VC) e citotoxicidade (CT) de cada grupo por concentração
e tempo de exposição à βLP, pelo método de exclusão do corante azul de
tripan.
TEMPO DE EXPOSIÇÃO
TRATAMENTO
24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS
% VC % CT % VC % CT % VC %CT
0,1 μM 68,03 31,97 62,58 37,42 58,97 41,03
0,3 μM 80,27A
19,73B
47,41A
52,59B
35,19A
64,81B
1,0 µM 68,79 31,21 60,13 39,87 51,84 48,16
CONTROLE 92,99 - 90,03 - 96,78 -
A = melhor regressão da viabilidade celular.
B = melhor progressão da citotoxicidade.
O G72 com tratamento de 0,3 µM apresentou menor viabilidade celular. Já o G24
com tratamento de 0,3 µM apresentou maior viabilidade celular. Todos os grupos
apresentaram CT, o que demonstra que a βLP é citotóxica para as células de OS. Os valores
calculados para cada grupo, pelo Teste F, foram comparados ao F tabelado 5% (2,2). Na
dosagem de 0,1 µM não houve diferença estatística entre os tempos de exposição à βLP. A
diferença estatística ocorreu nos grupos que foram tratados com 0,3 µM, concentração que
apresentou a melhor regressão da viabilidade celular e melhor progressão da citotoxicidade,
por tempo de exposição. A VC diminuiu de 80,27% no G24 para 47,41% no G48 e, em
sequência, para 35,19% no G72. Da mesma forma, a citotoxicidade subiu de 19,73% no G24
para 52,59% no G48 e chegou a 64,81% no G72. Corroborando os resultados de Aireset al.22
,
segundo o qual a βLP possui atividade citotóxica em diversas células de tumores humanos.
De modo diferente ao encontrado na presente pesquisa, a viabilidade de células de
OS apresentou diminuição dose-dependente quando tratadas com α mangostin, substância
extraída do mangostão, fruta tropical encontrada no sudeste da Ásia4. Similarmente,
42
Cinegagliaet al.7 descreveram que as células de OS foram sensíveis ao efeito citotóxico dose-
dependente em concentrações entre 50 µg a 100 µg da própolis, um produto coletado
deexsudatos de plantas misturado com cera e enzimas da saliva das abelhas. Por outro lado, a
carboplatina não apresentou atividade citotóxica em células de OSC nos ensaios feitos por
Steimet al.24
e em células de OS no estudo de Robson et al.32
.
A concentração 0,3 µM é expressivamente menor que as concentrações letais
utilizadas nas primeiras pesquisas sobre a βLP para diferentes células em cultivo, que
variavam entre 1,0 μM e 30,0 μM33
. Diferiu tambémdo relato de Pardeeet al.21
, no qual a βLP,
em dose de 2,0 μM a 10 μM, apresentou letalidade contra várias células tumorais em cultivo
e retardou o crescimento de células de tumor de próstata, mama e ovário in vivo.
FIGURA 1 - Ensaio da Viabilidade celular pelo método de
exclusão do Azul de Tripan. A) Média da
Viabilidade celular de cada grupo por
concentração e tempo de exposição à βeta
Lapachona. B) Cálculo da Citotoxicidade de cada
grupo por concentração e tempo de exposição à
βeta Lapachona. Análise por contador celular
automatizado LunaTM
.
43
A medida da eficácia da βLP foi fornecida por meio do cálculo do IC50, feito pelo
programa estatístico GraphPad Prism. Os resultados indicaram que a concentração necessária
para 50% de inibição in vitro em G24foi 0,959 μM, em G48foi 1,657 μM e em G72foi 0,180
μM.
A variação nos valores de IC50 pode ser atribuída à sensibilidade aos efeitos da
substância nos diferentes tempos de exposição e ao metabolismo da droga. As baixas
concentrações encontradas pelo IC50 no presente estudo podem ser sugestivas de menores
efeitos adversos ao paciente que o de células de OS tratadas com concentrações entre 50 μM e
100 μM de baicaleína, substância utilizada em tratamentos populares na China10
.
A média do número de células de OSC, verificada após o período de incubação do
ensaio de sobrevivência clonogênica, revelou diminuiçãodose dependente nos grupos G24(5
células/0,1μM; 3 células/0,3μM e 0,55 célula/1μM), G48 (1,33 células/campo/0,1μM; 0,88
células/campo/0,3μM e 0,33 célula/campo/1,0 μM) e G72(1,22 células/campo/0,1μM; 0,22
célula/campo/0,3 μM e 0,11 célula/campo/1,0 μM). Quanto maior foi a concentração e o
tempo de exposição, menor foi a sobrevivência clonogênica. Foi possível perceber que no GC
(56 células/campo/24 horas; 24,66células/campo/48 horas e 41,22células/campo/72 horas)
houve crescimento celular compatível com a ausência do tratamento pela βLP. A diminuição
do número de células com o período de tratamento neste grupo, provavelmente se deve ao
fato da restrição com relação ao tempo de exposição e o espaço para o crescimento.
O cálculo das frações de sobrevivência (Figura 2) foi feito para comparar o
número de células encontradas nos grupos tratados com o número de células observadas no
GC. Observou-se que o crescimento celular após o tratamento foi menor (0,50%) no G72 com
a concentração de 1,0 µM e maior (13,93%) no G24 com a concentração de 0,3 µM. Os dados
sugerem que, após o tratamento com a βLP, houve retomada pouco significativa do
crescimento celular. O ensaio de sobrevivência clonogênica é importante para analisar a
capacidade proliferativa das células após a exposição a um determinado agente
antiproliferativo34
.
Os resultados obtidos em relação à proliferação celular sugerem possível efeito da
βLP no combate à recidivas, como o já observado em modelos de xenoenxerto de câncer de
mama em camundongos tratados com β lapachona; os animais mantiveram-se sadios por 200
dias após o final do tratamento e foram considerados curados31
. Por outro lado, é importante
analisar esse efeito por prazos mais longos em futuras pesquisas, pois a utilização de agentes
citotóxicos e inibidores de transdução de sinal pode promover eliminação das células
44
cancerosas em curto prazo, porém a reincidência das células residuais pode ocorrer com
resistência ao medicamento35
. Nesse sentido, um problema relatado no caso do OSé a
possibilidade de recidiva local com a utilização dos tratamentos convencionais, como
analgésicos, terapia de radiação, cirurgia e quimioterapia4.
FIGURA 2 - Fração de sobrevivência de cada grupo por concentração e tempo
de exposição à βeta Lapachona. Nos grupos de 48 e 72 horas, o
padrão observado de redução foi similar.
Para testar a probabilidade das variâncias serem significativamente diferentes, os
resultados das FS foram analisados pelo Teste F (Tabela 2).
TABELA 2 - Medidas de variação entre os grupos de tratamento com diferentes concentrações e
tempo de exposição à β lapachona. TRATAMENTO
PARÂMETROS
24 h
0,1µM 0,3µM1,0µM
48 h
0,1µM0,3µM 1,0µM
72 h
0,1µM0,3µM 1,0µM
X 5,70 13,93 4,66 5,17 2,82 1,69 4,74 0,64 0,50
S2
8,37 41,74 12,38 0,63 1,84 0,03 3,15 0,10 0,09
S 2,89 6,46 3,51 0,79 1,35 0,16 1,77 0,32 0,31
Onde X = média; S2 = variância; S = desvio padrão; h = hora
Os valores calculados para cada grupo por meio do Teste F foram comparados ao
F tabelado5% (2,2)=19. Conclui-se que não houve diferença estatística para o crescimento
45
celular entre as diferentes concentrações e tempos de exposição à βLP. Isto pode indicar que,
mesmo com baixa concentração e curto intervalo de tempo de exposição, o crescimento
celular após o tratamento foi mínimo. De forma semelhante, Kunget al.23
relataram um
pequeno percentual de sobrevivência das células de câncer de pulmão, ao utilizarem
concentrações entre 1,0 µM e 5,0 µM de βLP.
Este estudo é o primeiro a avaliar os efeitos antiproliferativos da βLP como
tratamento para células de OSCin vitro, demonstrando que o composto efetivamente
apresentou atividade antiproliferativa e efeito citotóxico sobre o tipo celular testado. A
dosagem de 0,3 μM mostrou ser a mais promissora, sugerindo que, em baixa concentração, é
possível obter a ação terapêutica desejada, associada à possibilidade de menores efeitos
adversos. Os resultados desta pesquisa apontam para novos caminhos, como a observação
deste tratamento em xenoenxertos em camundongos por períodos mais longos.
4. Conclusão
A β lapachona possui efeitos citotóxicos em células de osteossarcoma canino.
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49
“Crescimento maligno e crescimento normal são tão
entrelaçados geneticamente que separá-los pode ser o
desafio científico mais importante que nossa espécie tem
diante de si. O câncer está incrustado no nosso genoma: os
genes que desencadeiam a divisão normal das células não
são estranhos ao nosso corpo, mas versões mutantes e
distorcidas dos mesmos genes que desempenham funções
celulares vitais.”
Siddartha Mukherjee
50
CAPÍTULO 3 – β LAPACHONA BLOQUEIA O CICLO CELULAR E
INDUZ APOPTOSE EM CÉLULAS DE OSTEOSSARCOMA CANINO
RESUMO
O osteossarcoma é uma das mais frequentes neoplasias ósseas malignas. Caracteriza-se por
infiltração local agressiva dos tecidos subjacentes e disseminação hematógena rápida. A β
lapachona é derivada das naftoquinonas e apresenta potencial citotóxico e genotóxico, devido
ao fato de interagir com as biomoléculas e interferir na ação das enzimas celulares envolvidas
no processo de proliferação celular. Para determinar a ação da β lapachona no processo da
morte celular em linhagem de osteossarcoma canino, foi realizada a avaliação de apoptose e
necrose, o ensaio potencial de membrana mitocondrial e a cinética do ciclo celular. A
apoptose inicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos os grupos, tendo sido
menor no grupo de 24 horas tratado com 0,1 μM (4,26 %) e maior no grupo de 72 horas
tratado com 1,0 μM (85,89 %). A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose
dependente, indicando a ocorrência de apoptose intrínseca. A inibição do crescimento das
células ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 conforme o tempo de exposição.
Palavras-chave: lapachol,linhagem D-17, ipê, tabebuia.
51
β LAPACHONE BLOCKS THE CELL CYCLE AND
INDUCESAPOPTOSIS IN CANINE OSTEOSARCOMA CELLS
ABSTRACT
Osteosarcoma is one of the most frequent malignant bone tumors. It is characterized by
aggressive local infiltration of the subjacent tissue and fast hematogenous dissemination. β
lapachone derives from naphthoquinones and bears cytotoxic and genotoxic potential, due to
interacting with biomolecules and interfering in enzymes involved in cell proliferation. In
order to determine β lapachone role in canine osteosarcoma cells death, apoptosis and
necrosis evaluation, mitochondrial membrane potential assay and cell cycle kinetics were
performed. Early apoptosis was the most frequent type of cell death considering all groups. It
was less frequent in the 24-hour group treated with 0,1 μM (4,26 %) and more frequent in the
72-hour group treated with 1,0 μM (85,89 %). Mitochondrial depolarization was dose-
dependent. Cell growth inhibition was carried out through cycle block at G0/G1 phase,
according to exposure time.
Keywords: D-17 cells, lapachol, naphthoquinone, tabebuia.
52
1. Introdução
O osteossarcoma é um tumor heterogêneo, com padrões histológicos distintos,
constituído por vários tipos celulares que são originados de uma única célula mesenquimal
pluripotente ou de osteoblastos imaturos. É uma das mais frequentes neoplasias ósseas
malignas. Pertence ao grupo de tumores primitivos que produz tecido ósseo, sendo conhecido
também como sarcoma osteogênico ou sarcoma osteoblástico1,2
.
Esta neoplasia caracteriza-se por infiltração local agressiva dos tecidos
subjacentes e disseminação hematógena rápida3. A principal razão para a baixa taxa de
sobrevivência dos pacientes com osteossarcoma é a evolução para metástase. Pacientes com
metástases têm prognóstico desfavorável, com taxa de sobrevivência em longo prazo entre
10% e 30%. A combinação de agentes na quimioterapia e o avanço nas técnicas cirúrgicas
ortopédicas vêm aumentando a taxa de sobrevida4,5,6,7
.
A β lapachona (3,4-dihidro-2, 2-dimetil-2H-nafthol [1,2-b] piran-5,6-diona) foi
isolada em 1882 por meio da extração da serragem do ipê (Tabebuia sp) e possui diversas
propriedades biológicas8,9
. É derivada das naftoquinonas e apresenta potencial citotóxico e
genotóxico, devido ao fato de interagir com as biomoléculas e interferir na ação das enzimas
celulares envolvidas no processo de proliferação celular10
. Possui também a capacidade de
induzir o estresse oxidativo na via da enzima P450 redutase, promovendo a cisão do DNA11
.
Dessa forma, por meio da formação de peróxido de hidrogênio, de superóxido e de radical
hidroxila, danifica componentes celulares, interferindo na divisão celular, alterando pontos
específicos da evolução morfogênica natural, inviabilizando a célula e induzindo a morte
celular12
.
Trata-se de substância com a capacidade de inibir o complexo das topoisomerases,
que permite que as funções de transcrição, reparação, replicação e estruturação do
cromossomo ocorram normalmente. Ao inibir o complexo, não deixando as topoisomerases se
reconectarem ao DNA, ocorre ativação de pontos de checagem no processo da divisão celular,
induzindo a morte das células malignas. Por se multiplicarem com rapidez, as células
neoplásicas se tornam um alvo mais sensível aos inibidores da topoisomerase13
. Nas células
cancerígenas, a β lapachona pode acionar os mecanismos de apoptose, autofagia e morte
celular por necrose14
. A forma exata pela qual desencadeia a morte celular permanece
desconhecida. No entanto, sabe-se que pode induzir seletivamente a morte de células
neoplásicas em humanos, sem interferir nas células normais15
.
53
Neste estudo, buscou-se determinar os efeitos da β lapachona na progressão do
ciclo celular e processo da morte celular em linhagem de osteossarcoma canino, com vistas à
sua possível utilização terapêutica em pacientes caninos e humanos.
2. Material e métodos
2.1.Células e cultura
As células de OSC (D-17, BCRJ 0276, Lote 000573, Passagem 239) foram
adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro (UFRJ – Rio de Janeiro, Brasil) originárias
da ATCC (American Type Culture Collection- Manassas, VA, USA). As células foram
mantidas em incubadora umidificada a 37ºC com uma atmosfera de 5% de CO2. Foram
cultivadas em meio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) acrescido de 10% de soro fetal
bovino, penicilina e estreptomicina (10.000 U.I./ml - 10 mg/ml), anfotericina B e L glutamina
(todos os reagentes da Cultilab, Campinas, Brasil), de acordo com adaptação de YU et al.16
A βLP foi adquirida da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, EUA). Os
compostos de teste foram dissolvidos em DMSO (Dimetilsulfóxido, Cultilab) e as soluções de
estoque foram preparadas com 1 mM e armazenadas a -20ºC.
2.2.Ensaio de dupla marcação com anexina v-fitc e iodeto de propídio
O procedimento foi adaptado de Yuet al.16
e Park et al.14
. As células foram
cultivadas em placas de 12 poços, na concentração de 5x105células/poço, em incubadora
umidificada a 370C, com uma atmosfera de 5% de CO2. Os tratamentos com β lapachona
foram feitos com as dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e grupo controle negativo por 24 h
(G24), 48 h (G48) e 72 h (G72). Para o grupo controle positivo, foram utilizados 7 μl de
peróxido de hidrogênio (Proquímios, Rio de Janeiro, Brasil) a 1 %. Em seguida, o meio de
cada poço foi descartado e as células foram suspensas com 300 μl de tripsina (Cultilab,
Campinas, Brasil), após lavagem com PBS (Cultilab). A tripsina foi inativada com o
acréscimo de 700 μl de meio fresco. O material foi centrifugado a 130 rcf(g) por 10 minutos e
o meio foi novamente descartado. Adicionaram-se 400 μl de tampão de ligação, 5,0 μl de
54
anexina V-FITC e 1,0 μl de iodeto de propídio (Annexin V Apoptosis Detection Kit I - BD
Biosciences, San Diego, USA). O material permaneceu incubado, em temperatura ambiente
por 15 minutos e foi analisado em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences). As
células marcadas somente pela anexina V foram classificadas como em apoptose inicial. As
células marcadas pela anexina V e iodeto de propídio foram classificadas como em apoptose
tardia. As células marcadas somente pelo iodeto de propídio foram classificadas em necrose.
As células que não apresentaram nenhuma marcação foram consideradas como viáveis. Os
dados foram transferidos para o programa de gráficos estatísticos GraphPad Prism. A análise
dos dados, segundo a classificação do fator coluna, estimou os valores individuais das células
viáveis, apoptose inicial, apoptose tardia e necrose. A análise dos dados, segundo a
classificação do fator linha, comparou os valores encontrados em cada concentração.
Para o ensaio foram realizados três experimentos independentes em triplicata.
2.3.Ensaio potencial de membrana mitocondrial jc-1
O procedimento ocorreu adaptado de Yuet al.16
. As células foram cultivadas por
24 horas em placas de doze poços, com a concentração de 5x105 células/poço, em incubadora
umidificada a 37oC, com atmosfera de 5% de CO2. Os tratamentos com β lapachona foram
feitos com as dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e grupo controle negativo por 24 h. Ao final
do período de tratamento, o meio de cada poço foi descartado e as células foram suspensas
com 300 μl de tripsina (Cultilab). Após centrifugação a 130 rcf(g) por 10 minutos, o meio foi
novamente descartado e as células ressuspensas em 700 μl de meio fresco. As células foram
incubadas com o corante JC-1 por 15 minutos a 37ºC. Em seguida, foram centrifugadas,
ressuspensas em 1000 μl de solução tampão, centrifugadas, ressuspensas em 500 μl de
solução tampão, centrifugadas e ressuspensas em PBS. Ao final desse período, as células
foram lavadas com PBS eressuspensas em tampão de ensaio. Os resultados foram obtidos por
meio do citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences) e analisados pelo programa de
gráficos estatísticos GraphPad Prism. A análise dos dados, segundo a classificação do fator
coluna, estimou os valores individuais das células viáveis e apoptose. A análise dos dados,
segundo a classificação do fator linha, comparou os valores encontrados em cada
concentração.
Para o ensaio foram realizados três experimentos independentes em triplicata.
55
2.4.Análise da cinética do ciclo celular
A avaliação foi feita utilizando placas de 12 poços com células na concentração de
5x105 células/poço, em incubadora umidificada, a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. Os
tratamentos com βLP foram feitos com as dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e grupo
controle negativo por 24 h, 48 h e 72 h. Para o grupo controle positivo, foram utilizados 7 μl
de peróxido de hidrogênio (Proquímios, Rio de Janeiro, Brasil) a 1 %. Em seguida, o meio de
cada poço foi descartado e as células foram suspensas com 300 μl de tripsina (Cultilab,
Campinas, Brasil), após lavagem com PBS (Cultilab). A tripsina foi inativada com o
acréscimo de 700 μl de meio fresco. O material foi centrifugado a 130 rcf(g) por 5 minutos, o
meio foi novamente descartado e as células incubadas por 24 horas a -20ºC em 1 ml de álcool
etílico a 70 % armazenado previamente à temperatura de 4ºC. Após esse período, o material
foi novamente centrifugado e o álcool descartado. O material foi incubado em uma solução
contendo ribonuclease A (Ribonuclease A from Bovine Pancreas, Sigma Aldrich, St Louis,
USA) 0,05 %, em banho maria a 37ºC por 30 minutos. Houve nova centrifugação, a
ribonuclease foi descartada, as células foram ressuspensas em 290 μl de PBS e foi acrescido
50 μg.ml-1
de iodeto de propídio. A porcentagem de células em G1, S, G2 e sub-G1 foi
analisada em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences) e analisados pelo programa
de gráficos estatísticos GraphPad Prism. A análise dos dados, segundo a classificação do fator
coluna, estimou os valores individuais das células encontradas em cada fase do ciclo celular.
A análise dos dados, segundo a classificação do fator linha, comparou os valores encontrados
em cada concentração.
Para o ensaio foram realizados três experimentos independentes em triplicata.
3. Resultados e discussão
Para distinguir o mecanismo de morte celular promovido pela β lapachona nas
células de osteossarcoma canino, realizou-se o ensaio de dupla marcação com anexina V e
iodeto de propídio. As células em apoptose inicial foram marcadas somente pela anexina V.
As células em apoptose tardia foram marcadas pela anexina V e iodeto de propídio. As células
em necrose foram marcadas somente pelo iodeto de propídio. As células viáveis não
apresentaram nenhuma marcação (Figura 1).
56
FIGURA 1 – Imagens representativas de amostras da análise do mecanismo de morte celular
promovido pela β lapachona nas células de osteossarcoma canino, por meio do
ensaio de dupla marcação com anexina V (eixo X) e iodeto de propídio (eixo Y).
A) 0,1 μM/24h. B) 0,3 μM/24h. C) 1,0 μM/24h. D) 0,1 μM/48h. E) 0,3 μM/48h.
F) 1,0 μM/48h. G) 0,1 μM/72h. H) 0,3 μM/72h. I) 1,0 μM/72h. Onde N = morte
celular por necrose, AT = apoptose tardia, CV = células viáveis e AI = apoptose
inicial. Citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences).
Houve prevalência da apoptose inicial em todas as concentrações do G48 e G72. A
apoptose tardia foi maior na concentração de 1,0 μM do G24. A concentração de 1,0μM
apresentou maior índice de apoptose nos três tempos de exposição. Os dados fornecidos pelo
citômetro de fluxo, sobre o mecanismo de morte celular, encontram-se na Tabela 1.
57
TABELA 1 - Média dos dados fornecidos pelo citômetro de fluxo sobre o mecanismo de morte
celular promovido pela β lapachona em células de osteossarcoma canino. TT C CV AI AT N
24h CN 87,49 4,26 2,43 5,81
0,1μM 75,35 19,02 2,02 3,42
0,3 μM 79,79 9,99 4,40 5,82
1,0 μM
3,27 29,49 49,97 14,54
48h CN 83,66 6,36 3,73 6,58
0,1μM 27,30 5,22 3,39 2,87
0,3μM 56,56 25,26 9,29 8,88
1,0μM
6,58 80,06 12,58 0,77
72h CN 75,33 14,57 4,56 5,55
0,1μM 86,44 5,12 4,76 3,68
0,3μM 27,96 54,81 9,99 7,23
1,0μM
5,08 85,89 8,93 0,09
TT: tempo de tratamento; C: concentração; CV: células viáveis; AI: apoptose inicial; AT:
apoptose tardia; N: necrose; h: horas; CN: controle negativo.
Os valores encontrados foram avaliados pelo programa de gráficos estatísticos
GraphPad Prism, por meio do método ANOVA bidirecional.Não houve diferença estatística
significativa entre os valores das repetições e triplicatas em cada concentração (p=1,000). A
apoptose inicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos os grupos. No entanto,
houve diferença estatísticasignificativa entre os resultados encontrados nas concentrações
utilizadas em cada grupo de tratamento (p<0,0001). A apoptose inicial ocorreu de forma dose
dependente (Figura 2). Foi menor no grupo de 48 horas tratado com 0,1 μM de β lapachona
(5,22%) e maior no grupo de 72 horas tratado com 1,0 μM de β lapachona (85,89%).
Estes resultados indicam que a redução da viabilidade das células de
osteossarcoma canino, após tratamento com a β lapachona, está relacionada com a apoptose.
O mesmo mecanismo de morte celular pela β lapachona foi relatado por Pardee et al.17
em
células de glioma e de câncer de cólon humano. Kung et al.18
observaram que a apoptose foi
induzida em células de câncer de pulmão, por essa droga, pela diminuição da ativação dos
fatores de proliferação. No entanto, houve discordância com o estudo feito por Park et al.14,
onde ocorreu a indução de necrose programada, pela β lapachona, nas células de carcinoma
hepatocelular humano. Para Flick et al.19
, a morte celular por necrose pode ocorrer com a
58
utilização do tratamento com a β lapachona, devido ao fato deste composto potencializar o
sistema imunológico, por meio de fatores associados com a inflamação.
FIGURA 2 - Gráfico com os valores encontrados para
viabilidade celular, apoptose inicial, apoptose
tardia e necrose, nas células de
osteossarcoma canino, após tratamento com a
β lapachona, nas diferentes concentrações e
tempos de exposição.
59
Outros compostos utilizados para o tratamento do osteossarcoma, como a
loperamida20
, a survivina21
, a baicaleína22
e o mangostin23
, também induzem a apoptose. Já a
doxorrubicina induz autofagia em células de osteossarcoma24
.
O efeito da β lapachona sobre o potencial de membrana mitocondrial foi medido
durante 24 horas, por meio do corante lipofílico JC-1. O produto penetrou nas células,
acumulou-se no interior das organelas e emitiu fluorescência vermelha em mitocôndrias
funcionais, indicando viabilidade celular. As mitocôndrias com menor potencial de atividade
de membrana permaneceram na forma monomérica, indicando apoptose (Figura 3).
FIGURA 3- Análise do efeito de diferentes concentrações da β
lapachona em 24 horas sobre o potencial de membrana
mitocondrial nas células de osteossarcoma canino, por
meio da utilização do corante lipofílico JC-1. Nota-se
acentuado aumento da apoptose (A) e decréscimo de
viabilidade celular (VC) na concentração de 1,0 μM.
FL-1 = fluorescence channel 1; FL-2 = fluorescence
channel 2. Citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD
Biosciences).
60
A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose dependente. A apoptose
foi menor na concentração de 0,1 μM (14,86%) e maior na concentração de 1,0 μM (88,13%).
Os dados indicaram que a apoptose desencadeada pela β lapachona pode estar relacionada
com a ruptura da integridade do potencial de membrana mitocondrial. Em conformidade com
esse resultado, Pardeeet al.17
relataram que a β lapachona causa liberação de citocromo c,
proteína associada à membrana interna da mitocôndria, que inibe o ciclo celular. Dessa forma,
a β lapachona desempenha uma ação antineoplásica seletiva nas mutações mitocondriais,
frequentes em células tumorais. Galluziet al.25
descrevem como apoptose intrínseca a morte
celular que inicia na membrana mitocondrial externa ou pode resultar da transição da
permeabilidade mitocondrial.
Os valores encontrados foram avaliados pelo programa de gráficos estatísticos
GraphPad Prism, por meio do método ANOVA bidirecional (Tabela 2).
TABELA 2 - Média dos dados fornecidos pelo citômetro de
fluxo sobre o potencial de membrana
mitocondrial, ao utilizar o corante lipofílico JC-
1. TT C VC A
24h CN 95,15 3,47
0,1μM 83,45 16,22
0,3μM 54,91 38,80
1,0μM 12,77 83,45
TT: tempo de tratamento; C: concentração; VC: células viáveis; A: apoptose; h: horas; CN: controle negativo.
Não houve diferença estatística significativa entre os valores das repetições e
triplicatas em cada concentração (p=0,9583). No entanto, houve diferença estatística
significativa entre os resultados encontrados (Figura 4) nas concentrações utilizadas
(p<0,0001). A despolarização mitocondrial foi menor no grupo tratado com 0,1 μM de β
lapachona (3,47%) e maior no grupo tratado com 1,0 μM de β lapachona (83,45%). A
indução da perda da integridade do potencial de membrana mitocondrial também ocorreu em
células de osteossarcoma canino tratadas por 3 horas, com 30 μg/ml de α mangostin,
substância extraída do mangostão, fruta tropical encontrada no sudeste da Ásia23
.
61
FIGURA 4 - Gráfico sobre o potencial de membrana
mitocondrial ao utilizar o corante
lipofílico JC-1. Valores da viabilidade
celular e apoptose nas células de
osteossarcoma canino, após tratamento
com a β lapachona, nas diferentes
concentrações, em 24 h. Observa-se o
caráter inversamente proporcional.
As fases do ciclo celular foram caracterizadas por meio da porcentagem de células
de osteossarcoma canino, após o tratamento com a β lapachona, em sub-G1, G0/G1, S, e
G2/M (Tabela 3). Houve diferença estatística significativa (p<0,0001) entre os tempos de
exposição. No G24 houve semelhança entre o número de células na fase G0/G1 e S. Com esse
tempo de exposição, as células podem sintetizar as proteínas necessárias para que cada
cromossomo possa se replicar. Porém, esse acontecimento depende da origem e do tipo
celular17
.
TABELA 3 - Média dos dados fornecidos pelo citômetro de fluxo sobre a análise do bloqueio
do ciclo celular da linhagem D-17, após o tratamento com a β lapachona. TT C SUB-G1 G0/G1 S G2/M
24h 0,1μM 0,75 46,42 49,13 8,67
0,3 μM 7,35 43,46 52,11 4,43
1,0 μM
2,69 58,44 41,56 0,00
48h 0,1μM 0,00 72,74 27,20 0,05
0,3μM 0,81 65,74 33,80 0,45
1,0μM
4,67 71,08 18,10 12,96
72h 0,1μM 0,02 69,03 29,12 1,84
0,3μM 1,45 64,99 32,01 2,98
1,0μM
11,92 66,48 12,02 21,52
TT: tempo de tratamento; C: concentração; h: horas.
62
A diferença entre as fases aumentou significativamente no G48 e G72,
predominando nas fases G0/G1 (Figura 5), que corresponde ao intervalo entre a mitose e a
duplicação do DNA. Conforme o ciclo progride para a transição G0/G1, ocorre o estímulo à
transcrição dos genes envolvidos na progressão do ciclo celular, que codificam as proteínas c-
Myc, p53, pRb, Ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-κB, CDK, ciclinas e CKI. O bloqueio no ponto
de checagem, na fase G1/S, gera mecanismos para impedir a formação de células anômalas,
efetuar o reparo ou induzir a apoptose26,27,28,29
.Além disso, a β lapachona possui como
propriedade a capacidade de inibir o complexo das topoisomerases, não deixando que elas se
reconectem ao DNA e desfazendo o complexo. Dessa forma, ocorre a ativação de pontos de
checagem no processo da divisão celular, induzindo a morte das células malignas13
.
Não houve diferença estatística entre as concentrações utilizadas durante o
tratamento deste experimento e o bloqueio do ciclo celular. Resultado distinto ocorreu nas
linhagens HBL-100, HeLa, SW1573 e WiDr de tumores sólidos humanos, em que as
alterações no ciclo celular foram dependentes da concentração da β lapachona15
. O presente
resultado difere também do reportado em células de osteossarcoma tratadas com baicaleína,
em que a distribuição das células na fase G0/G1 aumentou de forma dose dependente22
.
Neste estudo, foi possível perceber que, na dosagem de 1,0 μM em G48h e G72h,
houve células bloqueadas na fase G2/M, induzindo a catástrofe mitótica. Para Pardeeet al.17
,
aberrações cromossômicas podem ser criadas indiretamente pela longa exposição da β
lapachona a altas concentrações e estas células são bloqueadas na fase G2/M.Galluzzi et al.25
,
relatam que o bloqueio do ciclo celular quando há tentativa de divisão de células com DNA
danificado caracteriza a catástrofe mitótica.
Em síntese, a inibição do crescimento das células de osteossarcoma canino, após o
tratamento com a β lapachona, ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 e aumentou
significativamente com o tempo de exposição. O mesmo ocorreu com células de
osteossarcoma canino tratadas com o α-mangostin23
. O que difere dos agentes antineoplásicos
utilizados na rotina para o tratamentodo osteossarcoma, como a cisplatina, a carboplastina, a
doxorubicina e o metotrexato. Esses agentes inibem a síntese do DNA na fase S do ciclo
celular30
. Da mesma forma, as células humanas de câncer do cólon e hepatoma, tratadas pela
β lapachona, também são inibidas na fase S17
.
63
FIGURA 5 - Representação gráfica do resultado da Cinética do
ciclo celular, para os grupos com 24h (A), 48h
(B) e 72h (C) de permanência das células de
osteossarcoma canino em tratamento com a β
lapachona. Nota-se que a inibição do crescimento
ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 e
aumentou com o tempo de exposição. Eixo X =
fases do ciclo celular; eixo Y = número de
células.
64
Este estudo é o primeiro a avaliar os efeitos da β lapachona na progressão do
ciclo celular e processo da morte celular em linhagem de osteossarcoma canino. A apoptose
inicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos os grupos, relacionada com a
ruptura da integridade do potencial de membrana mitocondrial, indicando a ocorrência de
apoptose intrínseca. A inibição do crescimento das células ocorreu pelo bloqueio do ciclo na
fase G0/G1. Dessa forma, é possível que tenha ocorrido a formação de pontos de checagem
no processo da divisão celular, induzindo a morte das células de osteossarcoma canino em
baixa concentração. Os resultados desta pesquisa apontam para novas perspectivas, como a
observação deste tratamento em xenoenxertos de células tumorais de osteossarcoma em
camundongos por períodos mais longos.
4. Conclusão
A β lapachona induz apoptosenas células de osteossarcoma canino e promove o
bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1.
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67
“Quem não tem formação em química ou medicina
talvez não perceba quão difícil é a questão do
tratamento de câncer. É quase – não tanto, mas quase
– tão difícil como descobrir um agente capaz de
dissolver a orelha esquerda, por exemplo, e deixar a
orelha direita intacta. Tão pequena é a diferença entre
a célula cancerosa e seu ancestral normal.”
William Woglom
68
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
O desenvolvimento de novos agentes antineoplásicos está relacionado com uma
sequência de atividades experimentais, que decorrem de tempo e relação custo e benefício. A
necessidade de medicamentos mais efetivos, com menor consequência adversa, tem feito com
que a quimioterapia baseada num planejamento racional de fármacos seja o modelo para
diversos estudos.
O emprego de novas técnicas em uma unidade pode gerar riscos e dificuldades,
necessitando muito estudo e dedicação para minimizá-los.Durante a manipulação das células
de cultivo, a contaminação externa pode ocorrer e, portanto, existe a necessidade da
manutenção de técnicas assépticas e o emprego de normas para procedimento na sala de
cultura, para reduzir a probabilidade de infecção, perda de reagentes e de material biológico.
Alguns fatores externos, como oscilação de temperatura e energia, também podem alterar o
bom andamento da rotina previamente planejada.
Neste contexto, foi investigado o efeito citotóxico da β lapachona em linhagem D-
17 de osteossarcoma canino, uma vez que essa substância tem mostrado potencial
significativo para a abordagem terapêutica de diversas neoplasias. Como não existem estudos
sobre a propriedade antiproliferativa daβ lapachona no osteossarcoma canino, tratou-se de um
projeto original. Nesse sentido, foi preciso realizar reajustes na dosagem pré-estabelecida para
os tratamentos dos grupos do delineamento experimental. Vale ressaltar que asconcentrações
de β lapachona utilizadas para todo o experimento foram baixas, o que torna a substância
econômica para pesquisas. Além disso, diminui a possibilidade de efeitos adversos ao
paciente, diante da utilização de baixas concentrações terapêuticas.
Diversas repetições de algumas das técnicas realizadasforam necessárias. Isso
deve-se ao fato de ser indispensável trabalhar com a utilização de adaptações de
procedimentos já constituídos, até ser possível instituiruma metodologia imprescindível.
Além disso, cada linhagem celular necessita do estabelecimento de procedimentos próprios,
como tempo e substâncias necessárias para a realização dos processos de congelamento,
descongelamento e cultivo.
Dessa forma, duas técnicas para análise da viabilidade celular foram usadas, para
que se pudesse calcular o valor do IC50 e a citotoxicidade. Ao perceber a capacidade
citotóxica da β lapachona no osteossarcoma canino, mesmo conhecendo o IC50, existiu a
curiosidade de estabelecer grupos com outras concentrações que pudessem expressar ação
citotóxica ainda maior. O que pode sugerir a possibilidade de projetos futuros.
69
Num segundo passo, a nossa abordagem envolveu a avaliação da ação da β
lapachona no tipo de morte celular e no bloqueio do ciclo das células de osteossarcoma
canino. Frente aos resultados, percebeu-se que existe ainda um vasto campo de descobertas
para a utilização da β lapachona no osteossarcoma, como a avaliação dos genes envolvidos na
progressão do ciclo celular, bem como das proteínas relacionadas com a formação dos pontos
de checagem no processo da divisão celular.
Acredita-se que os dadosobtidos possam contribuir como uma alternativa, viável e
sustentável, para a utilização do composto β lapachona na quimioterapia do osteossarcoma,
vislumbrando uma possível aplicação no tratamento pré-operatório e/ou coadjuvante desta
neoplasia em cães e humanos. Além disso, espera-se que os impactos da pesquisa contribuam
para o despertar crescente da comunidade científica, especialmente no concernente à
exploração extrativista vegetal bem conduzida dos recursos naturais do Bioma Cerrado.
