PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE … · Ao laboratório de Toxinas Vegetais, do qual já fiz parte, por sempre disponibilizar ... 3.2 Animais de Laboratório e Alojamento

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

GEÓRGIA SAMPAIO FERNANDES

PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES

DE DEZ ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA

FORTALEZA-CEARÁ

2011

GEÓRGIA SAMPAIO FERNNDES

PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE DEZ

ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA

Tese submetida à Coordenação do

Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica da Universidade Federal do

Ceará, como requisito parcial para

obtenção do título de Doutor em

Bioquímica

Orientadora: Dra. Ana de Fátima F.

Urano de Carvalho

FORTALEZA-CEARÁ

2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências e Tecnologia

F398p Fernandes, Geórgia Sampaio.

Prospecção nutricional e bioativa de sementes de dez espécies vegetais da Caatinga / Geórgia

Sampaio Fernandes. – 2011. 331 f. : il., enc. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciência, Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular, Pós-Graduação em Bioquímica, Fortaleza, 2011.

Área de Concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientação: Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho.

1. Leguminosas – valor nutricional. 2.Leguminosas - larvicida. 3.Leguminosas – atividade

antimicrobiana. I. Título.

CDD 574-192

GEÓRGIA SAMPAIO FERNANDES

PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE DEZ ESPÉCIES

VEGETAIS DA CAATINGA

Esta tese foi apresentada como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau

de Doutor em Bioquímica, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se à

disposição dos interessados na Biblioteca do Centro de Ciências e Tecnologia da referida

universidade.

A transcrição de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita em

conformidade com as normas da ética científica.

________________________________________

Tese aprovada em: _____/_____/_____. Geórgia Sampaio Fernandes

Dra. Ana de Fátima F. Urano de Carvalho

Orientadora


Depto. de Biologia

Dr. Renato de Azevedo Moreira

Universidade de Fortaleza

Centro de Ciências da Saúde

Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio

Universidade Estadual do Ceará

Curso de Nutrição

Dra. Fernanda Maria Machado Maia

Universidade Estadual do Ceará

Curso de Nutrição

Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas


Depto. de Bioquímica e Biologia

Molecular

À m inha orientadora,

A na de F átim a F . U rano de

Carvalho, por toda a ajuda, o

carinho, a com preensão durante todo

tem po que trabalham os juntas, com o

prova da m inha gratidão,

O fereço.

A D eus,

A o m eu esposo,

A os m eus queridos filhos,

A m inha F am ília, os m eus irm ãos,

E m especial, aos m eus pais, por todo o

am or, paciência, a juda e incentivo

D edico

AGRADECIMENTOS

À Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano de Carvalho, por ser uma orientadora única,

que acompanha de perto os experimentos, questiona, discute, aconselha, dá sugestões, ajuda,

incentiva e motiva todos os alunos do laboratório, além de sua contagiante alegria, mesmo no

meio de tanto trabalho e problemas a resolver.

À Dra. Ilka Maria Vasconcelos, por todos os ensinamentos, pelo profissionalismo, por

disponibilizar seu laboratório para alguns experimentos, por ter contribuído muito para a

minha formação científica, pela paciência, por todo o tempo que trabalhamos juntas e por ter

me incentivado e ajudado para que eu pudesse seguir em frente.

À Dra. Fernanda Maria Machado Maia, por tudo que já me ensinou, por ter sido

fundamental para a minha titulação como Mestre e pela disposição em, mais uma vez,

contribuir para a minha formação de Doutora.

Às professoras Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio, Dra. Ana Cristina de Oliveira

Monteiro Moreira e Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas pela pronta disponibilidade em aceitar

participar da banca examinadora.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular,

na pessoa do Dr. Márcio Viana Ramos.

A todos os funcionários do Departamento.

A todos os professores e responsáveis por laboratórios dos Departamentos de

Bioquímica e Biologia Molecular e de Biologia, que contribuíram disponibilizando os

equipamentos e reagentes para a realização deste trabalho, especialmente o Laboratório de

Carboidratos e Lectinas (Carbolec), na pessoa da professora Dra. Norma Maria Barros

Benevides e Luana Maria Castelo Melo Silva, por serem excelentes pessoas e pela

insuperável disposição em ajudar.

Ao Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa, em especial, ao professor José Tadeu

Abreu de Oliveira, por toda a infraestrutura e reagentes cedidos de seu laboratório, e por toda

a disponibilidade em ensinar e ajudar. A todos seus integrantes, principalmente aos que mais

me ajudaram, Fredy Albuquerque e Darcy Mayra Gondim, por toda a simpatia, gentileza,

disposição, positivismo, ensinamento, enfim, por toda a grande e valiosa ajuda prestada.

Ao laboratório de Toxinas Vegetais, do qual já fiz parte, por sempre disponibilizar

toda a infraestrutura necessária para a realização de etapas importantes deste trabalho e aos

amigos lá conquistados: Hermógenes Oliveira, por todas as dúvidas sanadas, por toda a ajuda,

incentivo, torcida e bom humor, sempre. A Janne Keila Morais por toda a torcida, todo apoio,

toda força e presteza em me ajudar. A todos os outros integrantes: Henrique Pinho, Adelina

Batista, Helen Costa, Daniele Bezerra, Mirella Pereira, Paulo de Paula, Raquel Rocha,

Mariana Arantes, por toda a colaboração, ajuda, por toda a convivência agradável e, em

especial, a minha grande amiga Juliana Gifoni, pela grande força, incentivo e orações.

Ao laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais pelo incrível acolhimento,

ótima infraestrutura e, principalmente, pelos amigos conquistados: Martônio Viana, Glauber

Pacelli, Renata Silva, Priscila Caracas, Sarah Sant’ana, Gabrielle Freire, Terezinha Souza,

Nathanna Mateus, Lady Bezerra, Berenice Alves e, especialmente ao Davi Farias, por toda a

torcida, toda a força, otimismo, energia e alegria contagiante, enorme disposição de todos em

ajudar, pela credibilidade e confiança que foi depositada em mim, enfim, o meu muitíssimo

obrigada, o que ainda é muito pouco por tudo que vocês fizeram por mim.

A todos os amigos e pessoas que, de forma direta ou indireta, contribuíram para a

realização deste trabalho.

Aos meus pais, José Gláucio e Gláucia Fernandes, pela incansável ajuda, apoio,

incentivo, por cuidarem dos meus filhos para que eu pudesse concluir esse trabalho e

principalmente pelas orações e amor incondicional que vocês têm por mim.

Aos meus irmãos, Geritsa, Gláucio Filho e Germana e meus sobrinhos amados Lucas e

Mariana, por estarem presentes em minha vida.

Ao meu esposo maravilhoso, pelo enorme amor, paciência, compreensão, e ajuda nas

tarefas domésticas e no cuidado com nossos filhos, tudo para que eu pudesse finalizar mais

uma etapa da minha formação científica.

Aos meus filhos gêmeos, Gabriel e Rafael, meus anjos amados, que só trouxeram

bênçãos e alegria para a minha vida e da minha família.

E, sobretudo, a Deus, por estar eternamente do meu lado me ajudando em todas as

etapas da minha vida, permitindo- me a conclusão deste trabalho através de suas bênçãos.

MUITO OBRIGADA!!!!!

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio dos seguintes Órgãos e Instituições:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

DECIT/SCTIE/MS, por intermédio do CNPq, o apoio da FUNCAP e da SESA, com o

financiamento do Projeto “Inclusão de Novos Genótipos de Feijão Caupi e de outras

Leguminosas de elevado Valor Nutricional e Funcional na Alimentação da População do

Semi-árido”.

Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Ceará,

Fortaleza, Ceará.

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade

Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará.

Núcleo de Controle das Endemias Transmissíveis por Vetores (NUVET), da Secretária

de Saúde do Estado do Ceará.

Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Departamento de Biologia da

Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Laboratório de Toxinas Vegetais do Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará

Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec) do Departamento

de Biologia da Universidade Federal do Ceará, onde o trabalho foi desenvolvido.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS................................................................................................ 15

LISTA DE TABELAS............................................................................................... 18

LISTA DE QUADROS.............................................................................................. 22

ABREVIATURAS..................................................................................................... 23

RESUMO.................................................................................................................... 25

ABSTRACT................................................................................................................ 27

CAPITULO 1. Fundamentação Teórica 29

1. LEGUMINOSAS COMO FONTE DE NUTRIENTES NA

ALIMENTAÇÃO HUMANA...................................................................................

30

2. COMPOSTOS ANTINUTRICIONAIS E/OU BIOATIVOS DE

LEGUMINOSAS.......................................................................................................

33

2.1 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Protéica.................. 34

2.1.1 Proteases............................................................................................................ 34

2.1.2 Inibidores de Tripsina...................................................................................... 36

2.1.3 Lectinas.............................................................................................................. 38

2.1.4 Ureases............................................................................................................... 40

2.1.5 Toxinas............................................................................................................... 41

2.1.6 Quitinases.......................................................................................................... 42

2.1.7 ββββ-1,3- glucanases............................................................................................... 44

2.2 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Não Proteica.......... 45

2.2.1 Alcalóides........................................................................................................... 46

2.2.2 Composto Fenólicos.......................................................................................... 47

2.2.3 Taninos............................................................................................................... 48

2.2.4 Saponinas........................................................................................................... 49

3. BIODIVERSIDADE DAS ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA COMO

FONTE DE ALIMENTOS E REPOSITÓRIO DE MOLÉCULAS

BIOLOGICAMENTE ATIVAS...............................................................................

50

3.1 Caesalpinia bracteosa Tul. .................................................................................. 53

3.2 Caesalpinia ferrea Mart. Ex. Tul. ...................................................................... 54

3.3 Dioclea megacarpa Rolfe .................................................................................... 55

3.4 Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong ................................................. 55

3.5 Erythrina velutina Willd . .................................................................................... 56

3.6 Hymenaea courbaril L. ........................................................................................ 57

3.7 Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth .............................................................. 58

3.8 Parkia platycephala Benth. ................................................................................. 59

3.9 Piptadenia moniliformis Benth. .......................................................................... 60

3.10 Senna rugosa (G.Don) H.S.Irwin & Barneby ................................................. 61

CAPÍTULO 2. Prospecção Nutricional em Sementes de Leguminosas da

Caatinga Cearense

65

1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA ....................... 66

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 68

2.1 Objetivos Gerais .................................................................................................. 68

2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 68

3. MATERIAIS ......................................................................................................... 69

3.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga.................................................... 69

3.2 Animais de Laboratório e Alojamento ............................................................. 69

3.3 Reagentes Químicos ............................................................................................ 70

3.4 Componentes das Dietas ..................................................................................... 70

4. MÉTODOS ............................................................................................................ 71

4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ..... 71

4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais ........................... 71

4.3 Dosagem de Proteínas ......................................................................................... 72

4.4 Composição Proximal das Sementes ................................................................. 72

4.4.1 Umidade ............................................................................................................ 72

4.4.2 Proteínas Totais ............................................................................................... 73

4.4.3 Lipídios Totais .................................................................................................. 73

4.4.4 Matéria Mineral (Cinzas) ................................................................................ 74

4.4.5 Fibra Alimentar Total ..................................................................................... 74

4.4.6 Carboidratos digeríveis ................................................................................... 75

4.4.7 Conteúdo de Energia ....................................................................................... 75

4.5 Composição em Aminoácidos ............................................................................ 78

4.6 Dosagem de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais ................................... 78

4.6.1 Lectinas ............................................................................................................. 78

4.6.2 Inibidores de Tripsina ..................................................................................... 79

4.6.3 Ureases .............................................................................................................. 80

4.6.4 Toxinas .............................................................................................................. 81

4.7 Determinação de Minerais ................................................................................. 81

4.8 Criação de Índice de Qualidade Nutricional para a Classificação das

Espécies mais Promissoras .......................................................................................

82

4.9 Experimento Nutricional I 82

4.9.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia

moniliformis ...............................................................................................................

82

4.9.1.1 Preparo das Dietas Experimentais .................................................................. 83

4.9.1.2 Procedimento Experimental ............................................................................ 84

4.9.1.3 Índices para Avaliação da Qualidade Proteica ............................................... 86

4.9.1.4 Parâmetros Bioquímicos Sanguíneos ............................................................. 87

4.9.1.5 Peso Relativo dos Órgãos em Base Seca ........................................................ 87

4.10 Experimento Nutricional II ............................................................................. 87

4.10.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia

moniliformis livre de αααα-galactosídios .......................................................................

88

4.10.1.1 Processo de extração dos α-galactosídios ..................................................... 88

4.10.1.2 Preparo das Dietas Experimentais ................................................................ 88

4.11 Análise Estatística ............................................................................................. 89

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 91

5.1 Composição Proximal das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ... 91

5.2 Composição de Aminoácidos das Sementes das Espécies Vegetais da

Caatinga .....................................................................................................................

101

5.3 Determinação de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais das Sementes

das Espécies Vegetais da Caatinga ..........................................................................

104

5.4 Determinação da Composição de Minerais das Sementes das Espécies

Vegetais da Caatinga ................................................................................................

110

5.5 Classificação das Espécies Vegetais Através do Índice de Qualidade

Nutricional .................................................................................................................

113

5.6 Experimento Nutricional I ................................................................................. 116

5.6.1 Crescimento dos animais ................................................................................. 117

5.6.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar ............................ 120

5.6.3 Balanço Nitrogenado ....................................................................................... 123

5.6.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos ....................................................... 133

5.6.5 Análise dos parâmetros séricos ....................................................................... 137

5.7 Experimento Nutricional II ............................................................................... 142

5.7.1 Crescimento dos animais ................................................................................. 142

5.7.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar ............................ 144

5.7.3 Balanço Nitrogenado ....................................................................................... 147

5.7.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos ....................................................... 152

5.7.5 Análise dos parâmetros séricos dos ratos ...................................................... 155

6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO .......................................................................... 160

CAPÍTULO 3. Prospecção Bioativa em Sementes de Leguminoas da Caatinga

Cearense

161

1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA ....................... 162

2. OBJETIVOS ........................................................................................ 165

2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 165

2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 165

3. MATERIAIS ...................................

......................................................................

166

3.1 Sementes .............................................................................................................. 166

3.1.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ............................................... 166

3.1.2 Sementes de Piptadenia moniliformis Benth. ................................................. 166

3.2 Eritrócitos ........................................................................................................... 167

3.3 Microrganismos ................................................................................................. 167

3.4 Animais de Laboratório e Alojamento ............................................................. 167

3.5 Insetos e Alojamento ........................................................................................... 168

3.6 Reagentes Químicos e Outros Materiais ........................................................... 168

3.6.1. Proteínas .......................................................................................................... 168

3.6.2. Substratos Enzimáticos .................................................................................. 169

3.6.3 Meios de Cultura .............................................................................................. 169

3.6.4 Reagentes para Eletroforese ........................................................................... 169

3.6.5 Outros Materiais .............................................................................................. 169

4. MÉTODOS ............................................................................................................ 170

4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga .....

4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais ...........................

170

170

4.3 Dosagem de Proteínas ......................................................................................... 171

4.4 Detecção de Metabólitos Secundários ............................................................... 171

4.5 Detecção e Dosagem de proteínas Bioativas ..................................................... 172

4.5.1 Lectinas ............................................................................................................. 172

4.5.2 Inibidores de Tripsina ..................................................................................... 172

4.5.2.1 Determinação dos Inibidores de Tripsina das sementes das dez espécies

vegetasi da Caatinga ...................................................................................................

172

4.5.2.2 Determinação dos Inibidores de Tripsina da Fração Proteica de Piptadenia

moniliformis (PmFP) ..................................................................................................

173

4.5.3 Inibidores de Quimotripsina ........................................................................... 174

4.5.4 Ureases .............................................................................................................. 174

4.5.5 Quitinases ......................................................................................................... 175

4.5.6 β-1,3-glucanases ............................................................................................... 176

4.5.7 Atividade proteolítica ...................................................................................... 176

4.5.7.1 Análise qualitativa de proteases ...................................................................... 176

4.5.7.2 Atividade proteolítica total ............................................................................. 177

4.5.8 Toxinas .............................................................................................................. 177

4.6 Ensaios Biológicos ............................................................................................... 178

4.6.1 Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti ......................... 178

4.6.2 Atividade Larvicida contra Aedes aegypti ..................................................... 179

4.6.3 Análise de larvas tratadas ............................................................................... 179

4.6.4 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio

Sólido ..........................................................................................................................

180

4.6.5 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio

Líquido ......................................................................................................................

180

4.6.6 Atividade Inibitória do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido ....... 181

4.6.7 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio sólido ............... 181

4.6.8 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio Líquido ...........

4.7 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em

Sementes de Piptadenia moniliformis Benth. ..........................................................

182

183

4.7.1 Fracionamento protéico com ácido tricloroacético (TCA) .......................... 183

4.7.2 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-celulose ................... 183

4.7.3 Cromatografias de Afinidade em Matriz de Quitina ................................... 184

4.7.4 Cromatografias de troca iônica em Matriz de CM-sepharose .................... 184

4.7.5 Cromatografia de afinidade em Matriz de “ Affi-gel blue gel” ................... 185

4.7.6 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de Resource Q em sistema de

FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”) ....................................................

185

4.7.7 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida ........................................................... 186

4.8 Análise Estatística ................................................................................................ 186

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 187

5.1 Seleção das Espécies Vegetais ........................................................................... 187

5.2 Sólido Solúvel e Proteínas solúveis do Extrato Bruto das Espécies Vegetais

da Caatinga ................................................................................................................

191

5.3 Metabólitos Secundários em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga 191

5.4 Proteínas Bioativas em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ......... 194

5.5 Avaliação de Toxicidade dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies


200

5.6 Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies


204

5.7 Espécies Vegetais com Bom Perfil de Bioatividade ......................................... 208

5.8 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em

Sementes de Piptadenia moniliformis Benth. ..........................................................

212

5.9 Re-estruturação da Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica

Presentes em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth. ...................................

231

5.10 Cromatográfia de Troca Iônica de F 2 em Matriz de CM-sepharose .......... 234

5.11 Cromatográfia de Troca Iônica de C1 em Matriz de Resouce Q Acoplada

ao Sistema de FPLC .................................................................................................

237

5.12 Detecção e Dosagem de Proteínas Bioativas na Fração Proteica de

Sementes de P.moniliformis (PmFP) .......................................................................

239

5.13 Ensaios Biológicos ............................................................................................. 244

5. 13.1 Atividade Antifúngica – Fungos Leveduroformis e Filametosos ............ 245

5.13.1.1 Ensaio de Inbição do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido ............ 245

5.13.1.2 Ensaio de Inbição do Crescimento de fungos filamentosos em Meio

Líquido ........................................................................................................................

247

5. 13. 2 Atividade Antibacteriana ............................................................................ 250

5.13.2.1 Ensaio de Inibição do Crescimento de Bactérias em Meio Líquido ............ 250

5.13. 3 Atividade Inseticida ...................................................................................... 252

5.13.3.1 Ensaio de Deteriminação da Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de

Aedes aegypti ..............................................................................................................

252

6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO .......................................................................... 259

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................... 260

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 262

9. ANEXOS ................................................................................................................ 328

9.1 Fonte da figura 2 ................................................................................................. 329

9.1 Fonte da figura 8 ................................................................................................. 330

9.3 Artigo publicado ................................................................................................. 331

15

LISTA DE FIGURAS

CAPITULO 1 Página

FIGURA 1 – Enzimas utilizadas no mercado mundial ................................ 36

FIGURA 2 – Espécies vegetais da Caatinga Cearense ................................ 63

FIGURA 3 – Vagens e Sementes de espécies vegetais da Caatinga ........... 64

CAPITULO 2 Página

FIGURA 1 - Procedimento para determinação de Fibra Alimentar Total

da farinha delipidada das dez sementes das dez espécies vegetais da

Caatinga segundo a metodologia descrita pela AOAC (1997) ....................

77

FIGURA 2 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com

dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr) e processadas

termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-ondas (PmM) e

cozimento por autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de

ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr),

processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína

(AP)...............................................................................................................

118

FIGURA 3 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com

dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr), farinha de P.

moniliformis crua livre de α-galactosídios (PmLG), farinha de soja crua

adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua

(SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta

contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e

dieta isenta de proteína (AP) ........................................................................

143

CAPITULO 3 Página

FIGURA 1 – Cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-

celulose..........................................................................................................

213

FIGURA 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença

de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) do Extrato bruto de P.

moniliformis Benth e da 1a fração proteica não retida oriunda do extrato

bruto P. moniliformis de quando submetidas a cromatografia de troca

iônica em matriz de DEAE-Celulose, revelada com nitrato de prata............

216

16

FIGURA 3 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina ................. 217

FIGURA 4 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose .... 219

FIGURA 5 – Cromatografia de afinidade em matriz de Affi-gel blue gel ..... 221


de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de

D1 quando submetida à cromatografia de afinidade em matriz de “Affi-

gel blue gel”, revelada com nitrato de prata .................................................

224

FIGURA 7 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose ... 225

FIGURA 8 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina ................. 227


de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de

A1 quando submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina,

revelada com nitrato de prata .......................................................................

228

FIGURA 10 - Esquema da tentativa de purificação de proteínas com

atividade quitinásica presentes em sementes de P. moniliformis .................

230

FIGURA 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença

de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata

das frações proteicas obtidas de do fracionamento com ácido

tricloroacético (TCA) ...................................................................................

233

FIGURA 12 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose .. 235



das proteínas do extrato bruto de P. moniliformis Benth. ............................

236

FIGURA 14 – Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q

acoplada ao sistema de FPLC .......................................................................

238



das frações proteicas de C1 obtidas quando submetidas a uma

cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao

sistema de FPLC ...........................................................................................

240

FIGURA 16 – Esquema de purificação da fração proteica de sementes de

P. moniliformis com elevada atividade quitinásica ......................................

241

FIGURA 17 - Curvas de crescimento de quatro leveduras crescidas em

17

caldo BHI (Brain Heart Infusion), pH 5, 0, contendo diferentes

concentrações da fração proteica de P. moniliformis (Pm-FP) ....................

246

FIGURA 18- Curvas de crescimento de quatro fungos crescidos em caldo

YPD (Yeast Potato Dextrose), contendo diferentes concentrações da

fração proteica de P. moniliformis (Pm-FP) .................................................

248

FIGURA 19 - Curvas de crescimento de quatro cepas bactérias (2 Gram +

e 2 Gram -) crescidos em caldo nutritivo (Peptona e Extrato de levedura)

contendo diferentes concentrações da fração proteica de P. moniliformis

(Pm-FP) ........................................................................................................

251

FIGURA 20 – Fotomicrografia (50 x) das larvas de Aedes aegypti

tradadas com BSA (1 mgP/ml) (a) e com PmFP (0,225 mgP/ml) ...............

255

FIGURA 21 – Fotomicrografia (50 x) dos ovos de Aedes aegypti tratados

com PmFP (1 mgP/ml) .................................................................................

258

18

LISTA DE TABELAS

CAPITULO 1 Página

TABELA 1 – Espécies da família leguminosae endêmicas presentes na

Caatinga .................................................................................................................

52

CAPITULO 2 Página

TABELA 1 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas

controles e experimentais do experimento nutricional I .......................................

85

TABELA 2 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas das

dietas controles e experimentais do experimento nutricional II ............................

90

TABELA 3 – Composição proximal e de energia das sementes de dez

leguminosas selvagens da caatinga .......................................................................

95

TABELA 4 - Composição de aminoácidos das proteínas das dez sementes de

leguminosas da caatinga, composição de aminoácidos de proteína vegetal (soja)

e animal (clara de ovo) padrões e referências de aminoácidos para grupos de

crianças em diferentes idades e requerimentos para ratos......................................

102

TABELA 5 – Fatores tóxicos e/ou antinutricionais das sementes de dez

espécies vegetais da caatinga ................................................................................

105

TABELA 6 – Composição de minerais das sementes de dez espécies vegetais

da caatinga e recomendação de ingestão diária (RDI) para adultos e crianças

com quatro ou mais anos de idade baseado em um consumo de 2000 Kcal

diárias ....................................................................................................................

111

TABELA 7 – Índice de Qualidade Nutricional* das espécies vegetais da

caatinga em ordem decrescente .............................................................................

115

TABELA 8 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiência alimentar* de ratos

(n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr) e

processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-onas (PmM)

e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de ratos alimentados

com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente

por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ..................................................

121

TABELA 9 – Balanço de nitrogênio* dos ratos (n = 6) alimentados com dietas

contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente

19

por fervura (PmF), cozimento em micro-onas (PmM) e autoclavagem (PmA),

comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo

farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta

isenta de proteína (AP) ..........................................................................................

124

TABELA 10 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n =

6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr) e

processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-onas (PmM)

e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de ratos alimentados

com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente

por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ..................................................

127

TABELA 11 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos

de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua

(PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-

onas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de ratos

alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada

termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...........................

134

TABELA 12 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas






138

TABELA 13 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiênica alimentar* de ratos

(n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr),

farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios (PmLG), farinha de

soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua


contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta


145

TABELA 14 – Balanço de nitrogênio* dos ratos (n = 6) alimentados com dietas

contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr), farinha de P. moniliformis

crua livre de α-galactosídios (PmLG), farinha de soja crua adicionada de α-

galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o

20

crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja

processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) .........

148

TABELA 15 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n =

6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (PmCr),

farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios (PmLG), farinha de

soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua


contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta


150

TABELA 16 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos

de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua

(PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-

onas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de ratos

alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada

termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...........................

153

TABELA 17 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas






156

CAPÍTULO 3 Página

TABELA 1 – Espécies vegetais utilizadas nesse estudo, nome botânico e

popular, uso na medicina popular, quantidade de sólido solúvel e quantidade de

proteína ..................................................................................................................

189

TABELA 2 – Detecção de metabólitos secundários no extrato bruto de

sementes de espécies vegetais da caatinga ............................................................

193

TABELA 3 – Detecção e dosagem de proteínas bioativas no extrato bruto de

sementes de espécies vegetais da caatinga ............................................................

196

TABELA 4 – Determinação de atividade tóxica do extrato bruto de sementes

de espécies vegetais da caatinga para camundongos e larvas de Aedes aegypti

no 3 º estádio de desenvolvimento .......................................................................

201

TABELA 5 – Avaliação da atividade antimicrobiana em meio sólido do extrato

21

bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga .............................................. 205

TABELA 6 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas

oriundas do extrato bruto de P. moniliformis Benth. quando submetido a uma

cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose ................................

215


oriundas de D1 quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de

“Affi-ge Blue gel” .................................................................................................

222


oriundas de A1 quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de

Quitina ...................................................................................................................

227


oriundas do extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. quando

submetidos à precipitação com ácido tricloroacético (TCA) em diferentes

concentrações ........................................................................................................

232


oriundas da fração TCA 2% quando submetida a uma cromatografia de troca

iônica em matriz de CM-sepharose .......................................................................

235

TABELA 11 - Detecção e Dosagem de proteínas bioativas da fração proteica de

sementes de P. moniliformis (PmFP) ...................................................................

243

TABELA 12 – Efeito da fração proteica de Piptadenia moniliformis (PmFP)

sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência de larvas em 1º estádio de Aedes

aegypti após 7 dias de exposição ...........................................................................

254

22

LISTA DE QUADROS

CAPITULO 2 Página

QUADRO 1 – Informações botânicas, nutricionais e antinutricionais das dez

espécies de leguminosas da caatinga ........................................................................

92

23

ABREVIATURAS

ALT Alanina aminotransferase

AST Aspartato aminotransferase

BANA Ná-Benzoil-DL-Arginina-p-Naftilamida

BAPNA Ná-Benzoil-DL-Arginina-p-Nitroalinida

BSA Albumina Sérica Bovina

CL 50 Concentração Letal Média capaz de matar 50 %

organismos

CM Carboximetil

DL 50 Dose Letal Média capaz de matar 50 % dos animais

testados

DEAE Dietilaminoetil

DMAB p-dimetilaminobenzaldeído

DMSO Dimetilsolfóxido

DTT Ditiotreitol

EB Extrato Bruto

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FAO Organização para a Agricultura e Alimentação

FAT Fibra Alimentar Total

FPLC “Fast Protein Liquid Chromatography”

IQN Índice de Qualidade Nutricional

µgTI Micrograma de Tripsina Inibida

Mo-CBP3 Proteína ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera

NPU Utilização Líquida da Proteína

PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

PmFP Fração proteica de Piptadenia moniliformis

PR-proteína Proteína relacionada à patogênese

SBTI Inibidor de tripsina da soja

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

SST Sólidos Solúveis Totais

TCA Ácido Tricloroacético

TEMED N’, N’, N’, N’, tetrametiletilenodiamina

24

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

VB Valor Biológico

UH Unidades de Hemaglutinação

25

RESUMO

A Caatinga possui uma vegetação heterogênea cuja biodiversidade taxonômica conta

com mais de 2.000 espécies de plantas. Dentre essas, cerca de 220 pertencem à família das

leguminosas com 80 espécies endêmicas, únicas desse bioma. Muitas são usadas para diversas

finalidades de forma indiscriminada, reduzindo consideravelmente a diversidade e o número

de espécies antes mesmo do conhecimento de suas potencialidades. Estudos que possam

agregar valor econômico e viabilizar o uso racional, sustentável e a conservação das mesmas,

aliada à constante busca por novas fontes de proteínas vegetais para atender à demanda

crescente da população, bem como a grande necessidade de descoberta de compostos naturais

que auxiliem no combate aos patógenos humanos e de plantas, são de extrema relevância.

Assim, o presente estudo objetivou avaliar o potencial nutricional e bioativo de sementes de

dez espécies vegetais da Caatinga destacando a espécie mais promissora. Para tanto, dez

espécies de leguminosas selvagens da Caatinga foram analisadas quanto a sua composição

nutricional, apresentando elevado percentual de proteína bruta (10,9 ± 0,4 a 50,0 ± 3,4 %),

fibras (0,8 ± 0,0 a 52,3 ±1,0 %) e energia (1.000 a 1.804 kJ/100g), com perfil de aminoácidos

comparáveis aos da soja, com maiores teores de lisina (1088 a 456 mg/gN) e histidina (199 a

918 mg/gN) e bom perfil de minerais por apreentar boas quantidades de (mg/100g de farinha)

de todos eles, em especial, de ferro (3,8 a 20,2), cálcio (31 a 268), magnésio (102 a 244) e

potássio (366 a 1.581). As sementes apresentaram baixas quantidades de lectinas (80 a 2.560 e

160 a 2.560 UH/gF, quando não tratadas e tratadas com enzimas, respectivamente), inibidores

de tripsina (4,1 ± 0,4 a 27,4 ± 0,2 µgTI/mgF ), ureases (465 ± 13 a 47.178 ± 3.351 U/KgF) e

atividade tóxica, em apenas três espécies, com DL50 variando de 0,72 ± 0,03 a 1,12 ± 0,04

g/Kg peso. Foi determinado um índice de qualidade nutricional para todas as espécies, o qual

apontou a espécie Piptadenia moniliformis Benth. (Catanduva) como detentora de melhor

qualidade nutricional, sendo assim destacada e avaliada in vivo a qualidade das proteínas de

suas sementes. Os processamentos térmicos (fervura, cozimento em micro-ondas e

autoclavagen) e o processo de extração de α-galactosídios nas sementes dessas espécies não

proporcionaram bom desempenho dos animais, tendo em vista a perda de peso apresentada.

Melhoria nos parâmetros nutricionais, como NPU e VB foi verificada após a retirada de α-

galactosídios dessas sementes, sugerindo que a análise de outros processamentos para o

aproveitamento das proteínas de suas sementes, pode torná-las uma fonte promissora. Além

do alto potencial nutricional, as dez espécies apresentam também potencial bioativo devido à

presença de metabólitos secundários como alcalóides, catequinas, calchonas, auronas,

flavonóis, fenóis flavonas, xantonas, flavononóis, saponinas e triterpenóides. Possuem

proteínas bioativas como proteases, quitinases (0,23 ± 0,02 a 2,0 ± 0,33 nKat/mgP), β-1,3-

glucanases (0,01 ± 0,0 a 0,8 ± 0,01 nKat/mgP), além de proteínas ativas contra

26

microorganismos que também são consideradas antinutricionais (lectinas, inibidores de

tripsina, ureases e toxinas). A avaliação dos extratos brutos (EB) das espécies mostrou que

todas são ativas contra larvas de Aedes aegipty com percentual de mortalidade variando de

13,33 ± 0,54 a 100,00 ± 0,00 %, exceto o EB de Caesalpinea bracteosa que foi ativo contra a

cepa Bacillus subtilis e contra o fungo Fusarium oxysporum, juntamente como o EB de

Dioclea megacarpa. A espécie Senna rugosa inibiu o crescimento das cepas Bacillus subtilis

e Staphylococcus aureus. Os fungos fitopatogênicos Aspergilus niger e Colletotrichum

truncatum foram inibidos pelos EBs de Piptadenia moniliformis e Enterolobium

contortisiliquum, que além destes, foi ativo frente a Neurospora sp. e Trichoderma viridae. A

espécie P. moniliformis destacou-se por sua elevada atividade quitinásica (1,12 ± 0,0

nKat/mgP) em adição à atuação contra modelos biológicos susceptíveis a essa enzima, tendo

sido escolhida para sua purificação. A fração proteica purificada de P. moniliformis (PmFP)

contém elevada atividade de quitinases e causou pequena redução no crescimento das

leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, bem como da bactéria B. subtilis.

Inibiu ainda, a eclosão de ovos de A. aegypti com CI50 de 204, 42 ± 2,19 µgP/ml e alterou a

estrutura dos ovos e morfologia das larvas de primeiro estádio. A investigação do potencial

nutricional e bioativo das espécies mostrou boa composição de nutrientes, em especial de

proteínas e confirmou a presença de compostos bioativos de natureza proteica e de

metabólitos secundários, tornando-as promissoras fontes de nutrientes e compostos

antimicrobianos e anti-inseticidas que podem ser utilizados biotecnologicamente para fins

agrícolas e industriais.

Palavras chaves: Caatinga, Leguminosas, Leguminosas selvagens, Piptadenia moniliformis,

valor nutricional, proteínas bioativas, antimicrobiano, larvicida.

27

ABSTRACT

The Caatinga Biome shows an heterogeneous vegetation with a taxonomic

biodiversity of over 2,000 species of plants. Among these, approximately 220 belong to the

Leguminosae family with 80 endemic species, unique to that biome. Many are used for

various purposes in an indiscriminate manner, greatly reducing the variety and number of

species even before the knowledge of their potential uses. Studies that can add economic

value and enable the rational, sustainable use of these species, coupled with the constant

search for new sources of plant protein to meet the ever increasing demand of the population

are extremely important. Similarly important is the search for natural compounds which may

help to combat human and plant pathogens. Thus, this study aimed to assess the nutritional

and bioactive value of the seeds of ten plant species from Caatinga, highlighting the most

promising ones. For this, the seeds were analyzed for nutritional composition, showing a high

percentage of crude protein (10.9 ± 0.4 to 50.0 ± 3.4%), dietary fiber (0.8 ± 0 , 0 to 52.3 ±

1.0%) and energy (1,000 kJ/100g a1.804), with amino acid profile similar to that of soybeans,

with higher amounts of lysine (1088-456 mg/gN) and histidine (199-918 mg/gN) and good

mineral profile, with good content (mg/100 g flour) for all of them, especially, iron (3.8 to

20.2), calcium (31 to 268), magnesium (102-244) and potassium ( 366-1581). The seeds

showed low amounts of lectins (80-2560 and 160-2560 UH / gF, when untreated and treated

with enzymes, respectively), trypsin inhibitor µ(4.1 ± 0.4 to 27.4 ± 0.2 GTI / mgF), urease

(465 ± 13 to 47,178 ± 3,351 U / KGF) and toxic activity in only three species, with LD50

ranging from 0.72 ± 0.03 to 1.12 ± 0.04 g / kg body weight . Was given an index of nutritional

quality for all species, which pointed to Piptadenia moniliformis Benth. species (Catanduva)

as the most promising one and because of that the seeds of this species was had the quality of

its proteins evaluated in vivo. The thermal processing (boiling, microwave cooking and

autoclaving) as well as the removal of α-galactosides did not improve animals performance.

The nutritional parameters NPU and BV were improved when the animals were fed the seeds

diet after removal of the α-galactosides. This may indicate that the search for apropriate

processing methods may turn these seeds a promising source of proteins. Besides the high

nutritional potential, the seeds of the ten studied species also have bioactive potential due to

the presence of secondary metabolites such as alkaloids, catechins, calchonas, Auron,

flavonols, flavones phenols, xanthones, flavononols, saponins and triterpenoids. These seeds

also have bioactive proteins such as proteases, chitinases (0.23 ± 0.02 to 2.0 ± 0.33 nkat / mg

P), β-1,3-glucanase (0.01 ± 0.0 to 0.8 ± 0, 01 nkat / mg P), and proteins active against

microorganisms that are also considered antinutritional factors (lectins, trypsin inhibitors,

urease and toxins). The evaluation of the crude extracts (CE) of the seeds showed that all

species are active against the larvae of Aedes aegipti with mortality rates ranging from 13.33

28

± 0.54 to 100.00 ± 0.00%, except that of Caesalpinea bracteosa which similarly to the CE of

Dioclea megacarpa, was active against the bacterium Bacillus subtilis and against the fungus

Fusarium oxysporum. Seeds extract of Senna rugosa species was able to inhibit the growth of

Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. The pathogenic fungi Aspergillus niger and

Colletotrichum truncatum were inhibited by the CE of Piptadenia moniliformis and

Enterolobium contortisiliquum. The latter was also active against Neurospora sp. and

Trichoderma viridae. The species P. moniliformis was distinguished for its high chitinase

activity (1.12 ± 0.0 nkat / mg P) in addition to its activity against biological models

susceptible to this enzyme. For these reasons attempts were made for its purification. The

purified protein fraction of P. moniliformis (PmFP) contains high activity of chitinases and

caused a small reduction in the growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida

tropicalis, and of the the bacterium B. subtilis. This protein fraction also inhibits the hatching

of A. aegypti eggs with IC50 of 204. 42 ± 2.19 µgP / ml. It causes changes in the eggs structure

and in the morphology of first stage larvae. Thus, investigation of bioactive and nutritional

potential of the species showed good composition of nutrients, especially of proteins, and

confirmed the presence of bioactive compounds from protein nature and secondary

metabolites, making them promising sources of nutrients, antimicrobial and insecticides that

can biotechnologically be used for agricultural and industrial purposes.

Key words: Caatinga, Pulses, wild legumes, Piptadenia moniliformis, nutritional value,

bioactive proteins, antimicrobial, larvicidal.

29

Fundamentação Teórica

30

1. LEGUMINOSAS COMO FONTE DE NUTRIENTES NA ALIMENTAÇÃ O

HUMANA

Os vegetais mais importantes na agricultura e na alimentação humana, depois das

gramíneas (cereais), são os da família das leguminosas, com sua enorme quantidade de

espécies e variedades (DURANTI, 2006). As leguminosas e os cereais são considerados a

base na dieta de toda sociedade, apresentando aminoácidos essenciais complementares que os

tornam alimentos de boa qualidade e capazes de fornecer proteínas funcionais (SHEWRY;

TATHAM, 1999; SINDHU; KHETARPAUL, 2001; BOYE et al., 2010).

As leguminosas são fontes de proteínas, carboidratos, lipídios, algumas vitaminas e

minerais, sendo destacadas como fontes de proteínas, embora o principal componente de

algumas delas seja o óleo. São amplamente utilizadas como fonte de proteínas na dieta do

homem devido ao alto conteúdo de nitrogênio quando comparado à quantidade presente nos

cereais, que é cerca de duas vezes menor. Por essa razão, são importantes na dieta de seres

humanos e animais, sendo a única fonte de proteínas na alimentação humana em muitas partes

do mundo, principalmente em países em desenvolvimento com elevado número de pessoas de

baixa renda (SHIM; JUN; KANG, 2003; WANG et al., 2003; CRUZ et al., 2004; GRUSAK,

2005; GRUSAK, 2008).

As proteínas provenientes de plantas fornecem aproximadamente 65% da oferta

mundial de proteínas para os seres humanos e, entre as plantas, as leguminosas são

consideradas a principal fonte de proteínas alimentares, variando de 20 até 40 g por 100 g de

matéria seca (NORTON; BLISS; BRESSANI, 1985; MAHE; GAUSSERES; TOME, 1994).

Feijões, ervilhas, favas, lentilhas, grão de bico e soja são exemplos de importantes

leguminosas usadas na alimentação humana e, entre as 20 espécies mais utilizadas, os feijões

(Phaseolus vulgaris e Vigna sinensis) e as ervilhas (Pisum sativum L) são os mais

amplamente cultivados e consumidos em todo o mundo (MORROW, 1991; OFUYA;

AKHIDUE, 2005). O feijão comum (Phaseolus vulgaris) é considerado uma das principais

fontes proteicas da população brasileira (OLIVEIRA et al., 2003) e o feijão de corda (Vigna

unguiculata) apresenta boa fonte de vitaminas do complexo B (tiamina, niacina, riboflavina,

piridoxina e ácido fólico) e de minerais, especialmente ferro, zinco, potássio e fósforo

(GRANGEIRO et al., 2005; PHILLIPS et al., 2003).

Por outro lado, sementes de leguminosas são deficientes nos aminoácidos sulfurados

metionina, cisteína e, em menor escala, em triptofano. Contêm quantidades relativamente

31

baixas de certos minerais (ferro, zinco e cálcio) quando comparadas às fontes de proteínas de

origem animal (carnes) (GRUSAK, 2002; SHIM; JUN; KANG, 2003).

Várias espécies de leguminosas têm sido cultivadas e consumidas em larga escala em

diversas zonas climáticas. Já as espécies de leguminosas selvagens são recolhidas e também

consumidas, em menor escala, pelas populações rurais e tribais, além de sua utilização como

fontes de proteínas em algumas partes do mundo (AMUBODE; FETUGA, 1983;

RODRIGUES; TORNE, 1991; MOHAN; JANARDHANAN, 1995; SEENA; SRIDHAR;

JUNG, 2005; VADIVEL; JANARDHANAN, 2005). Essa utilização de leguminosas

selvagens na alimentação mostra o potencial de conversão dessas espécies selvagens em

cultivadas. Muitos esforços têm sido direcionados, nesse sentido, devido à limitação de

proteínas animais e ao seu alto custo, que acabam por incentivar a busca por novas fontes de

proteínas de origem vegetal (ENUJIUGHA; AYODELE-ONI, 2003; CRUZ et al., 2004;

IQBAL et al., 2006). Além disso, a necessidade de minimizar os riscos relacionados ao

consumo de alimentos de origem animal, o crescente aumento populacional e o número de

indivíduos que passam fome no mundo (cerca de um bilhão de pessoas) também aumentam a

necessidade da busca de novas fontes de nutrientes, em especial de proteínas (DURANTI,

1999; “International Food Policy Research Institute” (IFPRI, 2011).

Estudos relacionados à qualidade de proteínas como novas fontes alternativas de

nutrientes são de grande importância e muitos têm sido realizados sobre leguminosas

selvagens, há algum tempo, em diversas partes do mundo (RAJARAM; JANARDHANAN,

1992; ARINATHAN; MOHAN; DE BRITTO, 2003; ARUN et al., 2003), como, por

exemplo, os realizados na Nigéria com as espécies Centrosema pubescens, Tamarindus indica

e Cassia alata (UKHUN e IFEBIGH, 1988, 1989; ISHOLA; AGBAJI; AGBAJI, 1990),

Acacia colei e Acacia tumida, usados como alimentos pelo povo australiano e Cassia

floribunda Cav pelos indianos (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001), Vicia fava L. da região

da Antália (HACISEFEROGULLARE et al., 2003) e leguminosas selvagens do deserto de

Sonora, no México (ORTEGA-NIEBLAS; VÁSQUEZ-MORENO; ROBLES-

BURGUEÑO,1996). Segundo Ortega-Nieblas e colaboradores (1996), sementes e vagens de

leguminosas do gênero Acacia, Olneya e Prosopis têm sido utilizadas em diversos países para

consumo humano e animal.

O grande número de pesquisas em torno de leguminosas selvagens pode ser explicado

por serem cosideradas por Shim, Jun e Kang (2003), de alta qualidade, de alto valor

nutricional e apresentarem baixos teores de fatores antinutricionais, além desse fato ter sido

comprovado pelos estudos de Bravo, Grados e Saura-Calixto (1994) e Ortega-Nieblas,

32

Vásquez-Moreno e Robles-Burgueño (1996) que demonstraram que vagens de plantas do

gênero Prosopis são palatáveis e possuem alto valor nutricional e baixo teor de compostos

antinutricionais. Entretanto, a adaptação às condições adversas e à resistência a doenças e

pestes são as principais vantagens dessas plantas (MAIKHURI; NAUTIYAL; KHALI, 1991;

SRIDHAR; SEENA, 2006).

Investigação de leguminosas selvagens economicamente viáveis como uma alternativa

de alimento amplia as fontes de proteínas para nutrição humana. Porém, não basta apenas

disponibilizar essas fontes proteicas sem antes realizar os estudos da presença de fatores

antinutricionais, bem como análise de toxicidade (MAIKHURI; NAUTIYAL; KHALI, 1991;

PRAKASH; MISRA, 1983; SHIM; JUN; KANG, 2003).

As leguminosas são conhecidas por conterem compostos que prejudicam a utilização

de seus nutrientes, especialmente de suas proteínas quando incorporados nas dietas, causando

efeitos deletérios agudos ou crônicos. Esses compostos são tidos como antinutricionais e são

originados tanto do metabolismo primário quanto do metabolismo secundário das plantas, os

quais incluem os polifenóis, as lectinas, os inibidores de proteases, as ureases, o ácido fítico,

grupos cianogênicos, alcalóides, taninos, oligossacarídeos (α-galactosídios), as saponinas e as

toxinas, sendo responsáveis pela limitação do emprego de várias espécies de leguminosas na

alimentação e pelo aumento de produção de flatos (WIRYAWAN; DINGLE, 1999; SINDHU;

KHETARPAUL, 2001; VASCONCELOS et al., 2001; VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004;

JAIN; KUMAR; PANWAR, 2009).

Um dos alvos para aumentar a qualidade nutricional das leguminosas inclui a remoção

de fatores tóxicos e/ou antinutricionais, de compostos que tornam os sabores indesejáveis, de

alergénos potenciais e melhoria da digestibilidade (SHIM; JUN; KANG, 2003).

Recentemente, pesquisas sobre o desenvolvimento e a utilização de leguminosas selvagens

têm focado na superação do déficit nutricional e toxicidade de algumas dessas leguminosas

cultivadas (GUIL; RODRÍGUEZ-GARCÍA; TORIJA, 1997). Existem processamentos

capazes de minimizar ou mesmo excluir os efeitos deletérios dos compostos antinutricionais

como é o caso do aquecimento, visto que melhora a qualidade das proteínas de leguminosas

pela inativação de compostos antinutricionais termolábeis, como, por exemplo, de lectinas e

inibidores de tripsina (SWAMINATHAN, 1974; CHAU; CHEUNG; WONG, 1997; WANG

et al., 1997; VIJAYAKUMARI et al., 1998), além disso, melhora o sabor e a aceitação da

dieta. O processamento que consiste na retirada da casca das sementes retira taninos,

responsáveis pela diminuição da digestibilidade das proteínas (BRESSANI; ELIAS, 1980). O

tratamento de hidratação das sementes ajuda na retirada da casca, facilita o cozimento e extrai

33

alguns compostos antinutricionais que são solúveis em água (DURANTI, 2006). O processo

de germinação das sementes envolve o aumento de atividade enzimática de muitas enzimas

(amilase, proteases, fitase, lipase) levando à hidrólise das reservas das sementes, permitindo

melhor aproveitamento dos nutrientes (WIRYAWAN; DINGLE, 1999; THARANATHAN;

MAHADEVAMMA, 2003; DURANTI, 2006).

Os estudos referentes à qualidade nutricional de sementes de leguminosas selvagens

além de contribuir para o aumento de novas fontes de proteínas e nutrientes ainda é uma das

formas de valorização e preservação dos recursos naturais, tendo em vista a utilização na

alimentação humana (MATUDA; NETTO, 2005).

Pesquisas mostram que os grãos de leguminosas não são apenas fontes de macro e

micronutrientes, são também fontes de compostos ativos capazes de aumentar a promoção de

saúde dos indivíduos por prevenirem doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, entre outras

(BAZZANO et al., 2001; AMAROWICZ; PEGG, 2008; CHO et al., 2007; VILLEGAS et al.,

2008; LETERME, 2002). São utilizados para diversos outros fins, incluindo produção de

madeira, medicamentos, aditivos alimentares, como fontes de moléculas bioativas importantes

na agricultura, o que aumenta, ainda mais, sua importância e necessidade de ampliar as suas

fontes (DUTANTI, 2006).

2. COMPOSTOS ANTINUTRICIONAIS E/OU BIOATIVOS DE LEGUMINOSAS

A utilização de leguminosas na dieta como fonte de nutrientes, seja de proteínas, de

lipídios, de fibras, de vitaminas ou minerais, têm acrescido à dieta componentes que exercem

ação antinutricional como as lectinas, os inibidores de proteases, os compostos fenólicos, o

ácido fítico, grupos cianogênicos, alcalóides, taninos, ureases, oligossacarídeos, as saponinas

e as toxinas (CHITRA et al., 1995; OBOH et al., 1998; WIRYAWAN; DINGLE, 1999;

BURBANO et al., 1999; SINDHU; KHETARPAUL, 2001; VASCONCELOS et al., 2001;

VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004; JAIN; KUMAR; PANWAR, 2009), responsáveis pela

redução de utilização e do consumo dessas plantas como alimento, conforme já mencionado.

Entretanto, pequenas quantidades de componentes antinutricionais têm sido negligenciadas,

porque acredita-se que uma baixa quantia de um fator antinutricional não causa problemas no

sistema humano (SHIM; JUN; KANG, 2003). Ademais, muitos desses compostos

antinutricionais provocam efeitos fisiológicos além daqueles associados com a nutrição

34

humana essencial, sendo considerados compostos bioativos (CHAMP, 2002; BFC, 2004;

SUNEJA et al., 2011).

Efeitos fisiológicos benéficos no controle e prevenção de várias doenças metabólicas

(diabetes mellitus, doença cardíaca coronária e câncer de cólon) relacionados com a inclusão

de leguminosas na dieta diária já foram relatados e o interesse pelos mesmos vem aumentando

devido à sua capacidade de melhorar a qualidade de vida das pessoas que sofrem de distúrbios

metabólicos (SHEHATA et al., 1988; SIMPSON et al., 1981; THARANATHAN;

MAHADEVAMMA, 2003)

Os compostos antinutricionais que também são considerados bioativos são os

inbidores de tripsina, as lectinas, as ureases, as toxinas (todos proteínas) e, os polifenóis, os

alcalóides, os taninos, os compostos cianogênicos, as saponinas (todos metabólitos

secundários), entre outros, onde uma das funções da maioria deles está relacionada à defesa

de plantas contra pragas e/ou patógenos (WINK, 1998; MACEDO et al., 2006; OLIVEIRA

et al., 2007; WIESMAN; CHAPAGAIN et al., 2003; CHAUDHARY et al., 2008).

2.1 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Proteica

As leguminosas contêm em suas sementes, além dos nutrientes, proteínas como

inibidores de proteínas e de amilases, lectinas, proteínas de defesa e outras, que por várias

razões, são importantes para a qualidade nutricional e funcional das sementes. Uma das razões

da existência dessas proteínas é a capacidade de adaptação e necessidade de sobrevivência sob

condições naturais para a perpetuação da espécie (MURRAY, 1979; DURANTI, 2006).

2.1.1 Proteases

As proteases são enzimas com função de catalisar a hidrólise de ligações peptídicas de

proteínas. São classificadas como exopeptidases, que clivam ligações peptídicas nas

extremidades das proteínas (N- e C- terminais) e endopeptidases, com atividade catalítica no

interior das proteínas (FRANCO; MELO; SILVA, 1999). As endopeptidases também são

conhecidas como proteinases e são classificadas de acordo com o aminoácido presente em seu

35

sítio ativo e em seu mecanismo de ação em serínica, cisteínica, aspártica e metaloproteinases

(BARRETT, 1987). As quatro classes de proteinases têm sido encontradas em diferentes

órgãos e tecidos das plantas (RYAN; WALKER-SIMMONS, 1981). Realizam uma grande

variedade de funções em processos fisiológicos complexos. Em plantas e microorgnismos

atuam na esporulação e liberação do conídio, germinação (TORNERO et al., 1996; BEERS;

JONES; DICKERMAN, 2004), reconhecimento de patógenos, indução de respostas de defesa

(AVROVA et al., 1999; LIU; DAMMANN; BHATTACHARYYA, 2001), degradação de

proteínas de reserva (KEMBHAVI et al., 1993), ativação de zimogênios, degradação de

proteínas defeituosas (RUDENSKAYA et al., 1995) e morte celular programada (SOLOMON

et al., 1999). Substâncias que atuam em proteases de microorgismos podem perturbar seu

desenvolvimento normal e causar inibição de seu crescimento. Em seres humanos e animais,

apresenta papel crucial em muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como catabolismo

de proteínas, cogulação do sangue, liberação de hormônios, ativação de zimogênios,

transporte de proteínas secretoras, crescimento e migração celular, morfogenia e

desenvolvimento, inflamação, crescimento de tumores e metástase (GODFREY; WEST,

1996). Compostos capazes de atuarem em proteases tumorais poderão ser utilizados como

ferramentas contra câncer (CLEMENTE et al., 2004), como é o caso dos inibidores de

proteases.

Proteases provenientes de plantas de grande interesse e utilização são a papaína,

bromelina, e a queratinase (MORIHARA; ODA, 1993). Suas diversas funções fazem dessa

classe de proteínas importantes ferramentas bioativas usadas para uma infinidade de

aplicações industriais e biotecnológicas. A FIGURA 1 mostra as enzimas utilizadas no

mercado mundial. Cerca de 60 % do mercado total de enzimas são produzidas pela indústria

mundial, destas uma boa parcela é usada nas áreas de alimentação e de detergentes

(GODFREY; WEST, 1996; MAURER, 2004), além da farmacêutica, onde são muito

utilizadas para a fabricação de pomadas cicatrizantes. Devido à participação em etapas

fisiológicas importantes que ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no

ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos, as proteases

tranformam-se em um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de novos

compostos farmacêuticos (MONSAN et al., 1978; SUTAR et al., 1986; KALISZ, 1988).

36

FIGURA 1 – Enzimas utilizadas no mercado mundial (Fonte: RAO et al., 1998).

2.1.2 Inibidores de Tripsina

Os inibidores de tripsina são proteínas capazes de se complexarem com as enzimas

tripsina e quimiotripsina inibindo a atividade catalítica das mesmas (ORRU; DEMEL, 1941;

OLIVEIRA et al., 2007) e dessa forma prejudicam o processo digestivo por reduzir a

digestibilidade de proteínas, causando reações fisiológicas indesejadas como a indução de

hipertrofia e hiperplasia pancreática. Posteriormente, foi descoberto que os inibidores de

tripsina também afetam o crescimento quando presente em dietas contendo aminoácidos livres

(LIENER, 1976; LIENER, 1994: LAJOLO; GENOVESE, 2002). Experimentos com animais

mostram que seu consumo promove moderada redução no ganho de peso e uma significante

redução na utilização líquida de proteínas (PUSZTAI et al., 1992).

O mecanismo de ação dos inibidores de tripsina na dieta (do tipo Kunitz e Bowman

Birk), seria a supressão da regulação por “feedback” negativo da secreção pancreática através

do aumento da liberação de hormônio colecistocinina (LIENER, 1994). Entretanto, de acordo

com as observações de Pustzai e colaboradores (1997), esse efeito não é decorrente apenas da

redução de proteases no intestino, a simples presença desses inibidores no intestino já provoca

liberação do hormônio colecistocinina. Contudo, os efeitos negativos são manifestados com a

alta ingestão do inibidor, como ocorre quando as sementes de leguminosas são consumidas

37

cruas, posto que são termoestáveis e o aquecimento é capaz de causar desnaturação,

provocando redução considerável em sua atividade inibitória (VIDAL-VALVERDE, 1994;

HABIBA, 2002).

Em contraposição à sua atividade antinutricional, uma vez inativados, os inibidores de

tripsina podem contribuir positivamente na dieta devido ao seu alto conteúdo de aminoácidos

contendo enxofre em relação à maioria das proteínas das sementes (RYAN, 1990). Além

disso, também possuem efeito de proteção contra câncer (BANERJI; FERNANDES, 1994;

WANG et al., 1999; ARMSTRONG et al., 2000; LAJOLO; GENOVESE, 2002; MATHERS,

2002; MURILLO; CHOI; PAN, 2004). Estudos com inibidor de tripsina da soja apontam ação

contra certos tumores na mama e no cólon. Sua atividade anticancerígena parece estar

envolvida com o controle da atividade enzimática de tumores (KENNEDY, 1995; 1998a,b;

CLEMENTE et al., 2004). A atividade contra certos tipos de cânceres requer que o inibidor

esteja em sua conformação nativa, não podendo, dessa forma, utilizar tratamento térmico

prolongado ou com temperaturas muito elevadas para o preparo de leguminosas, pelo fato

desse processamento ser capaz de desnaturá-lo completamente (LAJOLO; GENOVESE,

2002). No entanto, essa desnaturação não ocorre com o cozimento convencionalmente

utilizado para leguminosas, antes do consumo. Os inibidores de tripsina da soja mostram

atividade anti-inflamatória pela inibição de protease mediadora da inflamação, tendo sido

relatada redução de colite ulcerativa em ratos (WARE et al., 1999). Já existem patentes para o

uso de inibidores de tripsina da soja no combate à obesidade, a doenças degenerativas e auto-

imunes (WARE et al., 1999; FREITAS et al., 2003; ROSTAMI; KENNEDY, 2004;

SWEENEY; MORRIS; KENNEDY, 2005).

O inibidor de tripsina presente nas sementes de leguminosa possui um importante

papel na defesa do vegetal contra a herbivoria, além de evidências de seu envolvimento em

resposta à injúria (ECKELKAMP; EHMANN; SCHOPFER, 1993; LIN et al., 2006;

LEDOIGT et al., 2006). Dessa forma, sua ação não se restringe somente aos seres humanos,

também é responsável por causar efeitos deletérios aos insetos que se alimentam de grãos

(HILDER et al., 1987; JOHNSON et al., 1989; McMANAUS et al., 1995; GROSJEAN apud

VAN DER POEL et al., 1993; LAWRENCE; KOUNDAL, 2002), agindo de forma

semelhante, já que impede a ação das proteases serínicas dos insetos sobre seu substrato,

impedindo o aproveitamento de nutrientes, atrapalhando o desenvolvimento normal dos

mesmos (URWIN et al., 1997; MACEDO et al., 2000). Atua frente a vários nematóides

patogênicos como Globodera tabacum, Globodera pallida, e Meloidogyne incognita

(WILLIAMSON; HUSSEY, 1996). É capaz de interferir, ainda, na germinação de esporos e

38

crescimento micelial de fungos fitopatogênicos (DUNAEVSKII et al., 1997; WANG; NG,

2006b). Sua atuação frente a pragas e patógenos insere-o no grupo de proteínas bioativas com

boas características para serem aproveitadas para o desenvolvimento de culturas transgênicas

resistente a pragas e patógenos, como já tem sido observado (SANE et al., 1997; ALTPETER

et al., 1999; FALCO; SILVA, 2003), podendo proteger grãos de leguminosas

economicamente importantes e, quem sabe, ainda trazendo benefícios aos seres humanos.

2.1.3 Lectinas

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas, amplamente distribuídas na natureza, que

possuem como característica a ligação a carboidratos presentes na superfície celular.

Apresentam especificidade e grau de afinidade variado a diferentes carboidratos, desse modo,

são capazes de aglutinar eritrócitos de alguns ou de todos os grupos sanguíneos in vitro

(GONZÁLEZ et al., 2002). Apresentam mais de um papel fisiológico nas plantas, como

função de proteínas de reserva, crioprotetoras e moduladoras de atividade enzimática

(RÜDIGER, 1998) e principalmente, como proteínas de defesa, exercendo efeito

antinutricional em insetos e animais (PEUMANS; VAN DAMME, 1995; VASCONCELOS;

OLIVEIRA, 2004). O efeito antinutricional em animais ocorre pela sua capacidade de

interação com glicoconjugados, encontrados nas células gástricas e nos enterócitos,

interferindo negativamente no aproveitamento de nutrientes da dieta devido à sua resistência à

proteólise (SAGARBIERI, 1996; SASAKI et al., 2002, VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004;

OLIVEIRA et al, 2004a,b).

A toxicidade de lectinas, quando consumidas em dietas por animais experimentais, é

caracterizada pela inibição do crescimento desses animais, por causar danos ao epitélio e

indução de aumento do intestino delgado, e, por estimular a hiperplasia e a hipertrofia do

pâncreas, além de diarréia, náuseas, distensão abdominal e vômitos, quando consumidas

ativas por seres humanos (LIENER; SHARON; GOLDSTEIN, 1986; BARDOCZ et al., 1992;

1996). De forma similar aos inibidores de tripsina, as lectinas também parecem estimular a

secreção pancreática de enzimas digestivas, mas modulada apenas parcialmente pela

colecistocinina (GRANT et al., 1999). Outro efeito indesejado dessas proteínas é a promoção

de alergia alimentar provocada por afetar a resposta imune contra a ovoalbumina (CAMPOS-

VEGA et al., 2009a).

39

O processamento térmico adequado pode reduzir essa toxicidade das lectinas, no

entanto baixa temperatura ou cozimento insuficiente pode não inativar completamente a

mesma (VAN DRIESSCHE, 1988; LINNER, 1994).

Em contrapartida, as lectinas são consideradas moléculas bioativas há bastante tempo,

por possuir numerosos efeitos já observados incluindo indução de hiperplasia do intestino

delgado, mudanças na flora intestinal, atividade imunomoduladora, interferência na secreção

hormonal, acesso ao sistema circulatório, afinidade por antígenos tumorais, inibição da

proliferação de células leucêmicas e da resposta mutagênica, entre outras. São, por isso,

consideradas ferramentas importantes na medicina. Apesar de suas inúmeras propriedades

terem dificultado a sua utilização médica, numerosos relatos mostram que, em modelos

animais, as lectinas podem limitar o crescimento de tumores cancerígenos no intestino através

da promoção de hiperplasia do epitélio do intestino ou outros fatores e parecem estar

envolvidas no decréscimo de insulina e de lipídios no sangue, o que as tornam úteis para o

tratamento terapêutico de câncer e de obesidade (PUSZTAI; BARDOCZ, 1996; PUSZTAI et

al., 1998; PRYME et al., 1998; MATSUÍ et al., 2001; HARLAND, 2002; VEJA; PÉREZ,

2006; WONG; NG, 2006; WONG et al., 2006; GABOR; KLAUSEGGER; WIRTH, 2001;

YAN et al., 2005; MACEDO et al., 2006).

A característica de ligação a carboidratos com variado grau de especificidade confere

as lectinas multifuncionalidade e aplicação em pesquisa biomédica e biotecnológica, sendo

utilizadas como agentes defensivos na agricultura, através da engenharia genética, contra

predadores, por serem ativas contra fungos (CIOPRAGA et al., 1999; MELO et al., 2005;

XIA; NG, 2005; NGAI; NG, 2007), bactérias e insetos incluindo ação contra Aedes aegypti,

vetor da dengue (PEUMANS et al., 2000; GAIDAMASHVILI; VAN STADEN, 2002;

COELHO et al., 2009).

Segundo Silva e Silva (2000) podem ser úteis na investigação de estrutura de proteína

e carboidratos em células, na purificação e caracterização de polissacarídeos e

glicoconjugados (LIMA et al., 1997), na estimulação da mitogênese de linfócitos (abrindo

novas perspectivas no campo da imunologia) e na aglutinação de células cancerígenas, sendo

utilizadas nos estudos de oncogênese (SHARON; LIS, 2004).

Diante do exposto, lectinas são proteínas biologicamente ativas que podem ser

aproveitadas para diversos fins e sua exploração para possíveis usos na clínica médica e na

agricultura é muito atrativa.

40

2.1.4 Ureases

As ureases são enzimas (EC 3.5.1.5, uréa aminohidrolase) que catalisam a hidrólise de

uréia a amônia, dióxido de carbono e água (ROSENTHAL, 1974, STAPLES; REITHEL,

1976; DIXON et al.,1980). Segundo Polacco e Holland (1993) e Sirko e Brodzik (2000),

pouco se sabe sobre o papel fisiológico de ureases em plantas, embora seja abundante nos

vegetais. Acredita-se que está envolvida, juntamente com a arginase, na utilização das

proteínas de reserva durante a germinação (THOMPSON, 1980) e tem sido proposto papel

na assimilação de uréia derivada do metabolismo de ureídeos (SHELP; IRLANDA, 1985) ou

importados a partir do ambiente uma vez que a uréia é um fertilizante foliar efetivo (ZONIA;

STEBBINS; POLACCO, 1995).

Uma hipósete compartilhada por muitos autores é que a urease desempenha algum

outro papel importante nos vegetais, porque o seu substrato, uréia, não é o principal

metabólito de planta (POLACCO; HOLLAND, 1993). Supõe-se o envolvimento de urease na

defesa de vegetais (CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002), uma vez que a atividade ureolítica de

urease é realizada em um sítio diferente de outras atividades relatadas para ela (FOLLMER et

al., 2001, 2004), além disso a distribuição e acúmulo de urease em sementes de leguminosas

durante a maturação do embrião são sugestivos de um outro importante papel fisiológico.

Sabendo que existe uma isoforma de ureases de plantas (canotoxina de Canavalia ensiformis)

que é letal para ratos e camundongos, quando injetados por via intraperitoneal, que inibem

fungos fitopatogênicos e são ativas contra insetos Coleoptera e Hemíptera (OLIVEIRA et al.,

1999; CARLINI; GUIMARAES, 1981; FOLLMER et al., 2001; CARLINI; GROSSI-DE-SA,

2002), e, que urease purificada de Canavalia ensiformis também apresentaram atividade

contra outros fungos fitopatogênicos (BECKER-RITT et al., 2007), esses dados podem

reforçar a possibilidade de sua participação na defesa do vegetal contra insetos e fungos

fitopatogênicos.

As ureases são amplamente difundidas nos vegetais, fungos e bactérias (MOBLEY e

HAUSINGER, 1989). As ureases bacterianas, tais como as de Proteus mirabilis e

Helicobacter pylori desempenham um importante papel na patogênese de doenças animais e

humanas (MOBLEY; ISLAND; HAUSINGER, 1995; OLIVERA-SEVERO; WASSEMANN;

CARLINI., 2006). A H. pylori coloniza especificamente a mucosa e as microvilosidades

gástricas das células epiteliais, através de sua potente atividade ureásica, que promove a

alcalinização da acidez do estômago, permitindo sua sobrevivência em um meio ácido

41

(OPLUSTIL et al., 2001). A produção de amônia pela urease bacteriana através da hidrólise

da uréia presente no estômago apresenta atividade citotóxica, aumentando a permeabilidade

da célula epitelial para prótons, e talvez participe como mediadora da resposta imune local, já

que é potente ativadora de monócitos in vitro (GOBERT et al., 2002; VOLAND et al., 2003).

Embora pouco compreendido, tem sido sugerido um papel antinutricional para ureases de

plantas e especula-se que sua ação possa estar relacionada com o mecanismo de ação das

ureases de H. pylori no estômago (POLACCO; HOLLAND, 1993). Em concordância à teoria

de urease como fator antinutricional estão os achados de Vasconcelos e colaboradores (2001),

que relacionaram a qualidade nutricional da proteína da soja com a presença de vários

compostos tóxicos e/ou antinutricionais e mostraram, através de uma análise de regressão, que

a urease é uma variável que estava envolvida nessa toxicidade, interferindo em alguns

parâmetros nutricionais. No entanto, assim como para os inibidores de tripsina e as lectinas, as

ureases também são termolábeis e podem ter sua atividade reduzida por tratamento térmico, o

que irá aumentar a qualidade nutricional (ZHU; RIAZ; LUSAS, 1996; RAJKO; SZABO,

1997; DUDLEY-CASH, 1999).

2.1.5 Toxinas

Segundo Sgarbieri (1996), as toxinas são encontradas em diferentes organismos,

incluindo as plantas, estando envolvidas na defesa do vegetal em conjunto com outras

substâncias. Quando consumidas por via oral, ou administrada por vias endovenosa ou

intraperitoneal, as proteínas tóxicas provocam alterações fisiológicas em algum parâmetro

biológico dos organismos que entraram em contato com determinadas quantidades das

mesmas. Sua toxicidade depende da quantidade, da via e da proteína utilizada (OLIVEIRA,

2009).

As toxinas vegetais são, em sua maioria, metabólitos secundários e causam riscos à

saúde humana e animal que as consomem em grandes quantidades. Se essas toxinas forem

consumidas em quantidades moderadas também agirão como agentes antinutricionais, com

exemplo os alcalóides, os glicosídeos cianogênicos, os oxalatos, os fenóis, os inibidores de

protease, os taninos, as lectinas, entre outros. Agem inibindo ou bloqueando importantes rotas

do metabolismo, especialmente a digestão por agirem contra enzimas, vitaminas, minerais e,

principalmente, proteínas, reduzindo o valor nutritivo do alimento (NOVAK; HASLBERGR,

42

2000). Entretanto, proteínas tóxicas tais como a soyatoxina (SYTX), a toxina da soja (SBTX)

e a Glycine max toxina (Gm-TX) isoladas e caracterizadas por Vasconcelos et al. (1994) e

Siebra (1998) e Oliveira (2009), respectivamente, já foram encontradas em soja e quando

injetadas por via intraperitoneal, em camundongos, ou ratos, produzem dispnéia, paralisia

flácida, convulsões tônico-clônicas e morte.

As toxinas da soja não são capazes de afetar parâmetros de avaliação da qualidade

nutricional (ganho de peso, utilização líquida de proteínas, digestibilidade e consumo de

alimentos) de ratos, mas causa efeitos negativos em alguns órgãos, como intestino delgado e

pâncreas (VASCONCELOS et al., 2001), caracterizando sua toxicidade. Muitas toxinas são

relativamente termoestáveis e somente parcialmente inativadas durante o tratamento térmico.

(PEUMANS; VAN DAMME, 1996; CARLINI; UDEDIBIE, 1997). Este fato torna relevante

a investigação de presença de toxinas em fontes que servirão de alimentos para seres humanos

e/ou animais no intuito de proteção da saúde de ambos.

Estudos realizados por Morais (2010) sugerem a participação da toxina da soja

(SBTX) no mecanismo de defesa de plantas, uma vez que seus níveis são aumentados em

resposta a injúria mecânica e possui atividades frente a fungos fitopatogênicos. Esses achados

fazem dessa proteína tóxica, ou mesmo de outras, boas candidatas para a biotecnologia em

plantas, pois os genes de proteínas tóxicas já têm sido introduzidas nos genomas de culturas

importantes no intuito de torná-las resistentes a patógenos e insetos e estão sendo testadas nas

condições de campo ou em vias de comercialização (PEFEROEN, 1997; SCHULER et al.,

1998; JOUANIN et al., 1998; HILDER; BOULTER, 1999).

2.1.6 Quitinases

Quitina é um homopolissacarídeo altamente estável e insolúvel, formado por ligações

de resíduos de β-1,4-N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) (BRUNNER et al., 1998). Representa

o composto orgânico mais abundante na natureza, depois da celulose (LEE et al., 2007), por

isso amplamente distribuída, estando presente nas carapaças de crustáceos, em conchas de

moluscos, na cutícula, no exoesqueleto e na membrana peritrófica de insetos, e, na parede

celular de fungos e de algas verde, estando ausente em plantas superiores e animais incluindo

o homem (GOODAY, 1990; BRUNNER et al., 1998; SONGSIRIRITTHIGUL et al., 2008).

Esse biopolímero tem atraído significativa atenção nas áreas farmacológicas, biomédicas,

43

nutrição e nos campos agrícolas e biotecnológicos (MUZZARELLI; JEUNIAUX; GOODAY,

1986; BRINE; SANDFORD; ZIKAKIS, 1992; YAMADA et al., 1993; PICHYANGKURA et

al., 2002; SASHIWA et al., 2003; TANGSADTHAKUN et al., 2007; KACHANECHAI;

JANTAWAT; PICHYANGKURA, 2008; SONGSIRIRITTHIGUL et al., 2008), por originar

oligossacarídeos como quitoligossacarídeos [(GlcNAc)6 e (GlcNAc)7], glicosaminas e

GlcNAc conhecidos por possuírem várias atividades biológicas incluindo atividade

antitumoral e utilização no tratamento de osteoartrite (SUZUKI et al., 1985; SHIRO et al.,

1996).

Quitinases (EC 3.2.1.14) são as principais enzimas que catalisam a hidrólise de

quitina. Existem muitos tipos de quitinases em sementes de plantas e muitas sintetizam várias

isoformas de quitinases (COLLINGE et al., 1993; GRAHAM; STICKLEN, 1994), já tendo

sido purificadas de sementes de cereais como a cevada (LEAH et al., 1991) e leguminosas,

como o feijão de corda (GOMES et al., 1996), soja (YEBOAH et al., 1998), entre outras.

Essa enzima é dividida em cinco classes de acordo com sua estrutura (YAMAGAMI;

ISHIGURO, 1998) e são consideradas proteínas relacionadas a patogêneses (PR-proteínas),

sendo produzidas constitutivamente e não apenas em resposta a estresses bióticos ou abióticos

(FLACH; PILOT; JOLLES, 1992; COLLINGE et al., 1993). Em micro-organismos estão

envolvidas na morfogênese da parede celular e processos nutritivos (EL-KATANY et al.,

2001).

Devido à ausência de quitina nos vegetais é sugerido seu envolvimento na defesa de

plantas contra patógenos (ONAGA; TAIRA, 2008), principalmente frente a fungos

(SCHLUMBAUM et al., 1986). O fato de a quitina ser o principal componente estrutural da

parede de fungos fitopatogênicos (BARTNICK-GARCIA, 1968; WESSELS; SIETSMA,

1981) faz das quitinases importantes proteínas bioativas contra esse patógeno, demonstrando

seu potencial em proteger culturas economicamente importantes (MAUCH; MAUCH-MANI;

BOLLER, 1988; NIELSEN; JORGENSEN; MEKKELSEN, 1994; GOMES et al., 1996).

Entretanto, algumas quitinases não apresentam atividade antifúngica (TAIRA et al., 2005).

Seu papel fisiológico não parece ser somente de defesa de plantas, pois parece possuir

diferentes papéis em diferentes espécies. Kasprzewska (2003) sugere seu envolvimento na

interação com micro-organismos simbióticos e em processos de desenvolvimento

(embriogênese). Além disso, está envolvida na regulação da modulação de moléculas sinais e

morte celular programada (GOORMACHTIG et al., 1998; DE JONG et al., 1992;

HELLEBOID et al., 2000; PASSARINHO et al., 2001).

44

As quitinases também são usadas para reciclar lixo como restos de carapaças de

artrópodes, e para a produção de quito-oligossacarídeos e produção de antifúngico para seres

humanos (PATIL et al., 2000; WANG; HWANG, 2001; DAHIYA; TEWARI; HOONDAL,

2006). O uso de quitinases na Biotecnologia através da engenharia genética é uma ferramenta

promissora importante para a redução dos riscos e desvantagens inerentes aos métodos e

proteção tradicional, já que além da ação contra fungos, apresenta-se ativa frente a

nematóides, insetos e bactérias (GOODAY, 1990; DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006).

Pelo exposto, percebe-se que as aplicações biotecnológicas de quitinases são diversas

e amplamente utilizadas na agricultura, indústria e proteção ambiental em plantas transgênicas

(LORITO et al., 1998; FELSE; PANDA, 1999; PATIL et al., 2000; WANG; HWANG, 2001;

KISHIMOTO et al., 2004), conferindo um grau de importância elevado para essa proteína

devido sua à vasta bioativiade.

2.1.7 ββββ-1,3- glucanases

As glucanas são polímeros de carboidratos que podem ter centenas ou milhares de

unidades monossacarídicas ligadas entre si por ligações glicosídicas e diferem uma das outras

pelo tipo de ligação, comprimento de suas cadeias polissacarídicas e pelo grau de ramificação

(BAUERMEISTER, et al., 2010). A β-1,3-glucana, como a quitina, é um dos principais

componentes estruturais da parede celular de fungos e exoesqueleto de insetos, sendo o

componente encontrado em maior quantidade na parede celular de leveduras (ZHU et al.,

1994; PINHEIRO et al., 1999; KIM; CHANG; YUN, 2004). As β-1,3-glucanas podem ser

hidrolisadas pelas β-1,3-glucanases para diferentes finalidades.

As β-1,3-glucanases ao degradarem as β-1,3-glucanas liberam glucose e

oligossacarídeos, como produtos finais da reação, e em um período mais longo, apenas

moléculas de glucose (GIESE et al., 2006). Elas podem ser do tipo exo- (EC 3.2.1.58) ou

endoglucanases (EC 3.2.1.39) e também fazem parte das PR proteínas (PR-2). São

amplamente distribuídas em plantas superiores e são induzidas durante a resposta de

hipersensibilidade da planta a patógenos (BUCHER et al., 2001), participando diretamente do

processo de defesa de plantas por degradarem as β-1,3-glucanas constituintes estruturais de

alguns patógenos (STONE; CLARKE, 1992; SUTHERLAND, 1999; IORIO et al., 2008;

FLEURI; SATO, 2008), apresentando atividade antifúngica quando analisada in vitro

45

(MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER , 1998; SELA-BUURLAGE et al., 1993;

VOGELSANG; BARZ, 1993). Já tendo sido utilizada na engenharia genética, juntamente

com as quitinases, para a produção de plantas transgênicas de tomate e de tabaco conferindo

um aumento na resistência desses vegetais, quando comparada à ação isolada de cada uma

delas, ou seja, sua atividade frente a patógenos é bem superior quando as quitinses também

estão presentes e vice versa, mostrando sinergismo de ambas (STINTZI et al., 1993;

JONGEDIJK et al., 1995; JACH et al.,1995).

Os gluco-oligossacarídeos originados da atuação das β-1,3-glucanases possuem

potencial bioativo e têm sido descritos como agentes antitumorais (BARBOSA et al., 2004),

imunomoduladores e indutores de resposta anti-inflamatória, mediada pelas células do sistema

imune, através da indução de mediadores pró- e anti-inflamatórios. O mecanismo de ação

antitumoral tem sido relacionado à indução das diversas respostas imunológicas do

hospedeiro, principalmente pela ativação das células “natural killer” (NK) (BARBOSA;

DEKKER; GIESE; BARBOSA; DEKKER, 2010).

As β-1,3-glucanases podem ainda, auxiliar na purificação de produtos presentes em

células bacterianas como peptídeos, polissacarídeos, proteínas recombinantes, ácidos

nucléicos, pigmentos, enzimas, lipídios, entre outros, além do potencial de aplicação para o

preparo de protoplastos e fusão celular. Ressalta-se ainda a produção de extrato de levedura

(FLEURI; SATO, 2008). Portanto, As β-1,3-glucanases possuem diferentes aplicações

biotecnológicas, visto que atuam sobre diversas substâncias naturais que possuem ligações β-

1,3- glicosídicas, podendo ser aplicadas na agricultura, em indústrias de alimentos (na

produção de bebidas como vinhos e cervejas), farmacêutica (oligossacarídeos com atividades

funcionais) e laboratorial, entre outros (DUBOURDIEU et al., 1985; KIRK; BORCHET;

FUGLSANG, 2002; BLASCO et al., 2006; GIESE; BARBOSA; DEKKER, 2010;

BARBOSA; DEKKER; GIESE, 2010).

2.2 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Não Proteica

Os metabólitos secundários são oriundos do metabolismo secundário dos vegetais, isto

é, produtos que não apresentam uma função direta nas atividades bioquímicas primárias,

responsáveis pelo crescimento, desenvolvimento e reprodução. Compreendem uma ampla

gama de substâncias de diferentes famílias, tais como compostos fenólicos, terpenóides, óleos

46

essenciais e compostos nitrogenados como alcaloides, entre outros. São altamente induzidos

em resposta ao estresse. Muitos deles são responsáveis pelos efeitos medicinais, ou tóxicos,

das plantas e apresentam grande importância ecológica, uma vez que podem atuar na atração

de polinizadores ou representar uma defesa química contra estresse ambiental (BALADRIN et

al., 1985; Di STASI, 1995; RISPAIL; NASH; WEBB, 2005). São considerados

antinutrientes, agindo como barreira para o uso de leguminosas como alimento e,

simultaneamente, conferindo efeitos benéficos sendo, assim, considerados nutracêuticos,

fazendo parte dos chamados alimentos funcionais (CHAMP, 2002; JAMROZ; KUBIZNA,

2008; CAMPOS-VEGA et al., 2009a). Exemplos desses compostos são os alcaloides,

compostos fenólicos, taninos, as saponinas, entre outros.

2.2.1 Alcaloides

Os alcaloides ocorrem naturalmente como aminas tóxicas produzidas pelas plantas,

estando presente em diversos vegetais incluindo sementes de leguminosas como tremoço

(WINK et al., 1995). São incolores, geralmente básicos, insolúveis em água e solúveis em

solventes orgânicos. Todos os alcaloides contêm nitrogênio, geralmente formando parte de

uma estrutura heterocíclica. Os efeitos tóxicos de alcaloides resultam em perturbações no

sistema nervoso central, processos digestivos, reprodução e sistema imunológico (LALLÈS;

JANSMAN, 1998). Existem muitos alcaloides conhecidos, mas nem todos são tóxicos. Dentre

esses compostos, o alcaloide quinolizinínico é o fator antinutricional mais importante e seu

alto conteúdo em dietas à base de leguminosas é a razão para vários efeitos deletérios no

organismo, tais como diminuição da palatabilidade, consumo e utilização da dieta

(GODFREY et al., 1985; DONOVAN et al., 1991).

Há muito tempo, é conhecida a ação dos alcaloides na defesa de plantas contra a

herbivoria (WALLER; NOWACKI, 1978; WINK, 1998) e possuem efeitos antihelmínticos

(HOCQUEMILLER et al. 1991; KAYSER; KIDERLEN; CROFT, 2003), antibacteriano

(CASTILHOS et al., 2007) contra, por exemplo, as espécies Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus thuringensis, Bacillus subtilus and Staphylococcus aureus (JUL et al.,

2003) e antifúngico (WINK; MOHAMED, 2003), frente os fungos fitopatogênicos Alternaria

porri, Piriculata oryzae, Helminthosporium carbonum, Fusarium oxysporum e Aspergillus

oryzae (JUL et al., 2003), por exemplo. Apresentam, ainda, propriedades farmacológicas e já

47

têm sido usados para o tratamento clínico de câncer, parkinsonismo, hipertensão e desordem

no metabolismo central (RATHBONE; BRUCE, 2002).

2.2.2 Composto Fenólicos

Os compostos fenólicos possuem uma ou mais hidroxilas (OH) ligados ao anel

aromático, podendo apresentar vários grupos substituíntes e estão entre os metabólitos

secundários mais difundidos (CASTRO et al., 2004). Os polifenóis são exemplos destes e sua

classe mais importante é a dos ácidos fenólicos que compreendem estruturas poliméricas tais

como taninos hidrolisáveis, lignanas, estilbenos, e flavonóides. Os flavonoides incluem as

flavonas, as isoflavonas, flavanonas, antocianidinas e os flavonois (catequinas e

proantocianidinas, conhecidos como taninos condensados) (SCALBERT; WILLIAMSON,

2000; MANACH et al, 2004).

Os polifenóis possuem uma enorme variedade de funções que envolvem tanto o

desenvolvimento natural da planta como sua proteção contra predadores e micro-organismos

patogênicos (DUTHIE; DUTHIE; KYLE, 2000; SCHIJLEN et al., 2004;

KALOGEROPOULOS et al., 2010). Para se defenderem de predadores como os herbívoros,

que incluem os seres humanos, possuem a capacidade de se ligarem a proteínas positivamente

carregadas, aminoácidos e/ou cátions multivalentes ou minerais como cálcio, ferro e zinco nos

alimentos (GILANI; COCKELL; SEPEHR., 2005). Assim, reduz a digestão e absorção desses

nutrientes, diminuindo a qualidade do alimento. Embora considerados antinutricionais

também apresentam propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antidiabéticas e

antitumorais, contribuindo para o decréscimo de patologias degenerativas relacionadas com a

idade e apresentando um papel positivo contra alguns tipos de câncer, tais como os de

pulmão, próstata, pele e cólon e são associadas como baixa incidência de doenças

cardiovasculares (KRIS-ETHERTON et al., 2002), além de funções defensivas contra

infecções (atividades antimicrobianas) e injúrias (DECKER,1995; BARNES; ANDERSON;

PHILLIPSON, 2001; THARANATHAN; MAHADEVAMMA, 2003; PETTI E SCULLY,

2009).

Dessa forma, enquanto o baixo conteúdo de fenóis é preferido para os atributos

nutricionais, altos níveis desses compostos bioativos são importantes, do ponto de vista de seu

uso biotecnológico, na proteção e combate de doenças para humanos e plantas.

48

2.2.3 Taninos

Os taninos são compostos fenólicos solúveis em água compreendendo um grande

grupo de substâncias complexas muito disseminadas no reino vegetal. Em quase todas as

famílias botânicas há espécies que contêm taninos, estando presentes em cereais como a

cevada e o sorgo e em leguminosas como a fava e a ervilha, entre outras (JANSMAN, 1993).

São encontrados, principalmente, nas cascas das sementes (BALOGUN; FETUGA, 1986;

JOSEPHINE; JANARDHANAN, 1992). Podem ser divididos em dois grupos os hidrolisáveis

e os não hidrolisáveis ou taninos condensados (FERRÃO et al., 2003). Ambos possuem a

característica de se complexarem com proteínas e polissacarídeos, impedindo a ação

enzimática sobre o complexo, além de possuir afinidade de ligação a íons metálicos, tais

como vanádio, ferro, cobre, manganês, alumínio, cálcio, entre outros (JANSMAN, 1993;

FERRÃO et al., 2003). Um dos efeitos antinutricionais de taninos é a redução da

palatablidade devido às suas propriedades adstringentes, as quais são causadas pela formação

de complexos entre os taninos e as glicoproteínas presentes na saliva, durante a mastigação

(REED, 1995). Apresentam ainda redução de digestibilidade de carboidratos além das

proteínas, causando redução no crescimento (VADIVEL; JANARDHANAN, 2005). Embora

termoestáveis, o nível de taninos em leguminosas pode ser reduzido por simples tratamentos

como retirada de suas cascas e hidratação das sementes seguidas de tratamentos térmicos

como autoclavagem, por exemplo (RAO; DEOSTHALE, 1982; SIDDHURAJU;

VIJAYAKUMARI; JANARDHANAN, 1996; VIJAYAKUMARI et al., 1996; RANI; HIRA,

1998).

Em contraposição às propriedades antinutricionais, os taninos, são compostos

bioativos com propriedades bioquímicas e farmacológicas in vitro, incluindo atividade

antioxidante, conhecida por trazer benefícios à saúde (SRIDHAR; SEENA, 2006),

Apresentam efeitos antihelmintico (KAYSER; KIDERLEN; CROFT, 2003), antitumoral,

antimicrobiano e antiviral (HASLAM et al., 1989; OKUDA; YOSHIDA; HATANO, 1992;

HASLAM, 1996).

49

2.2.4 Saponinas

As saponinas são moléculas estruturalmente diversas e quimicamente referidas como

triterpenos e glicosídeos esteroidais. Consistem em agliconas não polares associadas a um ou

mais monossacarídeos (OLESZEK, 2002), são caracterizadas por suas propriedades

surfactantes e por formar espuma em soluções aquosas (OLESZEK; BIALY, 2006). Possuem

inúmeras propriedades, as quais incluem a doçura e o amargor (GRENBY, 1991;

KITAGAWA, 2002; HENG et al., 2006b), formação de espumas e propriedades

emulsificantes (PRICE; JOHNSON; FENWICK, 1987), hemolíticas (SPARG; LIGHT; VAN

STADEN, 2004; CAMPOS-VEGA et al., 2009a), farmacológicas e medicinais, devido à sua

capacidade de redução da pressão arterial e do colesterol do fígado (OAKENFULL et al.,

1984; ATTELE; WU; YUAN, 1999), as quais levam à diminuição dos riscos de doenças

cardiovasculares (KORATKAR; RAO, 1997; DURANTI, 2006). Apresentam efeito protetor

contra câncer (MATHERS, 2002), aliada a propriedades antimicrobianas, anti-inseticidas

(incluindo contra larva de Aedes aegypti) e moluscicidas (WIESMAN; CHAPAGAIN, 2003;

SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004; SANTIAGO et al., 2005; JAMROZ; KUBIZNA,

2008). Têm sido utilizadas em bebidas e confeitaria, bem como em produtos cosméticos

(PRICE; JOHNSON; FENWICK, 1987; PETIT et al, 1995; UEMATSU; HIRATA; SAITO,

2000) e farmacêuticos (SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004).

Seu efeito antinutricional, provavelmente, se dá por meio da ligação a células

intestinais afetando a absorção de nutrientes pela parede intestinal ou pelo aumento da

permeabilidade das células do intestino delgado, levando a uma redução de transporte ativo

de nutrientes através da parede intestinal (JOHNSSON; OBST; DAVIES, 1982) e,

consequentemente, diminuição de crescimento (CHEEKE, 1971; JOHNSON et al., 1986;

PUSZTAI et al., 2004; GOLAWASKA, 2007).

Devido às suas propriedades variadas são utilizadas para diversos fins fazendo parte

dos compostos bioativos de grande interesse industrial.

50

3. BIODIVERSIDADE DAS ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA C OMO

POTENCIAL FONTE DE ALIMENTOS E REPOSITÓRIO DE MOLÉC ULAS

BIOLOGICAMENTE ATIVAS

Biodiversidade é definida como variedade e variabilidade entre organismos vivos e a

complexidade ecológica, segundo Sandes e Diblasi (2000). O país que apresenta a maior

biodiversidade do mundo é o Brasil e apesar disso, pouco se conhece dessa amplitude

biológica. A Região Nordeste é coberta pelo bioma da Caatinga de clima semiárido, com

plantas adaptadas fisiologicamente às condições de deficiência hídrica. A biodiversidade da

flora dessa região é extremamente alta, contendo mais de 2.000 espécies de plantas

(ANDRADE-LIMA,1981,1989; SAMPAIO et al., 2002, VELOSO et al., 2002, LEAL;

TABERNALLI; SILVA, 2003). Apresenta um alto índice de endemismo, tendo sido

considerada, equivocadamente, por um bom período, como apresentando pouco valor

biológico (TABARELLI; VICENTE, 2004). Acredita-se que a quantidade real de espécies da

Caatinga é ainda mais numerosa do que a relatada, já que 41% da região nunca foi estudada e

80% ainda permanecem subamostradas (SILVA et al. 2004; TABARELLI, VICENTE, 2004).

Regiões naturais são aquelas que cobrem mais de 10.000 km2 de área contendo mais

de 70% de vegetação intacta. Há pouco tempo a Caatinga foi considerada uma das 37 grandes

regiões naturais do planeta, com uma pequena controvérsia, dado seu atual nível de

perturbação, ou seja, pelo extenso processo de devastação ambiental provocado pelo uso

insustentável dos seus recursos naturais (LEAL; TABERNALLI; SILVA, 2003). Isso, apesar

de ser a única grande região natural brasileira cujos limites estão inteiramente restritos ao

território nacional. Ademais, a contribuição da sua biota à biodiversidade do Brasil tem sido

subestimada e pouca atenção tem sido dada à conservação da diversificada e característica

paisagem desse bioma (SILVA et al., 2003).

Somente há alguns anos a Caatinga passou a ser mais estudada, mas ainda assim,

pouco é conhecido em relação a suas potencialidades, já que existem espécies que ainda nem

foram descritas (GIULIETTI et al., 2004). No entanto, mesmo sendo bastante desconhecida e

desvalorizada, apresenta muitas espécies vegetais que podem ser estudadas, valorizadas e

portanto, conservadas. A necessidade de conservação da biodiversidade tem ganhado cada vez

mais adeptos e esse número cresce à medida em que a ciência descobre novos usos para

plantas, até, então, sem interesse (GIULIETTI et al., 2004).

51

Plantas nativas da região têm sido utilizadas para diversas finalidades, tais como uso

forrageiro, medicinal, apícola, para o melhoramento do solo, para a produção de carvão,

lenha, vara e madeira para uso industrial. Em menor escala, são usadas na alimentação

humana, devido à escassez de conhecimento. A utilização das espécies é feita de forma

prejudicial e predadória, causando redução na diversidade das espécies nativas (DRUMOND

et al., 2000; McCRAY; WALSH; HAMMETT, 2005). Por isso, estudos que possam

viabilizar o uso racional e sustentável das mesmas são de extrema relevância.

Na Caatinga, foram encontradas 215 espécies da família Leguminosae, destas, 80 são

endêmicas, únicas desse bioma (GIULIETTI et al., 2002) e os principais gêneros dessa

família estão apresentados na TABELA 1.

As famílias que ocorrem com maior frequência são as Cactaceae e Euphorbiaceae,

sendo as espécies dos gêneros Pithecellobium, Senna e Mimosa, presentes em maior número

(BIOSFERA DA CAATINGA, 2010).

A família das leguminosas possui uma enorme variedade de espécies e são conhecidas

por sua vasta quantidade de compostos de defesa proteicos e não proteicos, como as

proteases, inibidores de protease, lectinas, quitinases, e, os alcaloides, terpenoides, os

polifenóis, respectivamente (CARLINI; GROSSI-DE-SA, 2002; WINK; MOHAMED, 2003).

São, ainda, fontes de macro e micronutrientes para a alimentação humana e as leguminosas

selvagens são consideradas de alta qualidade e de alto valor nutricional, além de

apresentarem baixos fatores antinutricionais (SHIM; JUN; KANG, 2003).

Pelo exposto, a biodiversidade de leguminosas pertencentes à Caatinga é bastante útil

para a prospecção de espécies no intuito da busca por novas fontes alimentares, novos

fármacos e/ou por produtos para serem aproveitados industrialmente, ou para outras

finalidades, uma vez que suas sementes são repositórios de moléculas bioativas, ou seja,

possuem substâncias que apresentam alguma atividade sobre o metabolismo de um organismo

vivo.

De acordo com Rodrigues (2003), trabalhos de conhecimento da biodiversidade para

conservação, manejo e bioprospecção foram, e são exaustivamente realizados em outros

biomas do país (bioma Amazônico, na região norte e bioma Atlântico, na região sudeste).

Sabendo que a Caatinga, dentre os biomas brasileiros, é o menos conhecido, cientificamente,

tornam-se necessários estudos envolvendo espécies pertencentes a esse ecossistema, visando

não só a conservação dos recursos naturais, como também o aproveitamento da

biodiversidade na intenção de contribuir com o planejamento de estratégias de

desenvolvimento sustentável.

52

TABELA 1 – Algumas espécies da família Leguminosae endêmicas presentes na Caatinga

Leguminosae (80)

Acacia kallunkiai Grimes &Barneby Leucochloron limae Barneby & Grimes Acacia piauhiensis Benth. Mimosa adenophylla Taub. var. armandiana

(Rizzini) Barneby Aeschynomene martii Benth. Mimosa adenophylla var. mitis Barneby Arachis pusilla Benth. Mimosa brevipinna Benth. Arachis triseminata Krapov. & Gregory Mimosa caesalpiniifolia Benth. Bauhinia cacovia subsp. Blanchetiana Wunderiin Mimosa campicola Harms var. planipes Barneby Blanchetiodendron blanchetii (Benth.) Barneby & Grimes Mimosa coruscocaesia Barneby Caesalpinia calycina Benth. Mimosa exalbescens Barneby Caesalpinia gardneriana Benth. Mimosa glaucula Barneby Caesalpinia laxiflora Tul. Mimosa hor tensis Barneby Caesalpinia microphylla Mart. ex G.Don Mimosa lepidophora Rizzini Caesalpinia pyramidalis Tul. var. Pyramidalis Mimosa leptantha Benth. Calliandra aeschynomenoides Benth. Mimosa marröensis Barneby Calliandra depauperata Benth. Mimosa mensicola Barneby Calliandra duckei Barneby Mimosa misera Benth. var. Misera Calliandra imperialis Barneby Mimosa misera var. subnermis (Benth.) Barneby Calliandra leptopoda Benth. Mimosa modesta Mart. var. Modesta Calliandra macrocalyx Benth. var. aucta Barneby Mimosa modesta Mart. var. ursinoides (Harms)

Barneby Calliandra macrocalyx Benth. var. Macrocalyx Mimosa niomarlei A.Fernandes Calliandra spinosa Ducke Mimosa nothopteris Barneby Calliandra squarrosa Benth. Mimosa ophthalmocentra Benth. Calliandra ulei Harms Mimosa pseudosepiaria Harms Calliandra umbellifera Benth. Mimosa setuligera Harms Chamaecrista belemii (Irwin & Barneby) var. belemii Mimosa subenervis Benth. Chamaecrista belemii var. paludicola (Irwin & Barneby) Irwin & Barneby

Mimosa ulbrichiana Harms

Chamaecrista brevicalyx (Benth.) Irwin & Barneby var. elliptica (Irwin &Barneby) Irwin & Barneby

Mimosa xiquexiquensis Barneby

Chamaecrista coradini Barneby Mysanthus uleanus (Harms) G.P.Lewis & A.Delgado

Chamaecrista swainsonii (Benth.) Irwin & Barneby Parapiptadenia zehntneri (Harms) M.P.Lima & H.C.de Lima

Chloroleucon dumosum (Benth.) G.P.Lewis Pterocarpus simplicifolius Barneby Klitgaard. L.P.Queiroz & G.P.Lewis

Chloroleucon extortum Barneby & Grimes Senna acuruensis (Benth.) var. Acuruensis Coursetia rostrata Benth. Senna acuruensis var. caatingae (Harms) Irwin &

Barneby Coursetia vicioides (Nees & Mart.) Benth. Senna acuruensis var. interjecta Irwin & Barneby Cratylia mollis Mar t. ex Benth. Senna aversiflora (Herb.) Irwin & Barneby Crotalaria holosericea Nees & Mar t. Senna gardneri (Benth.) Irwin & Barneby Dalbergia catingicola Harms Senna harleyi Irwin & Barneby Dalbergia cearensis Ducke Senna martiana (Benth.) Irwin & Barneby Dalbergia decipularis Rizzinni & A.Mattos Senna rizzin Irwin & Barneby Dioclea marginata Benth. Stylosanthes bahienses L.´t Mannetje & G.P.Lewis Hymenaea eriogyne Benth. Zornia echinocarpa (Meissner) Benth. Indigofera blanchetiana Benth. Zornia ulei Harms

Fonte: GIULIETTI et al., 2002

53

Neste contexto, as pesquisas para a identificação de novas fontes de nutrientes, em

especial de proteínas, para a alimentação humana, bem como a identificação de proteínas e

metabólitos secundários bioativos presentes em plantas, foram realizados em dez espécies de

leguminosas pertencentes a esse bioma.

As dez espécies selecionadas para os estudos foram escolhidas aleatoriamente dentre

muitas outras existentes no banco de sementes do Laboratório de Bioprospecção de Recurssos

Regionais (Bioprospec) devido, primeiramente, à disponibilidade de suas sementes, já seria

necessário uma grande quantidade de grãos para o estudo proposto.

3.1 Caesalpinia bracteosa Tul.

A Caesalpinia bracteosa Tul. é conhecida como Catingueira no Ceará e como Pau-

amarante nas demais localidades encontradas como Piauí, Bahia e Mato Grosso. Pertence à

ordem Fabales, a família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinoidae, ao gênero

Caesalpinia e a espécie Caesalpinia bracteosa Tul (CORRÊA, 1974).

É uma árvore com folhas de 3-5 pinas e com flores numerosas de cor amarela, usadas

medicinalmente contra doenças das vias aéreas superiores (FIGURA 2-H). Seus frutos

encontram-se em vagens (FIGURA 3-2) e sua madeira possui valor regular (CORRÊA, 1974;

QUEIROZ, 2002; ZIPCODE ZOO, 2010).

A C. bracteosa adapta-se muito bem à maioria dos solos e climas, sendo bastante

tolerante à seca. Possui um potencial forrageiro que mais demora a entrar em dormência,

mantendo-se com sua folhagem em média por 238 dias após o término das chuvas, além de

apresentar uma boa quantidade de proteínas (BARROS; SOUSA; ARRUDA, 1997; ARAÚJO

FILHO; CARVALHO; GADELHA, 1998).

A maioria dos estudos relacionados com a C. bracteosa Tul. é referente ao seu valor

nutritivo para a alimentação de ruminantes e de ovelhas (ARAÚJO FILHO; CARVALHO;

SILVA, 2002; NETO et al., 2001; NETO et al., 2004). Nenhuma pesquisa relaciona essa

espécie vegetal como fonte de nutrientes para a alimentação humana e pouquíssimas

pesquisas estão relacionadas à busca por compostos bioativos (GOÉS et al., 2003) tornando

esses enfoques bastante promissores.

54

3.2 Caesalpinia ferrea Mart. Ex. Tul.

A espécie Caesalpinia ferrea é conhecida popularmente como Jucá e Pau-ferro.

Pertence à família Leguminosae (Fabaceae) subfamília Caesalpinoidae, gênero Caesalpinia e

espécie C. ferrea Mart. Ex. Tul. É encontrada em toda a região Nordeste e também no

Espírito Santo e o Rio de Janeiro (na Floresta Pluvial atlântica). No Ceará é mais frequente na

serra do Araripe e do Apodi (BRAGA, 1976; MAIA, 2004; APG, 2010).

O porte arbóreo dessa espécie é de 10 a 15 metros de altura (FIGURA 2-B), com

tronco de curto diâmetro (40 a 60 m). Sua copa possui forma redonda, ampla e bem aberta. As

folhas alternas, compotas, com 2-4 pares de pinas, cada uma com 4-6 pares de folíolos de 1 a

3 cm (MAIA, 2004). Suas flores são pequenas e amarelas. Seu fruto (FIGURA 3-1) é uma

vagem acastanhada, achatada, às vezes encurvada, com 6-8 cm de comprimento e 1,5 cm de

largura (MAIA, 2004). A floração acontece nas épocas chuvosas e de transição chuvosa-seca

que se estende do final de novembro até janeiro. Prefere solos argilosos e profundos devido à

profundidade de suas raízes. Seus frutos estão maduros em meados de julho e agosto

(BRAGA, 1976) e suas vagens são procuradas pelos animais silvestres e domésticos, não

sendo degradada no trato digestório de ruminantes (MAIA, 2004).

Cresce sobre diferentes condições, sendo encontradas às margens de rios e riachos, em

tabuleiros e pés de serra. É resistente ao fogo e tolerante à sombra. É uma espécie utilizada

com diversas finalidades, tais como planta ornamental, forragem, como planta medicinal para

o tratamento de feridas, contusões, asma, tosse crônica, antidiarréicos, antitérmicos (MAIA,

2004). Seu extrato aquoso bruto é eficaz contra úlcera gástrica (BACCI; SERTIE, 1988).

Tendo sido relatada atividade anti-inflamatória e analgésica (THOMAS; ARAÚJO; SOUZA,

1988; CARVALHO et al., 1996). Além disso, sua madeira é utilizada na construção civil e

para outras aplicações (MAIA, 2004). Suas várias aplicações medicinais mostram bom

potencial para presença de compostos bioativos e o fato de animais a consumirem como

alimento deve ser melhor investigado, pois pode levar à descoberta de novas fontes de

alimentos.

55

3.3 Dioclea megacarpa Rolfe

A espécie Dioclea megacarpa Rolfe, apresenta nome popular de Mucunã e olho-de -

boi. Pertence à família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Faboideae, gênero Dioclea e a

espécie D. megacarpa Rolfe. É uma leguminosa trepadeira cujas flores são roxas (FIGURA 2-

I). No outono ela assume uma coloração amarela, as espécies adultas são grandes em tamanho

e alcançam 17 m de altura (BRAGA, 1976).

D. megacarpa Rolfe foi classificada de modo errôneo como D. grandiflora (Mart.) no

herbário da Universidade Federal do Ceará, Prisco Bezerra, tendo como conseqüência a

publicação de alguns trabalhos com a classificação incorreta dessa espécie (BATISTA, 2009).

A espécie possui potencial bioativo uma vez que já foram purificadas e caracterizadas

proteínas, como lectinas e inibidores de tripsina em suas sementes (FIGURA 3-3(a) e (b))

(MOREIRA et al., 1983; CARVALHO et. al., 1988; MELGAREJO; VEGA; PÉREZ., 2005),

bem como encontradas proteínas com atividade antifúngica e com potencial inseticida contra

Callosobruchus maculatus (BATISTA, 2009). Entretanto, não foi relatado nenhum dado

referente a metabólitos secundários nessa espécie, nem investigação sobre a qualidade dos

nutrientes presentes nas sementes.

3.4 Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong

A espécie Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong é vulgarmente conhecida

como Orelha-de-macaco, orelha-de-negro, timbaúba, entre outros. Apresenta dois nomes

botânicos: Mimosa contortisiliqua Vell. e Enterolobium timbouva Mart. (LORENZI, 1998).

Faz parte da família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Mimosoideae, gênero Enterolobium

Mart. e Enterolobium timbouva Mart. e espécie Enterolobium contortisiliquum (Vell.)

Morong. (CRIA, 2005).

É uma espécie arbórea com altura entre 20 a 35 m e tronco medindo de 80 a 160 cm de

diâmetro (FIGURA 2-E). A copa é ampla e frondosa, proporcionando ótima sombra. Suas

folhas são compostas, bipinadas, com 2 a 7 jugas de pinas. As flores apresentam-se em

capítulos globosos, esbranquiçados, florescendo em meados de setembro, permanecendo até

novembro. A vagem é coriácea, dura e lenhosa, indeiscente, preta, incurvo-reniforme,

56

lembrando uma orelha [FIGURA 3-5(a) e (b)], explicando a origem de seu nome popular

“Orelha-de-negro”. Seus frutos amadurecem nos meses de junho e julho, porém permanecem

na árvore por alguns meses a mais (BRAGA, 1982; LORENZI, 1998).

Foram relatados vários estudos com essa planta relacionados à sua bioatividade pela

presença de compostos secundários e de algumas proteínas. As sementes de E.

contortisiliquum possuem óleo essencial que apresenta ainda atividade antibacteriana

(SHAHAT et al., 2008). De acordo com a pesquisa de Hashimoto e Nishimoto (1996) o uso

dessa espécie na medicina popular no tratamento de doenças parasitárias e gonorréia está

associado à elevada quantidade de saponinas triterpenóides nela presente. Outras pesquisas

apresentaram o isolamento de outras nove saponinas com atividade citotóxica contra

macrófagos (MIMAKI et al., 2003; 2004). Em relação às proteínas já estudadas dessa

espécie, já foi isolada, a partir das sementes, uma proteína hemolítica apresentando atividade

pró-inflamatória (CASTRO-FARIA-NETO et al., 1991), um inibidor de tripsina do tipo

Kunitz foi purificado e caracterizado (BATISTA et al., 1996) e três inibidores de

quimotripsina (EcCI1, EcCI2 e EcCTI) (BEZERRA, 2010), além de uma vicilina ligante à

quitina, biologicamente ativa contra fungos filamentosos e insetos (MOURA et al., 2007).

Dessa forma, a espécie E. contortisiliquum pode ser considerada importante

repositório de moléculas biologicamente ativas, devendo ser mais explorada. No que diz

respeito à qualidade nutricional dessa leguminosa não foram encontrados relatos, sendo

interessante investigá-la.

3.5 Erythrina velutina Willd.

A espécie Erythrina velutina Willd. apresenta nomes comuns, tais como Mulungu,

corticeira-do-banhado, suinã, bico-de-papagaio, canivete, corticeira e sananduva. Faz parte da

família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Faboideae, gênero Erythrina e espécie E.

velutina Willd. (ESALQ – USP, 2010).

É uma espécie arbórea, medindo de 8 a 12 m de altura (FIGURA 2-A). O tronco

possui muitos acúleos, casca lisa, com estrias longitudinais mais claras. Suas folhas são

alternas, trifolioladas, com cerca de 20 cm de comprimento, apresenta folíolos ovado-

deltoídes, tomentosos e mais claros na face interior. As flores são de cor vermelha, dispostas

em rácemos. Seu fruto é uma vagem, semi tortuosa, com sementes em formato de feijão, de

57

cor avermelhada (FIGURA 3-9(a) e (b)), a época de frutificação é de Janeiro a Fevereiro

(ESALQ – USP, 2010).

A madeira dessa espécie é branca, leve, mole e porosa, usada na fabricação de palitos

de fósforo. É uma planta ornamental, usada no paisagismo com sucesso. É ainda usada no

sombreamento de cacaueiros e como cerca viva. Muitos pássaros procuram suas flores pelo

seu néctar (ESALQ – USP, 2010).

Estudos utilizando o extrato bruto das cascas de E. velutina apresentaram atividade

antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. Foram identificados

nas frações do extrato bruto alcaloides, ácido fênico, ácido cinâmico, α-amirina,

estigmasterol, β-amirina, β -sitosterol e lupeol (VIRTUOSO; MIGUEL, 2005; VIRTUOSO et

al., 2005). Apresentam ainda lectinas (STOJANOVIC et al., 1994; MORAES et al., 1996;

OLIVEIRA et al., 1998), alcaloides (FOLKERS; SHAVEL, 1951) e flavonoides (DA

CUNHA et al., 1996). Possuem atividades analgésica (VASCONCELOS et al., 2003), e anti-

inflamatória (SAIDU et al., 2000), ansiolítica (VASCONCELOS et al., 2004; RIBEIRO et

al., 2006) e anticonvulsivante (VASCONCELOS et al., 2007), o que mostra seu potencial

farmacológico. Não foram encontradas pesquisas com utilização dessa espécie como fonte de

alimento para humanos.

3.6 Hymenaea courbaril L.

É conhecida popularmente como Jatobá, farinheira, imbiúva, jabotii-timbaí, jassaí,

jatabá-trapuca, jataí, jataíba, jatobá-de-anta, entre outros (LORENZI; MATOS, 2002). Faz

parte da família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinoideae, gênero Hymenaea e

espécie Hymenaea courbaril L. (ESALQ – USP, 2010).

É uma árvore com 30 m de altura ou mais (FIGURA 2-C), possuindo folhas

compostas, alternas, pecioladas, bifoliada, coriáceas, falciformes ou ovais, glabras. Sua

inflorescência se dá em panículas terminais. Apresentam flores esbranquiçadas e frutos (2-8

cm) em forma de vagens indeiscentes, duros e de cor castanho-avermelhado, apresentando de

2 a 6 sementes [FIGURA 3-7(a) e (b)], envoltas por uma farinha. Essa farinha é dotada de

grande valor nutritivo, consumida pelo homem como alimento e por animais, principalmente

roedores. Floresce durante os meses de outubro a dezembro. Os frutos amadurecem a partir do

58

mês de julho (PRANCE; SILVA, 1975; CARVALHO FILHO et al., 2003; GORCHOV et al.,

2004).

Sua farinha é empregada como fonte de alimento e a madeira para obras hidráulicas,

na construção civil, na fabricação de móveis, carroçarias, postes, tonéis, dormentes,

construções variadas, entre outros. (LOUREIRO; SILVA; ALENCAE, 1979; LORENZI;

MATOS, 2002). Produzem resinas utilizadas para a produção de vernizes (RIZZINI, 1971).

Pesquisas com H. courbaril mostram a presença de óleos essenciais, taninos

(PANIZZA, 1997; PINTO et al., 2000) e, em suas folhas e casca, possuem compostos

terpênicos e fenólicos com propriedades antifúngicas, antibacterianas e moluscicidas

(STUBBLEBINE; LANGENHEIM, 1980; LORENZI; MATOS, 2002). Muitos estudos estão

focados em seus carboidratos (Xiloglucanos, galactoxyloglucan) (TINÉ; CORTELAZZO;

BUCKERIDGE, 2000; MARTIN et al., 2003; TINÉ et al., 2006). Esses trabalhos mostram o

grande potencial alimentar e como fonte de moléculas bioativas.

3.7 Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth

A espécie Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth é popularmente conhecida por Ingá,

ingazeiro, imburana, entre outros (LORENZI, 1998). Pertence à família Leguminosae

(Fabaceae), subfamília Papilionaceae, ao gênero Lonchocarpus Kunth e à espécie L. sericeus

(Poiret) Kunth (CRIA, 2005).

Essa espécie é uma planta arbórea, com altura variando de 4 a 20 metros e copa

arredondada (FIGURA 2-D). Seu tronco é ereto e cilíndrico, com diâmetro de 30 a 70 cm e

com casca ligeiramente rugosa (LORENZI, 1998). Suas folhas são compostas imparipinadas,

com raque de 5 a 9 cm de comprimento, cada uma tem entre 5 e 9 folíolos opostos, com

estípulas pequenas. As flores possuem coloração lilás, contendo brácteas e bractéolas. Seus

frutos são vagens indeiscente, membranosa, contendo de 1 a 6 sementes [FIGURA 3-6(a) e

(b)] (CORRÊA, 1984; LORENZI, 1998). As sementes são feijões de, aproximadamente, 1,5

cm de comprimento por 1 cm de largura (CORRÊA, 1984; LORENZI, 1998).

A florescência ocorre principalmente entre os meses de outubro e fevereiro e o

amadurecimento dos frutos se dá de junho a agosto.

Essa espécie é utilizada como árvore ornamental, sua madeira é utilizada na

construção civil, na fabricação de móveis, lenha, carvão, ente outros (LORENZI, 1998).

59

Em sementes de L. sericeus já foram detectadas lectinas com atividade anti-

inflamatória e antimicrobiana em ratos apresentando peritonite (ALENCAR et al., 2005), e,

apresentando capacidade de redução da migração de leucócitos e de hipernocicepção

inflamatória (NAPIMOGA et al., 2007). As cascas de suas raízes possuem atividade

antiedematogênica. As calchonas presentes em suas raízes apresentaram atividade citotóxica

sobre células de leucemia linfocítica de origem humana (FONTENELE, 2010).

Essa espécie é usada na medicina popular para tratamento de desordens intestinais e

como protetor do fígado, possuindo efeito hepatoprotetor confirmado por Agbonon e

Gbeassor (2009). Foi realizada avaliação de sua qualidade nutricional determinação da

composição proximal, da presença de fatores antinutricionais, composição de aminoácidos,

associado ao ensaio de alimentação usando ratos experimentais (PROLL et al., 1998).

3.8 Parkia platycephala Benth.

A espécie Parkia Platycephala Benth, conhecida como Visgueiro, faveira, faveira-

preta, ou fava-de-bolota, taxonomicamente é classificada como sendo da família das

Leguminosae (Fabaceae), da subfamília Mimoseae , do gênero Parkia P. Browne e da espécie

P. Platycephala Benth. (CRIA, 2005).

É uma leguminosa arbórea, com altura de 8 a 10 cm, dotada de copa ampla (FIGURA

2-E). Suas folhas são compostas bipinadas, alternas ou opostas, de 10 a 12 cm de

comprimento. Seu fruto é achatado, glabro, frequentemente enrolado, de 10 a 12 cm de

comprimento [FIGURA 3-8(a) e (b)], legumes indeiscentes produzidos anualmente no meio

da estação seca de seis meses de duração, entre os meses de agosto e outubro (BULHÃO;

FIGUEIREDO, 2002; LORENZI, 2002).

A P. Platycephala é destacada pelo potencial paisagístico, qualidade de sua madeira e

por participar da exploração de energia, adubação verde e reflorestamento (BEZERRA;

CARVALHO; CHAVES, 2009). As suas vagens maduras apresentam potencial forrageiro e

são muito usadas na suplementação alimentar para ruminantes, especialmente caprinos e

bovinos, (LORENZI; 2002; ALVES et al., 2007) com valor nutritivo de suas vagens já

investigado (ALVES, 2004).

Estudos com P. Platycephala mostram o isolamento e a cristalização de uma lectina

(GALLEGO DEL SOL et al., 2002) e de uma proteína ligante a quitina presentes em suas

60

sementes (CAVADA et al., 2005). Já foi relatada a presença de compostos fenólicos e

atividade antioxidante nessa espécie (BEZERRA; CARVALHO; CHAVES, 2009). As

pesquisas que a relatam como suplemento para ruminantes e de presença de proteínas e

compostos secundários bioativos mostram quão promissora é essa espécie, merecendo mais

investigações para maiores utilizações futuras.

3.9 Piptadenia moniliformis Benth.

P. moniliformis é conhecida popularmente como Angico, angico de bezerro, rama de

bezerro, carrasco, jurema preta, marmeleiro, quipembé, catanduba, e catanduva no estado do

Ceará (LEWIS, 1987; MAIA, 2004). É uma espécie pertencente à ordem Fabales, família

Leguminosae (Fabaceae), subfamília Mimoseae, tribo Adenanthereae, gênero Piptadenia

Benth., seção Pityrocarpa e espécie P. moniliformis Benth. (CRIA, 2005). Geograficamente é

distribuída no Brasil pelos estados da Bahia, Ceará, Pernambuco e Piauí. Apresenta-se com

uma árvore de tamanho médio, medindo 4 a 9 metros de altura, sem espinhos, dotada de copa

arredondada (FIGURA 2-G). Seu tronco é tortuoso e um pouco rugoso. Possui folhas

compostas, bipinadas e suas flores são branco-esverdeada quando novas, ficando quase

amarela ou marron quando velhas, estando disposta em espigas de 5 a 9 centímetros de

comprimento. Seu fruto é uma vagem de até 13 centímetros de comprimento, de cor marron,

coriácea, curvada, contraída entre as sementes que são brancas, ovais e comprimidas

(FIGURA 3-10(a) e (b)). Sua floração acontece nos meses de janeiro a março, por ocasião do

período chuvoso na região, e, os frutos amadurecem nos meses de julho a setembro (MAIA,

2004).

É planta decídua, heliófita, seletiva xerófita, pioneira, característica da caatinga do

Nordeste brasileiro, onde é muito abundante. A sua presença é muito comum no sopé de

serras e na faixa intermediária entre o litoral e o sertão, possuindo caráter invasor e um

crescimento rápido. Apresenta uma produção abundante de sementes viáveis e é muito

indicada para o reflorestamento com fins conservacionistas (BRAGA, 1982; MAIA, 2004).

A P. moniliformis é utilizada em pequenas obras na construção civil, marcenaria leve,

cabo de ferramentas, para lenha e carvão, devido à boa qualidade de suas madeiras. Por ser

uma espécie de rápido crescimento, é indicada na recuperação de solos, combate à erosão

além do reflorestamento (LORENZI, 1998; MAIA 2004). É empregada também na apicultura,

61

posto que suas flores são muito visitadas por abelhas haja vista a grande quantidade de néctar

existente, tendo recebido grande atenção pelos interessados na produção de mel (AIRES;

FREITAS, 2001; SILVA et al., 2004). Apresenta ainda, um grande potencial forrageiro sendo

palatável para bovinos, ovinos e caprinos. No entanto, há relatos pela população nativa de que

os animais que consomem suas folhas cortadas, algumas horas antes, são intoxicados, ao

passo que em seu estado fresco (na árvore) nada lhes acontecem (GIULIETTI et al., 2004;

MAIA, 2004; ZIPCODE ZOO, 2010).

Os estudos encontrados relacionados a essa espécie possuem foco na composição

florística e estrutural e na produção de mel (ARAÚJO et al., 1998; AIRES; FREITAS, 2001;

MARACAJÁ et al., 2003; SILVA et al., 2004). Além disso, foi purificado por Cruz (2008)

um inibidor de tripsina do tipo Kunitz de sementes de P. moniliformis, apresentando atividade

contra larvas das moscas-das-frutas (Ceratitis capitata). A farinha de suas sementes

apresentou efeito deletério no desenvolvimento do bruquídeo Callosobruchus maculatus,

quando incorporada a dietas artificiais (COSTA, 2009), mostrando que possui potencial

bioativo. Não foram encontrados relatos referentes à qualidade nutricional de suas sementes.

3.10 Senna rugosa (G.Don) H.S.Irwin & Barneby

A espécie Senna rugosa (G. Don) H.S.Irwin & Barneby é vulgarmente conhecida

como Lagarteira, pertencente à família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinoideae,

gênero Senna e espécie S. rugosa (G. Don) H.S.Irwin & Barneby.

É uma espécie arbórea, medindo 1,5 m (FIGURA 2-J). Suas folhas apresentam

pecíolos pilosos. As flores são pediceladas, medindo de 2-3 cm, com pétalas amarelas. Seus

frutos são legumes arredondados com 7 a 9 cm, estipitados, pilosos; possuem várias sementes

(FIGURA 3-4). Sua floração é observada nos meses de fevereiro a maio e a frutificação de

maio a agosto (MARTINS, 2009).

. Há poucos relatos na literatura sobre a espécie S. rugosa. Uma das pesquisas com essa

espécie apresenta o isolamento de antraquinona e naftopiranos (BARBOSA et al., 2004). No

entanto, no gênero Senna, a qual pertence, já foram constatadas a presença de alcaloides

(ALEMAYEHU et al., 1993; SANSORES-PERAZA et al., 2000), quinonas (ALEMAYEHU

et al., 1993), antraquinonas, em sua cerne (MALHOTRA; MISRA, 1982), em suas sementes

(ALEMAYEHU et al., 1993) e em raízes e folhas (BARBA; DÍAZ; HERZ, 1992).

62

A espécie S. Rugosa, por ser pouco estudada e devido ao potencial apresentado por seu

gênero torna-se objeto de pesquisa interessante.

A pesquisa com espécies selvagens pode contemplar a interdisciplinaridade e buscar a

conservação desses recursos genéticos da flora brasileira.

63

FIGURA 2 – Espécies vegetais da Caatinga Cearense. A - Erythrina velutina; B - Caesalpinia

ferrea; C - Hymenaea courbaril; D - Lonchocarpus sericeus; E - Enterolobium

contortisiliquum ; F - Piptadenia moniliformis ; G - Parkia platycephala; H - Caesalpinia

bracteosa ; I - Dioclea megacarpa ; J – Senna rugosa. (Fontes em anexo)

B A C

D E

F G

H I J

64

FIGURA 3 – Vagens e Sementes de espécies vegetais da Caatinga. (a) Vagens, (b) Sementes

1 - Caesalpinia ferrea; 2 – Caesalpinia bracteosa; 3 – Dioclea megacarpa; 4 – Senna rugosa;

5 - Enterolobium contortisiliquum; 6 – Parkia platycephala; 7 - Lonchocarpus sericeus; 8 -

Erythrina velutina; 9 - Hymenaea courbaril; 10 – Piptadenia moiliformis. (Fontes em anexo)

7 (a)2 7 (b)

8 (b) 8 (a)

7 (a)1

1 1 2

3 (a) 3 (b)

4

5 (a) 5 (b)

6 (a) 6 (b)

10 (a) 2 10 (b) 10 (a) 1

7 a)

9 (a)

9 (b)

65

Prospecção Nutricional em Sementes

de dez Leguminosas da Caatinga

Cearense

66

1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA

A maior diversidade genética vegetal do mundo pertence ao Brasil, contendo cerca de

60.000 espécies de plantas, o que corresponde a 75% de todas as espécies vegetais existentes nas

grandes florestas, possuindo 20% de toda a flora mundial conhecida (SANT’ANA e ASSAD,

2001; CALIXTO, 2003; Ambiente Brasil-Ambiente Natural – Caatinga (2011). O único bioma

exclusivo do Brasil é a Caatinga, destacada pela riqueza de sua flora com um grande número de

espécies (mais de 2.000 espécies de plantas), incluindo muitas endêmicas (ANDRADE-LIMA,

1981, 1989; PRADO, 1991; LEAL; TABERNALLI; SILVA, 2003).

O número real de espécies na Caatinga é, provavelmente, ainda maior, uma vez que 41%

da região nunca foi investigada e 80% permanece subamostrada (TABARELLI; VICENTE,

2004). Esses percentuais mostram a biodiversidade da Caatinga, inserindo-a em um relevante

cenário para a bioprospecção, tendo em vista a importância de espécies vegetais para diversos

fins, incluído sua utilização como alimentos, uma vez que muitas plantas nativas desse bioma já

têm sido relatadas com essa finalidade (ALMEIDA et al., 1998; EPSTEIN, 1998).

A exploração indiscriminada da vegetação da Caatinga, feita com fins meramente

lucrativos, tem levado a uma crescente devastação dos ecossistemas, causando uma gradual e

irreversível perda de espécies, sem que haja tempo e recursos para estudar suas potencialidades

(FERREIRA, 2000; NASCIMENTO; OLIVEIRA, 2005). Assim, pesquisas com espécies nativas

que venham a revelar seu potencial podem gerar conhecimentos de várias de suas propriedades e

aplicabilidades, viabilizando os usos sustentáveis dessas espécies, podendo ainda despertar

interesse de conservação, exploração racional e manejo desses ecossistemas. Portanto, são de

grande importância estudos que mostrem o valor econômico que pode ser agregado aos produtos

naturais provenientes da Caatinga, para investimento no aproveitamento sustentável dos recursos

genéticos e da diversidade biológica em áreas de interesse químico, farmacêutico, agrícola e

industrial (ODALIA-RÍMOLI et al., 2000).

Por outro lado, a nutrição é a necessidade básica mais importante dos seres vivos, estando

diretamente ligada à saúde dos indivíduos (VADIVEL; JANARDHANAN, 2005). A desnutrição

é um problema mundial, especialmente em países em desenvolvimento, com sérias consequências

econômicas (FAO/WHO, 2001). Para se ter uma ideia, de acordo com a pesquisa realizada por

67

IFRPRI (International Food Policy Research Institute) em 2010, existe quase um bilhão de

pessoas passando fome no mundo e, segundo o Instituto, a persistência da fome no mundo está

ligada à desnutrição infantil, que se concentra em algumas regiões. A deficiência de proteínas é a

principal causa da má ou desnutrição nos países em desenvolvimento (PELLETIER et al., 1995)

e o elevado preço dos produtos alimentares, inclusive da soja, pode contribuir para esse quadro

(ENUJIUGHA; AYODELE-ONI, 2003). Por isso, grãos de leguminosas são fontes importantes

de proteínas e em muitas regiões do mundo são a única fonte desse nutriente (DURANTI; GIUS,

1997; WANG et al., 2003). Ademais, o aumento gradativo da população mundial e a necessidade

de reduzir os riscos relacionados ao consumo de alimentos de origem animal, especialmente nos

países desenvolvidos, aumentam a importância da utilização de proteínas (e outros nutrientes) de

sementes de leguminosas na dieta e, consequentemente, aumento na demanda (DURANTI;

SCARAFONI, 1999).

O fato justifica os intensos esforços dos pesquisadores na busca por novas fontes de

proteínas de plantas. As leguminosas selvagens, adaptadas a condições adversas, têm sido alvo de

estudo como novas fontes alternativas de proteínas ao redor do mundo há bastante tempo

(BALOGUN; FETUGA, 1986; RAVINDRAN; RAVINDRAN, 1988; SIDDHURAJU;

VIJAYAKUMARI; JANARDHANAN, 1996; BRESSANI et al., 1987; BRESSANI; SOSA,

1990; CARNOVALE; LUGARO; MARCONI, 1991; JOSEPHINE; JANARDHANAN, 1992;

RAJARAM; JANARDHANAN, 1992; EKANAYAKE; JANSZ; NAIR, 2000; ARINATHAN;

MOHAN; DE BRITTO, 2003; ARUN et al., 2003; VADIVEL; JANARDHANAN, 2005;

SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). Isso porque, segundo Shim, Jun e Kang (2003), plantas

selvagens de alta qualidade, alto valor nutricional e baixos fatores antinutricionais, já têm sido

encontradas com sucesso.

A necessidade de descoberta de novas fontes de proteínas e o fato da Caatinga se

constituir em um repositório de espécies vegetais selvagens muito pouco exploradas, tanto sob o

viés científico como econômico, serviram como bases científicas para formulação da seguinte

hipótese:

A Caatinga possui leguminosas selvagens com bom potencial nutricional podendo

servir como fonte de novas proteínas vegetais a serem utilizadas na alimentação humana.

68

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

• Determinar o potencial nutricional das sementes de dez espécies de leguminosas da

Caatinga

• Avaliar a qualidade proteica de uma espécie promissora usando como modelo

experimental ratos em crescimento.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar a composição centesimal de dez sementes de leguminosas da Caatinga;

• Determinar a composição de aminoácidos essenciais e não essenciais das proteínas das

sementes das leguminosas;

• Investigar a presença de compostos tóxicos e/ou antinutricionais (lectina, inibidor de

tripsina, ureases e toxinas);

• Verificar o teor de minerais de importância nutricional (potássio, sódio, cálcio, magnésio,

ferro, zinco, manganês, cobre, cromo e molibdênio);

• Apontar espécies com melhor potencial nutricional para estudos futuros, mais

aprofundados, referentes à qualidade de suas proteínas;

• Selecionar uma espécie dentre aquelas com melhor potencial nutricional para a avaliação

de sua qualidade proteica através de experimentos nutricionais com ratos a fim de avaliar

o desempenho desses animais comparados ao controle positivo;

• Avaliar métodos diferentes de processamentos na farinha das sementes da leguminosa

escolhida para a diminuição dos fatores antinutricionais no intuito de melhorar a

qualidade das proteínas.

69

3. MATERIAIS

3.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

Foram realizadas três expedições de coleta: janeiro de 2005, setembro de 2005 e março de

2007. As sementes das dez espécies foram coletadas com a ajuda de nativos em dois locais

distintos do estado do Ceará: região de semiárido, no município de Quixadá e a na Floresta

Nacional do Araripe (FLONA), uma floresta úmida no município do Crato. Cada espécie foi

coletada apenas uma vez devido a diferenças na fenologia, às dificuldades pertinentes à região do

semiárido que sofre secas severas e às limitações estabelecidas por agências de proteção

ambiental brasileira. Apenas uma espécie teve as sementes coletadas no município de Fortaleza,

no Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (outubro de 2006). As plantas foram

identificadas e os espécimes foram depositados no Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade

Federal do Ceará (UFC). O nome botânico e popular das espécies utilizadas nesse trabalho, bem

como seus locais de coleta e números de identificação estão apresentadas no QUADRO 1 do item

5.

3.2 Animais de Laboratório e Alojamento

Um coelho da raça Nova Zelândia com três meses de idade foi adquirido junto ao setor de

cunicultura do Departamento de Zootecnia da UFC e mantido no Biotério de Manutenção do

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC com água e ração apropriadas ad

libitum. Seu sangue foi utilizado como fonte de eritrócitos para os ensaios de aglutinação. Os

ratos machos convencionais da linhagem Wistar e os camundongos machos convencionais da

linhagem Swiss foram adquiridos do Biotério Central da UFC (Biocen-UFC) com três semanas

de idade. Os animais foram alojados no Biotério Experimental do Laboratório de Bioprospecção

de Recursos Regionais (Bioprospec), do Departamento de Biologia da UFC, com temperatura

70

(23,0 ± 2,0 ºC) e fotoperíodo (12 h claro/12 h escuro) controlados. Os ratos e os camundongos

foram mantidos em número adequado em caixas de polipropileno com substrato de raspa de

pinho, água e ração (Biobase, Águas Frias, Santa Catarina, Brasil) ad libitum até atingirem cerca

de 60 g e 20 g, respectivamente.

Todos os protocolos com animais, adotados neste trabalho, foram submetidos ao Comitê de

Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Protocolo No. 34/09) para parecer formal, segundo a

Legislação vigente (Lei No. 11.794/2008), que regulamenta a criação e uso de animais de

laboratório na pesquisa científica no Brasil

3.3 Reagentes Químicos

Inibidor de tripsina da soja (Sigma T9128), tripsina de pâncreas humano (Sigma T6424),

protease de Bacillus licheniformis (Sigma P3910), L-BApNA (Nα-benzoil-DL-arginina-p-

nitroanilida) (Sigma B3133), urease de Canavalia ensiformis (Sigma U0251), “Kit” para a

determação de fibras totais (Sigma TDF100A), “Coomassie Brilliant Blue G”, Albumin sérica

bovina (BSA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA). Os kits de determinação

diagnóstica de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase

alcalina, uréia, proteína total, albumina e creatinina foram adquiridos da Bioclin (Santa Branca,

Brasil).

3.4 Componentes das Dietas

As farinhas integrais das sementes de P. moniliformis cruas, tratadas termicamente e

livres de α-galactosídios foram utilizadas como fonte de proteínas das dietas teste. Para a dieta

padrão, foram utilizadas as farinhas integrais de sementes de soja crua e tratada termicamente,

obtidas em comércio local (Jasmine, Paraná, Brasil). Foi utilizada maizena® (Unilever, São

Paulo, Brasil) como fonte de amido, D(+)-glucose anidra P.A. (dextrose) (Vetec, Rio de Janeiro,

71

Brasil) como fonte de carboidratos simples e Neofiber® (Nuteral, Ceará, Brasil) como fonte de

fibra alimentar. A fonte de lipídios das dietas foi o óleo de milho Mazola® (Cargil, São Paulo,

Brasil). As misturas de minerais e vitaminas utilizadas nas dietas foram produzidas a partir de

reagentes de grau analítico, sendo obtidos comercialmente.

Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e estão citados no decorrer

da descrição da metodologia, assim como todos os equipamentos usados nos experimentos.

4. MÉTODOS

4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

As sementes foram retiradas de suas vagens e moídas em moinho rotatório para grãos de

café (Cadence, Caxias do Sul, Brasil). Em seguida, as farinhas foram peneiradas em malha de 1,0

mm2, a fim de deixá-las bem finas e colocadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo,

Brasil) a 45 ºC por 72 horas para obtenção de um material mais homogêneo e livre de umidade.

As farinhas foram acondicionadas em recipientes plásticos hermeticamente fechados, em câmara

fria a 4°C, até a realização das análises.

4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais

As farinhas das sementes foram postas em contato com o tampão fosfato de sódio 0,05 M,

pH 7,0 na proporção de 1:10 (m/v) e deixada sob agitação contínua por 4 h, a 4 °C. Em seguida,

a suspensão foi filtrada em pano de trama fina. O resíduo obtido foi descartado. O filtrado foi

centrifugado a 13.000 x g, 30 minutos, 4 °C; o precipitado foi descartado e o sobrenadante obtido

foi filtrado em papel de filtro e denominado de Extrato Bruto. A extração de proteínas foi feita

para a determinação dos compostos tóxicos e/ou antinutricionais.

72

4.3 Dosagem de Proteínas

Os teores de proteínas dos extratos brutos e das frações proteicas obtidas foram

determinados segundo a metodologia descrita por Bradford (1976). Brevemente, para cada 100 µl

de amostra, em diferentes concentrações, foram adicionados 2,5 ml do regente de Bradford. A

mistura foi agitada por alguns segundos e após 10 minutos sobre a bancada e à temperatura

ambiente, procedeu-se a leitura das absorbâncias a 595 nm, em um espectrômetro Genesys 10,

Spectronic Unicam (New York, EEUU). A concentração de proteínas foi estimada usando-se o

fator de calibração obtido através de uma curva padrão constituída com concentrações conhecidas

de albumina sérica bovina (BSA).

4.4 Composição Proximal das Sementes

4.4.1 Umidade

A umidade das sementes das dez espécies de leguminosas foi determinada seguindo a

metodologia descrita pela AOAC (1998). Em triplicata, 10 g de farinha não-desidratada de

sementes das dez espécies foram colocadas em recipientes limpos, secos, tarados e deixadas em

estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil) a 110 °C por 24 horas. Após esse período,

as amostras foram colocadas em dessecador até atingirem a temperatura ambiente, sendo, então,

pesados e colocados novamente em estufa. Esse procedimento foi repetido de 12 em 12 horas, até

obtenção de peso constante. O teor percentual de umidade foi calculado pela relação entre os

pesos inicial e final da amostra.

73

4.4.2 Proteínas Totais

A quantidade de proteínas totais das farinhas das sementes das dez espécies foi

determinada em triplicata segundo o método Macrokjeldahl (AOAC, 1998). Amostras de 0,5 g,

25 mL de ácido sulfúrico concentrado e 5,0 g de catalizador [K2SO4; CuSO4.H2O; Selênio;

(100:10:1)] foram colocados em balões de digestão de Kjeldahl, levados para um digestor

[Modelo MA 448, Marconi (Piracicaba, Brasil)] e deixados por uma hora a 400 °C. Em seguida,

o material digerido foi transferido para balões volumétricos de 250 mL, que tiveram seus

volumes aferidos com água deionizada. A quantidade total de nitrogênio foi obtida por ensaio

fotocolorimétrico como descrito por Baethgen e Alley (1989), utilizando uma curva padrão

obtida com diferentes concentrações de sulfato de amônio (Merck, Darmstadt, Alemanha). O

fator utilizado para a conversão do total de nitrogênio em proteínas foi de 6,25.

4.4.3 Lipídios Totais

O teor de lipídios totais das farinhas das dez sementes foi determinado, em triplicata,

segundo o método descrito pela AOAC (1998). Amostras de 5 g foram pesadas em balança

analítica [Bioprecisa, Modelo FA2104N (São Paulo, Brasil)] e embaladas em envelopes de papel

de filtro, sendo, então, transferidas para um sistema de Soxhlet 303 mm. A extração foi contínua

durante 8 h, sendo o n-hexano utilizado como solvente (150 mL). Em seguida, o solvente foi

transferido para um béquer previamente pesado e completamente evaporado em capela de

exaustão de gases durante 48 h. Os lipídios totais foram calculados pela diferença entre o peso

inicial e final dos béqueres, para posterior cálculo do percentual em relação à amostra bruta

inicial.

74

4.4.4 Matéria Mineral (Cinzas)

A matéria mineral foi determinada a partir de triplicata das amostras de farinha das dez

sementes segundo metodologia descrita pela AOAC (1998). Amostras pesando 1 g foram levadas

em cadinhos de porcelana a um forno mufla [Quimis, Modelo Q-318m24 (Diadema, Brasil)] e

calcinizadas à temperatura de 550 °C por 4 h. O valor de matéria mineral foi determinado pela

diferença entre os pesos inicial e final.

4.4.5 Fibra Alimentar Total

As análises de fibra alimentar total foram realizadas, em duplicata, segundo Prosky et al.

(1988). Esta metodologia é recomendada pela AOAC (1997) e utiliza uma combinação de

métodos enzimáticos e gravimétricos. Foi utilizado o kit para determinação de fibra alimentar

total TDF-100A (Sigma-Aldrich Co., St Louis, EUA). Amostras delipidadas secas foram

primeiramente gelatinizadas com alfa-amilase termoestável. Logo depois, foram digeridas

enzimaticamente com protease e amiloglucosidase para remover as proteínas e amido,

respectivamente, presentes na amostra. Em seguida, foi adicionado etanol 95% para precipitar a

fibra alimentar solúvel. O resíduo foi então filtrado e lavado com etanol e acetona. Depois de

secos, os resíduos foram pesados. Metade dos resíduos de cada amostra foi analisada para

proteínas totais e o restante para matéria mineral, (de acordo com os tópicos 4.4.2 e 4.4.4,

respectivamente). Paralelamente às amostras, foi realizado um ensaio “branco”, onde nenhuma

amostra estava presente. O teor de fibra alimentar total das amostras foi calculado de acordo com

a fórmula:

% FAT = Ramostra - Pamostra - Aamostra - B x 100

PA

75

Onde:

FAT = fibra alimentar total

R = peso médio do resíduo da amostra (mg), calculado pela diferença entre o R2 e o R1;

P = peso médio da proteína (mg);

A = peso médio da matéria mineral (mg), calculado pela diferença entre o R3 e o R1;

PA = peso médio da amostra (mg).

B = Rbranco – Pbranco – Abranco

O procedimento detalhado o encontra-se na FIGURA 1.

4.4.6 Carboidratos digeríveis

O percentual de carboidratos digeríveis foi calculado por diferença dos demais

constituintes analisados, usando a seguinte fórmula: [100g do peso seco – (g proteínas totais + g

lipídios totais + g de matéria mineral + g fibra dietética total)]/100g, de forma que o total some

100%.

4.4.7 Conteúdo de Energia

O conteúdo de energia foi estimado utilizado os fatores “Atwater” modificados, que são

17 para proteínas totais, 37 para lipídios totais e 17 para carboidratos digeríveis expressos em kJ

(FAO, 2003).

76

DIGESTÃO

1,0000 g da amostra livre de umidade em tampão fosfato de sódio 0,08 M, pH 6,0 (50 mL)

contendo 0,1 mL de α-amilase (kit TDF-100, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU)

Banho-maria (95 °C) por 15 min, agitação a cada 5 min

Resfriar à temperatura ambiente

Ajustar o pH para 7,3 a 7,7 com 10 mL de NaOH 0,275 M

Adicionar 0,1 mL de protease 50 mg/mL (kit TDF-100, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU)

Banho-maria a 60ºC com agitação por 30 min

Deixar resfriar à temperatura ambiente

Ajustar o pH para 4,0 a 4,6 com 10 mL de HCl 0,325M

Adicionar 100 mL de amiloglucosidase (kit TDF-100, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU) e

misturar bem

Banho-maria a 60ºC com agitação por 30 min

Deixar resfriar à temperatura ambiente

Acrescentar um volume de etanol 95% correspondente a 4 x o volume já existente nos recipientes

Registrar o peso do cadinho livre de umidade e da celite (referido como R1 = cadinho + celite)

Deixar as soluções sedimentarem overnight à temperatura ambiente

77

Umedecer e redistribuir a camada de celite (kit TDF-100, Sigma Co., St. Louis, EEUU) em cada

cadinho, usando etanol 78%

FILTRAÇÃO

Aplicar sucção branda para sentar a celite e transferir o precipitado e a suspensão para o cadinho

Acrescentar 20 mL de etanol 78%, 2 porções de 10 mL de etanol 95% e 2 porções de 10 mL de

acetona

Secar os cadinhos contendo os resíduos overnight em uma estufa ventilada a 105 ºC ou a vácuo a

70 ºC

Pesar os cadinhos livres de umidade (referido como R2 = cadinho + celite + resíduo)

PROTEÍNAS E CINZAS

Metade das amostras teve proteínas totais quantificadas segundo Baethgen e Alley (1989) e a

outra metade foi utilizada para a determinação de a matéria mineral (registrar o peso do cadinho

+ amostra calcinizada = R3) segundo a AOAC (1990)

FIGURA 1 - Procedimento para determinação de Fibra Alimentar Total da farinha delipidada das

sementes segundo a metodologia descrita pela AOAC (1997).

78

4.5 Composição em Aminoácidos

A composição em aminoácidos da farinha das sementes das dez espécies foi realizada

através de cromatografia de troca-iônica em HPLC (High Performance Liquid Chromatography),

adaptada a partir do método descrito por Spackman, Stein e Moore (1958). Em triplicata, 4 mg

da farinha delipidada de cada amostra foi hidrolisada com 1 mL de HCl 6,0 M contendo 1% de

fenol (p/v), por 22 h, a 110 ºC, em ampolas de vidro fechadas, sob atmosfera de nitrogênio.

Concluída a hidrólise, as ampolas foram abertas e o HCl/fenol removido por evaporação em

dessecador com pressão reduzida na presença de NaOH. Em seguida, as amostras foram

dissolvidas em tampão citrato de sódio pH 2,2, filtradas em membrana de 40 µm (Millipore®) e

submetidas à análise de aminoácidos.

O aminoácido aromático triptofano, sensível a hidrólise ácida, foi determinado pelo

método descrito por Pintér-Szakács e Molnár-Perl (1990). Amostras contendo 12,5 mg de farinha

foram colocadas em contato com 2,5 mL de reagente contendo ninhidrina a 1% dissolvida em

HCl 37% + ácido fórmico 96% (2:3, v/v), por 2 h, a 35 ºC. O branco foi realizado paralelamente

em condições semelhantes, mas sem ninhidrina. Em seguida, às amostras em solução foram

adicionados 2,5 mL de uma mistura feita com as soluções HCl/ácido fórmico descritas e etanol

absoluto (1:4, v/v). O teor de triptofano foi medido através de leitura espectrofotométrica a 380

nm, tendo como referência uma curva padrão feita com L-triptofano (Sigma-Aldrich Co., St.

Louis, EUA).

4.6 Dosagem de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais

4.6.1 Lectinas

A presença de lectinas nas dez sementes foi avaliada através de ensaios de atividade

hemaglutinante de seus Extratos Brutos (EBs), seguindo a metodologia descrita por Moreira e

79

Perrone (1977), adaptada para o uso de tubos de ensaio. Os Extratos brutos foram diluídos

seriadamente com NaCl 0,9% (1:2; 1:4; 1:8; 1:16 etc) e cada diluição foi misturada (1:1) com

uma suspensão a 2% de eritrócitos de coelho nativos e tratados previamente com um “pool” de

proteases de Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU). O tratamento com

proteases foi feito através da mistura da solução de proteases (1 mg. mL-1) com a suspensão de

eritrócitos a 2%, na proporção 1:100 (v/v), por 1 h, a 4 ºC. Em seguida, as proteases foram

retiradas por centrifugações e lavagens com NaCl 0,9%. Posteriormente, os tubos contendo as

amostras, com o sangue nativo e tratado de cada espécie animal, foram incubados a 37 °C por 30

min e mantidos por mais 30 min à temperatura ambiente. Após esse tempo, os tubos foram

centrifugados a 2000 x g, por 1 min, e a aglutinação foi visualizada a olho nu. Os resultados

foram expressos como título de hemaglutinação, o qual foi definido como o recíproco da maior

diluição que é capaz de provocar aglutinação visível. Essa concentração foi denotada como uma

unidade de atividade hemaglutinante (UH).


A atividade inibitória de tripsina das dez sementes de leguminosas foi determinada de

acordo com Kakade, Simons e Liener (1969) com algumas modificações. A extração dos

inibidores foi realizada agitando-se, durante 3 h, em temperatura ambiente, 20 mg da amostra

(farinhas das sementes das 10 espécies) em 1 mL de NaOH 0,01 N. A suspensão foi então

deixada em repouso por 30 min e, em seguida, uma alíquota de 0,5 mL desta suspensão foi

adicionada a 0,5 mL de NaOH 0,01 N e centrifugada a 15.000 x g, por 5 min. O sobrenadante foi

utilizado para determinação da atividade dos inibidores de tripsina. Para obtenção da curva

padrão de inibidor de tripsina, volumes de 10, 15, 20, 25, 30 e 35 µL de SBTI – inibidor de

tripsina de soja tipo Kunitz (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) dissolvido em NaOH 0,01 N, na

concentração de 1 mg/mL, foram incubados com 100 µL tripsina de pâncreas bovino, dissolvido

em HCl 0,001 N na concentração de 1 mg/mL, e 100 µL da solução de BAPNA – Nα-Benzoil-

DL-arginina-p-nitroanilida (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU), dissolvido em DMSO (dimetil-

80

sulfóxido de sódio) e água destilada. O volume final de cada tubo foi ajustado para 1,6 ml com

tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,2, contendo CaCl2 0,02 M. Após 5 min, os tubos foram incubados

a 37 ºC por 45 min. O procedimento do ensaio, realizado em triplicata, obedeceu à mesma

seqüência de eventos da curva padrão, apenas substituindo o SBTI por 20 µL do sobrenadante da

amostra. A reação foi interrompida pela adição de 200 µL de ácido acético 30 % (v/v) e a

absorbância lida a 410 nm contra os brancos (aos quais a tripsina não foi adicionada). Os

resultados foram expressos como a quantidade de tripsina (µg) inibida por miligrama de farinha

(µgTI/mgF).

4.6.3 Ureases

A determinação da atividade ureásica das dez sementes de leguminosas foi realizada de

acordo com a metodologia descrita por Kaplan (1969), com algumas modificações

(VASCONCELOS et al., 1997). Uma alíquota de 0,1 mL de uma solução de ureia 500 mM foi

misturada com 0,7 mL de EDTA 2%, tamponando com uma solução de fosfato de sódio 0,02 M,

pH 6,5. Em seguida, 0,2 mL dos EBs das farinhas das 10 sementes foram adicionadas e as

misturas foram incubadas a 37 ºC, por 15 min. Posteriormente, foram adicionadas às misturas 1,0

mL da solução A (62 g de fenol + 0,25 g de nitroprussiato de sódio/L) e 1,0 mL da solução B (43

mL de hipoclorito de sódio + 20 g de hidróxido de sódio/L), sendo deixadas a 37 ºC, por 5 min.

Após esse tempo, foram adicionados 7,0 mL de água deionizada aos tubos, sendo estes cobertos

com filme de PVC e agitados vigorosamente. As leituras das absorbâncias foram feitas a 625 nm

e a atividade enzimática foi avaliada em relação a uma curva padrão obtida com urease (EC

3.5.1.5, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU). A atividade ureásica foi expressa como unidades

de enzima por Kg de farinha (U/KgF).

81

4.6.4 Toxinas

A detecção de toxinas das sementes das dez leguminosas foi realizada por meio da

avaliação da toxicidade aguda dos EBs das farinhas das sementes das respectivas espécies. Foi

realizada segundo a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (1997), através de injeção

intraperitonial (0,3 mL/10 g de peso corpóreo) em camundongos machos, pesando entre 20-25 g,

alimentados ad libitum com dieta peletizada comercial. Diferentes teores de proteína foram

testados, de modo a encontrar a dose máxima não letal, a dose mínima capaz de causar 100% de

letalidade e doses intermediárias envolvendo percentuais de morte no intervalo de 0-100%. Para

toxicidade, foram considerados válidos apenas os resultados observados no período de 24 horas.

A toxicidade foi expressa como DL50, sendo definida como a quantidade de proteína (g de

proteína/Kg de peso corpóreo) necessária para produzir convulsões e morte em 50% dos animais

testados.

4.7 Determinação de Minerais

A quantificação de oito elementos minerais de importância nutricional (ferro, zinco,

sódio, potássio, cálcio, magnésio, manganês e cobre) foi realizada por espectroscopia de emissão

atômica (ICP-OES) (OLIVEIRA et al., 2009). Para cada espécie analisada, 200 mg de farinha de

semente delipidada foram tratados com 3 mL de ácido nítrico e 1 mL de peróxido de hidrogênio

30% (v/v). Esta mistura foi aquecida em microondas (“Multiwave, Anton Par”) sob pressão,

utilizando o programa “soyabean”, específico para sementes de leguminosas (35 minutos de

aquecimento e 15 minutos de resfriamento). Após a decomposição das amostras, a suspensão foi

aferida para 25 mL com água padrão Milli-Q. A curva de calibração foi preparada usando uma

solução com padrões de cada mineral a ser quantificado. As análises foram realizadas em

triplicata.

82

4.8 Criação de Índice de Qualidade Nutricional para a Classificação das Espécies mais

Promissoras

Para possibilitar a comparação entre as leguminosas selvagens, os dados obtidos para

proteínas totais, aminoácidos essenciais (metionina e cisteína), lipídios totais, fibra alimentar,

minerais (calcio, ferro, zinco e potássio) e de fatores tóxicos e antinutricionais (lectina, inibidores

de tripsina, urease e toxina) foram aplicados em um índice de seleção linear, ou otimizado,

fenotípico (FARIAS, 2005). Para tanto, foi levado em consideração a importância das

leguminosas como fonte de proteínas, aminoácidos essenciais, lipídios, fibras e minerais, além de

incluir como atributo desejável, nesta média, a presença de níveis baixos de fatores tóxicos e

antinutricionais. Para cada um desses componentes foi estabelecido, com base nos valores

desejáveis, nos resultados obtidos nas análises ou em valores de referência um valor limítrofe que

era mínimo para características desejáveis e máximo para as indesejáveis. Quando o valor obtido

experimentalmente para uma característica desejável era maior que o valor limítrofe, o resultado

era positivo e negativo se fosse menor. Para as características indesejáveis, o inverso era

verdadeiro. Em seguida, cada valor foi multiplicado pelo seu peso de acordo com a característica

em questão e procedeu-se a soma algébrica de cada termo. O resultado final desta soma foi,

então, dividido pela soma dos pesos (SOUZA, 2010).

4.9 Experimento Nutricional I

O Experimento nutricional I foi realizado com a espécie vegetal classificada como a mais

promissora para o consumo humano após a aplicação do índice de qualidade nutricional (IQN).

Assim sendo, Piptadenia moniliformis Benth. foi utilizada para uma investigação in vivo da

qualidade nutricional de suas proteínas.

4.9.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia moniliformis

83

4.9.1.1 Preparo das Dietas Experimentais

Para o experimento nutricional utilizando ratos em crescimento foram preparadas sete

dietas, cuja única diferença era a fonte de proteínas. Foi elaborada uma dieta isenta de proteínas,

denominada dieta aproteica (AP), como controle negativo; uma dieta contendo farinha de soja

processada termicamente por fervura (SJF), como controle positivo, por ser considerda padrão de

proteína vegetal de boa qualidade; uma dieta contendo farinha de soja crua (SJCr); uma dieta com

farinha de P. moniliformis Crua (PmCr) e três dietas processadas termicamente: dieta contendo

farinha de P. moniliformis processada por Fervura (PmF), dieta com farinha de P. moniliformis

processada por cozimento em Micro-ondas (PmM) e dieta com farinha de P. moniliformis

processada por cozimento em autoclave ou Autoclavagem (PmA). Para o processamento térmico

por fervura, as sementes de P. moniliformis e de soja comercial foram imersas em água na

proporção de 1:4 (p/v) por quatro horas, a água foi escorrida e foi, novamente, adicionada água

na proporção de 1:5 (p/v) e levados em uma panela de vidro temperado a uma chapa elétrica

(XMTD-702, Biomixer) para a fervura por quarenta e cinco minutos. Para o cozimento em

micro-ondas, as sementes foram colocadas em recipiente apropriado com água na proporção de

1:5 (p/v) e colocado para cozinhar no micro-ondas em potência máxima (100%, que corresponde

a aproximadamente 180 °C), por vinte minutos. Já para a autoclavagem, as sementes foram

colocadas em recipiente apropriado com água na mesma proporção dos processamentos

anteriores, levados à autoclave e mantidos sob pressão a 121º C por 20 minutos. Após os

processamentos térmicos as sementes foram secas em estufa 60º C (FANEM, Modelo 002 CB,

São Paulo, Brasil), moídas em moinho para grãos de café e peneiradas em malha de 1,0 mm2 a

fim de obter uma farinha bem fina. Todas as dietas formuladas foram isocalóricas e isoproteicas,

exceto para a dieta aproteica, de modo a conter 100 g de proteína por Kg de dieta (100 g/Kg), ou

seja, 10 % de proteína, variando apenas a fonte proteica utilizada (TABELA 1).

Para preparo de todas as dietas foram adicionados 50g/Kg de uma mistura de vitaminas

[vitamina B12 (100%) 0,5; ácido fólico 0,1; biotina (99%) 0,1; piridoxina HCl 0,2; tiamina HCl

0,2; riboflavina (99%) 0,2; pantotenato de cálcio (97,5%) 0,4; ácido nicotínico 0,6; inositol 8,0;

84

p-amino-benzóico 0,2; cloreto de colina (50%) 16,0; vitamina A 0,24; vitamina D 0,25; vitamina

E 1,2; vitamina K 0,02 e amido de milho 971,79] e de Mistura de minerais [Citrato de cálcio

296,1; fosfato de cálcio monobásico 108,2; fosfato de potássio dibásico 210,1; cloreto de sódio

74,0; cloreto de potássio 119,5; carbonato de cálcio (40 %) 65,8; carbonato de magnésio 34,3;

carbonato de cobre 1,1; carbonato de zinco 0,48; fluoreto de sódio 0,48 e iodeto de potássio 0,1].

4.9.1.2 Procedimento Experimental

A avaliação da qualidade nutricional da farinha integral crua e processada de sementes de

P. moniliformis como fonte de proteínas foi realizada de acordo com a técnica descrita por Miller

e Bender (1955). Ratos machos da linhagem Wistar foram adquiridos do Biotério Central após o

desmame e com peso médio de 60,00 ± 5,00 g, sendo alimentados com dieta comercial peletizada

(Biobase, Águas Frias, Santa Catarina, Brasil) até atingirem o peso médio de 70,00 ± 5,00 g.

Grupos homogêneos de animais foram selecionados para serem submetidos a um período de

adaptação de, em média, 5 dias às gaiolas metabólicas de acrílico e à dieta comercial pulverizada

até atingirem um peso médio de 85,00 ± 5,0 g. Após o período de adaptação, grupos homogêneos

de animais (6 animais/grupo) foram utilizados, sendo os animais distribuídos individualmente em

gaiolas metabólicas, as quais possibilitam a coleta separada de fezes.

Para cada grupo de animais foram oferecidas as dietas experimentais, contendo farinha de

sementes de P. moniliformis crua e processadas (por fervura, por cozimento em micro-ondas e

autoclavagem), e as dietas controles, uma à base de farinha de soja crua e processada

termicamente por fervura e a outra isenta de proteínas. Para cada tratamento foram ofertados

diariamente 15 g de dieta e água ad libitum durante 10 dias.

85

TABELA 1 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas controle [Dieta Farinha de Soja Processada por Fervura

(SJF) e Dieta Aproteica – AP] e experimentais [Dieta Farinha de P. moniliformis Crua (PmCr), Dieta Farinha de Soja crua (SJCr),

Dieta Farinha de P. moniliformis processada por Fervura (PmF), dieta com Farinha de P. moniliformis processada por cozimento em

Micro-ondas (PmM) e dieta com farinha de P. moniliformis processada por Autoclavagem (PmA)] do experimento nutricional I

DIETAS INGREDIENTES

SJF AP SJCr PmCr PmF PmM PmA

Farinha de soja Fervida 272,70 __ __ __ __ __ __

Farinha de soja crua __ __ 272,70 __ __ __ __

Farinha de P. moniliformis crua __ __ __ 268,95 __ __ __

Farinha de P. moniliformis fervida __ __ __ __ 267,45 __ __

Farinha de P. moniliformis em Micro-ondas __ __ __ __ __ 296,91 __

Farinha de P. moniliformis Autoclavada __ __ __ __ __ __ 309,41

Amido de milho 288,64 475,00 288,64 301,96 305,42 286,74 278,82

Glucose 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00

Mistura de fibras (Neofiber®) 93,20 125,00 93,20 50,94 46,44 37,78 34,11

Óleo de milho 95,46 150,00 95,43 130,22 130,69 128,56 127,66

Mistura de vitaminas 50 50 50 50 50 50 50

Mistura de minerais 50 50 50 50 50 50 50

Densidade calórica 3,91 3,90 3,91 3,93 3,93 3,94 3,94

86

A dieta consumida e o peso de cada rato foi mensurado diariamente. A partir do 5° dia de

experimento, as fezes passaram a ser coletadas e congeladas. No último dia de experimento (10°

dia), os animais foram deixados em jejum por 2 h e, passado esse tempo, foram levemente

anestesiados com éter etílico e tiveram seu sangue retirado por punção do plexo retro-orbital,

sendo coletados em tubos limpos e livres de anticoagulantes. O sangue foi centrifugado a 2000 x

g, por 10 min, e soro foi coletado e armazenado a – 20 °C para posterior determinação de

parâmetros sorológicos.

Em seguida, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e dissecados para

retirada e mensuração de seus órgãos internos [timo, coração, pulmões, baço, estômago,

pâncreas, intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo), intestino grosso, rins e fígado]. A carcaça de

cada animal foi pesada. Os órgãos foram congelados, liofilizados e pesados novamente. As

carcaças foram colocadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil) a 100 °C, por

72 h, pesadas novamente e, finalmente, moídas para determinação do nitrogênio total

(BAETHGEN; ALLEY, 1989). As fezes foram pesadas e, finamente moídas para a determinação

do nitrogênio total pela mesma técnica descrita anteriormente.

4.9.1.3 Índices para Avaliação da Qualidade Proteica

Os índices para avaliação da qualidade proteica foram a Utilização Líquida de Proteína

(NPU), Digestibilidade (D) e Valor Biológico (VB) (MILLER; BENDER, 1955). As equações

utilizadas encontram-se a seguir:

NPU = N da carcaça (do grupo teste) – N da carcaça (do grupo aproteico) N ingerido do grupo teste

D = N ingerido - (N fecal do grupo teste – N fecal do grupo aproteico) N ingerido do grupo teste

87

Para o cálculo da digestibilidade verdadeira, foram utilizados os valores obtidos durante

os últimos cinco dias de experimento. Para os cálculos de NPU foram usados os valores dos dez

dias de experimento.

4.9.1.4 Parâmetros Bioquímicos Sanguíneos

Os parâmetros bioquímicos analisados no soro coletado dos animais foram: aspartato

aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, ureia, proteína total,

albumina e creatinina. As análises foram realizadas utilizando kits fotocolorimétricos para

diagnóstico clínico, seguindo as instruções do fabricante [Bioclin (Santa Branca, Brasil)].

4.9.1.5 Peso Relativo dos Órgãos em Base Seca

Foi calculada a relação ‘peso do órgão / peso da carcaça’ para cada órgão de cada animal,

em base seca. Em seguida, as médias de cada órgão para cada grupo foram comparadas e

avaliadas quanto a possíveis diferenças estatisticamente significantes entre os tratamentos.

4.10 Experimento Nutricional II

VB = NPU X 100

D

88

4.10.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia moniliformis livre

de αααα-galactosídios

4.10.1.1 Processo de extração dos α-galactosídios

As sementes de P. moniliformis foram submetidas a extração dos α-galactosídios de

acordo com o procedimento descrito por Gulewicz et al. (2000). Primeiramente, as sementes

inteiras foram embebidas com água destilada (1:2 p/v), e ficaram em repouso por 12 h a 4 °C.

Após esse período a água foi escorrida e reservada. Foi adicionado às sementes o mesmo volume

anterior (1:2 p/v) de etanol a 50% (v/v), preparado com álcool etílico P.A. e a água removida do

primeiro molho. As sementes foram então colocadas em banho-maria a 40 ºC onde ficaram em

repouso por 18 h. Após este período, o material foi novamente escorrido e o extrato

hidroalcoólico reservado. Um último molho foi realizado com etanol a 50% (v/v), desta vez

preparado com álcool etílico P.A. e água destilada, por 18 h a 40 ºC. Ao fim do procedimento, as

sementes foram mais uma vez escorridas e todos os extratos (o aquoso e os dois hidroalcoólicos)

foram reunidos e colocados em banho-maria a 60 °C para a evaporação total do ácool. Obtendo,

dessa forma, sementes de P. moniliformis livre de α-galactosídios e o extrato contendo os α-

galactosídios. Posteriormente, o que restou do extrato após a evaporação do etnol, foi congelado,

liofilizado e armazenado à temperatura ambiente até a utilização no preparo da dieta à base de

soja crua adicionada de α-galactosídios.

4.10.1.2 Preparo das Dietas Experimentais

Para o experimento nutricional II foram elaboradas duas dietas: Uma dieta contendo

farinha de P. moniliformis crua, livre de α-galactosídios (PmLG) e outra contendo farinha de

Soja comercial crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), como fontes de proteínas. Foram

utilizados os dados da dieta aproteica (AP) e da dieta farinha de soja processada termicamente

89

por fervura (SJF) e das dietas experimentais [Farinha de soja crua e farinha (SJCr) de farinha de

P. moniliformis crua (PmCr)] do experimento nutricional I, para comparação com as novas dietas

experimentais, no intuito de verificar se houve ou não melhora na qualidade da proteína no novo

processamento utilizado.

Após a retirada dos α-galactosídios, as sementes de P. moniliformis foram colocadas pra

secar em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil), moídas em moinho para grãos de

café e peneiradas em malha de 1,0 mm2 a fim de obter uma farinha bem fina. Após a

pulverização da soja crua, os α-galactosídios liofilizados foram pesados e adicionados a esta

farinha na mesma proporção em que se encontravam nas sementes de P. moniliformis.

Todas as dietas formuladas foram isocalóricas e isoproteicas, exceto para a Dieta

Aproteica, de modo a conter 100 g de proteína por Kg de dieta (100 g/Kg), ou seja, 10 % de

proteína, variando apenas a fonte proteica utilizada (TABELA 2). As vitaminas e os minerais

foram preparados do mesmo modo que no experimento nutricional I e adicionados de modo a

representar 5 % da massa total de cada dieta.

O procedimento experimental adotado no experimento de alimentação II foi

essencialmente similar ao procedimento empregado no experimento nutricional I.

As determinações dos parâmetros bioquímicos sangüíneos, do peso relativo dos órgãos e

dos índices para avaliação da qualidade proteica foram realizadas como descrito anteriormente

para o experimento de alimentação I.

4.11 Análise Estatística

Os dados numéricos referentes aos experimentos nutricionais foram submetidos à análise

de variância (One-way ANOVA) para a avaliação das possíveis diferenças entre os grupos,

seguida de teste de contraste entre as médias (Teste de Tukey). O nível de significância

considerado foi p < 0,05. Os testes foram realizados no programa GraphPad Prism versão 5

(GraphPad software).

90

TABELA 2 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas controles [Dieta Farinha de Soja Processada por Fervura

(SJF) e Dieta Aproteica– AP] e experimentais [Dieta Farinha de P. moniliformis Crua Livre de α-galactosídios (PmLG), Dieta

Farinha de Soja crua Adicionada de α-galactosídios (SJAG), Dieta Farinha de P. moniliformis crua (PmCr), dieta com Farinha de

Soja crua (SJCr)] do experimento nutricional II

DIETAS INGREDIENTES

SJF AP SJCr PmCr PmLG SJG

Farinha de soja Fervida 272,70 __ __ __ __ __

Farinha de soja crua __ __ 272,70 __ __ __

Farinha de P. moniliformis crua __ __ __ 268,95 __ __

Farinha de P. moniliformis crua livre e α-galactosídios __ __ __ __ 343,29 __

Farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios __ __ __ __ __ 272,70

Amido de milho 288,64 475,00 288,64 301,96 279,79 288,64

Glucose 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00

Mistura de fibras (Neofiber®) 93,20 125,00 93,20 50,94 0,0 93,20

Óleo de milho 95,46 150,00 95,43 130,22 126,92 95,46

Mistura de vitaminas 50 50 50 50 50 50

Mistura de minerais 50 50 50 50 50 50

Densidade calórica 3,91 3,90 3,91 3,93 3,96 3,91

91

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O Brasil é considerado possuidor da maior biodiversidade do planeta, estimada em cerca

de 20% do número total de espécies do mundo e a Caatinga está inserida nessa estatística,

contribuindo na diversidade de espécies apresentando muitas plantas nativas sub-explorada,

principalmente no que se refere ao seu potencial nutricional (CALIXTO, 2003; Ambiente Brasil-

Ambiente Natural - Caatinga, 2011). Este patrimônio genético tem valor econômico estratégico

inestimável em várias atividades devendo ser mais bem aproveitado.

Diante da grande variedade de espécies da flora mundial que são utilizadas para a

alimentação pela população e da possibilidade de existência de inúmeras outras com igual

potencial nunca antes estudado, tornou-se relevante a seleção de algumas espécies nativas da

Caatinga cearense para essa investigação.

Dessa forma, dez sementes de espécies vegetais da caatinga foram selecionadas para um

estudo de qualidade nutricional, inicialmente pela disponibilidade de suas sementes. Algumas

informações a respeito das dez espécies escolhidas forma coletadas e encontram-se no QUADRO

1.

Após levantamento bibliográfico sobre as espécies escolhidas, partiu-se para a

investigação do potencial alimentar dessas espécies selvagens da Caatinga cearense. Para tanto,

foi realizada a determinação da composição proximal, da composição de aminoácidos, dos

fatores tóxicos e/ou antinutricionais e composição de minerais. Após análise dos dados, as

espécies mais promissoras foram destacadas.

5.1 Composição Proximal das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A composição proximal das sementes das dez espécies vegetais, em base seca,

apresentando percentual de proteínas totais, de lipídios, de carboidratos, de fibras, de cinzas, de

umidade e energia encontra-se na TABELA 3.

92

QUADRO 1 – Informações botânicas, nutricionais e antinutricionais das dez espécies de leguminosas da caatinga.

Família – Subfamília

Nome Botânico/

Nome popular

[Tipo de ambiente/vegetação:

Época da colheita]

Número de identificação

Informações sobre

propriedades nutricionais e

antinutricionais

Caesalpinia bracteosa Tul./

Catingueira

[Floresta Nacional do Araripe,

floresta úmida: Jan/2005]

EAC 39616

Não avaliada

Caesalpinia ferrea Mart./

Jucá, pau-ferro



EAC 39616

Relato de consumo de suas

vagens por animais (MAIA,

2004)

Hymenaea courbaril L./

Jatobá



EAC 38108

Vagens com farinha

comestível usada por homens

e animais (LORENZI;

MATOS, 2002)

Fabaceae – Caesalpinoideae

Senna rugosa (G.Don)

H.S.Irwin & Barneby/

Lagarteiro


floresta úmida: Sep/2005]

EAC 38112

Não avaliada

Continua

93


Continuação

Família-Subfamília

Nome Botânico/

Nome popular


Época da colheita]


Informações sobre


antinutricionais

Dioclea megacarpa Rolfe/

Mucunã, olho-de-boi



EAC 38110

Atividade lectínica

(MOREIRA et al., 1983) e

atividade inibitória de tripsina

(CARVALHO, 1988)

Erythrina velutina Willd./

Mulungu

[Semiárido da Caatinga: Sep/2005]

EAC 35979


(MORAES et al., 1996)

Fabaceae – Faboideae

Lonchocarpus sericeus (Poiret)

Kunth/

Ingá

[Semiárido da Caatinga: Oct/2006]

EAC 39615

Composição proximal,

Energia, antiutrientes,

composição de aminoácidos e

ensaio de alimentação com

ratos (PROLL et al., 1998).


(ALENCAR et al., 2005)

Continua

94


Continuação

Família-Subfamília

Nome Botânico/

Nome popular


Época da colheita]


Informações sobre


antinutricionais

Enterolobium contortisiliquum

(Vell.) Morong/

Orelha-de-macaco, orelha-de-

negro


floresta úmida: Set/2005]

EAC 38115

Atividade inibitória de

tripsina tipo Kunitz

(BATISTA et al., 1996)

Parkia platycephala Benth./

Visgueiro


floresta úmida: Mar/2007]

EAC 38109

Atividade lectínica (MANN

et al., 2001) vagens usadas na

alimentação de ruminantes ,

(LORENZI, 2002)

Fabaceae – Mimosoideae

Piptadenia moniliformis Benth./

Catanduva

[Semiárido da Caatinga:

Mar./2007] EAC 35974

Atividade inibitória de

tripsina tipo Kunitz (CRUZ,

2008)

95

TABELA 3 – Composição proximal e de energia das sementes de dez leguminosas selvagens da caatinga

% em base seca Espécies vegetais

Energia*

(kJ/100g)

%

Umidade Proteínas† Lipídios Carboidratos¶ Fibras Cinzas

Caesalpinia bracteosa 1.159 15,9 ± 0,5 29,3 ± 1,5 10,9 ± 0,2 15,2 40,9 ± 0,7 3,7 ± 0,1

Caesalpinia ferrea 1.000 10,3 ± 0,6 42,7 ± 1,6 1,8 ± 0,2 12,2 37,7 ± 0,9 5,6 ± 0,2

Dioclea megacarpa 1.618 12,8 ± 0,5 44,8 ± 1,9 2,5 ± 0,0 44,9 5,3 ± 0,0 2,5 ± 0,0

Enterolobium contortisiliquum 1.291 10,3 ± 0,5 50,0 ± 3,4 3,4 ± 0,0 18,5 24,6 ± 0,3 3,5 ± 0,4

Erythrina velutina 1.299 10,3 ± 1,0 39,0 ± 3,6 12,4 ± 0,1 10,4 33,2 ± 1,4 5,0 ± 0,2

Hymenaea courbaril 1.804 11,4 ± 0,2 10,9 ± 0,4 8,0 ± 0,4 8,3 70,3 ± 0,8 2,5 ± 0,4

Lonchocarpus sericeus 1.709 6,7 ± 0,6 35,7 ± 1,6 29,6 ± 0,1 0,4 30,8 ± 0,3 3,5 ± 0,1

Parkia platycephala 1.048 10,0 ± 0,1 32,2 ± 1,9 13,4 ± 0,7 0,3 52,3 ±1,0 1,8 ± 0,1

Piptadenia moniliformis 1.390 11,4 ± 1,1 44,7 ± 2,0 7,2 ± 0,1 21,4 23,5 ± 0,2 3,2 ± 0,1

Continua

96

TABELA 3 – Composição proximal e de energia das sementes de dez leguminosas selvagens da caatinga

Continuação

% em base seca Espécies vegetais

Energia*

(kJ/100g)

%

Umidade Proteínas† Lipídios Carboidratos¶ Fibras Cinzas

Senna rugosa 1.048 8,2 ± 0,1 22,3 ± 1,3 0,7 ± 0,0 37,8 37,3 ± 0,4 1,9 ± 0,0

§RDI 8.368

(kJ/dia) -

50

(g/dia)

65

(g/dia)

300

(g/dia)

25

(g/dia) -

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata.

* Estimado pela multiplicação do percentual de proteínas totais, lipídios totais e carboidratos digeríveis pelos fatores “Atwater”

modificados, que são 17 para proteínas totais, 37 para lipídios totais e 17 para carboidratos digeríveis expressos em kJ (FAO, 2003).

†N x 6,25; ¶ O teor de carboidratos foi determinada pelo cálculo da diferença percentual de todos os outros componentes de acordo com a fórmula:

[100g peso seco – (g proteína bruta + g lipídio bruto + g cinzas + g fibra dietética)]/100g.;

§ Referência de ingestão diária de 101.9 (c) (8) iv. FDA U.S. Food and Drug Administration (2010).

97

O percentual de proteínas totais de todas as espécies analisadas apresentou-se elevado

com um valor médio de 35,16 %, superior ao de leguminosas de referências comumente

consumidas, como o de Phaseolus vulgaris (26,6 %) comercializados no Brasil (MECHI;

CANIATTI-BRAZACA; ARTHUR, 2005), os de seis cultivares de feijão de corda que variaram

de 19,5 to 26,1% (MAIA et al., 2000), bem como de três outros cultivares de feijão de corda que

apresentam média em torno de 20% (VASCONCELOS et al., 2010), além das ervilhas que

possuem, em média 25% de proteínas (SALGADO et al., 2002).

O teor de proteínas das 10 espécies variou de 10,9 ± 0,4 a 50,0 ± 3,4 %, todas

apresentando valor superior a 20% com exceção da espécie Hymenaea courbaril que apresentou

o menor teor de proteínas. Resultados semelhantes ou mesmo superiores aos de algumas espécies

analisadas foram encontrados para leguminosas não convencionais, como várias espécies do

gênero Canavalia contendo de 22,4 a 35,5% (SRIDHAR; SEENA, 2006), como os de

leguminosas indianas selvagens (20,3 a 35,0%) (VADIVEL; JANARDHANAN, 2005) e de

tremoço mexicanos também selvagens com 37,20 a 45,41% de proteínas em suas sementes

(RUIZ; SOTELO, 2001).

Ademais, algumas espécies apresentaram percentuais mais elevdos de proteínas (> 40%)

tais como: E. contortisiliquum (50,0 ± 3,4%), D. megacarpa (44,8 ± 1,9%) e P. moniliformis

(44,2 ± 2,0%) e C. ferrea (42,7 ± 1,6%), com valores superiores aos de fava que variam de 20 a

40%, de tremoço com média de 35% de proteínas, sendo a quantidade de proteínas dessas

sementes considerada altas por Salgado et al. (2002), e valores comparáveis ou até mesmo

maiores que aos de cinco cultivares de soja que variaram de 36,1 a 48,5% (VASCONCELOS et

al., 1997).

As sementes de leguminosas estudadas podem ser consideradas boas fontes de proteínas

já que 100 g de semente contêm de 22 a 100 % da recomendação de ingestão diária (RDI) para

adultos e crianças acima de quatro anos de idade, baseado na ingestão de 2.000 calorias diárias,

segundo a FDA, 2010.

O percentual de lipídios presente nas sementes das dez espécies vegetais apresentou-se, de

uma maneira geral, baixo e bem heterogêneo, posto que houve variação de 0,7 a 3,4 %, entre

quatro espécies e, as demais, apresentaram valores um pouco mais elevados de 7,2 ± 0,1 (P.

moniliformis) a 13,4 ± 0,7 (P.platycephala), exceto a espécie L. sericeus que apresentou alto

percentual de lipídios em suas sementes (29,6 ± 0,1). Esta última apresentou valor maior de

98

lipídios que os encontrados para alguns cultivares de soja, importante oleaginosa produzida no

Brasil, que possui 20,1 a 23,2 % de lipídios segundo o estudo de Vasconcelos et al. (2006), bem

como de outras cultivares de soja avaliadas que variaram de 18,3 a 21,5% (VASCONCELOS et

al., 1997). Esse dado mostra a importância de um estudo em relação à composição dos lipídios

dessa espécie como possíveis fontes de ácidos graxos mono e poliinsaturados, conhecidos por

prevenirem doenças cardiovasculares.

No entanto, as demais espécies apresentam valores de lipídios bem inferiores aos de

outras leguminosas conhecidas como os de sementes de soja (VASCONCELOS et al., 1997,

2006), citada acima e, sementes de grão de bico comercializada no Egito contendo 23,64 % de

lipídio (ALAJAJI; EL-ADAWY, 2006). Em contrapartida, 100 linhagens de feijão de corda

também apresentam baixos percentuais de lipídios, variando de 1,4 a 2,7% (NIELSEN;

BRANDT; SINGH, 1993), bem como de um importante legume indiano [Vigna mungo (L.)

Hepper] com valores variando de 0,5 a 3,7% do total de lipídios, sendo compatíveis com os

encontrados para algumas espécies avaliadas.

A quantidade de carboidratos digeríveis das espécies em estudo apresentou-se muito

variada. As espécies apresentando os mais altos percentuais foram: D. megacarpa (44,9%), S.

rugosa (37,8 %) e P.moniliformis (21,4%), em oposição a P. platycephala e L. sericeus possuíra

os menores níveis com 0, 3 e 0,4 %, respectivamente. Nas demais os teores variaram de 8,3 a

18,5 %.

Os teores de carboidratos da maioria das espécies foram baixos quando comparados aos

de leguminosas não convencionais, mostrados em um estudo comparativo realizado por Sridhar e

Seena (2006), tais como: Canavalia ensiformes (45,8 a 65,4%), Canavalia gladiata (45,1 a

68,5%), Canavalia marítima (44,9 a 50,5%) e de Canavalia cathartica (48,2 a 59,6%). O grão de

bico, leguminosa comumente utilizada na alimentação humana, também possui elevada

quantidade de carboidrato, pois varia de 41,10 a 47,42 % (ALAJAJI; EL-ADAWY, 2006), sendo

superior ao encontrado para maioria das espécies, mas semelhante à quantidade apresentada por

D. megacarpa (44,9 %).

Dentre as 10 espécies estudadas apenas D. megacarpa (5,3%) não apresentou boa

quantidade de fibras. Todas as outras apresentaram quantidades superiores a 20%, variando de

23,5 ± 0,2 % (P. moniliformis) a 70,3 ± 0,8 % (H. courbaril), quantidades consideradas elevadas,

visto que a recomendação de ingestão dietética (RDI) é de 25 g por dia (FDA, 2010), a qual seria

99

facilmente alcançada com ingestão de porções diárias dessa leguminosa quando associadas a

outros alimentos também contendo fibras. Além disso, algumas sementes possuem conteúdo de

fibras próximo ou superior ao encontrado no feijão comum (38,6 ± 1,6 g/100g) que é considerado

uma importante fonte de fibras para a população brasileira (MECHI; CANIATTI-BRAZACA;

ARTHUR, 2005).

Sementes selvagens de leguminosas indianas como Neonotonia wightii e Cássia

floribunda possuem apenas 8,7 % e 11,7 a 13,8 % de fibra dietética em suas sementes,

respectivamente (VISWANATHAN et al. 2001; VADIVEL; JANARDHANAN, 2001), o que

representa menos da metade do conteúdo apresentado pela maioria das leguminosas estudadas,

podendo ser, portanto, consideradas importantes fontes de fibras alimentares.

O alto consumo de fibras traz benefícios fisiológicos à saúde, como a melhora do trânsito

intestinal, redução dos níveis séricos de colesterol, redução nos níveis de glucose sanguínea e

diminuição da concentração de insulina, levando à redução na incidência de doenças intestinais,

doenças coronarianas e diabetes, respectivamente (SRIDHAR; SEENA, 2006).

Em relação às cinzas, as espécies apresentaram quantidades variando de 1,8 ± 0,1 (P.

Platycephala) a 5,6 ± 0,2 (C. ferrea). Muitas delas, encontram-se próximas à matéria mineral de

espécies do gênero Lupinus, que variam de 3,30 a 4,20 % (RUIZ; SOTELO, 2001), de

leguminosas não convencionais como Cassia floribunda, que variou de 3,4 a 5,3% (VADIVEL;

JANARDHANAN, 2001) e de Styphonolobium burseroides (3,3 %) e Acacia bilimekii (5,3 %),

(SOTELO et al., 1999). Os valores da matéria mineral das espécies em estudo foram merecedores

de atenção devido a sua boa quantidade, por isso foram determinados. (TABELA 6).

A umidade das sementes foi elevada e apresentou valores homogêneos entre si variando

de 6,7 ± 0,6 (L. sericeus) a 15,9 ± 0,5 (C. bracteosa). Resultados similares aos encontrados por

Sridhar e Seena (2006) para Canavalia gladiata (7,58 a 12,2%) e Canavalia ensiformis (3,80 a

13,5%). Oitenta por cento das espécies apresentaram umidade superior à do feijão de corda,

leguminosa muito consumida no nordeste do Brasil, que possui umidade variando de 6,1 a 8,9%.

Umidades mais altas não prejudicam os nutrientes contidos nas sementes uma vez que

alguns autores recomendam que a soja seja estocada, em média, a 12,5% de umidade para evitar a

proliferação de micro-organismos e a ocorrência de hidrólise de nutrientes capazes de reduzir o

valor nutritivo dos grãos (PUZZI, 2000; WEBER, 2001). Desta forma, a elevada umidade da

maioria das sementes pode ser considerada favorável à preservação de sua qualidade nutricional.

100

Embora a maioria das sementes avaliadas não apresente equilíbrio em seus

macronutrientes (proteínas, lipídios e carboidratos), o elevado percentual de um ou dois desses

nutrientes levou à alta quantidade de energia nas sementes (TABELA 3). Todas as espécies

apresentaram teor de energia igual ou superior a 1.000 kJ/100g, variando de 1.000 (C. ferrea) a

1.804 kJ/100g (H. courbaril). Esse resultado está de acordo como o estudo realizado por Seena,

Sridhar e Jung (2005) com uma leguminosa selvagem da Índia, Canavalia cathartica, que

apresentou 1.520 kJ/100g e com outras espécies selvagens desse mesmo gênero a Canavalia

ensiformis que apresentou variação de energia de 1.470 a 1.910 kJ/100g, a C. gladiata (1.690 a

1.830 kJ/100g) e a C. marítima (1.590 kJ/100g) (SRIDHAR; SEENA, 2006), além da Cassia

floribunda (1.422 – 1.444 kJ/100g) (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001). De acordo com

Kuzayali, Cowan e Sabry (1966) apud Sridhar e Seena (2006) a quantidade de energia de

leguminosas comumente cultivadas varia de 1.358 a 1426 kJ/100g. No entanto, P. vulgaris possui

menor quantidade de energia (955,25 kJ/100g.) que as demais (MECHI; CANIATTI-

BRAZACA; ARTHUR, 2005).

A energia apresentada por 100 g das leguminosas representa 12 a 22% da recomendação

de ingestão dietética (RDI) segundo a FDA (2010) e as sementes que apresentaram melhor

equilíbrio de macronutrientes foram: C. bracteosa, E. velutina, H. courbaril e P. moniliformis.

As espécies vegetais contam com uma boa composição química elementar mostrando que

esse potencial deve ser mais bem estudado para o aproveitamento de suas propriedades,

principalmente por serem leguminosas selvagens que vivem em condições adversas de

temperatura e umidade além de possuírem quantidades de macronutrientes que se assemelham ou

mesmo se sobrepõem às de leguminosas importantes no nordeste brasileiro como é o caso do

feijão de corda.

O fato das espécies vegetais da Caatinga ter apresentado elevado teor proteico não é

suficiente para caracterizar o valor nutritivo das proteínas nas sementes. É necessário, ainda, que

na composição de seus aminoácidos, os essenciais estejam presentes e sejam totalmente

disponíveis ao organismo durante o metabolismo (SGARBIERI, 1996). Para tanto, o próximo

passo foi a determinação da composição dos aminoácidos das sementes das 10 espécies em

estudo.

101

5.2 Composição de Aminoácidos das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A composição de aminoácidos essenciais e não-essenciais das sementes das espécies

vegetais analisadas está mostrada na TABELA 4.

Segundo os requerimentos de aminoácidos essenciais para crianças de duas diferentes

faixas etárias recomendados pela FAO/WHO/UNU (1985), a maioria das espécies atendeu aos

requerimentos de treonina, valina, isoleucina, lisina e histidina, sendo os dois últimos presentes

em todas as espécies com quantidades elevadas, atendendo aos requerimentos para ratos e

superiores as quantidades presentes na clara do ovo, que é uma proteína de referência por possuir

alto valor biológico, estando em consonância com a literatura que relata a presença de elevada

quantidade de lisina nas leguminosas (GUPTA, 1982).

Por outro lado, o conteúdo de outros aminoácidos essenciais como leucina, tirosina,

cisteína, metionina, fenilalanina e tritofano da maioria das espécies não atenderam aos

requerimentos da FAO/WHO/UNU (1985) ou não atingiram perfil dos aminoácidos da soja ou a

quantidade necessária para ratos conforme apresentados na TABELA 2. A característica inerente

às leguminosas de deficiência de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) (GUPTA, 1982;

VASCONCELOS et al., 2001; RUIZ e SOTELO, 2001) também foi apresentada pela maioria das

espécies, mas inesperadamente, duas espécies (E. velutina e P. moniliformis) apresentaram

quantidades de metionina mais elevadas que a da soja e a espécie P. platycephala apresentou

maior quantidade de cistina do que a soja e até do que de clara do ovo. Esse fato também foi

encontrado por Sridhar e Seena (2006) para duas leguminosas não convencionais.

O resultado da análise da composição de aminoácidos das espécies mostra que, de uma

maneira geral, o perfil das variedades de soja estudadas por Trugo et al. (2000) e por

Vasconcelos et al. (2001) pode ser comparado aos das espécies analisadas. No entanto, as

espécies E. velutina, P. platycephala, P. moniliformis e S. rugosa apresentam melhor perfil de

aminoácidos quando comparado ao dessa leguminosa padrão que é uma das mais importantes

fontes proteicas de plantas. As espécies destacadas merecem estudos mais consistentes para seu

aproveitamento como novas fontes de proteínas.

102

TABELA 4 - Composição de aminoácidos das proteínas das sementes de dez espécies de leguminosas da caatinga, composição de

aminoácidos de proteína vegetal (soja) e animal (clara de ovo) padrões e referências de aminoácidos para grupos de crianças em

diferentes idades e requerimento para ratos

Aminoácidos (mg/ gN)

Essenciais Não essenciais Espécies vegetais

Thr Val Ile Leu Lys Phe Tyr Met Cys Trp His Asx Glx Ser Gly Ala Arg Pro

Caesalpinia bracteosa 358 249 23 342 862 346 262 49 45 23 344 394 587 398 432 6 1202 148

Caesalpinia ferrea 318 154 154 311 789 281 222 44 101 21 419 471 757 369 378 8 1190 184

Dioclea megacarpa 292 154 188 356 1088 304 116 0 0 11 737 494 348 203 262 33 1490 180

Enterolobium contortisiliquum 239 213 188 509 931 326 234 64 52 12 379 577 884 356 314 311 509 164

Erythrina velutina 273 346 332 457 789 524 501 132 52 131 199 341 489 292 256 302 758 209

Hymenaea courbaril 211 261 276 390 861 254 353 0 0 0 918 408 375 257 501 175 922 131

Lonchocarpus sericeus 153 191 140 358 618 211 173 16 101 29 736 568 594 274 258 262 1500 96

Parkia platycephala 242 304 236 426 970 284 218 67 211 23 258 531 818 344 296 341 574 132

Piptadenia moniliformis 255 278 229 417 939 360 224 303 73 10 296 373 490 293 326 53 1120 215

Continua

103

TABELA 4 – Composição de aminoácidos das proteínas das sementes de dez espécies de leguminosas da caatinga, composição de

aminoácidos de proteína vegetal (soja) e animal (clara de ovo) padrões e referências de aminoácidos para grupos de crianças em

diferentes idades e requerimento para ratos

Continuação

Aminoácidos (mg/ gN)

Essenciais Não essenciais Espécies vegetais

Thr Val Ile Leu Lys Phe Tyr Met Cys Trp His Asx Glx Ser Gly Ala Arg Pro

Senna rugosa 299 288 168 421 456 265 182 0 151 65 374 789 819 434 385 386 597 238

Padrões

Soja* 238 291 237 480 409 378 314 86 102 34 190 696 1140 264 242 266 532 333

Ovalbumina† 308 346 361 482 689 559 275 327 149 91 146 382 538 339 204 363 650 182

Requerimento para

crianças¶

2 – 5 anos 212 219 175 412 362 394 156 69 119

10 – 12 anos 175 156 175 275 275 138 138 6 119

Requerimentos para ratos 250 343 312 500 375 564 282 10 156

Os valores são médias de três repetições da mesma amostra. Os valores de desvio padrão foram menores que 5% das médias.

*Vasconcelos et al. (2001).

†Adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA). ¶ FAO/WHO/UNU (1985).

104

Vale ressaltar ainda que a espécie E. velutina merece destaque dentre as espécies acima

citadas por possuir todos os aminoácidos essenciais em quantidades adequadas com exceção de

apenas um aminoácido, a cisteína, tendo apresentado também elevado teor de proteínas em suas

sementes, tornado-a uma espécie bastante promissora.

5.3 Determinação de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais das Sementes das Espécies

Vegetais da Caatinga

A qualidade nutricional das sementes como futuras fontes proteicas, além da quantidade

de proteínas e qualidade de aminoácidos essenciais presentes, depende da digestibilidade e da

biodisponibilidade dos aminoácidos essenciais que pode ser afetada pela presença de fatores

toxicos e/ou antinutricionais.

A TABELA 5 mostra a determinação da presença de compostos tóxicos e/ou

antinutricionais realizada no intuito de verificar qualidade das proteínas nas sementes. Os

compostos avaliados foram as lectinas, os inibidores e tripsina, as ureases e a atividade tóxica.

Em relação às lectinas, nas condições testadas, só foram encontradas nas farinhas de

metade das espécies avaliadas (D. megacarpa, E. velutina, L. sericeus, P. platycephala e S.

rugosa). A maior atividade hemaglutinante foi detectada em sementes de espécie P. platycephala

com 2.560 UH/g de farinha, em eritrócitos tratados e não tratados com protease. A presença de

lectinas nas espécies D. megacarpa, E. velutin, L. sericeus e P. platycephala era esperado, pois já

haviam sido previamente detectadas como mostra o QUADRO 1.

As demais espécies com atividade lectínica apresentaram variação de 160 a 2.560 UH/g

de farinha em eritrócitos tratados com protease, valores esses, maiores que os encontrados nas

farinhas de diferentes genótipos de feijão de corda (99,6 a 540,3 UH/gF), nas mesmas condições

(VASCONCELOS et al., 2010). No entanto, para cultivares de soja (leguminosa referência como

fonte de proteínas), a atividade lectínica encontrada foi bem superior, posto que variou de 1.152 a

147.456 UH/gF (VASCONCELOS et al., 2006).

As outras cinco espécies analisadas (C. bracteosa, C. ferrea, E. contortisiliquum, H.

courbaril, P. moniliformis) não apresentaram atividade hemaglutinante nas condições testadas.

105

TABELA 5 – Fatores tóxicos e/ou antinutricionais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga

Lectinas* Espécies Vegetais

Não tratados Tratados

Inibidor de Tripsina † Urease¶ Toxina§

Caesalpinia bracteosa ND ND 16,2 ± 0,8 11.278 ± 1.307 NL#

Caesalpinia ferrea ND ND 27,4 ± 0,2 822 ± 50 NL

Dioclea megacarpa 1.280 2.560 10,8 ± 0,1 47.178 ± 3.351 0,72 ± 0,03

Enterolobium contortisiliquum ND ND 26,2 ± 0,1 3.684 ± 173 1,12 ± 0,04

Erythrina velutina 1.280 1.280 24,0 ± 0,8 3.645 ± 171 1,01 ± 0,02

Hymenaea courbaril ND ND 4,5 ± 0,2 620 ± 28 NL

Lonchocarpus sericeus 1.280 320 8,3 ± 0,3 23.895 ± 3.388 NL

Continua

106

TABELA 5 – Fatores tóxicos e/ou antinutricionais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga

Continuação

Lectinas* Espécies Vegetais

Não tratados Tratados

Inibidor de Tripsina † Urease¶ Toxina§

Parkia platycephala 2.560 2.560 ND 5.907 ± 967 NL

Piptadenia moniliformis ND ND 8,9 ± 0,5 1.899 ± 228 NL

Senna rugosa 80 160 4,1 ± 0,4 465 ± 13 NL

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata, com exceção da dosagem de lectinas que foram expressas apenas as

médias. ND = não detectado. * UH/gF, onde Uma UH corresponde ao valor recíproco da maior diluição capaz de provocar aglutinação visível a olho nu em

eritrócitos de coelhos tratatos e não tratados com protease do Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA); † (µgTI/mgF), Atividade inibitória de tripsina é expressa por µg de tripsina inibida por miligrama de farinha; ¶ (U/KgF), A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha; onde Um grama de urease pura contém

870.000 unidades (Sigma).

*Toxicidade aguda em camundongos (n=6) foi expressa como DL50. Uma DL50 representa a quantidade de proteína em gP/Kg de peso

corpóreo de camundongo capaz de produzir convulsão e morte em 50% dos animais após administração por via intraperitoneal. NL =

Não letal em doses de 1g/Kg do peso corpóreo de camundongo. ND = Não detectado.

107

Fator positivo, visto que, tal atividade já foi encontrada em mais de 600 espécies de

leguminosas (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001) e segundo Mancini-filho, Lajolo, Vizeu

(1979) e Pusztai (1989) as lectinas estão presentes em quantidade superiores em grãos de

leguminosas e gramíneas, tendo sido detectadas em leguminosas convencionais e não

convencionais como Cassia floribunda, Canavalia cathartica, Styphnolobium burseroides e

Acacia bilimekii (SOTELO et al., 1999; VADIVEL; JANARDHANAN, 2001; SEENA;

SRIDHAR; JUNG, 2005).

As lectinas compreendem uma classe de proteínas que interagem com carboidratos e

constituem importantes fatores antinutricionais pelo fato de serem, em sua maioria, resistentes à

degradação por enzimas proteolíticas e, desse modo, quando presentes na dieta, podem causar

alterações nas mucosas gástrica e intestinal e no metabolismo, em geral, através da sua interação

com glicoconjugados encontrados nas células gástricas e nos enterócitos, causando uma

interferência não específica com a absorção e utilização de nutrientes (KORDÁS et al., 2000,

2001; OTTE et al., 2001; SASAKI et al., 2002, VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004;

OLIVEIRA et al., 2004a,b).

Entretanto, um processamento simples como cozimento dos grãos em elevada temperatura

(100°C), por um determinado período de tempo, inativam as lectinas, como encontrado para

várias lectinas de leguminosas (LINNER, 1994).

Os inibidores de tripsina foram detectados em quase todas as espécies, menos na P.

platycephala. A quantidade nas espécies variou de 4,1 ± 0,4 (S. rugosa) a 27,4 ± 0,2 µgTI/mgF

(C. ferrea). Resultados próximos foram encontrados para sementes de feijão de corda cuja

variação foi de 12,00 a 30,56 µgTI/mgF (MAIA et al., 2000) e de três cultivares de feijão-de-

corda (12,0 a 16,67 µgTI/mgF ) estudadas por Vasconcelos et al. (2010).

Entretanto, as espécies analisadas apresentaram valores baixos quando comparados aos

inibidores de tripsina encontrado em diferentes estudos com várias cultivares de soja, os quais

variaram de 28,1 a 77,2 µgTI/mgF (ARMOUR et al., 1998; QUEDRAOGO et al., 1999;

VASCONCELOS et al., 2001; 2006). As espécies de leguminosas não convencionais como

Cassia floribunda também apresentou inibidores de tripsina em suas sementes (16,4 a 17,4

UTI/mgP), bem como em espécies do gênero Sesbania spp, (5,25 a 14,01 µgTI/mgF), com

quantidades próximas ou inferiores as encontradas neste estudo (VADIVEL; JANARDHANAN,

2001; HOSSAIN; BECKER, 2001).

108

O Inibidor de tripsina é responsável pela diminuição da digestibilidade de proteínas por se

ligar à tripsina impedindo sua atuação, levando a redução de crescimento e hipertrofia

pancreática (LINNER, 1994; EVENEPOEL et al., 2000, BAJPAI; SHARMA; GUPTA, 2005).

Todavia se o cozimento dos grãos de leguminosas for realizado antes de seu consumo causará,

pelo menos em parte, desnaturação e inativação dessas proteínas, não afetando a digestibilidade e

aproveitamento das mesmas, podendo até desempenhar um positivo efeito para saúde

(DURANTI; GIUS, 1997), visto que estudos já investigam o potencial dos inibidores de tripsina

na prevenção e supressão da carcinogênese, mostrando indícios de sua participação (SAITO et

al., 2007; ZHANG et al., 2007; LIN; NG, 2008).

As ureases estão presentes em todas as espécies analisadas (TABELA 5), porém

apresentam-se em níveis bem diversos. A espécies D. megacarpa aparece como a detentora de

maior quantidade de atividade ureásica com 47.178 ± 3.351 U de urease/kgF, seguida de L.

sericeus (23.895 ± 3.388 U/kgF) e C. bracteosa (11.278 ± 1.307 U/kgF). As espécies com menor

quantidade de ureases são S. rugosa (465 ± 13 U/kgF), H. courbaril (620 ± 28 U/kgF) e C. ferrea

(822 ± 50 U/kgF). As demais espécies possuem valores que variam de 1.899 ± 288 a 5.907 ± 967.

Cultivares de soja estudadas por Vasconcelos et al. (2001), apresentaram valores que variaram de

107.320 ± 9.470 a 219.280 ± 12.600 U/KgF, sendo seu menor valor cerca de duas vezes maior

que a quantidade de urease apresentada pela espécie D. megacarpa com maior quantidade dessa

enzima entre todas analisadas. Outras nove cultivares de soja apresentaram valores ainda mais

altos de urease que variaram de 643.000 a 1.061.400 U/kgF (VASCONCELOS et al., 2006). A

variação no teor de urease na soja é comum, segundo Vasconcelos et al. (1997), e reflete a

variabilidade ambiental e genética.

O efeito antinutricional da urease não é bem compreendido, mas Polacco e Holland

(1993) sugerem que sua ação parece estar envolvida com a mimetização dos efeitos observados

para urease microbiana na mucosa gástrica. Além disso, no estudo de Vasconcelos et al. (2001), a

análise de regressão, feita para relacionar a qualidade da proteína da soja com os compostos

tóxicos e/ou antinutricionais presentes, mostrou que a urease é mais uma variável que também

está envolvida interferindo em alguns parâmetros nutricionais. Todavia, mesmo a soja possuindo

uma grande quantidade dessa enzima em suas sementes, essa leguminosa é bastante consumida

como fonte de proteínas em diversas partes do mundo. Isso ocorre porque, de acordo com as

pesquisas, quando os grãos de soja são submetidos ao tratamento térmico adequado, há uma

109

inativação suficiente de fatores antinutricionais, melhorando sua qualidade nutricional

(YOSHIDA; KAJIMOTO, 1988; MARTY; CHAVEZ, 1993; MARTY; CHAVEZ; DE LANGE,

1994; QIN et al., 1996; ZHU; RIAZ; LUSAS, 1996; RAJKO; SZABO, 1997; DUDLEY-CASH,

1999). Esse fato mostra que a presença dessa enzima provavelmente não afetará a qualidade

nutricional dos gãos das espécies em estudo se também for realizado um adequado tratamento

térmico antes de consumí-las.

Em relação à toxicidade, a maioria das espécies não apresentou atividades tóxicas para

camundongos quando seus extratos brutos foram injetados intraperitonealmente, nem mesmo na

dose mais elevada (0,3 mL para 10g de peso corpóreo). Apenas três especies tiveram a

capacidade de serem letais a camundongos: D. Megacarpa, E. velutina e L. sericeus , com DL50

de 0,72 ± 0,03; 1,12 ± 0,04 e 1,01 ± 0,02 g/Kg de peso corpóreo, respectivamente. Assim mesmo,

essa toxicidade foi pequena se comparada à apresentada pela soja Bays, onde sua DL50 foi de

0,137 ± 0,02 g/kgP (VASCONCELOS et al., 2001), representando toxicidade cerca de cinco

vezes maior.

A presença de toxina nas sementes foi avaliada porque, assim como para ureases, no

estudo de Vasconcelos et al. (2001), essas proteínas, quando ativas, interferem de alguma

maneira na qualidade nutricional dos grãos.

As proteínas antinutricionais, incluindo as toxinas, são instáveis ao calor, podendo ser

inativadas pelo cozimento ou outro tratamento térmico, como já descrito. O resultado aqui

apresentado mostra que as sementes de leguminosas selvagens possuem componentes

antinutricionais proteicos semelhantes e mesmo inferiores a muitas leguminosas comumente

consumidas, o que as tornam promissoras como novas fontes de proteínas. Nesse contexto,

estudo mais aprofundado com essa finalidade torna-se relevante, já que apenas a determinação de

compostos relacionados com qualidade nutricionais e antinutricionais in vitro, sozinhos apenas

sugerem boa ou má qualidade nutricional. Uma correlação entre os pontos fortes e fracos das

sementes selvagens em estudo pode apontar aquelas mais promissoras para estudos mais

refinados, portanto a determinação da quantidade de minerais presentes nesses grãos foi realizada

para investigar a presença de mais uma qualidade postiva.

110

5.4 Determinação da Composição de Minerais das Sementes das Espécies Vegetais da

Caatinga

A TABELA 6 mostra o resultado da análise da composição de minerais nas sementes das

espécies em estudo. O teor de potássio foi elevado em todas as sementes selvagens variando de

366 a 1.581 mg/100g de farinha (F), o que representa 12 a 45% da RDI (FDA, 2010). Resultado

comum para a maioria das leguminosas, segundo Vadivel e Jnardhanan (2001), que também

encontraram altos níveis desse mineral em sementes de Cassia floribunda, leguminosa não

convencional.

Altos teores de magnésio (102 a 244 mg/100 g de farinha), representando 26 a 61% RDI,

zinco (1,3 a 5,6 mg/100gF), 10 a 37% RDI, manganês (1,1 a 5,2 mg/100gF), 55 a 528% RDI,

cobre (360 a 2.200 µg/100gF), 36 a 110%, cromo (20 a 290 µg/100gF), 17 a 242% RDI e

molibdênio (0 a 600 µg/100gF), 0 a 800% RDI foram encontrados nas sementes avaliadas.

Relacionando os teores de alguns desses minerais (em mg ou µg por 100 gramas de

farinha) com outras leguminosas não cultivadas, a espécie Cassia floribunda apresentou maior

quantidade de magnésio (318), menor quantidade de zinco (1,7), similar quantiade de manganês

(1,0) e bem inferior de cobre (0,35). Já outra espécie, a Canavalia cathartica apresentou menor

teor de magnésio (5,3), maior teor de zinco (11,4) e, assim como para a outra leguminosa, similar

teor de manganês (1,36) e inferior de cobre (1,10). Essa comparação mostra que a composição de

minerais é muito variada entre as leguminosas e até mesmo entre uma mesma leguminosa de

diferentes origens, isso devido à origem genética, origem geográfica, níveis de fertilidade do solo,

da estação seca ou úmida ou ainda podem variar de um ano para o outro (OLUWATOSIN, 1998;

VADIVEL; JANARDHANAN, 2001; PHILLIPS et al., 2003; WANG et al., 2003; SEENA;


Vale ressaltar a elevada quantidade de cálcio que variou de 31 a 268 mg/100gF e de ferro

de 1,5 a 20,2 mg/100gF (correspondendo 3 a 50% da RDI e 8,3 a 112% da RDI, respectivamente)

apresentada pela maioria das espécies estudadas, posto que as leguminosas são conhecidas por

apresentarem baixas concentrações desses minerais além do zinco (WANG et al., 2003).

111

TABELA 6 – Composição de minerais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga e recomendação de ingestão diária (RDI)

para adultos e crianças com quatro ou mais anos de idade baseado em um consumo de 2000 Kcal diárias.

Minerais (mg 100g-1 de farinha de semente) Minerais (µg 100g-1 de

farinha de semente) Espécies Vegetais

K Na Ca Mg Fe Zn Mn Cu Cr Mo

Caesalpinia bracteosa 890 14,1 249 142 11,4 3,9 5,2 1.500 20 30

Caesalpinia ferrea 1.351 9,2 268 160 5,7 5,6 1,5 2.200 200 340

Dioclea megacarpa 738 7,8 31 111 5,2 1,8 1,6 620 280 190

Enterolobium contortisiliquum 844 9,2 41 244 20,2 2,0 2,3 890 280 20

Erythrina. Velutina 1.581 8,8 113 157 6,1 3,8 3,2 1.600 150 410

Hymenaea courbaril 366 10,2 58 117 3,8 1,5 2,5 1.040 280 70

Lonchocarpus sericeus 1.137 10,6 224 102 5,9 5,7 3,7 1500 160 320

Parkia platycephala 826 8,1 116 229 5,9 2,3 1,7 1.080 110 90

Piptadenia moniliformis 888 9,0 103 135 4,4 3,0 2,2 800 230 290

Senna rugosa 813 5,5 116 124 5,5 1,3 2,7 360 90 50

** RDI (mg/dia) (µg /dia)

3.500 2.400 1.000 400 18 15 2,0 2.000 120 75

Os valores são médias de três repetições da mesma amostra. Os valores de desvio padrão foram menores que 5% das médias. * Não detectada pela metodologia utilizada ** Referência de ingestão diária de 101.9 (c) (8) iv. FDA U.S. Food and Drug Administration (2010).

112

Os teores de minerais encontrados nesse estudo foram bem mais elevados do que o

presente em outras leguminosas selvagens e cultivadas (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001;

ONWULIRI; OBU, 2002; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005).

O cálcio é necessário para uma série de funções no corpo, incluindo a atividade

neuromuscular, a funções na membrana, secreção hormonal, atividade enzimática, coagulação do

sangue e mineralização óssea. Uma ingestão adequada de cálcio na dieta é imprecindível sendo

necessária para compensar as perdas obrigatórias de cálcio no urina e os sucos digestivos, bem

como perda de cálcio dos ossos (FRANCIS, 1996; FRANCIS et al., 2006). Já o ferro é essencial

ao metabolismo, atuando diretamente nas reações celulares ou como cofator para centenas de

proteínas (BEARD; DAWSON; PIÑERO, 1996; CONRAD; UMBREIT; MORRE, 1999; ROY;

ENNS, 2000). Portanto, essas sementes podem contribuir para manter os níveis de ingestão

adequada desses minerais, caso sejam aptas ao consumo humano.

Os níveis de sódio nas sementes analisadas foram baixos variando de 1,4 to 14 mg/100gF,

podendo ser considerado um fator positivo já que esse mineral está presente em quase todos os

alimentos tornando fácil sua adequação e, seu consumo deve ser limitado a 2,4 g por dia (FDA,

2010) a fim de evitar aumentos na pressão arterial.

De uma maneira geral, o perfil de minerais encontrado nas sementes de espécies vegetais

selvagens desse trabalho são parecidos aos encontrados para espécies do sul da Índia, também

selvagens, dos gêneros Canavalia, Cassia e Mucuna (VADIVEL e JANARDHANAN, 2005),

bem como semelhante ao relatado por Onwuliri e Obu (2002) para diferentes variedades de feijão

de corda e feijão preto, só que com teores mais elevados nos minerais analisados com exceção do

cálcio e do sódio. Portanto, essas sementes são boas fontes de minerais, satisfazendo parcial ou

totalmente as necessidades de ingestão diária estabelecidas como referência (RDI) (TABELA 5).

Estando em consonância com a afirmação de Grusak (2002) de que leguminosas são uma

importante fonte de minerais na dieta com potencial de fornecer vários minerais essenciais

requeridos pelo homem.

Ezeagu et al. (2002) sugerem que um alimento destinado à alimentação humana ou para

fins de formulação de rações é sempre necessário determinar com precisão a composição dos

vários nutrientes e antinutrientes, particularmente quando for de interesse a utilização de fontes

não convencionais, a fim de atingir uma utilização ótima de tais ingredientes em uma dieta.

Após a análise dos constituites das sementes das dez espécies de leguminosas selvagens

113

da Caatinga pôde ser constatado que as sementes das espécies avaliadas possuem elevado

potencial como fonte de proteínas, fibras e minerais, segundo a análise da composição proximal,

boa composição de aminoácidos essenciais e de minerais, associados à baixa quantidade de

compostos tóxicos e/ou antinutricionais, tornando-as de fato, possíveis fontes adicionais ou

alternativas de proteínas para a alimentação humana ou animal. Contudo, algumas espécies são

mais promissoras que outras quando todos esses parâmetros são correlacionados, devendo ser

investigadas com mais afinco primeiro. Assim sendo, foi criado um índice de qualidade

nutricional para a classificação das espécies mais promissoras como fonte de nutrientes afim de

permitir uma investigação mais detalhada com testes que comprovem in vivo o aproveitamento e

a qualidade dos nutrientes.

5.5 Classificação das Espécies Vegetais Através do Índice de Qualidade Nutricional

O valor nutricional das sementes das leguminosas depende da presença de macro- e

micronutrientes, bem como da ausência de fatores tóxicos e/ou antinutricionais, os quais

depreciam a qualidade dos alimentos e causam respostas fisiológicas adversas (SHIMELIS;

RAKSHIT, 2005). Dessa forma, a análise em conjunto dos principais compostos detectados nas

sementes de leguminosas podem predizer a qualidade nutricional de cada espécie analisada e

apontar aquelas mais promissoras como fonte de nutrientes para estudos futuros mais

aprofundados, utilizando modelos biológicos para experimentos in vivo.

Para tanto, um Índice de Qualidade Nutricional (IQN) foi estabelecido, aplicando pesos

arbitrários, de acordo com o grau de importância atribuído a cada composto analisado. Ao teor de

proteínas foi atribuído peso cinco (5), seguido do teor de dois aminoácidos essenciais, conhecidos

por serem deficientes em leguminosas, metionina e cisteína, com peso quatro (4). Tendo sido

escolhido para determinação do índice devido, sua deficiência geralmente ser um dos fatores

limitantes ao aproveitamento das proteínas de leguminosas. Sendo as leguminosas fontes de

minerais e de fibras, estes aparecem logo em seguida, na mesma ordem de importância, sendo

atribuído para a quantidade de ambos peso equivalente a três (3). Foram destacados alguns

minerais (cálcio, ferro, zinco e potássio) como característica do IQN por serem mais importantes

114

na alimentação humana. Para o teor de lipídios, o peso foi dois (2), escolhidos para determinar o

IQN por ser um macronutriente importante na representação da quantidade de energia, bem como

por ser fonte de gordura mono e poli-insaturadas benéficas à saúde. E, por último, ficaram os

fatores antinutricionais, já que reduzem a qualidade dos nutrientes, como peso um (1).

A cada uma das características consideradas foi estabelecido um valor limítrofe. Para o

percentual da composição proximal (proteínas, lipídios e fibras), foi estabelecido que seria a

média dos teores das próprias sementes (34,5%, 9%, 28,6%, em base seca, respectivamente), pelo

fato de seus valores serem superiores aos encontrados na Tabela Brasileira de Composição de

Alimentos (TACO, 2006), para feijão comum e para o feijão de corda, consideradas leguminosas

importantes e muito consumidas no Brasil, especialmente na região Nordeste desse país. Em

relação aos aminoácidos essenciais (Metionina e Cisteína), o valor limítrofe foi considerado igual

ao teor daqueles presentes na soja (VASCONCELOS et al., 2001), devido ser uma leguminosa

utilizada como padrão de referência. Os minerais tiveram valor limítrofe de acordo com a

quantidade (mg/g) apresentada pelo feijão comum (carioca) cru (TACO, 2006). Para os fatores

antinutricionais, devido à baixa quantidade apresentada pelas dez sementes de leguminosas

quando comparadas às quantidades de leguminosas mundialmente consumidas como soja e feijão

comum, foram atribuídos para as lectinas e toxinas apenas SIM ou NÃO, sendo o SIM

equivalente a zero e o NÃO equivalente a 1. Já para os inibidores de tripsina e para as ureases

foram utilizados como limítrofe as próprias médias das dez sementes (9,94 µgTI/mgF e 13 U/gF).

A TABELA 7 mostra a classificação das espécies, de acordo com o índice de qualidade

nutricional (IQN) aplicado, em ordem decrescente, da mais promissora para a menos promissora.

O IQN foi capaz de apontar quais espécies apresentaram o maior número de

características desejáveis para o propósito de serem utilizadas como fonte de alimentos,

destacando especialmente as proteínas, posto que o maior peso (peso 5) foi atribuído a elas.

As três espécies mais promissoras segundo o IQN, em ordem decrescente, foram: P.

moniliformis > P. platycephala > E. Velutina. A variação do índice entre as dez espécies foi

grande, de -24,04 (D. Megacarpa) a 23,71 (P. Moniliformis).

115

TABELA 7 – Índice de Qualidade Nutricional* das espécies vegetais da caatinga em ordem

decrescente

* Índice calculado multiplicando-se cada valor em excesso ou em

falta, resultante da diferença dos valores desejados (valores

limítrofes atribuídos), previamente estabelecidos pelo seu peso

atribuído arbitrariamente, seguido da soma algébrica de cada termo.

O resultado final desta soma é dividido pela soma dos pesos de cada

componente.

ESPÉCIES VEGETAIS ÍNDICE DE QUALIDADE

NUTRICIONAL

Piptadenia moniliformis 23,71

Parkia platycephala 13,32

Erythrina Velutina 1,51

Caesalpinia ferrea - 2,78

Senna rugosa - 6,08

Lonchocarpus sericeus - 6,45

Enterolobium contortisiliquum - 6,90

Caesalpinia bracteosa -10,99

Hymenaea courbaril - 21,66

Dioclea megacarpa - 24,04

116

A espécie P. moniliformis Benth., detentora do maior IQN (23,71), possui um elevado

percentual de proteínas (44,7%) contendo todos os aminoácidos essenciais, incluindo metionina e

cisteína, atendendo à recomendação para crianças (nas faixas de 2 – 5 e 10 – 12 anos) segundo a

FAO/WHO/UNU (1985), com exceção de apenas cisteína, triptofano e tirosina, além de possuir

teor razoável de lipídios (7,2%) e de carboidratos (21,4%), os quais, juntamente com as proteínas

a torna boa fonte de energia (1.390 kJ/100 g). Rica fonte de fibras (23,4%) e matéria mineral

(3,2%), contendo boas quantidades de todos eles. Dentre os fatores antinutricionais de natureza

proteica avaliados apresenta apenas baixas quantidades de inibidores de tripsina (8,9 µgTI/mgF)

e de urease (1.899 U/g). Justificando, portanto, sua colocação como primeiro lugar pelo IQN.

As demais espécies avaliadas também apresentaram bom perfil nutricional e a posição de

sua classificação de acordo com o IQN ou valores negativos do mesmo não significam que elas

não poderão ser uma fonte promissora de nutrientes para futuras utilizações na alimentação

humana e/ou animal. Posto que, o índice foi aplicado no intuito de escolher qual semente deveria

ter prioridade nas análises de incorporação em dieta para animais experimentais para avaliar sua

qualidade in vivo, já que as determinações in vitro, sozinhas, não garantem o real aproveitamento

dos nutrientes por parte dos organismos que os consomem. Existe uma série de outros fatores que

podem interferir na utilização de nutrientes que não foram determinados e, por isso, precisam ser

detectados e mais bem avaliados.

Nesse sentido, a espécie P. moniliformis Benth. foi escolhida para a avaliação da

qualidade de suas proteínas in vivo por meio de experimentos de alimentação utilizando ratos em

crescimento.

5.6 Experimento Nutricional I

O experimento nutricional I foi conduzido para avaliar a qualidade nutricional in vivo das

proteínas das sementes de uma leguminosa selvagem, P. moniliformis Benth., espécie vegetal

classificada como a mais promissora segundo o IQN (TABELA 7) e destacada devido ao bom

perfil de sua composição química elementar e de suas qualidades mencionadas anteriormente. O

primeiro experimento teve o propósito de avaliar, em ratos em crescimento, a qualidade das

117

proteínas das farinhas das sementes de P. moniliformis crua e processada termicamente por três

diferentes métodos (fervura, cozimento em micro-ondas e autoclavagem) e comparar o

desenvolvimento de animais alimentados com a farinha de uma leguminosa padrão,

mundialmente consumida com fonte de proteínas, a soja. Para tanto, foram elaboradas sete dietas,

conforme descrito no item 4.9.1.1. Uma dieta contendo farinha de P. moniliformis crua como

fonte de proteínas (PmCr), três dietas com farinha de P. moniliformis processada termicamente

como fontes de proteínas, sendo um processamento a fervura (PmF), o outro o cozimento em

micro-ondas (PmM) e o último autoclavagem (PmA). Foi utilizada uma dieta com farinha das

sementes de soja crua (SJCr), para fins comparativos, uma dieta contendo farinha de sementes de

soja processada termicamente por fervura (SJF) como padrão positivo, e uma dieta isenta de

proteína ou aproteica (AP), como padrão negativo. As dietas foram denominadas conforme

especificado entre parênteses e foram oferecidas para ratos em crescimento para a análise dos

parâmetros nutricionais.

5.6.1 Crescimento dos animais

A dieta contendo farinha de P. moniliformis crua (PmCr) usada como fonte de proteínas

(100 g de proteínas por Kg de dieta) proporcionou menores taxas de crescimento nos ratos,

quando comparada com a dieta padrão, soja tratada termicamente por fervura (SJF), considerada

uma excelente fonte proteica de origem vegetal, bem como quando comparadas à dieta contendo

farinha de soja crua (SJCr) (FIGURA 2).

Os três processamentos térmicos [fervura (PmF), cozimento em micro-ondas (PmM) e

autoclavagem (PmA)] realizados na farinha das sementes de P. moniliformis, antes de compor as

dietas, de forma a minimizar os efeitos antinutricionais, aumentar a disponibilidade de

aminoácidos e, assim, melhorar a digestibilidade das proteínas, não foram eficazes em aumentar

o desempenho dos animais em relação a dieta contendo a mesma farinha crua. Ao contrário,

proporcionaram maior decréscimo na curva de crescimento do que aquela apresentada pela dieta

à base de soja crua (SJCr) e curva de crescimento semelhante a do grupo de animais que

receberam dieta isenta de proteínas (AP).

118

FIGURA 2 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de

Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento

em micro-onas (PmM) e cozimento por autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de

ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente

por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

50

60

70

80

90

100

110

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dias

Pes

o (g

)

SJF SJCr PmCr PmF PmA PmM AP

119

Os processamentos realizados em farinhas de leguminosas possuem o intuito de aumentar

a biodisponibilidade proteica, uma vez que o valor nutritivo e a digestibilidade proteica de farinha

de leguminosas cruas são baixos e, segundo Liener (1962), Khattab, Arntfield e Nyachoti (2009),

devem ser submetidos ao tratamento térmico. Além disso, já foi descrito na literatura que farinhas

de leguminosas cruas não são capazes de proporcionar bom crescimento e desenvolvimento em

amimais experimentais (RUBIO et al., 1991; VASCONCELOS et al., 2001; SEENA;


Foram escolhidos três tratamentos térmicos, dois mais convencionais (fervura e

cozimento em micro-ondas) e o outro, menos convencional (autoclavagem 121º C por 20

minutos). Os três tratamentos são capazes de aumentar o conteúdo de aminoácidos essenciais nas

sementes de leguminosas, incluindo os sulfurados (ALAJAJI; EL-ADAWY, 2006; KHATTAB;

ARNTFIELD; NYACHOTI, 2009), sendo a autoclavagem mais eficiente, e, também escolhido

devido sua utilização por alguns pesquisadores na mesma intenção proposta nesse trabalho

(melhoria da digestibilidade e redução de fatores tóxicos e/ou antinutricionais) (ALONSO;

AGUIRRE; MARZO, 2000; JIMÉNEZ-MARTÍNEZ et al., 2001; REHMAN; SHAH, 2005;

SIDDHURAJU; BECKER, 2005). A idéia era comparar a eficiência dos três tratamentos, mas

isso não foi possível porque todos levaram a uma redução no crescimento dos animais tal como a

farinha não processada. Resultados semelhantes foram encontrados por pesquisadores quando

administraram dietas à base de farinha de leguminosas selvagens como Enterolobium

cyclocarpium (PROLL et al., 1998), Canavalia ensiformis e Mucuna pruriens (AGBEDE e

ALETOR, 2005) tratadas termicamente, para ratos em crescimento, ocasionando perda de peso

nos animais experimentais desses estudos.

Por outro lado, ratos alimentados com dietas à base de farinha de outra leguminosa

selvagem (Canavalia cathartica) cozida, conseguiram aumentar seu peso, embora tenha sido

pouco em relação ao controle com dieta à base de caseína (SEENA et al., 2006). O baixo ganho

de peso desse estudo realizado por Seena et al. (2006) foi atribuído às lectinas tipo ConA por

terem sido resistentes ao tratamento térmico. Esse fator limitante de C. cathartica não pode ser

atribuído à dieta contendo farinha das sementes de P. moniliformis cozida por não ter sido

detectado lectinas na composição de sua farinha crua. Portanto, a redução da curva de

crescimento pelos animais deve ser atribuída a outros fatores não termolábeis que possam estar

interferindo em seu aproveitamento.

120

5.6.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar

A TABELA 8 mostra o resultado da variação de peso, dieta ingerida e eficiência alimentar

dos ratos alimentados por dez dias com as dietas à base de farinha de soja e de P. moniliformis

crua e processada termicamente por fervura, cozimento em micro-ondas e por autoclavagem, bem

como pelas dietas padrão: soja fervida e dieta isenta de proteínas.

Os grupos experimentais que receberam dietas contendo farinha de P. moniliformis crua

(PmCr) e processada termicamente (PmF, PmA e PmM), como fonte de proteínas, apresentaram

variação de peso (Peso inicial – Peso final) negativa e significativamente (p < 0,05) diferente em

relação a dieta controle positivo (SJF) a qual obteve um aumento no peso de 13,82 ± 6,17 g em

dez dias de experimento. As dietas experimentais PmCr, PmF, PmA e PmM tiveram variação de

peso similares de -17,87 ± 4,28 g, -16,72 ± 2,52 g, -20,32 ± 1,78 g e -17,57 ± 4,58 g,

respectivamente, não diferindo significantemente (p < 0,05) da perda de peso apresentada pelo

grupo que consumiu dieta aproteica (-22,50 ± 1,81 g). Os ratos alimentados com dieta contendo

farinha de soja crua também perderam peso (-9,46 ±1,33 g), embora menos que os demais

grupos. Na pesquisa de Giami (2005), os ratos alimentados com dietas contendo farinha de novas

linhagens de feijão de corda (Vigna unguiculata) crua como fontes de proteínas também

apresentaram perda de peso com variação de -2,87± 0,04 a -5,02 ± 0,06 g.

Existem relatos na literatura com estudos de alimentação em ratos utilizando farinha de

leguminosas cruas que também não promovem o ganho de peso e crescimento de animais

(KAKADE et al., 1972; FETUGA; BABATUNDE; OYENUGA, 1973; KADAM et al., 1987).

No entanto, após algum tipo de processamento na farinha dessas leguminosas, o ganho de peso

dos ratos é melhorado significativamente, como o encontrado para farinha de feijão de corda após

o tratamento térmico por fervura e por cozimento no vapor (GIAMI, 2005), bem como para

outras leguminosas após a fervura (WALKER; KOCHHAR, 1982; KADAM et al., 1987;

OYELEKE, 1992). Ratos alimentados com dieta à base de farinha da leguminosa não

convencional (Canavalia Cathartica) obtiveram ganho de peso de 4,43 ± 0,67 e 8,27 ± 0,95 g

para o tratamento com sementes assadas e para as sementes cozidas sob pressão, respectivamente.

121

TABELA 8 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiência alimentar* de ratos (n = 6) submetidos

a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente

por fervura (PmF), cozimento em micro-ondas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com

o crescimento de ratos alimentados com dieta contendo farinha de soja crua (SJCr), processada

termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes

estatisticamente (p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de

Teste de Tukey.

* Os valores estão expressos em g/rato.

# Eficiência alimentar = Variação de peso (g)/dieta ingerida (g)

Dietas Variação de Peso (g)

(Peso inicial – Peso final) Dieta Ingerida (g) Eficiência Alimentar#

SJF 13,82 ± 6,17a 104,78 ± 15,77a 0,11 ± 0,05a

SJCr -9,46 ±1,33b 78,80 ± 7,43b -0,13 ± 0,02b

PmCr -17,87 ± 4,28c 51,05± 3,10c -0,35 ± 0,09c

PmF -16,72 ± 2,52c 52,97 ± 4,04c -0,32 ± 0,05c

PmA -20,32 ± 1,78c 50,27 ± 3,67c -0,41 ± 0,05c

PmM -17,57 ± 4,58c 50,92 ± 4,64c -0,34 ± 0,06c

AP -22,50 ± 1,81c 68,30 ± 6,1b -0,33 ± 0,02c

122

No entanto, esses valores ainda são pequenos quando comparados aos apresentados pelos

animais que consumiram a dieta padrão caseína (33,27 ± 1,13 g) (SENNA et al., 2005). Ganho de

peso por parte dos animais não foi verificado neste trabalho, mesmo após três diferentes

tratamentos térmicos. Resultados similares foram encontrados por Proll et al. (1998)

administrando dietas para ratos em crescimento, à base de uma leguminosa não convencional

(Enterolobium cyclocarpium), tratada termicamente, que também não foi capaz de promover

aumento de peso nos animais, ao contrário, ocasionou uma perda de 10,0 ± 4,2 g. Dietas à base

da leguminosa selvagem (Amburana cearensis) crua e tratada termicamente ocasionaram grandes

perdas de peso nos animais (- 24,85 ± 3,56 e - 18,54 ± 2,05 g, respectivamente) que foram

atribuídas ao seu baixíssimo consumo dietético (FARIAS, 2009).

O grupo experimental que recebeu a dieta padrão (SJF) foi o que apresentou maior

consumo voluntário da dieta, atingindo 104,78 ± 15,77 g por animal, durante o experimento. Por

outro lado, os tratamentos que apresentaram menor consumo, não diferindo estatisticamente entre

si, foram os das dietas experimentais PmCr, PmF, PmA e PmM, cuja pequena variação foi de

50,27 ± 3,67 g a 52,97 ± 4,04 g por animal, o que representa um consumo cerca de duas vezes

menor em relação ao consumo do grupo da dieta padrão positivo (SJF). Os ratos que consumiram

a dieta SJCr ingeriram quantidades maiores que as consumidas pelos grupos testes e quantia

semelhantes aos ratos que utilizaram a dieta isenta de proteínas (AP). O baixo consumo das dietas

dos grupos testes pode ter ocorrido pela baixa palatabilidade, embora as leguminosas

normalmente tenham sua qualidade melhorada após o tratamento térmico. Muitas vezes, o odor é

fator crucial na aceitação da dieta por parte dos animais, segundo Martínez-Villaluenga et al.

(2007). Foi observado, durante a pesagem diária das sobras das dietas, que aquelas contendo

farinha de P. Moniliformis, quando em contato com água, ou seja, quando estavam molhadas

pelos animais, exalava um odor característico muito forte, lembrando o odor de β-mercaptoetanol

ou compostos que contêm enxofre. Os compostos responsáveis por este odor podem também

estar relacionados com o baixo consumo alimentar, mesmo após o tratamento térmico. Talvez

presença, nessa semente, do elevado teore de compostos sulfurados, como é o caso da metionina,

possa explicar esse fato.

Consequentemente, a eficiência alimentar, ou seja, a relação entre o ganho de peso e a

dieta ingerida, segue a mesma tendência do ganho de peso para cada grupo que, por sua vez, está

intimamente ligada ao consumo de dieta por parte do animal. Assim, os animais que receberam

123

dieta à base de soja tratada termicamente por fervura, tiveram maior consumo de dieta e maior

ganho de peso, apresentando maior eficiência alimentar com índice de 0,11 ± 0,05. Os animais

que se alimentaram das dietas (PmCr, PmF, PmA e PmM) dos grupos teste, consumiram cerca da

metade da quantidade de dieta consumida pelos animais do grupo da dieta padrão (SJF) e cerca

de 35% menos que o grupo que consumiu dieta a base de farinha de soja crua (SJCr), não

apresentando diferença significativa para os grupos teste em suas eficiências alimentares, as quais

foram negativas, caracterizando ineficiência alimentar (TABELA 8). As curvas de crescimento

dos animais dos grupos teste refletiram essa ineficiência alimentar com curva decrescente no

mesmo patamar do grupo que recebeu dieta isenta de proteínas. Resultado de ineficiência

alimentar também foi verificado por Farias (2009), ao avaliar a qualidade da proteína da

leguminosa não convencional Amburana cearensis crua e processada termicamente por fervura.

Na ocasião, o consumo alimentar dos animais de ambas as dietas foi bem menor que o

apresentado para as dietas teste deste trabalho, com perda de peso de 24,85 ± 3,56 g, para dieta

com farinha de A. cearensis crua e de 18,20 ± 2,05 g, para dieta com farinha de A. cearensis

cozida, perda essa até mesmo superior à do grupo aproteico desse estudo (-10,20 ± 0,76 g). Taxas

reduzidas de eficiência alimentar também foram verificadas para dietas à base de leguminosas

não convencionais como a de Adansonia digiata (0,04 ± 0,04) e de Enterolobium cyclocarpium (-

0,14 ± 0,06) (Proll et al., 1998).

5.6.3 Balanço Nitrogenado

Um dos métodos empregados na determinação da qualidade proteica é a determinação do

balanço nitrogenado que se refere à relação entre o nitrogênio ingerido e o nitrogênio excretado.

É considerado positivo quando a ingestão de nitrogênio é maior que sua excreção e

negativo quando ocorre o inverso, refletindo na baixa utilização das proteínas pelo organismo. O

resultado do balanço nitrogenado, referente aos últimos cinco dias de experimentos, como dieta

ingerida, nitrogênio ingerido e nitrogênio fecal, estão apresentados na TABELA 9.

124

TABELA 9 – Balanço de nitrogênio* dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas

de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF),

cozimento em micro-ondas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o de ratos

alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por

fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Dietas Dieta

Ingerida (D)

Nitrogênio

Ingerido (N)

Nitrogênio

Fecal (NF)

NF/N

x 100

SJF 55,48 ± 8,59ª 0,85 ± 0,16ª 0,12 ± 0,02ab 14,69 ± 1,44ª

SJCr 34,35 ±5,24b 0,55 ± 0,08b 0,11 ± 0,04a 21,33 ± 3,87ªb

PmCr 26,62 ± 1,22bc 0,43 ± 0,02bc 0,10 ± 0,02a 23,85 ± 2,96b

PmF 25,58 ± 2,39c 0,41 ± 0,04bc 0,15 ± 0,01abc 38,0 ± 5,61c

PmA 24,20 ± 2,42c 0,39 ± 0,04c 0,19 ± 0,03c 51,39 ± 5,09d

PmM 25,58 ± 2,59c 0,41 ± 0,04bc 0,17 ± 0,05bc 38,31 ± 6,41c



Teste de Tukey.

* Os valores estão expressos em g/rato e referem-se aos últimos cinco dias de experimento.

125

Os ratos alimentados com a dieta contendo soja cozida (SJF), como única fonte de

proteínas, obtiveram o maior consumo de dieta nos últimos cinco dias de experimento (55,48 ±

8,59 g). A ingestão dietética de ratos alimentados com dietas cuja fonte de proteínas era a farinha

de P. moniliformis crua e tratada temicamente (PmCr, PmF, PmA e PmM), foram

significativamente (p < 0,05) inferiores, cerca de duas vezes menor àquela verificada para a dieta

padrão.

A quantidade de nitrogênio ingerido pelos animais pertencentes aos grupos teste (PmCr:

0,43 ± 0,0 g; PmF: 0,41 ± 0,04 g; PmA: 0,39 ± 0,04 e PmM: 0,41g ± 0,04 g), seguiu a mesma

tendência da ingestão de dieta nos últimos cinco dias, em torno da metade do nitrogênio ingerido

pelo grupo que consumiu a dieta SJF (0,85 ± 0,16). Embora tenham sido encontradas diferenças

significativas (p < 0,05) nas quantidades de dietas ingeridas entre os diferentes grupos testes e o

controle, a ingestão de nitrogênio dos grupos alimentados com as dietas PmCr, PmF e PmM foi

similar àquela do grupo que recebeu a dieta à base de soja crua (0,55 ± 0,0 g). A quantidade de

nitrogênio ingerido nos grupos testes (PmCr, PmF, PmA e PmM) também foram inferiores aos

observados para leguminosas não convencionias como Adansonia digitata (0,95 ± 0,04 g),

Enterolobium cyclocarpium ( 0,79 ± 0,08 g) e Sesbania pachycarpa (0,94 ± 0,02 g) no estudo de

Proll et al. (1998).

Em relação à excreção de nitrogênio fecal, o maior nível de excreção de nitrogênio foi

apresentado pelo grupo de ratos que utilizaram a dieta PmA (0,19 ± 0,03 g), embora não tenham

diferido significativamente dos outros tratamentos térmicos.

O grupo de animais que fizeram uso da dieta SJF (padrão) excretou 0,12 ± 0,02 g de

nitrogênio em suas fezes, quantidade semelhante à excretada pelos grupos que consumiram as

dietas SJCr (0,11 ± 0,04 g), PmCr (0,10 ± 0,02 g) e PmF (0,15 ± 0,0 g). A excreção de nitrogênio

fecal dos animais alimentados com as dietas teste e padrão desse experimento foram próximas às

encontradas para ratos alimentados com dieta à base de clara do ovo (que contém proteínas de

alto valor biológico) que foi de 0,12 ± 0,01 g e de uma cultivar de soja cozida (0,16 ± 0,01 g).

Além disso, também excretaram menores quantidades que essa mesma cultivar de soja crua (0,36

± 0,02), apresentadas no estudo de Vasconcelos et al. (2001), bem como das leguminosas da

pesquisa de Proll et al. (1998), Adansonia digitata (0,32 ± 0,03 g), Enterolobium cyclocarpium

(0,46 ± 0,06 g) e Sesbania pachycarpa (0,24 ± 0,006 g).

126

Contudo, a quantidade de nitrogênio ingerida pelos grupos teste foi bem inferior que a

ingerida pelo grupo padrão, o que torna a excreção de nitrogênio dos grupos teste elevada,

refletindo no índice que relaciona a excreção de nitrogênio fecal com a ingestão do nitrogênio

dietético (FN/N x 100) presente na TABELA 9, onde, é inversamente proporcional ao nitrogênio

ingerido, sendo tanto menor quanto maior a quantidade de nitrogênio ingerido e vice versa, já que

os níveis de excreção fecal entre todos os tratamentos foram bem próximos. Dessa forma, o maior

índice foi encontrado para o grupo de ratos que ingeriram a dieta PmA (51,39 ± 5,09). Os

menores valores desse índice (FN/N x 100) foram 23,85 ± 2,96 para a dieta padrão SJF, 14,69 ±

1,44 para a dieta PmCr e 21,33 ± 3,87 para PmF, os quais não diferiram estatisticamente (P <

0,05), mostrando que os tratamentos de cozimento em micro-ondas e autoclavagem foram

inferiores à fervura no que diz respeito ao aproveitamento de proteínas, por terem apresentado

maiores taxas de excreção de nitrogênio. Portanto, os animais dos grupos experimentais

retiveram menos nitrogênio no organismo do que os animais do grupo controle.

A excreção de nitrogênio aumentada é geralmente associada à presença de fatores tóxicos

e/ou antinutricionais por muitos autores, já que prejudicam a digestão e/ou a absorção das

proteínas. Dessa forma, outros fatores antinutricionais que não foram aqui pesquisados podem

estar interferindo no aproveitamento das proteínas dos grupos testados.

Outros parâmetros nutricionais puderam ser avaliados através do ensaio nutricional com

ratos, tais como a Digestibilidade, a Utilização Líquida de Proteína (NPU) e Valor Biológico,

conforme mostrado na TABELA 10.

Para todos os parâmetros nutricionais avaliados, o grupo que se alimentou da dieta

contendo soja tratada termicamente por fervura (padrão) foram significativamente (p < 0,05)

superiores aos verificados para os grupos teste, com exceção da digestibilidade do grupo de

animais que consumiram a dieta PmCr, por não ter diferido significativamente do grupo da dieta

padrão. A dieta contendo soja crua não diferiu estatisticamente da dieta padrão para nenhum

parâmetro nutricional avaliado.

A digestibilidade avaliada foi a verdadeira que leva em consideração, também, a excreção

de nitrogênio endógena, ou seja, as perdas que ocorrem naturalmente no organismo, o que pode

ser avaliado a partir dos animais que não consumiram proteína durante o experimento (AP).

127

TABELA 10 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) com dietas

contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por

fervura (PmF), cozimento em micro-ondas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o

crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada

termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Dietas Digestibilidade

(%)

NPU

(%)

Valor Biológico

(%)

SJF 90,95 ± 0,95a 44,35 ± 8,19ª 0,49 ± 0,15a

SJCr 88,97 ± 5,73a 39,63 ± 8,92ª 0,45 ± 0,13a

PmCr 87,10 ± 3,30a -20,86 ± 5,15b -0,23 ± 0,07b

PmF 73,45 ± 4,71b -29,22 ± 8,07b -0,40 ± 0,12b

PmA 64,66 ± 5,83c -28,20 ± 9,30b -0,53 ± 0,16b

PmM 73,18 ± 6,30b -40,88 ± 3,53c -0,42 ± 0,15b

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não

diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-

way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

128

A digestibilidade apresentada pela dieta PmCr (87,10 ± 3,3 %) foi estatisticamente

semelhante à apresentada pela dieta SJCr (88,97 ± 5,73%) e superior àquela apresentada pelas

dietas contendo P. moniliformis tratadas termicamente [PmF (73,45 ± 4,71 %), PmA (73,18 ±

6,30) e PmM (64,66 ± 5,83)], as quais não diferiram entre si. Esse dado prova que o tratamento

térmico realizados com o intuito de aumentar a digestibilidade pelo aumento da disponibilidade

de proteínas e por redução de ativação dos fatores antinutricionais termolábeis não atingiu seu

objetivo.

Percentuais de digestibilidade similares foram encontradas para três leguminosas

indígenas chinesas, tratadas termicamente, Phaseolus angularis (75,2 ± 0,62 %), Phaseolus

calcaratus (70,1 ± 2,48 %) e Dolichos lablab (75,8 ± 2,57 %) (WONG; CHEUNG, 1998). A

digestibilidade das sementes da leguminosa Canavalia cathartica tanto assadas (53,48 ± 0,87 %)

quanto cozidas sob pressão (56,01 ± 0,31%) foi inferior à do grupo padrão caseína (90,46 ± 1,25),

bem como para as encontradas para as dietas testes (PmCr, PmF, PmA e PmM). A baixa

digestibilidade de Canavalia cathartica foi atribuída, pelo menos em parte, à presença de lectinas

(SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005).

A utilização líquida de proteína (NPU) que significa o percentual de nitrogênio ingerido

que ficou retido no organismo, foi superior para a dieta padrão, com 44,35 ± 8,19 %, não

diferindo significativamente da dieta SJCr com 39,63 ± 8,92 %. Os grupos das dietas teste

contendo P. moniliformis crua e tratada termicamente (PmF, PmA e PmM) não apresentaram

valores de NPU significativamente diferentes entre si, mas os valores calculados para esse

parâmetro foram negativos, o que significa que o nitrogênio ingerido não foi utilizado para

promover o crescimento e desenvolvimento dos animas, apresentando desempenho inferior ou

semelhante ao do grupo que consumiu dieta isenta de proteína (AP), conforme já verificado

através da curva de crescimento na FIGURA 2 e pela perda de peso apresentada pelos animais do

grupo teste na TABELA 8. Baixo percentual de NPU (20,9 ± 6.7 %) foi verificado para um

grupo de animais que apresentou perda de peso (- 10,0 ± 4,2 g) ao consumirem uma dieta

contendo proteínas da farinha de Enterolobium cyclocarpium (leguminosa não convencional)

tratadas termicamente (PROLL et al., 1998).

Embora o balanço nitrogenado tenha sido positivo, baixos percentuais de NPU foram

encontrados por Seena, Sridhar e Jung (2005) para a leguminosa (Canavalia cathartica) assada

129

(24,97 ± 1,61 %) e cozida sob pressão (27,06 ± 0,94 %), quando comparados ao da dieta padrão

caseína (79,57 ± 1,61).

Portanto, parece comum a baixa retenção de nitrogênio para testes iniciais com

leguminosas selvagens. No entanto, se for levado em consideração o fato de que a soja

consumida mundialmente já vem sendo melhorada geneticamente, estudada e analisada há muito

tempo, e, quando consumida crua também não proporciona bom desempenho nos animais

experimentais, pode-se dizer que as leguminosas selvagens, incluindo a P. moniliformis aqui

estudada, são importantes futuras fontes de proteínas para a utilização humana, bastando, para

isso, mais estudos na tentativa de melhorar o aproveitamento desse potencial.

O valor biológico associa a digestibilidade com o NPU, assim reflete o percentual de

proteínas digeridas e absorvidas que ficaram retidas no organismo. O resultado do valor biológico

foi semelhante ao do NPU, onde através do cálculo deste último, não foi verificada a retenção de

nitrogênio nos ratos alimentados com as dietas testes contendo P. moniliformis cruas ou tratadas

termicamente. Desse modo, os percentuais de valores biológicos também foram negativos,

mostrando que embora as proteínas possam ter sido digeridas elas não foram absorvidas e nem

retidas nos animais, tendo sido excretadas nas fezes, conforme demonstrado pela elevada

quantidade de nitrogênio fecal, em comparação com a dieta SJF. O valor biológico da dieta à

base de soja crua (0,45 ± 0,13 %) não diferiu daquele calculado para a dieta à base de soja fervida

(0,46 ± 0,15 %). Dietas à base de sementes de Canavalia cathartica assadas e cozidas sob vapor

apresentaram valor biológico relativamente baixo 46,68 ± 2,43% e 48,31 ± 1,58 %,

respectivamente (SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005), o que foi atribuído à presença de lectinas

remanescentes que não foram inativadas com os tratamentos térmicos.

Sabe-se que a qualidade das proteínas em uma dieta é afetada por compostos

antinutricionais que se ligam a elas, que interagem com o trato intestinal ou atuam sobre enzimas

digestivas impedindo seu aproveitamento, podendo levar a um aumento de perdas proteicas,

aumentando o conteúdo de nitrogênio fecal (VADIJVEL; JANARDHANAN, 2005). Além disso,

a ação destes sobre o consumo da dieta e a eficiência alimentar também deve ser considerada

(PROLL et al., 1998). Tendo sido atribuído aos compostos antinutricionais (alcaloides, taninos,

inibidores de tripsina e lectinas), em muitos trabalhos, o desempenho não satisfatório dos animais

alimentados com leguminosas selvagens (CARNOVALE; LUGARO; MARCONI, 1991; PROLL

130

et al., 1998; CHANG; BAILEY; COLLINS., 1994; WONG; CHEUNG, 1998; SEENA;


Entre os compostos proteicos antinutricionais e/ou tóxicos analisados na farinha de

sementes de P. moniliformis (TABELA 5), só foram encontrados inibidor de tripsina (8,9 ± 0,5

µgTI/mgF) e de urease (1.899 ± 228 U/KgF). Ainda assim, a quantidade desses fatores

antinutricionais é bem inferior ao encontrado para vários cultivares de soja (VASCONCELOS et

al., 2001; 2006). No trabalho citado, os animais alimentados com dieta à base de soja fervida

(SJF) não tiveram excreção de nitrogênio fecal aumentada, em comparação com outros trabalhos,

justamente por que estes compostos interferentes serem termolábeis e consideravelmente

reduzidos, conforme demonstrado nos trabalhos de Seena, Sridhar e Jung (2005) e de Vadivel e

Pugalenthi (2008) ou completamente desaparecidos com tratamentos térmicos segundo Habiba

(2002) e de acordo com o encontrado para os inibidores de tripsina do feijão comum, soja, fava,

ervilha, entre outros (TRUGO et al., 2000; EL-HADY; HABIBA, 2003). Outros compostos

antinutricionais proteicos que não foram analisados neste trabalho são os inibidores de

quimiotripsina e de α-amilase, contudo também são termolábeis e reduzidos com o aquecimento.

O desempenho dos animais alimentados com as dietas contendo P. moniliformis crua não

diferiu estatisticamente (P < 0,05) daqueles que consumiram as dietas contendo P. moniliformis

tratadas termicamente, nem mesmo através de autoclavagem, o que leva à conclusão de que os

fatores antinutricionais de natureza termolábil não foram os principais componentes prejudiciais

dessa dieta.

Outros compostos antinutricionais de natureza não proteica, ou seja, oriundos do

metabolismo secundário, dependendo do tipo e da quantidade consumida por animais, causam

perda de peso e redução de digestibilidade (CHEEKE; PALO 1995; DEARING; FOLEY;

MCLEAN, 2005; SORENSEN; MCLISTER; DEARING, 2005; FROBERG; IBRAHIM;

FURBEE, 2007). Os metabólitos secundários de P. moniliformis foram analisados

qualitativamente, tais como alcaloides, taninos, compostos fenólicos, saponinas e triterpenoides,

entre os quais foi determinada, apenas, a presença de compostos fenólicos como fenóis, flavonas,

flavonóis e xantonas (dados não mostrados nesse capítulo). Os compostos fenólicos são

responsáveis por reduzir a digestão e absorção de proteínas e minerais, levando a uma redução no

aproveitamento desses nutrientes (GILANI; COCKELL; SEPEHR, 2005). Todavia, são

parcialmente reduzidos com o tratamento térmico, como fervura, de acordo com o verificado para

131

feijão de corda (OLOGHOBO; FETUGA, 1984), para soja (KAKADE et al., 1972; GIAMI,

2002), bem como para novas linhagens de feijão de corda (GIAMI, 2005) e para ervilhas, grãos

de bico e lentilhas (XU; CHANG, 2008). Os remanescentes desses compostos na farinha de P.

moniliformis, após o aquecimento, poderiam estar contribuindo pra o aumento da excreção fecal

de nitrogênio, mas não é o fator limitante, posto que nenhum tratamento térmico foi capaz de

melhorar nenhum parâmetro nutricional, nem mesmo a autoclavagem pôde proporcionar leve

melhora no desempenho dos animais.

A presença de grandes quantidades de proteínas do tipo globulinas em leguminosas

diminui a digestibilidade das dietas devido à alta estabilidade de sua conformação nativa

dificultar a ação das enzimas digestivas. No entanto, o tratamento térmico é capaz de desnaturá-

las, abrindo sua estrutura, tornando-as menos resistentes a proteases, facilitando seu

aproveitamento (WALKER; KOCHHAR, 1982). Além dos tratamentos térmicos não terem

melhorado a digestibilidade das proteínas em relação à dieta à base de P. moniliformis crua, a

pesquisa de COSTA (2009) mostrou que a fração globulínica representa apenas 6 % do extrato

bruto de P. moniliformis, o que descarta completamente a possibilidade dessas proteínas serem as

principais responsáveis por estarem prejudicando a qualidade das proteínas.

Os ratos reduzem ou rejeitam o consumo dietético quando a qualidade da proteína não é

boa, ou seja, quando é pobre em aminoácidos essenciais (DE ANGELIS, 1986; KOEHNLE;

RUSSEL; GIETZEN, 2003). A farinha de P. moniliformis possui um bom perfil contendo todos

os aminoácidos essenciais (TABELA 4), possuindo inclusive metionina (em quantidade cerca de

três vezes mais que o recomendado para crianças de 2 a 5 anos (FAO/WHO/UNU, 1985), não

atendendo à essa recomendação apenas em cisteína, triptofano, que juntamente com a metionina

são conhecidamente deficientes em leguminosas (GRUSAK, 2002; SHIM; JUN; KANG, 2003),

além da tirosina.

A baixa ou mesmo a elevada quantidade de alguns aminoácidos essenciais podem ter

contribuído para o consumo mais baixo das dietas experimentais em relação à dieta padrão,

acarretando menor ingestão de nitrogênio, mas não justifica o não aproveitamento do nitrogênio

ingerido, pelo menos para a manutenção do peso corpóreo.

A explicação mais plausível para a não melhora dos tratamentos térmicos em relação à

farinha de P. moniliformis crua, pode estar no fato de a elevada temperatura ou prolongado

período de cozimento poder reduzir a quantidade de alguns aminoácidos essenciais, como já

132

verificado por alguns autores (MAIA, 1996; FARIAS, 2009) ou devido à reação de aminoácidos

com açúcares (reação de Maillard), juntamente com a formação de complexos com os compostos

fenólicos, tornando as proteínas indisponíveis (UZOGARA; OFUYA, 1992).

É sugerido que a não retenção de nitrogênio em experimentos de alimentação com ratos

pode ser atribuída, mais provavelmente, ao teor de carboidratos não digeríveis elevados

(EZEAGU et al., 1996). As substâncias indigeríveis, além das fibras incluem os oligossacarídeos

não digeríveis ou α-galactosídios, que são responsáveis por limitar o consumo de leguminosas

como feijão de corda e tremoço (Lupinus albus) por muitas pessoas em todo o mundo

(ONYENEKWE; NJOKU AMEH, 2000; PRICE et al. apud MARTÍNEZ-VILLALUENGA;

FRÍAS; VIDAL-VALVERDE, 2006)

Os α-galactosídios são substâncias causadoras de flatos que não são digeridas em seres

humanos devido à ausência de α-galactosidase, por isso são fermentadas por micro-organismos

no intestino, produzindo dióxido de carbono, hidrogênio e metano (WANG et al., 2003).

Segundo Shim, Jun e Kang (2003) a presença desses α-galactosídios é uma das principais

razões pelas quais as leguminosas não desempenham papel principal na alimentação animal e

humana, uma vez que causam desconforto e diarreia em animais, dificultando sua aceitação como

alimento (SRIDHAR; SEENA, 2006). Os α-galactosídios que fazem parte da família rafinose

são: rafinose, estaquiose, verbascose e ajugose (GRIESHOP; REESE; FAHEY JR., 2001)

Os grãos de leguminosas possuem elevada quantidade de carboidratos solúveis,

especialmente aqueles pertencentes à família dos oligossacarídeos rafinose. O processamento dos

grãos é uma forma padrão de manipulação para a utilização das leguminosas contendo α-

galactosídios. Devido à sua relativa estabilidade ao aquecimento, esse tratamento não é capaz de

eliminar seus efeitos indesejáveis (CERNING-BEROARD, 1976; ONIGBINDE; AKINYELE,

1983). O cozimento por 40 minutos do feijão de corda reduz em até 40% o nível de

oligossacarídeos (rafinose e estaquiose) (ONYENEKWE, et al., 2000). Outros tratamentos têm

sido empregados com a mesma finalidade e incluem hidratação, retirada das cascas (SOMIARI;

BALOGH, 1993), tratamento enzimático (THANANUNKUl et al., 1976), fermentação

(REDDY; SALUNKHE, 1980), germinação (TRUGO et al., 1990), extrusão de alta temperatura

(BOREJSZO; KHAN , 1992) e ultrafiltração (OMOSAIYE; CHERYAN; MATHEWS, 1978).

Entretanto, nenhum desses métodos, com exceção da germinação, é suficiente para uma redução

significativa dos agentes causadores de flatos (ONYENEKWE, et al., 2000; ARANDA et al.,

133

2001). Contudo, Gulewicz e colaboradores (2000), desenvolveram um procedimento simples de

extração de α- galactosídios em lentilhas e ervilhas que foi utilizada com sucesso para a redução

desses agentes causadores de flatos em tremoço (Lupinus albus var. multolupa), com elevada

redução, permanecendo apenas de 0,5 a 1% dos agentes causadores de flatos. A extração desses

compostos não ocasionou grandes variações no teor de macro- e micronutrientes presentes em

tremoço e aumentou a importância nutricional dessa leguminosa (MARTÍNEZ-

VILLALUENGA; FRÍAS; VIDAL-VALVERDE, 2006).

Diante do exposto e baseado na observação da presença de gases no intestino dos ratos,

além do forte odor, característico de farinha de P. moniliformis (conforme já mencionado) ter

sido verificado durante o sacrifício dos animais para a retirada de seus órgãos, após o final do

experimento nutricional, os α-galactosídios apresentaram fortes indícios de serem os responsáveis

pelo consumo moderado das dietas testes (à base de farinha de P. moniliformis), bem como pelo

aumento de excreção fecal, tendo prejudicado o desempenho dos animais, devendo ser mais bem

analisados.

No intuito de verificar o estado nutricional e indícios de toxicidade das dietas

experimentais, o sangue dos animais foi coletado e os parâmetros séricos avaliados.

Posteriormente, os ratos foram dissecados e seus órgãos internos avaliados.

5.6.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos

A análise do peso seco relativo dos órgãos (peso dos órgãos/peso da carcaça) foi realizada

para observar possíveis alterações decorrentes do consumo das dietas experimentais, cujo

resultado pode ser observado na TABELA 11.

Foi observada uma atrofia do timo dos grupos que consumiram as dietas experimentais

(PmCr, PmF, PmA e PmM) em relação ao grupo que recebeu a dieta padrão SJF e a dieta SJCr,

tendo sido mais proeminente para o grupo da dieta PmCr.

134

TABELA 11 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinha de

Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro- ondas (PmM) e autoclavagem

(PmA), (comparado com ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF)

e dieta isenta de proteína (AP).

Dietas

ÓRGÃOS

(g/100g) SJF SJCr PmCr PmF PmA PmM AP

Timo 0,23 ± 0,04ª 0,23 ± 0,03ª 0,12 ± 0,03b 0,16 ± 0,02bc 0,17 ± 0,02c 0,14 ± 0,02bc 0,16 ± 0,02bc

Coração 0,30 ± 0,02a 0,31 ± 0,03ac 0,38 ± 0,03ab 0,37 ± 0,04ab 0,42 ± 0,10b 0,35 ± 0,04ab 0,39 ± 0,04bc

Pulmões 0,42 ± 0,05a 0,55 ± 0,02b 0,63 ± 0,04bc 0,60 ± 0,06bc 0,65 ± 0,05c 0,61 ± 0,05bc 0,69 ± 0,06c

Baço 0,18 ± 0,01ª 0,20 ± 0,02a 0,23 ± 0,03ª 0,21 ± 0,02a 0,22 ± 0,03a 0,22 ± 0,04ª 0,20 ± 0,02ª

Estômago 0,53 ± 0,04a 0,61 ± 0,06ab 0,79 ± 0,08c 0,74 ± 0,07bc 0,76 ± 0,10bc 0,70 ± 0,06bc 0,78 ± 0,13c

Duodeno 0,80 ± 0,14a 0,92 ± 0,16ª 1,05 ± 0,15ª 0,94 ± 0,10a 0,96 ± 0,20ª 0,95 ± 0,22ª 0,93 ± 0,19ª

Jejuno 0,79 ± 0,16a 0,87 ± 0,25ª 0,95 ± 0,13ª 0,87 ± 0,12a 0,82 ± 0,21ª 0,91 ± 0,05ª 0,89 ± 0,14ª

Íleo 0,58 ± 0,09ª 0,73 ± 0,17ªb 0,81 ± 0,14b 0,82 ± 0,21 ªb 0,69 ± 0,18ªb 0,71 ± 0,13ªb 0,67 ± 0,08ªb

Intestino Grosso 0,72 ± 0,08ad 0,96 ± 0,08bd 1,04 ± 0,10bcd 1,21 ± 0,09c 1,21 ± 0,18c 1,16 ± 0,13bc 0,87 ± 0,11d

Continua

135

TABELA 11 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinha de

Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro- ondas (PmM) e autoclavagem

(PmA), (comparado com ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF)

e dieta isenta de proteína (AP).

Continuação

Dietas Órgãos

(g/100g) SJF SJCr PmCr PmF PmA PmM AP

Pâncreas 0,31 ± 0,07ª 0,44 ± 0,06ab 0,39 ± 0,14ª 0,36 ± 0,05a 0,33 ± 0,07ª 0,33 ± 0,03a 0,60 ± 0,20b

Fígado 4,28 ± 0,40ª 4,33 ± 0,33ª 5,27 ± 0,29b 4,40 ± 0,30ª 4,85 ± 0,88ab 4,78 ± 0,34ab 4,48 ± 0,31ab

Rins 0,79 ± 0,07a 0,98 ± 0,08b 1,29 ± 0,06c 1,21 ± 0,10c 1,29 ± 0,17c 1,18 ± 0,16cd 1,03 ± 0,07bd

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste de

Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

136

Atrofia de timo também foi verificada para ratos alimentados com dietas contendo

globulinas de feijão de corda como fontes de proteínas, a qual não foi capaz de proporcionar

crescimento e desenvolvimento adequado dos animais (FERNANDES, 2005b). Resultado

semelhante de atrofia de timo também havia sido relatado por Rubio et al. (1999) para ratos

alimentados com proteínas de grão de bico.

Houve um aumento em órgãos como os pulmões, estômago e íleo dos grupos das dietas

experimentais (PmCr, PmF, PmA e PmM), comparável ao ocorrido para o grupo da dieta

aproteica, embora não tenha sido significativamente diferente (p > 0,05) do grupo que consumiu

a dieta à base de soja crua, exceto pelo estômago do grupo da dieta PmCr. Tamanho aumentado

dos rins, fígado e do intestino grosso também foi verificado para os grupos das dietas

experimentais em relação ao grupo da dieta SJF. Aumento do fígado foi constatado apenas pelo

grupo da dieta PmCr. O aumento relativo no tamanho de estômago, rins e fígado também foram

verificados para ratos alimentados com dieta à base de Amburna cearensis (leguminosa

selvagem), a qual proporcionou drástica perda de peso nos animais durante o período

experimental (FARIAS, 2009). Dieta à base de soja crua também proporcionou aumento no

estômago, fígado, intestino grosso, intestino delgado e nos pulmões de ratos (VASCONCELOS

et al., 2001). Aumento de órgãos vitais parece ser uma tentativa do organismo para se manter

vivo em caso de perda de reservas de energia.

Os outros órgãos internos avaliados não apresentaram diferenças significativas (p > 0,05),

quando comparados ratos mantidos nas quatro dietas experimentais com a dieta padrão SJF, com

exceção do coração do grupo da dieta PmA e do fígado do grupo da dieta PmCr.

As alterações ocorridas no tamanho dos órgãos parecem estar mais associadas à

desnutrição sofrida por parte dos animais do que propriamente à toxicidade de compostos que

poderiam estar presentes na dieta.

Os tratamentos térmicos realizados nas sementes de P. moniliformis não interferiram no

tamanho dos órgãos avaliados em relação às sementes dessa leguminosa crua, não sendo,

portanto, capazes de evitar aumentos ou diminuições nos órgãos.

137

5.6.5 Análise dos parâmetros séricos

Os parâmetros séricos analisados foram: as proteínas totais, albumina, ureia, fosfatase

alcalina, aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT) e creatinina, estando

descritos na TABELA 12.

O maior nível de proteínas totais foi verificado no grupo da dieta padrão SJF (4,40 ± 0,25

g/dL), o qual foi estatisticamente igual (p > 0,05) ao verificado para o grupo da dieta PmCr (4,34

± 0,18 g/dL). Esse mesmo teor de proteínas totais foi apresentado para o grupo de animais que

consumiram dieta à base de proteína animal, a proteína da clara do ovo (4,40 ± 0,09 g/dL)

(CAMPELLO et al., 2009), embora os valores de referência para proteínas totais seja de 6 a 8,5

mg/dL.

Resultado semelhante foi encontrado por Farias (2009) para ratos alimentados com dieta à

base de Amburana cearensis tratada termicamente, os quais apresentaram níveis de proteínas

totais (5,24 ± 0,11 g/dL) semelhantes ao da dieta do grupo controle à base de proteínas da clara

do ovo (5,04 ± 0,37 g/dL).

O grupo que utilizou a dieta SJCr apresentou nível de proteínas totais semelhante ao dos

grupos experimentais que consumiram as dietas à base de P. moniliformis processadas

termicamente (PmF, PmM e PmA), cuja variação foi de 3,70 ± 0,27 a 3,87 ± 0,30 g/dL, estes

sendo inferiores aos valores encontrados para o grupo da dieta padrão SJF (5,04 ± 0,37 g/dL).

Esse parâmetro sérico avalia o metabolismo proteico, onde a síntese das principais

proteínas totais (albumina, globulina e fibrinogênio) está diretamente relacionada com o estado

nutricional do animal (GONZÁLEZ; SILVA, 2006). A redução dessas proteínas no plasma está

ligada a falhas hepáticas, transtornos renais e intestinais, hemorragias, deficiência na nutrição,

entre outras, sendo esta última a causa da depleção de proteínas plasmáticas, neste trabalho, dada

a elevada perda de peso apresentada pelos animais que consumiram as dietas experimentais,

refletindo na baixa disponibilidade de aminoácidos para a síntese proteica.

138

TABELA 12 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e

processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-onas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento

de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de

proteína (AP).

Continua

PARÂMETROS ANALISADOS

DIETAS

Proteínas

totais

(g/dL)

Albumina

(g/dL)

Ureia

(mg/dL)

Fosfatase

Alcalina

(U/L)

AST*

(U/mL)

ALT **

(U/mL)

Creatinina

(mg/dL)

SJF 4,40 ± 0,25ª 3,02 ± 0,16ªc 30,33 ± 6,22ab 181,97 ± 39,54a 13,73 ± 0,88a 14,99 ± 0,58a 0,63 ± 0,08a

SJCr 3,78 ± 0,19b 3,09 ± 0,15ac 41,92 ± 5,72a 171,37 ± 14,69a 9,25 ± 0,80b 10,69 ± 1,98ab 0,52 ± 0,05a

PmCr 4,34 ± 0,18ac 3,65 ± 0,52b 37,93 ± 6,53ab 136,00 ± 42,63ac 13,83 ± 1,10a 14,92 ± 5,25ab 3,23 ± 0,68b

PmF 3,70 ± 0,27b 2,92 ± 0,12ac 35,10 ± 8,25ab 80,78 ± 9,83b 12,39 ± 2,32ab 10,42 ± 0,66b 0,53 ± 0,05a

139

TABELA 12 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e

processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-onas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o

crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta

isenta de proteína (AP).

Continuação

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste de Variância

Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * AST: Aspartato aminotransferase. ** ALT: Alanina aminotransferase


DIETAS

Proteínas

totais

(g. dL-1)

Albumina

(g. dL-1)

Ureia

(mg. dL-1)

Fosfatase

Alcalina

(U. L-1)

AST*

(U. mL-1)

ALT **

(U. mL-1)

Creatinina

(mg/dL)

PmA 3,87 ± 0,30bc 2,77 ± 0,21c 37,84 ± 6,03ab 111,76 ± 14,94bc 11,96 ± 2,38ab 11,14 ± 1,0ab 0,55 ± 0,12a

PmM 3,73 ± 0,27b 2,93 ± 0,15ac 31,30 ± 8,08ab 94,90 ± 19,27bc 11,37 ± 1,18ab 12,00 ± 0,85ab 0,51 ± 0,08a

AP 4,37 ± 0,43ac 3,26 ± 0,22ab 27,39 ± 6,16b 144,00 ± 42,31ac 13,83 ± 1,10a 13,48 ± 3,18ab 3,27 ± 1,52b

140

Assim, os tratamentos térmicos realizados nas sementes de P. moniliformis parecem ter

promovido maior catabolismo proteico que o encontrado para o grupo da dieta PmCr, talvez por

não terem sido capazes de remover por completo os fatores antinutricionais presentes, associados

a uma redução de alguns aminoácidos essenciais, conhecidamente, provocada pelo aquecimento

de longa duração ou alta temperatura, sendo, este último fator não ocorrido para a dieta a base de

P. moniliformis crua.

Os níveis de albuminas séricas para os tratamentos avaliados foram bem próximos entre

si, variando de 2,77 ± 0,21 g/dL (PmA) a 3,65 ± 0,52 (PmCr) g/dL com pouca diferença

estatísitica, sendo o grupo PmCr e PmA os únicos a apresentarem diferença significante em

relação ao grupo da dieta SJF.

As albuminas são muito abundantes no plasma, podendo representar uma importante

reserva de proteína. Sua concentração pode ser afetada pelo estado nutricional, catabolismo, entre

outros fatores (GONZÁLEZ, 2000). A restrição proteica reduz a síntese de albumina, devido à

baixa e desequilibrada disponibilidade de aminoácidos, levando a uma diminuição de seus níveis

plasmáticos (COWARD et al., 1977; SMITH; LUNN, 1984). A mesma diminuição dos níveis de

proteínas totais dos grupos das dietas experimentais à base de P. moniliformis tratadas

termicamente foi observado para albuminas em relação a PmCr.

Os níveis de ureia plasmática dos animais que utilizaram as dietas experimentais (PmCr,

PmF, PmA e PmM) foram estatisticamente semelhantes (p > 0,05) aos de grupo padrão positivo

(SJF) e aos do grupo da SJCr, estando dentro dos níveis normais. A ureia é o produto final do

metabolismo de proteínas, assim há correlação com o metabolismo orgânico e reflete a função

renal (KHON; DINEEN; RUSSEK-COHEN, 2005). Seus níveis encontram-se normais (10 a 40

mg/dL) quando existe equilíbrio entre perfusão e função renal, conteúdo proteico da dieta e

catabolismo proteico. Elevado catabolismo de proteínas eleva os níveis de ureia sanguínea,

principalmente se estiver associado a falhas nas taxas de filtração dos rins, os quais não serão

capazes de excretá-las corretamente (KHON; DINEEN; RUSSEK-COHEN, 2005). Talvez o

tamanho aumentado dos rins, do grupo de animais que consumiram a dieta à base de P.

moniliformis crua e tratadas termicamente, seja devido a um aumento de sua atividade na

tentativa de excretar a ureia e manter seus níveis normais no sangue.

Níveis de creatinina também avaliam a função renal e são mais precisos do que a ureia

para a determinação de danos renais devido à sua independência de fatores como dieta, grau de

141

hidratação e catabolismo proteico, quando elevada. Em relação ao nível de creatinina os grupos

de animais que consumiram as dietas teste tratadas termicamente (PmF, PmA e PmM) não

apresentaram diferença estatística (p > 0,05) em relação ao grupo da dieta padrão SJF. O grupo

da dieta PmCr apresentou-se com níveis bem mais elevados (3,23 ± 0,68 mg/dL), comparáveis

aos do grupo da dieta AP (3,27 ± 1,52 mgdL), valores esses, superiores ao valor de referência que

é de 0,60 a 1,30 mg/dL. Esse resultado mostra que, provavelmente, a capacidade de filtração

renal foi prejudicada com o consumo de dieta PmCr testada e que os tratamentos térmicos

avaliados, apesar de não terem sido eficientes nutricionalmente, parecem não ter prejudicado a

função renal.

As enzimas fosfatase alcalina, AST e ALT avaliam a função hepática e níveis elevados

estão associados a lesões no fígado. Os níveis de fosfatase alcalina apresentaram-se elevados, de

uma forma geral, sem diferença significante entre os animais do grupo padrão SJF (181,97 ±

39,54 U/L) e dos grupos SJCr (171,37 ± 14,69 U/L) e PmCr (136,00 ± 42,63 U/L). Os grupos dos

ratos que consumiram as dietas processadas termicamente não diferiram de forma

significantemente entre si, nem em relação ao grupo da dieta aproteica (AP), nos níveis de

fosfatase alcalina.

A mesma elevação dos níveis dessa enzima como encontrados aqui, inclusive para o

padrão positivo, já foi verificado no estudo de Couto et al. (2008), para ratos sadios alimentando-

se de ração comercial (158 ± 19,42 U/L) e no estudo de Farias (2009), para ratos em dieta à base

de clara do ovo (133,36 ± 13,03 U/L), sem explicações definidas.

As outras enzimas indicadoras da função hepática, AST e ALT, não apresentaram

alterações em seus níveis, estando todos os animais dos grupos experimentais (PmCr, PmF, PmA

e PmM) com teores semelhantes estatisticamentes (p > 0,05) aos do padrão SJF, com exceção dos

níveis de ALT para PmF que foram inferiores ao controle positivo.

Os parâmetros séricos das dietas experimentais também não demonstraram danos

hepáticos, apenas uma provável alteração na função renal com o uso da dieta PmCr por prte dos

animais, além de confirmaram a presença de elevado catabolismo proteico e desnutrição dos

animais.

Na tentativa de descobrir o fator responsável pelo não aproveitamento das proteínas, bem

como melhorar a qualidade nutricional das proteínas presentes em sementes de P.moniliformis,

um novo experimento nutricional foi realizado.

142

5.7 Experimento Nutricional II

A suspeita de que os principais responsáveis pelo moderado consumo das dietas teste à

base de P. moniliformis, bem com pelo não crescimento e desenvolvimento dos ratos tenham sido

os α-galactosídios, levou à condução de um novo experimento nutricional utilizando dietas à base

de farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios (PmLG), comparados com dietas à

base de farinha de soja crua adicionada dos α-galactosídios (SJAG). Os α-galactosídios foram

extraídos das sementes de P. moniliformis (conforme descrito no tópico 4.10.1.1) e adicionados à

dieta contendo soja crua na mesma proporção em que eram encontrados na farinha de P.

moniliformis crua (4,55 % da farinha). Os resultados referentes às dietas contendo farinha de soja

cura (SJC), dieta contendo farinha de P. moniliformis crua (PmCr), bem como as dietas padrões

contendo farinha de soja tratada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteínas (AP),

foram utilizados do experimento nutricional I para fins comparativos, tendo como padrões

positivo (SJF) e negativo (AP).

De forma semelhante ao experimento nutricional I, as dietas foram denominadas

conforme especificadas nos parênteses e foram oferecidas para ratos em crescimento para a

análise dos parâmetros nutricionais.

5.7.1 Crescimento dos animais

A curva de crescimento dos animais alimentados com as dietas teste contendo farinha de

P. moniliformis crua livre de α-galactosídios (PmLG) e farinha de soja crua adicionada de α-

galactosídios (SJAG) como fonte de proteínas está mostrado no gráfico da FIGURA 3.

143

50

60

70

80

90

100

110

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dias

Pes

o (g

)

SJF SJCr SJAG PmCr PmLG AP

FIGURA 3 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de

Piptadenia moniliformis crua (PmCr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios

(PmLG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja

crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas

de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

144

Os ratos alimentados com a dieta (SJAG) apresentaram um decréscimo na curva de

crescimento levemente maior do que aquele obtido pela soja crua, embora não tenha sido

significativo. Ao passo que os animais que consumiram a dieta PmLG mostraram curva de

crescimento tendendo a um menor decréscimo do que a encontrada para aqueles que consumiram

a dieta (PmCr), estando em um patamar um pouco superior à curva de crescimento dos ratos que

fizeram uso da dieta aproteica, ou seja perderam menos peso do que o grupo da dieta AP.

Portanto, o processo de extração de α-galactosídios parece ser mais eficiente do que os

processamentos térmicos realizados nas sementes de P. moniliformis, posto que a curva de

crescimento para os mesmos foi igual a do grupo aproteico. No entanto, o crescimento dos ratos

só foi observado para aqueles que consumiram a dieta padrão (SJF), os quais apresentaram curva

ascendente. A expectativa de uma grande melhora no crescimento dos animais com dietas

elaboradas após a extração dos agentes causadores de flatos não foi alcançada, já que foi

observada apenas uma pequena diferença para a curva decrescente de crescimento desses

animais.

5.7.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar

A variação de peso, dieta ingerida e a eficiência alimentar das dietas controle (SJF, AP) e

experimentais (SJCr, SJAG, PmCr e PmLG), podem ser observados na TABELA 13.

Os ratos alimentados com dieta à base de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG)

apresentaram perda de peso inferior (-6,74 ± 1,44 g), embora não estatisticamente diferente (p >

0,05), dos animais alimentados com dieta à base de soja crua (SJCr) (-9,46 ±1,33 g), mostrando

que a adição desses compostos antinutricionais não foram capazes de aumentar a perda de peso

dos animais. Resultado semelhante em relação a não alteração de peso, foi encontrado por

Zdunczyk et al. (1998) em um estudo realizado em ratos alimentados com uma dieta contendo

caseína como fonte de proteínas, adicionada de elevada quantidade de α-galactosídios, onde

também não houve diferença estatística no ganho de peso dos animais comparadas com a mesma

dieta isenta de α-galactosídios.

145

TABELA 13 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiênica alimentar* de ratos (n = 6)

submetidos a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr), farinha de P.

moniliformis crua livre de α-galactosídios (PmLG), farinha de soja crua adicionada de α-

galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de

ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura

(SJF) e dieta isenta de proteína (AP).


diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way

ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

* Os valores estão expressos em g/rato.

# Eficiência alimentar = Variação de peso (g)/dieta ingerida (g)

Dietas Variação de Peso (g) Dieta Ingerida (g) Eficiência Alimentar#

SJF 13,82 ± 6,17a 104,78 ± 15,77a 0,11 ± 0,05a

SJCr -9,46 ±1,33b 78,80 ± 7,43b -0,13 ± 0,02bc

SJAG -6,74 ± 1,44b 72,08 ± 4,98bd -0,09 ± 0,02c

PmCr -17,87 ± 4,28cd 51,05 ± 3,10c -0,35 ± 0,09d

PmLG -12,08 ± 2,90bc 61,12 ± 5,46cd -0,21 ± 0,06b

AP -22,50 ± 1,81d 68,30 ± 6,10d -0,33 ± 0,02d

146

Por outro lado, foi observado um decréscimo, não estatisticamente diferente, na perda de

peso dos ratos alimentados com dieta à base de farinha de P. moniliformis livre de α-

galactosídios (PmLG), (-12,08 ± 2,90 g) comparados àqueles que consumiram a dieta contendo

farinha de P. moniliformis íntegra (PmCr) (-17,87 ± 4,28 g). A perda de peso dos ratos

alimentados com as dietas teste não foi superior à apresentada pelo grupo que consumiu dieta

aproteica (AP). Dietas à base de tremoço contendo alto teor de α-galactosídios comparada com a

mesma dieta pobre em α-galactosídios não apresentaram diferença significante no ganho de peso.

No entanto uma leve diminuição no ganho de peso foi verificado com a adição desses compostos

(ZDUNCZYK et al., 1998).

Em relação à ingestão dietética, os ratos que se alimentaram da dieta SJAG (72,08 ± 4,98

g) não diferiram significativamente daqueles que consumiram SJCr (78,80 ± 7,43 g), apesar da

quantidade ingerida de dieta SJAG ter sido um pouco menor em relação à outra dieta. A mesma

tendência foi observada para as dietas PmLG e PmCr, onde o consumo foi de 61,12 ± 5,46 g e de

51,05 ± 3,10 g, respectivamente, sendo estatisticamente iguais.

A retirada de α-galactosídios da farinha de P. moniliformis teve uma leve tendência de

melhora do consumo dessas dietas por parte dos ratos, mas não foi o fator mais limitante, tendo

em vista que o aumento real de consumo não foi observado. A adição de α-galactosídios a dietas

à base de tremoço também não foi capaz de interferir no consumo da dieta por parte dos animais,

ao contrário, o consumo foi significativamente superior ao do grupo de animais que consumiram

a mesma dieta com baixo teor de α-galactosídios (ZDUNCZYK et al., 1998).

Mesmo com o aumento de consumo dietético por parte dos animais alimentados com

dieta PmLG não ter ocorrido de forma significante e a perda de peso continuar evidente, foi

constatada uma melhora no índice de eficiência alimentar (-0,21 ± 0,06) em relação àquele

verificado para animais de ingeriram a dieta PmCr (-0,35 ± 0,09), posto que houve diferença

significante. O que não significa que o aproveitamento da dieta ingerida aconteceu, já que os

valores da eficiência alimentar continuaram negativos.

Não houve diferença estatística para o índice de eficiência alimentar em relação aos

animais que consumiram dietas SJCr (-0,13 ± 0,02) e SJAG (-0,09 ± 0,02), tendo sido sutilmente

melhor para este último grupo.

147

5.7.3 Balanço Nitrogenado

A TABELA 14 apresenta os resultados referentes às quantidades de dieta ingerida,

nitrogênio ingerido e nitrogênio fecal referentes aos últimos cinco dias de experimento.

A maior ingestão dietética e, consequentemente, de nitrogênio ingerido foi apresentada

pelos ratos que utilizaram a dieta padrão SJF (55,48 ± 8,59 g, 0,85 ± 0,16 g, respectivamente).

Não houve diferença significante entre o consumo de dieta e de nitrogênio nos demais grupos,

(SJCr vs. SJAG, nem PmCr vs. PmLG). No entanto, a excreção de nitrogênio fecal foi

significativamente maior para os animais que consumiram a dieta PmLG (0,16 ± 0,0 3g) do que

para aqueles que fizeram uso da PmCr (0,10 ± 0,02 g). A excreção de nitrogênio fecal dos ratos

alimentados com PmLG, bem como para todas as outras dietas, não diferiram estatisticamente (p

< 0,05) daqueles alimentados com a dieta padrão SJF.

O índice que relaciona a excreção de nitrogênio fecal com o nitrogênio ingerido, mostra

que o grupo da dieta PmCr (23,85 ± 2,96) diferiu estatisticamente do grupo que fez uso da dieta

PmLG (30,76 ± 3,08), significando que, aparentemente, menos nitrogênio ficou retido neste

último grupo, pois ambos os grupos ingeriram a mesma quantidade de nitrogênio, mas o grupo da

dieta PmLG excretou mais nitrogênio. O processo utilizado para a extração de α-galactosídios,

parece não ter interferido no índice (FN/N x 100) em relação aos processamentos térmicos

realizado nas sementes de P. moniliformis como fervura e (38,0 ± 5,61) cozimento em micro-

ondas (38,31 ± 6,41), mostrados na TABELA 9.

O grupo da dieta SJCr (21,33 ± 3,87) apresentou o índice que relaciona o nitrogênio

excretado sobre nitrogênio ingerido melhor, parecendo reter mais nitrogênio, quando comparado

ao grupo da dieta SJAG (26,39 ± 1,54).

Dados mais conclusivos podem ser verificados com a análise dos parâmetros nutricionais,

tais como digestibilidade, utilização líquida de proteína (NPU) e valor biológico (TABELA 15).

Para todos os parâmetros avaliados, os animais que se alimentaram com dieta padrão SJF

continuaram com melhor desempenho, apresentando maior percentual de digestibilidade (90,95 ±

0,95 %), de retenção (NPU de 44,35 ± 8,19 %) e aproveitamento das proteínas (VB de 0,49 ±

0,09).

148

TABELA 14 – Balanço de nitrogênio* dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo

farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-

galactosídios (PmLG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com

farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta

contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína

(AP).

Dietas Dieta

Ingerida (D)

Nitrogênio

Ingerido (N)

Nitrogênio

Fecal (FN)

FN/N

x 100

SJF 55,48 ± 8,59ª 0,85 ± 0,16ª 0,12 ± 0,02ab 14,69 ± 1,44ª

SJCr 34,35 ± 5,24b 0,55 ± 0,08b 0,11 ± 0,04ac 21,33 ± 3,87b

SJAG 34,87 ± 3,05b 0,56 ± 0,05b 0,15 ± 0,02bc 26,39 ± 1,54cd

PmCr 26,62 ± 1,22b 0,43 ± 0,02b 0,10 ± 0,02a 23,85 ± 2,96bd

PmLG 31,73 ± 3,91b 0,51 ± 0,06b 0,16 ± 0,03b 30,76 ± 3,08c



Teste de Tukey.

* Os valores estão expressos em g/rato e referem-se aos últimos cinco dias de experimento.

149

Isso, resultou em um aumento ponderal de 13,82 ± 6,17 g, comparável ao apresentado

para o grupo de ratos alimentados com dietas a base do genótipo Bays de soja cozida (17,3 ± 1,5

g), na pesquisa de VASCONCELOS et al. (2001).

A digestibilidade do grupo de animais que consumiram a dieta SJAG (82,00 ± 1,70 %) foi

significativamente menor do que a apresentada pelo grupo de ratos das dietas SJCr (88,97 ± 5,73

%), A adição dos oligossacarídeos indigeríveis parece ter prejudicado a digestão das proteínas

presentes na soja. Resultado semelhante foi observado no estudo de Brasil et al. (2010), onde a

digestibilidade de soja delipidada e autoclavada livre de α-galactosídios (91,28 ± 2,07 %) foi

estatisticamente maior do que aquela contendo os α-galactosídios (87,14 ± 2,98 %).

Por outro lado, a digestibilidade apresentada pelo grupo de ratos que consumiram a dieta

PmLG (78,54 ± 3,60 %) foi reduzida em comparação com aquele que utilizaram a dieta PmCr

(87,10 ± 3,30 %).

A digestibilidade observada no grupo de animais que consumiram a dieta à base de

caseína adicionada de α-galactosíeos (90,5%) não diferiu estatisticamente daqueles que usaram a

mesma dieta com baixos teores de α-galactosíeos (94,4%) (ZDUNCZYK et al., 1998), já o grupo

de animais da dieta à base de tremoço com alto teor de α-galactosíeos (85,6 %) apresentou menor

percentual de digestibilidade em comparação ao grupo da dieta contendo tremoço com baixo teor

de α-galactosíeos (88,9 %) (ZDUNCZYK et al., 1998).

Apesar da digestibilidade do grupo de animais da dieta PmLG ter sido reduzida o NPU,

ou seja o percentual de retenção de nitrogênio no organismo foi consideravelmente aumentado

(19,66 ± 5,99 %), em relação ao grupo da dieta PmCr (-20,86 ± 5,15 %), bem como o valor

biológico foi significativamente melhorado, posto que passou de -0,23 ± 0,07 % (PmCr) para

0,29 ± 0,09 % (PmLG), mostrando indícios de que o processo de extração dos α-galactosídios

contribuiu para uma melhora, embora muito pequena, nos parâmetros nutricionais.

A adição de α-galactosídios à dieta à base de soja crua resultou na significativa redução

do percentual de retenção de nitrogênio (NPU) de 39,63 ± 8,92 % para 18,24 ± 6,83 % e do valor

biológico de 0,45 ± 0,13 % para 0,22 ± 0,08 %.

150

TABELA 15 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) submetidos a

dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr), farinha de P. moniliformis crua

livre de α-galactosídios (PmLG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG),

dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a

dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de

proteína (AP).

Dietas Digestibilidade

(%)

NPU

(%)

Valor Biológico

(%)

SJF 90,95 ± 0,95a 44,35 ± 8,19ª 0,49 ± 0,09a

SJCr 88,97 ± 5,73a 39,63 ± 8,92ª 0,45 ± 0,13a

SJAG 82,00 ± 1,70bc 18,24 ± 6,83b 0,22 ± 0,08b

PmCr 87,10 ± 3,30ab -20,86 ± 5,15c -0,23 ± 0,07c

PmLG 78,54 ± 3,60c 19,66 ± 5,99b 0,29 ± 0,09b


diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way

ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

151

Muito embora a melhora ou a piora dos parâmetros nutricionais com a extração ou adição

de α-galactosídios, respectivamente, às dietas não tenham sido refletida em alterações

significativas nos pesos dos ratos entre os grupos alimentados por essas dietas (PmCr vs. PmLG e

SJCr vs. SJCAG), esse resultado pode levar à suposição de que o processo utilizado para a

extração dos α-galactosídios pode ter sido realizado com sucesso, causando uma redução no seu

conteúdo.

Outros parâmetros de avaliação da qualidade da proteína in vivo utilizado nos estudos de

Zdunczyk et al. (1998) e de Brasil et al. (2010) para a avaliação da performance dos animais

alimentados com dietas adicionadas de α-galactosídios foram o PER (razão de eficiência

proteica) e o NPR (razão de eficiência líquida de proteína).

Uma dieta à base de tremoço com teor de α-galactosídios reduzido, comparada a outra

adicionada de elevado teor desses compostos, apresentou modificação significativa no percentual

do PER que passou de 2,40 % para 2,15 %. Já a adição de α-galactosídios à dieta à base de

caseína apresentou um decréscimo não significante de 2,59 % para 2,53 % no PER

(ZDUNCZYK et al., 1998). O inverso foi observado no estudo de Brasil et al. (2010) com a

adição desses oligossacarídeos à dieta à base de soja delipidada e autoclavada, no qual tanto o

PER quanto o NPR passaram de 2,63 ± 0,14 % e 3,56 ± 0,16 na dieta livre de oligossacarídeo,

para 2,71 ± 0,22 % e 3,53 ± 0,22 na dieta adicionada desses compostos, não havendo diferença

estatística para ambos os parâmetros entre os dois grupos.

Segundo Graham e colaboradores (2002), a redução na quantidade de oligossacarídeos

indigeríveis diminui a viscosidade do alimento ingerido prolongando o período de tempo da dieta

no intestino, permitindo melhor ação enzimática sobre o substrato e consequentemente aumento

na absorção de nutrientes pela mucosa intestinal, por isso o percentual de digestibilidade aumenta

em alguns experimentos. O aumento no percentual de digestibilidade com a remoção de α-

galactosídios em P. moniliformis não ocorreu, contudo proporcionou melhora nos outros

parâmetros nutricionais, estando de acordo com a pesquisa de Seve et al. (1989), na qual a

retirada de α-galactosídios da farinha da soja trouxe benefícios, mas pequena influência na

digestibilidade e utilização de nitrogênio na dieta de leitões.

A extração dos α-galactosídios parece ter sido eficiente por ter sido capaz de causar uma

pequena melhora no desempenho dos animais, conforme o ocorrido para as sementes de tremoço

segundo o estudo de Martínez-Villaluenga, Frias e Vidal-Valverde, 2006. Além disso, este

152

processo pode ter retirado, ainda, outros compostos que também poderiam estar prejudicando o

desempenho dos animais. No entanto, para uma análise mais conclusiva seria necessária a

detecção e quantificação dos α-galactosídios antes e depois do processamento em sementes de

farinha de P. Moniliformis, bem como a determinação de outros compostos antinutricionais.

Os antinutrientes mostram não só a redução na utilização de nutrientes, mas também

causam toxicidade se ingeridas em grandes quantidades (SHIM; JUN; KANG, 2003). A análise

macroscópica de órgãos internos e de alguns parâmetros séricos foi realizada para verificar se as

mudanças nos tamanhos dos órgãos eram evitadas com o novo processamento realizado nas

sementes de farinha de P. Moniliformis.

5.7.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos

A TABELA 16 mostra o peso seco relativo dos órgãos tais como timo, coração, pulmões,

baço, estômago, duodeno, jejuno, íleo, intestino grosso, intestino delgado, pâncreas, fígado e rins

dos ratos avaliados após serem sacrificados ao final do décimo dia de experimento.

O processo de extração dos α-galactosídios das sementes de P. Moniliformis e sua adição

à dieta à base de farinha de soja crua, como fonte de proteínas, não ocasionou alteração em

nenhum órgão interno analisado, quando comparado aos animais que se alimentaram com a

mesma dieta na forma íntegra, ou seja, quando PmLG e PmCr, e, SJAG e SJCr, foram

comparadas entre si.

O grupo dos animais que ingeriram dietas à base de soja íntegra ou adicionada de α-

galactosídios teve órgãos internos estatisticamente iguais aos observados para o grupo da dieta

padrão SJF, com exceção dos pulmões, do intestino grosso e dos rins que foram maiores. O

aumento desses órgãos pode estar relacionado à desnutrição verificada para esses dois grupos

experimentais conforme já verificado em outros estudos, onde o aumento dos mesmos também

foi constatado em animais que também não apresentaram bom estado nutricional

(VASCONCELOS et al., 2001; FARIAS, 2009).

153

TABELA 16 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo

farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-ondas

(PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua

(SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP)

Dietas

Órgãos SJF SJCr SJAG

PmCr PmLG AP

Timo 0,23 ± 0,04ª 0,23 ± 0,03ª 0,22 ± 0,03a 0,12 ± 0,03b 0,12 ± 0,03b 0,16 ± 0,02b

Coração 0,30 ± 0,02a 0,31 ± 0,03ª 0,34 ± 0,03ªb 0,38 ± 0,03b 0,37 ± 0,02b 0,39 ± 0,04b

Pulmões 0,42 ± 0,05a 0,55 ± 0,02b 0,60 ± 0,06bc 0,63 ± 0,04bc 0,64 ± 0,08bc 0,69 ± 0,06c

Baço 0,18 ± 0,01ª 0,20 ± 0,02ªb 0,19 ± 0,02ªb 0,22 ± 0,03b 0,22 ± 0,02b 0,20 ± 0,02ªb

Estômago 0,53 ± 0,04a 0,61 ± 0,16a 0,64 ± 0,03a 0,79 ± 0,08b 0,81 ± 0,05b 0,78 ± 0,13b

Duodeno 0,80 ± 0,14a 0,92 ± 0,16ª 0,85 ± 0,21ª 1,05 ± 0,15ª 0,94 ± 0,15ª 0,93 ± 0,19ª

Jejuno 0,79 ± 0,16a 0,87 ± 0,25ª 0,90 ± 0,13ª 0,95 ± 0,13ª 0,89 ± 0,13ª 0,89 ± 0,14ª

Íleo 0,58 ± 0,09ª 0,73 ± 0,17ªb 0,70 ± 0,13ªb 0,81 ± 0,14ªb 0,74 ± 0,12ªb 0,67 ± 0,08ªb

Continua

154

TABELA 16 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo

farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-ondas (PmM)

e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr),

processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Continuação

Dietas

Órgãos SJF SJCr SJAG

PmCr PmLG AP

Intestino Grosso 0,72 ± 0,08a 0,96 ± 0,08bc 0,99 ± 0,12bc 1,04 ± 0,10bc 1,07 ± 0,11b 0,87 ± 0,11ac

Pâncreas 0,31 ± 0,07a 0,44 ± 0,06ab 0,56 ± 0,23ab 0,39 ± 0,14ªb 0,33 ± 0,03a 0,60 ± 0,20b

Fígado 4,28 ± 0,40a 4,33 ± 0,33ª 4,50 ± 0,40ª 5,27 ± 0,29b 5,35 ± 0,34b 4,48 ± 0,31a

Rins 0,79 ± 0,07a 0,98 ± 0,08b 1,01 ± 0,03b 1,29 ± 0,06c 1,30 ± 0,11c 1,03 ± 0,07b

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste

de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

155

Para o grupo dos ratos que se alimentaram das dietas à base de P. Moniliformis íntegra e

livre de α-galactosídios, foi verificado atrofia no timo em relação aos três grupos das dietas base

de soja. Além disso, o aumento nos órgãos como coração, pulmões, baço e estômago, intestino

grosso, fígado e rins em relação ao grupo do controle positivo, sendo esses três últimos com

tamanho maior até do que o grupo que recebeu a dieta isenta de proteína.

O processo de extração dos α-galactosídios, assim como os tratamentos térmicos

realizados em sementes de P. Moniliformis também não impediu a diminuição do tamanho de

timo ou o aumento de determinados órgãos. Esse resultado pode estar associado ao fato de esse

processamento não ter ocasionado melhora significativa no estado nutricional dos ratos que

fizeram uso dessa dieta, posto que a perda de peso não foi impedida.

5.7.5 Análise dos parâmetros séricos dos ratos

A TABELA 17 apresenta o resultado dos parâmetros séricos analisados [Proteínas totais,

albuminas, Uréia, fosfatase alcalina, aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase

(ALT) e creatinina].

Não foi observada diferença estatística no teor de proteínas totais entre o grupo da dieta

padrão positiva (SJF) e o da dieta dos grupos testados (SJAG, PmLG).

Teores significativamente maiores de proteínas totais e de albuminas foram encontrados

para o grupo da dieta SJAG com 5,07 ± 1,35 g/dL e 3,67 ± 0,44 g/dL em relação a SJCr com

3,78 ± 0,19 g/dL e 3,09 ± 0,15 g/dL, respectivamente. Indicando que a adição de α-galactosídios

não foi capaz de causar alterações nos níveis séricos de proteínas relacionadas ao metabolismo.

Níveis estatisticamente iguais para os parâmetros proteínas totais, albuminas e ureia foram

verificados para o grupo de ratos alimentados com as dietas PmCr e PmLG, sugerindo que o

estado nutricional desses grupos são parecidos.

A ureia encontrou-se aumentada de forma significativa para o grupo da dieta SJAG (51,23

± 21,56 mg/dL) em relação ao grupo da dieta SJCr (41,92 ± 5,72 mg/dL). O aumento dos rins,

embora não de forma significativa, foi verificado para o grupo da dieta SJAG em relação ao

grupo da dieta à base de soja crua.

156

TABELA 17 – Parâmetros séricos de ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua (PmCr) e

processadas termicamente por fervura (PmF), cozimento em micro-ondas (PmM) e autoclavagem (PmA), comparadas com o crescimento

de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de

proteína (AP)

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente (p > 0,05), para o teste de Variância

Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * AST: Aspartato aminotransferase. ** ALT: Alanina aminotransferase


DIETAS Proteínas

totais

(g/dL)

Albumina

(g/dL)

Ureia

(mg/dL)

Fosfatase

Alcalina

(U/L)

AST*

(U/mL)

ALT **

(U/mL)

Creatinina

(mg/dL)

SJF 4,40 ± 0,25ªb 3,02 ± 0,16ª 30,33 ± 6,22ab 181,97 ± 39,54a 13,73 ± 0,88a 14,99 ± 0,58a 0,63 ± 0,08a

SJCr 3,78 ± 0,19b 3,09 ± 0,15ac 41,92 ± 5,72bc 171,37 ± 14,69a 9,25 ± 0,80b 10,69 ± 1,98a 0,52 ± 0,05a

SJAG 5,07 ± 1,35a 3,67 ± 0,44b 51,23 ± 21,56d 117,33 ± 70,71a 13,74 ± 1,67ª

13,58 ± 2,02a 2,50 ± 1,29b

PmCr 4,34 ± 0,18ab 3,65 ± 0,52bc 37,93 ± 6,53abc 136,00 ± 42,63a 13,83 ± 1,10a 14,92 ± 5,25a 3,23 ± 0,68b

PmLG 4,97 ± 0,46a 3,83 ± 0,42b 41,50 ± 14,11cd 110,93 ± 61,87a 14,11 ± 1,40ª 14,41 ± 1,98a 3,54 ± 1,19b

AP 4,37 ± 0,43ab 3,26 ± 0,22abc 27,39 ± 6,16a 144,00 ± 42,31a 13,83 ± 1,10a 13,48 ± 3,18a 3,27 ± 1,52b

157

Em relação à creatinina, os teores obtidos para os grupos da dieta SJF mostraram-se

inferiores de forma significativa em relação aos demais, com exceção para o grupo da dieta

SJCr (0,52 ± 0,05 mg/dL), sendo esta última estatisticamente diferente da SJAG (2,50 ± 1,29

mg/dL), que apresentou maior teor de creatinina. O grupo da dieta contendo P. moniliformis

livre de α-galctosídeos não diferiu, para esse parâmetro, do grupo da mesma dieta contendo

esses oligosacarídeos.

A dosagem sanguínea de enzimas fosfatase alcalina, AST e ALT, realizada para

avaliar nível toxicidade hepática por parte das dietas experimentais, mostrou que,

provavelmente, não houve dano ao fígado, posto que os níveis verificados não foram

aumentados (não houve diferença estatística) entre nenhum dos grupos testes avaliados (SJCr

vs. SJAG e PmCr vs. PmLG) em comparação ao controle positivo (SLF).

A perda de peso elevada, por parte dos animais dos grupos experimentais que se

alimentaram de dietas à base de farinha de P. moniliformis cruas ou processadas por

tratamento térmico (fervura, cozimento em micro-ondas e por autoclavagem) e por extração

de α-galactosídios, pode estar associado a um conjunto de fatores e não a um fator isolado

como foi pensado em relação aos α-galactosídios. Foi observado que o processamento para a

sua retirada melhorou a retenção de nitrogênio por parte dos animais, mas não foi possível

uma redução na perda de peso, muito menos aumento ponderal.

Assim sendo, a presença de compostos fenólicos detectada, os quais prejudicam a

digestão e absorção das proteínas (GILANI; COCKELL; SEPEHR, 2005), bem como de

outros compostos antinutricionais conhecidos, que não foram avaliados, como o ácido fítico,

grupos cianogênicos e de L-DOPA (3,4-dihidroxi L-fenilalanina), podem ter contribuído para

a performance insatisfatória desses grupos de animais, já que são relativamente resistentes ao

calor. O ácido fitico pode interferir na biodisponibilidade de minerais bivalentes, amido,

proteínas e enzimas, devido sua capacidade de formar complexos com esses compostos,

alterando a digestibilidade e absorção desses nutrientes (ÉSTEVEZ; CASTILLO-

FIGUEROLA; ÝANEZ, 1991; PALLAUF; RIMBACH, 1997; PROLL et al., 1998; VIDAL-

VALVERDE et al., 1994), ou provocar efeitos adversos como flatulência (ZHOU;

ERDMAN, 1995).

Para combater o ácido fítico, polifenóis e os inibidores de tripsina, Sindhu e

Khetarpaul (2001) e Beal e Mehta (1985), sugerem além do aquecimento, a utilização da

fermentação ou da germinação de leguminosas , uma vez que tais compostos apresentam certa

estabilidade ao calor e para ressaltar o valor nutritivo dos grãos.

158

Outro importante ponto a ser questionado é a baixa aceitação das dietas teste, em

comparação com a ingestão de dieta padrão (SJF), que pode ter sido prejudicada pela presença

de compostos responsáveis pelo forte odor apresentado pela farinha de P. moniliformis, já que

o aumento significativo do consumo da dieta não foi verificado com o processo de extração de

α-galactosídios.

Remover os componentes indesejáveis é essencial para melhorar a qualidade das

leguminosas no intuito de ser efetivamente usado para a alimentação animal e humana. Por

isso, muitos estudos como este têm sido realizados por vários pesquisadores na tentativa de

reduzir os fatores antinutricionais das leguminosas. A modificação de seus tipos e quantidades

via manipulação genética podem ter consequências catastróficas, segundo Khattab e Arntfield

(2009), visto que os mesmos desempenham importantes papéis na defesa das plantas

(OBENDORF, 1997; SCALBERT, 1991; WANG et al., 2003). Então, de acordo com Khattab

e Arntfield (2009), a melhor maneira de tentar solucionar esse problema é a utilização de

métodos simples e mais econômicos, como os utilizados neste trabalho (hidratação, fervura,

cozimento em micro-ondas e autoclavagem) ou outros como a retirada das cascas, maceração,

fermentação (ZAMORA; VEUM, 1979; REDDY; SALUNKHE; SHARMA, 1980),

germinação (NNANNA; PHILIPS, 1990; AL-KAISEY; AL-HADITHI; ALWAN , 1996; AL-

KAISEY; AL-HADITHI; SAHEAD, 1997), irradiação gama (RAO; VAKIL, 1983; ABU-

TARBOUSH, 1998) ou, ainda, a associação de alguns deles para melhorar a qualidade de

grãos de leguminosas. A irradiação de alimentos tem sido reconhecida como um método

confiável e seguro para preservação, melhora da qualidade higiênica e do valor nutricional

dos alimentos (DIEHL, 2002; GAMPBELL et al.,1983; AL-KAISEY et al., 2002). Podendo

ser um método de escolha na tentativa de aumentar a utilização de leguminosas selvagens

como a P. moniliformis.

O isolamento de frações proteicas também se apresenta como uma alternativa

promissora para a melhoria de qualidade nutricional das proteínas de sementes de

leguminosas quando comparadas à farinha integral crua, conforme verificado em vários

estudos, incluindo o realizado com sucesso por Farias (2009), onde após o isolamento de

frações protéicas da farinha das sementes de Amburana cearensis, foi evidente a melhora no

desenpenho e crescimento dos ratos alimentados com essa fração quando comparados com a

dieta à base de frarinha das mesmas sementes na forma íntegra, a qual causava não só perda

de peso, mas morte dos animais.

A boa composição nutricional das sementes de P. moniliformis, conforme

demonstrada pela determinação de macro e micronutrientes e pelo índice de qualidade

159

nutricional, o qual a apontou como a semente com melhor perfil nutricional dentre as

avaliadas, mostra o quão promissora é essa semente. Por tudo o que foi exposto, é de grande

importância uma melhor investigação no intuito de descobrir que componentes são os reais

responsáveis pelo não aproveitamento de seus nutrientes pelos animais, incluindo a busca por

métodos de processamento capazes de aumentar a biodisponibilidade de seus nutrientes e

assim, futuramente, ela poderá fazer parte da alimentação humana e/ou animal.

Esse trabalho chama a atenção para a relevância de estudos in vivo com animais, além

da determinação de sua composição in vitro na busca de novas fontes de leguminosas antes de

serem liberadas para a alimentação humana. Contribui para agregação de valor às espécies

analisadas e, talvez, possa aumentar a conscientização da população sobre a necessidade de

preservação da biodiversidade vegetal da Caatinga para o Brasil, devido aos diversos

benefícios que podem ser propiciados.

160

6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO

As sementes das espécies vegetais da Caatinga cearense apresentam um elevado

potencial nutricional, como elevado teor de proteínas, apresentando bom perfil de

aminoácidos essenciais e de minerais, são importantes fontes de fibras e energia, além de

conterem baixos compostos tóxicos e/ou antinutricionais, com perfis comparáveis ou mesmo

superiores ao de outras leguminosas selvagens, bem como ao de leguminosas mundialmente

consumidas.

O índice de qualidade nutricional (IQN) destacou as espécies P. moniliformis Benth.,

P. platycephala Benth e E. velutina Willd como as três espécies contendo maior número de

características desejáveis do ponto de vista nutricional, sendo a detentora do maior IQN a

espécie P. moniliformis Benth., a mais promissora fonte de nutrientes para a alimentação

humana e animal.

Os experimentos nutricionais realizados para avaliar a qualidade das proteínas das

sementes de P. moniliformis Benth. cruas e submetidas a diferentes processamentos

(tratamentos térmicos por fervura, cozimento em micro-ondas, autoclavagem, e extração de

α-galactosídios) não foram capazes de proporcionar um bom desempenho dos animais,

apenas melhores percentuais de parâmetros nutricionais foram verificados para o processo de

extração de α-galactosídios. Outros processamentos devem ser testados para um melhor

aproveitamento dos nutrientes existentes em P. moniliformis Benth.

161

Prospecção Bioativa em Sementes de

dez Leguminoas da Caatinga

Cearense

162

1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA

As doenças em plantas sempre foram e continuam sendo motivos de grandes

preocupações, já que perdas sempre ocorreram e esse quadro vem se agravando, uma vez que

os prejuízos na produção mundial são de um terço por ano devido ao ataque de fitopatógenos

(BAJWA; KHALID; CHEEMA, 2003; CHAPAGAIN; WIESMAN; LAHKIM, 2007).

Mundialmente os insetos causam perdas de 15% da produção agrícola total, gerando

gastos de mais de 100 bilhões de dólares. Os fungos, sozinhos, são responsáveis por 70% das

principais doenças das plantas e mais de 100 espécies de fungos causam doenças pós-colheita,

o que leva a uma perda agrícola de mais de 20% em diversas culturas (AGRIOS, 2000;

LAWRENCE; KOUNDAL, 2002; LEE et al., 2003; TRIPTHI; DUBEY, 2004). Por essas

razões, muitas entidades consideram que os agroquímicos são insumos importantes e

imprescindíveis para a produção mundial de alimentos, levando à constante liberação desses

produtos no meio ambiente. Foi estimado um aumento em torno de 1.900% em cinqüenta

anos (KARUNGI et al., 2000). Contudo, essas substâncias químicas estão associadas a uma

série de desvantagens, entre as quais a falta de especificidade, o aumento da incidência de

resistência sobre aplicações prolongadas e os riscos ambientais inerentes à toxicidade residual

que levam ao desequilíbrio ecológico, causando grande impacto ambiental. Dada essas

limitações, a busca por controles alternativos é de extrema relevância, destacando-se a

descoberta de novos compostos seguros e renováveis, de ocorrência natural e fácil obtenção

(LIU et al., 2001; MENDIETA; GIUDICI; LA CANAL, 2004; WANG et al., 2005 a,b;

BALE; VAN LENTEREN; BIGLER, 2008; DAYAN; CANTRELL; DUKE, 2009).

Não só as plantas sofrem com os micro-organismos patogênicos, pois nas últimas

décadas, a incidência de infecção fúngica em humanos, especialmente em pacientes

imunodeprimidos, tem crescido rapidamente devido ao aumento de sobrevida desses

pacientes ocasionados pelos avanços na medicina. Em contraposição, esses mesmos pacientes

sofrem sérias conseqüências quando infectados por fungos, justamente por existir poucos ou,

às vezes, nenhum tratamento eficiente para os mesmos. Aliado a isso, o aparecimento de

fungos patogênicos resistentes às terapias atuais, a escassez de compostos antifúngicos e a

toxicidade das drogas atualmente disponíveis incentivam o uso de compostos antifúngicos

naturais e seus derivados sintéticos com potencial promissor para o uso clínico

(SELITRENNIKOFF, 2001).

163

Outro micro-organismo causador de grandes infecções em humanos, principlamente,

infecções hospitalares e comunitárias são as bactérias, sendo responsáveis pela morte de mais

de 14 milhões de pessoas, representando uma média de 26 % da mortalidade global. Isso se

deve ao surgimento de micro-organismos resistentes aos antibióticos, decorrente, sobretudo,

do uso indiscriminado dos quimioterápicos antimicrobianos, restringindo a utilização dos

mesmos e, ao mesmo tempo, mostrando a importância da busca de novos compostos bioativos

no arsenal terapêutico com efeito antimicrobiano (LEVY, 2005; BECKER et al., 2006;

SILVEIRA et al., 2007).

Os insetos que se alimentam de sangue também prejudicam a saúde humana por serem

vetores de doenças graves e de difícil controle como é o caso da dengue, dengue hemorrágica,

febre amarela, encefalite japonesa e malária. A prevalência dessas e de outras doenças estão

aumentando nas zonas tropicais e subtropicais (SUTTHANONT et al., 2010) e o mosquito

Aedes aegypti, principal vetor da dengue, é responsável pela infecção de cerca de cinqüenta

milhões de pessoas por ano, tendo levado à morte inúmeros indivíduos (WHO, 2009;

JANSEN e BEEBE, 2010). O principal controle da dengue é seu vetor, o qual tem sido

combatido com inseticidas sintéticos, que ainda são necessários, especialmente em situações

de surto epidêmico e súbito aumento de mosquitos adultos. O uso desses produtos causa

impacto econômico na saúde pública mundial (YAICHAROEN et al., 2005; NATHAN;

KALAIVANI; SEHOON, 2006). No intuito de minimizar os danos causados ao homem e ao

ambiente pela excessiva utilização de agroquímicos, bem como de fungicidas e inseticidas

sintéticos, os bioprodutos vegetais tornam-se bem atraentes principalmente por serem, em

geral, mais biodegradáveis (SHAALAN et al., 2005), mas também por serem eficientes no

combate aos insetos e micro-organismos nocivos e praticamente atóxicos (FERNANDES,

2000).

Os vegetais produzem muitas substâncias a partir de seu metabolismo primário e

secundário para se defenderem do ataque de patógenos. Nesse sentido, muitas plantas de

biomas brasileiros têm sido usadas como medicamentos naturais pela população local para o

tratamento de muitas doenças, incluindo micoses. Muitas delas foram estudadas apresentando

comprovadas propriedades antimicrobianas, importantes no combate a fungos e bactérias

(SOUZA et al., 2002; DUARTE et al., 2005; BERTINI et al., 2005; CRUZ et al., 2007;

BOTELHO et al., 2007).

Considerando o fato de que apenas 8% das espécies vegetais brasileiras foram estudas

em busca de moléculas bioativas (AMORIM et al., 2003), a Caatinga ser um bioma com

extrema diversidade de plantas medicinais, ainda pouco exploradas (ALMEIDA et al., 2006),

164

e que há grande necessidade de descoberta de compostos naturais que auxiliem no combate

aos patógenos humanos e de plantas, surgiu a seguinte hipótese:

A Caatinga possui espécies vegetais repositórias de compostos bioativos frutos do

metabolismo primário e secundário das plantas capazes de atuarem frente a micro-

organismos patogênicos para o homem e/ou para plantas.

165

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

• Avaliar o potencial bioativo das sementes de dez espécies de plantas da caatinga,

identificar as espécies mais promissoras para estudos futuros e investigar a atividade

dos compostos bioativos de uma das espécies promissoras frente a modelos

biológicos de importância clínica e fitopatológica.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar a presença de alguns metabólitos secundários biologicamente ativos no

extrato bruto das dez sementes vegetais da caatinga;

• Investigar a presença de algumas proteínas bioativas (lectina, inibidor de tripsina,

urease, quitinase, β-1,3-glucanase e protease) no extrato bruto das sementes das dez

plantas da caatinga;

• Determinar a atividade tóxica do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da

caatinga para ratos e larvas de Aedes aegypti no 3 º estádio de desenvolvimento;

• Avaliar a presença de atividade antimicrobiana do extrato bruto de espécies vegetais

da caatinga;

• Apontar espécies vegetais com bom perfil de compostos bioativos promissoras para

estudos futuros;

• Selecionar, dentre as espécies promissoras, uma espécie contendo compostos

bioativos que apresente diversas funções e aplicações biotecnológicas e/ou

industriais;

• Isolar total ou parcialmente o composto bioativo da espécie selecionada e determinar

sua atividade contra leveduras, fungos filamentosos, bactérias e contra Aedes aegypti,

inseto vetor da dengue.

166

3. MATERIAIS

3.1 Sementes

3.1.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A coleta das sementes das espécies vegetais foi realizada na Caatinga, na Floresta

Nacional do Araripe e na zona costeira no estado do Ceará, no nordeste do Brasil. As

sementes selvagens (100 - 1000 g) foram coletadas durante o período seco (janeiro de 2005 a

março de 2007), com a ajuda de nativos. Apenas uma colheita foi realizada devido às

dificuldades pertinentes à região do semiárido que sofre secas severas e às limitações

estabelecidas por agências de proteção ambiental brasileira. As plantas foram identificadas e

os espécimes foram depositados no Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do

Ceará (UFC).

3.1.2 Sementes de Piptadenia moniliformis Benth.

O primeiro lote das sementes de P. moniliformis foi obtido de vagens maduras,

coletadas em uma área de caatinga arbórea, mais precisamente, na fazenda “Não me Deixes”,

no município de Quixadá, no sertão central do estado do Ceará. Um ramo terminal com folhas

e frutos foi coletado, prensado e desidratado para posterior identificação e incorporação ao

acervo do Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do Ceará (UFC), sob a

identificação EAC 35974 O segundo lote de sementes foi originado dos depósitos de

armazenamento do banco de sementes do Ibama, da floresta do Araripe (Crato, CE).

167

3.2 Eritrócitos

Eritrócitos utilizados nos ensaios de aglutinação foram obtidos de amostras de sangue

de coelho albino adulto (linhagem Nova Zelândia), mantido no Biotério de Manutenção do

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC.

3.3 Micro-organismos

As bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus aureus

ATCC 25923, e as Gram-negativas Enterobacter aerogens ATCC 13048, Klebsiella

pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 e Salmonella choleraesuis

ATCC 10708, assim como, as cepas dos fungos fitopatogênicos Aspergillus niger,

Colletotrichum musae, C. truncatum, Fusarium oxysporum, F. solani, Mucor sp., Neurospora

sp., Penicillium herguei, Pithium oligandrum, Phomopsis sp. Rhizoctonia solani foram

cedidas pelo Laboratório de Ecologia Microbiana e Biotecnologia (LEMBIOTECH), do

Departamento de Biologia da UFC. As leveduras Candida albicans, C. tropicalis, Pichia

anômala e Saccharomyces cerevisiae foram obtidas de isolados clínicos, identificadas e

mantidas pelo referido laboratório.

3.4 Animais de Laboratório e Alojamento

Um coelho da raça Nova Zelândia com três meses de idade foi adquirido junto ao setor

de cunicultura do Departamento de Zootecnia da UFC. O coelho foi mantido no Biotério de

Manutenção do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC com água e ração

apropriadas fornecidas ad libitum. Os camundongos machos convencionais da linhagem

Swiss foram adquiridos do Biotério Central da UFC (Biocen-UFC) com 3 semanas de idade.

Os animais foram alojados no Biotério Experimental do Laboratório de Bioprospecção de

Recursos Regionais (Bioprospec), do Departamento de Biologia da UFC, com temperatura

(23,0 ± 2,0 ºC) e fotoperíodo (12 h claro/12 h escuro) controlados. Os camundongos foram

168

mantidos em número adequado em caixas de polipropileno com substrato de raspa de pinho,

água e ração (Biobase, Águas Frias, Santa Catarina, Brasil) ad libitum até atingirem cerca de

60 g e 20 g, respectivamente.

Os protocolos com animais, adotados neste trabalho, foram submetidos à aprovação pelo

Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC, que adota os preceitos do Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

3.5 Insetos e Alojamento

Ovos e larvas em 3º estádio de Aedes aegypti foram obtidos de uma colônia de

mosquitos mantida no NUVET/SESA (Núcleo de Controle de Endemias Transmissíveis por

Vetores da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará). Os insetos (ovos e larvas) foram

mantidos no insetário do Bioprospec com umidade 40 - 50%, temperatura 27 – 30 ºC e

fotoperíodo 12 h claro/12 h escuro, e alimentados, diariamente, com ração para tartaruga

(Reptolife, Alcon, Camboriú, Brasil). Os insetos remanescentes dos experimentos e o

excedente foram sacrificados por fervura em água por 15 min.

3.6 Reagentes Químicos e Outros Materiais

3.6.1. Proteínas

Albumina sérica bovina (BSA), inibidor de proteína da soja (SBTI), marcadores de

massa molecular e proteases foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EEUU) e da

AMRESCO Inc. (Ohio, EEUU).

169

3.6.2. Substratos Enzimáticos

Os substratos sintéticos BApNA (Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida), substrato

proteico Azocaseína, Glucuronidase (ECP 3.2.1.31) e Lamnarina foram adquiridos da Sigma-

Aldrich Co. (St. Louis, EEUU).

3.6.3 Meios de Cultura

Agar batata, agar Mueller-Hinton, agar nutritivo, agar sabouraud, caldo nutritivo,

caldo TGE (Triptona, Glucose e Extrato de levedura) e caldo BHI (“Brain-Heart Infusion”)

foram obtidos da Difco, Becton, Dickinson and Company (Sparks, EEUU).

3.6.4 Reagentes para Eletroforese

Acrilamida, Coomassie Brilliant Blue R-250, Dodecil Sulfato de Sódio (SDS),

TEMED (N ,́ N’, N', N'- tetrametiletilenodiamina), trizma-base, metilenobisacrilamida, β-

mercaptoetanol, nitrato de prata e demais reagentes foram comprados das empresas

Amersham Biosciences (Piscataway, EEUU), Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EEUU), Acros

Organics (Geel, Bélgica) e AMRESCO Inc. (Ohio, EEUU).

3.6.5 Outros Materiais

Quitina coloidal, p-dimetilaminobenzaldeido (DMAB), quitina, membrana de diálise

com “cut off” de 12.000 e ditiotreitol (DTT), foram obtidos da Sigma-Aldrich Co., St Louis,

USA.

As matrizes cromatográficas de DEAE-Celulose e CM-Sepharose foram obtidas da

GE HeathCare, Uppsala, Suécia. Affi-gel-Blue-gel da BioRads, Hercules, California, EEUU.

Os demais reagentes foram de grau analítico e provenientes de diferentes

fornecedores.

170

4. MÉTODOS

4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

As sementes foram retiradas de suas vagens e moídas em moinho rotatório para grãos

de café (Cadence, Caxias do Sul, Brasil). Em seguida, as farinhas foram peneiradas em malha

de 1,0 mm2 a fim de deixá-las bem finas e colocadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB,

São Paulo, Brasil) a 45 ºC por 72 horas para obtenção de um material mais homogêneo e livre

de umidade. As farinhas foram acondicionadas em recipientes de plásticos hermeticamente

fechados, em câmera fria a 4°C, até a realização das análises.

4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais

As farinhas das sementes foram postas em contato com o tampão fosfato de sódio

0,05 M, pH 7,0 ou com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 ou em água destilada na

proporção de 1:10 (m/v) e deixada sob agitação contínua por 4 h, a 4 °C. Em seguida, a

suspensão foi filtrada em pano de trama fina. O resíduo obtido foi descartado. O filtrado foi

centrifugado a 13.000 x g, 30 minutos, 4 °C; o precipitado foi descartado e o sobrenadante

obtido foi filtrado em papel de filtro e denominado de Extrato Bruto. A extração de proteínas

feita com o tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,0, foi utilizada para a determinação das

atividades de: toxicidade aguda para camundongos, lectinas, proteases, antibacterianas e

antifúngicas. Para a determinação do extrato sólido solúvel e de atividade larvicida (Aedes

aegipty) foi realizada a extração de proteínas com água destilada e para a determinação da

atividade quitinásica, β-1,3 – glucanásicas e purificação das proteínas com atividade

quitinásica bem como todos os ensaios utilizados com a fração purificada, foram realizados

com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2.

171

4.3 Dosagem de Proteínas

Os teores de proteínas dos extratos brutos e das frações proteicas obtidas foram

determinados segundo a metodologia descrita por Bradford (1976). Brevemente, para cada

100 µl de amostra, em diferentes concentrações, foram adicionadas 2,5 ml do regente de

Bradford. A mistura foi agitada por alguns segundos e após 10 minutos sobre a bancada e à

temperatura ambiente, procedeu-se a leitura das absorbâncias a 595 nm, em espectrômetro

tipo Genesys 10, Spectronic Unicam, New York, EEUU. A concentração de proteínas foi

estimada utilizando-se o fator de calibração obtido através de uma curva padrão constituída

com concentrações conhecidas de albumina sérica bovina (BSA). A absorbância a 280 nm foi

usada para estimar o conteúdo de proteínas nos eluatos das matrizes cromatográficas.

4.4 Detecção de Metabólitos Secundários

O estudo fitoquímico de determinação qualitativa de metabólitos secundários foi

realizado utilizando os protocolos descritos por Matos (1997). Inicialmente, foi realizada uma

extração alcóolica da farinha integral seca das sementes das 10 espécies na proporção de 1:3

(p/v), por 72 h, com duas trocas consecutivas de álcool etílico 95 %. Entre as trocas, os

sobrenadantes foram armazenados em frascos âmbar e, posteriormente, concentrados por

rotaevaporação. Esse procedimento foi repetido três vezes. O concentrado obtido foi

armazenado a - 20 ºC, sendo descongelados e ressuspendidos em volume mínimo de álcool

para a realização das análises de detecção de várias classes de metabólitos. A análise foi feita

através da adição de reagentes específicos e observação de mudança de cor, aparecimento de

precipitado ou formação de espuma, os quais eram indicativos de presença de diferentes tipos

de metabólitos. Os metabólitos secundários analisados foram: taninos; fenóis; alcaloides;

saponinas; antocianinas e antocianidinas; flavonas, flavonois e xantonas; chalconas e auronas;

flavonoides; leucoantocianidinas; triterpenoides; catequinas; esteroides e flavononas.

172

4.5 Detecção e Dosagem de proteínas Bioativas

4.5.1 Lectinas

A presença de lectinas nas 10 sementes foi avaliada através de ensaios de atividade

hemaglutinante de seus Extratos Brutos (EBs), seguindo a metodologia descrita por Moreira e

Perrone (1977), adaptada para o uso de tubos de ensaio. Os Extratos brutos foram diluídos

seriadamente com NaCl 0,9% (1:2; 1:4; 1:8; 1:16 etc) e cada diluição foi misturada (1:1) com

uma suspensão a 2% de eritrócitos de coelho nativos e tratados previamente com um “pool”

de proteases de Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU). O tratamento com

proteases foi feito através da mistura da solução de proteases (1 mg/mL) com a suspensão de

eritrócitos a 2%, na proporção 1:100 (v/v), por 1 h, a 4 ºC. Em seguida, as proteases foram

retiradas por centrifugações e lavagens com NaCl 0,9%. Os tubos contendo os EBs, suas

diluições, o sangue nativo e tratado foram incubados a 37 °C, durante 30 min, e depois, por

mais 30 min à temperatura ambiente. Após esse tempo, os tubos foram centrifugados a 2000 x

g, por 1 min, e a aglutinação visualizada a olho nu. Os resultados foram expressos como título

de hemaglutinação, o qual foi definido como o recíproco da maior diluição que é capaz de

provocar aglutinação visível. Essa concentração foi denotada como uma unidade de atividade

hemaglutinante (UH).


4.5.2.1 Determinação dos Inibidores de Tripsina nas sementes

A atividade inibitória de tripsina foi determinada de acordo com Kakade et al. (1969)

com algumas modificações. A extração dos inibidores foi realizada agitando-se, durante 3 h,

em temperatura ambiente, 20 mg da amostra (farinhas das sementes das 10 espécies) em 1 mL

de NaOH 0,01 N. A suspensão foi então deixada em repouso por 30 min e, em seguida, uma

alíquota de 0,5 mL desta suspensão foi adicionada a 0,5 mL de NaOH 0,01 N e centrifugada

173

a 15.000 x g, por 5 min. O sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade dos

inibidores de tripsina. Para obtenção da curva padrão de inibidor de tripsina, volumes de 10,

15, 20, 25, 30 e 35 µL de SBTI – inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz (Sigma-Aldrich, St

Louis, EEUU) dissolvido em NaOH 0,01 N, na concentração de 1 mg/mL, foram incubados

com 100 µL tripsina de pâncreas bovino, dissolvido em HCl 0,001 N na concentração de 1

mg/mL, e 100 µL da solução de BAPNA – Nα-Benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (Sigma-

Aldrich, St Louis, EEUU), dissolvido em DMSO (dimetil-sulfóxido de sódio) e água

destilada. O volume final de cada tubo foi ajustado para 1,6 ml com tampão Tris-HCl 0,05 M,

pH 8,2, contendo CaCl2 0,02 M. Após 5 min, os tubos foram incubados a 37 ºC por 45 min. O

procedimento do ensaio, realizado em triplicata, obedeceu à mesma seqüência de eventos da

curva padrão, apenas substituindo o SBTI por 20 µL do sobrenadante da amostra. A reação

foi interrompida pela adição de 200 µL de ácido acético 30 % (v/v) e a absorbância lida a 410

nm contra os brancos (sem adição de tripsina). Os resultados foram expressos como a

quantidade de tripsina (µg) inibida por miligrama de farinha (µgTI/mgF).

4.5.2.2 Determinação dos Inibidores de Tripsina da Fração Proteica de Piptadenia

moniliformis (PmFP)

A atividade inibitória sobre a tripsina de PmFP foi determinada de acordo com

Erlanger et al. (1961). Vinte microlitros (20 µl) de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em

HCl 0,0025 M) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH

7,5 e 0,1 mL da solução teste. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL

de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi

interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%. A mistura de reação foi

centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na

proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela

enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco foram realizadas

em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de

Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância

a 440 nm.

174

4.5.3 Inibidores de Quimotripsina

A atividade inibitória sobre a quimotripsina de PmFP foi determinada de acordo com

Erlanger et al. (1961). Vinte microlitros de solução (20 µl) de quimotripsina bovina (0,1

mg/mL em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 contendo CaCl 0,02 M) foram pré-incubados,

por 15 min a 37 °C, com o mesmo tampão e 0,1 mL da solução de PmFP. Após esse período,

a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M,

pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de

TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante

alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da

clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm.

Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram

expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o

decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.

4.5.4 Ureases

A determinação da atividade ureásica foi realizada de acordo com a metodologia

descrita por Kaplan (1969), com algumas modificações (VASCONCELOS et al., 1997). Uma

alíquota de 0,1 mL de uma solução de uréia 500 mM foi misturada com 0,7 mL de EDTA 2%,

tamponando com uma solução de fosfato de sódio 0,02 M, pH 6,5. Em seguida, 0,2 mL dos

EBs das farinhas das 10 sementes foram adicionadas e as misturas foram incubadas a 37 ºC,

por 15 min. Posteriormente, foram adicionados às misturas 1,0 mL da solução A (62 g de

fenol + 0,25 g de nitroprussiato de sódio/L) e 1,0 mL da solução B (43 mL de hipoclorito de

sódio + 20 g de hidróxido de sódio/L), sendo deixadas a 37 ºC, por 5 min. Após esse tempo,

foram adicionados 7,0 mL de água deionizada aos tubos, sendo estes cobertos com filme de

PVC e agitados vigorosamente. As leituras das absorbâncias foram feitas a 625 nm e a

atividade enzimática foi avaliada em relação a uma curva padrão obtida com urease (EC

3.5.1.5, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU). A atividade ureásica foi expressa como

unidades de enzima por Kg de farinha (U/KgF).

175

4.5.5 Quitinases

As atividades quitinolíticas foram determinadas segundo o método colorimétrico

descrito por Boller (1993), usando como parâmetro a liberação de N-acetil-D-glucosamina

(NAG) a partir da ação hidrolítica das enzimas sobre a quitina coloidal Boller (1992).

Inicialmente, a atividade quitinolítica total foi determinada por incubação de 250 µL da

amostra (EBs das sementes das 10 espécies, frações cromatográficas e PmFP) com 250 µL da

quitina coloidal (10 mg/ml), a 37 °C, durante 1 h, em seguida, fervidos em banho-maria a 98

°C por 5 minutos. Os tubos, após resfriamento, foram centrifugados a 10.000 x g, 25 °C, por

10 minutos, e alíquotas de 300 µL foram retiradas e incubadas com 10 µL da solução de

glucoronidase (EC 3.2.1.31), a 37 °C, por 1 h. A solução de glucoronidase usada nos ensaios

foi preparada por diálise da preparação bruta de Helix pomatia (Tipe HP-2, 132.000

Unidades/ml) com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e diluição (10 vezes) com o

mesmo tampão de reação. Esta segunda etapa enzimática também foi interrompida por meio

de fervura em banho-maria, durante 10 minutos. Para determinação da quantidade de NAG

liberada a partir da quitina coloidal sob ação de enzimas quitinolíticas, 310 µl do hidrolizado

foram acrescidos de 190 µl de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 6,0 e 100 µl de tetraborato

de sódio e potássio 0,6 M. A mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 98 ºC, por 5

minutos. Após resfriamento, 1 ml da solução de ρ-dimetilaminobenzaldeido (DMAB), foi

adicionado à mistura reacional e incubado em banho-maria a 37 ºC por 20 minutos. A solução

de DMAB foi preparada dissolvendo-se 10,0 g de DMAB em 100 mL de ácido acético glacial

contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. As leituras de absorbância foram feitas no

comprimento de onda de 585 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação,

uma curva padrão construída com concentrações variadas (100 a 500 µM) de N-acetil-D-

glucosamina foi utilizada (REISSIG; SROMENGER; LELOIR, 1955). A atividade

quitinolítica foi expressa em nanokatal (nKat) por mg de proteína (nKat/mgP), onde 1 nKat

equivale a 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo.

176

4.5.6 β-1,3-glucanases

A atividade de β-1,3-glucanase foi avaliada de acordo com o método descrito por

Boller (1993), pelo qual se detecta a glucose liberada no meio reacional como conseqüência

da hidrólise da laminarina, usada como substrato. A solução de laminarina (2 mg/mL), diluída

em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, foi aquecida a 60 °C, por 10 minutos, e

exaustivamente dialisada contra o mesmo tampão para remoção de glucose livre. Alíquotas de

100 µL da amostra (EBs das sementes das 10 espécies, frações cromatográficas e PmFP)

foram incubadas com 900 µL da solução de laminarina, a 50 °C, por 30 minutos. Em seguida,

foi adicionado 1 mL da solução “D” (1 mL da solução “B” + 25 mL da solução “A”) e a

mistura incubada a 100 °C, por 20 minutos. A solução “A” continha 25 g de carbonato de

sódio + 25 g de tartarato de sódio e potássio + 20 g de bicarbonato de sódio + 200 g de

sulfato de sódio anidro + H2O grau Milli-Q q.s.p. 1000 mL. A solução “B” continha 15 g de

sulfato de cobre pentahidratado + 20 µL de ácido sulfúrico concentrado + H2O grau Milli-Q,

q.s.p. 100 mL. Após resfriamento dos tubos, foi adicionado 1 mL da solução “C” (3 g de

arseniato de sódio heptahidratado + H2O grau Milli-Q q.s.p. 25 mL), e estes agitados até a

completa remoção de gases sendo, então, deixados em repouso por 5 minutos. As leituras de

absorbância foram feitas a 520 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação

foi utilizada uma curva padrão construída a partir de concentrações variadas de glucose (7,5 a

240 µg/mL), preparadas em tampão acetato de sódio 0,05 M, p H 5,2. A atividade de β-1,3-

glucanase foi expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por

segundo.

4.5.7 Atividade proteolítica

4.5.7.1 Análise qualitativa de proteases

A determinação qualitativa de proteases foi realizada pela análise da hidrólise da

gelatina de acordo com a metodologia descrita por Lima et al. (2008), com algumas

modificações. O pó da gelatina obtida comercialmente foi dissolvido em 200 ml de água fria.

177

A solução foi colocada no forno de micro-ondas por 30s, em potência alta. Logo em seguida,

3 ml da amostra (extrato bruto das dez sementes das espécies, água como controle negativo e

proteases de Bacillus licheniformis (1 mg) (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU ), como contrle

positivo) foi adicionado em 10 ml da solução de gelatina e homogeniado. Em seguida, foram

mantidos a 4°C por 30 minutos, para ocorrer a geleificação. A ocorrência ou não de proteólise

foi determinada por meio da geleificação observada indiretamente mediante a viscosidade do

meio. A reação foi positiva quando a gelatina permaneceu líquida após refrigeração,

indicando que foi hidrolisada por proteases. A reação foi considerada negativa quando o meio

se ressolidificou durante o período em que esteve em baixa temperatura.

4.5.7.2 Atividade proteolítica total

A determinação da atividade proteolítica das amostras foi realizada de acordo com a

metodologia descrita por Xavier-filho et al. (1989), utilizando azocaseína como substrato

inespecífico. Soluções de 1mg/ml de PmFP em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0 foram

centrifugadas (10.000 x g, 4ºC, 10 min). Alíquotas de 100 µl do sobrenadante foram

incubadas com 40 µl de DTT 3 mM ou 40µl de tampão (sem DTT) por 10 min para a ativação

das proteases. Posteriormente, foram adicionados 200 µl de azocaseína 1% e a solução foi

incubada a 37 ºC por uma hora. A reação foi interrompida com a adição de ácido

tricloroacético (TCA) 20 %. As Amostras foram centrifugadas a 10.000 x g por 10 min e uma

alíquota de 400 µl do sobrenadante foi alcalinizada com 400µl de NaOH 2N. A leitura em

espectofotômetro foi realizada em uma absorbância a 420 nm. Uma Unidade de Atividade

(UA) foi definida como a quantidade de enzima que produz um aumento de 0,01 unidades de

absorbância a 420 nm. Os resultados foram expressos em atividade específica, ou seja, UA

por micrograma de proteína.

4.5.8 Toxinas

A detecção de toxinas foi realizada por meio da avaliação da toxicidade aguda dos EBs

178

das farinhas das sementes das 10 espécies. Sendo realizada segundo a metodologia descrita

por Vasconcelos et al. (1997), através de injeção intraperitonial (0,3 mL/10 g de peso

corpóreo) em camundongos machos, pesando entre 20-25 g, alimentados ad libitum com dieta

peletizada comercial. Diferentes teores de proteína foram testados, de modo a encontrar a

dose máxima não letal, a dose mínima capaz de causar 100% de letalidade e doses

intermediárias envolvendo percentuais de morte no intervalo de 0-100%. Para toxicidade,

foram considerados válidos apenas os resultados observados no período de 24 horas. A

toxicidade foi expressa como DL50, a quantidade de proteína (g de proteína/Kg de peso

corpóreo) necessária para produzir convulsões e morte em 50% dos animais testados.

4.6 Ensaios Biológicos

4.6.1 Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti

O ensaio de atividade inibitória da eclosão dos ovos de Aedes aegypti por PmFP, em

diferentes concentrações, foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Ramos et al.

(2006), com algumas modificações. Os testes foram realizados em triplicata e sob condições

ideais de temperatura (27 ± 2 °C) e umidade (80% ± 10), com fotoperíodo de 12h claro/12 h

escuro. Tiras de papel contendo 20 ovos, contados em um estereomicroscópio (Tecnival),

foram mergulhadas em 5 mL de cada amostra (PmFP 1; 0,5; 0,250; 0,225; 0,200 e 0,175

mgP/ml e os controles negativo albumina sérica bovina (BSA) (1 mgP/ml) e água destilada),

todas contendo 1% de álcool etílico absoluto, dispostas em tubos de ensaio. Após, 72 h, à

temperatura ambiente, foi contado o número de larvas vivas ou mortas em cada amostra e, a

partir disso, foi calculado o número de ovos não-eclodidos, o percentual de inibição da

eclosão dos ovos e, por fim, foram retirados os ovos não eclodidos para observações de

possíveis alterações no estereomicroscópio.

A CI50, ou seja, a concentração capaz de inibir 50% de eclosão, foi calculada através

de teste estatístico Probit (FINNEY, 1971).

179

4.6.2 Atividade Larvicida contra Aedes aegypti

O ensaio de avaliação da atividade larvicida contra A. aegypti pelos EBs das sementes

das 10 espécies, foi realizado de acordo com a metodologia de WHO (2005), com algumas

modificações. Vinte larvas em 3º estádio larval foram coletadas com pipetas Pasteur,

colocadas em papel filtro para remover o excesso de água e então transferidas com um pincel

para copos plásticos descartáveis de 150 ml contendo, em cada um, 100 mL de EB de cada

semente. A mortalidade e a sobrevivência foram monitoradas durante as primeiras três horas

do experimento e registradas após 24 horas de exposição à temperatura ambiente (25◦C). As

larvas foram consideradas mortas quanto nenhum movimento foi detectado após serem

tocadas com uma escova fina. Foi contado o número de larvas vivas ou mortas em cada

amostra e, a partir disso, foi calculado o percentual de mortalidade. O experimento foi

realizado em triplicata, para cada extrato, em três análises diferentes e água destilada foi

usada como controle negativo.

4.6.3 Análise de larvas tratadas

As larvas de 1º estádio que se encontravam vivas após o teste de inibição de eclosão

de ovos com o tratamento de PmFP (0,225 mgP/ml) foram coletadas com pipetas Pasteur,

colocadas em papel filtro para remover o excesso de água e então transferidas com um pincel

para tubos de ensaio contendo água destilada e submetidas à temperatura de -20°C por

aproximadamente 5 min, a fim de deixá-las letárgicas. Após esse tempo, foram depositadas

em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2 com paraformaldeído 4% para fixação (a 4ºC).

Após duas horas de fixação, as larvas foram retiradas e colocadas sobre lâminas, onde o

excesso de tampão de fixação foi retirado e foi acrescentada uma gota de glicerol. Lamínulas

foram colocadas cuidadosamente sobre as larvas, e a amostra foi observada em

estereomicroscópio.

180

4.6.4 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Sólido

O ensaio de inibição do crescimento de fungos filamentosos fitopatogênicos pelos EBs

das sementes das 10 espécies em meio sólido foi realizado seguindo a metodologia descrita

por Roberts e Selitrennikoff (1990), com algumas modificações. Foram utilizados os seguinte

fungos filamentosos: Aspergillus niger, Colletotrichum musae, C. truncatum, Fusarium

oxysporum, F. solani, Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei, Pithium oligandrum,

Phomopsis sp. Rhizoctonia solani e Trichoderma viridae. As culturas de fungos foram

inoculadas como “pellets” de 8 mm no centro de placas de ágar batata. As placas foram

incubadas em temperatura ambiente por 48 h ou mais, dependendo da velocidade de

crescimento de cada fungo. Discos de papel de filtro com 3 cm de diâmetro foram colcados

aproximadamente 5 mm da borda da placa de Petri. Foram injetados nos discos 300 µL de EB

de cada semente (esterilizados em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro) e os controles BSA

(10 mg. mL-1), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH7,0 (controle negativo), NaCl 0,9%

(controle negativo) e nistatina 100.000 UI.mL-1 (EMS, Hortolândia, São Paulo) (controle

positivo). As placas foram novamente incubadas à temperatura ambiente até o crescimento

restante dos fungos em presença das amostras. A formação de halos ao redor dos poços

indicou inibição do crescimento fúngico.

4.6.5 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Líquido

O ensaio de inibição do crescimento de fungos filamentosos fitopatogênicos por PmFP

em meio líquido foi realizado seguindo a metodologia descrita por Freire et al. (2002), com

algumas modificações. Para o ensaio foram utilizados os seguintes fungos fitopatogênicos:

Aspergillus niger, Fusarium solani, Penicillium herguei e Rhizoctonia solani. Inicialmente, os

fungos filamentosos foram repicados da micoteca para placas estéreis de agar batata e

incubadas a 37 ºC, por uma semana, sendo, então, utilizados no experimento, após a obtenção

da suspensão de esporos. Placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96

poços, foram postas em câmara de fluxo laminar e a cada poço adicionados 100 µL de meio

YPD (“Yeast Peptone Dextrose”, Difco Co., EEUU) estéril, seguidos de 10 µL da suspensão

de esporos (2 x 10 5 esporos. mL-1) e 100 µL de cada amostra estéril (esterilização em filtro

181

Millipore® de 0,22 µm de poro), PmFP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml) e dos controles

negativos ovoalbumina (500 µg/ml), tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 (controle

negativo) e peróxido de hidrogênio 0,1 M (controle positivo). Em seguida, as placas de

microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 630 nm em leitor de

microplacas, seguidas de novas leituras a cada 12 h, até um total de 72 h. Entre os intervalos

de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.

4.6.6 Atividade Inibitória do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido

O ensaio de inibição do crescimento das leveduras Candida albicans, C. tropicalis

Saccharomyces cerevisiae, e Pichia anomala por PmFP, foi realizado de acordo com a

metodologia descrita por Ribeiro et al. (2007), com algumas modificações. Inicialmente, as

leveduras foram repicadas para placas estéreis de agar saboraud e incubadas a 37 ºC, por 24 -

48 h, sendo, então, utilizadas no experimento. Nas placas de microtitulação de poliestireno

(estéreis), contendo 96 poços, foram adicionados, em cada poço, 100 µL de caldo BHI (Brain

and Hearth Infusion, Difco Co., EEUU), com pH ajustado para 5,0, contendo uma

concentração de células leveduriformes correspondente a uma leitura de absorbância de 0,05,

comprimento de onda de 600 nm, seguidos seguidos de 100 µL de cada amostra estéril

(esterilização em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro), PmFP (500; 250; 125; 62,5; 31,25 e

15,62 µg/ml) e os controles: ovoalbumina (500 µg/ml) como controle negativo, e o formol

(0,04%), como controle positivo. Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a

uma leitura inicial de absorbância a 600 nm em uma leitora de microplacas, seguidas de novas

leituras a cada 6 h, até um total de 48 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram

incubadas em estufa a 37 °C.

4.6.7 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio sólido

A atividade antibacteriana foi determinada pelo método de difusão em meio sólido,

segundo a metodologia de Soares et al. (2007), na qual as bactérias Bacillus subtilis ATCC

182

6633, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterobacter aerogens ATCC 13048, Klebsiella

pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 e Salmonella choleraesuis

ATCC 10708 foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI – “Brain Heart Infusion” – DIFCO®)

e incubado a 37°C por 24 horas em microaerofilia através do método da chama da vela. Após

a observação da turvação do meio, procedeu-se a semeadura da bactéria em placa de Petri

contendo o meio de cultura Ágar Müller Hinton (DIFCO®) pela técnica de inundação. Foram

realizadas perfurações no meio de cultura de 6 mm de diâmetro. Nos orifícios foram inseridos

50 ml de amostra [EB de cada semente (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 µm de

poro) e os controles BSA (10 mg/mL), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH7,0 (controle

negativo) e solução de clorexidina a 0,12% (controle positivo)]. As placas foram incubadas

em estufa bacteriológica a 37°C por um período de 24 horas. Com o objetivo de controlar o

estudo e assegurar a sua reprodutibilidade, os experimentos foram realizados em triplicata.

Foi considerado positivo quando a amostra era capaz de produzir halos de inibição em torno

da amostra analisada.

4.6.8 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio Líquido

O ensaio de atividade inibitória do crescimento bacteriano em meio líquido de PmFP

foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Hissa et al. (2008). Foram utilizadas as

bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus aureus ATCC

25923, e as Gram-negativas Enterobacter aerogens ATCC 13048 e Salmonella choleraesuis

ATCC 10708. Inicialmente, as bactérias foram repicadas da bacterioteca para placas estéreis

de agar nutritivo e incubadas a 37 ºC, por 24 h, sendo, então, utilizadas no experimento. O

ensaio foi realizado em meio líquido da seguinte forma: placas de microtitulação de

poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram postas em câmara de fluxo laminar e a cada

poço adicionados 100 µL de caldo nutritivo contendo células bacterianas numa concentração

de 107 UFC. mL-1 (absorbância entre 0,1 e 0,2, a 600 nm), seguidos de 100 µL de cada

amostra estéril (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro), PmFP (500; 250; 125;

62,5 e 31,25 µg/ml), de Ovoalbumina (500 µg/ml), como controle negativo e de Formol 0,4%,

como controle positivo. Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma

leitura inicial de absorbância a 600 nm em uma leitora de microplacas, seguidas de novas

183

leituras a cada 4 h, até um total de 24 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram

incubadas em estufa a 37 °C.

4.7 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de

Piptadenia moniliformis Benth.

4.7.1 Fracionamento proteico com ácido tricloroacético (TCA)

O extrato bruto obtido de sementes de P.moniliformis foi submetido à precipitação

com solução aquosa de TCA 10%. Alíquotas de 4 mL de extrato bruto foram precipitadas

com solução aquosa de TCA 10%, em banho de gelo, para obter frações proteicas com

concentração final de 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3% de TCA. Decorridos 30 min da adição lenta de

TCA em constante agitação, as frações proteicas foram centrifugadas a 12.000 x g por 30

minutos a 4 0C e os sobrenadantes obtidos dialisados contra água destilada e submetidos a

ensaio de determinação de atividade quitinásica. Após essa primeira análise, a fração proteica

obtida após adição de TCA na concentração final de 2% apresentou maior atividade específica

para quitinase. Tendo em vista esse resultado, o restante do extrato bruto foi submetido ao

mesmo tratamento e a fração proteica, denominada F 2, foi utilizada nas etapas subseqüentes

pra a obtenção de PmFP.

4.7.2 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-celulose

Uma alíquota do extrato bruto de P.moniliformis (30 mgP) foi aplicada em matriz de

DEAE-celulose (14,0 cm x 2,7 cm), previamente equilibrada com tampão acetato de sódio

0,05 M, pH 5,2. A coluna foi percolada com o mesmo tampão de equilíbrio, até a completa

remoção das frações proteicas não retidas. A eluição das proteínas retidas na matriz foi

realizada com a adição sequencial de 0,2 M e 0,4 M de NaCl. a cromatografia foi realizada em

um fluxo de 30 mL/h, sendo coletadas frações de 6,0 mL por tubo. Todo o procedimento foi

monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de

184

atividade quitinásica e eletroforese. A fração que encerrou maior atividade específica para

quitinase após ser reunida, foi dialisada exaustivamente contra água destilada e

posteriormente, liofilizada.

4.7.3 Cromatografias de Afinidade em Matriz de Quitina

A matriz cromatográfica quitina foi utilizada do mesmo modo, em duas ocasiões,

diferindo apenas da amostra utilizada. A amostra [D1 - Primeira fração não retida em matriz

de DEAE-Celulose (11,4 mgP) ou A1 -primeira fração proteica não retida na matriz de “Affi-

gel blue gel” (10 mgP)] foi ressuspendida em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 e

aplicada à coluna de cromatografia de afinidade em matriz de quitina equilibrada com o

mesmo tampão. A amostra permaneceu por meia hora em contato com a matriz, antes do

início da retirada das proteínas não retidas. Posteriormente, a matriz foi percolada com esse

mesmo tampão até a remoção das proteínas não adsorvidas na matriz. A retiradas das proteínas

que interagiram com a matriz se deu por meio da aplicação de ácido acético 0,05 M e, após

zerada a leitura a 280 nm, uma eluição adicional com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 foi

realizada. As proteínas não retidas foram retiradas a um fluxo de 30 mL/h e as retidas a 45

ml/h. As frações foram coletadas em 3 ml (cromatografia utilizando amostra D1) e 1,5 ml

(cromatografia utilizando amostra A1) por tubo. Todo o procedimento foi monitorado por

leituras das absorbâncias a 280 nm. A cromatografia utilizando a amostra A1, foi

acompanhada da realização de determinação de atividade quitinásica e de eletroforese.

4.7.4 Cromatografias de troca iônica em Matriz de CM-sepharose

A matriz de CM-Sepharose foi utilizada para a realização de três Cromatografias com

uso de três amostras diferentes: amostra 1 (D1 - 31,35 mgP), amostra 2 (A1) e amostra 3 (F 2

– fração oriunda da precipitação encerrando 2% de TCA). A coluna foi equilibrada com

tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2 e uma amostra foi aplicada. A fração proteica não

retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna. As proteínas retidas foram eluídas

com a adição de NaCl ao tampão de equilíbrio nas seguintes condições: 0,2 M, 0,6 M e 1M de

185

NaCl (amostra 1), 1 M de NaCl (amostra 2) e 0,25M de NaCl (amostra 3). A cromatografia

seguiu em um fluxo de 30 mL/h. As frações foram coletadas em 6, 5 e 3 mL por tubo para as

amostras 1,3 e 3 mL, respectivamente. Todo o procedimento foi monitorado por leituras das

absorbâncias a 280 nm e acompanhada da realização de determinação de atividade

quitinásica. As frações oriundas dessa cromatografia com a amostra 3 (F 2) foram

exaustivamente dialisadas contra água e lofilizadas, bem como utilizadas para verificação do

perfil por eletroforese.

4.7.5 Cromatografia de afinidade em Matriz de “Affi-gel blue gel”

A matriz de Affi-gel blue gel (12,5 cm x 1,7 cm) foi equilibrada com o tampão acetato

de sódio 0,05 M, pH 5,2 e D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE (3,33 mgP)

foi ressuspendida no mesmo tampão de equilíbrio e aplicada a matriz. Após o contato de meia

hora com a matriz, as frações proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação

da coluna e a fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,4 M de NaCl ao tampão de

equilíbrio. Fluxo para a retiradas das proteínas não retidas foi de 20 mL/h e o fluxo para a

saída das proteínas retidas foi de 30 ml/h. Foram coletadas frações de 3,0 mL por tubo. Todo

o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como

através de ensaio de atividade quitinásica e eletroforese. A fração que encerrou maior

atividade específica para quitinase após ser reunida, foi dialisada exaustivamente contra água

destilada e posteriormente, liofilizada.

4.7.6 Cromatografia de Troca iônica em Matriz de Resource Q Sistema de de FPLC

(“Fast Protein Liquid Cromatography”)

A Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q (6,4 mm x 30 mm)

acoplada ao sistema de FPLC foi realizada com a aplicação de C1 (2 mgP) – Fração proteica

não retida na matriz de CM-sepharose realizada com amostra 3 (F 2), após o equilíbrio dessa

matriz com o tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. As proteínas não retidas foram eluídas

com o tampão de percolação da coluna e as proteínas retidas foram eluídas com a adição de

186

0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio. A cromatografia correu em um fluxo de 0,5 mL/min

e as frações coletadas forma de 0,5 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através

de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de atividade quitinásica

e eletroforese.

4.7.7 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

As frações obtidas de algumas cromatografias conforme descritas foram analisadas por

eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS), seguindo

a metodologia de Laemmli (1970), adaptadas para uso em placas. Foram utilizados géis de

concentração com 3,5% e de separação de 12,5% de acrilamida. As amostras proteicas (3 µg)

foram dissolvidas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, pH6,8 com SDS 2%, glicerol,

azul de bromofenol e β-mercaptoetanol). As amostras foram aquecidas a 100 °C, durante 10

min, e centrifugadas a 10.000 x g, durante 5 min, a 4 °C. Em seguida, 25 µL de cada amostra

foi aplicado em poços feitos em um gel vertical de 2 mm de espessura. As corridas foram

conduzidas a uma corrente constante de 20 mA por placa, durante 1,5 h. as bandas proteicas

foram visualizadas revelando-se o gel com nitrato de prata (BLUM; BEIER; GROSSA, 1987).

Como padrão de massa molecular foram usadas miosina (212 kDa), β-galactosidase (116

kDa), fosforilase B (97,4 kDa), albumina sérica bovina (66,2 kDa), albumina do ovo (45,0

kDa), anidrase carbônica (31,0 kDa), inibidor de tripsina da soja (21,4/ 19,7 kDa) e lisozima

(14,2 kDa) (AMRESCO Inc., Ohio, EEUU) e α-lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa,

inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase

carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0

kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa da Sigma-Aldrich Co. (St.

Louis, EEUU).

4.8 Análise Estatística

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão das triplicatas. Para outras

187

análises, os dados foram mostrados como média de três determinações e os valores de desvio-

padrão foram omitidos uma vez que mostraram valores inferiores a 5% da média.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Seleção das Espécies Vegetais

A existência de uma imensa quantidade de espécies vegetais a serem exploradas, torna

difícil a seleção daquelas que devem ser investigadas quanto ao seu potencial bioativo

(farmacológico, industrial e biotecnológico), por isso relatos da medicina popular costumam

ser eficazes na identificação de espécies vegetais potencialmente terapêuticas, auxiliando nas

pesquisas que visam a utilização de compostos de plantas para a produção de fitoterápicos,

por exemplo (FETROW; ÁVILA, 1999, MACIEL et al., 2002).

As espécies vegetais utilizadas neste estudo para a avaliação do potencial bioativo,

foram as mesmas utilizadas para a avaliação do potencial nutricional e foram escolhidas

devido, principalmente, à presença de substâncias classificadas como fatores

‘antinutricionais’, as quais, muitas delas (inibidores de proteases, lectinas, ureases), são

substâncias bioativas (SUNEJA et al., 2011), onde uma de suas funções relaciona-se com a

defesa de plantas contra pragas e patógenos (MACEDO et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007

CHAUDHARY et al., 2008). Além disso, a disponibilidade de suas sementes e o uso na

medicina popular pelas propriedades terapêuticas apresentada por algumas delas, também

contribui para a seleção e investigação de compostos ativos (TABELA 1).

O uso de plantas para o tratamento de doenças no mundo contribui significativamente

para o cuidado com a saúde. No Brasil, muitas plantas são utilizadas na forma de extrato

bruto, infusões ou emplastos no tratamento de infecções comuns, sem nenhuma evidência

científica, tornando-se necessário validar o uso das mesmas (HOLETZ et al., 2002; SOUZA

et al., 2004).

Várias plantas são utilizadas para o tratamento de infecções respiratórias e, na

TABELA 1 podemos ver algumas delas como: C. bracteosa, C. ferrea, E. velutina, e espécies

do gênero Hymenaea.

188

TABELA 1 – Espécies vegetais utilizadas nesse estudo, nome botânico e popular, uso na medicina popular, quantidade de sólido solúvel e

quantidade de proteína

Continua

Espécies vegetais

Nome Científico/ Nome Popular Uso medicinal popular

Sólido solúvel do

Extrato

(mg/ml)

Quantidade de proteína

(mg/ml)

Caesalpinia bracteosa Tul. (Catingueira)

Vermífugo, tratamento de

infecções respiratórias, hepatite,

disenteria e anemia (MAIA ,2004)

28,11 ± 0,08 2,17 ± 0,02

Caesalpinia ferrea Mart. (Jucá, pau-ferro)

Tratamento de doenças nos

brônquios, nos pulmões e diabetes

(MAIA ,2004)

28,14 ± 0,54 1,40 ± 0,01

Dioclea megacarpa Rolfe (Mucunã, olho-de-boi)

Tratamento de pedra nos rins,

disfunções da glândula próstata e

ações analgésicas (BATISTA,

1993; BATISTA et al., 1995)*

26,33 ± 1,09 7,46 ± 0,73

Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong

(Orelha-de-macaco, orelha-de-nego)

Anti-inflamatório (AGRA et al.,

2007)

35,23 ± 1,54 3,13 ± 0,15

Erythrina velutina Willd. (Mulungu)

calmante, sudorífica, emoliente e

anestésica local, insônias, tosse e

Vermífugo (AGRA et al., 2007)

32,25 ± 1,37 7,71 ± 0,66

189

TABELA 1 – Espécies vegetais utilizadas nesse estudo, nome botânico e popular, uso na medicina popular, quantidade de sólido solúvel e

quantidade de proteína

Continuação

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata

* Uso medicinal popular referente apenas ao gênero devido à ausência de relatos na literatura sobre a espécie.

Espécies vegetais

Nome Científico/ Nome Popular Uso medicinal popular

Sólido solúvel do

Extrato

(mg/ml)

Quantidade de proteína

(mg/ml)

Hymenaea courbaril L. (Jatobá, Madeira nova)

Tratamento bronquites, problemas

estomacais, atividades analgésicas

e anti-inflamatórias

(MARSAIOLI; LEITÃO FILHO;

DE CAMPELO, 1975; CORREA,

1984; NEVES et al., 1993)*

11,80 ± 0,10 1,13 ± 0,07

Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth (Ingá) Laxativo e hepatoprotetor

(AGBONON; GBEASSOR, 2009)

33,29 ± 1,22 7,70 ± 0,81

Parkia platycephala Benth. (Visgueiro) Antidiarréica e tratamento e

feridas (MARTINS,1989)

28,50 ± 0,82 1,32 ± 0,08

Piptadenia moniliformis Benth. (Catanduva) Leucorréia (REITZ, 1950)* 36,70 ± 1,36 4,30 ± 0,21

Senna rugosa (G.Don) H.S.Irwin & Barneby

(Lagarteiro)

Feridas e antidartroso

(MOREIRA, 1862; CASTRO,

1878)

54,71 ± 2,02 2,40 ± 0,11

190

O estudo dessas espécies pode levar à descoberta de compostos antimicrobianos ou até

mesmo imunomoduladores, como ocorreu com uma planta nativa do sul da África,

Pelargonium sidoides, que é comercializada na Alemanha há mais de cinqüenta anos para

tratamento de infecções causadas por bactéiras (HAANWINCKEL; MIGOWISKI; REI,

2006).

Assim, a análise da TABELA 1 mostra que a espécie vegetal que apresentou atividade

anti-inflamatória foi a E. contortisiliquum e as propriedades analgésicas estavam presentes em

espécies dos gêneros Dioclea e Hymenaea. C. bracteosa e o gênero Dioclea são usados

popularmente no tratamento de distúrbios renais, E. velutina e C. bracteosa são utilizadas

como vermífugo, C. ferrea no tratamento de diabetes, S. rugosa como antidartoso e o gênero

Piptadenia para o tratamento de feridas e leucorréia, sendo os três últimos, sinais e sintomas

indicativos de ação antifúngica (FENNER et al., 2006).

Dentre as espécies citadas, E. velutina e C. bracteosa destacaram-se por apresentar

mais propriedades terapêuticas distintas e, muito provavelmente, pode conter mais compostos

bioativos.

Além dessas plantas, várias outras da flora brasileira são empregadas na medicina

popular, com eficiente atividade medicinal, utilizadas com finalidade antisséptica, antifúngica

e no tratamento de doenças infecciosas (HOLETZ et al., 2002; SOUZA et al., 2004). A

pesquisa realizada por Lima et al. (2005) avaliou a existência de atividade antibacteriana de

extratos brutos, de diferentes partes da planta, de vinte e cinco espécies brasileiras usadas na

medicina popular e mostrou que, entre os quarenta e nove extratos testados, catorze foram

ativos contra bactérias, comprovando a bioatividade de plantas usadas na medicina popular.

Através do estudo foi possível também o isolamento do composto responsável pela atividade

biológica por separações bioguiadas. Esse e outros estudos têm confirmado a presença de

atividade antimicrobiana em plantas medicinais (ALVES et al., 2000; HOLETZ et al., 2002;

SARTORI et al., 2003; CAMPOS et al., 2007; LIMA et al., 2005).

A diversidade de espécies presentes na flora brasileira tem intensificado a busca de

novos agentes antimicrobianos de ocorrência natural pela necessidade de combater a

resistência de micro-organismos a exposições sucessivas a compostos sintéticos (ADEBAJO;

OLOREK; ALADESANMI, 1989; BRITO; BRITO 1993; MIGUEL et al., 1996; LIMA,

2001; YUNES; FILHO, 2001; SCHAECHTER et al., 2002). Neste intuito, é relevante um

“screening” de determinação de compostos bioativos nas dez espécies escolhidas para estudo.

191

5.2 Sólido Solúvel e Proteínas solúveis do Extrato Bruto das Espécies Vegetais da

Caatinga

O sólido solúvel do extrato bruto das dez espécies foi determinado pela pesagem de 1

ml extrato bruto liofilizado, feito na intenção de comparação com a quantidade de proteínas.

Percebe-se, pela TABELA 1, que a quantidade de sólido solúvel do extrato bruto das espécies

vegetais é bem maior do que a quantidade de proteínas extraídas de suas sementes, variando

de 11,80 ± 0,10 (H. courbaril) a 54,71 ± 2,02 mg/ml (S. rugosa), ao passo que as proteínas

variam de 1,13 ± 0,07 (H. courbaril) a 7,71 ± 0,66 mg/ml (E. velutina). As espécies C.

bracteosa e E. velutina, destacadas por suas propriedades terapêuticas diversas, apresentam

28,11 ± 0,08 e 32,25 ± 1,37 mg/ml de sólido solúvel e 2,17 ± 0,02 e 7,71 ± 0,06 mg/ml de

proteínas, respectivamente. Em termos percentuais, as proteínas de E. velutina representam

cerca de 24% do total do sólido solúvel de seu extrato bruto e o de C. bracteosa representa

apenas 7,72%. A espécie C. ferrea apresenta quantidade ainda menor de proteínas (1,40 ±

0,01), representando cerca de 5% em relação ao sólido solúvel (28,14 ± 0,54).

Esses dados mostram que as propriedades terapêutcas apresentadas por essas espécies

podem ser devido não só as proteínas, mas também devido a presença de outras substância

que, por ventura, possam ser extraídos juntamente com as proteínas, como os metabólitos

secundários (que também se apresentam como compostos bioativos), carboidratos e outras

substâncias solúveis.

Comparações mais concretas a respeito da relação proteínas/sólido solúvel tornam-se

mais claras após identificação tanto de compostos proteicos como de sustâncias originadas do

metabolismo secundário de plantas e investigação de atividades biológicas dos extratos das

espécies em estudos. Assim, o correlacionamento poderá nos levar aos objetivos almejados

que é apresentar espécies promissoras para o isolamento de compostos bioativos.

5.3 Metabólitos Secundários em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

O estudo fitoquímico de detecção dos metabólitos secundários foi realizado devido às

propriedades químicas e farmacêuticas por eles apresentados que os tornam compostos

bioativos e, que já foram isolados, apresentando eficiência comprovada na proteção da saúde

192

de seres humanos e de plantas (WATSON et al., 2001; RASKIN et al., 2002; REDDY;

ODHAV; BHOOLA, 2003; FORBEY et al., 2009). O resultado desse estudo está mostrado na

TABELA 2.

A maioria das espécies avaliadas apresentou saponinas em seus extratos brutos, com

exceção das espécies P. moniliformis e C. bracteosa. e, apenas três espécies (E.

contortisiliquum, H. courbaril e S. rugosa) não apresentaram flavonas, flavonoides e

xantonas. Em contrapartida, antocianinas, antocianidina, esteroides, flavanonas e

leucoantocianidinas eram ausentes em todas as espécies, e apenas a espécie C. ferrea continha

catequinas em seu extrato bruto, assim como as chalconas e auronas só estavam presentes em

S. rugosa e os flavononois em H. courbaril.

Os taninos foram encontrados nas espécies de C. bracteosa e C. ferrea, nesta última os

fenóis também eram presentes, assim como em P. moniliformis e S. rugosa. Já os

triterpenoides, só foram encontrados em E. velutina, L. sericeus e, também, na S. rugosa. Nas

espécies C. bracteosa, D. megacarpa, E. velutina e L. sericeus foi detectado a presença de

alcaloides em seus extratos brutos.

Os compostos fenólicos compreendem os flavonoides, xantonas, antocianinas, as

catequinas e os taninos. Os flavonoides são substâncias de constituição variada, por isso são

divididos em diferentes classes, tais como flavonois, flavonas, isoflavonas, chalconas, auronas

e flavanonas (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE, 1984; ASOLINI et al., 2006). Segundo

Barnes; Anderson e Phillipson (2001), os compostos fenólicos têm propriedades anti-

inflamatórias, antimicrobianas, antitumorais e antidiabéticas e foram encontrados em todas as

espécies vegetais analisadas nesta pesquisa, com exceção da espécie E. contortisiliquum

(TABELA 2).

A pesquisa realizada por Asolini et al. (2006), comprovou as propriedades

antibacterianas e antioxidante dos compostos fenólicos encontrados em extratos aquosos e

etanólicos de arruda (Ruta graveolens), camomila (Matricaria chamomilla), macela

(Achyrocline satureioides), alcachofra (Cynara scolymus), erva-mate (Ilex paraguariensis),

tanchagem (Plantago major), malva (Malva silvestris), sálvia (Salvia officinalis), capim-

limão (Cymbopogon citratus) e alecrim (Rosmarinus officinalis), o que mostra a

potencialidade desses compostos.

Além dos compostos fenólicos, foram analisados os metabólitos secundários

pertencentes à classe dos terpenos: as saponinas e os triterpenoides. As saponinas dentre suas

inúmeras propriedades, destacam-se por suas propriedades farmacológicas, medicinais,

hemolíticas, antimicrobiana e inseticida (ATTELE; WU; YUAN, 1999; ODA et al., 2000;

193

TABELA 2 – Detecção de metabólitos secundários no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Espécies

Vegetais

Alcaloi-des

Anto-

cianinas

antocia-

nidinas

Cate-

quinas

(taninos

caté-

quicos )

Chalco-

nas,

auronas

Esteroi-

des

Fenóis

Flavano-nas

flavonas, flavonois, xantonas

Flavono

-nois

Leucoan

-tociani-

dinas

Saponi-

nas

Taninos

Triterpe

-noides

C. bracteosa +1 _1 _ _ _ _ _ + _ _ _ + _

C. ferrea _ _ + _ _ + _ + _ _ + + _

D. megacarpa + _ _ _ _ _ _ + _ _ + _ _

E.

contortisiliquum _

_ _ _ _ _ _ _ _ _ + _ _

E. velutina + _ _ _ _ _ _ + _ _ + _ +

H. courbaril _ _ _ _ _ _ _ _ + _ + _ _

L. sericeus + _ _ _ _ _ _ + _ _ + _ +

P. platycephala _ _ _ _ _ _ _ + _ _ + _ _

P. moniliformis _ _ _ _ _ + _ + _ _ _ _ _

S. rugosa _ _ _ + _ + _ _ _ _ + _ +

+1 : detectado;

_1 : Não detectado

194

SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004). Podem ser utilizadas ainda várias

aplicações incluindo produção de cosméticos e produtos farmacêuticos (PRICE; JOHNSON;

FENWICK, 1987; PETIT et al., 1995; UEMATSU; HIRATA; SAITO, 2000; SPARG;

LIGHT; VAN STADEN, 2004).

As saponinas estavam presentes na maioria dos extratos de sementes das espécies

utilizadas neste estudo, assim como também foi encontrada e isolada de sementes da espécie

Mimusops laurifolia (ESKANDER et al., 2006).

Os metabólitos secundários, da classe dos compostos nitrogenados estudados, foram

os alcaloides que são compostos altamente tóxicos, associados à defesa de plantas contra a

herbivoria há bastante tempo (WALLER; NOWACKI, 1978; WINK, 1998). Os alcaloides

possuem propriedades farmacológicas e têm sido usados para o tratamento clínico de câncer,

parkinson, hipertensão e desordem no metabolismo central (RATHBONE; BRUCE, 2002).

Esses compostos foram encontrados em quatro espécies de plantas deste estudo (C. bracteosa,

D. megacarpa, E. velutina e L. sericeus), como citado anteriormente.

Esses dados mostram a existência de compostos secundários biologicamente ativos nas

espécies estudadas que são de interesse para as indústrias farmacêuticas, cosméticas e

agrícolas, podendo se constituir, ao lado da indução de resistência, mais uma forma potencial

de controle alternativo de doenças em plantas cultivadas.

A espécie que se destaca neste estudo fitoquímico é a C. ferrea por apresentar mais

metabólitos secundários e de duas classes diferentes (compostos fenólicos e terpenos), embora

as outras espécies também sejam igualmente promissoras.

5.4 Proteínas Bioativas em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A família das leguminosas (Fabaceae) é conhecida por sua variedade de compostos de

defesa de plantas, originados tanto do metabolismo secundário, tais como os compostos

fenólicos, alcaloides, terpenoides, quanto do metabolismo primário, como lectinas, proteases

quitinases, glucanaes e inibidores de proteases. Todos, conhecidamente apresentam atividades

inseticida, antifúngica e antibacteriana (GOMES et al., 1996; FRANCO; MELO, 2000;

CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; WINK; MOHAMED, 2003 KIM et al., 2005; KAKU et

al., 2006; VAN LOON et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007; REVINA et al., 2010), além de

outras propriedades com aplicabilidades na prática medica.

195

Partindo desse pressuposto, foi realizada a detecção e dosagem de proteínas bioativas

nos extratos das sementes selecionadas. O conteúdo de lectina, inibidor de tripsina, urease,

quitinase, β-1,3-glucanase e a análise qualitativa de atividade proteolítica estão mostrados na

TABELA 3.

A atividade lectínica contra eritrócitos de coelhos não tratadas e tratadas com protease

foi encontrada nas espécies: D. megacarpa (1.280 / 2.560 UH/gP), E. velutina (1.280 / 1.280

UH/gP), L. sericeus (1.280 / 2.560 UH/gP), P. platycephala (2.560 / 2.560 UH/gP) e S.

rugosa (80 / 160 UH/gP). Após o tratamento das células de eritrócitos com protease, foi

verificado aumento de atividade hemaglutinante em apenas três espécies. A presença de

lectinas no extrato bruto de D. megacarpa era esperada devido ao isolamento prévio das

lectinas glucose/manose específica e lactose específica realizados por Moreira et al. (1983) e

Melgarejo, Vega e Pérez (2005) respectivamente. O mesmo é válido para E. velutina e L.

sericeus pelo fato de já terem sido detectadas atividades hemaglutinantes nessas espécies

(MORAES et al., 1996; PROLL et al., 1998). Entretanto, duas novas fontes de lectinas foram

encontradas.

As sementes de vegetais, em especial de leguminosas, são ricas fontes de lectinas

(MANCINI-FILHO; LAJOLO; VIZEU ,1979; PUSZTAI, 1989;VEJA; PÉREZ, 2006), por

isso já foram purificadas a partir de várias sementes incluindo as do gênero Artocarpus

(TRINDADE et al., 2006), de Crotalaria pallida (REGO et al., 2002), em sementes de

Moringa oleifera (SANTOS et al., 2005) e também, foi detectada no extrato bruto de

sementes de uma espécie de leguminosa selvagem (Acácia constricta) com título de

hemaglutinação de 419 UH/mgP, sendo purificada posteriormente (GUZMÁN-PARTIDA et

al.,2004).

As lectinas são consideradas ferramentas importantes na pesquisa biomédica e

biotecnológica onde são amplamente utilizadas. Isso se deve a capacidade de ligação a

carboidratos com alto grau de especificidade que pode ser comprável a especificidade de

anticorpos. Assim, essas proteínas são muito utilizadas na engenharia genética como proteínas

de defesa de plantas contra predadores, mas também bastante analisadas para usos em campos

clínicos, pelas suas propriedade de afinidade por antígenos de células tumorais, podendo ser

usadas em estudos imunohistoquímicos e celulares, sendo potenciais ferramentas bioadesivas

na entrega de drogas; podem impedir a proliferação de células leucêmicas, inibir resposta

mitogênicas, entre outras (MATSUÍ et al., 2001; GABOR; KLAUSEGGER; WIRTH, 2001;

YAN et al., 2005; VEJA; PÉREZ, 2006; WONG e NG, 2006; WONG et al., 2006; MACEDO

196

TABELA 3 – Detecção e dosagem de proteínas bioativas no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Espécies vegetais Lectina* Inibidor

de tripsina† Urease¶

Quitinase§ β-1,3-

glucanase#

Protease**

Não tratadas Tratadas

Caesalpinia bracteosa ND ND 16,2 ± 0,8 11.278 ± 1.307 1,55 ± 0,12 0,3 ± 0,05 -

Caesalpinia férrea ND ND 27,4 ± 0,2 822 ± 50 2,0 ± 0,33 ND -

Dioclea megacarpa 1.280 2.560 10,8 ± 0,1 47.178 ± 3.351 0,26 ± 0,04 0,04 ± 0,01 +

Enterolobium contortisiliquum ND ND 26,2 ± 0,1 3.684 ± 173 0,34 ± 0,03 0,08 ± 0,04 -

Erythrina velutina 1.280 1.280 24,0 ± 0,8 3.645 ± 171 0,23 ± 0,02 0,02 ± 0,01 +

Hymenaea courbaril ND ND 4,5 ± 0,2 620 ± 28 0,55 ± 0,04 0,01 ± 0,0 -

Lonchocarpus sericeus 1.280 320 8,3 ± 0,3 23.895 ± 3.388 0,24 ± 0,02 0,05 ± 0,01 -

Parkia platycephala 2.560 2.560 ND 5.907 ± 967 0,66 ± 0,05 0,13 ± 0,02 +

Continua

197

TABALA 3 - Detecção e dosagem de proteínas bioativas no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Continuação

Espécies vegetais Lectina*

Inibidor

de tripsina† Urease¶

Quitinase§ β-1,3-glucanase#

Protease**

Não Tratadas Tratadas

Piptadenia moniliformis ND ND 8,9 ± 0,5 1.899 ± 228 1,12 ± 0,0 0,21 ± 0,04 +

Senna rugosa 80 160 4,1± 0,4 465 ± 13 0,32 ± 0,03 0,8 ± 0,01 -

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata, com exceção da dosagem de lectinas que foram expressas apenas as médias. ND =

não detectado. * UH/gP, onde Uma UH corresponde ao valor recíproco da maior diluição capaz de provocar aglutinação visível a olho nu em eritrócitos de coelhos

tratatos e não tratados com protease do Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA); † (µgTI/mgF), Atividade inibitória de tripsina é expressa por µg de tripsina inibida por miligrama de farinha; ¶ (U/KgF), A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha; § Atividade quitinásica está expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat representa 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo. #Atividade β-1,3-glucanásica está expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo.

** + = detectado e – Não detectado através de atividade gelatinásica.

198

et al., 2007). Dessa forma, a presença das lectinas em algumas das espécies de leguminosas

avaliadas é interessante para estudos na área agrícola e médica.

Os inibidores de proteinase, incluindo os da classe serínica, são intensamente

estudados em relação a sua atuação na defesa de plantas em resposta aos estresses abióticos e,

principalmente, bióticos frente ao ataque de vários micro-organismos patogênicos (FRANCO;

MELO, 2000; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; BREITENEDER; RADAUER, 2004; KIM

et al., 2005) São, também, compostos protéicos de grande interesse por agirem como

moduladores, desempenhando papéis em uma variedade de funções fisiológicas importantes

tais como coagulação sanguínea, fibrinólise, apoptose, desenvolvimento, inflamação e

ativação do complemento em humanos (VAN GENT et al., 2003; LU et al., 2008). Dentre

outras numerosas funções, ainda possuem propriedades antivirais e anticarcinogênicas.

(KENNEDY, 1998a,b; ZHANG et al., 2007; LIN; NG, 2008).

Todas as espécies apresentaram inibidores de tripsina com exceção de P. platycephala

(TABELA 3). A espécie S. rugosa apresentou menor capacidade de inibir tripsina (4,1 ± 0,4

µgTI/mgF) e C. ferrea destacou-se por inibir com mais eficiência essa enzima (27,4 ± 0,2

µgTI/mgF), seguida de E. contortisiliquum (26,2 ± 0,1 µgIT/mgF) e E. velutina (24,0 ± 0,8

µgTI/mgF). A quantidade de tripsina inibida encontrada por Vasconcelos et al. (2010) em

três cultivares de feijão-de-corda variou de 12,0 ± 1,12 a 16,67 ± 1,42 gTI/KgF, sendo esses

valores menores que os encontrados para essas sementes de leguminosas, se for levado em

consideração a unidade utilizada para a atividade enzimática (expressar em µgIT/mgF é o

mesmo que expressar em gTI/KgF). A simples presença dessa atividade pode levar a

purificação do inibidor que é uma substância com diversas atividades biológicas interessantes

a serem aplicadas em diferentes áreas.

A TABELA 3 mostra que a urease encontra-se presente em todas as sementes das

espécies avaliadas, com quantidades que variam de 465 ± 13 (S. rugosa) a 47.178 ± 3.351 (D.

megacarpa) de urease/KgF, sendo menor que aquelas presentes em sementes de soja, cujos

valores variaram de 107.320 ± 9,47 a 219.280 ± 2,60 U de urease/KgF (VASCONCELOS et

al., 2001), mostrando o potencial bioativo dessas espécies nativas da caatinga, posto que as

ureases possuem papel na defesa de plantas contra insetos Coleoptera e Hemíptera, sendo

mais tóxicas do que inibidores de α-amilase, inibidores de proteinases e do que algumas

lectinas (CARLINI et al., 1997; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002). Além disso, também

possuem função de ativação de plaquetas sanguíneas (FOLLMER, 2008), as quais podem ser

aproveitadas pelas indústrias agrícolas e farmacêuticas.

199

Foi determinada a presença de proteínas relacionadas à patogênese como quitinases e

β-1,3-glucanases. Assim como as outras proteínas, as quitinase e as glucanases foram

escolhidas por apresentarem diversas propriedades as quais podem ser utilizadas para diversos

fins. Essas enzimas também estão envolvidas na defesa das plantas contra patógenos,

principalmente fungos (BOLLER et al., 1983; MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988;

MAJEAU et al., 1990; GOMES et al., 1996; RADUTOIU et al. 2003; KASPRZEWSKA,

2003; KAKU et al. 2006; ALCAZAR-FUOLI et al., 2010), podendo ser utilizadas para

biotecnologia. Além disso, as quitinases também são úteis em processos de bioconversão de

lixo (restos de crustáceos) em produtos derivados de quitina, que podem ser aproveitados, e,

podem, ainda, ser aplicadas na medicina,através de seu uso para produção de

quitoligossacarídeos, glicosaminas e GlcNAc, por apresentar atividades antitumorais.

(DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006). Mostram, assim, seu grande potencial

farmacológico.

Nas espécies utilizadas nessa pesquisa todas apresentaram atividade quitinolítica e

quase todas foram capazes de catalisar a quebra hidrolítica de ligações β-1,3-glucosídicas,

menos a espécie C. ferrea. Em geral, os extratos brutos das sementes de todas as espécies

mostraram uma alta atividade da enzima quitinase em relação à atividade apresentada por

alguns genótipos de soja, cuja variação foi de 0,26 a 0,44 nKat/mgP (SIEBRA, 2004). No

entanto, algumas se sobressaíram: C. ferrea (2,0 ± 0,33 nKat/mgP), C. bracteosa (1,55 ± 0,12

nKat/mgP) e P. moniliformis (1,12 ± 0,0 nKat/mgP), podendo ser utilizadas para a purificação

de quitinases.

Em relação as β-1,3-glucanases, ao contrário das quitinases, a maioria das espécies

apresentou baixa atividade e algumas apresentaram atividade razoável (C. bracteosa - 0,3 ±

0,05 nKat/ml; P. platycephala - 0,13 ± 0,02 nKat/ml; P. moniliformis - 0,21 ± 0,04), embora

mais baixa que as atividades encontradas por Souza (2001) em sementes de dois genótipos de

soja 9,84 e 12,06 nKat/mgP. Todavia, a presença dessas enzimas em sementes de espécies

nativas subexploradas no campo científico, contribui para estudos futuros que visam

aprimorar o uso dessas espécies.

A atividade proteolítica das espécies vegetais foi detectada pela capacidade de

degradar ou não gelatina, como substrato inespecífico. Poucas espécies foram capazes de

degradar gelatina, limitando a atividade proteolítica a apenas quatro espécies: D. megacarpa,

E. velutina, P. platycephala e P. moniliformis. Entretanto, são necessários ensaios mais

específicos de atividades proteolíticas para uma real afirmação de ausência dessa atividade

apresentada por algumas das espécies testadas.

200

As proteases também estão envolvidas na defesa da planta com papéis distintos,

atuando na percepção, sinalização e execução do processo de defesa (VAN DER HOORN;

JONES, 2004), Além disso, também participam da esporulação e liberação conidial,

germinação, modificação de proteínas, regulação da expressão gênica e morte celular

programada (TORNERO 1996; BEERS; JONES; DICKERMAN, 2004).

Em animais e seres humanos, as proteases são importantes para o catabolismo de

proteínas, coagulação sanguínea, inflamação, crescimento e migração celular, morfogenia e

desenvolvimento, crescimento de tumores e metástases, liberação de hormônios, transporte de

proteínas, entre outras (GODFREY; WEST 1996).

As diversas funções das proteases fazem essa classe de proteínas bastante promissoras

para aplicações nas indústrias farmacêuticas.

A hipótese de que as sementes de plantas nativas da caatinga apresentam proteínas

com potencial bioativo foi comprovada, pois os extratos brutos de todas as espécies

apresentaram pelo menos três proteínas bioativas e, em duas espécies (D. megacarpa e E.

velutina) estavam presentes todas as proteínas bioativas avaliadas. Os extratos brutos de P.

moniliformis, P. platycephala e de S. rugosa destacaram-se por apresentar quase todas as

proteínas testadas com exceção de apenas uma delas. Assim, qualquer uma das dez espécies

poderia ser escolhida para isolamento total ou parcial de uma ou mais proteínas detectadas e

avaliação de suas atividades biológicas para futuras aplicações nas indústrias farmacêuticas,

agrícolas ou, até mesmo, na indústria de cosmético.

5.5 Avaliação de Toxicidade dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies Vegetais da

Caatinga

O ensaio de toxicidade aguda foi realizado em camundongos injetando-se os extratos

brutos das espécies por via intraperitoneal,visando a detecção de substâncias tóxicas (toxinas)

nos extratos brutos das dez sementes das espécies vegetais. Alterações fisiológicas como

dispnéia, convulsões tônico-clônicas, culminando na morte dos animais, caracterizam a

presença de toxinas. Estas são encontradas em diferentes organismos compondo o arsenal de

defesa em conjunto com outros compostos (SGARBIERI, 1996).

Tem sido relatada a presença de proteínas tóxicas em vegetais, como por exemplo na

soja, onde já foram purificadas três toxinas. Morais (2010) sugere a participação das proteínas

201

tóxicas presentes em sementes de soja na defesa do vegetal, tornando essas proteínas

potencialmente importantes para o uso na agricultura. Diante dessa possibilidade, a busca por

toxinas nesses extratos brutos tornou-se relevante.

Os dados da TABELA 4 mostram que as espécies D. megacarpa, E. contortisiliquum e

E. velutina são tóxicas para camundongos, apresentando DL50 de 0,72 ± 0,03; 1,12 ± 0,04 e

1,01 ± 0,02 g/Kg de peso corpóreo, respectivamente. No entanto, essa toxicidade foi bem

menor do que a relatada para o genótipo de soja Bays, no qual a DL50 foi de 0,137 ± 0,02

g/kgP (VASCONCELOS et al., 2001). De uma maneira geral, pode-se dizer que as espécies

avaliadas não são boas fontes de toxinas vegetais, já que apenas três possuíram atividades

tóxicas, sendo ainda, relativamente baixa.

Após a verificação de várias substâncias biologicamente ativas nos extratos brutos das

sementes das dez espécies vegetais escolhidas nesta pesquisa, partiu-se para a avaliação das

atividades frente a modelos biológicos, os quais são reconhecidamente afetados por várias

substâncias aqui encontradas.

O ensaio de determinação de toxicidade dos extratos brutos das dez espécies para

larvas de A. aegypti foi conduzido, com larvas de terceiro estádio, no intuito de associar a

presença de atividade biológica com os compostos bioativos encontrados nos extratos brutos

avaliados.

Esse modelo biológico foi escolhido devido ao sério problema de saúde pública pelo

qual passa o Brasil e outras regiões do mundo, enfrentando epidemias de dengue, doença

contra a qual não existe vacina e cujo controle baseia-se principalmente no combate ao vetor.

É, pois, de grande relevância pesquisar fontes naturais de substâncias inseticidas para ajudar a

contornar o sério problema do aumento de resistência desses insetos aos inseticidas sintéticos

comumente utilizados (MACORIS et al., 1999; TAUIL, 2002; LAURENTINO DE

CARVALHO et al., 2004; BRAGA; VALLE, 2007; JANSEN; BEEBE, 2010).

Os extratos brutos das sementes das espécies vegetais avaliadas mostraram um

elevado percentual de atividade larvicida com exceção das espécies C. Bracteosa - para a qual

não foi detectada toxicidade para as larvas - H. Courbaril e S. Rugosa, as quais apresentaram

baixo percentual de mortalidade, girando em torno de 15%. Ao contrário, as espécies D.

megacarpa, E. Contortisiluquum e P. Moniliformis apresentaram percentual de mortalidade

de larvas de 100%, tornando essas espécies promissoras para o auxílio do combate ao vetor da

dengue. Em consonância com esse resultado, uma pesquisa realizada por Ferreira et al.

(2009), utilizando o extrato bruto de sementes de M. oleifera Lamarck também apresentou

toxicidade para larvas de A. Aegypti com uma LC50 de 1.260 µg/ml.

202

TABELA 4 – Determinação de atividade tóxica do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga para camundongos e larvas de Aedes

aegypti no 3 º estádio de desenvolvimento

Espécies vegetais Toxicidade aguda

(DL 50 g/Kg)*

Atividade larvicida

(% de mortalidade larval de 3º Esdádio)

Caesalpinia bracteosa NL ND

Caesalpinia férrea NL 85,04 ± 3,84

Dioclea megacarpa 0,72 ± 0,03 100,0 ± 0,0

Enterolobium contortisiliquum 1,12 ± 0,04 100,0 ± 0,0

Erythrina velutina 1,01 ± 0,02 75,12 ± 1,89

Hymenaea courbaril NL 13,33 ± 0,54

Lonchocarpus sericeus NL 70,09 ± 2,34

Parkia platycephala NL 70,09 ± 2,34

Piptadenia moniliformis NL 100,0 ± 0,0

Senna rugosa NL 16,67 ± 0,78

* Toxicidade aguda em camundongos (n=6) foi expressa como DL50. Uma DL50 representa a quantidade de proteína em gP/Kg de peso corpóreo de

camundongo capaz de produzir convulsão e morte em 50% dos animais após administração por via intraperitoneal. NL = Não letal em doses de 1g/Kg do

peso corpóreo de camundongo. ND = Não detectado. Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata.

203

A espécie D. megacarpa contém em seu extrato bruto, todas as proteínas bioativas

analisadas e, dentre elas, as lectinas, a presença de atividade proteolítica e toxicidade aguda

para camundongos, merecem destaque.

Isso porque, embora existam poucos relatos na literatura sobre a atividade larvicida de

proteínas de origem vegetal contra Ae. Aegypti, um dos estudos se refere às lectinas de

sementes de Myracrodruon urundeuva, mostrando atividade larvicida (SÁ et al., 2008), outro

realizado por Ramos et al., (2006) relata a toxicidade de proteases cisteínicas para larvas

desse inseto e, ainda, toxinas proteicas Cry de Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) também

causam mortalidade nas larvas de Ae. Aegypti (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007).

Além das proteínas, a espécie D. megacarpa também apresenta metabólitos

secundários como saponinas com propriedades inseticidas e os alcaloides que são altamente

tóxicos. Saponinas e óleos essenciais com propriedades larvicidas, repelentes ou deterrentes a

ovoposição de Ae. Aegypti, já foram relatadas (MURUGAN; MURUGAN; NOORTHEEN,

2007; CHAPAGAIN; SAHARAN; WIESMAN, 2008; CORIA et al., 2008; SILVA et al.,

2008). Nesse contexto, esses compostos presentes nesta espécie podem estar envolvidos na

toxicidade às larvas do vetor, sozinhas, associadas ou mesmo devido à existência de outras

substâncias ativas para insetos que também estão presentes na espécie, mas que não foram

estudadas.

De forma semelhante, a espécies E. Contortisiluquum também apresentou saponinas

em seu extrato bruto, além de outras proteínas, também apresentdas por P. moniliformis que

são igualmente prejudiciais ao desenvolvimento dos insetos como os inibidores de tripsina,

ureases, as quitinases e presença de proteases, sendo estas últimas pertencentes apenas a P.

moniliformis.

A preocupação com o meio-ambiente intensifica as buscas por substâncias ativas mais

biodegradádeis e seguras, como os bioinseticidas, contra o mosquito da dengue. Nesse

sentido, os extratos de plantas têm sido avaliados como fontes naturais de inseticidas e muitos

ensaios larvicidas vêm sendo conduzidos com o terceiro (usados nesse estudo) e quarto

estádio larval (LUNA et al., 2005; KIRAN et al., 2006; MURUGAN; MURUGAN;

NOORTHEEN, 2007; COELHO et al., 2009). As espécies analisadas neste trabalho merecem

atenção, no que diz respeito à atividade tóxica para larvas desse inseto, como futuras fonte de

inseticidas naturais.

204

5.6 Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies Vegetais da

Caatinga

Dando continuidade aos ensaios biológicos, quatro espécies de bactérias, sendo duas

Gram-negativas (Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa) e duas Gram-positiva

(Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis) e doze espécies de fungos filamentosos

Aspergillus niger, Colletotrichum musae, Colletotrichum truncatum, Fusarium oxysporum,

Fusarium solani, Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei, Phomopsis sp., Pythium

oligandrum, Rhizoctonia solani e Trichoderma viridae foram selecionadas para a avaliação de

atividade antibacteriana utilizando os extratos brutos das sementes das dez espécies em estudo

(TABELA 5).

A atividade antibacteriana foi verificada para as espécies C. bractosa contra Bacillus

subtilis e S. rugosa contra Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus, ambas bactérias Gram-

positivas. A pesquisa de Lima et al. (2005) também mostrou forte inibição no crescimento de

cepas da bactéria Staphylococcus aureus quando em contato com os extratos de diferentes

partes das espécies Schinus terebinthifolius, Lafoensia pacari, Serjania lethalis e Jatropha

elliptica. A bactéria Gran-negativa Pseudomonas aeruginosa, assim como neste estudo,

também não foi inibida pelo extrato salino das sementes da leguminosa Stryphnodendron

obovatum Benth. (VASCONCELOS et al., 2004).

O grupo de bactérias Gram-positivas parece ser mais susceptível às substâncias

antibacterianas de plantas do que o grupo das bactérias Gram-negativas, segundo a conclusão

de Kumar et al. (2006) após a realização de um “screening” com vários extratos de plantas

medicinais, frente aos dois grupos bacterianos. No entanto, o perfil químico de seletividade

contra Gram-positivas não é restrito apenas aos compostos de plantas, mas sim um fenômeno

geral observado em muitos antibióticos (SCHAECHTER et al., 1999; BASILE et al., 2000)

Acredita-se que a maior resistência encontrada por parte das bactérias Gam-negativas seja à

existência de uma membrana externa adicional que dificulta a entrada de substâncias tóxicas

na célula (SCHAECHTER et al., 2002).

De uma maneira geral, extratos de sementes de plantas possuem alta atividade

antibacteriana (BASILE, 1997 apud TALAS-OĞRAŞ et al., 2005), já que muitos estudos

mostram potentes proteínas antimicrobianas purificada de sementes (KUMARASAMY et al.,

2002).

205

TABELA 5 – Avaliação da atividade antimicrobiana em meio sólido do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Micro-organismos Testados

Bacterias

Gram - Gram +

Fungos

Espécies vegetais

Kp Pa Sa Bs AN CM CT FO FS M N PH P PO RS TV

C. bracteosa -1 - - +2 - - - + - - - - - - - -

C. férrea - - - - - - - - - - - - - - - -

D. megacarpa - - - - - - - + - - - - - - - -

E. contortisiliquum - - - - + - + - - - + - - - - +

Er. Velutina - - - - - - - - - - - - - - - -

H. courbaril - - - - - - - - - - - - - - - -

P. platycephala - - - - - - - - - - - - - - - -

L. sericeus - - - - - - - - - - - - - - - -

Pi. Moniliformis - - - - + - + - - - - - - - - -

Se. Rugosa - - + + - - - - - - - - - - - -

Kp: Klebsiella pneumoniae; Pa: Pseudomonas aeruginosa; Sa: Staphylococcus aureus; Bs: Bacillus subtilis; AN: Aspergillus niger; CM: Colletotrichum musae; CT:

Colletotrichum truncatum; FO: Fusarium oxysporum; FS: Fusarium solani; M: Mucor sp.; N: Neurospora sp.; PH: Penicillium herguei; P: Phomopsis sp; PO: Pythium

oligandrum; RS: Rhizoctonia solani; TV: Trichoderma viridae.

¹ Não apresentou halo de inibição. 2 Apresentou halo de inibição.

206

Uma vasta gama de proteínas de defesas é produzida pelos vegetais em diferentes

locais, por isso várias proteínas antibacterianas e/ou antifúngicas têm sido purificadas, sendo

classificadas como tioninas, defensinas, proteínas de transferência de lipídios, quitinases,

proteínas ligantes a quitina, β-1,3-glucanases, lectinas, permatinas, 2S albuminas, proteínas

inativadoras de ribossomos, peptídeos tipo-heveína, proteínas tipo-knotina, entre outras

(CAMMUE et al.,1995; BROEKAERT et al., 1997; WANG et al., 2001; KUMARASAMY

et al., 2002; KELEMU; CARDONA; SEGURA, 2004).

Nos extratos de C. bractosa e S. rugosa também foram detecdados a presença de

proteínas antibacterianas e/ou antifúngias como quitinases e maiores quantidades de β-1,3-

glucanases (TABELA 3) que podem estar envolvidas com a presença da atividade

antibacteriana encontrada. Além das proteínas, alguns metabólitos secundários como

alcaloides, flavonas, flavonois, xantonas, taninos foram encontrados em C. bractosa, e,

calchonas, auronase, fenóis, saponinas e triterpenótides em S. rugosa (TABELA 2).

A espécie vegetal Schinus terebinthifolius é conhecida por possuir triterpenos, fenóis e

flavonóis (HEGNAUER, 1964 apud LIMA et al, 2005) e seu extrato etanólico, o qual extrái

metabólitos secundários, é capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus,

Pseudomona aeruginosa e Candida albicans (MARTINEZ et al., 1996; GUERRA et al.,

2000). Assim, não só os compostos proteicos podem atuar frente às bactérias, mas também os

compostos oriundos do metabolismo secundário do vegetal existentes nessas espécies.

Em relação à avaliação da atividade antifúngica, as espécies C. bracteosa e D.

megacarpa foram capazes de inibir o crescimento do fungo Fusarium oxysporum. A espécie

P. moniliformis impediu o crescimento dos fungos Aspergillus niger e Colletotrichum

truncatum e a espécie E. contortisiliquum apresentou maior potencial antifúngico, uma vez

que prejudicou o crescimento de um maior número de fungos (A. niger, Colletotrichum

truncatum, Neurospora sp. e Trichoderma viridae) (TABELA 5).

O “screening” do ensaio antifúngico com as dez espécies vegetais da caatinga mostrou

que quatro espécies exibiram atividade contra os fungos testados, significando que 40% das

plantas estudadas são fontes potenciais de agentes antifúngicos. Esse resultado foi de grande

valia, haja vista as pesquisas de Kelemu, Cardona e Segura (2004), que investigaram o extrato

bruto de 26 espécies de leguminosas na busca por propriedades antifúngicas e somente uma

delas apresentou forte atividade frente ao fungo Rhizoctona solani; e a de Schmourlo et al.

(2005) que investigou os extratos de dezesseis plantas medicinais e alimentares sobre a

inibição do crescimento de três fungos, obtendo atividade antifúngica significante em seis

espécies, que representa 37% da potencialidade das espécies.

207

As plantas sintetizam muitos peptídeos e proteínas antifúngicas para se defenderem do

ataque de patógenos que são valiosos na proteção de grãos economicamente importantes (NG,

2004; WANG; NG, 2006a; LAM; NG, 2009). Por isso, têm recebido bastante atenção por

parte dos pesquisadores que cada vez mais buscam a purificação de peptídeos e/ou proteínas

antifúngicas em sementes de leguminosas (CHU; LIU; NG, 2003; WANG; NG, 2005; WaNG

e NG, 2006b).

Muitos desses compostos produzidos pelas plantas também exercem ação deletéria aos

fungos patogênicos para o homem (SELITRENNIKOFF, 2001; PELEGRINI et al., 2009;

PARK; LEE, 2009). Dada a importância clínica, têm sido isoladas novas proteínas exercendo

essa ação (AGIZZIO et al., 2006).

Em relação às proteínas bioativas encontradas nas espécies que apresentaram atividade

contra fungos (TABELA 5), todas continham inibidor de tripsina, quitinases e β-1,3-

glucanases (TABELA 3). Atividade proteolítica estava presente em P. moniliformis e D.

megacarpa, esta última apresentando ainda as lectinas. Dentre os compostos secundários

estudados, foram encontrados alcaloides em uma espécie que apresentou atividade

antifúngica, compostos fenólicos em duas espécies e saponinas em três espécies. Todos esses

compostos possuem propriedades antimicrobianas (BENNET; WALLSGROVE, 1994;

ATTELE; ; WU; YUAN, 1999; ODA et al., 2000; BARNES; ANDERSON; PHILLIPSON,

2001; RATHBONE; BRUCE, 2002; SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004; ASOLINI et

al., 2006) que podem estar envolvidas na atividade antifúngica encontrada.

De acordo com TALAS-OĞRAŞ et al. (2005), a triagem de atividade antimicrobiana

permite a seleção de extratos de plantas com propriedades úteis para estudos farmacêuticos e

bioquímicos. Assim sendo, a identificação de proteínas e de metabólitos secundários que

possuem ação antifúngica já relatada na literatura, associando a própria atividade biológica

encontrada, pode levar à purificação bioguiada de um desses agentes ou mesmo de outros que

não foram testados e contribuir futuramente para minimização de perdas na agricultura com a

utilização da biotecnologia, bem como contribuir com a indústria farmacêutica na fabricação

de medicamentos capazes de reduzir o desenvolvimento de doenças causadas por fungos

patogênicos ao homem.

208

5.7 Espécies Vegetais com Bom Perfil de Bioatividade

Todas as espécies vegetais estudadas apresentaram compostos bioativos frutos do

metabolismo primário e do metabolismo secundário e, algumas, apresentaram atividades

frente a modelos biológicos patológicos para o homem e/ou para as plantas, então

dependendo do composto ou da atividade de interesse qualquer uma das dez espécies pode ser

escolhida para um estudo mais aprofundado. Entretanto, no que diz respeito à presença de

compostos bioativo associados às atividades biológicas apresentadas neste estudo, as espécies

C. bracteosa, D. megacarpa, E. contortisiliquum, P. moniliformis e S. rugosa, apresentam

melhor perfil bioativo.

A espécie C. bracteosa é usada na medicina popular, através de seus extratos, para o

tratamento de varias enfermidades, entre elas, o tratamento de infecções respiratórias (MAIA

2004). Neste trabalho, essa espécie destacou-se por apresentar compostos fenólicos (flavonas,

flavonois, xantonas e taninos) e alcaloides, dentre os metabólitos secundários, e, inibidores de

tripsina, ureases, elevada atividade de quitinase e β-1,3 – glucanases, dentre as proteínas

bioativas avaliadas. Além disso, essa espécie também foi capaz de inibir o crescimento da

bactéria Gram-positiva B. subtilis que embora benéfica para as plantas (ARAÚJO, 2008) é

causadora de doenças oportunistas em pacientes imunodeprimidos (JAWETZ; MELNICK;

ADELBERG, 1998). O extrato dessa espécie também apresentou inibição do crescimento do

fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum.

A propriedade terapêutica apresentada pela espécie C. bracteosa para o tratamento de

infecções respiratórias e os efeitos deletérios para a cepa de B. subtilis podem estar associados

à presença dos compostos fenólicos e alcaloides, devido a evidente atividade antimicrobiana

por eles já relatadas (RATHBONE; BRUCE, 2002; HOLLEY; PATEL, 2005). A correlação

entre compostos fenólicos e testes de inibição do crescimento de bactérias, inclusive de B.

subtilis, também foi feita por Asolini et al. (2006), tendo sido comprovada. Por outro lado, as

proteínas bioativas também podem contribuir para esse efeito terapêutico e para a inibição do

crescimento da bactéria B. subtilis, bem como do fungo F. oxysporum. Exemplos de proteínas

com atividade antifúngica capaz de inibir o crescimento do fungo F. oxysporum são: a lectina

do germe de trigo (WGA) (CIOPRAGA et al., 1999) e uma proteína ligante ligante à quitina

(Mo-CBP3) purificada de Moringa oleífera Lamarck (GIFONI, 2009). No entanto, outras

proteínas como quitinases, β-1,3 – glucanases, inibidores de tripsina também possuem

propriedades antifúngicas e podem causar prejuízo ao fungo em questão.

209

Foram encontrados em D. megacarpa metabólitos secundários como alcaloides,

saponinas e compostos fenólicos (flavonas, flavonois e xantonas), além disso, todas as

proteínas bioativas dosadas estavam presentes nessa espécie incluindo as toxinas. Vale

ressaltar a elevada quantidade de ureases encontradas. O seu extrato bruto foi, ainda, capaz

de causar 100% de mortalidade em larvas de Ae. Aegypti e de inibir o crescimento do fungo F.

oxysporum.

A ação contra o fungo F. oysporum pode ser causada por proteínas como as lectinas,

por já ter sido encontrado a WGA com essa atuação (CIOPRAGA et al., 1999), bem como

qualquer uma das outras proteínas encontradas nessa espécie, conforme mencionado

anteriormente. Há, ainda, a possibilidade de ação dos compostos secundários encontrados. A

atividade frente ao Ae. Aegypti foi muito boa, podendo ter sido ocasionada por proteases,

quitinases, inibidor de tripsina ou mesmo compostos secundários como os alcaloides, que são

altamente tóxicos, e saponinas por já terem apresentado potente atividade larvicida contra o

vetor da dengue (WIESMAN; CHAPAGAIN, 2003; SANTIAGO et al., 2005).

A espécie E. contortisiliquum destacou-se primeiramente por seu espectro de atuação

frente aos fungos filamentosos, tendo sido capaz de inibir A. niger, C. truntcatum, Neurspora

sp. e T. viridae e, em segundo lugar, por sua ótima atividade contra as larvas de Ae. Aegypti

(100% mortalidade). Apresentou saponinas (metabólito secundário), inibidor de tripsina,

ureases, quitinases, toxinas e baixa atividade de β-1,3 – glucanases. Todos esses compostos

podem sozinhos ou em conjunto estar prejudicando o crescimento dos fungos. Esses micro-

organismos são responsáveis pelas perdas mais importantes em culturas desde do início do

cultivo de plantas por seres humanos (HARVEY, 1978), tornando seu controle de grande

importância. Na literatura, a capacidade das quitinases purificadas do germe do trigo de inibir

o crescimento do fungo T. viridae foi descrito por Schlumbaum et al. (1986). Morais, em

2007, mostrou que o fungo A. niger tem seu crescimento prejudicado quanto posto em contato

com uma toxina da Soja (SBTX). O fungo C. truncatum, causador de antracnose na soja, está

envolvido em perdas consideráveis desta cultura no Brasil (WRATHER et al., 1997), por isso

sustâncias que atuem em seu controle são de grande interesse.

Em relação à forte atividade larvicida apresentada por E. contortisiliquum, as

saponinas podem ser as responsáveis, bem como qualquer outra substância capaz de interagir

com alguma parte da larva, como por exemplo, as quitinases por serem capazes de degradar

quitinas que estão presentes na membrana peritrófica dos insetos, ou mesmo agir sobre sua

cutícula (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005).

210

Já a espécie P. moniliformis destacou-se por sua forte atividade quitinolítica e

razoável atividade de β-1,3 – glucanases e de ureases em adição alta toxicidade apresentada às

larvas de Ae. Aegipty, capazes de causar 100% de mortalidade. Apresentou ainda, inibidores

de tripsina e a presença de atividade proteolítica, bem como de fenóis, flavonas, flavonois,

xantonas e taninos. Ademais é utilizada na medicinda popular para tratar sinais e sintomas que

são indicativos de ação antifúngica e foi encontrada atividade contra os fungos A. niger e C.

truncatum.

O uso de plantas medicinais no tratamento de doenças de pele, incluindo infecções

fúngicas, é uma prática antiga adotada em muitas regiões do mundo (IROBI; DARAMBOLA,

1993). Este uso tem sido apoiado pela ciência através do isolamento de compostos com

atividade antifúngica a partir de extratos de plantas (COSTA et al., 2000; PASSOS et al.,

2002). Portanto, a existência de agentes antifúngicos no extrato bruto de P. moniliformis

auxilia na comprovação de seu uso medicinal. As xantonas, assim como outros compostos

fenólicos, também foram descritas como possuidores de atividade antifúngica (REYES-

CHILPA; JIMENEZ-ESTRADA; ESTRADA MUÑIZ, 1997; MOREL et al., 2000; KHAN;

KIHARA; OMOLOSO, 2002; ZHANG et al., 2002; HAY et al., 2003). Os flavonoides são

substâncias sintetizadas nas plantas em resposta a infecções microbianas (TSUCHIYA et al.,

1996; COWAN, 1999), por isso podem estar envolvidas nas atividades apresentadas.

As quitinases e β-1,3 – glucanases são comumente estudadas como antifúngicos por

hidrolisarem quitina e β-1,3 – glucanos que são os biopolímeros majoritários presentes na

parede celular dos fungos (WEBSTER, 1986). Muitas dessas enzimas que foram isoladas de

vegetais apresentaram atividade contra fungos fitopatogênicos isoladamente (SHENOY et al.,

2006; HO; NG 2007; COTA et al., 2007; ONAGA; TAIRA 2008; KUO et al. 2008) ou em

sinergismo (STINTZI et al., 1993; JACH et al., 1995). Somando-se a isso, as quitinases

também possuem atividades inseticidas por serem capazes de atuar nas estruturas contendo

quitina presentes em insetos (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005). De acordo com o

encontrado para P. moniliformis, já foi descrito que proteínas contendo quitinas de B.

thuringiensis apresentaram-se tóxicas para larvas de Ae. aegypti, causando alto percentual de

mortalidade (THAMTHIANKUL et al., 2001).

O que merece destaque para a espécie S. rugosa é a capacidade de impedir o

crescimento de bactérias S. aureus e B sibtilis e a presença de metabólitos secundários de

diferentes classes como: compostos fenólicos – clachonas e fenóis; terpenos - saponinas e

triterpenoides. Apresentou baixa atividade larvicida para o mosquito da dengue e baixa

211

atividade de inibidor de tripsina e de urease. Possui também atividade hemaglutinante,

quitinases e elevada atividade de β-1,3 – glucanases.

Um metabólito secundário da família dos terpenos já foi isolado da espécie vegetal

Acmela brasiliensis Spreng e possui atividades antibacterianas (WILKINS et al., 2002),

antifúngicas (SARTORI et al., 2003), larvicida (BATISTA; CHIARI; OLIVEIRA, 1999) e

antinociceptiva (BLOCK et al., 1998). Inclusive já foi demonstrado que os terpenos são ativos

contra diversos micro-organismos (COWAN, 1999; DORMAN; DEANS, 2000; WILKINS,

2002). Diante disso, pode-se especular a ação de saponinas e triterpenoides encontrados em S.

rugosa contras as espécies S. aureus e B sibtilis. Ademais, compostos fenólicos com

propriedades antimicrobianas efetivas contra S. aureus e resistentes à meticilina já foram

encontradas e muitos desses compostos foram isolados (XU; LEE, 2001; ZACCHINO et al.,

2001). As proteínas encontradas nessa espécie também podem estar atuando contra bactérias.

S. aureus e B subtilis são bactérias patogênicas para seres humanos e responsáveis por

graves infecções em pacientes imunodeprimidos (RANG; DALE; RITTER, 1997;

SCHAECHTER et al., 2002), por isso seu controle é de extrema importância e a espécie S.

rugosa pode ser estudada nessa intenção.

Na presença de patógenos (fungos, bactérias e vírus) as plantas produzem compostos

com propriedades que permitem sua proteção contra os ataques, por essa razão muitos autores

referem-se às plantas usadas na medicina tradicional como uma das fontes de pesquisa mais

promissoras para novos compostos biológicos ativos (ZACCHINO et al., 1998; URBINA et

al., 2000; ZACCHINO et al., 2001; SARTORI et al., 2003), fato esse, também comprovado

neste trabalho. A busca por subtâncias antifúngicas converge na procura por alvos específicos

para as células de fungos, tais como inibidores de biossíntese do ergoesterol, inibição de

topoisomerases ou ainda compostos que atuem na parede celular uma vez que a célula fúngica

é semelhante às células humanas e por isso, muitos compostos ativos acabam sendo tóxicos

para o homem, devendo ter utilização restrita (ZACCHINO et al., 2001). De forma

semelhante, compostos inseticidas atuantes em alvos que não estão presentes nos seres

humanos são relevantes para seu uso na engenharia genética, de forma a proteger culturas

economicamente importantes, sem causar prejuízo aos seres que irão consumir alguma parte

dessa planta. Dessa forma, a quitina torna-se um alvo de interesse por não fazer parte da

constituição do homem e, as quitinases se sobressaem por atuarem nesse composto.

As quitinases são amplamente usadas na biotenologia para a produção de protoplastos

(MANOCHA; ZHONGHUA, 1997), para o controle biológico de patógenos de plantas

(fungos, insetos, bactérias) para a bioconversão de produtos, bem como na indústria

212

farmacêutica para a produção de quitohexoses e quitopentoses devido suas propriedades

antitumorais e produção de antifúngicos para o homem (DAHIYA; TEWARI; HOONDAL,

2006).

Diante do grande potencial de utilização das quitinases, a espécie vegetal apresentando

a mais elevada atividade específica dessa enzima e concomitante atividade biológica em

modelos possivelmente susceptíveis a essa enzima e, ainda, que apresentem grande

necessidade de combate, foi escolhida para sua purificação. A espécie que melhor se

enquadrou nessa categoria foi a P. moniliformis Benth., sendo utilizada para um estudo mais

aprofundado de suas quitinases.

5.8 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de

Piptadenia moniliformis Benth.

A espécie vegetal P. moniliformis Benth. selecionada, destacou-se, principalmente,

devido à presença de elevada atividade quitinásica no extrato bruto dialisado de suas

sementes, além de ser repositório de outras moléculas biologicamente ativas, como já relatado

anteriormente. Dessa forma, a atividade quitinásica foi escolhida para monitorar a purificação

da(s) proteína(s) responsável(éis) por essa atividade.

A purificação da(s) quitinase(s) presente(s) em sementes de P. moniliformis, iniciou-se

com a obtenção do extrato bruto (EB) a partir da farinha de suas sementes como descrito no

item 4.2 que apresentou um rendimento de 33,07 ± 1,22 mgP/gF. Uma alíquota do extrato

bruto (30 mgP) foi submetida à cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose,

previamente equilibrada com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. As proteínas não

retidas na matriz foram eluídas com o mesmo tampão de equilíbrio, resultando em três frações

proteicas, denominadas D1 – primeira fração não retida na matriz de DEAE-celulose; D2 –

segunda fração não retida na matriz de DEAE-celulose e D3 – terceira fração não retida na

matriz de DEAE-celulose. Em seguida, foi adicionado 0,2 M de NaCl para a retirada de D4

(primeira fração retida na matriz de DEAE-celulose) e, logo após, adicionado 0,4 M de NaCl

para a eluíção de D5 (segunda fração retida na matriz de DEAE-celulose) (FIGURA 1).

213

FIGURA 1 – Cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose. Extrato bruto (30

mgP), preparado a partir de farinha das sementes de Piptadenia moniliformis Benth., foi

aplicado em matriz de DEAE-celulose (14,0 cm x 2,7 cm), equilibrada com tampão acetato de

sódio 0,05 M, pH 5,2. As frações proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de

percolação da coluna e denominadas D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE,

D2 - 2ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE, D3 - 3ª Fração proteica não retida na

matriz de DEAE. As frações proteicas retidas foram eluídas com a adição de 0,2 M e 0,4 M

de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominadas de D4 - 1ª fração proteica retida na DEAE e

D5 - 2ª fração proteica retida na DEAE. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 6,0 mL/tubo.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1 16 31 46 61 76 91 106 121 136 151 166 181

fração 6 ml

AB

S 2

80 n

m

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

[ ] d

e N

aCl

D1 D3

D2

D4

D5

214

Desse modo, o extrato bruto de P. moniliformis foi separado em cinco frações

proteicas, sendo três não retidas (D1, D2 e D3) e duas retidas (D4 e D5), mostrando a

eficiência da matriz trocadora aniônica, DEAE-celulose, na separação das proteínas dessa

semente, que é uma vantagem, devido o grau de heterogeneidade de proteínas aí presentes.

O Extrato bruto de P. moniliformis e as cinco frações proteicas obtidas após o processo

de cromatografia em matriz de DEAE-celulose foram dialisados e submetidas à determinação

de atividade quitinásica, no intuito de verificar a fração detentora de maior atividade. O

resultado apresentado na TABELA 6 mostra, que todas as frações proteicas apresentaram

atividade de quitinase, mas aponta D1 como a fração de maior atividade quitinásica (3,74 ±

0,18 nKat/mgP) em relação as demais (D2, D3, D4 e D5), posto que variaram de 0,11 ± 0,03

(D5) a, no máximo, 0,64 ± 0,15 (D2).

O valor de atividade quitinásica obtido para D1 é cerca de 3 vezes maior que o

valor obtido para o extrato bruto dialisado (1,13 ± 0,03), mostrando um aumento na

purificação das proteínas com atividade de quitinase e confirmando a eficiência dessa

cromatografia para o que foi proposto. Então, essa fração proteica foi escolhia para dar

continuidade ao processo de purificação, sendo avaliada suas proteínas por eletroforese.

O perfil eletroforético do extrato bruto (EB) de P. moniliformis e de D1 pode ser

visualizado na FIGURA 2. No extrato bruto (raia 2) há uma predominância de bandas

proteicas entre 50 e 20 kDa, apresentando maior concentração de proteínas nas faixas de 40,

36, 24 e 20 kDa que são massas moleculares relativamente baixas (< 45 kDa).

Em D1 as faixas de maior concentração de proteínas verificadas em EB não estavam

mais presentes, mas o número de bandas proteicas foi aumentado, estendendo-se de,

aproximadamente, uma altura de 80 até 14,0 kDa, com maior número de bandas entre as

alturas de 66 a 20 kDa. Esse fato pode ser explicado devido ao aumento de purificação de

umas proteínas em detrimento de outras, o que as tornam mais visíveis.

D1 foi dialisada (cut-off 12 kDa) exaustivamente contra água, liofilizada e,

posteriormente, submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina (FIGURA 3).

Uma alíquota de D1 foi ressuspendida em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2

(11,4 mgP) e aplicada em coluna de cromatografia de afinidade em matriz de quitina,

equilibrada com o mesmo tampão. Esse procedimento resultou na obtenção de uma fração não

retida (Q1), obtida apenas com o tampão de equilíbrio, e de duas outras frações retidas, sendo

a primeira eluída com ácido acético 0,05 M e denominada Q2 e a segunda fração proteica

retida na matriz de quitina foi eluída com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 e denominada Q3.

215

TABELA 6 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas do extrato

bruto de Piptadenia moniliformis Benth. quando submetido a uma cromatografia de troca

iônica em matriz de DEAE-celulose

FRAÇÕES PROTEICAS ATIVIDADE QUITINÁSICA

nKat/mgP

Extrato Bruto dialisado 1,13 ± 0,03

D1 3,74 ± 0,18

D2 0,64 ± 0,15

D3 0,40 ± 0,07

D4 0,18 ± 0,03

D5 0,11 ± 0,03


216

FIGURA 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-

mercaptoetanol (2,5%) do Extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. e da 1ª Fração

proteica não retida oriunda do extrato bruto de P. moniliformis quando submetido a

cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE –Celulose, revelada com nitrato de prata.

Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1- MM = marcadores de massa

molecular: α-lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1

kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa,

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo –

45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa; Raia 2 – Extrato bruto; Raia 3 – 1ª Fração proteica

não retida na matriz de DEAE-celulose.

1 2 3

29,0

66,0

45,0

36,0

20,1 24,0

14,2

217

FIGURA 3 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina. D1- 1ª Fração proteica não

retida na matriz de DEAE (11,4 mgP) foi aplicada em matriz de quitina (10,2 cm x 1,5 cm),

equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. A fração proteica não retida foi

eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada Q1. A primeira fração proteica

retida na matriz de quitina foi eluída com ácido acético 0,05 M e denominada Q2 e a segunda

fração proteica retida na matriz de quitina foi eluída com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 e

denominada Q3. Fluxo da fração proteica não retida: 30 mL/h, fluxo da fração retida: 45 ml/h.

Frações: 3,0 mL/tubo.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121

fração 3 ml

Abs

280

nm

Ac. Acético 0,05 M

Q1 Q2

Q3

Tampão glicina 0,01 M, pH 9,0

218

A princípio, Q1 e Q2 embora tivessem apresentado picos de absorbância a 280 nm

muito baixos, foram consideradas frações, uma vez que, em alguns casos, picos de

absorbâncias baixos possuem quantidades consideráveis de proteínas. No entanto, após a

dosagem de proteínas, pelo método de Bradford (1976), dos picos em questão, não foi

verificado a presença de proteínas nem mesmo com a união dessas frações oriundas de mais

três cromatografias. Por isso, não foi possível a determinação de atividade quitinásica dessas

frações. Desse modo, a cromatografia de afinidade em matriz de quitina não se mostrou

eficiente na separação das proteínas presentes na fração D1, já que só foi possível a retirada

das proteínas aplicadas em uma única fração (Q3) com um aumento brusco de pH (de

aproximadamente 3,0 para 9,0), o que mostrou forte interação dessas proteínas à matriz de

quitina, tornando necessário testes com outras matrizes cromatográficas.

Outro passo cromatográfico realizado para o fracionamento de D1 foi a

utilização de uma matriz trocadora de cátions, a CM-sepharose (FIGURA 4), uma vez que

essa fração proteica não ficou retida em DEAE-celulose que é uma matriz de características

contrárias. Sendo assim, D1 (31,35 mgP) foi submetido à cromatografia de troca iônica em

coluna de CM-sepharose, resultando na obtenção de frações proteicas não retidas (FNR-CM)

eluídas com tampão de equilíbrio (acetato de sódio 50 mM, pH 5,2) e frações proteicas retidas

(FR-CM), que foram eluídas com o tampão de equilíbrio acrescido de 0,2 M, 0,6 M e 1M de

NaCl (FIGURA 4).

O perfil cromatográfico apresentado na FIGURA 4 mostra a predominância de

proteínas nas frações não retidas (FNR-CM), em detrimento às frações retidas, ou seja, nas

condições experimentais testadas, a maioria das proteínas presentes em D1 não ficou

adsorvida na matriz de CM-sepharose, levando a hipótese de que a maioria das proteínas

parecia estar com carga líquida igual à zero. Quando realizada a determinação de atividade

quitinásica para todas as frações, apenas a fração não retida apresentou tal atividade. Diante

dos resultados, esse passo cromatográfico foi, portanto, descartado.

O processo de purificação prosseguiu utilizando outra cromatografia de afinidade, a

“affi-gel blue gel. Essa matriz é um gel de agarose covalentemente ligado a um corante

“Cibacron®” azul F3GA que tem a característica de purificar uma grande variedade de

proteínas, das mais variadas origens, pelo fato do corante azul funcionar como ligante iônico,

hidrofóbico, aromático ou devido ao seu sítio de ligação estericamente ativo em várias

aplicações.

219

FIGURA 4 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose. D1 - 1ª Fração

proteica não retida na matriz de DEAE (31,35 mgP) foi aplicada em matriz de CM –

sepharose (16,5 cm x 2,1 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A

fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada

FNR-CM. As frações proteicas retidas foram eluídas com a adição de 0,2 M, 0,6 M e 1M de

NaCl ao tampão de equilíbrio e denominadas de FR-CM. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 6,0

mL/tubo.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121

Fração 6 ml

Abs

280

nm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

[ ] N

aCl

FRN-CM FR-CM

220

Tem sido utilizada para a purificação de diversas proteínas bioativas (CHU; LIU; NG,

2003; XIA; NG, 2004; XIA; NG, 2005; WANG; NG, 2005; WANG; NG, 2006a,b; WANG;

NG, 2007) e é indicada para a purificação de enzimas, incluindo quitinases (WANG et al.,

2009).

Alíquotas de D1 (3,33 mgP) foram, então, submetidas à cromatografia de afinidade em

matriz de “affi-gel blue gel” (FIGURA 5) e sua aplicação resultou em três frações não retidas

à coluna: primeira, segunda e terceira fração não retida na matriz de “affi-gel blue gel”

denominadas de A1, A2 e A3, respectivamente, obtidas pela percolação da coluna com o

tampão de equilíbrio (tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2). O material retido foi eluído

com o mesmo tampão acrescido de NaCl 0,5 M originando A4, fração retida na matriz de

“affi-gel blue gel”. A adição de NaCl 1,5 M ao tampão de equilíbrio não foi capaz de retirar

mais nenhuma fração proteica.

Essa matriz foi eficiente na separação das proteínas não retidas na matriz de DEAE-

celulose (D1), obtendo-se 4 picos cromatográficos pelo monitoramento da absorbância a 280

nm. Embora as três primeiras frações não tenham aparecido como picos isolados, foi possível

sua separação e monitoramento de atividade biológica. Resultado esse, não conseguido nas

duas tentativas (cromatografias anteriores) anteriores.

As frações A1, A2, A3 e A4, provenientes da cromatografia de afinidade em matriz de

“Affi-gel blue gel” foram avaliadas quanto a sua capacidade em hidrolisar quitina (TAELA

7). A1 concentrou a maior atividade específica para quitinase (15,04 ± 0,57 nKat/mgP),

seguida de A4 (5,81 ± 0,20 nKat/mgP) e A2 (1,37 ± 0,24 nKat/mgP). Não foi detectada

atividade quitinásica para a fração A3.

A atividade apresentada por A1 foi de 13,41 vezes maior do que a encontrada para o

extrato bruto de P. moniliformis e 4,02 vezes maior que a atividade de D1, mostrando que

essa cromatografia foi capaz não só de separar as proteínas presentes em D1 como também de

aumentar consideravelmente a purificação das proteínas com atividade quitinásica. Dessa

forma, a matriz em questão tornou-se o terceiro passo no processo de purificação dessas

proteínas.

Entretanto, o rendimento de proteínas dessas etapas de purificação não foi muito

animador, já que ocorreu grande perda de proteínas a cada passo cromatográfico, passando de

um rendimento de 33,07 ± 1,22 mgP/gF presentes no extrato bruto para 0,059 ± 0,005 mgP/gF

em A1.

221

FIGURA 5 – Cromatografia de afinidade em matriz de Affi-gel blue gel. D1 - 1ª Fração

proteica não retida na matriz de DEAE (3,33 mgP) foi aplicada em matriz foi Affi-gel blue gel

(12,5 cm x 1,7 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. As frações

proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e denominadas A1

- 1ª Fração proteica não retida na matriz de Affi-gel blue gel, A2 - 2ª Fração proteica não

retida na matriz de Affi-gel blue gel, A3 - 3ª Fração proteica não retida na matriz de Affi-gel

blue gel. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,4 M de NaCl ao tampão de

equilíbrio e denominadas de A4 - 1ª fração proteica retida na Affi-gel blue gel . Fluxo das

frações não retidas: 20 mL/h, fluxo da fração retida : 30 ml/h. Frações: 3,0 mL/tubo.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121

Fração 3 ml

Abs

280

nm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

[ ]M

NaC

l

A1

A2 A3

A4

222

TABELA 7 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas de D1

quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de “Affi-ge Blue gel”.


nKat/mgP

A1 15,04 ± 0,57

A2 1,37 ± 0,24

A3 0,0 ± 0,0

A4 5,81 ± 0,20

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata.

223

O perfil eletroforético da primeira fração não retida na matriz de “affi-gel blue gel”

(A1) (FIGURA 6) apresentou-se mais limpo em relação ao de D1 (FIGURA 2) com menor

número de bandas proteicas na faixa de 97 a 40 kDa, onde foi visualizado apenas uma banda

na altura de, aproximadamente, 80 kDa e outra na altura de 66,0 kDa. Abaixo de 40 kDa foi

verificada a presença de bandas em torno dos marcadores moleculares de 31,0 e 21,4 kDa e

uma banda proteica na altura do marcador de 14 kDa.

Para uma fração proteica mais pura, ou seja, com maior número de quitinases em

relação ao de outras proteínas, era necessário dar continuidade à purificação para a utilização

da mesma na avaliação de atividades biológicas importantes, como atividades contra vetores

de doenças e antimicrobianas. Dessa forma, foi escolhido outro passo cromatográfico, a

matriz de CM-sepharose, para a tentativa de separação das proteínas presentes na fração

proteica A1.

Essa matriz foi novamente escolhida por se tratar de uma matriz com alta capacidade

de ligação e devido sua estabilidade química e física elevada. Essa matriz não foi eficiente na

separação das proteínas presentes em D1 nas condições anteriormente testadas, mas o perfil

cromatográfico poderia ser melhorado se fosse utilizado a adição de 1 M de NaCl ao tampão

acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 para a retirada do material que ficou retido na coluna. Dessa

forma, talvez, ao invés de vários picos retidos indefinidos com baixa leitura a uma

absorbância de 280 nm, seria possível a obtenção de um único pico, com absorbância maior

mais bem definido.

Foi pensando dessa forma que A1 (10 mgP) foi submetida à cromatografia de troca

iônica em matriz de CM-sepharose (FIGURA 7) equilibrada com tampão acetato sódio 50

mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de equilíbrio da coluna e

denominada FNR-CM2. Para a retirada da fração proteica retida na matriz de CM-sepharose

(FR-CM2) foi adicionado NaCl 1M ao tampão de equilíbrio como havia sido pensado.

No entanto, essa tentativa não foi muito bem sucedida pelo fato dessa fração retida não

apresentar proteínas quando dosadas pelo método de Bradford (1976), o que era de se esperar,

após a análise do cromatograma, visto que aumentos de leitura à absorbância de 280 nm dessa

fração foram quase inexistentes. O que leva a concluir que todas as proteínas presentes em A1

saíram na fração não retida na matriz, não sendo possível o aumento da purificação.

Mais uma vez foi necessária a tentativa de outro passo cromatográfico. Dessa vez a

matriz selecionada foi, novamente, a matriz de quitina.

224


mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de D1 quando submetida à cromatografia

de afinidade em matriz de “Affi-gel blue gel”, revelada com nitrato de prata. Em cada poço

foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1- MM = marcadores de massa molecular:

lisozima - 14,0 kDa, inibidor de tripsina da soja – 21,4 kDa, anidrase carbônica – 31,0 kDa,

ovalbumina – 45,0 kDa, albumina sérica bovina – 66,2 kDa, fosforilase B – 97,4, β-

galactosidase – 116 kDa, miosina – 212 kDa; Raia 2 – 1ª Fração proteica não retida na matriz

de “Affi-gel blue gel”.

66,0

31,0

45,0

21,4

14,0

116,0 97,4

1 2

225

FIGURA 7 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose. A1 - 1ª Fração

proteica não retida na matriz de Affi-gel blue gel (10 mgP) foi aplicada em matriz de CM –

sepharose (10,5 cm x 2,1 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A

fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada

FNR-CM2. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 1M de NaCl ao tampão de

equilíbrio e denominadas de FR-CM2. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 5,0 mL/tubo.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

1 11 21 31 41 51 61 71

Fração 5 ml

Abs

280

nm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

[ ] M

NaC

l

FNR-CM2

FR-CM2

226

Foi insistido na utilização dessa matriz por funcionar como afinidade para proteínas

que se ligam a quitina ou mesmo para quitinases, tendo sido usada com sucesso para a

purificação total, parcial ou verificação da capacidade de ligação dessas proteínas com a

matriz (FREITAS, 2006; GIFONI, 2009).

A1 (10 mgP) foi aplicado na cromatografia de afinidade em matriz de quitina

(FIGURA 8) previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. O

processo cromatográfico resultou em uma fração não retida, retirada com o tampão de

equíbrio (FQ1) e uma fração retida retirada com tampão glicina 0,01 M pH 9,0 (FQ2). Tal

fração apresentou-se como um pico bem definido característico de material de elevado grau

de pureza. A utilização de ácido acético 0,05 M não foi capaz de promover a saída de

nenhuma fração proteica.

As frações FQ1 e FQ2 foram analisadas quanto à quantidade de proteínas por

Bradford, rendimento, determinação de atividade quitinásica e quanto ao seu perfil

eletroforético.

Em relação ao rendimento proteico, FQ1 apresentou 0,02 mgP/gF ± 0,002 mostrando

um rendimento muito baixo, posto que corresponde a apenas 0,06 % em relação ao conteúdo

de proteínas presentes no extrato bruto. Além disso, seu rendimento proteico foi três vezes

menor em relação à quantidade de proteínas presentes na fração A1, que já era baixo. FQ2

obteve um rendimento bem maior de proteínas, cerca de 13 vezes maior que FQ1, com 0,27 ±

0,01 mgP/gF. Esse valor representa 0,82% das proteínas presentes no extrato bruto, o que

ainda é baixo, visto que não chega nem a 1 % do total de proteínas extraídas de sementes de

P. moniliformis.

Embora as frações tenham apresentado um baixo rendimento proteico, a determinação

de atividade quitinásica das frações FQ1 e FQ2 foi realizada. O resultado apresentado na

TABELA 8 aponta FQ1 como a fração de maior atividade quitinásica (5,56 ± 0,41 nKat/mgP)

em relação a FQ2 (0,79 ± 0,04 nKat/mgP), no entanto o valor encontrado para essa fração é

quase três vezes menor que a atividade quitinásica apresentada por A1. Esse resultado não foi

favorável ao objetivo de aumentar a purificação de proteínas com atividade quitinásica, tendo

em vista que ao invés de aumentar a atividade específica com a diminuição de proteínas, o

que ocorreu foi um decréscimo na atividade.

A eletroforese das frações proteicas oriundas da cromatografia de afinidade em matriz

de quitina após a aplicação de A1 (FIGURA 9) mostra que o perfil das proteínas de FQ1 e

FQ2 são diferentes, provando que essa matriz foi capaz de promover a separação das

proteínas presentes em A1.

227

FIGURA 8 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina. A1- 1ª Fração proteica não

retida na matriz de “Affi-gel blue gel” (10 mgP) foi aplicada em matriz de quitina (11,5 cm x

1,6 cm), equilibrada com tampão Acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não

retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada FQ1. A fração proteica

retida na matriz de quitina foi eluída com tampão glicina 100 mM, pH 9,0 e denominada FQ2.

Fluxo da fração proteica não retida: 30 mL/h, fluxo da fração proteica retida: 45 ml/h.

Frações: 1,5 mL/tubo.

TABELA 8 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas de A1

quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de Quitina


nKat/mgP

FQ1 5,56 ± 0,41

FQ2 0,79 ± 0,04


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171

Fração 1,5 ml

Abs

280

nm

Ácido acético 50 mM

Glicina 100 mM, pH 9,0

FQ1

FQ2

228


mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de A1 quando submetida à cromatografia

de afinidade em matriz de quitina, revelada com nitrato de prata. Em cada poço foram

aplicados 3 µgP de cada amostra. Raias 1- MM = marcadores de massa molecular: lisozima -

14,0 kDa, inibidor de tripsina da soja – 21,4 kDa, anidrase carbônica – 31,0 kDa, ovalbumina

– 45,0 kDa, albumina sérica bovina – 66,2 kDa, fosforilase B – 97,4, β-galactosidase – 116

kDa, miosina – 212 kDa; Raia 2 – Fração proteica não retida na matriz de quitina; Raia 3 –

Fração proteica retida na matriz de quitina.

1 2

66,0

31,0

45,0

21,4

14,0

212,0

116,0 97,4

31,0

45,0

21,4

14,0

116,0 97,4

66,0

1 3

229

O perfil de FQ1 é parecido com o perfil das proteínas presentes em A1, com exceção

de algumas proteínas; uma na altura do marcador molecular de 66,0 kDa, algumas que estão

abaixo de 31 kDa e umas que estão entre os marcadores de 21,4 e 14 kDa, que aparecem no

perfil de FQ2 (indicados com setas pretas na FIGURA 9). Houve um aumento de bandas de

proteínas próximas ao marcador de 45 kDa e uma maior concentração proteica na altura de

66,0 kDa na eletroforese da fração FQ1.

A análise do cromatograma da FIGURA 8, do perfil de proteínas por eletroforese

(FIGURA 9), do rendimento de proteínas e da determinação de atividade quitinásica

(TABELA 8) das frações FQ1 e FQ2, leva a concluir que o pico cromatográfico referente à

fração FQ2, embora tenha se apresentado de forma bem definido, que condiz com seu perfil

eletroforético limpo, com poucas bandas proteicas, sua atividade quitinásica (0,79 ± 0,04

nKat/mgP) foi cerca de 19 vezes menor que a apresentada pela fração A1 (15,04 ± 0,57

nKat/mgP) do passo cromatográfico anterior.

A capacidade de FQ1 em hidrolisar quitina também não foi mais eficiente que a de

A1. Esses achados mostram que a utilização de A1 na cromatografia em matriz de quitina foi

capaz, apenas, de separar suas proteínas em duas frações proteicas com baixo rendimento e

sem aumentar a purificação das proteínas com atividade quitinásica. Isso inviabilizou o uso

dessa matriz no prosseguimento da maior purificação de proteínas com atividade quitinásica.

Em virtude do baixo rendimento proteico (0,059 ± 0,005 mgP/gF) da primeira fração

não retida na matriz de “Affi-gel blue gel” (A1) e das tentativas não bem sucedidas de

aumentar a purificação dessa fração (FIGURA 10), uma nova estratégia para aumentar a

purificação de proteínas com atividade quitinásica foi proposta, visto que, alguns ensaios

biológicos requerem uma grande quantidade de proteínas, o que tornaria difícil o acúmulo de

A1 para a realização dos mesmos. Além do que, quanto mais pura a fração a ser utilizada,

maior será o entendimento do seu modo de ação.

230

FIGURA 10 - Esquema da tentativa de purificação de proteínas com atividade quitinásica

presentes em sementes de Piptadenia moniliformis. F = Fração; N = Não e R = Retida.

1a FNR

D1 Fração com maior atividade

quitinásica

EXTRATO BRUTO

2a FNR D2

3a FNR D3

1a FR D4

2a FNR D2

DEAE - celulose

Quitina

1a FR Q3

Única fração

proteica presente

CM- s e p h a r o s

1a FNR FNR –CM

Atividade quitinásica

apenas nessa fração

1a FR FR –CM

↓ Quantidade de proteínas

“Affi-gel blue gel”

1a FNR

A1 Fração

com maior atividade

quitinásica, porém com

baixo rendimento

2a FNR A2

3a FNR A3

1a FR A4

CM-sepharose

1a FNR FNR-CM2 Única fração

proteica presente

FNR FQ1

Atividade quitinásica, maior,

embora menor que A1

Baixo rendimento.

FR FQ2

Dificuldade no acúmulo de material para ensaios biológicos

Quitina

231

5.9 Re-estruturação da Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes

em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth.

O rendimento das proteínas foi o fator crucial para uma reestruturação na purificação

das proteínas com atividade quitinásica. Esse fato tornou-se mais acentuado após a

necessidade de utilização de outro lote de sementes de P. moniliformis Benth. originaria dos

depósitos de armazenamento do banco de sementes do Ibama, da floresta do Araripe (Crato,

CE). A quantidade de proteínas extraídas com a utilização desse novo lote de sementes passou

a ser de 10,21 ± 0,20 mgP/gF, o que representa perda superior a três vezes em relação à

quantidade de proteínas das sementes usadas inicialmente (33,07 ± 1,22 mgP/gF). Esse

achado pode ser justificado devido ao local e época de coletas distintos, bem como pelo maior

tempo de armazenamento das sementes.

Diante desse fato, tornou-se necessário aumentar a concentração de proteínas com

atividade quitinásica antes da utilização dos passos cromatográficos. Assim sendo, o extrato

bruto de P. moniliformis foi submetido ao fracionamento com sulfato de amônio sólido nas

faixas de saturação de 0-30%, 30-70% e de 70-100%. Posteriormente, foi analisada a

atividade específica de quitinase para cada fração e verificado que tal procedimento não foi

capaz de atingir o objetivo almejado, pois nenhuma delas apresentou atividade específica

superior a do extrato bruto, e sim bem inferiores (dados não mostrados). Ao invés de testar

outras faixas de saturação com sulfato de amônio, para a precipitação de proteínas, foi usado o

ácido tricloroacético (TCA) por sua rapidez, simplicidade e eficiência na purificação de

diversas proteínas (FIELDING; RYALL, 1971; YEANG; YUSOF; ABDULLAH, 1995;

BEZERRA, 2010) Alíquotas do extrato bruto foram precipitadas com solução aquosa de

TCA 10%, para obter frações proteicas com concentração final de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e

3,0% de TCA e denominadas de F 0,5; F 1; F 1,5; F 2; F 2,5 e F 3, respectivamente.

Posteriormente foram analisadas quanto à determinação de atividade quitinásica (TABELA 9)

e quanto ao perfil de proteínas por eletroforese (FIGURA 11).

Segundo a TABELA 9, a F 2 foi fração possuidora da maior atividade específica para

quitinase (0,62 ± 0,01), sendo menor que a atual atividade encontrada para o extrato bruto

(0,98 ± 0,03). Esse novo valor de atividade determinada para o extrato bruto apresentou uma

redução de 13% em relação à atividade quitinásica encontrada para o primeiro lote de

sementes utlilizados (1,13 ± 0,03). Isso se deve ao fato da redução de atividade total ter

acompanhado a diminuição da quantidade total de proteínas extraídas das novas sementes.

232

TABELA 9 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas do extrato

bruto de Piptadenia moniliformis Benth. quando submetido à precipitação com ácido

tricloroacético (TCA) em diferentes concentrações

AMOSTRAS ATIVIDADE QUITINÁSICA

nKat/mgP

Extrato Bruto Dializado 0,98 ± 0,03

F 0,5 0,29 ± 0,01

F 1 0,44 ± 0,02

F 1,5 0,59 ± 0,01

F 2 0,62 ± 0,01

F 2,5 0,19 ± 0,0

F 3,0 0,0 ± 0,0


233

FIGURA 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-

mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das frações proteicas obtidas do

fracionamento com ácido tricloroacético (TCA). Em cada poço foram aplicados 1 µgP de

cada amostra. Raia 1- MM = marcadores de massa molecular: lisozima - 14,0 kDa, inibidor

de tripsina da soja – 21,4/19,7 kDa (duplo), anidrase carbônica – 31,0 kDa, ovalbumina – 45,0

kDa, albumina sérica bovina – 66,2 kDa, fosforilase B – 97,4, β-galactosidase – 116 kDa,

miosina – 212 kDa; Raia 2 – Extrato bruto; Raia 3 – Fração TCA 0,5%; Raia 4 – Fração

TCA 1,0%; Raia 5 – Fração TCA 1,5%; Raia 6 – Fração TCA 2,0%; Raia 7 – Fração TCA

2,5%; Raia 8 – Fração TCA 3,0%.

1 2 3 4 5 6 7 8

31,0

45,0 66,0

116,0 97,4

21,4

14,0

234

A partir do aumento de inclusões de TCA concentrando 3 % houve uma perda total de

atividade quitinásica, mostrando que níveis maiores que 2,5 % desse ácido, parecem estar

causando desnaturação das proteínas de interesse levando a perda de sua função.

O perfil da eletroforese da FIGURA 11 mostra que todas as frações precipitadas por

TCA apresentaram perfis semelhantes, com exceção da F 1,5 que apresentou bandas acima da

altura do marcador de massa molecular de 21,4 e nas proximidades do marcador de 30 kDa.

Todas as frações apresentaram-se com menos bandas proteicas em relação ao extrato bruto. F

1,5 possui atividade específica (0,59 ± 0,01) próxima de F 2 (0,62 ± 0,01), embora mais baixa.

Em seu perfil eletroforético, há presença de maior número de bandas de proteínas que F2.

Além disso, F 2 apresentou um rendimento de 2,66 ± 0,06 mgP/gF, representando 26% das

proteínas presentes no estrato bruto, sendo superior ao rendimento de D1 oriundo da primeira

etapa de purificação do protocolo anterior. Isso tornou F 2 a fração escolhida para ser

submetida aos procedimentos subseqüentes de purificação.

5.10 Cromatográfia de Troca Iônica de F 2 em Matriz de CM-sepharose

A fração proteica de sementes de P. moniliformis proveniente do fracionamento do

extrato bruto com TCA, na concentração final de 2,0% (denominada de F 2), após diálise e

liofilização, foi submetida à cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose com

uma alíquota contendo 10 mg de proteína (FIGURA 12). A fração não adsorvida na matriz foi

eluída com tampão acetato de sódio, 50 mM, pH 5,2 e denominada C1. A fração proteica

adsorvida foi eluída com a adição de NaCl 0,25 M ao tampão de percolação da coluna e

denominada de C2. As frações proteicas foram subseqüentemente dialisadas exaustivamente

contra água destilada e submetidas aos ensaios para determinação da atividade quitinásica.

A TABELA 10 mostra que C1 concentrou maior atividade específica para quitinase

(2,10 ± 0,11), em torno de 90 % a mais que C2 (0,14 ± 0,03) e, apresentou atividade cerca de

duas vezes maior que a encontrada para ao extrato bruto (0,98 ± 0,03). Esse resultado mostra

que o aumento da purificação de proteínas com atividade quitinásica foi possível, no entanto

para verificar se houve eficiência na separação das proteínas de F 2, uma eletroforese em gel

de poliacrilamida com o extrato bruto e as frações proteicas foi realizada (FIGURA 13).

235

FIGURA 12 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose. Fração TCA 2%

(10 mgP) foi aplicada em matriz de CM – sepharose (7,5 cm x 2,2 cm), equilibrada com

tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão

de percolação da coluna e denominada C1. A fração proteica retida foi eluída com a adição de

0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominada C2. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 3,0

mL/tubo.

TABELA 10 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas da

fração TCA 2% quando submetida a uma cromatografia de troca iônica em matriz de CM-

sepharose.


nKat/mgP

C1 2,10 ± 0,11

C2 0,14 ± 0,03


C1

C2

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

1 11 21 31 41 51 61 71

Fração 3 ml

Abs

280

nm

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

[ ] M

NaC

l

C1 C2

236


mercaptoetanol (2,5%) e revelada com nitrato de prata das proteínas do extrato bruto de

Piptadenia moniliformis Benth. e de suas frações proteicas obtidas do fracionamento com 2%

de TCA seguido de cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose. Em cada poço

foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1- MM = α-lactoalbumina do leite bovino -

14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0

kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo

de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa; Raia 2 –

Extrato bruto de P. moniliformis Benth; Raia 3 – Fração TCA 2%; Raia 4 – Fração proteica

não retida na matriz de CM-sepharose (C1); Raia 5 – Fração proteica retida na matriz de CM-

sepharose (C2).

1 2 3 4 5

66,0

45,0

36,0 29,0

20,1 24,0

14,2

237

A eletroforese mostra que houve separação das proteínas presentes em F 2, posto que

C1 (raia 4) e C2 (raia 5) apresentaram perfil proteico diferente. C1 concentrou a maioria das

proteínas de F 2, encontrando-se quase todas na região entre os marcadores moleculares de

45,0 e 20,1 kD, com exceção de uma banda proteica que apareceu acima do marcador de 45,0

kDa e outra na altura do marcador de 14 kDa. A faixa de concentração de proteínas em C1 é

condizente com as massas moleculares de quitinases de plantas que geralmente apresentam

massas moleculares variando de 25 – 45 kDa (SAHAI; MANOCHA 1993; WANG et al.,

2009). As bandas proteicas da fração C2 apareceram em menor número, sendo uma localizada

acima do marcador de 66,0 kDa, duas abaixo de 20,1 kDa e uma banda abaixo de 14,0 kDa.

Os perfis eletroforéticos apresentados por C1 e C2 estão de acordo com o resultado de

determinação de atividade quitinásica dessas frações, onde C1 apresenta bandas de proteínas

em alturas que correspondem às de quitinases de plantas com atividade quitinolítica maior que

C2, que possui poucas bandas proteicas na altura de quitinases vegetais.

Pelo exposto, a cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose foi eficiente

não só em separar a F 2 em duas outras frações (C2 e C2) com também em aumentar a

purificação de proteínas com atividade quitinásica. Essa matriz trocadora de cátions também

foi utilizada com sucesso para a purificação de quitinase de leguminosa por Wang et al.

(2009), mostrando sua eficiência.

C1 possui 0,1 ± 0,02 mgP/gF que representa 0,98% das proteínas presentes no extrato

bruto. Assim sendo, C1 foi a fração escolhida para dar continuidade ao processo de

purificação.

5.11 Cromatográfia de Troca Iônica de C1 em Matriz de Resource Q Acoplada ao

Sistema de FPLC

A fração proteica, denominada C1, proveniente de cromatografia de troca iônica em

matriz de CM-sepharose foi aplicada à coluna de troca iônica em matriz de Resource Q

acoplada ao sistema de FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”) (FIGURA 14). Apenas

duas frações proteicas foram observadas (as demais eram isentas de proteínas), a fração que

não interagiu com a matriz foi retirada com o tampão de equilíbrio, acetato de sódio 0,05 M

pH 5,2, e denominada de RQ1.

238

FIGURA 14 – Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao sistema de

FPLC. C1 – Fração proteica não retida na matriz de CM-sepharose (2 mgP) foi aplicada em

matriz de Resource Q (6,4 mm x 30 mm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM,

pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e

denominada RQ1. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,1 M de NaCl ao

tampão de equilíbrio e denominada de RQ2. Fluxo: 0,5 mL/min; Frações: 0,5 mL/tubo.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

1 11 21 31 41 51 61 71

Fração 0,5 ml

Abs

280

nm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

[ ] M

NaC

l

RQ1

RQ2

239

A fração que interagiu com a resource Q foi eluída após a adição de 0,1 M de NaCl ao

tampão de equilíbrio e denominada RQ2. As frações proteicas obtidas foram dialisadas,

liofilizadas e utilizadas no ensaio de determinação da atividade quitinásica, onde ambas

apresentaram atividade específica para quitinase semelhantes (dados não mostrados). Esse

achado apontou que poderiam se tratar de proteínas semelhantes. Para tanto, a eletroforese em

gel de poliacrilamida dessas frações foi realizada (FIGURA 15).

O perfil eletroforético de RQ1 e RQ2 foram iguais, mostrando que se tratavam da

mesma fração proteica. A matriz de trocadora aniônica, Resource Q, não foi capaz de

promover a separação das proteínas presentes em C1. Esse resultado foi um tanto inesperado

dado o fato de essa matriz ter sido escolhida, justamente, devido a sua capacidade de

promover a separação em alta resolução de biopolímeros, sendo bastante utilizado na

purificação de proteínas, como no caso das proteínas putificadas por Sheehan; O’sullivan,

2004, Gifoni, 2009 e Bezerra, 2010).

Diante da dificuldade na obtenção de uma única quitinase (FIGURA 16) e do

insucesso de separação de C1 por uma cromatografia de alta resolução, aliado ao rendimento

proteico considerável e à elevada atividade quitinásica, essa fração foi escolhida para a

utilização em ensaios biológicos, usando modelos experimentais de importância econômica

para o homem, plantas e animais. A fração proteica C1 será mencionada, a partir de agora,

como Fração proteica de sementes P. moniliformis (PmFP), dada sua origem. Seu esquema de

purificação encontra-se na FIGURA 16.

5.12 Detecção e Dosagem de Proteínas Bioativas na Fração Proteica de Sementes de

Piptadenia moniliformis (PmFP)

A fração proteica de sementes de P. miniliformis (PmFP) possui quitinases em sua

composição, dada a elevada atividade quitinolítica apresentada. No entanto, o conhecimento

de outras possíveis proteínas presentes na PmFP é relevante para um melhor direcionamento

quanto sua atuação nos diferentes modelos biológicos testados.

240


mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das frações proteicas de C1 obtidas

quando submetidas a uma cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao

sistema de FPLC. Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1- MM = α-

lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa,

tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa,

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo –

45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa; Raia 2 –Fração proteica não retida na matriz

resource Q (RQ1) ; Raia 3 - Fração proteica retida na matriz resource Q (RQ2).

1 2 3

45,0

29,0

20,1

66,0

36,0

24,0

14,2

241

FIGURA 16 – Esquema de purificação da fração proteica de sementes de Piptadenia

moniliformis com elevada atividade quitinásica.

EXTRATO BRUTO

0,5 % de TCA

(F 0,5)

Fracionamento com TCA

1,0 % de TCA (F 1)

1,5 % de TCA

(F 1,5)

2,0 % de

TCA

(F 2) Fração de

maior atividade

quitinásica

2,5 % de TCA

(F 2,5)

3,0 % de TCA (F 3)

CM- sepharose

FNR

(C1) Fração de

maior atividade

quitinásica

FR (C2)

Resource Q

FNR (RQ1)

FR (RQ2)

Frações iguais

PmFP

242

Sabe-se que a quitina, juntamente com β-1,3-glucano representam o maior

componente estrutural da parede celular da maioria dos fungos patogênicos e há relatos que

quitinases e glucanases de plantas possuem atividade antifúngica contra uma variedade desses

fitopatógenos (BARTNICK-GARCIA, 1968; WESSELS; SIETSMA, 1981 SCHLUMBAUM

et al., 1986; LEAH et al., 1991; ASAO et al., 1997; TABEI et al., 1998; YAMAMOTO et

al., 2000; ALCAZAR-FUOLI et al., 2010), além de atividade inseticida (GOMES et al.,

1996). Algumas quitinases também apresentam atividade de lisozima sendo capaz de degradar

peptídeoglicanos da parede celular de bactéria (BOLLER et al., 1983; MAUCH; MAUCH-

MANI; BOLLER, 1988; MAJEAU et al., 1990; RADUTOIU et al. 2003; KAKU et al. 2006).

Os inibidores de protease de plantas, entre suas várias funções, também participam da

defesa vegetal contra o ataque de patógenos frente a vários micro-organismos patogênicos

além dos fungos e dos insetos (FRANCO; MELO, 2000; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002;

KIM et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2007; REVINA et al., 2010).

Assim sendo, foram determinadas as atividades biológicas de proteínas já bem

descritas na literatura frente aos modelos escolhidos (fungos, bactérias e insetos), dentre

aquelas anteriormente encontradas no extrato bruto de sementes de P. moniliformis, como:

atividade inibitória de tripsina e de quimiotripsina, atividade quitinásica, glucanásica e de

protease (TABELA 11).

PmFP apresentou atividade inibitória de tripsina de 4.582,62 UI/mgP, que representa

25% de inibição na atividade da enzima tripsina padrão e atividade inibitória de

quimiotripsina de 3.764,91 UI/mgP, representando apenas 19% de inibição em relação a

atuação da enzima padrão. Embora os valores de atividade específica sejam elevados, o

percentual de inibição enzimática foi baixo, quando comparados à atividade de outros

inibidores, como, por exemplo, o inibidor de tripsina purificado de sementes de Poecilanthe

parviflora (PPTI), que inibe a atividade catalítica da tripsina em 65% e, em menor extensão,

também foi efetivo sobre a quimotripsina (> 40%) (GARCIA et al., 2004), o PKTI-22,

inibidor de tripsina purificado de Solanum tuberosum, foi capaz de inibir a tripsina em mais

de 90 % (REVINA et al., 2010) e o ApTKI, inibidor de sementes de Adenanthera pavonina

que reduz a atividade da tripsina em 97% (MIGLIOLO et al., 2010). Dessa forma, conclui-se

que PmFP possui baixa inibição para as enzimas tripsina e quimiotripsnia, e as atividades

específicas elevadas podem ser justificadas pela baixa quantidade de proteína utilizada nos

ensaios de determinação das atividades de tripsina e quimiotripsina.

243

TABELA 11 - Detecção e Dosagem de proteínas bioativas da fração proteica de sementes de

Piptadenia moniliformis (PmFP)

Proteínas Bioativas PmFP

Inibidor de tripsina

(UI/mgP)* % de Inibição 4.582,62 25

Inibidor de quimotripsina

(UI/mgP) % de Inibição 3.764,91 19

Quitinase (nKat/mgP) § 2,10 ± 0,11

Glucanase (nKat/mgP) # ND

Protease (UA/mgP)** ND

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata. ND = Não Detectada.

* UI/mgP, onde uma unidade de inibição é definida como o decréscimo em 0,01 na

absorbância a 440 nm no ensaio de atividade inibitória sobre a quimotripsina segundo Erlanger

et al. (1961).

§ nKat/mgP, onde 1 nKat representa 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo. # nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo.

** UA/mgP, onde uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que

produz um aumento de 0,01 unidades de absorbância a 420 nm.

244

Não foi detectada atividade de β-1,3-glucanase e nem atividade proteolítica total em

PmFP, apenas atividade quitinásica (2,10 ± 0,11 nKat/mgP), como já mencionado

anteriormente (TABELA 11). A unidade de atividade (U) quitinásica utilizada neste trabalho

é o nKat, que representa 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo. Além dessa

forma de expressar a unidade de atividade (U), existem outras como o µg de N-acetil-D-

glucosamina liberado por minuto que é utilizada por muitos pesquisadores que trabalham com

quitinase. Então, se a atividade específica de PmFP for convertida para essa outra unidade, a

mesma passará a ser de 27,4 ± 1,45 U/mgP, sendo catorze vezes maior que a de uma quitinase

recombinante de trigo que apresentou atividade específica de 1,9 U/mgP (SINGH;

KIRUBAKARAN; SAKTHIVEL, 2007) e seis vezes maior que a quitinase da cevada (4,2

U/mgP), purificada após clonagem e expressão (KIRUBAKARAN; SAKTHIVEL, 2007).

Pode-se dizer que PmFP possui uma elevada atividade quitinolítica, quando

comparada a quitinase recombinante de cevada, justamente por se tratar de uma fração

proteica e não de uma proteína pura “superexpressada”.

Esse resultado sugere que a atividade biológica a ser apresentada por essa fração

poderá ser, principalmente, pela presença das proteínas com atividade de quitinase, já que as

outras atividades testadas não estavam presentes ou apresentaram-se em baixo percentual.

5.13 Ensaios Biológicos

Após a obtenção, determinação e apresentação das cracterísticas das proteínas

presentes em PmFP (FIGURA 16 e TABELA 11), partiu-se para a determinação das

atividades biológicas dessa fração.

A escolha dos modelos para os ensaios biológicos foi devido sua importância clínica e

fitopatológica, bem como devido ao conhecimento de determinadas funções das proteínas

presentes em PmFP. Dessa forma, a fração proteica de P. moniliformis foi avaliada quanto à

presença de atividade inibitória do crescimento de fungos leveduriformis (4 cepas) e de

fungos fitopatogênicos (4 espécies), inibitória do crescimento bacteriano (4 cepas) e, ainda,

atividade inibitória da eclosão de ovos e larvicida contra Ae. aegypti.

245

5. 13.1 Atividade Antifúngica – Fungos Leveduroformis e Filamentosos

5.13.1.1 Ensaio de Inbição do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido

A PmFP, em diferentes concentrações (500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,62 µg/mL), foi

testada quanto sua capacidade em inibir o crescimento das leveduras C. albicans, C.

tropicalis, S. cerevisiae e P. anomala. A ovoalbumina (500 µg/ml) e o formol (0,04%) foram

usados como controles negativo (permite o crescimento das leveduras) e positivo (impede o

crescimento das leveduras), respectivamente (FIGURA 17).

O resultado do ensaio de inibição do crescimento das leveduras C. albicans e P.

anomala por PmFP mostrou que não foi possível impedir o crescimento de ambas, em

nenhuma das concentrações testadas, ao contrário, o crescimento foi favorecido em relação ao

controle negativo testado (albumina). A C. albicans merece destaque na micologia médica

devido a sua alta patogenicidade que leva a necessidade de encontrar novas substâncias com

capacidade inibitória para ela, o que não é muito fácil, dado vários trabalhos citados na

literatura com esse propósito que também não tiveram êxito como, por exemplo o realizado

por Pretto (2005), Pelegrine et al. (2006), além do realizado com extrato bruto e as frações de

Plinia glomerata, uma planta com potencial medicinal da mata atlântica brasileira, também

não apresentou potencial inibitório para C. albincans, apenas para outros micro-organimos

(SERAFIN et al., 2007). Esse fato pode ser explicado considerando que a parede celular dos

fungos age como barreira protetora, impedindo a entrada de extratos, frações ou compostos

puros, ou estes não estão atuando em processos que resultem em inibição do curso de vida

normal desse patógeno (SELITRENNIKOFF, 1992; SELITRENNIKOFF, 2001).

Contrapondo-se a esse fato, C. albicans foi inibida por extratos aquosos de Momordica

charantia, Schinus terebinthifolius e Schinus molle em uma triagem de agentes antifúngicos

em plantas medicinais e alimentares (SCHMOURLO et al., 2005).

As curvas de crescimento da levedura C. tropicalis em todas as concentrações de

PmFP testadas, com exceção da maior concentração (500 µg/mL), foram menores que a do

controle negativo albumina, sendo as concentração de 250 e 125 µg/mL capazes de promover

redução de cerca de 50 e 30% no crescimento de C. tropiaclis, respectivamente. Esse

resultado foi semelhante ao encontrado para a curva de crescimento de S. cerevisiae, diferindo

apenas no percentual de redução da curva de crescimento para as concentrações de 250 e 125

µg/ml que foram um pouco inferiores, cerca de 40% para ambas as concentrações.

246

FIGURA 17 - Curvas de crescimento de quatro leveduras crescidas em caldo BHI (Brain

Heart Infusion), pH 5, 0, contendo diferentes concentrações da fração proteica de P.

moniliformis (Pm-FP). Pm-FP 500 µg/mL; Pm-FP 250 µg/mL; Pm-FP 125

µg/mL; Pm-FP 62,5 µg/mL ; Pm-FP 31,25 µg/mL; Pm-FP 15,62 µg/mL;

Formol 0,4%; (controle positivo) e Ovoalbumina 500 µg/mL (controle negativo). Os

valores do Coeficiente de variação para cada ponto foram ≤ 10 %.

Candida albicans Saccharomyces cerevisiae

Candida tropicalis Pichia anomala

-0,10

0,1

0,20,30,40,50,60,7

0,80,9

1

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (h)

A60

0 n

m

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (h)

A6

30 n

m

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (h)

A60

0 nm

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (h)

A60

0 nm

247

Entre os fungos unicelulares, as leveduras do gênero Candida representam a maior

causa de infecções fúngicas nos seres humanos, particularmente a C. albicans e C. tropicalis

que são responsáveis por 46% dos casos de infecção, tendo se tornado maior causa de

mortalidade entre pacientes imunodeprimidos (CARLISLE; GUCALP; WIERNIK, 1993;

GEORGOPAPADAKOU; TKACZ, 1995; RUY, 2007). O aumento da incidência de

infecções e da resistência a antifúngicos comercialmente utilizados para esses patógenos

impulsionaram pesquisas na busca de melhores alternativas de combate e o uso de extratos e

proteínas de vegetais são fortes candidatos (ANAISSIE et al., 1989; GHANNOUM e RICE,

1999; LOGUERCIO et al., 2005). Portanto, PmFP, tendo sido capaz de proporcionar redução

no crescimento de C. tropicalis pode vir a ser usada, após pesquisas mais refinadas, como

uma dessas alternativas para ajudar no combate a esse patógeno.

5.13.1.2 Ensaio de Inbição do Crescimento de fungos filamentosos em Meio Líquido

A atividade inibitória do crescimento de fungos filmentosos foi testada com

concentrações decrescentes (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml) da PmFP frente aos fungos

Aspergillus niger, Penicillium herguei, Fusarium solani e Rhizoctonia solani. Foram usados

como controles negativo, a ovoalbumina (500 µg/mL) e positivo, o peróxido de hidrogênio 10

mM, como pode ser visto na FIGURA 18.

Os fungos citados foram escolhidos como modelo de estudo por se tratarem de

fitopatógenos causadores de perdas consideráveis em culturas importantes como a do milho

(Fusarium, Aspergillus e Penicillium), a da soja (Fusarium, Aspergillus e Penicillium e

Rhizoctonia) e a do feijão-de-corda (R. solani) (FERNANDES, 2005a; SARTORATO, 2010;

PATOLOGIA DE SEMENTES, 2011)

O resultado da FIGURA 18 mostra que os fungo A. niger, F. solani, R. solani e P.

herguei, não tiveram seu crescimento inibido por nenhuma concentração de PmFP testada,

tendo sido estimulado o crescimento desse último fungo quando comparado ao controle

negativo ovoalbumina.

248

FIGURA 18- Curvas de crescimento de quatro fungos crescidos em caldo YPD (Yeast Potato

Dextrose), contendo diferentes concentrações da fração proteica de Piptadenia moniliformis

(Pm-FP). Pm-FP 500 µg/mL; Pm-FP 250 µg/mL ; Pm-FP 125 µg/mL;

Pm-FP 62,5 µg/mL; Pm-FP 31,25 µg/mL; Tampão fosfato de sódio 50 mM, pH

5,2; Peróxido de Hidrogênio 10 mM (controle positivo); Ovoalbumina 500 µg/mL

(controle negativo). Os valores do Coeficiente de variação para cada ponto foram ≤ 10 %.

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 12 24 36 48 60 72

Tempo (h)

A63

0 nm

Aspergillus niger Fusarium solani

Penicillium herguei Rhizoctonia solani

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

0 12 24 36 48 60 72

Tempo (h)

A63

0 nm

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 12 24 36 48 60 72

Tempo (h)

A63

0 nm

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 12 24 36 48 60 72

Tempo (h)

A63

0 nm

249

A ausência de atividade antifúngica da fração proteica de P. moniliformis (PmFP) não

foi esperada, dada à presença de forte atividade quitinásica que é reconhecidamente capaz de

degradar parede celular de fungos, uma vez que a quitina é o maior componente estrutural de

parede de fungos fitopatogênicos (KUDAN; PICHYANGKURA, 2009). Além disso, o

extrato bruto dessa espécie é ativo contra o fungo A. niger, como pode ser visto na TABELA

5. No entanto, nem toda quitinase é ativa contra todos os fungos e algumas quitinases de

plantas e de bacterias são desprovidas de atividade antifúngica (KAWASE et al., 2006).

Ademais, a amostra testada neste trabalho não se tratava de uma quitinase pura, e sim de uma

mistura de proteínas contendo quitinases, o que poderia atrapalhar, de alguma forma, a

atuação das quitinases não prejudicando o ciclo de vida dos fungos testados.

Verburg e Huynh (1991) purificaram uma quitinase de Arabidopsis thaliana e

verificaram sua capacidade em inibir o crescimento do fungo T. reesei, no entanto o

crescimento dos fungos A. solani, F. oxysporum, S. sclerotiorum, G. Graminis e P.

megasperma, não foi inibido por essa quitinase. Resultado similar foi encontrado por

Broekhaert et al. (1988) onde quitinases de tabaco e de trigo foram ativas contra a germinação

de esporos e contra o crescimento de hifas dos fungos Trichoderma hamatum e Phycomyces

blakesleeanus, mas não do Botrytis cinerea. Em 2007, Ho e Ng purificaram duas proteínas

tipo quitinases de banana que apresentavam potencial antifúngico diferente para Fusarium

oxyporum e nenhuma delas era ativa contra Mycosphaerella arachidicola, indicando a

especificidade de ação antifúngica.

As quitinases, segundo Wang et al. (2009), parecem ter seu próprio epectro antifúngico

cracterístico, atuando apenas em determinadas espécies. Um estudo realizado por Yan et al.

(2008) sugere que esse fato pode estar correlacionado com a microestrutura de superfície e a

proporção de quitina presente na parede celular de cada fungo. Essa especificidade de atuação

pode contribuir para o desenvolvimeto do controle biológico de fungos patogênicos de

espécies particulares. Assim sendo, PmFP pode apresentar propriedades antifúngicas a

espécies ainda não testadas, por isso é importante verificar a atuação da PmFP frente a outros

fungos patogênicos no intuito de determinar seu espectro de ação.

250

5. 13. 2 Atividade Antibacteriana

5.13.2.1 Ensaio de Inibição do Crescimento de Bactérias em Meio Líquido

A FIGURA 19 mostra as curvas de crescimento das espécies Gram-positivas B.

subtilis e S. aureus, e das Gram-negativas E. aerogenes e S. choleraesuis, na presença de

PmFP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/mL), de Ovoalbumina (500 µg/mL), como controle

negativo e de formol 0,4%, como controle positivo.

As curvas de crescimento da bacteria B. subtilis foram menores na presença de PmFP,

em todas as concentrações, quando comparado com aquela contendo ovoalbumina, até

mesmo na menor concentração testada (31,25 µg/mL), a qual foi capaz de causar redução em

torno de 60% do crescimento dessa cepa Gram-positiva em relação ao controle negativo. O

mesmo resultado não foi obtido para a outra bactéria Gram-positiva, a S. aureus, posto que

PmFP, apenas nas mais baixas concentrações, foi capaz de causar leve diminuição na curva de

crescimento quando comparadas ao controle ovoalbumina. Basile et al. (2000) afirmaram que

na utilização de plantas para a avaliação de atividade antimicrobiana existe um perfil de

seletividade maior entre as bactérias Gram-positivas. Entretanto esse fenômeno também é

observado na outra classe bacteriana (SCHAECHTER et al., 2002).

Em relação às espécies Gram-negativas, PmFP não apresentou efeito significativo

sobre a E. aerogenes em nenhuma das concentrações testadas, mas sobre a S. choleraesuis,

PmFP, apenas na menor concentração (31,25 µg/mL), causou uma redução na curva de

crescimento de cerca de 2 vezes em relação ao crescimento da mesma cepa na presença de

ovoalbumina. Na realidade, o que parece acontecer é a estimulação do crescimento das

bactérias na presença de PmFP e, quanto mais baixa a concentração, menor é a curva de

crescimento, daí a redução no crescimento de S. choleraesuis e de S. aureus citados

anteriormente.

A estrutura das células bacterianas Gram-negativas tem sido associada à resistência a

diversos antimicrobianos, pois possuem uma membrana externa que não só dificultam a

entrada desses agentes como não permite que concentrações suficientes penetrem para causar

inativação da célula e, ainda, quando penetram, as bactérias possuem mecanismos

especializados (bombas de efluxos) para expulsar substâncias estranhas para fora da célula.

251

FIGURA 19 - Curvas de crescimento de quatro espécies de bactérias (2 Gram + e 2 Gram -)

crescidos em caldo nutritivo (Peptona e Extrato de levedura) contendo diferentes

concentrações da fração proteica de P. moniliformis (Pm-FP). Pm-FP 500 µg/mL;

Pm-FP 250 µg/mL; Pm-FP 125 µg/mL; Pm-FP 62,5 µg/mL; Pm-FP 31,25

µg/mL; Formol 0,4% (controle positivo); Ovoalbumina 500 µg/mL (controle

negativo). Os valores do Coeficiente de variação para cada ponto foram ≤ 10 %.

Bacillus subtilis Enterobacter aerogenes

Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuis

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (h)

A28

0nm

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (h)

A28

0nm

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (h)

A28

0nm

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (h)

A2

80nm

252

Além disso, possuem um espaço periplasmático, onde podem ser encontradas enzimas

degradantes que inativam alguns antibióticos, como os beta-lactâmicos, proteases, nucleases e

outros (TAVARES, 1999; SCHAECHTER et al., 2002; VAN BAMBEKE; MICHOT;

TULKENS, 2003).

Isso, pode explicar, pelo menos em parte, a dificuldade em encontrar novos agentes

antimicrobianos e a resistência das bactérias a esses compostos. Em consonância com esse

fato, um estudo realizado por Kumar et al. (2006), usando extratos de várias plantas

medicinas, concluiu que, no geral, as substâncias antibacterianas de plantas parecem inibir

mais as bactérias Gram-positivas do que as Gram-negativas.

De uma maneira geral, PmFP, não apresentou atividade antibacteriana potente frente

às cepas testadas, apenas proporcionou uma leve redução na curva de crescimento da bactéria

B. subtilis em relação ao controle negativo, ovoalbumina. No entanto, esse é um resultado

positivo que dever ser investigado mais detalhadamente, posto que ainda são poucas as

proteínas em relação a outros compostos, com atividade antibacteriana descritas na literatura

até o momento (NINGAPPA et al., 2010). E, diante da capacidade de adaptação e resistência

desses micro-organismos ainda existe a necessidade da busca constante por agentes com

propriedades antibacterianas.

5.13. 3 Atividade Inseticida

O modelo biológico escolhido para o ensaio de atividade inseticida foi o mosquito Ae.

aegypti por ser o principal vetor da dengue, doença que atinge o maior número de indivíduos

por ano, sendo responsável por inúmeras mortes em todo mundo. A primeira estratégia de

controle dessa doença é o combate ao seu vetor devido à ausência de vacinas eficientes

(WHO, 2009; JANSEN; BEEBE, 2010).

5.13.3.1 Ensaio de Determinação da Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes

aegypti

O efeito de PmFP em diferentes concentrações (1; 0,5; 0,250; 0,225; 0,200 e 0,175

253

mgP/ml) e dos controles negativos: albumina sérica bovina (BSA) (1 mgP/mL) e água

destilada sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência de larvas em 1º estádio de Ae. aegypti

estão apresentados na TABELA 12.

A fração proteica de P. moniliformis, nas concentrações de 1, 0,5 e 0,250 mgP/mL,

impediu completamente a eclosão dos ovos de Ae. aegypti, mostrando-se tóxica, uma vez que

a casca do ovo é uma estrutura impermeável e rígida que protege o embrião, desempenhando

um papel importante na sobrevivência do mosquito transmissor da dengue e da febre amarela.

A

A rigidez característica dos ovos de A. aegypti deve-se à presença de um material

semelhante à quitina em sua composição (BECKEL, 1958; MOREIRA et al., 2007). Há

outros relatos que sugerem que quitina é um componente da casca do ovo em outros insetos

(BECKEL, 1958; HARWOOD, 1958; POWELL; HOLLANDER; FUCHS, 1986; WILSON;

CRYAN, 1997; MOREIRA et al., 2007; MANSUR et al., 2010). Esses dados podem

justificar a atuação de PmFP, pelo fato dessa fração ser rica em proteínas com atividade

quitinolítica, capaz de degradar a quitina presente na casca desses ovos e inviabilizá-los.

A concentração de 0,225 mgP/mL de PmFP, apresentou baixo percentual de eclosão

dos ovos (11,66 ± 2,9) e mortalidade de cerca 33% entre as poucas larvas que eclodiram

(TABELA 12). As larvas que se mantiveram vivas apresentaram escurecimentos em toda a

sua estrutura, com ênfase no tórax, nos segmentos abdominais, incluindo o intestino médio e

os túbulos de malpighi (FUGURA 20). Além disso, as brânquias anais das larvas tratadas com

PmFP (FIGURA 20, 3b) encontraram-se extremamente amareladas, diferentemente do

controle BSA (FIGURA 20, 3a).

PmFP causou alteração na morfologia das larvas provavelmente pela ação das

quitinases, uma vez que o escurecimento das larvas é devido à sobreposição de cutícula dos

segmentos abdominais que pode ser causado por uma alteração na síntese e/ou na reabsorção

de quitina (SALVADOR, 2002; CAVALHEIRO, 2010). Além disso, proteína bruta de B.

thuringiensis contendo quitinases foi tóxica para larvas de Ae. aegypti, causando alto

percentual de mortalidade (THAMTHIANKUL et al., 2001).

Quantidades menores de PmFP (0,200 e 0,175 mgP/mL) permitiram maiores

percentuais de eclosão de ovos do inseto em estudo (58,3 ± 5,8; 96,66 ± 2,9,

respectivamente), mas ainda assim, foram capazes de causar mortalidade nas larvas do

mosquito da dengue (TABELA 12).

254

TABELA 12 – Efeito da fração proteica de Piptadenia moniliformis (PmFP) sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência de larvas em 1º estádio de

Aedes aegypti após 7 dias de exposição

Amostras Número de ovos

Número de eclosões

% Eclosão Número de larvas vivas

Número de larvas mortas

% Mortalidade*

BSA (1 mgP/mL) 20 20 ± 0 100 ± 0 20 ± 0 0 0

PmFP (1 mgP/mL) 20 0 0 ± 0 - - -

PmFP (0,500 mgP/mL) 20 0 0 ± 0 - - -

PmFP (0,250 mgP/mL) 20 0 0 ± 0 - - -

PmFP (0,225mgP/mL) 20 2,33 ± 0,6 11,66 ± 2,9 1,66 ± 1,5 0,66 ± 1,1 33,33 ± 5,7

PmFP (0,200mgP/mL) 20 11,76 ± 1,1 58,3 ± 5,8 9 ± 1,7 2,67 ± 0,6 23,31 ± 6,9

PmFP (0,175mgP/mL) 20 19,33 ± 0,6 96,66 ± 2,9 17 ± 1,0 2,33 ± 0,6 12,10 ± 3,2

Água destilada 20 20 ± 0 100 ± 0 20 ± 0 0 0


* Média do número de larvas mortas/ número de eclosões x 100;

255

FIGURA 20 – Fotomicrografia (50 x) das larvas de Aedes aegypti tradadas com BSA (1

mgP/mL) (a) e com PmFP (0,225 mgP/mL) (b). 1 – CA: Cabeça, TX: Tórax e AB: Abdômen;

2 – SR: Sifão respiratório e BA: Brânquias anais (75 x); 3 – Detalhes das Brânquias anais; 4 –

IM: Intestino Médio e TM: Túbulos de Malpighi; 4.1 – Detalhes do IM e TM.

2a

3a

4a

1b

2b

3b

4b

4.1b

1a CA

TX

AB

SR

BA

IM

TM

TM

2a

3a

4a

256

As alterações de escurecimento apresentadas pelas larvas tratadas com PmFP (0,250

mgP/mL) não estavam presentes nas larvas tratadas com essa fração na concentração de 0,175

mgP/mL (não mostrado). O que sugere uma atuação dose-dependente.

Poucos estudos que buscam alternativas de controle contra A. Aegypti testam a

toxicidade de compostos de planta sobre a eclosão de ovos quando comparados aos estudos

que utilizam larvas de terceiro estádio. O que não torna menos importante, posto que são os

ovos são o principal meio de dispersão do inseto, já que são capazes de resistir a longos

períodos de dessecação (450 dias), permitindo seu transporte a grandes distâncias e tornando-

se um sério obstáculo para sua erradicação (TELES, 2009).

Nesse contexo, o resultado apresentado neste trabaho, onde uma fração proteica de P.

moniliformis (de 1 a 0,250 mgP/mL) é capaz de causar inibição de eclosão de 100% nos ovos

causando alterações em sua estrutura, torna-se de elevada importância.

Resultado semelhante também foi encontado por Ramos et al. (2006), onde frações

proteicas do látex da planta Calotropis procera foram capazes de inibir 100% a eclosão de

ovos de Ae. Aegypti, só que em concentrações bem mais elevadas (10, 50 e 100 mgP/mL).

Broadbent e Pree (1984) relataram que quando ovos de Ae. Agypti são expostos a altas

concentrações de compostos, maior quantidade é capaz de penetrar na casca afetando a

embriogênese.

Outros estudos, usando metabólitos secundários de plantas, também investigaram o

percentual de eclosão dos ovos como o de Govindarajan e Karuppannan (2011), que testaram

vários extratos de folhas de Eclipta alba contra ovos de Ae. Aegypti. Aqueles autores

encontraram que o extrato metanólico apresentou atividade ovicida mais efetiva, sem eclosão

de nenhuma larva (100% de mortalidade) na concentração de 300 ppm.

A concentração capaz de inibir 50% de eclosão dos ovos de Ae. aegypti (CI50)

apresentada por PmFP foi de 204,418 ± 2,19117 µgP/mL, superior à encontrada por Prajapati

et al. (2005) para óleos essenciais de Curcuma longa (CI50 90,7 µg.mL-1) e Ocimun basilicum

(CI50 173,9 µg.mL-1). No entanto, as substâncias ativas apresentadas nos trabalhos acima

citados e na maioria dos trabalhos relatados na literatura, não são de natureza proteica o que

torna difícil a comparação. Desse modo, o resultado apresentado fica ainda mais interessante,

posto que novos compostos ativos contra o veículo de dispersão do mosquito da dengue estão

sendo revelados.

No intuito de verificar possíveis alterações nos ovos de Ae. aegypti, foi realizado,

novamente, o ensaio de atividade inibitória sobre a eclosão dos ovos usando PmFP na maior

concentração capaz de causar 100% de inibição de eclosão (1 mgP/mL, TABELA 12). Após

257

um período de sete dias, os ovos foram retirados e visualisados em estereomicroscópio

Tecnival® (FIGURA 21). Através das observações no microscópio, pôde-se constatar

alterações na morfologia dos ovos, já que a casca apresentou aspecto quebradiço e

transparente, em algumas regiões, sendo possível a passagem da luz do microscópio através

dele, sugestivo de fragilidade. Isso pode ter levado ao comprometimento embrionário. Esse

resultado é semelhante ao achado de Jarial (2001), onde extratos de alho causaram fissuras na

superfície dos ovos impedindo a eclosão das larvas.

Existem trabalhos mostrando que a quitina está presente em duas principais estruturas

extracelulares de insetos: cutícula, sintetizada por células epiteliais e a membrana peritrófica,

sintetizada pelas células de revestimento intestinal, desempenhando um importante papel no

reforço da estrutura do exoesqueleto e protegendo os insetos contra os estresses ambientais e

micróbios patogênicos (NEVILLE; PARRY; WOODHEAD-GALLOWAY, 1976;

TIMMERMANN; BRIEGEL, 1999; IBRAHIM et al., 2000; ZHU et al., 2002; DIAS FILHO

et al., 2002; ZIMOCH; MERZENDORF, 2002; ARAKANE et al., 2004; ARAKANE et al.,

2005; KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005; KATO et al., 2006). Essas estruturas

contendo quitina tem se tornado objeto de muitos estudos como alvo seguro de controle de

insetos devido sua ausência nos vertebrados (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005). Assim

sendo, PmFP pode desempenhar um importante papel no controle da disseminação desse

inseto, tornando-se relevante um estudo mais aprofundado.

258

FIGURA 21 – Fotomicrografia (50 x) dos ovos de Aedes aegypti tratados com PmFP (1

mgP/mL). (A); tratados com BSA (1mg/mL) (B); Detelhe da alteração dos ovos tratados com

PmFP (C).

AAAA BBBB

CCCC

259

6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO

As dez espécies vegetais da Caatinga apresentam vários compostos bioativos nos

extratos brutos de suas sementes originados do metabolismo primário (proteínas bioativas) e

do metabolismo secundário (metabólitos secundários), além de, algumas delas, apresentarem

atividades biológicas importantes frente a larvas de terceiro estádio de Ae. aegypti, fungos

fitopatogêncos e bactérias patogênicas para seres humanos, tornando-as promissoras fontes de

compostos antimicrobianos e inseticidas que podem ser aproveitados biotecnologicamente

para o controle natural de doenças de plantas e pelas indústrias farmacêuticas.

As espécies que se destacaram como possuidoras de um bom perfil bioativo foram: C.

bracteosa, D. megacarpa, E. contortisiliquum, P. moniliformis e S. rugosa, por terem

apresentado atividades frente a modelos biológicos de importância para o homem e/ou para as

plantas que podem estar associados aos compostos biativos por elas apresentados.

Dentre as espécies promissoras, foi isolada a fração proteica de P. moniliformis

(PmFP) contendo elevada atividade quitinásica que foi capaz de causar uma leve redução no

crescimento das leveduras S. cerevisiae e C. tropicalis, bem como na bactéria B. subtilis.

PmFP foi capaz de inibir a eclosão de ovos de Ae. aegypti com CI50 de 204, 42 ± 2,19 µgP/ml,

alterando a estrutura dos ovos por causar fissuras, além de causar modificações na morfologia

das larvas de primeiro estádio como o escurecimento em vários de seus segmentos.

260

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Um dos propósitos desse trabalho foi o conhecimento a respeito das potencialidades de

espécies vegetais nativas da caatinga, objetivando a agregação de valor a cada espécie, no

intuito de viabilizar o uso racional e sustentável das mesmas, além do objetivo de contribuir

para a descoberta de novas moléculas bioativas contra micro-organismos patogênicos para o

homem e para as plantas, novas fontes de proteínas, outros nutrientes e alimentos.

As metas do trabalho foram atingidas após a investigação da presença de metabólitos

secundários e proteínas na busca de substâncias bioativas presente nas sementes das dez

espécies, bem como com a determinação da composição dos vários nutrientes e antinutrientes

nesses grãos de leguminosas não convencionais estudadas. Já que, o presente estudo

proporcionou a comprovação de que estas espécies apresentam uma gama de compostos

bioativos possíveis de serem isolados e aproveitados para o combate a vetores causadores de

doenças humanas, biotecnologicamente para o controle natural de doenças de plantas e pelas

indústrias farmacêuticas, além da comprovação de que a composição nutricional dessas

sementes são possível de serem utiliadas para a alimentação humana e/ou animal.

Através desse trabalho vários caminhos foram abertos para diversas outras pesquisas

como: isolamento de qualquer um dos compostos bioativos detectados nas sementes

estudadas; investigação da ação desses compostos in vitro ou em modelos biológicos para

futuras utilizações agrícolas ou em indústrias farmacêuticas; estudos mais detalhados em

torno de cada nutriente determinado; investigação de nutrientes (vitaminas, por exemplo) e

antinutrientes não pesquisados; Isolamento de qualquer constituinte de interesse (fibras,

lipídios) para uma melhor análise e futura utilização pela indústria de alimentos, entre outras.

A necessidade de mais estudos em torno das sementes de leguminosas analisadas

torna-se evidente após a investigação da qualidade protéica da farinha das sementes da

espécie Piptadenia moniliformis Benth., apontada como mais promissora segundo o índice de

qualidade nutricional (IQN), que mostrou através das analises in vitro que embora seu perfil

de nutrientes seja bom, com elevada quantidade de proteínas e boa composição de

aminoácidos, quando analisadas in vivo não foi capaz de promover crescimento e

desenvolvimentos dos animais experimentais. Nem mesmo após tratamentos os térmicos

realizados. Quando um novo estudo foi conduzido com a retirada de outro potente fator

antinutricional, os α-galactosídeos, das farinhas de P. moniliformis, constatou-se uma leve

melhora nos parâmetros nutricionais avaliados. Isso comprova que estudos mais detalhados

261

com as sementes podem levar a descoberta do real fator que prejudica o aproveitamento dos

nutrientes desses grãos, processá-los de forma correta e torná-los possíveis de serem

utilizados como alimento no futuro.

Além disso, ensaios mais conclusivos podem ser feitos para o aproveitamento de

PmFP na diminuição da disperção dos ovos do mosquito da dengue, pelo dano que essa fração

protéica é capaz de causar na estrutura dos ovos e ainda prejuízo causados nas larvas que

deles eclodem.

Assim sendo, a presente pesquisa não só atingiu aos seus objetivos como contribuiu

para o aumento de objetos de pesquisa através da grande quantidade de conhecimentos

gerados.

262

263

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABU-TARBOUSH; H. M. Irradiation inactivation of some antinutritional factors in plant seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 46, p. 2698–2702, 1998. ADEBAJO, A. C.; OLOREK, K. J.; ALADESANMI; A. J. Antimicrobial activities and microbial transformation of volatile oils of Eugenia uniflora. Fitoterapia, v. 15, p. 451-455, 1989. AGBEDE, J. O.; ALETOR; V. A. Studies of the chemical composition and protein quality evaluation of differently processed Canavalia ensiformis and Mucuna pruriens seed flours. Journal of Food Composition and Analysis, v. 18, n. 1, p. 89–103, 2005. AGBONON, A.; GBEASSOR; M. Hepatoprotective Effect of Lonchocarpus sericeus Leaves in CCl4- Induced Liver Damage. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, v. 15, p. 216 – 226, 2009. AGRA, M. F.; BARACHO, G. S.; SILVA, N. K.; BASÍLIO, I. J. L. D.; COELHO, V. P. M. Medicinal and poisonous diversity of the flora of “Cariri Paraibano”, Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 111, p. 383–395, 2007. AGIZZIO, A. P.; CUNHA, M. D.; CARVALHO, A. O.; OLIVEIRA, M. A.; RIBEIRO, S. F. F.; GOMES, V. M. The antifungal properties of a 2S albumin-homologous protein from passion fruit seeds involve plasma membrane permeabilization and ultrastructural alterations in yeast cells. Plant Science, v. 171, p. 515-522, 2006. AGRIOS; G. N. Plant Pathology. Academic Press, London, 2000. AIRES, E. R. B.; FREITAS, B. M. Caracterização palinológica de algumas amostras de mel do estado do Ceará. Ciência Agronômica, v. 32, 8 pp., 2001. ALAJAJI, S. A.; EL-ADAWY, T. A. Nutritional composition of chickpea (Cicer arietinum L.) as affected by microwave cooking and other traditional cooking methods. Journal of Food Composition and Analysis, v. 19, p. 806–812, 2006. ALCAZAR-FUOLI, L.; CLAVAUD, C.; LAMARRE, C.; AIMANIANDA, V .; SEIDL-SEIBOTH, V.; MELLADO, E.; LATGÉ, J-P.; ALCAZAR-FUOLI, L. Functional analysis of the fungal/plant class chitinase family in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology, p. 1-12, 2010. ALEMAYEHU, G.; ABEGAZ, B.; SNATZKE, G.; DUDDECK, H. Bianthrones from Senna longiracemosa.Phytochemistry, v. 1993, n. 32, p. 1273-1277, 1993. ALENCAR, N. M.; CAVALCANTE, C. F.,; VASCONCELOS, M. P.; LEITE, K. B.; ARAGÃO, K. S.; ASSREUY, A. M. S.; NOGUEIRA, N. A. P.; CAVADA, B. S.; VALE, M. R. Anti-inflammatory and antimicrobial effect of lectin from Lonchocarpus sericeus seeds in an experimental rat model of infectious peritonitis. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 57, p. 919–22, 2005.

264

AL-KAISEY, M. T.; AL-HADITHI, T. R.; ALWAN, A. K. H. Effect of germination on flatulence causing oligosaccharides cowpeas (Vigna unguiculata). Mu’tah Journal of Research Study, v. 11, n.5, p.193–206, 1996. AL-KAISEY, M. T.; AL-HADITHI, T. R.; SAHEAD, B. A. A. Changes in vicine, convicine and oligosaccharides contents during germination of broad bean. Mu’tah Journal of Research Study, v.12, n.1, p. 327–345, 1997. AL-KAISEY, M. T.; MOHAMMED, M. A.; ALWAN, A. K. H.; MOHAMMED, M. H. The effect of gamma irradiation on the viscosity of two barley cultivars for broiler chicks. Radiation Physics and Chemistry, v. 63, p. 295–297, , 2002. ALMEIDA, C. F. C. B. R.; AMORIM, E. L. C.; ALBUQUERQUE, U. P.; MAIA, M. B. Medicinal plants popularly used in the Xingó region – a semi-arid location in Northeastern Brazil. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, v. 15, p. 1-7, 2006. ALMEIDA, S. P.; PROENÇA, C. E.; SANO, S. M., RIBEIRO, J. F. Cerrado, espécies vegetais úteis. Planaltina Embrapa - CPAC. Distrito Federal, 1998, pp. 464. ALONSO, R.; AGUIRRE, A.; MARZO, F. Effects of extrusion and traditional processing methods on antinutrients and in vitro digestibility of protein and starch in faba and kidney beans. Food Chemistry, v. 68, p. 159–165, 2000. ALTPETER, F.; DIAZ, I.; MCAUSLANE, H.; GADDOUR, K.; CARBONERO, P.; VASIL, I. K. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor Cme. Molecular Breeding, v. 5, n.1, p. 53-63, 1999. ALVES, A. A. Valor Nutritivo da Vagem de Faveira (Parkia platycephala Benth) para Ruminantes. Tese (Doutordo em Zootecnia). Departament de Zootecnia, Universidade Federal do Ceará, Fortalea, 2004. 198 p. ALVES, A. A.; SALES, R. O.; NEIVA, J. N. M.; MEDEIROS, A. N.; BRAGA, A. P.; AZEVEDO, A. R. Degradabilidade ruminal in situ de vagens de faveira (Parkia platycephala Benth.) em diferentes tamanhos de partículas. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, n.4, p.1045-1051, 2007. ALVES, T. M. A.; SILVA, A. F.; BRANDÃO, M.; GRANDI, T. S. M.; SMÂNIA, E. F. A.; SMÂNIA JUNIOR, A.; ZANI, C. L. Biological screening of Brasilian medicinal plants. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 95, n. 3, p. 367-373, 2000. AMAROWICZ, R.; PEGG, R. B. Legumes as a source of natural antioxidants.European Journal of Lipid Science and Technology, v.110, p. 865–878, 2008.

AMBIENTE BRASIL-AMBIENTE NATURAL (Caatinga). Disponível em http://www.ambientebrasil.com.br/composer.php3?base=./natural/index.html&conteudo=./natural/biomas/caatinga.html. Acesso em 2 de janeiro de 2011. AMORIM, E. L. C.; LIMA, C. S. A.; HIGINO, J. S.; SILVA L. R. S.; ALBUQUERQUE, U. P. Fitoterapia: Instrumento para uma melhor qualidade de vida. Infarma, v. 15, n. 1-3, p. 66-669, 2003.

265

AMUBODE, F. A.; FETUGA, B. L. Proximate composition and chemical assay of methionine, lysine, tryptophan in some Nigerian Forest trees. Food Chemistry, v. 12, p. 67–72, 1983. ANAISSIE, E. J.; BODEY, G. P.; WATTS, F. Z.; MOORE, A. L. Emerging fungal pathogens. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, v. 8, p. 323-330, 1989. ANDRADE-LIMA, D. Plantas da Caatinga. Academia Brasileira de Ciências, Rio de Janeiro, 1989. ANDRADE-LIMA, D. The Caatingas dominium. Revista Brasileira de Botânica, v. 4, p. 149 – 163, 1981. AOAC. Official Methods of Analysis of the Association of Analytical Chemists.15th ed. The Association: Arlimgton, VA,1990. AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC International.16th ed. Gaitheersburgh, 1997. AOAC - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTRY. Official Methods of Analysis. 2v, 16a ed, 4 rev., 1998. APG – ANGIOSPERM PHYLOGENY WEBSITE. Caesalpiniaceae. Dispnível em: < http://www.mobot.org/MOBOT/ResearchAPweb/welcome.htlm> Acesso em : 20 de dezembro de 2010. ARANDA P.; DOSTALOVA J.; FRIAS J.; LOPEZ-JURADO M.; KOZLOWSKA H.; POKORNY J.; URBANO G.; VIDAL-VALVERDE C.; ZDYUNCZYK Z. Nutrition. In: HEDLEY, C. L. (Eds), Carbohydrates in Grain Legume Seeds. Improving Nutritional Quality and Agronomic Characteristics. CAB International, Wallingford, UK, pp 61–87, 2001. ARAKANE, Y.; HOGENKAMP, D. G.; ZHU, Y. C.; KRAMER, K. J.; SPECHT, C. A.; BEEMAN, R. W.; KANOST, M. R.; MUTHUKRISHNAN, S. Characterization of two chitin synthase genes of the red flour beetle, Tribolium castaneum, and alternate exon usage in one of the genes during development. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 34, p. 291–304, 2004. ARAKANE, Y.; MUTHUKRISHNAN, S.; KRAMER, K. J.; SPECHT, C. A.; TOMOYASU, Y.; LORENZEN, M. D.; KANOST, M., R.; BEEMAN, W. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Molecular Biology, v. 4, p. 453–463, 2005. ARAÚJO FILHO, J. A.; CARVALHO, F. C.; GADELHA, J. A. et al. Fenologia e valor nutritivo de espécies lenhosas caducifólias da caatinga. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 35, 1998, Botucatu. Anais... Botucatu: SBZ, p.360-362, 1998.

266

ARAÚJO FILHO, J. A., CARVALHO, F. C., SILVA, N. L. Fenología y valor nutritivo de follajes de algunas especies forrajeras de la Caatinga. Agroforestería en Las Américas, v. 1, p. 33-34, 2002. ARAÚJO, F. S.; SAMPAIO, E. V. S. B.; FIGUEIREDO, M. A.; RODAL, M. J. N.; FERNANDES, A. G. Composição florística da vegetação de carrasco, Novo Oriente, CE. Revista Brasileira de Botânica, v. 21, p.105-116, 1998. ARAÚJO, F. F. Inoculação de sementes com Bacillus subtilis, formulado com farinha de ostras e desenvolvimento de milho, soja e algodão. Ciências e agrotecnologia. v. 32, n. 2, 2008. ARINATHAN, V.; MOHAN, V. R.; DE BRITTO, A. J. Chemical composition of certain tribal pulses in South India. International Journal of Food Science and Nutrition, v. 54, p. 209–217, 2003. ARMOUR, J. C.; PERERA, R. L. C.; BUCHAM, W. C.; GRANT, G. Protease inhibitors and lectins in soya beans and effects of aqueous heat-treatment. Journal of the Science of Food and Agriculture , v. 78, p. 225–31, 1998. ARMSTRONG, W. B.; KENNEDY, A. R.;WAN, X. S.; ATIBA, J.; MCLAREN, C. E.; MEYSKENS, F. L., JR. Single-dose administration of Bowman-Birk inhibitor concentrate in patients with oral leukoplakia. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, v. 9, p. 43 – 7, 2000. ARUN, A. B.; SRIDHAR, K. R.; RAVIRAJA, N. S.; SCHMIDT, E.; JUNG, K. Nutritional and antinutritional components of seeds of Canavalia spp. from the west coast sand dunes of India. Plant Foods for Human Nutrition , v. 58, p. 1–13, 2003. ASAO, H.; NISHIZAWA, Y.; ARAI, S.; SETO, T.; HIRAI, N.; YOSHIDA, K.; SHINMYO, A.; HIBI, T. Enhanced resistance against a fungal pathogen in transgenic strawberry expressing a rice chitinase gene. Plant Biotechnology. v. 14, p. 145–149, 1997. ASOLINI, F. C.; TEDESCO, A. M.; CARPESBRAZ, S. T. J. Antioxidant and Antibacterial Activities of Phenolic Compounds from Extracts of Plants Used as Tea. Brazilian Journal of Food Technology. v.9, n.3, p. 209-215, 2006. ATTELE, A. S.; WU, J. A.; YUAN, C. S. Ginseng pharmacology. Multiple constituents and multiple actions. Biochemical Pharmacology, v. 58, p. 1685–1693, 1999. AVROVA, A. O.; STEWART, H. E.; DE JONG, W. D.; HEILBRONN, J.; LYON, G. D BIRCH, P. R. A cysteine protease gene is expressed early in resistant potato interactions with Phytophthora infestans. Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 12, p. 1114–1119, 1999. BACCI, E. M.; SERTIE, J. A. A. Ação anti-úlcera de Styrax camporum Pohl and Caesalpinia ferrea Mart. Tenth . Brazilian simposium in Medicinal Plants. São Paulo, 1988, 619 p.

267

BAETHGEN, W. E.; ALLEY, M. M. A manual colorimetric procedure for measuring ammonium nitrogen in soil and plant Kjeldahl digests. Communications in Soil Science and Plant Analysis, v.20, n.9, 10, p. 961-96, 1989. BAJPAI, S.; SHARMA, A; GUPTA, M. N. Removal and recovery of antinutritional factors from soybean flour. Food Chemistry, v. 89, p. 497-501, 2005. BAJWA, R.; KHALID, A.; CHEEMA, T. S. Antifungal activity of allelopathic extracts. III. Growth response of some pathogenic fungi to aqueous extract of Parthenium hysterophorus. Pakistan Journal of Plant Pathology, v. 2, p. 145-156. 2003. BALADRIN, M. F.; KLOKE, J. A.; WURTELE, E. S.; BOLINGE, W. H. Natural plant chemicals. Source of industrial and medicinal materials. Science, v. 228, p.1054-1060, 1985. BALE, J. S.; VAN LENTEREN, J. C.; BIGLER, F. Biological control and sustainable food production. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences, p. 363, 761e776, 2008. BALOGUN, A. M.; FETUGA, B. L. Chemical composition of some under-exploited leguminous crop seeds in Nigeria. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 34, p. 189–192, 1986. BANERJI, A. P; FERNANDES, A. O. Field bean protease inhibitor preparations, unlike methotrexate, can completely suppress Yoshida sarcoma tumor in rats. Cell Biology International , v. 18, p. 1025–1034, 1994. BARBA, B.; DÍAZ J.G.; HERZ, W. Anthraquinones and other constituents of two Senna species. Phytochemistry, v. 31, p. 4374-4375, 1992. BARBOSA, A. M.; CUNHA, P. D. T.; PIGATTO, M. M.; CORRADI da SILVA, M. L. Produção e aplicações de exopolissacarídeos fúngicos. Semina, v. 25, p. 29-42, 2004. BARBOSA, A. M.; DEKKER, R. F. H.; GIESE, E. C. Bioactive oligosaccharides: production, biological functions and potential commercial applications. New York: Nova Science Publishers, 2010, 60 pp. BARBOSA, F. G.; OLIVEIRA, M. C. F.; BRAZ-FILHO, R.; SILVEIRA, E. R. Anthraquinones and naphthopyrones from Senna rugosa. Biochemical Systematics and Ecology, v. 32, p. 363–365, 2004. BARDOCZ, S.; BROWN, D. S.; GRANT, G.; PUSZTAI, A.; STEWART, J. C.; PALMER, R. M. Effect of the â-adrenoceptor agonist clenbuterol and phytohemagglutinin on growth, protein-synthesis and polyamine metabolism of tissues of the rat. British Journal of Pharmacology, v. 106, p. 476 482, 1992. BARDOCZ, S.; GRANT, G.; PUSZTAI, A.; FRANKLIN, M. F.; CARVALHO, A. D. F. U. The effect of phytohaemagglutinin at different dietary concentrations on the growth, body composition and plasma insulin of the rat. British Journal of Nutrition , v. 76, p. 613 626, 1996.

268

BARNES, J.; ANDERSON, L. A.; PHILLIPSON, J. D. St. John’s worth (Hypericum perforatum): A review of ch emistry, pharmacology and chemical properties. Journal of pharmacy and pharmacology, v. 53, p. 583-600, 2001. BARRETT, A. T. The cystatins: a new class of peptidase inhibitors. Trends in Biochemistry, v. 12, p. 193-196, 1987. BARROS, N. N; SOUSA, F. B.; ARRUDA, F. A. V. Utilização de forrageiras e resíduos agroindustriais por caprinos e ovinos. Sobral, EMBRAPA – CNPC, 1997, 28p. BARTNICK-GARCIA, S. Cell wall chemistry, morphogenesis, and taxonomy of fungi. The Annual Review of Microbiology, v. 22, p. 87–108, 1968. BASILE, A.; SORBO, S.; GIORDANO, S.; RICCIARDI, L.; FERRERA, S.; MONTESANO, D.; COBIANCHI, C. R.; VUOTTO, M. L.; FERRARA, L. Antibacterial and allelophatic activity of extract form Castana sativa. Fitoterapia, v. 71, p. 110-116, 2000. BASILE, A.; VUOTTO, M. L.; VIOLANTE, U.; SORBO, S.; MARTONE, G.; CASTALDO-COBIANCHI, R.; INT, J. Antimicrob Agents (1997) In: TALAS-OĞRAŞ, T.; IPEKÇI, Z.; BAJROVIÇ, K.; GÖZÜKIRMIZI. Antibacterial activity of seed proteins of Robinia pseudoacacia. Fitoterapia v. 76, p. 67– 72, 2005. BATISTA, A. B. Potencial Fungicida e inseticida de proteínas presentes em sementes de Dioclea megacarpa Rolfe. 2009. 112 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. BATISTA, I. F. C.; OLIVA, M. L. V.; ARAUJO, M. S.; SAMPAIO, U. M.; RICHARDSON, M.; FRITZ, H.; SAMPAIO, C. A. M. Primary structure of a kunitz-type trypsin inhibitor from Enterolobium contortisiliquum seeds. Phytochemistry, v. 41, p. 1017-1022, 1996. BATISTA J. S.; ALMEIDA R. N., Jnanabrata Bhattacharyya. Analgesic effect of Dioclea grandiflora constituents in rodents. Journal of Ethnopharmacology, v. 45, p. 207-210, 1995. BATISTA, J. S. Estudo químico e farmacológico das cascas das raízes da Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth. 1993. Dissertação (Mestrado em Farmácia). Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 1993. BATISTA, R.; CHIARI, E.; OLIVEIRA, A. B. Trypanosomicidal kaurane diterpenes from Wedelia paludosa. Planta Medica, v. 65, p. 283-284, 1999. BAUERMEISTER A.; REZENDE, M. A.; GIESE, E. C.; DEKKER, R. F. H.; BARBOSA, A. M. β-1,3-Glucanases Fúngicas: produção e aplicações biotecnológicas. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas. v. 31, n. 2, p. 75-86, 2010. BAZZANO, L. A.; HE, J.; OGDEN, L. G.; LORIA, C.,; VUPPUTURI, S.; MYERS, L.; WHELTON, P. K. Legume consumption and risk of coronary heart disease in US men and women NHANES I epidemiologic follow-up study. Archives of Internal Medicine, v. 161, p.2573–2578, 2001.

269

BEAL L.; MEHTA T. Zinc and phytate distribution in peas: influence of heat treatment germination pH substrate and phosphorus on pea phytase and phytase. Journal of Food Science, v. 50, n.1, p. 96-100,1985. BEARD, J. L.; DAWSON, H.; PIÑERO, J. D. Iron metabolism: a comprehensive review. Nutrition Reviews, v.54, n.10, p. 295-317,1996. BECKEL,W. E., Investigations of permeability, diapause, and hatching in the eggs of the mosquito Aedes hexodondus Dyar. Canadian Journal of Zoology, v. 36, p. 541–554, 1958. BECKER, K.; HU, Y.; BILLER-ADORNO, N. Infectious diseases a global challenge. International Journal of Medical Microbiology . v. 296, p. 179-185, 2006. BECKER-RITT, A. B.; MARTINELLI, A. H. S.; MITIDIERI, S.; FEDER, V.; WASSERMANNA, G. E.; SANTI, L.; VAINSTEIN, M. H.; OLIVEIRA, J. T. A.; FIUZA, L. M.; PASQUALI, G.; CARLINI, C. R. Antifungal activity of plant and bacterial ureases. Toxicon, v. 50, p. 971–983, 2007. BEERS, E. P.; JONES, A. M.; DICKERMAN, A.W. The S8 serine C1A cysteine and A1 aspartic protease families in Arabidopsis. Phytochemistry, v. 65, p. 43 – 58, 2004. BENNET, R.; WALLSGROVE, R. M. Secondary Metabolites in plant defense mechamisms. New Phytologist. v. 172, p. 617– 633, 1994. BERTINI, L. M.; PEREIRA, A. F.; OLIVEIRA, C. L. L.; MENEZES, E. A.; MORAIS, S. M.; CUNHA, F. A.; CAVALCANTE, E. S. B. Perfil de sensibilidade de bactérias frente a óleos essenciais de algumas plantas do Nordeste do Brasil. Infarma , v. 17, p. 80-83, 2005. BEZERRA, L. C. B. R. Prospecção de moléculas com potencial nutracêutico em sementes de Enterolobium contortisiliquum (vell.) Morong.: purificação e caracterização parcial de três inibidores de quimotripsina. 2010. 97 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. BEZERRA, R. D. S.; CARVALHO, A. A.; CHAVES, M. H. Fenóis totais e atividade antioxidante de extratos das folhas de Parkia platycephala benth. 32ª Sociedade Brasileira de Química (SBQ), 2009. BFC (Bioactive food components. American Society of Nutrition response to the Federal Register notice of September 16, 2004. Disponível em: http://www.ods.od.nih.gov/Research-Food-Components-Initiatives.aspx . Acesso em: 04 de janeiro de 2010. BIOSFERA DA CAATINGA. Disponível em: <http://www.biosferadacaatinga.org.br/o_bioma_caatinga.htmlCaatinga>. Acesso em 8 de nevembro de 2010. BLASCO, L.; VEIGA-CRESPO, P.; POZA, M.; VILLA, T. G. Hydrolases as markers of wine aging. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v.22, p. 1229-1233, 2006.

270

BLOCK, L. C.; SANTOS, A. R. S.; SOUZA, M. M.; SCHEIDT, C.; YUNES, R. A.; SANTOS, M. A.; MONACHE, F.; CECHINEL-FILHO, V. Chemical and pharmacological examination of antinociceptive constituents of Wedelia paludosa. Journal of Ethnopharmacology, v. 61, p. 85-89, 1998. BLUM, H.; BEIER, H.; GROSSA, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA e DNA in polyacrylamide gels. Eletrophoresis, v. 8, p. 93-99, 1987. BOLLER, T. (1983) Biochemical analysis of chitinases and β-1,3-glucanase. In: S. J. GURR, M. J. Mc PHERSON, D. J. BOWLES (Eds.). Molecular Plant Pathology: A Pratical Approuch, Vol. II, 1992. BOREJSZO Z.; KHAN K. Reduction of flatulence-causing sugars by high temperature extrusion of pinto bean high starch fractions. Journal of Food Science, v. 57, p. 771-772, 1992. BOTELHO, M. A.; NOGUEIRA, N. A. P.; BASTOS, G. M.; FONSECA, S. G. C.; LEMOS, T. L. G.; MATOS, F. J. A.; MONTENEGRO, D.; HEUKELBACH, J.; RAO, V. S.; BRITO, G. A. C. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 40, p. 349-356, 2007. BOYE, J.; ZARE, F.; PLETCH, A. Pulse proteins: Processing, characterization, functional properties and applications in food and feed. Food Research International, v. 43, p. 414−431, 2010. BRAGA, I. A.; VALLE, D. Aedes aegypti: inseticidas, mecanismos de ação e resistência. Epidemiologia e Serviços de Saúde, v. 16, n. 4, p. 295-302, out-dez. 2007. BRAGA, R. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. Escola Superior de Agricultura de Mossoró, ed. 3, Mossoró, v. XI, p. 178, 1976. BRAGA, R. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. 3º edição comemorativa ao II Congresso Brasileiro de Florestas Tropicais. v. XLII, 3ª.ed. Mossoró: Coleção Morossoense, 1982. BRASIL, A. P. R.; REZENDE, S. T.; PELÚZIO, M. C. G. ; GUIMARÃES, V. M. Removal of oligosaccharides in soybean flour and nutritional effects in rats. Food Chemistry, v.118, p. 251–255, 2010. BRAVO, A.; GILL, S. S.; SOBERÓN, M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon, v. 49, n. 4, p. 423-435, mar. 2007. BRAVO, L.; GRADOS, N.; SAURA-CALIXTO, F. Composition and potential uses of mesquite pods (Proposis pallida L): comparison with carob pods (Ceratonia siliqua L.). Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 65, n.3, p. 303-306, 1994.

271

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976. BREITENEDER, H.; RADAUER, C. A classification of plant food allergens. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 113, p. 821-830, 2004. BRESSANI, R.; BRENES, R. S.; GARCIA, A., ELIAS, L. G. Chemical composition, amino acid content and protein quality of Canavalia spp.seeds. Journal of the Science of Food Agriculture , v. 40, p. 17–23, 1987. BRESSANI, R.; ELIAS, L.G. Nutritional value of legumes crops for humans and animals. In: SUMMERFIELD, R. J., BUNTING, A. H. (eds.). Advances in legume science. London. Royal Botanical Gardens, 1980. v. 1, sec. 3, p. 135-155. BRESSANI, R.; SOSA, J. L. Effect of processing on the nutritive value of Canavalia Jack beans (Canavalia ensiformis L.). Plant Foods for Human Nutrition, v. 40, p. 207–214, 1990. BRINE, C. J.; SANDFORD, P. A.; ZIKAKIS, J. P. Advances in Chitin and Chitosan. Elsevier Applied Science, London, 1992. 685 pp. BRITO, A. R. M. S.; BRITO, A. A. S. Forty years of Brasilian medicinal plant research. Journal of Ethnopharmacology, v. 39, n. 1, p. 53-67, 1993. BROADBENT, A. B.; PREE, D. J. Effects of diflubenzuron and bay SIT 8514 on the oriental fruit moth and oblique banded leaf roller. Journal of Economic Entomology, v. 77, p.194-197, 1984. BROEKAERT, W. F.; CAMMUE, B. P. A.; DE BOLLE, M. F. C.; THEVISSEN, K.; DE SAMBLANX, G. W.; OSBORN, R. W. Antimicrobial peptides in plants. Critical Reviews in Plant Sciences, v. 16, p. 297-232,1997. BROEKHAERT, W. F.; VAN PARIJS, J.; ALLEN, A. K.; PEUMANS, W. J. Comparison of some molecular, enzymatic and antifungal properties of chitinases from thorn-apple, tobacco and wheat. Physiological and Molecular Plant Pathology, v. 33, p. 319-331, 1988. BRUNNER, F.; STINTZI, A.; FRITIG, B.; LEGRAND, M. Substrate of tobacco chitinases, The Plant Journal, v.14, p. 225–234, 1998. BUCHER, G. L.; TARINA, C.; HEINLEIN, M.; DI SERIO, F.; MEINS JR, F.; IGLESIAS, V. A. Local expression of enzymatically active class I b-1, 3-glucanase enhances symptoms of TMV infection in tobacco. The Plant Journal, v.28, n.3, p.361-369, 2001. BULHÃO, C. F.; FIGUEIREDO, P. S. Fenologia de leguminosas arbóreas em uma área de cerrado marginal no nordeste do Maranhão. Revista Brasileira de Botânica, v. 25, p.361-370, 2002.

272

BURBANO, C.; MUZQUIZ, M.; AYET, G.; CUADRADO, C. Pedrosa M. M. Evaluation of antinutritional factors of selected varieties of Phaseolus vulgaris. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 79, p. 1468–1472, 1999. CALIXTO, J. B. “Biodiversidade como Fonte de Medicamentos”. Revista Ciência e Cultura Temas e tendências SBPC, ano 55; n. 3, p. 37-39, 2003. CAMMUE, B. P. A.; THEVISSEN, K.; HENDRIKS, M.; EGGERMONT, K.; GODERIS, I. J.; PROOST, P.; VAN DAMME, J.; OSBORN, R. W.; GUERBETTE, F.; KADER, J-C.; BROEKAERT, W. F. A potent antimicrobial protein from onion seeds showing sequence homology to plant lipid transfer proteins. Plant Physiology, v. 109, p. 445-455, 1995. CAMPELLO, C. C.; CARVALHO, V. L.; VIEIRA, K. M.; FARIAS, D. F.; BRASIL, I. C. F.; MAIA, A. A. B.; MORAIS, J. K. S.; CARVALHO, A. F. U.; VASCONCELOS, I. M. Desempenho e parâmetros séricos de ratos alimentados com dietas contendo soja integral crua. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 46, n. 3, p. 188-198, 2009. CAMPOS, M. A. A.; UCHIDA, T. Influência do sombreamento no crescimento de mudas de três espécies amazônicas. Pesquisa agropecuária brasileira, v.37, n.3, p.281-288, 2002. CAMPOS, M. P.; CECHINEL FILHO, V.; SILVA, R. R.; YUNES, R. A.; MONACHE, F. D.; CRUZ, A. B. Antimicrobial activity of extract, fractions and four compounds from Piper solmsianum C. DC. Var solmsianu (Piperaceae) Z Naturforsch C., v. 62, p. 173-8, 2007. CAMPOS-VEGA, R.; GUADALUPE LOARCA-PIÑA; DAVE OOMAH, B. Minor components of pulses and their potential impact on human health. Food Research International , p. 461-482, 2009a. CAMPOS-VEGA, R.; REYNOSO-CAMACHO, R.; PEDRAZA-ABOYTES, G.; ACOSTA-GALLEGOS, J.; GUZMAN-MALDONADO, S.; PAREDES-LOPEZ, O.; OOMAH, B.; LOARCA-PINA, G. Chemical composition and in vitro polysaccharide fermentation of different beans (Phaseolus vulgaris L.). Journal of Food Science, v. 74, n. 7, p. T59-T65, 2009b. CARLINI, C. R.; GROSSI-DE-SÁ, F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon, v. 40, p. 1515–1539, 2002. CARLINI, C. R.; GUIMARÃES, A. B. Isolation and characterization of a toxic protein from Canavalia ensiformis (jack bean) seeds, distinct from concanavalin A. Toxicon, v. 19, n. 5, p. 667-675, 1981. CARLINI, C. R.; UDEDIBIE, A. B. Comparative effects of processing methods on hemagglutinating and antitryptic activities of Canavalia ensiformis and Canavalia braziliensis seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 45, p. 4372–4377, 1997. CARLISLE, P. S.; GUCALP, R.; WIERNIK, P. H. Nosocomial infections in neutropenic cancer patients. Infection Control and Hospital Epidemiology, v. 14, p. 320-324, 1993.

273

CARNOVALE, E.; LUGARO, E.; MARCONI, E. Protein quality and antinutritional factors in wild and cultivated species of Vigna spp. Plant Foods for Human Nutrition, v. 41, p.11–20, 1991. CARVALHO FILHO, J. L. S.; ARRIGONI-BLANK, M..; BLANK, A. F.; RANGEL, M. S. A. Produção de mudas de jatobá (Hymenaea courbaril L.) em diferentes ambientes, recipientes e composições de substratos. Cerne, v.23, n.1, p.109-118, 2003. CARVALHO, J. C. T.; TEIXEIRA, J. R. M.; SOUZA, P. J. C.; BASTOS, J. K.; SANTOS-FILHO, D.; SARTI, S. J. Preliminry studies of analgesic and anti-inflamatory properties os Caesalpinia ferrea crude extract. Journal of Ethnopharmacology, v. 53, p. 175-178, 1996. CARVALHO, M. M. M.; XAVIER FILHO, J.; ARY, M. B.; CAMPOS, F. A. P.; MOREIRA, R. A. Trypsin Inhibitor in Seeds of Dioclea grandiflora Mart. Revista Brasileira de Botânica, v. 11, p. 81-84, 1988. CASTILHOS, T. S.; GIORDANI, R. B.; HENRIQUES, A. T.; MENEZES, F. S.; ZUANAZZI, J. A. S. Avaliação in vitro das atividades antiinfl amatória, antioxidante e antimicrobiana do alcalóide montanina. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, p. 209-214, 2007. CASTRO-FARIA-NETO, H. C.; MARTINS, M. A.; BOZZA, P. T.; PEREZ, S. A. C.; CORREA-DA-SILVA, A. C. V.; LIMA, M. C. R.; CRUZ, H. N.; CORDEIRO, R. S. B.; SOUSA, M. V.; MORHY, L. Pro-inflammatory activity of enterolobin: A haemolytic protein purified from seeds of the Brazilian tree Enterolobium contortisiliquum. Toxicon, v. 29, p. 1143-1150, 1991. CASTRO, H. G.; FERREIRA, F. A.; SILVA, D. J. H., MOSQUIM, P. R. Contribuição ao estudo das plantas medicinais – Metabólitos Secundários. 2a ed. Viçosa-MG, Visconde do Rio Branco. 113p. il., 2004. CASTRO, J. M. Purgativos indígenas do Brasil. Rio de Janeiro: Typ. de Moreira, Maximiano & C. 1878. 186p. Dissertação (Mestrado em Medicina), Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 1878. CAVADA, B. S.; CASTELLÓN, R. E. R.; VASCONCELOS, G. G.; ROCHA, B. A. M.; BEZERRA, G. A.; DEBRAY, H.; DELATORRE, P.; NAGANO, C. S.; TOYAMA, M.; PINTO, V. P. T.; MORENO, F. B. M. B.; CANDURI, F.; AZEVEDO JR. W. F. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a new chitin-binding protein from Parkia platycephala seeds. Acta Crystallographica, v. F61, p. 841–843, 2005. CAVALHEIRO, M. G. Caracteriação Bioquímica Parcial do Látex de Cryptostegia grandiflora R. Br. e Ação Contra o Vetor da Dengue. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. CERNING-BEROARD J.; FILIATRE A. A Comparism of the carbohydrate composition of legume seeds: Horsebeans, peas and lupines. Cereal Chemistry, v. 53, p. 968-978, 1976.

274

CHAMP, M. M. Non-nutrient bioactive substances of pulses. British Journal of Nutrition , v. 88, p. S307–S319, 2002. CHANG, M.-C. J.; BAILEY, J. W.; COLLINS, J. L. Dietary tannins from cowpeas and tea transiently alter apparent calcium absorption but not absorption and utilization of protein in rats. Journal of Nutrition , v. 124, p. 283–288, 1994. CHAPAGAIN, B. P.; SAHARAN, V.; WIESMAN, Z., Larvicidal activity of saponins from Balanites aegyptiaca callus against Aedes aegypti mosquito. Bioresource Technology, v. 99, p.1165-1168, 2008. CHAPAGAIN, B. P.; WIESMAN, Z.; LAHKIM, L. T. In vitro study of the antifungal activity of saponin-rich extracts against prevalent phytopathogenic fungi. Industrial Crops and Products, v. 26, p. 109-115, 2007. CHAU, C. F.; CHEUNG, P. C.; WONG, Y. S. Effect of cooking on content of amino acids and antinutrients in three Chinese indigenous legume seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture , v. 75, p. 447–452, 1997. CHAUDHARY, N. S.; SHEE, C.; ISLAM, A.; AHMAD, F.; YERNOOL, D.; KUMAR, P.; SHARMA, A. K., Purification and characterization of a trypsin inhibitor from Putranjiva roxburghii seeds. Phytochemistry, v. 69, p. 2120–2126, 2008. CHEEKE, P. R. Nutritional and physiological implications of saponins: a review. Canadian Journal of Animal Science, v. 51, p. 621–623, 1971. CHEEKE, P. R.; PALO, R. T. Plant toxins and mammalian herbivores: co-evolutionary relationships and antinutritional effects. In: JOURNET, M., GRENET, E., FARCE, M-H., THERIEZ, M., DEMARQUILLY, C., (Eds.) Recent developments in the nutrition of herbivores. INRA Editions, Paris, 1995, p. 437–56. CHITRA, U.; VIMALA, V.; GEERVANI, P.; SINGH, U. Variability in phytic acid content and protein digestibility of grain legumes. Plant Foods for Human Nutrition, v. 47, p.163–172, 1995. CHO, Y-S.; YEUM, K. J.; CHEN, C-Y.; BERETTA, G.; TANG, G.; KRINSKY, N. I.; YOON, S.; LEE-KIM, Y. C.; BLUMBERG, J.; RUSSELL, R. M. Phytonutrients Affecting Hydrophilic & Lipophilic Antioxidant Activities in Fruits, Vegetables and Legumes. Journal of Science and Food Agriculture, v. 87, n. 6, p. 1096-1107, 2007. CHU, K. T.; LIU, K. H.; NG, T. B. Cicerarin, a novel antifungal peptide from Green chickpea. Peptides, v. 24, p. 659-663, 2003. CIOPRAGA, J.; GOZIA, O.; TUDOR, R.; BREZUICA, L.; DOYLE, R. Fusarium sp. Growth inhibition by wheat germ agglutinin. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1428, p. 424-432, 1999. CLEMENTE, A.; MCKENZIE, D. A.; JOHNSON, I. T.; DOMONEY, C. Investigation of legume seed protease inhibitors as potential anti-carcinogenic proteins. Legumes for the

275

benefit of agriculture, nutrition and the environment. Proc 5th Eur Conf Grain Legume Dijon. AEP; 2004. p. 51. COELHO, J. S.; SANTOS, N. D. L.; NAPOLEÃO, T. H.; GOMES, F. S.; FERREIRA, R. S.; ZINGALI, R. B.; COELHO, L. C. B. B.; LEITE, S. P.; NAVARRO, D. M. A. F.; PAIVA, P. M. G. Effect of Moringa oleifera lectin on development and mortality of Aedes aegypti larvae. Chemosphere, v. 77, p. 934–938, 2009. COLLINGE, D. B.; KRAGH, K. M.; MIKKELSEN, J. D.; NIELSEN, K. K.; RASMUSSEN, U.; VAD, K. Plant chitinases. The Plant Journal, v. 3, p. 31–40,1993. CONRAD, M. E.; UMBREIT, J. N.; MORRE, E. G. Iron absorption and transport. The American journal of the medical sciences, v. 318, p. 213-219, 1999. CORIA, C.; ALMIRON, W.; VALLADARES, G.; CARPINELLA, C.; LUDUEÑA, F.; DEFAGO, M.; PALÁCIOS, S. Larvicide and oviposition deterrent effects of fruit and leaf extracts from Melia azedarach Lon Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Bioresource Technology, v. 99, p. 3066–3070, 2008. CORRÊA, M. P. Diccionário das Plantas Úteis do Brasil. Ministério da Agricultura, Rio de Janeiro, v. V, p. 378, 1974. CORRÊA, M. P. Diccionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. v. 5. Imprensa Nacional, Rio de Janeiro, 1984. CORRÊA, M. P. Dicionario de Plantas Uteis do Brasil, Ministerio da Agricultura, IBDF. Imprensa Nacional, Rio de Janeiro, 1994, p. 593-599. COSTA, H. P. S. Avaliação do potencial de sementes de Piptadenia moniliformis Benth. como fonte de proteínas contra Callosobruchus maculatus (f.) (Coleoptera: Bruchidae). 2009. 65 f. Monografia (Graduação em Biologia), Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. COSTA, T. R.; FERNANDES, O. F. L.; SANTOS, S. C.; OLIVEIRA, C. M. A.; LIÃO, L. M.; FERRI, P. H.; PAULA, J. R. P.; FERREIRA, H. D.; SALES, H.N.; SILVA, M. R. R. Antifungal activity of volatile constituints of Eugenia dysenterica leaf oil. Journal of Ethnopharmacology, v. 72, p. 111-117, 2000. COTA, I. E.; TRONCOSO-ROJAS, R.; SOTELO-MUNDO, R.; SÁNCHEZ-ESTRADA, A.; TIZNADO-HERNÁNDEZ, M. E. Chitinase and b-1,3-glucanase enzymatic activities in response to infection by Alternaria alternata evaluated in two stages of development in different tomato fruit varieties. Scientia Horticulturae, v. 112, p. 42–50, 2007. COUTO, J. L. A.; VIEIRA, R. C. S.; BARBOSA, J. M.; MACHADO, S. S.; FERREIRA, H. S. Alterações da função hepática de camundongos desnutridos e infectados pelo Schistosoma mansoni. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 41, n. 4, p. 390-393, 2008. COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, v. 12, n, 4, p. 564-582, 1999.

276

COWARD, W. A.; WHITEHEAD, R.G.; LUNN, P. G. Reasons why hypoalbuminaemia may or may not appear in protein-energy malnutrition. British Journal of Nutrition , v.38, n.1, p.115-126, 1977. CRIA. Centro de Referência em Informação Ambintal. Flora Brasiliensis (2005). Disponível em: <http://florabrasiliensis.cria.org.br/>. Acesso em: 28 de deembro de 2010. CRUZ, A. C. B. Purificação, Caracterização e Análise Boinseticida de um Inibidor de Tripsina em Sementes de Catanduva (Piptadenia moniliformis). 2008. 97f.(Dissertação) Centro de Biociências, Departamento de Bioquímica da Universidade da Federal do Rio Grande do Norte, 2008, 97 f. CRUZ, G. A. D. R.; OLIVEIRA, M. G. A.; PIRES, C. V.; PILON, A. M.; CRUZ, R. S., BRUMANO, M. H. N.; MOREIRA, M. A. Avaliação da digestibilidade protéica, inibidor de protease e fibras alimentares de cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Brazilian Journal of Food Technology, v. 7, p. 103-109, 2004. CRUZ, M. C. S.; SANTOS, P. O.; BARBOSA, A. M.; JR, D. L. F. M.; ALVIANO, C. S.; ANTONIOLLI, A. R.; ALVIANO, D. S.; TRINDADE, R. C. Antifungal activity of Brazilian medicinal plants involved in popular treatment of mycoses. Journal Ethnopharmacol, v.111, p. 409-412, 2007. DA CUNHA, E. V. L.; DIAS, C.; BARBOSA-FILHO, J. M.; GRAY, A. I. Eryvellutinone, an isoflavanone from the stem bark of Erythrina vellutina. Phytochemistry, v. 43, p.1371-1373, 1996. DAHIYA, N.; TEWARI, R.; HOONDAL, G. S. Biotechnological aspects of chitinolytc enzymes: a review. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, p. 773-782, 2006. DAYAN, F. E.; CANTRELL, C. L.; DUKE, S. O. Natural products in crop protection. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 17, p. 4022-4034, 2009. DE ANGELIS, R. C. Proteínas e seu valor nutritivo. In: ______. Fisiologia da Nutrição. v.1, 3ª ed. São Paulo: Nobel, p. 84-112, 1986. DEARING, M. D.; FOLEY, W. J.; MCLEAN, S. The influence of plant secondary metabolites on the nutritional ecology of herbivorous terrestrial vertebrates. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, v.36, p.169–89, 2005. DE JONG, A.; CORDEWENER, J.,; LOSCHIAVO, F.; TERZI, M.; VANDEKERCKHOVE, J.; VAN KAMMEN, A.; DE VRIES, S. C. A carrot somatic embryo mutant is rescued by chitinase. The Plant Cell, v. 4, p. 425–433, 1992. DECKER, E. A. The phenolic, conjugated linoleic acid, carnosine and pyrroloquinoline quinone as non-essential dietary antioxidants. Nutrition Review , v. 53, p. 49−58, 1995. DEL SOL, F. G., ÂN-MAIQUES, S. R.; SANTOS, C. F.; GRANGEIRO, T. B.; NAGANO, C. S.; FARIAS, C. M. S. A.; CAVADACA, B. S.; CALVETEA, J. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the seed lectin from Parkia platycephala. Acta Crystallographica, v. D58, p. 167-169, 2002.

277

DIAS FILHO, B. P.; LEMOS, F. J. A.; SECUNDINO, N. F.; PÁSCOA, V.; PEREIRA, S. T.; PIMENTA, P. F. Presence of chitinase and N-acetylglucosaminidase in the Aedes aegypti. A chitinolytic system involving peritrophic matrix formation and degradation. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 32, p. 1723–1729, 2002. DI STASI, L. C. Plantas Medicinais: Arte e Ciência. UNESP, Brasil, 1995, p. 230. DIEHL, J. F. Food irradiation-past, present and future. Radiation Physics and Chemistry, v. 63, p. 211–215, 2002. DIXON, N. E.; RIDDLES, P. W.; GAZZOLA, C.; BLAKELEY, R. L.; ZERNER, B. Jack bean urease (EC 3.5.1.5) on the mechanism of action of urease and urea, formamide, acetamide, n-methyl urea and related compounds. Canadian Journal of Biochemistry, 58,1534–1535, 1980. DONOVAN, B. C.; MCNIVEN, M. A.; MACLEOD, J. A.; ANDERSON, D. M. Protein quality of two cultivars of lupin seeds evaluated in weanling rats. Animal Feed Science and Technology, v. 33, p. 87–95, 1991. DORMAN, H. J. D.; DEANS, S. G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils, Journal of Applied Microbiology , v. 88, p. 308–316, 2000 DRUMOND, M. A.; KIILL, L. H. P.; LIMA, P. C. F.,; OLIVEIRA, M. C.; OLIVEIRA, V. R.; ALBUQUERQUE, S. G.; NASCIMENTO, C. E. S.; CAVALCANTE, J. Estratégias para o uso sustentável da biodiverdidade da caatinga. In: Seminário para avaliação e identificação de ações prioritárias para a conservação, utilização sustentável e repartição de benefícios da biodiversidade do bioma Caatinga. Embrapa/Cpatsa, UFPE e Conservation International do Brasil, Petrolina, 2000. DUARTE, M. C. T.; FIGUEIRA, G. M.; SANTORATTO, A.; REHDER, V. L. G.; DELARMELINA, C. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. Journal Ethopharmacology, v. 97, p. 305-311, 2005. DUBOURDIEU, D.; DESPLANQUES, C.; VILLETAZ, J. C.; RIBÉREAU-GAYON, P. Investigations of an industrial B-D-Glucanase from Trichoderma harzianum. Carbohydrate Research, v. 144, p. 277-287, 1985. DUDLEY-CASH, W. A. Methods for determining quality of soybean meal protein. Feedstuffs, v. 71, n. 1, p. 10-11, 1999. DUNAEVSKII, Y. E.; GLADYSHEVA, I. P.; PAVLUKOVA, E. B.; BELIAKOVA, G.A.; GLADYSHEVA, D. P.; PAPISOVA, A. I.; LARIONOVA, N. I.; BELOZERSKY, M. A. The anionic protease inhibitor BBWI-I from buckwheat seeds. Kinetic properties and possible biological role. Plant Physiology, v. 100, p. 483-488, 1997. DURANTI M.; SCARAFONI A. Modification of storage protein content and quality in legume seeds. Journal of New Seeds, v. 1, p.17-35, 1999.

278

DURANTI, M. Grain legume proteins and nutraceutical properties. Fitoterapia, v. 77, p. 67-82, 2006. DURANTI, M.; GIUS, C. Legume seeds: protein content and nutritional value. Fields Crops Research, v.53, p.31-45, 1997. DUTHIE, G. G.; DUTHIE, S. J.; KYLE, J. A. M. Plant polyphenols in cancer and heart disease: implications as nutritional antioxidants. Nutrition Research Reviews, v. 13, p. 79–106, 2000. ECKELKAMP, C.; EHMANN, B.; SCHOPFER, P. Wound-induced systemic accumulation of a transcript coding for a Bowman-Birk trypsin inhibitor-related protein in maize (Zea mays L.) seedlings. FEBS Letters, v. 323, p. 73-76, 1993. EKANAYAKE, S.; JANSZ, E. R.; NAIR, B. M. Nutritional evaluation of protein and starch of mature Canavalia gladiata seeds. International Journal of Food Science and Nutrition, v. 51, p. 289–294, 2000. EL-HADY, A. A. A.; HABIBA, R. A. Effect of soaking and extrusion condutions on antinutrients and protein digestibility of legume seeds. Lebensm. Wiss. U. Technol., n. 36, p. 285-293, 2003. EL-KATANY, M. H.; GUDELJ, M.; ROBRA, K. H.; ELNAGHY, M. A. Caracterization of chitinase and β-1,3-glucasase from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytophatogen Sclerotium rolfsii. Applied Microbiological Biotechnology. v. 56, p. 137 – 143, 2001. ENUJIUGHA, V. N.; AYODELE-ONI, O. Evaluation of nutrients and some anti-nutrients in lesser known underutilized oilseeds. International Journal of Food Science and Technology, v. 38, p. 525–528, 2003. EPSTEIN, L. A riqueza do umbuzeiro. Revista Bahia Agrícola., v.2, n. 3, nov., 1998. Disponível em: http://www.seagri.ba.gov.br/revista/rev_1198/umbu.htm, acesso em: 01 de Dezembro de 2010. ERLANGER, B. F.; KOLOWSKY, N.; COHEN, W. The action of chymotrypsin on two chromogenic substrates. Archives of Biochemistry, v. 95, p. 271-278, 1961. (ESALQ – USP, 2010). Trilhas de ESALQ. Árvores Úteis, Eritrina, Erythrina velutina Willd. Disponível em: http://www.esalq.usp.br/trilhas/uteis/ut02.php, acesso em: 10 de Dezembro de 2010. ESKANDER, J.; LAVAUD, C.; ISABELLE POUNY, I.; SOLIMAN, H. S. M.; ABDEL-KHALIK, S. M.; MAHMOUD, I. I. Saponins from the seeds of Mimusops laurifolia. Phytochemistry, v. 67, p. 1793–1799, 2006. ÉSTEVEZ A. M.; CASTILLO-FIGUEROLA F.; YÁNEZ E. Effect of processing on some chemical and nutritional characteristics of pre-cooked and dehydrated legumes. Plant Foods for Human Nutrition , v. 41, n. 3, p.193-201, 1991.

279

EVENEPOEL, P.; HIELE, M.; GEYPENS, B.; GEBOES, K. P.; RUTGEERTS, P.; GHOOS, Y. C-13-egg white breath test: a non-invasive test of pancreatic trypsin activity in the small intestine. Gut - BMJ Journals, v. 46, p.52-57, 2000. EZEAGU, I. E.; METGES, C. C.; PROLL, J.; PETZKE, K. J.; AKINSOYIN A. O. Chemical composition and nutritive value of some wild-gat ered tropical plant seeds. Food and Nutrition Bulletin , v. 17, p. 275–278, 1996. EZEAGU, I. E.; PETZKE, J. K.; METGES, C. C.; AKINSOYINUA A. O.; OLOGHOBOA, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factor for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry, v. 78, p. 105–109, 2002. FALCO, M. C.; SILVA, F. M. C. Expression of soybean proteinase inhibitors in transgenic sugarcane plants. Effects on natural defense against Diatraea saccharalis. Plant Physiology and Biochemistry, v. 41, p. 761-766, 2003. FAO/WHO. Human vitamin and mineral requirements. Report of a joint FAO/WHO expert consultation, Bangkok, Thailand, 2001. FAO/WHO. Food energy – methods of analysis and conversion factors. Report of a technical workshop, Rome, 2003. 93 p. FAO/WHO/UNU. Energy and protein requirements, Report of a joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation. Meetings Series N° 724. Geneva, Switzerland: WHO, 1985. FARIAS, D. F. Proteínas de sementes de Amburana cearensis (Allemao) a. c. Smith: valor nutricional e bioatividade contra patógenos e vetores de doenças. 2009. 186 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. FARIAS, F. J. C. Índice de Seleção em cultivares de algodoeiro herbáceo. 2005. 121 f. Tese (Doutorado em Agronomia) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, São Paulo, 2005. FDA (2010). Nutritional Labeling and Education Act (NLEA) Requirements (8/94 - 2/95), Revisado em 2010. disponível em: http://www.fda.gov/ICECI/Inspections/InspectionGuides/ucm074948.htm. Acesso em 8 de Outubro de 2010. FELSE, P. A.; PANDA, T. Regulation and cloning of microbial chitinase genes. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 51,p. 141–151, 1999. FENNER, R.; BETTI, A. H.; MENTZ, L. A.; RATES, S. M. K. Plantas utilizadas na medicina popular brasileira com potencial atividade antifúngica. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 42, n. 3, 2006. FERNANDES, C. F. (2005a) Principais Doenças e Pragas do Feijão-de-Corda. Disponível em: <http://www.agronline.com.br/artigos/artigo.php?id=294>. Acesso em: 8 de janeiro, 2011.

280

FERNANDES, G. S. Potencial de utilização de globulinas de feijão-de-corda (Vigna unguiculata (L.) WALP.) como fonte alternativa de proteína de alta qualidade. 2005. 97f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica). Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005b.

FERNANDES, M. C. A. Emprego de métodos alternativos de controle de pragas e doenças na olericultura. Horticultura Brasileira, Brasília , v.18, p.112-113, 2000. FERRÃO, M. F.; FURTADO, J. C.; NEUMANN, L. G.; KONZEN, P. H. A.; MORGANO, M. A.; BRAGAGONOLO, N.; FERREIRA, M. M. C. Técnica não destrutiva de análise de tanino em café empregando espectroscopia no infravermelho e algoritmo genético. Tecno-Lóg, v.7, n.1, p.9-26, 2003. FERREIRA, P. M. P.; CARVALHO, A. F. U.; FARIAS, D. F.; CARIOLANO, N. G.; MELO, V. M. M.; QUEIROZ, M. G. R.; MARTINS, A. M. C.; MACHADO-NETO, J. G. Larvicidal activity of the water extract of Moringa oleifera seeds against Aedes aegypti and its toxicity upon laboratory animals. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 81, p. 207–216. 2009. FERREIRA, V. F. Biodiversidade, lei de recursos genéticos e política científica, Química Nova, v. 23, n. 5, 2000, p. 623-626. FETROW, C. W.; ÁVILA, J. R. Manual de Medicina Alternativa para o Profissional. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1999. FETUGA, B. L.; BABATUNDE, G. M.; OYENUGA, V. A. Protein quality of some Nigerian feedstuffs. II. Biological evaluation of protein quality. Journal of the Science of Food and Agriculture , v. 24, p. 1515–1523, 1973. FIELDING. J.; RYALL, R. G. Some Characteristics of Trichloroacetic Acid-Precipitated Proteins and their Effects on Biochemical Assay. Clinica Chimica Acta, v. 33. p. 235 – 240, 1971. FINNEY, D. J. Probit analysis. Third Edition. Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1971, 350p. FLACH, J.; PILOT, P. E.; JOLLES, P. What’s new in chitinase research? Experientia, v. 48, p. 701–716, 1992. FLEURI, L. F.; SATO, H. H. β-1,3 Glucanases e quitinases: aplicação na lise de leveduras e inibição de fungos. Ciência e Agrotecnologia, v. 32, p. 1224-1231, 2008. FOLKERS, K.; SHAVEL, J. Erythrina Alkaloids. Chromatographic analyses of erysodine, erysovine and “Erysocine” and technique for preparative isolation. Journal of American Chemical Society, v. 64, p. 1892–1896,1951. FOLLMER, C.; BARCELLOS, G. B. S.; ZINGALI, R. B.; MACHADO, O. L. T.; ALVES, E. W.; BARJA-FIDALGO, C.; GUIMARAES, J. A.; CARLINI, C. R. Canatoxin, a toxic protein from jack beans (Canavalia ensiformis), is a variant form of urease (EC 3.5.1.5):

281

biological effects of urease independent of its ureolytic activity. Biochemical Journal, v. 360, p. 217–224, 2001. FOLLMER, C.; REAL-GUERRA, R.; WASSERMANN, G. E.; OLIVERA-SEVERO, D.; CARLINI, C. R. Jackbean, soybean and Bacillus pasteurii ureases—Biological effects unrelated to ureolytic activity. European Journal of Biochemistry, v. 271, p. 1357–1363, 2004. FOLLMER, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry, v. 69, p.18-28, 2008. FONTENELE, J. B. Estudo farmacológico da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth e seus constituintes químicos, lonchocarpina e derricina , 2010 FORBEY, J. S.; HARVEY, A. L.; HUFFMAN, M. A.; PROVENZA, F. D.; SULLIVAN, R.; TASDEMIRK, D. Exploitation of secondary metabolites by animals: A response to homeostatic challenges. Integrative and Comparative Biology, v. 49, n. 3, p. 314–328, 2009. FRANCIS, R. M. Prevention and treatment of osteoporosis: Calcium and vitamin D. In: Compston, J. E., (ed.) Osteoporosis. New perspectives on causes, prevention and treatment, Royal College of Physicians of London, London, 1996, 123–34. FRANCIS, R. M.; ANDERSON, F. H.; PATEL, S.; SAHOTA, O.; VAN STAA, T. P. Calcium and vitamin D in the prevention of osteoporotic fractures. QJM: An International Journal of Medicine, v. 99, p. 355–363, 2006. FRANCO, O. L.; MELO, F. R. Osmoprotectants – A plant strategy in response to osmotic stress. Russian Journal of Plant Physiology, v. 47, p. 137-144, 2000. FRANCO, O. L.; MELO, F. R.; SILVA, M. C. M. Resistência de plantas a insetos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, n.11, p. 36-40, 1999. FREIRE, M. G. M.; GOMES, V. M.; CORSINI, R. E.; MACHADO, O. L. T.; SIMONE, S. G.; NOVELLO, J. C.; MARANGONI, S.; MACEDO, M. L. R. Isolation and partial characterization of a novel lectin from Talisia esculenta seeds that interferes with fungal growth. Plant Physiology and Biochemistry, v.40, p. 61-68, 2002. FREITAS, Z.; AUSICH, R., NEWMAN, J., SHAO, A., SHEABAR, F. Número de patente CA2483633., 2003 FREITAS, C. D. T. Proteínas do Látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. e Seus Efeitos Sobre Pragas Agrícolas. 2006. 118f. Dissertação (Mestrado em Boquímica) Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. FROBERG, B.; IBRAHIM, D.; FURBEE, R. B. Plant poisoning. Emergency Medicine Clinics of North America, v. 25, p. 375–433, 2007.

282

GAIDAMASHVILI, M.; VAN STADEN, J. Lectin-like proteins from South African plant species used in tradicional medicine. South African Journal of Botany, v. 68, p. 36-40, 2002. GABOR, F.; KLAUSEGGER, U.; WIRTH, M. The interaction between wheat germ agglutinin and other plant lectins with prostate cancer cells Du–145. The International Journal of Pharmaceutics, v. 221, p. 35-47, 2001. GALLEGO DEL SOL, F.; RAMÓN-MAIQUES, S.; SANTOS, C. F.; GRANGEIRO, T. B.; NAGANO, C. S.; FARIAS, C. M. S. A.; CAVADA, B. S.; CALVETE, J. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the seed lectin from Parkia platycephala. Acta Crystallographica D, v. D58, p. 167-169, 2002. GAMPBELL, G. L.; CLASSEN, H. L.; REICHERT, R. D.; GAMPBELL, I. D. Improvement of the nutritive value of rye for broiler chickens by gamma irradiation- induced viscosity reduction. British Poultry Science, v. 24, p. 205–211, 1983. GARCIA, V. A.; FREIRE, M. G. M.; NOVELLO, J. C.; MARANGONI, S.; MACEDO, M. L. R. Trypsin inhibitor from Poecilanthe parviflora seeds: Purification, characterization, and activity against pest proteases. The Protein Journal, v. 23, p. 343-350, 2004. GEORGOPAPADAKOU, N. H.; TRACZ, J. S. The fungal cell wall as a drug target. Trends in Microbiol Reviews, v. 12, p. 5015-5017, 1995. GHANNOUM, M. A.; RICE, B. L. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clinical Microbiology Reviews, v. 12, p. 510-517, 1999. GIAMI, S. Y. Chemical composition and nutritional attributes of selected newly developed lines of soybean (Glycine max L. Merr.). Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 82, p. 1735–1739, 2002. GIAMI, S. Y. Compositional and nutritional properties of selected newly developed lines of cowpea (Vigna unguiculata L.Walp). Journal of Food Composition and Analysis, v. 18, p. 665–673, 2005. GIESE, E. C.; BARBOSA, A. M.; DEKKER, R. F. H. Pathways to bioactive oligosaccharides: biological functions and potential applications. In: ITO, R., MATSUO, Y. Handbook of carbohydrate polymers: development, properties and applications. Nova Science Publishers, New York, 2010, p. 279-309. GIESE, E. C.; COVIZZI, L. G.; DEKKER, R. F. H.; MONTEIRO N. K.; CORRADI DA SILVA, BARBOSA, A. M. Enzymatic hydrolysis of botryosphaeran and laminarin by β-1,3-glucanases produced by Botryosphaeria rhodina and Trichoderma harzianum Rifai. Process Biochemistry, v. 41, p. 1265–1271, 2006. GIFONI J. M. Propriedades Bioquímicas e Funcionais de uma Proteína Ligante à Quitina Purificada de Sementes de Moringa oleifera Lmarck . (2009). Tese (Doudorado em Boquímica) Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009.

283

GILANI, G. S.; COCKELL, K. A.; SEPEHR, E. Effects of antinutritional factors on protein digestibility and amino acid availability in foods. Journal of AOAC International , v. 88, n. 3, p. 967–987, 2005. GIULIETTI, A. M. (ed) Diagnóstico da vegetação nativa do bioma Caatinga, In: SILVA, J. M. C., TABARELLI, M., FONSECA, M. F., LINS, L. V. Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias (orgs.) Brasília, DF, 2004. p. 47-78. GIULIETTI, A. M.; HARLEY, R. M.; QUEIROZ, L. P.; BARBOSA, M. R. V.; BOCAGE NETA, A. L.; FIGUEIREDO, M. A. Plantas endêmicas da caatinga. In: Vegetação e flora das caatingas. SAMPAIO, E. V. S. B.; GIULIETTI, A. M.; VIRGÍNIO, J.; GAMARRA-ROJAS, C. F. L. (Eds.). APNE / CNIP, Recife, PE, 2002. GOBERT, A. P.; MERSEY, B. D.; CHENG, Y.; BLUMBERG, D. R.; NEWTON, J. C.; WILSON, K. T. Cutting edge: urease release by Helicobacter pylori stimulates macro-phage inducible nitric oxide synthase. The Journal of Immunology, v. 168, p. 6002-6, 2002. GODFREY, N. W.; MERCY, A. R.; EMMS, Y.; PAYNE, H.G. Tolerance of growing pigs to lupin alkaloids. Australian Journal of Experimental Agriculture , v. 25, p. 791–795, 1985. GODFREY, T.; S.WEST. Industrial enzymology. 2a ed., MacMillan Publishers Inc., New York,1996, 609 p. GÓES, G. B.; NERI, D. K. P.; CHAVES, J. W. N.; MARACAJÁ, P. B. Efeito de extratos vegetais no controle de spodoptera frugiperda (j. e. smith) (lepidoptera: noctuidae). Caatinga, v. 16, p. 47-49, 2003. GOLAWASKA, S. Deterrence and toxicity of plant saponins for the aphid Acyrthosiphon pisum Harris. Journal of Chemical Ecology, v. 33, p.1598−1606, 2007. GOMES, V. M.,. OLIVEIRA, A. E. A., XAVIER-FILHO, J. A chitinase and a β-1,3-glucanase isolated from the seeds of cowpea (Vigna unguiculata L. (Walp)) inhibit growth of fungi and insect pests of the seed. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 72, p. 86–90, 1996. GONZÁLEZ, F.H.D. Uso de perfil metabólico para determinar o status nutricional em gado de corte. In:GONZÁLEZ, F.H.D.; BARCELLOS, J.O; OSPINA, H.; RIBEIRO, L.A.O. (Eds). Perfil Metabólico em ruminantes: seu uso em nutrição e doenças nutricionais. Porto Alegre, Brasil, Gráfica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2000. GONZÁLEZ DE MEJÍA, E.; ROCHA, N.; WINTER, H. C.; GOLDSTEIN, I. J. Differential effect of a lectin from mesquite (Prosopis juliflora) on HeLa and normal human keratinocyte cells. The FASEB Journal, v.15, n. 4:, p.128, 2002. GONZÁLEZ, F. H. D.; SILVA, S. C. Introdução à bioquímica clínica veterinária. Porto Alegre: Gráfica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 357p., 2006. GOODAY, G. The ecology of chitin degradation. Microbial Ecology, v. 10, p. 387-431, 1990.

284

GOORMACHTIG, S.,; LIEVENS, S.; VAN DE VELDE, W.; VAN MONTAGU, M.; HOLSTERS, M. Srchi 13, a novel early nodulin from Sesbania rostrata, is related to acidic class III chitinases. The Plant Cell, v. 4, p. 425–433, 1998. GORCHOV, D. L.; PALMEIRIM, J. M.; JARAMILLO, M.; ASCORRA, C. F. Dispersal of seeds of Hymenaea courbaril (Fabaceae) in a logged rain forest in the Peruvian Amazonian. Acta amazonica, v.34, n.2, p.251-259, 2004. GOVINDARAJAN, M.; KARUPPANNAN. P. Mosquito larvicidal and ovicidal properties of Eclipta alba (L.) Hassk (Asteraceae) against chikungunya vector, Aedes aegypti (Linn.) (Diptera: Culicidae). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, p. 24-28, 2011. GRAHAM, K. K.; KERLEY, M. S.; FIRMAN, J. D.; ALLEE, G. L. The effect of enzyme treatment of soybean meal on oligosaccharide disappearance and chick growth performance. Poultry Science, v. 81, p. 1014–1019, 2002. GRAHAM, L. S.; STICKLEN, M. B. Plant chitinases. Canadian Journal of Botany, v. 72, p.1057–1083, 1994. GRANGEIRO, T. B.; CASTELLÓN, R. E. R.; ARAÚJO, F. M. M. C.; SILVA, S. M. S.; FREIRE, E. A.; CAJAZEIRAS, J. B.; ANDRADE NETO, M.; GRANGEIRO, M. B.; CAVADA, B. S. Composição Bioquímica da Semente. In: FREIRE FILHO, F. R.; LIMA, J. A. A., RIBEIRO, V. Q., (eds.). Feijão-Caupi: Avanços Tecnológicos. Brasília-DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2005. Cap. 9. p. 337-365. GRANT, G.; EDWARDS, J. E.; EWAN, E. C.; MURRAY, S.; ATKINSON, T.; FARNINGHAM, D. A. H., PUSZTAI, A. Secretion of pancreatic digestive enzymes induced in rats by first-time oral exposure to kidney bean E2L2 lectin is mediated only in part by cholecystokinin (CCK). Pancreas, v. 19, p. 382 389, 1999. GREGOR L. B.; TARINA, C.; HEINLEIN, M.; DI SERIO, F.; MEINS JR.; F., IGLESIAS.V. A. Local expression of enzymatically active class I β-1, 3-glucanase enhances symptoms of TMV infection in tobacco. The Plant Journal, v. 28. p. 361–369, 2001. GRENBY, T. H. Intense sweeteners for the food industry: an overview. Trends in Food Science & Technology, v. 2, p. 2–6, 1991. GRIESHOP, C. M.; REESE, D. E.; FAHEY JR., G.C. Nonstarch Polysaccharides and Oligosaccharides in Swine Nutrition. In: LEWIS, A.J. and SOUTHERM, L.L. (Eds.) Swine Nutrition. 2 a ed. New York, p.107-130, 2001. GROSJEAN, F.; MÉTEAYER, J. P.; PEYRONNET, C.; CARROUÉE, B. Variability in trypsin inhibitor activity of peas (Pisum sativum) grown in France. In: VAN DER POEL, A. F. B.; HEUSMAN, J.; SAINI, H. S., (eds.). Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds. Wageningen Press,1993, pp. 411. GRUSAK M. A. Enhancing mineral content in plant food products. Journal of the American College of Nutrition, v. 21, p. 178S–183S, 2002.

285

GRUSAK, M. A., Legumes: types and nutritional value. In: ALLEN L, PRENTICE A (Eds.) Encyclopedia of human nutrition, 2a ed. Elsevier, New York, p. 120–125, 2005. GRUSAK, M. A., Genetic Diversity for Seed Mineral Composition in the Wild Legume Teramnus labialis. Plant Foods for Human Nutrition, v. 63, p.105–109, 2008. GUERRA, M. J. M.; BARREIRO, M. L.; RODRIGUES, Z. M.; RUBLACABA, Y. Actividad antimicrobiana de um extracto fluido al 80% de Schinus tere-binthifolius Roddi (Copal). Revista Cubana de Plantas Medicinais, v. 5, p. 23–25, 2000. GUIL, J. L.; RODRÍGUEZ-GARCÍA I.,; TORIJA E. Nutritional and toxic factors in selected wild edible plants. Plant Foods for Human Nutrition, v. 51, p. 99–107, 1997. GULEWICZ, P.; CIESIOLKA, D.; FRÍAS, J.; VIDAL-VALVERDE, C.; FREJNAGEL, S.; TROJANOWSKA, K., et al Simple method of isolation and purification of a-galactosides from legumes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 48, p. 3120–3123, 2000. GUPTA, Y. P. Nutritive value of food legumes. In: ARORA, S. K. (Ed.), Chemistry and biochemistry of Food legumes, Oxford e IBH Publishing Company New Delhi, India, 1982. Cap. 7. GUZMÁN-PARTIDA, A. M.; ROBLES-BURGUEÑO M. R.; ORTEGA-NIEBLAS, M.; VÁZQUEZ-MORENO I. Purification and characterization of complex carbohydrate specific isolectins from wild legume seeds: Acacia constricta is (vinorama highly homologous to Phaseolus vulgaris lectins. Biochimie, v. 86, p. 335–342, 2004. HAANWINCKEL, R. Z.; MIGOWISKI, E.; REI, B. Pelagonium sidoides: uma alternativa nas infecções do trato respiratório? Revista da Sociedade Médica do Estado do Rio de Janeiro. 2006. HABIBA, R. A. Changes in anti-nutrients, protein solubility, digestibility and HCl-extractability of ash and phosphorus in vegetable peas as affected by cooking methods. Food Chemistry, v. 77, p. 187–192, 2002. HACISEFEROGULLARE, H.; GEZER, I.; BAHTIYARCA, Y.; MENGES, H. O. Determination of some chemical and physical properties of Sakiz faba bean (Vicia fava L. Var. Major). Journal of food engineering, v. 60, n. 4, p. 475-479, 2003. HAHLBROCK, J. B. Flavonoids In: CONN, E. E. The biochemistry of plants. A comprehensive treatise. Academic Press, p. 425-591, 1981. HARBORNE, J. B. Phytochemical methods. A guide to modern techniques of plant analysis. Londres. Chapman and Hall, p. 288, 1984. HARBORNE, J. B. The flavonoids: Advances in research since 1986. Chapman and Hall, London. p. 499-535, 1993. HARLAND, J. Prevention is better than cure (soya isoflavones). Liquid Food and Drink Technology, v. 1, 2002.

286

HARVEY, J. M. Reduction of losses in fresh market fruits and vegetables. Annual Review of Phytopathology, v. 16, p. 321–341, 1978. HARWOOD, R. F. Development, structure, and function of coverings of eggs of floodwater mosquitoes. II. Post-ovarian structure. Annals of the Entomological Society of America, v. 51, p. 464–471, 1958. HASLAM, E., LILLEY, T., CAI, Y., MARTIN, R., MAGNOLATO, D. Traditional herbal medicines – the role of polyphenols. Planta Medica, v. 55, p. 1–8,1989. HASLAM, E. Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs: possible modes of action. Journal of Natural Products, v. 59, p. 205–215, 1996. HASHIMOTO, G.; NISHIMOTO, Y. Illustrated Cyclopedia of Brazilian Medicinal Plants. Kamakura: Aboc-sha Press, 1996. 676p. HAY, A. E.; GUILET, D.; MOREL, C.; LARCHER, G.; MACHEREL, D.; LE RAY, A. M.; LITAUDON, L.; RICHOMME, P. Antifungal chromans inhibiting the mitochondrial respiratory chain of pea seeds and new xanthones from Calophyllum caledonicum. Planta medica, v. 69, n. 12, p. 1130-1135, 2003. HELLEBOID, S.; HENDRIKS, T.; BAUW, G.; INZE, D.; VASSEUR, J.; HILBERT, J. L. Three major somatic embryogenesis related proteins in Cichorium identified as PR proteins. Journal of Experimental Botany, v. 51, p. 1189–1200, 2000. HENG, L.; VINCKEN, J.-P.; VAN KONINGSVELD, G. A.; LEGGER, L.; GRUPPEN, H.; VAN BOEKEL, M. A. J. S.; ROOZEN, J. P.; VORAGEN, A. G. J. Bitterness of saponins and their content in dry peas. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 86, p. 1225–1231, 2006. HEGNAUER, R. (1964). Chemotaxonomie der Pflanzen III. Birkh¨ auser Verlag, Basel. In: LIMA, M. R. F.; LUNA, J. S.; SANTOS, A. F.; ANDRADE, M. C. C. (Eds.) Anti-bacterial activity of some Brazilian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 105, p. 137-147, 2005. HILDER, V. A.; BOULTER, D. Genetic engineering of crop plants for insect resistance—a critical review. Crop Protection, v. 18, p. 177–191, 1999. HILDER, V. A; GATEHOUSE, A. M. R.; SHERMAN, S. E.; BARKER, R. F; BOULTER, D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature, v. 300, p. 160-163, 1987. HISSA, D. C.; VASCONCELOS, I. M.; CARVALHO, A. F. U.; NOGUEIRA, V. L. R.; CASCON, P.; ANTUNES, A. S. L.; MACEDO, G. R.; MELO, V. M. M. Novel surfactant proteins are involved in the structure and stability of noam nests from the frog Leptodactylus vastus. Journal of Experimental Biology, v. 211, p. 2707-2711, 2008. HO, V. S.; NG, T. B. Chitinase-like proteins with antifungal activity from emperor banana fruits. Protein and Peptide Letters, v. 14, p. 828–831, 2007.

287

HOCQUEMILLER, R.; CORTES, D.; ARANGO, G. J.; MYINT, S. H.; CAVE, A.; ÂNGELO, A.; MUNOZ, V.; FOURNET, A. Isolation and synthesis of espintanol, new antiparasitic monoterpene. Journal of Natural Products, v. 54, P. 445–52, 1991. HOLETZ, F. B.; PESSINI, G. L., SANCHES, N. R.; CORTEZ, D. A. G.; NAKAMURA, C. V.; DIAS FILHO, B. P. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, n. 7, p. 1027-1031, 2002. HOLLEY, R. A.; PATEL, D. Improvement in Shelf-life and safety of Perishable foods by plant essencial oils and Smoke Antimicrobial. Food Microbiology. v. 22, p. 2273–292, 2005. HOSSAIN, M. A.; BECKER, K. Nutritive value and antinutritional factors in different varieties of Sesbania seeds and their morphological fractions. Food Chemistry, v. 73, n. 4, p. 421-431, 2001. IBRAHIM, G. H.; SMARTT, C. T.; KILEY, L. M.; CHRISTENSEN, B. M. Cloning and characterization of a chitin synthase cDNA from the mosquito Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 30, p. 1213–1222, 2000. IFPRI - International Food Policy Research Institute. Improve Child Nutrition to Reduce Global Hunger, Says New Global Hunger Index . Disponível em: http://www.ifpri.org/ acesso em 05 fevereiro de 2011. IORIO, E.; TOROSANTUCCI, A.; BROMURO, C.; CHIANI, P.; FERRETTI, A.; GIANNINI, M.; CASSONE, A.; PODO, F. Candida albicans cell wall comprises a branched β-D-(1,6)-glucan with β-D-(1,3)- side chains. Carbohydrate Research, v. 343, p. 105-1061, 2008. IROBI, O. N.; DARAMBOLA, S. O. Antifungal activities of crude extract of Mitracarpus villosus (Rubiaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 40, 137-140, 1993. IQBAL, A.; IQTIDAR A.; KHALIL, I. A.; ATEEQ, A.; KHAN, M. S. Nutritional quality of important food legumes. Food Chemistry, v. 97, p. 331–335, 2006. ISHOLA, M. M.; AGBAJI, E. B.; ABGAJI, A. S. A. A chemical study of Tamarindus indica fruits grown in Nigeria. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 51, n. 1, p. 141-143, 1990. JACH, G.; GORNHARDT, B.; MUNDY, J.; LOGEMANN, J.; PINSDORF, E.; LEAH, R.; SCHELL, J.; MASS, C. Enhanced quantitative resistance against fungal diseases by combinational expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. The Plant Journal, v. 8, p. 97-109, 1995. JAIN, A. K.; KUMAR, S.; PANWAR, J. D. S. Antinutritional factors and theirdetoxification in pulses — A review. Agriculture Reviews, v. 30, p. 64−70, 2009. JAMROZ, D.; KUBIZNA, J. Harmful substances in legume seeds - their negative and beneficial properties. Polish Journal of Veterinary Sciences, v. 11, p. 389–404, 2008.

288

JANSEN, C. C.; BEEBE, N. W. The dengue vector Aedes aegypti: what comes next. Microbes and Infection, v. 12, p. 272-279, 2010. JANSMAN, A. J. M. Tannins in feedstuffs for simple stomached animals. Nutrition Research Reviews, v. 6, p. 209–236, 1993. JARIAL, M. S. Toxic Effect of Garlic Extracts on the Eggs of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): A Scanning Electron Microscopic Study. Journal of Medical Entomology, v. 38, n. 3, p. 446-450, 2001. JAWETZ, E.; MELNICK, J. L.; ADELBERG, E. A. Microbiologia Médica, Premier, São Paulo, 1998. JIMÉNEZ-MARTÍNEZ, C.; HERNÁNDEZ-SÁNCHEZ, H.; ALVÁREZ-MANILLA, G.; ROBLEDO-QUINTOS, N.; MARTÍNEZ-HERRERA, J.; DÁVILAORTIZ, G. Effect of aqueous and alkaline thermal treatments on chemical composition and oligosaccharide, alkaloid and tannin contents of Lupinus campestris seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture , v. 81, p. 421–428, 2001. JOHNSSON, I. D.; OBST, J. M.; DAVIES, R. Observations on the use of lupin feeding or exogenous hormones to improve the reproductive performance of stud and commercial ewes in the southeast of South Australia. Wool technology and sheep breeding, v. 30, p. 23–30, 1982. JOHNSON, L. T.; GEE, J. M.; PRICE, K. R.; CURL, C. L.; FENWICK, G. R. Influence of saponins in gut permeability and active nutrient transport in vitro. Journal of Nutrition , v. 116, p. 2270–2272, 1986 JOHNSON, R.; NARVAEZ, J.; AN, G., RYAN, C. A. Expression of proteinase inhibitors I and II, in trangenic tabacco plants: effects on natural defense against Manduca sexta larvae. Journal of Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 86, p. 9871-9875, 1989. JONGEDIJK, E.; TIGELAAR, H.; VAN ROEKEL, J. S. C.; BRES-VLOE-MANS, S. A.; DEKKER, I.; VAN DEN ELZEN, P. J. M.; CORNELISSEN, B. J. C.; MELCHERS, L. S. Synergistic activity of chitinases and b-1,3-glucanases enhances fungal resistance in transgenic tomato plants, Euphytica, v.. 85, p. 173-180, 1995. JOOD, S.; MEHTA, U.; SINGH, R.; BHAT, C. M. Effect of processing on flatus producing factors in legumes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 33, p. 268–271, 1985. JOSEPHINE, M. R.; JANARDHANAN, K. Studies on chemical composition and antinutritional factors in three germplasm seed materials of the tribal pulse, Mucuna pruriens (L.) DC. Food Chemistry, v. 43, p.13–18,1992. JOUANIN, L.; BONADE-BOTTINO, M.; GIRARD, C.; MORROT, G.; GIBAND, M. Transgenic plants for insect resistance. Plant Science, v. 131, p. 1–11, 1998. JUL, L. B.; FLENGMARK, P.; GYLLING, M.; ITENOV, K. Lupin seed (Lupinus albus and Lupinus luteus) as a protein source for fermentation use. Industrial Crops and Products, v.18, p. 199–211, 2003.

289

KACHANECHAI, T.; JANTAWAT, P.; PICHYANGKURA, R. The influence of chitosan on physico-chemical properties of chicken salt-soluble protein gel. Food Hydrocolloids, v. 22, p. 74–83, 2008. KADAM, S. S.; SMITHARD, R. R.; EYRE, M. D.; ARMSTRONG, D. G.. Effects of heat treatments on antinutritional factors and quality of proteins in winged bean. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 39, p. 267–275,1987. KAKADE, M. L.; SIMONS, N. R.; LIENER, I. E. An evaluation of natural vs synthetic substract for measuring the antitryptic of soybean samples. Cereal Chemistry, Saint Paul, v.46, n.4, p. 518-526, 1969. KAKADE, M. L.; SIMONS, N. R.; LIENER, I. E.; LAMBERT, J. W. Biochemical and nutritional assessment of different varieties of soybeans. Journal of Agricultural Food Chemistry, v. 20, p. 87–90, 1972. KAKU, H.; NISHIZAWA, Y.; ISHII-MINAMI, N.; AKIMOTO-TOMIYA MA, C.; DOHMAE, N.; TAKIO, K.; MINAMI, E.; SHIBUYA, N., Plant cells recognize chitin fragments for defense signaling through a plasma membrane receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences-USA, v. 103, p. 11086–11091, 2006. KALISZ, H. M. Microbial proteinases. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, v. 36, p. 1-65, 1988. KALOGEROPOULOS, K.; CHIOU, A.; IOANNOU, M.; KARATHANOS, V. T.; HASSAPIDOU, M.; ANDRIKOPOULOS, N. K. Nutritional evaluation and bioactive microconstituents (phytosterols, tocopherols, polyphenols, triterpenic acids) in cooked dry legumes usually consumed in the Mediterranean countries. Food Chemistry, v. 121, p. 682–690, 2010. KAPLAN, A. The determination of urea, amonia and urease. In: GLICK, D. (Ed.) Methods of biochemical analysis. New York, USA: John Wiley & Sons, 1969. p. 311-314. KARUNGI, J.; ADIPALA, E.; OGENGA-LATIGO, M. W.; KYAMANYAWA, S.; OYOBO, N.; JACKAI, L. E. N. Pest management in cowpea. Part 2. Integrating planting time, plant density & inseticide application for the controlo f cowpea field pests in eastern Uganda. Crop Protection, v.19, p. 237-245, 2000. KASPRZEWSKA A. Plant chitinases: Regulation and function. Cellular and Molecular Biology Letters, v. 8, p. 809–824, 2003. KATO, N.; MUELLER, C. R.; FUCHS, J. F.; WESSELY, V.; LAN, Q.; CHRISTENSEN, B. M. Regulatory mechanisms of chitin biosynthesis and roles of chitin in peritrophic matrix formation in the midgut of adult Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 36, p. 1–9, 2006. KAWASE, T.; YOKOKAWA, S.; SAITO, A.; FUJII, T.; NIKAIDOU, N.; MIYASHITA, K.; WATANABE, T. Comparison of enzymatic and antifungal properties between family 18 and

290

19 chitinases from S. Coelicolor A3(2). Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 70, p. 988–998, 2006. KAYSER, O.; KIDERLEN, A. F.; CROFT, S. L. Natural products as antiparasitic drugs. Parasitology Research, v. 90, p. S55–62, 2003. KELEMU, S.; CARDONA, C.; SEGURA, G. Antimicrobial and insecticidal protein isolated from seeds of Clitoria ternatea, a tropical forage legume. Plant Physiology and Biochemistry, v. 42, p. 867–873, 2004. KEMBHAVI, A. A.; BUTTLE, D. J.; KNIGHT, C. G.; BARRETT, A. J. The two cysteine endopeptidases of legume seeds: purification and characterization by use of specific flurometric assay. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 303, p. 208-213, 1993. KENNEDY, A. R. The evidence for soybean products a cancer preventive agents. Journal of Nutrition , v. 125, p. 733–43S, 1995. KENNEDY, A. R. Chemopreventive agents: protease inhibitors. Pharmacology & Therapeutics, v. 78, p. 167-209, 1998a. KENNEDY, A. R. The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as an anticarcinogenic agent, The American Journal of Clinical Nutrition , v. 68, p. 1406S-1412S, 1998b. KHAN, M. R.; KIHARA, M.; OMOLOSO, A. D., Antimicrobial activity of Calophyllum soulattri. Fitoterapia, v. 73, p. 741-743, 2002. KHATTAB, R. Y.; ARNTFIELD S. D. Nutritional quality of legume seeds as affected by some physical treatments 2. Antinutritional factors. LWT - Food Science and Technology, v. 42, p. 1113–1118, 2009. KHATTAB, R. Y., ARNTFIELD, S. D., NYACHOTI, C. M. Nutritional quality of legume seeds as affected by some physical treatments, Part 1: Protein quality evaluation. LWT - Food Science and Technology, v. 42, p. 1107–1112, 2009. KHON, R. A.; DINEEN, M. M.; RUSSEK-COHEN, E. Using blood urea nitrogen to predict nitrogen excretion and efficiency of nitrogen utilization in cattle, sheep, goats, horses, pigs and rats. Journal of Animal Science, v. 83, n. 4, p. 879-889, 2005. KIM, J. Y.; PARK, S. C.; KIM, M. H.; LIM, H. T.;, PARK, Y.; HAHM, K. S. Antimicrobial activity studies on a trypsin–chymotrypsin protease inhibitor obtained from potato. Biochemical and Biophysical Research, v. 330, p. 921-927, 2005. KIM, K. S.; CHANG, J. E.; YUN, H. S. Estimation of a soluble β-glucan content of yeast cell wall by the sensitivity to Glucanex 200G treatment. Enzyme and Microbial Technology. v, 35, n.6, p.672, 2004. KIRAN, S. R.; BAVHANI, K.; DEVI, P. S.; RAO, B. R. R.; REDDY, K. J. Composition and larvicidal activity of leaves and stem essential oils of Chloroxylon swietenia DC against Aedes aegypti and Anopheles stephensi. Bioresource Technology, v. 97, p. 2481–2484. 2006.

291

KIRK, O.; BORCHET, T. V.; FUGLSANG, C. C. Industrial enzyme applications. Current Opinion Biotechnology, v. 13, p. 345-351, 2002. KIRUBAKARAN, S. I.; SAKTHIVEL, N. Cloning and over expression of antifungal barley chitinase gene in Escherichia coli. Protein Expression and PuriWcation, v. 52, p. 159–166, 2007. KISHIMOTO, K.; NISHIZAWA, Y.; TABEI, Y.; NAKAJIMA, M.; HIB I, T.; AKUTSU, K. Transgenic cucumber expressing an endogenous class III chitinase gene has reduced symptoms from Botrytis cinerea. Journal of General Plant Pathology, v. 70, p. 314–320, 2004. KITAGAWA, I. Licorice root. A natural sweetener and an important ingredient in Chinese medicine. Pure and Applied Chemistry, v. 74, p. 1189–1198, 2002. KOEHNLE, T. J.; RUSSEL, M. C.; GIETZEN, D. W. Rats rapidly reject diets deficient in essential amino acids. Journal of Nutrition , v. 133, p. 2331-2335, 2003. KORATKAR, R.; RAO, A. V. Effect of soya bean saponins on azoxymethane-induced preneoplastic lesions in the colon of mice. Nutrition and Cancer, v. 27, p. 206–209, 1997. KORDA’S, K.; BURGHARDT, B.; KISFALVI, K.; BARDOCZ, S.; PUSZTAI, A.; VARGA, G. Diverse effects of phytohaemagglutinin on gastrointestinal secretions in rats. The Journa of. Physiology, v. 94, p. 31–36, 2000. KORDÁS, K.; SZALMAY, G.; BARDOCZ, S.; PUSZTAI, A.; VARGA, G. Phytohaemagglutinin inhibits gastric acid but not pepsin secretion in conscius rats. The Journa of. Physiology, v. 95, p. 309–314, 2001. KRAMER, K. J.; MUTHUKRISHNAN, S. Chitin metabolism in insects. In: GILBERT, L. I., IATROU, K., GILL, S. (Eds.), Comprehensive Molecular Insect Science. Biochemistry and Molecular Biology, v. 4, p.111–144, 2005. KRIS-ETHERTON, P. M.; HECKER, K. D.; BONANOME, A.; COVAL, S. M.; BINKOSKI, A. E.; HILPERT, K. F.; GRIEL, A. E.; ETHERTON, T. D. Bioactive compounds in foods: their role in the prevention of cardiovascular disease and câncer. The American Journal of Medicine, v. 113, n. 30, p. 71-88, 2002. KUDAN, S.; PICHYANGKURA, R. Purification and Characterization of Thermostable Chitinase from Bacillus licheniformis SK-1. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 157, p. 23 – 35, 2009. KUMAR, V. P.; CHAUHAN, N. S.; PADH, H.; RAJANI, M. Search for antibacterial and antifungal agents from selected Indian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 107 p. 182–188, 2006. KUMARASAMY, Y.; COX, P. J.; JASPARS, M.; NAHAR, L.; SARKER, S. D. Screening seeds of Scottish plants for antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 83, p. 73-77, 2002.

292

KUO, C. J.; LIAO, Y. C.; YANG, J. H.; HUANG, L. C.; CHANG, C. T., SUNG, H. Y. Cloning and characterization of an antifungal class III chitinase from suspension-cultured bamboo (Bambusa oldhamii) cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, p.11507–11514, 2008. KUZAYALI, M. V.; COWAN, J. W.; SABRY, Z. I. (1966) Nutritive value of middle eastern foodstuffs – II. Composition of pulses, seeds, nuts and cereal products of Lebanon. In : SRIDHAR, K. R.; SEENA, S. Nutritional and antinutritional significance of four unconvention legumes of the genus Canavalia – A comparative study. Food Chemistry, v. 99, p. 267-288, 2006. LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophague T4. Nature, v. 227, p. 689-695, 1970. LAJOLO, F. M., GENOVESE, M. I. Nutritional significance of lectin and enzyme inhibitors from legumes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, p. 6592–6598, 2002. LALLÈS, J. P.; JANSMAN, A. J. M. Recent progress in the understanding of the mode of action and effects of antinutritional factors from legume seeds in non-ruminant farmanimals. In: JANSMAN, A. J. M., HILL, G. D., HUISMAN, J., VAN DER POEL, A. F. B. (Eds.), Recent Advances of Research in Antinutritional Factors in Legume Seeds and Rapeseed. Centre for Agricultural Publishing and Documentation (PUDOC),Wageningen, 1998, p. 219–232. LAM, S. K.; NG, T. B. Passiflin, a novel dimeric antifungal protein from seeds of the passion fruit. Phytomedicine, v. 16, p.172–180, 2009. LAURENTINO DE CARVALHO, M. S.; CALDAS, E. D.; DEGALLIER, N.; VILARINHOS, P. T. R.,; SOUZA, L. C. K. R.; YOSHIZAWA, M. A. C.; KNOX, M. B.; OLIVEIRA, C. Susceptibility of Aedes aegypti larvae to the insecticide temephos in the Federal District, Brazil. Revista de Saúde Pública, v. 38, n.5, p. 1-6, 2004. LAWRENCE, P. K.; KOUNDAL, K. R. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. Electronic Journal of Biotechnology, v. 5, n.1, p. 93-109, 2002. LEAH, R.; TOMMERUP, H.; SVENDSEN, I.; MUNDY, J., Biochemical and molecular characterization of three barley seed proteins with antifungal properties, The Journal of Biological Chemistry, v. 266, p. 1564-1573, 1991. LEAL, I. R.; TABARELLI, M.; SILVA. J. M. C. Ecologia e conservação da Caatinga. Editora Universitária, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil, 2003. LEDOIG,T G.; GRIFFAUT, B.; DEBITON, E.; VIAN, C.; MUSTEL, A.; EVRAY, G.; MAURIZIS, J. C.; MADELMONT, J. C. Analysis of secreted protease inhibitor safter water stress in potato tubers. International Journal of Biological Macromolecules, v. 38, p. 268-271, 2006.

293

LEE, O. S.; LEE, B.; PARK, N.; KOO, J. C.; KIM, Y. H.; PRASAD D, T.; KARIGAR, C.; CHUN, H. J.; JEONG, B. R.; KIM, D. H.; NAM, J.; YUN. J.-G.; KWAK, S.-S.; CHO, M. J.; YUN, D.-J. Pn-AMPs, the hevein-like proteins from Pharbitis nil confers disease resistance against phytopathogenic fungi in tomato, Lycopersicum esculentum. Phytochemistry, v. 62, p. 1073–1079, 2003. LEE, Y-S.; PARK, I-H.; YOO, J-S.; CHUNG, S-Y.; LEE, Y-C.; CHO, Y-S.; AHN, S-C.; KIM, C-M.; CHOI, Y-L. Cloning, purication, and characterization of chitinase from Bacillus sp. DAU101. Bioresource Technology, v. 98, p. 2734–274, 2007. LETERME, P. Recommendatios by health organizations for pulse consumption. British Journal of Nutrition , v. 88, p. S239-S242, 2002. LEUBNER-METZGER, G.; MEINS JR. F. Functions and regulation of plant b-1,3-glucanases (PR-2). In: Datta, S.K. Muthukrishnan S. (Eds.), Pathogenesis-Related Proteins in Plants, CRC Press, Boca Raton, FL, 1999, pp. 49- 76. LEVY, S. B. Antibiotic resistance the problem intensifies. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 57, p. 1446-1450, 2005. LEWIS, G. P. Legumes of Bahia. The Royal Botanic Garden, Whitstasble, 1987. LIENER, I. .E; SHARON, N.; GOLDSTEIN, I.J. The lectins: properties, functions and applications in biology and medicine. FL: Academic Press, Orlando, 1986. LIENER, I. E. Implications of antinutritional components in soybean foods. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 34, n. 1, p. 31-67, 1994. LIENER, I. E. legume toxins in relation to protein digestibility – a review. Journal of Food Science, v. 41, p. 1076–1081, 1976. LIENER, I. E. Toxic factors in legumes and their elimination. American Journal of Clinical Nutrition , v. 11, p. 281–298, 1962. LIMA, M. R. F.; LUNA, J. S.; SANTOS, A. F.; ANDRADE, M. C. C.; SANTANA A. E. G.; GENET, J-P.; MÁRQUEZ, B.; NEUVILLE, L.; MOREAU, N. Anti-bacterial activity of some Brazilian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 105, p. 137-147, 2005. LIMA, E. O. Plantas e suas propriedades antimicrobianas: uma breve análise histórica. In: Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Agros, Chapecó, 2001, p. 479-499. LIMA, S. L. T.; JESUS, M. B.; SOUSA, R. R. R, OKAMOTO, A. K., LIMA, R., FRACETO, L. F. Estudo da Atividade Proteolítica de Enzimas Presentes em Frutos. Química Nova Na Escola, n. 28, p. 47-49, 2008. LIMA, V. L. M.; CORREIA, M. T. S.; CECHINELA, Y. M. N.; SAMPAIO, C. A. M.; OWENC, J. S.; COELHO, LUANA C. B. B. Immobilized Cratylia mollis lectin as a potential matrix to isolate plasma glycoproteins, including lecithin-cholesterol acyltranferase. Carbohydrate Polymers, v. 33, n. 1, p. 27-32, 1997.

294

LIN, P.; NG, T. B. A stable trypsin inhibitor from Chinese dull black soybeans with potentially exploitable activities. Process Biochemistry, v. 43 p. 992-998, 2008. LIN, Y. H.; LI, H. T.; HUANG, Y. C.; HSIEH, Y. C.; GUAN, H. H.; LIU, M. Y.; CHANG, T.; WANG, A. H. J.; CHEN, C. J. Purification, crystallization and preliminary Xray crystallographic analysis of rice Bowman-Birk inhibitor from Oryza sativa. Acta Crystallographica, v. F62:, p.522-524, 2006. LIU, C. H.; ZOU, W. X.; LU, H.; TAN, R. X. Antifungal activity of Artemisia annua endophyte cultures against phytopathogenic fungi. Journal of Biotechnology, v. 88, p. 277– 282, 2001. LIU, Y.; DAMMANN, C.; BHATTACHARYYA, M. K. The matrix metalloproteinase gene GmMMP2 is activated in response to pathogenic infections in soybean. Plant Physiology, v. 127, p. 1788–1797, 2001. LOGUERCIO, C.; FEDERICO, A.; TUCCILLO, C.; TERRACCIANO, F.; D'AURIA, M. V.; DE SIMONE, C.; DEL VECCHIO BLANCO C. Beneficial effects of a probiotic on parameters of liver dysfunction in chronic liver diseases. Journal of Clinical Gastroenterology, v. 39, n. 6, p. 540-543, 2005. LORENZI, H. Árvores Brasileiras: Manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. v. 2, 2ª ed. Instituto Plantarum, Nova Odessa , 1998. LORENZI, H. Árvores Brasileiras: Manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas do Brasil. v.2, 4ª.ed., Instituto Plantarum, Nova Odessa, 2002. 368p. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: Nativas e exóticas. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2002. 512p. LORITO, M.; WOO, S. L.; GARCIA, I.; COLUCCI, G.; HARMAN, G. E.; PINTOR-TORO, J. A.; FILIPPONE, E.; MUCCIFORA, S.; LAWRENCE, C. B.; ZOINA, A.; TUZUN, S.; SCALA, F. Genes from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 95, p. 7860–7865, 1998. LOUREIRO, A. A.; SILVA, M. F.; ALENCAR, J. C. Essências madeireiras da Amônia. Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, Manaus, v. 1,1979. LU X-Y.; WANG A-L.; YANG H-L.; LAI R. A Novel Trypsin Inhibitor from Bungarus fasciatus Venom. Chinese Journal of Natural Medicines, v. 6, p. 0153-0158, 2008. LUNA, J. S.; SANTOS, A. F.; LIMA, M. R. F.; OMENA, M. C.; MENDONÇA, F. A. C.; BIEBER, L. W.; SANT’ANA, A. E. G. A study of the larvicidal and molluscicidal activities of some medicinal plants from northeast Brazil. Journal Ethnopharmacol, v. 97, p. 199-206, jan. 2005.

295

MACEDO, M. L. R.; MATOS, D. G. G.; MACHADO, O. L. T.; MARANGONI, S.; NOVELLO, J. C. Trypsini inhibitor from Dimorphandra mollis seeds: purification and properties. Phytochemistry, v. 54, p. 553-558, 2000. MACEDO, M. L. R.; FREIRE, M. G. M.; SILVA, M. B. R.; COELHO, L. C. B. B. Insecticidal action of Bauhinia monandra leaf lectin (BmoLL) against Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae), Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculates (Coleoptera: Bruchidae). Comparative Biochemistry and Physiology, v. 146, p. 486-498, 2006. MACEDO, M. L. R.; FREIRE, M.G. M.; SILVA, M. B. R.; COELHO. L. C. B. B. Insecticidal action of Bauhinia monandra leaf lectin (BmoLL) against Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae), Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae). Comparative Biochemistry and Physiology A, v. 146, n. 4, p. 486-498, 2007. MACIEL, M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA JUNIOR, V. F.; GRYNBERG, N. F.; ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidiciplinares. Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002. MACORIS, M. L. G.; ANDRIGHETTI, M. T. M.; TAKAKU, L.; GLASSER, C. M., GARBELOTO, V. C.; CIRINO, V. C. B. Alteration in susceptibility response of Aedes aegypti to organophosphates in cities in the state of S. Paulo, Brazil. Revista de Saúde Pública, v. 5, n.33, p. 521-522, out. 1999. MAHE, S.; GAUSSERES, N.; TOME, D. Legume proteins for human requirements. Grain Legumes, v. 7, p.15–17,1994. MAIA, F. M. M. Composição e caracterização nutricional de três cultivares de Vigna unguiculata (L.) Walp. EPACE 10, OLHO DE OVELHA E IPA-206. 2009. 87p. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 1996. MAIA, F. M. M.; OLIVEIRA, J. T. A.; MATOS, M. R. T.; MOREIRA, R. A.; VASCONCELOS, I. M. Proximate composition, amino acid content and haemagglutinanting and trypsin-inhibiting activities of some Brazilian Vigna ungiculata (L.) Walp cultivars. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 80, n. 4, p. 453-458, 2000. MAIA, G. N. Caatinga: árvore e arbustos e suas utilidades. D & Z Computação Gráfica, Leitura e Arte, São Paulo, 2004, 413 p. MAIKHURI, R. K.; NAUTIYAL, M. C.; KHALI, M. P. Lesser-known crops of food value in Garhwal Himalaya and a strategy to conserve them. FAO/IGPBR Plant Genet Resources Newsletter, v. 86, p. 33–36, 1991. MALHOTRA, S.; MISRA, K Anthraquinones from Cassia sophera heartwood. Phytochemistry, v. 21, p. 197, 1982. MANACH, C.; SCALBERT, A.; MORAND, C.; REMESY, C.; JIMENEZ, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition , v. 79, p.727–47, 2004.

296

MANCINI-FILHO, J.; LAJOLO, F. M.; VIZEU, D. M. Lectins from red kidney beans: radiation effect on agglutinating and mitogenic activity. Journal of Food Science, v. 44, n.4, p. 1194-1196, 1979. MANN, K.; FARIAS, C. M. S. A.; DEL SOL, F. G.; SANTOS, C. F.; GRANGEIRO, T. B.; NAGANO, C. S.; CAVADA, B. S.; CALVETE, J. J. The amino-acid sequence of the glucose/mannose-specific lectin isolated from Parkia platycephala seeds reveals three tandemly arranged jacalin-related domains. European Journal of Biochemistry, v. 268, p. 4414–4422, 2001. MANOCHA, M. S.; AND ZHONGHUA, Z. Immunocytochemical and cytochemical localization of chitinase and chitin in the infected hosts of a biotrophic mycoparasite Piptocephalis virginiana. Mycologia, v. 89, p. 185–194, 1997. MANSUR, J. F.; FIGUEIRA-MANSUR J.; SANTOS, A. S.; SANTOS-JUNIOR, H.; RAMOS, I. B.; MEDEIROS, M. N.; MACHADO, E. A.; KAISER, C. R.; MUTHUKRISHNAN, S.; MASUDA, H.; VASCONCELLOS, A. M. H.; MELO, A. C. A.; MOREIRA, M. F. The effect of lufenuron, a chitin synthesis inhibitor, on oogenesis of Rhodnius prolixus. Pesticide Biochemistry and Physiology, v. 98, p. 59–67, 2010. MARACAJÁ, P. B.; BATISTA, C. H. F.; SOUSA, A. H.; VASCONCELOS, W. E. Levantamento florístico e fitosociológico do extrato arbustivo-arbóreo de dois ambientes na Vila Santa Catarina, Serra do Mel, RN. Revista de Biologia e Ciências da terra, v. 3, 13 pp., 2003. MARSAIOLI, A. J.; LEITAO FILHO, H. F.; DE CAMPELLO, J. P. Diterpenes in bark of Hymenaea courbaril. Phytochemistry, v.14, p. 1882–1883, 1975. MARTIN, S.; FREITAS, R. A.; OBAYASHI, E.; SIERAKOWSKI, M.-R. Physico–chemical aspects of galactoxyloglucan from the seed of Hymenaea courbaril and its tetraborate complex. Carbohydrate Polymers, v. 54, p. 287–295, 2003. MARTINS, J. E. C. Plantas Medicinais de Uso na Amazônia, 2 a ed. Graficentro-CEJUP, Belém, 1989. MARTINEZ, M. J.; BETANCOURT, J.; ALONSO-GONZALES, N.; JAUREQUI, A. Screening of some Cuban medicinal plants for antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 52, p. 171–174, 1996. C. MARTÍNEZ-VILLALUENGA, C.; FRÍAS, J.; VIDAL-VALVERDE, C. Functional lupin seeds (Lupinus albus L. and Lupinus luteus L.) after extraction of α-galactosides. Food Chemistry, v. 98, p. 291-299, 2006. MARTÍNEZ-VILLALUENGA, C.; URBANO, G.; PORRES, J. M.; FRIAS, J.; VIDAL-VALVERDE, C. Improvement in food intake and nutritive utilization of protein from Lupinus albus var. multolupa protein isolates supplemented with ascorbic acid. Food Chemistry, v. 103, p. 944-951, 2007. MARTINS M. V. Leguminosas arbustivas e arbóreas de fragmentos florestais remanescentes no noroeste paulista, Brasil. (Dissertação), Mestrado em Ciências

297

Biológicas (Botânica) do Instituto de Biociências, Universidade Estadual de São Paulo, Botucatu-SP, 2009. MARTINS, J. E. C. Plantas Medicinais de Uso na Amazônia, 2a ed. Graficentro-CEJUP, Belém, 1989. MARTY, B. J., Chavez, E. R. Effects of heat processing on digestible energy and other nutrient digestibilities of full-fat soybeans fed to weaner, grower and ®nisher pigs. Canadian Journal of Animal Science, v. 73, p. 411-419, 1993. MARTY, B. J., CHAVEZ, E. R., DE LANGE, C. F. M. Recovery of amino acids at the distal ileum for determining apparent and true ileal digestibilities in growing pigs fed various heat-processed full-fat soybean products. Journal of Animal Science., v. 72, p. 2029-2037, 1994. MATHERS J. C. Pulses and carcinogenesis: potential for the prevention of colon, breast and other cancers. British Journal of Nutrition , v. 88, p. S273-S279, 2002. MATOS, F. J. A. Introdução à fitoquímica experimental. Edições UFC, Fortaleza. 2ª Edição, p.141, 1997. MATSUI, T.; HAMAKO, J.; OZEKI, Y.; TITANI, K. Comparative study of blood group Arecognizing lectins toward ABO blood group antigens on neoglycoproteins, glycoproteins and complex–type oligosaccharides. Biochimica et Biophysica Acta, v.1525, p.50-57, 2001. MATUDA, T. G.; NETTO, F. M. Caracterização química parcial da semente de jatobá-do-cerrado (Mart.) Hymenaea stigonocarpa. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 25, p. 353-357, 2005. MAUCH, F.; MAUCH-MANI, B.; BOLLER, T. Antifungal hidrolases in pea tissue: purification and characterization of two chiticase and two β-1,3-glucanase differentially regulated during development and in response to fungal, Plant Physiology, v. 87, p. 325–333, 1988. MAUCH, F.; MAUCH-MANI, B.; BOLLER, T. Antifungal hydrolases in pea tissue: II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and b-1,3-glucanase. Plant Physiology, v. 88, p.936–942, 1998. MAURER, K. H. Detergent proteases. Current Opinion in Biotechnology, v. 15, p. 330-334, 2004. McMANAUS, M. T.; BURGESS, E. P. J. Effects of the soybean (Kunitz) trypsin inhibitor on growth and digestive proteases of larvae of Spodoptera-Litura. Journal of Insect Physiology, v. 41, n. 9, p. 731-738, 1995. McCRAY, J. K.; WALSH, B.; HAMMETT, A. L. Species, sources, seasonality, and sustainability of fuelwood commercialization in Malaya. Forest Ecology and Management, v. 205, p. 299-309, 2005.

298

MECHI, R.; CANIATTI-BRAZACA, S. G.; ARTHUR, V. Avaliação química, nutricional e fatores antinutricionais do Feijão-preto (Phaseolus vulgaris L.) irradiado. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.25, n.1, p.109-114, 2005. MELGAREJO, L. M; VEGA, N.; PÉREZ, G. Isolation and characterization of novel lectins from Canavalia ensiformes DC and Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth. seeds. Journal Plant Physiology, v. 17, p. 315-32, 2005. MELO, V. M. M.; VASCONCELOS, I. M.; GOMES, V. M.; CUNHA, M.; SOARES, A. A.; OLIVEIRA, J. T. A. A cotyledonary agglutinin from Luetzelburgia auriculata inhibits the fungal growth of Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium solani and Aspergillus niger and impairs glucose-stimulated acidification of the incubation medium by Saccharomyces cerevisiae cells. Plant Science, v. 169, p. 629-639, 2005. MENDIETA, J. R.; GIUDICI, A. M.; LA CANAL L. Occurrence of antimicrobial serin-proteinases in sunflower seeds. Journal of Phytopathology, v. 152, p. 43–7, 2004. MIGLIOLO, L.; OLIVEIRA, A. S.; SANTOS, E. A.; FRANCO, O. L.; SALES, M. P. Structural and mechanistic insights into a novel non-competitive Kunitz trypsin inhibitor from Adenanthera pavonina L. seeds with double activity toward serine- and cysteine-proteinases. Journal of Molecular Graphics and Modelling, v. 29, p. 148–156, 2010. MIGUEL, O. G.; LIMA, E. O.; MORAIS, V. M. F.; GOMES, S. T. A.; MONACHE, F. D.; CRUZ, A. B.; BELLA CRUZ, R. C.; CECHINEL FILHO, V. Antimicrobial activity of constituents isolated from Lychnophora salicifolia (Asteraceae). Phytotherapy Research, v. 10, p. 694-696, 1996. MILLER, D. S.; BENDER, A. E. The determination of the net utilization of proteins by a shortened method. British Journal of Nutrition , v. 9, p. 382-388, 1955. MIMAKI, Y.; HARADA, H.; SAKUMA, C.; HARAGUCHI M.; YUI S.; K UDO, T.; YAMAZAKI, M.; SASHIDA, Y. Enterolosaponins A and B, novel triterpene bisdesmosides from Enterolobium contortisiliquum, and evaluation for their macrophage-oriented cytotoxic activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 13, p. 623-627, 2003. MIMAKI, Y.; HARADA, H.; SAKUMA, C.; HARAGUCHI, M.; YUIC, S.; KUDOC, T.; YAMAZAKIC, M.; SASHIDA, Y. Contortisiliosides A – G: isolation of seven new triterpene bisdesmosides from Enterolobium contortisiliquum and their cytotoxic activity. Helvetica Chimica Acta, v. 87, p. 851-865, 2004. MOBLEY, H. L.; HAUSINGER, R. P. Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiology Reviews, v. 53, n. 1, p. 85-108, 1989. MOBLEY, H. L.; ISLAND, M. D.; HAUSINGER, R. P. Molecular biology of microbial ureases. Microbiology Reviews, v. 59, p. 451-480, 1995. MOHAN, V. R; JANARDHANAN. K. Chemical determination of nutritional and antinutritional properties in tribal pulses. Journal of Food Science and Technology, v. 32, p. 465–469, 1995.

299

MONSAN, P.; DUTEURTRE, B.; MOLL, M.; DURAND, G. Use of papain immobilized on Spherosil for beer chillproofing. Journal of Food Science, v. 43, p. 424-427, 1978. MORAES, S. M.; CAVADA, B. S.; MOREIRA, R. A.; ROQUE-BARREIRA, M. C.; SANTOSVDE OLIVEIRA, R.; PINTO, V. P.; OLIVEIRA, J. T. Purification, physicochemical characterization and biological properties of a lectin from Erythrina velutina forma aurantiaca seeds. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 29, p. 977–985, 1996. MORAIS, J. K. S. Aspectos estruturais da toxina da soja (SBTX) e sua participação na defesa vegetal, 2007. 113f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. MORAIS, J. K. S. Potencial biotecnológico da toxina da soja (SBTX) como uma ferramenta contra fungos. 2010. 173 f. Tese (Doutorado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. MOREIRA, M. F.; SANTOS, A. S.; MAROTTA, H. R.; MANSUR, J. F.; RAMOS, I. B.; MACHADO, E. A.; SOUZA, G. H. M. F.; EBERLIN, M. N.; KAISER, C. R.; KRAMER, K. J.; MUTHUKRISHNAN, S.; VASCONCELLOS, A. M. H. A chitin-like component em Aedes aegypti eggshells, eggs and ovaries. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 37, n. 12, p. 1249-1261, 2007. MOREIRA, N. J. Diccionario de plantas medicinaes brasileiras. Typographia do Correio Mercantil, Rio de Janeiro, 1862. 144p. MOREIRA, R. A.; BARROS A. C. H.; STEWART, J. M.; PUSZTAI, A. Isolation and characterization of a lectin from the seeds of Dioclea grandiflora (Mart.). Planta, v. 158, p.63-68, 1983.

MOREIRA, R. A.; PERRONE, J. C. Purification and partial characterization of a lectin from Phaseolus vulgaris. Plant Physiology, v. 59, p. 783-787, 1977. MOREIRA, R. A.; BARROS A. C. H.; STEWART, J. M.; PUSZTAI, A. Isolation and characterization of a lectin from the seeds of Dioclea grandiflora (Mart.). Planta, v. 158, p.63-68, 1983. MOREIRA, R. A.; CAVADA, B. S. Lectin from Canavalia brasiliensis (Mart.). Isolation, characterization and behavior during germination. Biologia Plantarum, v. 26, p. 113-120, 1984. MOREL, C.; SERAPHIN, J.; OGER, J. M.; LITAUDON, M.; SEVENET, T.; RICHOMME, P.; BRUNETON, J. New xanthones from Calophyllum caledonicum. Journal of Natural Products, v. 63, 1471-1474, 2000. MORIHARA, K.; ODA, K. Microbial degradation of proteins. In: GUENTHER, W. (Ed.). Microbial degradation of natural products. VCH Publishers, Weinheim, Germany:, 1993. p. 293-364. MORROW, B. The rebirth of legumes. Journal of Food Technology, v. 45, p. 96–111, 1991.

300

MOURA, F. T.; OLIVEIRA, A. S.; MACEDO, L. L. P.; VIANNA, A. L. B. R.; ANDRADE, L. B. S.; MARTINS-MIRANDA, A. S.; OLIVEIRA, J. T. A.; SANTOS, E. A.; SALES, M. P. Effects of a chitin-binding vicilin from Enterolobium contortisiliquum seeds on bean bruchid pests (Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus) and phytopathogenic fungi (Fusarium solani and Colletrichum lindemuntianum). Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 55, p. 260-266, 2007. MURILLO, G.; CHOI, J. K.; PAN, O. Constantinou, A. I, Mehta , R. G. Efficacy of garbanzo and soybean flour in suppression of aberrant crypt foci in the colons of CF-1 mice. Anticancer Researchv, v. 24, p. 3049-3055, 2004. MURRAY, D. R. A storage role for albumins in pea cotyledons Plant, Cell & Environment , v. 2, p. 221–226, 1979. MURUGAN, K.; MURUGAN, P.; NOORTHEEN, A. Larvicidal and repellent potential of Albizzia amara Boivin and Ocimum basilicum Linn against dengue vector, Aedes aegypti (Insecta: Diptera: Culicidae). Bioresource Technology, v. 98, p. 198–201, 2007. MUZZARELLI, R. A. A.; JEUNIAUX, C.; GOODAY, G. W. Chitin in Nature and Technology. Plenum Press: New York, 1986, pp. 237-240. MYLARAPPA, B.; NINGAPPA, B. L.; DHANANJAYA, R.; DINESHA, R.; HARSHA, SRINIVAS, L. Potent antibacterial property of APC protein from curry leaves. Food Chemistry, v. 118, p. 747–750, 2010. NAPIMOGA, M. H.; CAVADA, B. S.; ALENCAR, N. M. N.; MOTA, M. L.; BITTENCOURT, F. S.; ALVES-FILHO, J. C.; GRESPAN, R.; GONÇALVES, R. B.; CLEMENTE-NAPIMOGA, J. T.; FREITAS, A.; PARADA, C. A.; FERREIRA, S. H.; CUNHA, F. Q. Lonchocarpus sericeus lectin decreases leukocyte migration and mechanical hypernociception by inhibiting cytokine and chemokines production. International Immunopharmacology, v. 7, p. 824–835, 2007. NASCIMENTO, M. S. B.; OLIVEIRA, E. M., Diversidade e uso das plantas nativas. In; Embrapa Meio-Norte. Teresina, 2005. Disponível em: http://www.embrapa.br . Acesso em: 03 de janeiro, 2011. NATHAN, S. S.; KALAIVANI, K.; SEHOON. K. Effects of Dysoxylum malabaricum Bedd. (Meliaceae) extract on the malarial vector Anopheles stephensi Liston (Diptera: Culicidae). Bioresource Technology, v. 97, p. 2077-2083, 2006. NETO, S. G.; BATISTA, A. M. V.; CARVALHO, F. F. R; MARQUES, C. A. T.; SANTOS, G. R. A. Efeito da adição de feno de catingueira (caesalpinea bracteosa) na ração sobre o balanço de energia e de nitrogênio em ovinos morada nova Revista Brasileira de Zootecnia, v.33, p.1325-1331, 2004. NETO, S. G.; BATISTA, A. M. V.; CARVALHO, F. F. R.; MARTÍNEZ, R. L. V. BARBOSA, J. E. A. S.; SILVA, E. L. O. Composição bromatológica, consumo e digestibilidade in vivo de dietas com diferentes níveis de feno de catingueira (caesalpinea

301

bracteosa), fornecidas para ovinos morada nova. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 30, p. 553-562, 2001. NEVES, M. C. A.; NEVES, P. C. A.; ZANINI, J. C.; MEDEIROS, Y. S.; YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Analgesic and antiinflammatory activities of the crude hydroalcoholic extract obtained from the bark of Hymenaea martiana. Phytotherapy Research, v. 7, p. 356–362, 1993. NEVILLE, A. C.; PARRY, D. A. D.; WOODHEAD-GALLOWAY, J. The chitin crystallite in arthropod cuticle. Journal of Cell Science, v. 21, p. 73–82, 1976. NG, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides, v. 25, n. 7, p. 1215-1222, 2004. NGAI, P. H. K.; NG, T. B. A lectin with antifungal and mitogenic activities from red cluster pepper (Capsicum frutescens) seeds. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 74, n. 2, 366-371, 2007. NIELSEN, S. S.; BRANDT, W. E.; SINGH, B. B. Genetic variability for nutritional composition and cooking time of improved cowpea lines. Crop Science, Madison, v. 33, p. 469-472, 1993. NIELSEN, K. K.; JORGENSEN, P.; MIKKELSEN, J. D. Antifungal activity of sugar beet chitinase against Cercospora beticola: an autoradiographyc study on cell wall degradation, Plant Pathology, v. 43, p. 979–986, 1994. NINGAPPA, M. B.; DHANANJAYA, B.L.; DINESHA, R.; HARSHA, R.; SRINIVAS, L. Potent antibacterial property of APC protein from curry leaves. Food Chemistry, v. 118, p. 747–750, 2010. NNANNA, I. A.; PHILLIPS, R. D. Protein and starch digestibility and flatulence potential of germinated cowpeas (Vigna unguiculate Journal of Food Science, v. 55, p. 151–153, 1990. NORTON, G.; BLISS, F. A.; BRESSANI, R. Biochemical and nutritional attributes of grain legumes. In: SUMMERfiELD, R. J., ROBERTS, E. H. (Eds.), Grain legume crops, Collins, London, 1985, p. 73–114. NOVAK, W. K.; HASLBERGR, A. G. Substancial equivalence of antinutrients and inherent plant toxin in genetically modified novel foods. Food and Chemical Toxicology, v. 38, p. 473 – 483, 2000. OAKENFULL, D. G.; TOPPING, D. L.; ILLUMAN, R. J.; FENWICK, D. Prevention of diatory hypercholesterolaemia in the rat b soya and quillaja sapnonis. Nutrition Research International , v. 2, p. 1039–1041, 1984. OBENDORF, R. L. Oligosaccharides and galactosyl cyclitols in seed desiccation tolerance. Seed Science Research, v. 7, p. 63–74, 1997.

302

OBOH, H. A.; MUZQUIZ, M.; BURBANO, C.; CUADRADO, C.; PEDROSA, M. M.; AYET, G.; OSAGIE, A. U. Antinutritional constituents of six underutilized legumes grown in Nigeria. Journal of Chromatography A, v. 823, p. 307–312, 1998. ODA, K.; MATSUDA, H.; MURAKAMI, T.; KATAYAMA, S.; OHGITANI, T.; YOSHIKAWA, M. Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food plants. Biological Chemistry, v. 381, p. 67–74, 2000. ODALIA-RÍMOLI, A.; ARRUDA, E. J.; RÍMOLI, J.; BUENO, N. R.; COSTA, R. B. Biodiversidade, biotecnologia e conservação genética em desenvolvimento local, Revista Internacional de Desenvolvimento Local, v. 1, n.1, p. 21-30, 2000. OFUYA, Z. M.; AKHIDUE, V. The role of pulses in human nutrition: a review. Journal of Applied Sciences and Environmental Management, 9, 99–104, 2005. OKUDA, T.; YOSHIDA, T.. HATANO, T. Antioxidant effects of tannins and related polyphenols. In: HUANG, M.-T., HO, C.-T., LEE, C.Y. (Eds.), Phenolic Compounds in Food and Their Effects on Health, II. Acs Symposium Series, vol. 507, p. 87–97, 1992. OLESZEK, W. A. Chromatographic determination of plant saponins. Journal of Chromatography A, v. 967, p. 147–162, 2002. OLESZEK, W. A.; BIALY, Z. Chromatographic determination of plant saponins – An update (2002 – 2005). Journal of Chromatogrphy A, v. 1112, p. 78 – 91, 2006. OLIVEIRA, A. C.; REIS, S. M. P. M.; CARVALHO, E. M.; PIMENTA, F. M. V.; RIOS, K. R.; PAIVA, K. C.; SOUSA, L. M.; ALMEIDA, M.; ARRUDA, S. F. Adições crescentes de ácido fítico à dieta não interferiram na digestibilidade da caseína e no ganho de peso em ratos. Revista de Nutrição, v.16, p. 211-217, 2003. OLIVEIRA, A. S.; MIGLIOLO, L.; AQUINO, R. O.; RIBEIRO, J. K. C.; MACEDO, L. L. P.; ANDRADE, L. B. S.; BEMQUERER, M. P.; SANTOS, E. A.; KIYOTA, S.; SALES, M. P. Purification and characterization of a trypsin-papain inhibitor from Pithecelobium dumosum seeds and its in vitro effects towards digestive enzymes from insect pests. Plant Physiology and Biochemistry, v. 45, p. 858-865, 2007. OLIVEIRA, H. D. Toxinas protéicas de sementes de soja [Glycine max (L.) Merr.]: aspectos moleculares e funcionais. 2009. 179f. Tese (Doutorado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. OLIVEIRA, A. E.; GOMES, V. M.; SALES, M. P.; FERNANDES, K. V.; CARLINI, C. R.; XAVIER-FILHO, J. The toxicity of Jack bean [Canavalia ensiformis (L.) DC.] canatoxin to plant pathogenic fungi. Revista Brasileira Biologia, v. 59, p. 59-62, 1999. OLIVEIRA, J. T. A.; MORAES, S. M. D.; CAVADA, B. S.; MOREIRA, R. A.; VASCONCELOS, I. M. Protein and lectin mobilization during Erythrina velutina form a Aurantiaca seed germination and seedling growth in the dark. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v. 10, n. 1, p. 25-30, 1998.

303

OLIVEIRA, J. T. A.; PINTO, V. P. T.; VASCONCELOS, I. M.; FERNANDES, C. F.; RAMOS, M. V.; FERREIRA, F. V. A.; RIOS, F. J. B. In vitro and in vivo digestibility of the albumin and globulin fractions of eight Brazilian cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.) cultivars. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 84, p. 1823-1830, 2004a. OLIVEIRA, J. T. A.; RIOS, F. J. B.; VASCONCELOS, I. M.; FERREIRA, F. V. A.; NOJOSA, G. B.; MEDEIROS, D. A. Cratylia argentea seed lectin as a defensive protein against plant-eating organisms: effects on rat metabolism and gut histology. Food and Chemical Toxicology, v. 42, p.1737-1747, 2004b. OLIVEIRA, M. N.; FREITAS, A. L. P.; CARVALHO, A. F. U.; SAMPAIO, T. M. T.; FARIAS, D. F.; TEIXEIRA, D. I. A.; GOUVEIA, S. T.; PEREIRA, J. G.; SENA, M. M. C. C. Nutritive and non-nutritive attributes of washed-up seaweeds from the coast of Ceará, Brazil. Food Chemistry, v. 115, p. 254–259, 2009. OLIVEIRA-SEVERO, D.; WASSEMANN, G. E.; CARLINI, C. R. Ureases display biological effects independent of enzymatic activity is there a connection to diseases caused by urease-producing bacteria? Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 39, n. 7, p. 851-861, 2006. OLOGHOBO, A. D.; FETUGA, B. L. Effect of processing on the trypsin inhibitor, haemagglutinin, tannic acid and phytic acid contents of ten cowpea varieties. Tropical Agriculture , v. 61, p. 261–264, 1984. OLUWATOSIN, O. B. Genotype x environment influence on cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) antinutritional factors: 1. Trypsin inhibitors, tannins, phytic acid and haemagglutinin. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 79. p. 265.272. 1999. OMOSAIYE O.; CHERYAN M.; MATHEWS M. E. Removal of oligosaccharides from soybean water extract by ultrafiltration. Journal of Food Science, v. 43, p. 354 - 359, 1978. ONAGA, S.; TAIRA, T. A new type of plant chitinase containing LysM domains from a fern (Pteris ryukyuensis): Roles of LysM domains in chitin binding and antifungal activity. Glycobiology, v. 18, n. 5, p. 414–423, 2008. ONIGBINDE A. O.; AKINYELE I. O. Oligosaccharide content of 20 varieties of cowpeas in Nigeria. Journal of Food Science, v. 48, p. 1250-1254, 1983. ONWULIRI, V. A.; OBU, J. A. Lipids and other constituents of Vigna unguiculata and Phaseolus vulgaris grown in northern Nigeria. Food Chemistry, v. 78, p.1-7, 2002. ONYENEKWE, P. C.; NJOKU, G. C.; AMEH, D.A. Effect of cowpea (vigna ilwguiculata) processing methods on flatus causing oligosaccharides. Nutrition Research, v. 20, n. 3, p. 349-358, 2000. OPLUSTIL, C. P.; ZOCCOLI, C. M.; TOBOUTI, N. R.; SINTO, S. I. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier, São Paulo, 2001, 136p.

304

ORRU, A.; DEMEL, V. C. Physiological and anatomical–pathological observations on rats fed with the seeds of Canavalia ensiformis. Quanderni Nutrizione, v. 7, p. 272–275, 1941. ORTEGA-NIEBLAS, M.; VÁSQUEZ-MORENO, L.; ROBLES-BURGUEÑO, M. R.. Protein quality and antinutritional factors of wild legumes seeds from the Sonoran Desert. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44, n. 10, p. 3130-3132, 1996. OTTE, J. M.; CHEN, C.; BRUNKE, G.; KIEHNE, K.; SCHIMITZ, F.; FOELSCH, U. R.; HERZIG, K. H. Mechanisms of lectin (phytohemagglutinin)-induced growth in small intestinal epithelial cells. Digestion, v. 64, p. 169–178, 2001. OYELEKE, O. A. Utilization of protein and energy from cooked maize: legume dishes in growing rats compared with a traditional Nigerian dish. International Journal of Food Science and Technology, v. 27, p. 229–233, 1992. PALLAUF J.; RIMBACH G. Nutritional significance of phytic acid and phytase. Archives of Animal Nutrition , v. 50, n. 4, p. 301-19, 1997. PANIZZA, S. Plantas que curam (cheiro de mato). 15 a ed. São Paulo: IBRASA, 1997. 279p. PARK, C.; LEE, D. G. Fungicidal effect of antimicrobial peptide arenicin-1. Biochimestry Biophysic Acta, v. 1788, p. 1790-1796, 2009. PASSARINHO, P. A.; VAN HENGEL, A. J.; FRANSZ, P. F.; DE VRIES, S. C. Expression pattern of the Arabidopsis thaliana AtEP3/AtchitIV endochitinase gene. Planta, v. 212, p. 556–567, 2001. PASSOS, X. S.; SANTOS, S. C.; FERRI, P. H.; FERNANDES, O. F. L.; PAULA, T. F.; GARCIA, A. C. F.; SILVA, M. R. R. Atividade antifúngica de Caryocar brasiliensis (Caryocaraceae) sobre Cryptococcus neoformans. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, p.623-627, 2002. PATIL, R. S.; GHORMADE, V. V.; DESHPANDE, M. V. Chitinolytic enzymes: an exploration. Enzyme and Microbial Technology, v. 26, p. 473–483, 2000. PATOLOGIA DE SEMENTES (2011) Disponível em <http://www.patologiadesementes.com.br/> acesso em 8 de janeiro, 2011. PEFEROEN, M. Progress and prospects for field use of Bt genes in crops. Trends in Biotechnology, v. 15, p. 173–177, 1997. PELEGRINI, P. B.; FARIAS, L. R.; SAUDE, A. C.; COSTA, F. T.; BLOCH, C.; SILVA, L. P.; OLIVEIRA, A. S.; GOMES, C. E.; SALES, M. P.; FRANCO, O. L. A novel antimicrobial peptide from Crotalaria pallida seeds with activity against human and phytopathogens. Current Microbiology , v. 59, p. 400-404, 2009. PELEGRINI, P.; NORONHA, E.; MUNIZ, M.; VASCONCELOS, I.; CHIARELLO, M, OLIVEIRA, J.; FRANCO, O. L. An antifungal peptide from passion fruit (Passiflora edulis)

305

seeds with similarities to S2 albumin proteins. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1764, p. 1141-1146, 2006. PELLETIER, D. L.; FRONGILLO JR, E. A.; SCHROEDER, D. G.; HABICHT, J. P. The effect ofmalnutrition on childmortality in developing countries. Bull World Health Organ , v. 3, p. 443–448, 1995. PETIT, P. R.; SAUVAIRE, Y. D.; HILLAIRE-BUYS, D. M.; LECONTE, O. M.; BAISSAC, Y. G.; POSIN, G. R.; RIBES, G. R. Steroid saponins from fenugreek seeds: extraction, purification, and pharmacological investigation on feeding behaviour and plasma cholesterol. Steroids, v. 60, p. 674–680, 1995. PETTI, S.; SCULLY, C. Polyphenols, oral health and disease: A review. Journal of dentistry, v. 37, p. 413–423, 2009. PEUMANS, W. J.; ZHANG, W.; BARRE, A.; HOULÈS ASTOUL, C.; BALINT-KURTI, P. J.; ROVIRA, P.; ROUGÉ, P.; MAY, G. D.; VAN LEUVEN, F.; TRUFFA-BACHI, P.; VAN DAMME, E. J. Fruit-especific lectins from banana and plantain. Planta, v. 211, n. 6, p. 546-554, 2000. PEUMANS, W. J.; VAN DAMME, J. M. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiology, v. 109, p. 347 – 352, 1995. PEUMANS, W. J.; VAN DAMME, E. J. M.. Prevalence, biological activity and genetic manipulation of lectins in foods. Trends in Food Science & Technology, v. 7, p. 132–138, 1996. PHILLIPS, R. D.; MCWATTERS, K. H.; CHINNAN, M. S.; HUNG, Y. C.; BEUCHAT, L. R.; SEFA-DEDEH, S.; SAKYI-DAWSON, E.; NGODDY, P.; NNANYELUGO, D.; ENWERE, J.; KOMEY, N. S.; LIU, K.; MENSA-WILMOT, Y.; NNANNA, I. A.; OKEKE, C.; PRINYAWIWATKUL, W.; SAALIA, F. K. Utilization of Cowpeas for Human Food. Field Crops Research, v. 82, p. 193–213, 2003. PICHYANGKURA, R.; KUDAN, S.; KUTTIYAWONG, K.; SUKWATHANASININITT, M.; AIBA, S. Quantitative production of 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose from crystalline chitin by bacterial chitinase Carbohydrate Research, v. 337, p. 557–559, 2002. PINHEIRO, M. M.; SANDRONI, M.; LUMMERZHEIM, M.; OLIVEIRA, M. A Defesa de Plantas contra Doenças. Ciências Hoje, v. 147. p. 1-11 , 1999. PINTÉR-SZAKÁCS, M.; MOLNÁR-PERL, H. Determination of tryptophan inunhydrolyzed food and feedstuffs by the acid ninhydrin method. Journal of Agricultural and Food Chemistry, p. 720-726, 1990. PINTO, J. E. B. P.; SANTIAGO, E. J. A.; LAMEIRA, O. A. Compêndio de plantas medicinais. Lavras, MG: UFLA/FAEPE, 2000. 208p. POLACCO, J. C.; HOLLAND, M. A. Roles of urease in plant cells. International Review of Cytology, v. 145, p. 65–103, 1993.

306

POWELL, J. R.; HOLLANDER, A. L.; FUCHS, M. S. A preparation method for Aedes aegypti and Aedes atropalpus chorions for protein characterization. Insect Biochemistry, v. 16, p. 835–842, 1986. PRADO, D. E. A critical evaluation of the floristic links between Chaco ans Caatingas vegetation in south america. Ph.D. Thesis University of St. Andrews, St. Andrews, Scotland, 1991. PRAJAPATI, V.; TRIPATHI, A. K.; AGGARWAL, K. K.; KHANUJA, S. P. S. Insecticidal, repellent and oviposition-deterrnt activity of selected essential oils against Anopheles stephensi, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus. Bioresource Technology, v. 96, p. 1749-1757, 2005. PRAKASH D.; MISRA P. S. Amino acid composition of Bauhinia and Cassia seeds. Fitoterapia, v. 54, p. 257-260, 1983. PRANCE, G. T.; SILVA, M.F. Árvores de Manaus. CNPq/INPA, Manaus, 1975. 312p. PRETTO, J. B. Potencial antimicrobiano de extratos, frações e compostos puros obtidos de algumas plantas da flora catarinense. 2005. 85f. Dissertação (Mestrado em Ciências Famacêuticas). Centro de Educação de Ciências da Saúde da Universidade do Vale do Itajaí, 2005. PRICE, K. R.; JOHNSON, I. T.; FENWICK, G. R. The chemistry and biological significance of saponins in foods and feedstuffs. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 26, p. 27–135, 1987. PRICE, K. R.; LEWIS, J.; WYATT, G. M.; FENWICK, R. G. Flatulence-causes, relation to diet and remedies. (1988) In: C. MARTÍNEZ-VILLALUENGA, J. FRÍAS; C. VIDAL-VALVERDE. Functional lupin seeds (Lupinus albus L. and Lupinus luteus L.) after extraction of a-galactosides. Food Chemistry, v. 98, p. 291–299, 2006. PROLL J.; PETZKE K. J.; EZEAGU I. E.; METGES C. C. Low nutritional quality of unconventional tropical crop seeds in rats. Journal of Nutrition , v. 128, n. 11, p. 2014-22, 1998. PROSKY, L.; ASP, N.-G.; SCHWEIZER, T. F.; DEVRIES, J. W.; FURDA, I.Determination of insoluble, soluble, and total dietary fiber in foods and food products: Interlaboratory study. Journal of AOAC International . v. 71. p. 1017–1023. 1988. PRYME, I. F.; PUSTZAI, A.; BARDOCZ, S.; EWEN, S. W. B. The induction of gut hyperplasia by phytohaemagglutinin in the diet and limitation of tumour growth. Histology and Histopathology, v. 13, p. 575-583, 1998. PUSZTAI, A. Lectins. In: CHEEK, P. R. Toxicants of plant origin: proteins and aminoacids. v.3, Boca Raton : CRC Press, 1989, p.29-71. PUSZTAI, A.; BARDOCZ, S.; MARTÍN-CABREJAS, M. A. The mode of action of ANFs on the gastrointestinal tract and its microflora. In: MUZQUIZ, M., HILL, G.D., CUADRADO, C., PEDROSA, M.M., BURBANO, C. (Eds.), Recent Advances of Research

307

in Antinutritional Factors in Legume Seeds and Oilseeds. EAAP: Wageningen Academic Publishers, The Netherlands, 2004. p. 87–100. PUSZTAI, A.; GRANT, G.; BARDOCZ, S.; BAINTNER, K.; GELENCSER, E.; EWEN, S. W. B. Both free and complexed trypsin inhibitors stimulate pancreatic secretion and change duodenal enzyme levels. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, v. l35, p. G340-350, 1997. PUSZTAI, A.; GRANT, G.; BROWN, D. S.; STEWART, J. C.; BARDOCZ, S. Nutritional evaluation of the trypsin (EC 3.4.21.4) inhibitor from cowpea (Vigna unguiculata Walp.). British Journal of Nutrition, v. 68, p. 783-791, 1992. PUSZTAI A.; BARDOCZ, S. Biological Effects of Plant Lectins on the Gastrointestinal Tract: Metabolic Consequences and Applications. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, v. 8, p.149-165, 1996. PUSZTAI, A.; GRANT, G.; BUCHAN, W. C.; BARDOCZ, S.; DE CARVALHO, A. F. F. U.; EWEN, S. W. B. Lipid accumulation in obese Zucker rats is reduced by inclusion of raw kidney bean (Phaseolus vulgaris) in the diet. British Journal of Nutrition ., v. 79, p. 213 221, 1998. PUZZI, D. Abastecimento e armazenamento de grãos. Instituto Campineiro de Ensino Agrícola, Campinas, 2000, 666 p. QIN, G.; TER ELST, E. R.; BOSCH, M. W.; VAN DER POEL, A. F. B.Thermal processing of whole soya beans: studies on the inactivation of antinutritional factors and effects on ileal digestibility in piglets. Animal Feed Science and Technology, v. 57, p. 313-324, 1996. QUEDRAOGO, C. L.; COMBE, E.; LALLES, J. P.; TOULLEC, R.; TRECHE, S.; GRONGNET, J F. Nutritional value of the proteins of soybeans roasted at a small-scale unit level in Africa as assessed using growing rats. Reproduction Nutrition Development, v. 39, p. 201–12, 1999. QUEIROZ. Leguminosas da Caatinga da Bahia com Potencial Forrageiro. (2002) Disponível em: http://umbuzeiro.cnip.org.br/db/forrag/taxa/11736.shtml Acesso em; 30 de Maio, 2007. RADUTOIU, S.; MADSEN, L. H.; MADSEN, E. B.; FELLE, H. H.; UMEHARA, Y.; GRØNLUND, M.; SATO, S.; NAKAMURA, Y.; TABATA, S.; SANDAL, N.; et al. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases. Nature, v. 425, p.585–592, 2003. RAJARAM, N.; JANARDHANAN, K. Nutritional and chemical evaluation of raw seeds of Canavalia gladiata (Jacq) DC. and C. ensiformis DC: the under utilized food and fodder crops in India. Plant Foods for Human Nutrition, v. 42, p. 329–336, 1992. RAJKO, R.; SZABO, G. Designing experiments for reducing antinutritive agents in soybean by microwave energy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 45, p. 3565-3569, 1997.

308

RAMOS, M. V.; BANDEIRA, G. P.; FREITAS, C. D. T.; NOGUEIRA, N. A. P.; ALENCAR, N. M. N.; SOUSA, P. A. S.; CARVALHO, A. F. U. Latex constituents from Calotropis procera (R. Br.) display toxicity upon egg hatching and larvae of Aedes aegypti (Linn.). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 101, n. 5, p. 503-510, 2006. RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M. Farmacologia. 3 a ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1997, 692 p. RANI, N.; HIRA, C. K. Effect of different treatments on chemical constituents of mash beans (Vigna mungo). Journal of Food Science and Technology, v. 35, p.540–542, 1998. RAO, P. U.; DEOSTHALE, I. G. Tannin content of pulses: Varietal differences and effects of germination and cooking. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 33, p. 1013–1016, 1982. RAO, V. S.; VAKIL, U. K. Effect of gamma-irradiation on flatulence-causing oligosaccharides in green gram (Phaseolus areus). Journal of Food Science, v. 48, p. 1791–1795, 1983. RASKIM, I.; RIBNICKY, D. M.; KOMAMYTSKY, S.; ILIC, N.; POULEV, A.; BORISJUK, N.; BRINKER, A.; MORENO, D. A.; RIPOLL, C.; YAKOBY, N.; O´NEAL, J. M.; COMWELL, T.; PASTOR, I.; FRIDLENDER, B.Plants and human health in the twenty-first century. Trends in Biotechnology, v. 20, n. 12, p. 522-531, 2002. RATHBONE, D. A.; BRUCE, N. C., Microbial transformation of alkaloids. Current Opinion in Microbiology , v. 5, p. 274–281, 2002. RAVINDRAN, V.; RAVINDRAN, G. Nutritional and anti-nutritional characteristics of Mucuna utilis bean seeds. Journal of the Science and Food Agricultural, v. 46, p. 71–79, 1988. REDDY N. R.; SALUNKHE D. K. Changes in oligosaccharides during germination and cooking of black gram and fermentation of backgram/Rice blend. Cereal Chemistry, v. 57, p. 356-360, 1980. REDDY, N. R., SALUNKHE, D. K., SHARMA, R. P. Flatulence in rats following ingestion of cooked and germinated black gram and a fermented product of black gram and rice blend. Journal of Food Science. v. 45, p. 1161–1164, 1980. REDDY, L.; ODHAV, B.; BHOOLA, K. D. Natural products for cancer prevention: a gobal perspective. Pharmacology & Terapeutics, v. 99, p. 1-13, 2003. REED, J. D. Nutritional toxicology of tannins and related polyphenols in forage legumes. Journal of Animal Science, v. 73, p. 1516–1528, 1995. REGO, E. J. L.; CARVALHO, D. D.; MARANGONI, S.; OLIVEIRA, B.; NOVELLO, J. C. Lectins from Seeds of Crotalaria pallida (smooth rattlebox). Phytochemistry, v. 60, p. 441–446, 2002.

309

REHMAN, Z.; SHAH, W. H. Thermal heat processing effects on anti-nutrition, protein, starch digestibility of food legumes. Food Chemistry, v. 91, p. 327-331, 2005. REISSIG, J. L.; SROMENGER, J. L.; LELOIR, L. F. A modified colorimetric method for estimation of N-acetylamino sugars. Biological Chemistry, v. 217, p. 959-966, 1955. REITZ, R. Plantas medicinais de Santa Catarina. Anais botânicos do herbário Barbosa Rodrigues. Itajaí, v. 2, n. 2, p. 71-116, 1950. REVINA, T. A.; KLADNITSKAYA, G. V.; GERASIMOVA, N. G.; GVOZDEVA, E. L.; VALUEVA, T. A. Protein Trypsin Inhibitor from Potato Tubers. Biochemistry, v. 75, n. 1, p. 46-51, 2010. REYES-CHILPA, R.; JIMENEZ-ESTRADA, M.; ESTRADA MUÑIZ, E. Antifngal xanthones from Calophyllum brasiliensis heartwood. Journal of Chemical Ecology, v. 23, n. 7, p. 1901-1911, 1997. RIBEIRO, M. D.; ONUSIC, G. M.; POLTRONIERI, S. C.; VIANA, M. B. Effect of Erythrina velutina and Erythrina mulungu in rats submitted to animalmodels of anxiety and depression. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 39, p. 263–270, 2006. RIBEIRO, S. F. F.; AGIZZIO, A. P.; MACHADO, O. L. T.; NEVES-FERREIRA, A. G. C.; OLIVEIRA, M. A.; FERNANDES, K. V. S.; CARVALHO, A. O.; PERALES, J.; GOMES, V. M. A new peptide of melon seeds which shows sequence homology with vicilin: partial characterization and antifungal activity. Scientia Horticulturae, v. 111, p. 399-405, 2007. RISPAIL, N.; NASH, R.; WEBB, K. J., Secondary metabolite profiling. Lotus japonicus Handbook, 2005, p. 341 – 348. RIZZINI, C. T. Plantas do Brasil - árvores e madeiras úteis do Brasil: manual de dendrologia brasileira. São Paulo: Edgard Blücher, 1971, 296p. ROBERTS, W. K.; SELITRENNIKOFF, C. P. Zeamantin, an antifungal protein from maize with membrane permeabilizing activity. Journal of General Microbiology, v.136, p.1771-1778, 1990. RODRIGUES, B. F.; TORNE, S. G. A chemical study of seeds in three Canavalia species. Tropical Science, v. 31, p. 101–103, 1991. RODRIGUES, M. T. Biodiversidade: do planejamento à ação. Ciência Cultura, v.55, n.3, p.47-48, 2003. ROSENTHAL, G. A. The interrelationship of canavanine and urease in seeds of the lotoidee. Journal of Experimental Botany, v. 25, p. 609 – 613, 1974. ROSTAMI, A.; KENNEDY, A. R. Número de patente: US2004142050, 2004. ROY, C. N.; ENNS, C. A. Iron homeostasis: new tales from the crypt. Journal of the American Society of Hematology, v. 96, n. 13, p.4020-4027, 2000.

310

RUBIO, L. A.; GRANT, G.; BARDOCZ, S.; DEWEY, P.; PUSZTAI, A. Nutritional response of growing rats to faba beans (Vicia faba minor) and faba bean fractions. British Journal of Nutrition , v. 66, p. 533 – 542, 1991. RUBIO, L. A.; GRANT, G.; DAGUID, T.; BROWN, D.; PUSZTAI, A. Organs relative weight and plasma amino acid and concentrations in rats fed diets based on whole legumes (faba bean, lupin, chickpea, defatted soybean) seed meals or their fractions. Journal Sci. Food Agric., v. 79, p. 187-194, 1999. RUDENSKAYA, G. N.; BOGDANOVA, E. A.; REVINA, L. P.; GOLOVKIN, B. N.; STEPANOV, V. M. Macluralisin - a serine proteinase from fruits of Maclura pomifera (Raf.) Schneid. Planta, v. 196, n. 1, p. 174 – 179, 1995. RÜDIGER, H. Plant lectins-more than just tools for glicoscientists: occurrence, structure and possible functions of plant lectins. Acta Anatomica, v. 161, n. 1-4, p. 130-152, 1998. RUIZ, M. A.; SOTELO, A. Chemical composition, nutritive value, and toxicology evaluation of Mexican wild lupins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 49, n. 11, p. 5336-5339, 2001. RUY F., Estudo da bioenergética mitocondrial de leveduras de importância patológica: determinação da contribuição das diferentes vias de transporte de elétrons para o crescimento celular . 2007. 75 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas), Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2007. RYAN, C. A. Protease Inhibitors in Plants: Genes for Improving Defenses Against Insects and Pathogens. Annual Review of Phytopathology, v. 28, p. 425-449, 1990. RYAN, C. A. WALKER-SIMMONS, M. Plant proteinases. In: MARCUS, A. (ed). The Biochemistry of Plants. Academic Press, v.6, p. 321-350, 1981. SÁ, R. A.; SANTOS, N. D. L.; SILVA, C. S. B.,; NAPOLEÃO, T. H.; GOMES, F. S.; CAVADA, B. S.; COELHO, L. C. B. B.; NAVARRO, D. M. A. F.; BIEBER, L. W.; PAIVA, P. M. G. Larvicidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva on Aedes aegypti. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology, v. 149, n. 3, p. 300-306, 2008. SAHAI, A. S.; MANOCHA, M. S. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host–parasite interaction. FEMS Microbiology, v. 11, p. 317–338, 1993. SAIDU, K.; ONAH, J.; ORISADIPE, A.; OLUSOLA, A.; WAMBEMBE, C.; GAMANIEL, K. Antiplasmodial, analgesic and antiinflamatory activities of the aqueous stract of the stem bark of Erythrina senegalensis. Journal of Ethnopharmacology, v. 71, p. 275–280, 2000. SAITO, T.; SATO, H.; VIRGONA, N.; HAGIWARA, H.; KASHIWAGI, K.; SUZUKI, K.; ASANO, R.; YANO, T. Negative growth control of osteosarcoma cell by Bowman-Birk protease inhibitor from soybean; involvement of connexin 43. Cancer Letters, v. 253, p. 249-257, 2007.

311

SALEH, A. A.; EL-ADAWY, T. A. Nutritional composition of chickpea (Cicer arietinum.L.) as affected by microwave cooking and other traditional cooking methods. Journal of Food Composition and Analysis, v.19, p. 806–812, 2006. SALGADO, P.; FREIRE, J. P. B.; MOURATO, M.; CABRAL, F.; TOULLEC, R.; LALLÈS, J. P. Comparative effects of different legume protein sources in weaned piglets: nutrient digestibility, intestinal morphology and digestive enzymes. Livestock Production Science, v. 74, p. 191–202, 2002. SALVADOR, Z. L. Avaliação Morfohistológica de Larvas de Aedes aegypti Submetidas ao Temephos. Dissertação (Mestrado em Biologia Geral) – Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2002. SAMPAIO, E. V. S. O uso das plantas da Caatinga. In: SAMPAIO, E. V. S.; GIULIETTI, A. M.; VIRGÍNIO, J.; GAMARRAS- ROJAS, C. F. L. (eds), Vegetação & Flora da Caatinga. APNE/CNIP, Petrolina, 2002, p. 49-90. SANDES, A. R. R.; DI BLASI, G. Biodiversidade e diversidade química e genética. Biotecnologia, n. 13, p. 28 - 32, 2000. SANE, V. A.; NATH, P.; AMINUDDIN SANE, P. V. Development of insect resistant.transgenic plants using plant genes expression of cowpea trypsin inhibitor in transgenic tobacco plants. Current Science, v. 72, p.741-747, 1997. SANSORES-PERAZA, P.; ROSADO-VALLADO, M.; BRITO-LOEZA, W.; MENA-REJÓN, G. J.; QUIJANO, L. Cassine, an antimicrobial alkaloid from Senna racemosa. Fitoterapia, v. 71, p. 690-692, 2000. SANT’ANA, P. J. P.; ASSAD, A. L. O Contexto brasileiro para a bioprospecção: a competência científico-tecnológica brasileira, Biotecnologia, n. 29, p. 32-37, 2001. SANTIAGO, G. M. P.; VIANA, F. A.; PESSOA, O. D. L.; SANTOS, R. P.; POULIQUEN, Y. B. M.; ARRIAGA A. M. C.; ANDRADE-NETO, M.; BRAZ-FILHO, R. Avaliação da atividade larvicida de saponinas triterpênicas isoladas de Pentaclethra macroloba (Willd.) Kuntze (Fabaceae) e Cordia piauhiensis Fresen (Boraginaceae) sobre Aedes aegypti. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 15, n.3, p. 187-190, 2005. SANTOS, A. F. S.; ARGOLO, A. C. C.; COELHO, L. C. B. B.; PAIVA, P. M. G. Detection of water soluble lectin and antioxidant component from Moringa oleifera seeds. Water Research, v. 39, p. 975-980, 2005. SARTORATO. A. Doenças do feijão. Disponível em <http://www.unifeijao.com.br/feijao_do_brasil/doecas_brasil.htm > acesso em 10 de dezembro de 2010. SARTORI, M. R. K.; PRETTO, J. B.; BELLA CRUZ, A.,; BRESCIANI, L. F. V.; YUNES, R. A.; SORTINO, M.; ZACCHINO, S. A.; CECHINEL FILHO, V. Antifungal activity of fractions and two pure compounds of flowers from Wedelia paludosa (Acmela brasiliensis) (Asteraceae). Pharmazie, v. 58, p. 567-569, 2003.

312

SASAKI, M.; FITZGERALD, A. J.; GRANT, G.; GHATEI, M. A.; WRIGHT, N. A.; GOODLAD, R. A. Lectins can reverse the distal intestinal atrophy associated with elemental diets in mice. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, v.16, p. 633–642, 2002. SASHIWA, H.; FUJISHIMA, S.; YAMANO, N.; KAWASAKI, N.; NAKAYAMA, A.; MURAKI, E.; SUKWATTANASINITT, M.; PICHYANGKURA, R.; AIBA, S. Enzymatic production of N-acetyl-D-glucosamine from chitin. Degradation study of N-acetylchitooligosaccharide and the effect o mixing of crude enzymes. Carbohydrate Polymers, v. 51, p. 391–395, 2003. SCALBERT, A. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry, v. 12, p. 387–388, 1991. SCALBERT, A.; WILLIAMSON, G. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. Journal of Nutrition , v. 130, p. 2073S–2085S, 2000. SCHAECHTER, M.; ENGLEBERG, N. C.; EISENSTEIN, B. I.; MEDOFF, G. Mechanisms of microbial disease. 3 a ed., Ed. Lippincott, Williams & Wilkins, 1999. SCHAECHTER, M.; ENGLEBERG, N. C.; EISENSTEIN, B. I.; MEDOFF, G. Microbiologia: Mecanismos das Doenças Infeccioas. 3a ed. Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 2002. SCHIJLEN, E. G. W. M.; DE VOS, C. H. R.; VAN TUNEN, A. J.; BOVY, A. G. Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants. Phytochemistry, v. 65, p. 2631–48, 2004. SCHLUMBAUM, A.; MAUCH, F.; VO¨GELI, U.; BOLLER, T. Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth, Nature v. 324, p. 365-367, 1986. SCHMOURLOA, G.; MENDON FILHO, R. R.; ALVIANO, C. S.; COSTA, S. S. Screening of antifungal agents using ethanol precipitation and bioautography of medicinal and food plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 96, p. 563–568, 2005. SCHULER, T. H.; POPPY, G. M.; KERRY, B. R.; DENHOLM, I. Insect-resistant transgenic plants. Trends in Biotechnology, v. 16, p. 168–175, 1998. SEENA, S.; SRIDHAR, K. R.; JUNG, K. Nutritional and antinutritional evaluation of raw and processed seeds of a wild legume, Canavalia cathartica of coastal sand dunes of India. Food Chemistry, v. 92, p. 465–472, 2005. SEENA, S.; SRIDHARA, K. R.; ARUNB, A. B.; CHIU-CHUNG YOUNG. Effect of roasting and pressure-cooking on nutritional and protein quality of seeds of mangrove legume Canavalia cathartica from southwest coast of India. Journal of Food Composition and Analysis , v. 19, p. 284–293, 2006. SELA-BUURLAGE, M.; PONSTEIN, A. S.; BRES-VLOEMANS, S. A.; MELCHERS, L. S.; VAN DEN ELZEN, P. J. M., CORNELISSEN, B. J. C. Only specific tobacco (Nicotiana tabacum) chitinases and β-1,3-glucanases exhibit antifungal activity. Plant Physiology, v.101, p.857–863, 1993.

313

SELITRENNIKOFF, C. P. Antifungal proteins. Applied and Enviromental Microbiology, v. 67, p. 2883-2894, 2001. SELITRENNIOKOFF, C. P. Sreening for antifungal durgs. Biotechnology of Filamentosos Fungi – Technology and products, Boston: Butterum Henemann, p. 189- 217, 1992. SERFIN, C.; NART, V.; ÂNGELA MALHEIROS, A.; CRUZ, A. B.; MONACHE, F. D.; GETTE, M. A. G.; ZACCHINO, S.; CECHINEL FILHO, V. Avaliação do potencial antimicrobiano de Plinia glomerata o (Myrtaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, n. 4, p. 578-582, 2007. SEVE, B.; KERROS, C.; LEBRETON, Y.; QUEMENER, B.; GABORIT, T.; BOUCHEZ, P. Effect of the extraction of a-galactosides from toasted or raw soybean meal on dietary nitrogen and fat utilization in the young pig. In: HUISMAN, J., VAN DER POEL, T. F. B., LINER, J. E. (Eds.), Recent Advances of Research in Antinutritional Factors in Legume Seeds. Pudoc, Wageningen, 1989, p. 276–279. SGARBIERI, V. C. Fontes de proteínas na alimentação. In: ____. Proteínas em Alimentos Protéicos: Propriedades, Degradações, Modificações. Varela, São Paulo, 1996. p.139-257. SGARBIERI, V. C.; WHITAKER, J. R. Physical, chemical, and nutritional properties of common bean (Phaseolus) proteins. Advances Food Research, v. 28, n. 3, p. 93-166, 1982. SHAALAN, E.; CANYON, D.; FARIED, M. W.; ABDEL-WAHAB, H.; MANSOUR, A. A review of botanical phytochemicals with mosquitocidal potential. Environment International, v. 31, p. 1149-1166, 2005. SHAHAT, A. A.; EL-BAROUTY, G.; HASSAN, R. A.; HAMMOUDA, F. M.; ABDELRAHMAN, F. H.; SALEH, M. A. Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oil from the seeds of Enterolobium contortisiliquum (leguminosae). Journal of Environmental Science and Health Part B, v. 43, 519-525, 2008. SHARON, N.; LIS, H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules. Glycobiology, v. 14, n. 11, p. 53R-62R, 2004. SHEEHAN, D.; O’SULLIVAN, S. Protein purification protocols (Fast Protein Liquid Chromatography). Methods in Molecular Biology, v. 244, p. 253-258, 2004. SHEHATA, N. A.; DARWISH, N.; NAHR, F. E.; RAZEK, F. A. A. Supplementation of wheat flour with some local legumes. Die Nahrung, v. 31, p. 3–8, 1988. SHELP, B. J.; IRELAND, R. J.. Ureide metabolism in leaves of nitrogen-fixing soybean plants. Plant Physiology, v. 77, p. 779–783, 1985. SHENOY, S R.; KAMESHWARI, M. N.; SWAMINATHAN, S.; GUPTA, M. N. Major antifungal activity from the bulbs of Indian squill Urginea indica is a chitinase. Biotechnol Progress, v. 22: p. 631–637, 2006.

314

SHEWRY P. R.; TATHAM A. S. The characteristics, structures and evolutionary relationships of prolamins. In: SHEWRY, P. R., CASEY, R. (Eds.), Seed Proteins. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, p.11–33, 1999. SHIM, S. I.; JUN, W. J.; KANG, B. H. Evaluation of Nutritional and Antinutritional Components in Korean Wild Legumes. Plant Foods for Human Nutrition, v. 58, p. 1–11, 2003. SHIMELIS, E. A.; RAKSHIT, S. K. Antinutritional factors and in vitro protein digestibility of improved haricot bean (Phaseolus vulgaris L.) varieties grown in Ethopia. International Journal of Food Science and Nutrition, v. 56, p. 377−387, 2005. SHIRO, M.; UEDA, M.; KAWAGUCHI, T.; ARAI, M. Cloning of a cluster of chitinase genes from Aeromonas sp. no. 10S-24. Biochimica et Biophysica Acta, v.1305, p. 44–48, 1996. SIDDHURAJU, P.; BECKER, K. Nutritional and antinutritional composition, in vitro amino acid availability, starch digestibility and predicted glycemic index of differentially processed mucuna beans (Mucuna prurirns var. Utilis): an under-utilised legume. Food chemistry, v. 91, p. 275 – 286, 2005. SIDDHURAJU, P.; VIJAYAKUMARI, K.; JANARDHANAN, K. Chemical composition and protein quality of the little-known legume, velvet bean (Mucuna pruriens (L.) DC.). Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 44, p. 2636–2641, 1996. SIEBRA, E. A. SBTX, uma nova toxina protéica das sementes de soja [Glycine max (l.) Merr.] cv. BR-10. Isolamento e purificação. 1998, 109p. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,1998. SIEBRA, E. A. Toxina da soja [Glycine max (L.) Merril]: aspectos bioquímicos e seu provável papel na defesa da planta. Doutorado em Bioquímica. Universidade Federal do Ceará, p. 148, 2004. SILVA, J. M. C.; SOUZA, M. A.; BIEBER, A. G. D.; CARLOS, C. J. Aves da Caatinga: status, uso do habitat e sensitividade. In: Leal, I. R., Tabarelli, M., Silva, J. M. C. (orgs.). Ecologia e Conservação da Caatinga. Editora Universitária UFPE, Recife, 2003, p. 237-273. SILVA, J. M. C.; TABARELLI, M.; FONSECA, M. T.; LINS, L. Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, 2004. SILVA, M. R.; SILVA, M. A. A. P. Fatores antinutricionais: inibidores de proteases e lectinas. Revista de Nutrição, v. 13, n. 1, p. 3-9, 2000. SILVA, W. J.; DÓRIA, G. A. A.; MAIA, R. T.; NUNES, R. S.; CARVALHO, G. A.; BLANK, A. F.; ALVES, P. B.; MARÇAL, R. M.; CAVALCANTI, S. C. H.. Effects of essential oils on Aedes aegypt larvae: alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresource Technology, v. 99, p. 3251–3255. 2008.

315

SILVEIRA, L. M. S.; ROSAS, L., S.; OLEA, R. S. G.; GONÇALVES, E. C., FONSECA JR, D. C. Atividade antibacteriana de extrato de gervão frente cepas de Staphylococcus aureus oxacilina-sensíveis e oxacilina-resistentes isoladas de amostras biológicas. RBAC-Role-based access control, v. 39, n. 4, p. 299-301, 2007. SIMPSON, H. C.; LOUSLEY, R. S.; GREEKIE, M.; HOCKADAY, T. D. R.; CARTER, R. D.; MANN, J. I. A high carbohydrate leguminous fibre diet improves all aspects of diabetes control. The Lancet, v.1, p. 1–4, 1981. SINDHU S. C.; KHETARPAUL N. Probiotic fermentation of indigenous food mixture: effect on antinutrients and digestibility of starch and protein. Journal of Food and Composition Analysis, v. 14, p. 601-609, 2001. SINGH, A.; KIRUBAKARAN, S. I.,; SAKTHIVEL, N. Heterologous expression of new antifungal chitinase from wheat. Protein Expression and Purification, v. 56, p. 100–109, 2007. SIRKO, A.; BRODZIK, R. Plant ureases: roles and regulation. Acta Biochimica Polonica, v. 47, p. 1189–1195, 2000. SMITH, J.E.; LUNN, P.G. Albumin-synthesizing capacity of hepatocytes isolated from rats fed diets differing in protein and energy content. Annals of Nutrition and Metabolism, v.28, n.5, p.281-287, 1984. SOARES, D. G. S.; OLIVEIRA, C. B.; LEAL, C.; DRUMOND, M. R. S.; ADILHA, W. W. N. Atividade antibacteriana in vitro da tintura de Aroeira (Schinus terebinthifolius) na descontaminação de escovas dentais contaminadas pelo S. mutans. Pesquisa Brasileira em Odontopediatria Clinica Integrada, v. 7, n.3, p. 253-257, 2007. SOLOMON, M.; BELENGHI, B.; DELLEDONNE, M.; MENACHEM, E.; LEVINE, A. The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation programmed cell death in plants. The Plant Cell, v. 11, p. 431–443, 1999. SOMIARI R. I.; BALOGH E. Effect of soaking, cooking and crude alphagalactosidase treatment on the oligosaccharide content of cowpea flours. Journal of Food Science and Agriculture , v. 61, p. 339-343, 1993. SONGSIRIRITTHIGUL, C.; PANTOOMA, S.; AGUDA, A. H.; ROBINSON, R. C.; SUGINTA, W. Crystal structures of Vibrio harveyi chitinase A complexed with chitooligosaccharides: Implications for the catalytic mechanism. Journal of Structural Biology, v. 162, p. 491–499, 2008. SORENSEN, J. S.; MCLISTER, J. D.; DEARING, M. D. Plant secondary metabolites compromise the energy budgets of specialist and generalist mammalian herbivores. Ecology, v. 86,p.125–39, 2005. SOTELO, A.; MIGLIARO, P.; TOLEDO, A.; CONTRERAS, J. Chemical composition, digestibility and antinutricional factors content of two wild legumes: Styphonolobium burseroides and Acacia bilimeki . Plant Foods for Human Nutrition, v.54, p.59-65, 1999.

316

SOUZA, D. O. B. Avaliação bioquímica e nutricional da soja [Glycine max (L) Merr.] cv. Seridó e Seridó-RCH. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Ceará, 102 p., 2001. SOUZA, G. C.; HAAS, A. P. S.; VON POSER, G. L.; SCHAPOVAL, E. E. S.; ELISABETSKY, E. Etnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the South of Brazil. Journal Ethnopharmacology, v. 90, p. 135-143, 2004. SOUZA, L. K. H.; OLIVEIRA, C. M. A; FERRI, P. H.; SANTOS, S. C.; JÚNIOR, J. G. O.; MIRANDA, A. T. B.; LIÃO, L. M.; SILVA, M. R. R. Antifungal properties of Brazilian Cerrado plants. Brazilian Journal of Microbiology , v. 33, p. 247-249, 2002. SOUSA, N. M. Classificação de Trinta Genótipos de Feijão-Caupi [Vigna Unguiculata (L.) Walp.] por meio de Caracterização Bioquímica e Nutricional. 2010. 84 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. SPACKMAN, D. H.; STEIN, W. H.; MOORE, S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Analytical Chemistry, v. 30, p. 1190-1206, 1958. SPARG, S. G.; LIGHT, M. E.; VAN STADEN, J. Biological activities and distribution of plant saponins. Journal of Ethnopharmacology, v. 94, p. 219–243, 2004. SRIDHAR, K. R.; SEENA, S. Nutritional and antinutritional significance of four unconvention legumes of the genus Canavalia – A comparative study. Food Chemistry, v. 99, p. 267-288, 2006. STAPLES, S. J.; REITHEL, F. J. Evidence for an active–inactive subunit complex in jack bean urease. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.174, p. 651–657, 1976. STINTZI, A.; HEITZ, T.; PRASAD, V.; PRASAD, V.; WIEDEMANNMERDINOGLU, S.; KAUFFMANN, S.; GEOFFROY, P.; LEGRAND, M.; FRITIG, B. Plant pathogenesis-related proteins and their role in defense against pathogens. Biochemie, v. 75, n. 8, p. 687-706, 1993. STOJANOVIC, D.; FERNANDEZ, M.; CASALE, I.; TRUJILLO, D.; CASTES, M. Characterization and mitogenicity of a lectin from Erythrina velutina seeds. Phytochemistry, v. 37, p. 1069–1074, 1994. STONE, B.; CLARKE, A. Chemistry and biology of (1,3)-β-Glucans. Melbourne: La Trobe University Press, 1992. STUBBLEBINE, W. H.; LANGENHEIM, J. H. Estudos comparativos da variabilidade na composicão da resina da folha entre árvore parental e progênie de espécies selecionadas de Hymenaea: comparacão de populacões Amazônicas com uma população do sudeste brasileiro. Acta amazonica, v.10, n.2, p.293-309,1980. SUNEJA, Y.; KAUR, S.; GUPTA, A. K.,; KAUR, N. Levels of nutritional constituents and antinutritional factors in black gram (Vigna mungo L. Hepper). Food Research International , v. 44, p. 621-628, 2011.

317

SUTAR, I. I.; VARTAK, H. G.; SRINIVASAN, M. C.; SIVARAMAN, H. Production of alkaline protease by immobilized mycelium of Conidiobolus. Enzyme and Microbial Technology, v. 8, p. 632-634, 1986. SUTHERLAND, I. W. Polysaccharases for microbial exopolysaccharides. Carbohydrate Research, v. 38, p. 319-328, 1999. SUTTHANONT, N.; CHOOCHOTE, W.; TUETUN, B.; JUNKUM, A.; JITPAKDI, A.; CHAITHONG, U.; RIYONG, D.; PITASAWAT, B. Chemical composition and larvicidal activity of edible plant-derived essential oils against the pyrethroid-susceptible and -resistant strains of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology, v. 35, n. 1, p. 106-115, 2010. SUZUKI, K.; TOKORO, A.; OKAWA, Y.; SUZUKI, S.; SUZUKI, M. Enhancing effects of N-acetyl-chito-oligosaccharides on the active oxygen-generating and microbicidal activities of peritoneal exudate cells in mice. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 33, n. 2, p. 886–8, 1985. SWAMINATHAN M. Pulses-essentials of food and nutrition. Ganesh and Co, Madras, pp 355-356, 1974. SWEENEY, H. L.; MORRIS, C.; KENNEDY, A. R Número de patente: WO2005011596, 2005. TABARELLI, M.; VICENTE, A. Conhecimento sobre plantas lenhosas da Caatinga: lacunas geográficas e ecológicas. In: Silva, J. M. C., Tabarelli, M., Fonseca, M. T., Lins, L. V. (orgs.). Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, 2004, p. 101-111. TABEI, T.; KIDATE, S.; NISHIZAWA, Y.; KIKUCHI, N.; KAYANO, T.; HIBI, T.; AKUTSU, K. Transgenic cucumber plants harboring rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytis cinerea). Plant Cell Reports. v. 17, p. 159–164, 1998. TACO, TABELA BRASILEIRA DE COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS . NEPA- UNICAMP.- Versão II. 2a ed. Campinas, SP: NEPA-UNICAMP, 2006,113p. TAIRA, T., TOMA, N., ISHIHARA, M. Purification, characterization, and antifungal activity of chitinases from pineapple (Ananas comosus) leaf. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 69, p.189–196, 2005. TALAS-OĞRAŞ, T.; IPEKÇI, Z.; BAJROVIÇ, K.; GÖZÜKIRMIZI. Antibacterial activity of seed proteins of Robinia pseudoacacia. Fitoterapia, v. 76, p. 67– 72, 2005. TANGSADTHAKUN, C.; KANOKPANONT, S.; SANCHAVANAKIT, N.; PICHYANGKURA, R.; BANAPRASERT, T.; TABATA, Y.; DAMRONGSAKKUL, S. J. The influence of molecular weight of chitosan on the physical and biological properties of collagen/chitosan scaffolds. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, v. 18, n. 2, p. 147–163, 2007.

318

TAUIL, P.L. Aspectos críticos do controle do dengue no Brasil. Cadernos da Saúde Pública, v. 18, n. 3, p. 867-871, mai-jun. 2002. TAVARES, W. Manual de Antibióticos e Quimioterápicos Antiinfecciosos. 2a ed. Atheneu; São Paulo, 1999, 792 p. TELES R. M. Caracterização Química, Avaliação Térmica e Atividade Larvicida Frente ao Aedes Aegypti do Óleo Essencial da Aniba Duckei Kostermans. Tese (Doutorado em Química orgânica), Centro de Ciências Extas e da Ntureza da Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2009. TELLAM, R. L.; VUOCOLO, T.; JOHNSON, S. E.; JARMEY, J.; PEARSON, R. D. Insect chitin synthase cDNA sequence, gene organization and expression. European Journal of Biochemistry, v. 267, p. 6025–6043, 2000. THAMTHIANKUL, S.; SUAN-NGAY, S.; TANTIMAVANICH, S.; PANBANGRED, W. Chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. Pakistani. Appllied Microbiology Biotechnology, v. 56, p. 395–401, 2001. THANANUNKUL D.; TANAKA M.; CHICHESTER C. O.; TUNG-CHING L. Degradation of raftinose and stachyose in soybean milk by alpha-Galactosidase from Mortieralla vinacea. Entrapment of alpha-galactosidase within polyacrylamide gel. Journal of Food Science, v. 4, n. 1, p. 173- 175, 1976. THARANATHAN, R. N.; MAHADEVAMMA, S. Grain legumes - a boon to human nutrition. Trends in Food Science & Technology, v. 14, p. 507–518, 2003. THOMAS, G.; ARAÚJO, C. C.; SOUZA, O. S. Avaliação das atividades anti-inflamatórias, analgésica e antipirética dos extratos aquosos de Caesalpinia ferrea, Plantago major, Polygonum acre e Pterodon polygaeflorus. Tenth. Brazilian Simposium in Medicinal Plants. São Paulo, Brasil, 1988. 619 p. THOMPSON, J. F. In: MIflIN, B. J. (Ed.), The Biochemistry of Plants. Acadamic Press, New York, pp. 375–402, 1980 TIMMERMANN, S. E.; BRIEGEL, H. Larval growth and biosynthesis of reserves in mosquitoes. Journal of Insect Physiology, v. 45, p. 461–470, 1999. TINÉ, M. A. S.; CORTELAZZO, A. L.; BUCKERIDGE, M. S. Xyloglucan mobilisation in cotyledons of developing plantlets of Hymenaea courbaril L. (Leguminosae-Caesalpinoideae). Plant Science, v. 154, p. 117–126, 2000. TINÉ, M. A. S.; SILVA, C. O.; LIMA, D. U.; CARPITA, N. C.; BUCKERIDGE, M. S. Fine structure of a mixed-oligomer storage xyloglucan from seeds of Hymenaea courbaril. Carbohydrate Polymers, v. 66, p. 444–454, 2006. TORNERO, P.; MAYDA, E.; GOMES, M. D.; CANAS, L.; CONEJERO, V.; VERA, P. Caracterization of LRP, a leucine-rich repeat (LRR) protein from tomato plants that processed during pathogenesis. The plant Journal, v. 10, p. 315 – 330, 1996.

319

TRINDADE, M. B.; LOPES, J. L.; SOARES-COSTA, A.; MONTEIRO-MOREIRA, A.C.; MOREIRA, R. A.; OLIVA, M. L.; BELTRAMINI, L. M. Structural characterization of novel chitin-binding lectins from the genus Artocarpus and their antifungal activity.. Biochimicaet Biophysica Acta, v. 1764, n. 1, p.146-152, 2006. TRIPATHI, P.; DUBEY, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology, v. 32, p. 235–245, 2004. TRUGO L. C.; RAMOS L. A.; TRUGO N. M.F.; SOUZA M.C.P. Oligosaccharide composition and trypsin inhibitor activity of P. vulgaris and the effect of germination on the alpha-galactoside composition and fermentation in the human colon. Food Chemistry, v. 36, p. 53-6 1, 1990. TRUGO, L. C.; DONANGELO, C. M.; TRUGO, N. M. F.; BACHKNUDSEN, K. Effect of heat treatment on nutritional quality of germinated legume seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 48, p.2082-2086, 2000. TSUCHIYA, H.; SATO, M.; MIYAZAKI, T.; TANIGAKI, S.; OHYAMA, M.; TANAKA, T.; IINUMA, M. Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Ethnopharmacology, v.50, n.1, p.27-34, 1996. UEMATSU, Y.; HIRATA, K.; SAITO, K. Spectrophotometric determination of saponin in Yucca extract used as food additive. Journal of AOAC International , v. 83, p. 1451–1454, 2000. UKHUN, M. E.; IFEBIGH, E. O. Compositional chemistry of Cassia alata seeds. Food Chemistry, v. 30, n. 3, p. 205- 210, 1988. UKHUN, M. E.; IFEBIGH, E. O. Chemical Analysis of Centrosema pubescence legume seeds. Journal of Food Biochemistry, v. 12, n. 4, p. 261-267, 1989. URBINA, J. M.; CORTÉS, J. C.; PALMA, A.; LÓPEZ, S. N.; ZACCHINO, S. A.; ENRIZ, R. D.; KOUZNETSOV, V. V. Inhibitors of the fungal cell wall. Synthesis of 4-aryl-4-N-arylamine-1-butenes and related compounds with inhibitory activities on b (1-3) glucan and chitin synthases. Bioorganic and Medicinal Chemistry, v. 8, p. 691-698, 2000. URWIN, P. E.; LILLEY, C. J.; MCPHERSON, M. J.; ATKINSON, H. J. Resistance to both cyst and rootnot nematodes conferred by transgenic Arabidopsis expressing a modified plant cystatin. The Plant journal, v. 12, n.2, p. 455-461, 1997. USP (Universidade de São Paulo). Faculdade de Medicina. Parâmetros biológicos dos animais de experimentação no Biotério da FMUSP. São Paulo. Disponível em: http://www.tcirurgica.fm.usp.br/bioterio/asnell/bioquimica.doc. Acesso em: 27de dezembro, 2010. UZOGARA, S. G.; OFUYA, Z. M. Processing and utilization of cowpea in developing countries: a review. Journal Food Processing and Preservation, v.16, p. 105-147, 1992.

320

VADIVEL, V.; JANARDHANAN, K. Nutritional and antinutritional characteristics of seven south Indian wild legumes. Plant Foods for Human Nutrition, v. 60, n. 2, p. 69-75, 2005. VADIVEL, V.; JANARDHANAN, K. Nutritionas and Antinutritional Atributtes of the under-utilized legume, Cassia floribunda Cav. Food Chemistry, v. 73, p. 209 – 215, 2001. VADIVEL, V.; PUGALENTHI, M. Effect of various processing methods on the levels of antinutritional constituents and protein digestibility of Mucuna pruriens (l.) Dc. Var. Utilis (wall. Ex wight) baker ex burck (velvet bean) seeds. Journal of Food Biochemistry, v. 32, p. 795–812, 2008. VAN BAMBEK, F.; MICHOT, J. M.; TULKENS, P. M. Antibiotic Efflux Pump in Eukaryotic Cells: Occurence and Impact on Antibiotic Cellular Pharmacokinetics, Pharmacodynamics and Toxicodynamics. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.51. p. 1067 – 1077, 2003. VAN DER HOORN, R. A. L.; JONES, J. D. G. The plant proteolytic machinery and its role in defense. Current Opinion in Plant Biology , v. 7, p. 400-407, 2004. VAN DER POEL, A. F. B.; HUISMAN, J.; SAINI, H. S. Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds. [S.l.: s.n.] p.157-171, 1993. VAN DRIESSCHE E. Structure and function of leguminosae lectins. In: FRANZ H, (ed.). Advances in lectin research, vol. 1. Berlin: Springer-Verlag; 1988. p. 73. VAN GENT, D.; SHARP, P.; MORGAN, K.; KALSHEKER, N. Serpins: structure, function and molecular evolution [J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 35, n. 11, p. 1536-1547, 2003. VAN LOON, L. C.; REP, M.; PIETERSE, C .M. J. Significance of Iducible Defense-related proteins in infestants plnts. Annual Review of Phytopathology, v. 44, p. 135-162, 2006. VASCONCELOS, I. M.; MAIA, A. A.; SIEBRA, E. A.; OLIVEIRA, J. T. A.; CARVALHO, A. F. F. U.; MELO, V. M. M.; CARLINI, C. R.; CASTELLAR, L. I. M. Nutritional study of two Brazilian soybean (Glycine max) cultivars differing in the contents of antinutritional and toxic proteins. Journal of Nutritional Biochemistry, v.12, n.1, p.55-62, 2001. VASCONCELOS, I. M.; MAIA, F. M. M.; FARIAS, D. F.; CAMPELLO, C. C.; CARVALHO, A. F. U.; MOREIRA, R. A.; OLIVEIRA, J. T. A. Protein fractions, amino acid composition and antinutritional constituents of high-yielding cowpea cultivars. Journal of Food Composition and Analysis, v. 23, p. 54–60, 2010. VASCONCELOS, I. M.; OLIVEIRA, J. T. A. Antinutritional properties of plant lectins. Review. Toxicon, v. 44, p. 385-403, 2004. VASCONCELOS, I. M.; SIEBRA, E. A.; MAIA, A. A. B.; MOREIRA, R. A.; NETO, A. F.; CAMPELO, G. J. A.; OLIVEIRA, J. T. A. Composition, toxic and antinutritional factors of newly developed cultivars of Brazilian soybean (Glycine max). Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 75, n. 4, p. 419-426, 1997.

321

VASCONCELOS, I. M.; TRENTIM, A.; GULMARAES, J. A.; CARLINI, C. R. Purification and physicochemical characterization of soyatoxin, a novel toxic protein isolated form soybeans (glycine max). Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 312, p. 357–366, 1994. VASCONCELOS, M. C. A.; RODOVALHO, N. C. M.; POTT, V. J.; FERREIRA, A. M. T.; ARRUDA, A. L. A.; MARQUES, M. C. S.; CASTILHO, R. O.; BUENO, N. R. Avaliação de Atividades Biológicas das Sementes de Stryphnodendron obovatum Benth (leguminosae). Revista Brasileira de Farmacologia. v.14, n. 1, p. 121– 127, 2004. VASCONCELOS, S. M.; MACEDO, D. S.; DE MELO, C. T.; PAIVA MONTEIRO, A.; RODRIGUES, A. C.; SILVEIRA, E. R.; CUNHA, G. M.; SOUSA, F. C.; VIANA, G. S. Central activity of hydroalcoholic extracts from Erythrina velutina and Erythrina mulungu in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 56, p. 389–393, 2004. VASCONCELOS, I. M.; CAMPELLO, C. C.; OLIVEIRA, J. T. A.; CARVALHO, A. F. F. U.; SOUSA, D. O. B. ; MAIA, F. M. M. Brazilian soybean [Glycine max (L.) Merr.] cultivars adapted to low latitude regions: seed composition and bioactive protein contents. Revista Brasileira de Botânica, v. 29, p. 617-625, 2006. VASCONCELOS, S. M.; OLIVEIRA, G. R.; DE CARVALHO, M. M.; RODRIGUES, A. C.; SILVEIRA, E. R.; FONTELES, M. M. F.; SOUSA, F. C. F.; VIANA, G. S. B. Antinociceptive activities of the hydroalcoholic extracts from Erythrina velutina and Erythrina mulungu in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 26, p. 946–949, 2003. VASCONCELOS, S. M.; LIMA, N. M.; SALES, G. T.; CUNHA, G. M.; AGUIAR, L. M.; SILVEIRA, E. R.; RODRIGUES, A. C.; MACEDO, D. S.; FONTELES, M. M.; SOUSA, F. C.; VIANA, G. S. Anticonvulsant activity of hydroalcoholic extracts from Erythrina velutina and Erythrina mulungu. Journal of Ethnopharmacology, v. 110, p.271–274, 2007. VEGA, N.; PÉREZ, G. Isolation and characterization of a Salvia bogotensis seed lectin specific for the Tn antigen. Phytochemistry, v. 67, p. 347-355, 2006. VELLOSO, A. L.; SAMPAIO, E. V. S. B.; PEREYN, F. G. C. (eds.) Ecorregiões Propostas para o Bioma Caatinga. APNE, Recife, 2002. VERBURG, J. G.; HUYNH, Q. K. Purification and Characterization of an Antifungal Chitinase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiology. v. 95, p. 450-455, 1991. VIDAL-VALVERDE, C.; FRIAS, G.; ESTRELLA, I.; GOROSPE, M. G.; RUIZ, R.; BACON, J. Effect of processing on some antinutritional factors of lentils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 42, p.2291–2295, 1994. VIJAYAKUMARI, K.; SIDDHURAJU, P.; JANARDHANAN, K. Effect of different post-harvest treatments on antinutritional factors in seeds of the tribal pulse, Mucuna pruriens (L.) DC. International Journal of Food Sciences & Nutrition, v. 47, p. 263–272, 1996.

322

VIJAYAKUMARI, P.; SIDDHURAJU, P.; PUGALENTHI, M.; JANARDHANAN, K. Effect of soaking and heat processing on the levels of antinutrients and digestible proteins in seeds of Vigna aconitifolia and Vigna sinensis. Food Chemistry, v. 63, p. 259–264, 1998. VILLEGAS, R.; GAO, Y.-T., YANG, G.; LI, H.-L.; ELASY, T. A.; ZHENG, W.; SHU, X. O. Legume and soy food intake and the incidence of type 2 diabetes in the Shanghai Women’s Health Study. American Journal of Clinical Nutrition , v. 87, p.162–167, 2008. VIRTUOSO, S.; DAVET, A.; DIAS, J. F. G.; CUNICO, M. M.; MIGUEL, M. D.; OLIVEIRA, A. B.; MIGUEL, O. E. Preliminary study of the antibacterial activity of Erythrina velutina Willd., Fabaceae (Leguminosae). Brazilian Journal of Pharmacognosy, v.15, 137–142, 2005. VIRTUOSO, S.; MIGUEL, O. G. Estudo fitoquímico e biológico das cascas de Erythrina velutina willd. - fabaceae (leguminosae - papilionoideae) .Visão Acadêmica, Curitiba, v.6, p. 89-90, n.1, 2005. VISWANATHAN, M. B.; THANGADURAI, D.; RAMESH, N. Biochemical and nutritional evaluation of Neonotonia wightii (Wight & Arn.) Lackey (Fabaceae). Food Chemistry, v. 75, p. 275–279, 2001. VOGELSANG, R.; BARZ, W. Purification, characterization and differential hormonal regulation of a β-1,3-glucanase and two chitinases from chickpea (Cicer arietinum L.). Planta, v. 189, p. 60-69, 1993. VOLAND, P.; WEEKS, D. L.; MARCUS, E. A.; PRINZ, C.; SACHS, G.; SCOTT, D. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins encoded by the urease gene cluster. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Live Physiology, v. 284, p. G96–106, 2003. WALKER, A. F.; KOCHHAR, N. Effect of processing including domestic cooking on nutritional quality of legumes. Proceedings of the Nutritional Society, v. 41, p. 41–51, 1982. WALLER, G. R.; NOWACKI, E. K. Alkaloid Biology and Metabolism in Plants. Plenum Press, New York, 1978. WAN, X. S.; MEYSKENS, F. L.; ARMSTRONG, W. B.; TAYLOR, T. H.; KENNEDY, A. R. Relationship between protease activity and neu oncogene expression in patients with oral leukoplakia treated with the Bowman Birk inhibitor. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, v. 8, p. 601–608, 1999. WANG, H. X.; NG, T. B. An antifungal peptide from the coconut. Peptides, v. 26, p. 2392-2369, 2005. WANG, H. X.; NG, T. B. An antifungal protein from the pea Pisum sativum var Arvense. Peptides, v. 27, n 7, p. 1732-1737, 2006a. WANG, H. X.; NG, T. B. Concurrent isolation of a Kunitz-type trypsin inhibitor with antifungal activity and a novel lectin from Pseudostellaria heterophylla roots. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 342, p. 349-353, 2006b.

323

WANG, H. X.; NG, T. B. An antifungal peptide from red lentil seeds. Peptides, v. 28, p. 547-552, 2007. WANG, N.; LEWIS, M. J.,; BRENNAN, J. G.; WESTBY, A. Effect of processing methods on nutrients and antinutritional factors in cowpea. Food Chemistry, v. 58, p. 59–68, 1997. WANG, S. H.; NG, T.; CHEN, T.; LIN, D.; WU, J.; RAO, P.; YE, X. First report of a novel plant lysozyme with both antifungal and antibacterial activities. Biochemical And Biophysical Research Communications, v. 27 p. 820–827, 2005a. WANG, S. L.; HWANG, J. R. Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of chitinases. Enzyme and Microbial Technology, v. 28, p. 376–382, 2001. WANG, S-L.; YEN, Y-H.; TZENG, G-C.; HSIEH, C. Production of antifungal materials by bioconversion of shellfish chitin wates fermented by pseudomonas fluorescens K-188. Enzyme and Microbial Technology. v. 36. p. 49-56, 2005b. WANG, S.; SHAO, B.; FU, H.; RAO, P. Isolation of a thermostable legume chitinase and study on the antifungal activity. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 85, p. 313–321, 2009. WANG, T. L.; DOMONEY, C.; HEDLEY, C. L.; LASEY, R.; GRUSAK, M. A. Can we improve the nutritional quality of legume seeds? Plant Physiology, v. 131, p. 886−891, 2003. WANG, X.; BUNKERS, G. J.; WALTERS, M. R.; THOMA, R. S. Purification and characterization of three antifungal proteins from cheeseweed (Malva parviflora). Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 282, p. 124-1228, 2001. WARE, J. H.; WAN, X. S.; NEWBERNE, P.; AND KENNEDY, A. R Bowman-Birk inhibitor concentrate reduces colon inflammation in mice with dextran sulfate sodium-induced ulcerativ colitis. Digestive Diseases and Sciences, v. 44, p. 986-990, 1999. WATSON, A. A.; FLEET, G. W. J.; ASANO, N.; MOLYNEUX, R. J.; NASH, R. J. Polyhydroxylated alkaloids – natural occurrence and therapeutic applications. Phytochemistry, v. 56, p. 265-295, 2001. WEBER, E. A. Armazenagem Agrícola. Agropecuária, Guaíba, 2001 , 396 p. WEBSTER, J. Introduction to Fungi . Cambridge University Press, 1986, p.57–64. WESSELS, J. G. H.; SIETSMA, J. H. Fungal cell wall: a survey, In: TANNER, W.; LOEWUS, F. A. (Eds.), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Plant Carbohydrates II, Springer-Verlag, vol. 13B, 1981, p. 352–394. WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevent and control. WHO Library Cataloguing-in-publication, 2009. WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). Guidelines for laboratory and field testing of mosquito larvicides. WHO/CDS/WHOPES/GCDPP/2005.13, 2005.

324

WILKINS, M.; ALARCÓN, C.; URZÚA, A.; MENDOZA, L. Characterization of the bactericidal activity of the natural diterpene kaurenoic acid. Planta Medica, v. 68, n. 5, p. 452–54, 2002. WILSON, T. G.; CRYAN, J. R. Lufenuron, a chitin-synthesis inhibitor, interrupts development of Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology, v. 278, p. 37–44, 1997. WIESMAN, Z.; CHAPAGAIN, B. P. Laboratory Evaluation of Natural Saponin as a Bioactive Agent against Aedes aegypti and Culex pipiens. Dengue Bulletin, v. 27, p.168-173, 2003. WILLIAMSON, V. M.; HUSSEY, R. S. Nematode pathogenesis and resistance in plants. The Plant cell, v. 8, n. 10, p. 1735-1745,1996. WINK, M. Introdution. In: ROBERTS, WINK, M. Alkaloids: biochesmistry, ecology and medicinal applications, Plenum Press, New York, 1998. WINK, M.; MEIßNER, C.; WITTE, L. Patterns of quinolizidine alkaloids in 56 species of the genus Lupinus. Phytochemistry, v. 38, p. 139–153, 1995. WINK, M.; MOHAMED, G. I. A. Evolution of chemical defense traits in the Leguminosae: mapping of distribution patterns of secondary metabolites on a molecular phylogeny inferred from nucleotide sequences of the rbcL gene. Biochemical Systematics and Ecology, v. 31, p. 897–917, 2003. WIRYAWAN, K. G.; DINGLE, J. G. Recent research on improving the quality of grain legume for chicken growth. Animal Feed Science and Technology, v. 76, p. 185-193, 1999. WONG, J. H.; NG, T. B. Vulgarin, a broad-spectrum antifungal pepitide from haricot beans (Phaseolus vulgaris). The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v.37, p. 1626-1632, 2005. WONG, J. H.; NG, T. B. Isolation and characterization of a glucose/mannose Aspecific lectin with stimulatory effect on nitric oxide production by macrophages from the emperor banana. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 38, p.234-243, 2006a. WONG, J. H.; WONG, C. C. T.; NG, T. B. Purification and characterization of a galactose Aspecific lectin with mitogenic activity from pinto beans. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1760, p. 808-813, 2006. WONG, J. H.; NG., T. B. Vulgarinin, a broad-spectrum antifungal peptide from haricot beans (Phaseolus vulgaris). The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 37, p. 1626-1632, 2006b. WONG, K. H.; CHEUNG, P. C. K. Nutritional assessment of three chinese indigenous legumes in growing rats. Nutrition Research, v, 18, n. 9, p. 157 – 1580, 1998.

325

WRATHER, J. A.; ANDERSON, T. R.; ARSYAD, D. M.; GAI, J.; PLOPER, L. D.; PORTA-PUGLIA, A.; RAM, H. H.; YORINORI, J. T. Soybean disease loss estimates for the 10 soybean producing contries in 1994. Plant Disease, v. 81, p. 107-110, 1997 XAVIER-FILHO, J. Sementes e suas defesas contra insetos. Projeto Multinacional de Biotecnologia e Alimentos. Organização dos Estados Americanos-OEA, p. 1-31, 1989. XIA, L.; NG, T. B. Actinchinin, a novel antifungal protein from the gold kiwi fruit. Peptides, v. 25, p. 1093-1098, 2004. XIA, L.; NG, T. B. An antifungal protein from flageolet beans. Peptides, v. 26, n.12, p. 2397-2403, 2005. XU, B.; CHANG, S. K. C. Effect of soaking, boiling, and steaming on total phenolic content and antioxidant activities of cool season food legumes. Food Chemistry, v. 110, p. 1–13, 2008. XU, H. X.; LEE, S. F. Activity of plant flavonoids against antibiotic-resistant bacteria. Phytotherapy Research, v. 15, n. 1, p. 39-43, 2001. YAICHAROEN, R.; KIATFUENGFOO, R.; CHAREONVIRIYAPHAP, T.; RONGNOPARUT, P. Characterization of deltamethrin resistance in field populations of Aedes aegypti in Thailand. Journal of Vector Ecology, v. 30, p. 144-150, 2005. YAMADA, A.; SHIBUYA, N.; KODAMA, O.; AKATSUKA, T. Induction of Phytoalexin Formation in Suspension-cultured Rice Cells by N-Acetylchitooligosaccharides. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 57, p. 405–409, 1993. YAMAGAMI, T.; ISHIGURO, M. Complete amino acid sequences of chitinase-1 and -2 from bulbs of genus Tulipa. Bioscience. Biotechnology, and Biochemistry, v. 62, p.1253–1257, 1998. YAMAMOTO, T.; IKETANI, H.; IEKI, H.; NISHIZAWA, Y.; NOTSUKA, K.; HIBI, T.; HAYASHI, T.; MATSUTA, N. Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogen. Plant Cell Reports. v. 19, p. 639–646. 2000. YAN, Q.; JIANG, Z.; YANG, S.; DENG, W.; HAN, L. A. Novel homodimeric lectin from Astragalus mongholicus with antifungal activity. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 442, p. 72-81, 2005. YAN, R. X.; HOU, J.; DING, D. F.; GUAN, W.; WANG, C. Y.; WU, Z.; PROF, M. L. In vitro antifungal activity and mechanism of action of chitinase against four plant pathogenic fungi. Journal of Basic Microbiology, v. 48, p. 293 – 301, 2008. YEANG, H. Y.; YUSOF, F.; ABDULLAH, L. Precipittion of Hevea brasiliensis Latex proteins with Trichloroacetic Acid and Phosphotungstic Acid in Preparation for the Lowry Protein Assay.Analytical Biochemistry. v. 226, p. 35 – 43, 1995. YEBOAH, N. A.; ARAHIRA, M.; NONG, V. H.; ZHANG, D.; KADOKURA, K.; WATANABE, A.; FUKAZAWA, C. A class III acids endochitinase is especifically expressed

326

in the developing seeds of soybean (Glicine max (L.) Merr.). Plant Molecular Biology, v. 36, p. 407–415, 1998. YOSHIDA, H.; KAJIMOTO, G. Effects of microwave treatment on the trypsin inhibitor and molecular species of triglycerides in soybeans. Journal of Food Science, v. 53, n.6, p. 1756-1760, 1988. YUNES, R. A.,; E FILHO, V. C. Breve análise histórica da química da Plantas Medicinais: Sua importância na atual concepção de fármaco segundo os paradigmas ocidental e oriental. In: YUNES, R. A., E CALIXTO, J. B. Plantas Medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Argos, Chapecó, 2001, p. 17-44. ZACCHINO, S.; SANTECCHIA, C.; LÓPEZ, S.; GATTUSO, S.; MUNOZ, J.; CRUANES, A.; VIVOT, E.; CRUANES, M.; SALINAS A.; RUIZ, R.; RUIZ, S. In vitro antifungal evaluation and studies on mode of action of eight selected species fromthe Argentine flora. Phytomedicine, v.5, p.389-95, 1998. ZACCHINO, S. Estratégia para a descoberta de novos agentes antifúngicos. In: YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos. 2001, p. 435-479. ZAMORA, R. G.; VEUM, J.L. The nutritive value of dehulled soybeans fermented with Aspergillus oryzae or Rhizopus oligosporus as evaluated by rats. Journal of Nutrition , v.109, p.1333–1338 , 1979. ZDUNCZYK, Z.V.; JUSKIEWICZ, J.; FREJNAGEL, S.; GULEWIC, K. Influence of alkaloids and oligosaccharides from white lupin seeds on utilization of diets by rats and absorption of nutrients in the small intestine. Animal Feed Science Technology, v. 72, p. 143–154, 1998. ZHANG, Z.; LI, Y.; LI, C.; YUAN, J.; WANG, Z. Expression of a buckwheat trypsin inhibitor gene in Escherichia coli and its effects on multiple myeloma IM-9 cell proliferation. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, v. 39, p. 701-707, 2007. ZHANG, Z. Z.; ELSOHLY, H. N.; JACOB, M. R.; PASCO, D. S.; WALKER, L. A.; CLARK, A. M. Natural products inhibiting Candida albicans secreted aspartic proteases from Tovomita krukovii. Planta Medica, v. 68, p. 49-54, 2002. ZHOU J. R.; ERDMAN J. W. Phytic acid in health and disease. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 35, n. 6, p.495-508, 1995. ZHU, Q.; MAHER, E. A.; MASOUD, S.; DIXON, R. A.; LAMB, C. J. Enhanced protection against fungal attack by constitutive co expression of chitinase and glucanase genes in transgenic tobacco. Biotechnology, v. 12, p. 807-812, 1994. ZHU, S.; RIAZ, M. N.; LUSAS, E. W. Effect of different extrusion temperatures and moisture content on lipoxygenase inactivation and protein solubility in soybeans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44, p. 3315-3318, 1996.

327

ZHU, Y. C.; SPECHTN, C. A.; DITTMER, N. T.; MUTHUKRISHNAN, S.; KANOST, M. R.; KRAMER, K. J. Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding a putative epidermal chitin synthase of Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 32, p. 1497–1506, 2002. ZIMOCH, L.; MERZENDORF, H. Immunolocalization of chitin synthase in the tobacco hornworm. Cell and Tissue Research, v. 308, 2002. ZIPCODE ZOO, Disponível em: http://zipcodezoo.com/Plants/P/Piptadenia_moniliformis.asp#Taxonomy Acesso em: 28 de dezembro, 2010. ZONIA, L. E.; STEBBINS, N. E.; POLACCO, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiology, v. 107, p. 1097–1103, 1995.

328

329

8. ANEXOS

8.1 Fonte da Figura 2

LETRA / ESPÉCIE FONTE A / Erythrina velutina LORENZI, 2002. B / Caesalpinia ferrea http://www.atelierdobonsai.com.br/forum/viewtopic.php

?t=11646&sid=61343b5bd21e44d64bd58fbe7796cc15

C / Hymenaea courbaril LORENZI, 2002. D / Lonchocarpus sericeus Chris Baasch :

http://www.tropicsphere.com/main/forums/viewtopic.php?f=2&t=9474&p=75535

E / Enterolobium contortisiliquum F / Piptadenia moniliformis G / Parkia platycephala

LORENZI, 2002.

H / Caesalpinia Bracteosa http://www.brasilcidadao.org.br/museu/ma_flora_05.php I / Dioclea megacarpa http://plants.usda.gov/java/largeImage?imageID=dime7_

001_ahp.tif J / Senna rugosa Arquivo Pessoal

330

8.2 Fonte da Figura 3

LETRA / ESPÉCIE FONTE 1 Vagem de Caesalpinia ferrea 2 Vagens de Caesalpinia Bracteosa 3 (a) Vagens de Dioclea megacarpa

Arquivo Pessoal

3 (b) Sementes de Dioclea megacarpa

http://grainecreation.com/zye_bourik_dioclea_megacarpa.aspx

4 Senna rugosa 5 (a) Vagens de Enterolobium contortisiliquum

Arquivo pessoal

5 (b) Sementes de Enterolobium contortisiliquum

http://www.arvores.brasil.nom.br/new/tamboril/index.htm

6 (a) Sementes de Parkia platycephla 6 (b) Vagens de Parkia platycephla

LORENZI, 2002.

7 (a)1 Vagens de Lonchocarpus sericeus

Arquivo pessoal

7 (a)2 Vagens de Lonchocarpus sericeus 7 (b) Sementes de Lonchocarpus sericeus 8 (a) Vagens de Erythrina velutina 8 (b) Sementes de Erythrina velutina

LORENZI, 2002.

9 (a) Hymenaea courbaril LORENZI, 2002. /www.clubedasemente.org.br/jatoba.html

9 (b) Hymenaea courbaril LORENZI, 2002. 10 (a)1 Sementes de Piptadenia moniliformis

Arquivo pessoal

10 (a)2 sementes de Piptadenia moniliformis 10 (b) Vagens Piptadenia moniliformis

LORENZI, 2002.

331

8.3 Artigo publicado

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PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE … · Ao laboratório de Toxinas Vegetais, do qual já fiz parte, por sempre disponibilizar ... 3.2 Animais de Laboratório e Alojamento