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09/03/2018
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Estágios no processo produtivo
Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. CamargoCiências Físicas e Biomoleculares
IFSC - USP
1- Os três estágios do bioprocesso
2- Biorreatores
3- Upstream
3.1– Escolha do Biocatalisador
3.2 – Obtenção do Biocatalisador
3.3 – Conservação do Biocatalisador
Estágios no processo produtivo
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1. Os três Estágios do bioprocesso
Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios:
Processo “Upstream”
Biorreatores e biorreação
Processo “Downstream”
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Upstream
Biorreação/Biorreator
Downstream
Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas
mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas,
microrganismos ou enzimas sobre condições controladas para a
biotransformação de matérias primas em produtos
Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um
produto direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos
ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados
Produto – alimento, medicamento ou composto industrial
Escala laboratorial Escala industrial
Estágios do processo produtivo
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2. Biorreatores
Biorreator ou fermentador
Biorreatores, reatores
bioquímicos, reatores biológicos
são os reatores químicos nos
quais ocorrem uma série de
reações químicas catalisadas por
biocatalisadores
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Biorreator de 90L
Biorreator de bancada
http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930
Biorreator ou fermentador
http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor
3- Processo Upstream
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Processo “Upstream”
• Escolha do biocatalisador
• Preparo da matéria prima ou substrato a ser processado
• Preparação de meio e sua esterilização
• Alimentação do biorreator
• Regulação de temperatura, pH e pressão
• Inoculação da cultura no meio assepticamente
Biorreação
Características gerais desejáveis de microrganismos para aplicação industrial:
1. Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato
em produto;
2. Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter
elevada concentração do produto no caldo fermentado;
3. Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;
4. Apresentar constância quanto ao comportamento
fisiológico;
5. Não ser patogênico
6. Não exigir condições de processo muito complexas;
7. Não exigir meios de cultura dispendiosos;
8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio.
Processo “Upstream”
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1 - Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em
produto;
Matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final
(38 a 73% do custo total de produção)
C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2
1 g glicose 0,511g de etanol
S. cerevisiae rendimento de 90% da reação de fermentação anaeróbia
Destilação - perda
Quando o produto é produzido em menor quantidade em relação ao açúcar
consumido (enzimas ou antibiótico) o custo com a recuperação dos
produtos são mais onerosas
Processo “Upstream”
2 - Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se terelevada concentração do produto no caldo fermentado;
Sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo
3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;
Sem produzir proteases extracelulares
Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulemmenos compostos intermediários incrementam a síntese doproduto
Processo “Upstream”
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3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;
Exemplo:
Aspergillus produz glicoamilase
glicoamilaseAmido Glicose
Várias aplicações (xaropes de glicose na indústria de alimentos)
Alguns microrganismos também sintetizam transglicosidase que polimeriza a glicose novamente, porém de uma forma que
não são mais hidrolisadas pela glicoamilase
Processo “Upstream”
Característica importante: Estabilidade fisiológica da linhagem
Não basta uma linhagem hiperprodutora de uma substância,
mas que se conheça as técnicas mais adequadas para sua
conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente
produtora da substância de interesse ao longo de todas as
etapas envolvidas desde sua proliferação no laboratório,
germinadores e biorreator principal
Processo “Upstream”
4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico
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Para a célula há sempre a tendência de otimizar o crescimento,
em detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não
basta verificar se a célula cresce, mas se ela continua a
acumular o produto de maneira eficaz!!
Durante a proliferação da célula há sempre chances de
mutações naturais!!
Massa pequena de células no inóculo
Biorreatores de dezenas de milhares de litros10g de matéria seca de células/ L
Processo “Upstream”
5. Não ser patogênico!!
Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas
seguintes ao término da fermentação (downstream)
Se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de
dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante
aumentados, o que incidiria em custos adicionais
São utilizados patógenos para produção de vacinas em reatores de
pequeno porte (poucos milhares de litros), porém confinados em
câmaras assépticas, tomando-se precauções necessárias para a não
contaminação do meio ambiente
Processo “Upstream”
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Técnicos do Instituto Butantan trabalham na área de fermentação da linha de produção de vacinas
http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3
http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php
Fort Dodge (Pfizer)
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6. Não exigir condições de processo muito complexas
pH e Temperatura: em reatores de grande porte não há controle
preciso, por isso o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa
de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais,
particularmente no que se refere ao acúmulo do produto
Processo “Upstream”
Heterogeneidade ao longo da altura do reator
Reatores de grandes portes (dezenas de milhares de L)
Importante: células devem manter seu
desempenho dentro de uma faixa de
valores ótimos!!
pH e oxigênio
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Biotecnologia do bioprocesso
6. Não exigir condições de processo muito complexas
Tensão de oxigênio: os microrganismos que conseguem manter
um bom desempenho quando cultivados em baixas concentrações
de oxigênio são muito interessantes
Há maior gasto de energia para
a agitação e aeração do meio!
Processo “Upstream”
Biotecnologia do bioprocesso
Tensão de oxigênio:
Processo “Upstream”
Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por
exemplo) são evitados, pois a concentração de oxigênio no meio de
cultivo terá de ser mais elevada, a fim de que as células mais internas
destes aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando
comparadas às células que crescem isoladamente
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Biotecnologia do bioprocesso
Não é conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma
quantidade exagerada de proteínas para o meio
Geração de espuma.
Isso torna complexo os processos aeróbios
devido à necessidade de aerar e agitar o
conteúdo do biorreator
6. Não exigir condições de processo muito complexas
Processo “Upstream”
Biotecnologia do bioprocesso
7. Não exigir meio de cultura dispendioso
1. Ser o mais barato possível;
2. Atender às necessidades nutricionais do microrganismo;
3. Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser
ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas do
pH, ou evitar uma excessiva formação de espuma;
4. Não provocar problemas na recuperação do produto;
5. Os componentes devem permitir algum tempo de
armazenagem, a fim de estarem disponíveis o tempo todo;
6. Ter composição razoavelmente fixa;
7. Não causar dificuldades no tratamento final do efluente.
Processo “Upstream”
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Biotecnologia do bioprocesso
7. Não exigir meio de cultura dispendioso
Meios sintéticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composição
conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante.
Para células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,
espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de
não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do
produto final.
Meios definidos ou sintéticos podem ser preferidos se permitirem uma
maior economia nas etapas de recuperação do produto
Processo “Upstream”
Biotecnologia do bioprocesso
7. Não exigir meio de cultura dispendioso
Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como aminoácidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)
Adiciona-se as substâncias puras para manter o meio em sua forma mais definida – No entanto... Isso pode se tornar inviável
financeiramente quando as instalações são de grande porte.
Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc
Problema: substâncias caras, composição variável (ao longo do tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado) – oscilação no processo fermentativo!!!
Processo “Upstream”
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Biotecnologia do bioprocesso
7. Não exigir meio de cultura dispendioso
Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala:
Matérias-primas naturais: caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de
milho (Corn Steep Liquor) etc
•Composição química desconhecida
•Pode-se conhecer os teores de açucares disponíveis, nitrogênio, fósforo,
mas não se conhecem os teores dos sais minerais
•Sempre são completados com alguns sais (contento nitrogênio e fósforo)
Variação conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante colheita e estocagem etc – oscilações no processo fermentativo!!
Processo “Upstream”
Biotecnologia do bioprocesso
7. Não exigir meio de cultura dispendioso
Empresas que produzem antibióticos ou enzimas e que utilizam essas
matérias primas naturais, principalmente a água de maceração de milho,
devem manter uma planta piloto para o ajuste da composição do meio a
cada novo lote de matéria-prima recebida para evitar surpresas nos
biorreatores de grande porte
Por serem as mais baratas são as mais utilizadas
Porém podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação
do produto final, bem como problemas nos tratamentos das águas
residuárias
Processo “Upstream”
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Biotecnologia do bioprocesso
8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio
•Se o produto é liberado no meio, ele poderá ser recuperado nas
etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de
lise celular e outras reações que elevam o custo
•Se algum produto permanecer dentro das células ele poderá ser
perdido após a separação das células do meio após a fermentação
•Pode haver uma eventual inibição do próprio microrganismo pela
retenção de um dado produto do metabolismo
•Retenção de certos produtos nas células depende entre outros
fatores de: linhagem empregada, da composição do meio de cultura e
das condições impostas (pH, temperatura, etc)
Processo “Upstream”
3.2. Obtenção de Biocatalisadores
Processo “Upstream”
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3.2. Obtenção de Biocatalisadores
Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:
• Isolamento a partir de recursos naturais
• Compra em coleções de culturas (ATCC, NCTC...)
• Manipulações genéticas:
1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais
2. Fusão de protoplastos
3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de
engenharia genética
Processo “Upstream”
Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais
•Solo•Água•Plantas
Atividade de grande importância para obtenção de novas
linhagens de interesse industrial como linhagens melhor
produtoras de um dado produto. Além disso, pode conduzir
à descoberta de novos produtos, o que confere a esta
prática uma relevância inequestionável
Muito trabalho experimentalCusto relativamente elevado
Biotecnologia do bioprocesso
Processo “Upstream”
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Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais
Santuário do Caraça
Compra em coleções de culturas
Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA)
American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA)http://www.atcc.org/
Coleção de Culturas Tropical – (Campinas-SP)http://www.cct.org.br
National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido)http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha)
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQSLab. de Microrganismos de Referência - Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
•Disponíveis em vários países •Compra bastante viável•Facilidade através dos recursos da Internet
Microrganismos produtores de antibióticos, em geral, não estão disponíveis em uma coleção de culturas
Oriundos de programas de melhoramento genético
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Manipulações genéticas
1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais
2. Fusão de protoplastos
3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de
engenharia genética
Biotecnologia do bioprocesso
Processo “Upstream”
Obtenção de mutantes induzidos por
métodos convencionais
Proliferação celular mutação natural
Isolados
Potencialidade de produção
- Mutantes naturais – muito tempo
- Métodos que forçam a mutação: radiações ultra-violeta, substâncias químicas (nitrosoguanidina)
Destrói-se a maioria das células e recuperam-se as mutadas
Verifica-se se a mutação ocorreu na direção desejada
Mutação – deleção ou adição de uma ou mais partes químicas
da molécula do DNA
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Penicillium chrysogenum NRRL 1951Modificada por mutações
Produção de penicilina aumentou de 120 UI para 2658 UI (~20x)
Mutação pode levar à perda da função de
características indesejadas ou aumento da
produção por perda das funções de controle
Raramente leva ao aparecimento de novas
funções ou propriedades
Utilizar em microrganismo com a
característica desejada para melhoramento
Fusão de protoplastos ProtoplastosFrágeis – sem parede celularSem capacidade reprodutiva
Sem parede celular, a probabilidade de fusão celular entre diferentes
espécies aumenta
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Protoplasto
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg
Protoplastos de células das folhas de petúnias
Protoplasto de fusão da célula da folha com a da pétala
Digestão da parede celular
Meio isotônico
Fusão de protoplastos
Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas
1. Protoplastos são preparados cultivando as células em meios
isotônicos enquanto tratam-nas com enzimas;
2. Os protoplastos são regenerados usando estabilizadores osmóticos
como a sacarose;
3. Se a fusão ocorre para formar híbridos, os recombinantes desejados
são identificados através de meios seletivos;
4. Após a regeneração da parede celular, o microrganismo pode ser
utilizado para futuros estudos.
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- Fusão pode ser realçada usando polietileno glicol e
tratamento das preparações com irradiação ultravioleta
- Fusão de células humanas ou de animais
-Usado para o melhoramento da produção de antibióticos por
combinar mutações de diferentes linhagens ou até mesmo
espécies
-Facilita a transferência de DNA recombinante
-Método de associar grupos inteiros de genes entre diferentes
linhagens de macro- e microrganismos
Fusão de protoplastos
Fusão de células de mamíferos que levam à produção deanticorpos monoclonais.
Anticorpos são a principal defesa dos mamíferos. Uma célula de linfócito B produz um único tipo de anticorpo
A produção de linfócitos B em meios de cultura não teve sucesso pois eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos
1975 – Georges Köhler e Cesar Milsteindemonstraram a produção de anticorpos monoclonais de um hibridoma (produto de fusão) de Linfócitos B (células produtoras de anticorpos) e
células tumorais de mieloma
1984 – Prêmio Nobel
1990’s – o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia US$ 6 bilhões!!!
Fusão de protoplastos
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Mudança:
Células secretoras de anticorpos
com tempo de vida limitado
Células com capacidade contínua de crescimento (imortais) que mantém o
potencial de secretar anticorpos
Fusão de protoplastos
Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde
Aplicações do anticorpo monoclonal:
-Diagnóstico in vitro em saúde humana, plantas e agricultura
animal
-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga
citotóxica para o sítio de células cancerígenas
-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta
afinidade para ligar e purificar produtos caros
Fusão de protoplastos
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Obtenção de microrganismos recombinantes por
técnicas de engenharia genética
Linhagens instáveis limitam o emprego de sistemas de
fermentação mais eficientes, como processos contínuos, pois
poderá acontecer, ao longo do tempo, a seleção de células que
privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do produto
•Linhagens naturais•Linhagens mutantes
Células recombinantes por introdução de plasmídeos podem ser instáveis
Obtenção de microrganismos recombinantes por
técnicas de engenharia genética
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3.3 - Conservação do Biocatalisador
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Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, ela deve ser conservada
Técnicas de conservação:
1) Transferência ou sub-cultura periódica em tubos ou placas
de Petri com meio de cultura sólido (viabilidade: semanas)
2) Congelamento em freezers -20 ˚C ou -70 ˚C (anos)
3) Ultracongelamento: -196˚C, N líquido (anos)
4) Liofilização: desidratação por sublimação da água,
sob vácuo (anos ou décadas)
Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, elas devem ser conservadas
Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007
... 100
... 100
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Criotubos
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Lento
Rápido
Desequilíbrio osmótico
Fromação de cristais
intracelulares lise
Congelamento
Bactérias
Células de mamíferos
Manual de Criopreservação Nunc
Congelamento rápido minimiza os efeitos de concentração do soluto pois o gelo forma
uniformemente
Congelamento lento, por outro lado, resulta em grandes perdas de água da célula e
menos gelo intraceclular, mas aumenta os efeitos da solução
Congelamento
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Agente de criopreservação
agente químico que protege as células durante o
congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do
aumento da concentração do soluto e formação de cristal
Congelamento
Mais comuns:Dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol (menos tóxico que DMSO).
Escolha – depende da célula!!
Agentes de criopreservação podem penetrar na célula e causar um congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de solução. DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor desitradação da célula antes do congelamento intracelular.
DMSO penetra melhor nas células e geralmente mais usado para células maiores, mais complexas como os protistas.
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4 - Produção de etanol
Upstream
Biorreação/Biorreator
Downstream
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Exemplo prático: Produção de etanol
Upstream
Downstream
Obtenção da matéria prima;
Tratamento/preparo
Escolha do microrganismo
Preparo do pré-inóculo e inóculo
Resíduos dos grãos
Biotecnologia do bioprocesso
Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004
BiorreaçãoBiorreatores
Pré-inóculo
Inóculo
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Biotecnologia do bioprocesso
Próximas aulas!!
- Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas deengenharia genética
- Biorreatores
- Biorreação
-Processo Downstream
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Referências para a próxima aula
• Competent Cells guide
• Gerhard Hannig and Savvas C. Makrides. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. TIBTECH FEBRUARY 1998 (VOL 16)
• Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. 2008. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of existing biotecnology strategies.Mol Cell Biochem. 307:249-264.
Referências desta aula
Manual de criopreservação Nunc – ver site da disciplina
Capítulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology)
– ver site da disciplina
Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw-Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And Biotechnology) – ver site da disciplina
Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia
Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher
LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 2.