PROTEÔMICA NOVAS FRONTEIRAS NA PESQUISA CLÍNICA

8/8/2019 PROTEMICA NOVAS FRONTEIRAS NA PESQUISA CLNICA

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PROTEMICA: NOVAS FRONTEIRAS NA PESQUISA CLNICA

Alvaro Carlos Galdos-Riveros1, Ana Rita de Toledo Piza2, Lorenna CardosoResende3, Durvanei Augusto Maria4, Maria Anglica Miglino5

1Ps-graduando em Cincias pela Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia daUniversidade de So Paulo, So Paulo,Brasil ([email protected])2Ps-graduanda em Biotecnologia pelo Instituto Butantan, So Paulo, Brasil

3Ps-graduanda em Cincias pela Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia daUniversidade de So Paulo, So Paulo,Brasil.

4Professor Pesquisador Cientifico Nvel V do Laboratrio de Bioqumica e Biofsicado Instituto Butantan, So Paulo, Brasil.

5Professora Doutora da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia daUniversidade de So Paulo, So Paulo, Brasil.

RESUMO

As abordagens que utilizam a protemica como ferramenta no auxilio ao estudo dasprotenas expressas em um tipo de tecido ou clula, complementam o genoma eesto cada vez mais sendo usadas para tratar questes biomdicas. As protenasso o principal alvo de estudo, e com o cdigo gentico nem sempre possvelindicar quais protenas so expressas, que quantidade e forma. As Modificaesps-translacionais das protenas, tais como fosforilao ou glicosilao, soobjetivos muito importantes na determinao da funo da protena. Da mesmaforma, os efeitos de fatores ambientais ou processos multignicos comoenvelhecimento ou doena, no pode ser avaliado simplesmente pelo genoma. Estareviso descreve a tecnologia e as reas da investigao biomdica, que vo desdea patognese e o uso potencial de drogas e vacinas, como o estudo debiomarcadores de diversas doenas, utilizando a anlise protemica como principalferramenta.PALAVRAS-CHAVE : Protenas, eletroforese bidimensional, espectrometria demassas, pesquisa clinica.

PROTEOMICS: NEW FRONTEIRS IN CLINICAL RESEARCHABSTRACT

The approaches that use proteomics as a tool to aid in the study of proteinsexpressed in a tissue or cell type, complement the genome and are increasinglybeing used to address biomedical questions. Proteins are the main target of study,

and the genetic code is not always indicate which proteins are expressed, thatamount and shape. The post-translational modifications of proteins such asphosphorylation or glycosylation, are very important goals in the determination ofprotein function. Similarly, the effects of environmental factors or multigenicprocesses such as aging or illness, cannot be measured simply by the genome. Thisreview describes the technology and biomedical research areas, ranging from thepathogenesis and potential use of drugs and vaccines, as the study of diseasebiomarkers using proteomic analysis as a main tool.KEYWORDS: proteins, two-dimensional electrophoresis, mass espectrometry,proteome, clinics research.

INTRODUO

A protemica o estudo em larga escala das protenas, usualmente pormtodos bioqumicos. A palavra protemica tem sido associada tradicionalmente exibio de um grande nmero de protenas de uma linhagem celular ou organismo

ENCICLOPDIA BIOSFERA, Centro Cientfico Conhecer - Goinia, vol.6, N.11; 2010 Pg. 1
mailto:[email protected]:[email protected]


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em gis bidimensionais (ANDERSON & ANDERSON, 1996; CELIS et at., 1996;WILKINS et al., 1996; WILKINS et al., 1997; GALDOS, 2009). Nesse sentido aprotemica j existe desde o final da dcada de 1970 quando pesquisadoresiniciaram a formao de bancos de dados de protenas utilizando a ento

recentemente desenvolvida tcnica de eletroforese de gel bidimensional (OFARREL. 1975). Isso resultou na catalogao extensiva de manchas nos gisbidimensionais para se criar bancos de dados das protenas expressas.

A protemica esta relacionada com o conjunto de tecnologias, que tem porobjetivos separar e identificar protenas em amostras biolgicas complexas (ISFORet al., 2002).

As protenas controlam a maioria dos processos celulares, os quais ocorremem grande diversidade, podendo agir como enzimas, anticorpos, hormnios,componentes estruturais e receptores celulares (AEBERSOLD & MANN, 2003; DESOUZA et al., 2003).

Tais fatos impulsionaram o desenvolvimento de novas tecnologias para o

estudo deste conjunto de protenas expressas. Estas ferramentas passaram ento, aser denominadas instrumentos da Protemica (AEBERSOLD et al., 2000).

A protemica pode ser dividida em trs reas principais: (1) Micro-caracterizao protica para a identificao em larga escala de protenas e suasmodificaes ps-traducionais; (2) manifesta diferena para a comparao dosnveis de protena com aplicao potencial em uma ampla faixa de doenas; e (3)estudos das interaes protena-protena usando tcnicas tais como aEspectrometria de Massas (PANDEY; MANN, 2000).

A separao de protenas por tcnicas bidimensionais como ponto isoeltricoseguido de eletroforese em gel de poliacrilamida (mapeamento protico) ummtodo que tem apresentado caractersticas destacveis, tais como o alto poder deresoluo e boa reprodutibilidade quando so usados para separar soluescomplexas de protena, assim como extratos de plantas ou soro humano (KLOSE,1975).

A eletroforese bidimensional (2D) hoje a principal tcnica de separao deprotenas utilizada antes da aplicao da amostra no espectrmetro de massas. Suavantagem em relao a outras tecnologias a capacidade de separar com altaresoluo um grande nmero de protenas de uma amostra complexa e apossibilidade de se fazer anlise de expresso gnica por meio de comparao dospadres proticos (QUALTIERI et al., 2007; SIZOVA et al., 2007).

A preparao apropriada das amostras essencial para obter bons

resultados na protemica. O melhor mtodo de extrao, precipitao esolubilizao das protenas variam de uma amostra para outra e dever serestabelecido para cada caso em particular (RABILLOUD, 1996; CORTHALS et al.,2000; STULTS & ARNOTT, 2005; GORG et al., 2010; USAMI et al., 2007; GALDOS,2009).

A anlise das imagens do gel utilizando softwares especializados permitecomparaes de mltiplos gis e, atravs da interligao com bases de dadosdetalhadas do proteoma na internet. Assim, por um processo de subtrao, asdiferenas (por exemplo, presena, ausncia, ou intensidade das protenas) entreamostras sadias e doentes podem ser reveladas.

As protenas de interesse podem ento ser identificadas na base do

conhecimento do ponto isoeltrico e do peso molecular aparente, determinados apartir dos gis bidimensionais (JAMES, 1997). Geralmente aplicam-se cada vezmais mtodos como a espectrometria de massas que altamente sensvel e que



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requerem quantidades menores de material e tm uma eficincia mais elevada doque os mtodos convencionais de seqenciamento (sensibilidade do femtomole sconcentraes do attomole). As protenas ou peptdeos sofrem ionizao porelectrospray de estados lquidos (FENN, 1989), ou pela ionizao com matriz de

desoro de laser (KARAS & HILLENKAMP, 1988) e a massa dos ons so medidosmuito exatamente por vrios analisadores acoplados (JAMES, 1997). Por exemplo, oanalisador do tempo-de vo mede o tempo de vo em que os ons atravessam dafonte ao detector (MALDI-TOF). Se o spot excisado da protena for digeridoprimeiramente com tripsina, as protenas clivadas numa seqncia especfica deaminocidos podero ser quebradas em uma mistura dos peptdeos. As massas dospeptdeos podem ento ser medidas por espectrometria de massas para produzirum fingerprintda massa do peptdeo.

O objetivo desta reviso conhecer e compreender a protemica, seusconceitos e principais ferramentas utilizadas no estudo das protenas. Alem disso aaplicao da protemica na pesquisa clinica no desenvolvimento de biomarcadores,

vacinas e drogas capazes de combater as principais doenas que atingem estesculo.

REVISO DA LITERATURA

CINCIA DIRIGIDA PARA A DESCOBERTAOs projetos cientficos eram iniciados para testar uma hiptese, ou um modelo

que era proposto a partir de dados experimentais prvios. Baseadas nesta hipteseeram feitas previses e experimentos no intuito de produzir evidncias quesuportassem ou refutassem a hiptese. Apesar desta forma de cincia ser muitoimportante, ela pode inibir a descoberta de variaes, excees e mecanismos.Assim, recentemente, impulsionada principalmente pelo projeto Genoma, surgiu umanova modalidade de cincia baseada na coleta no seletiva de dados sobre umadeterminada funo ou sistema biolgico. Os resultados dos experimentos soanalisados na expectativa de que caractersticas significativas venham a emergir dosdados, gerando novas descobertas sobre o sistema. Esta forma de trabalho conhecida como discovery driven science (cincia dirigida/ impelida/ impulsionada/propelida/ acionada pela descoberta) em contraposio a cincia dirigida pelahiptese (hypothesis driven science), a forma clssica de fazer cincia. A cincia

dirigida pela descoberta baseia-se na analise de alto desempenho de um grandevolume de dados, e, portanto se tornou mais expressiva a partir do surgimento dabioinformtica e equipamentos de alta eficincia, como seqenciadores automticose espectrmetros de massas. O seqenciamento do Genoma de um organismo, porexemplo, no tem nenhuma hiptese previa embutida em seu projeto, ou seja,espera-se a analise dos dados para gerar novas descobertas e funes a fim decriar novas hipteses sobre este sistema (AEBERSOLD et al., 2000).

PROTEINASO termo protena foi introduzido na linguagem no ano de 1938 pelo Qumico

sueco Jns Jacob Berzelius para descrever um tipo particular de macromolculas

composto por uma cadeia linear de aminocidos, e que eram abundantes emorganismos vivos (TWYMAN, 2004). Protenas so polmeros de aminocidosresultantes da traduo das informaes genticas contida no ADN das clulas. O



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termo protena vem do grego proteios e significa a mais importante. De fato asprotenas compem um conjunto de molculas indispensveis para todos os seresvivos do planeta. Devido a essa diversidade de funes, as protenas exercem umpapel fundamental em quase todos os fenmenos biolgicos, como produo de

energia, defesa imunolgica, contrao muscular, atividade neuroqumica ereproduo (DE SOUSA et al., 2003).As molculas de protenas so co-polmeros de condensao de at 20

aminocidos de ocorrncia natural distintos apenas pelas suas cadeias laterais.Existem bilhes de combinaes possveis e milhares de diferentes tipos deprotenas, sendo cada com uma funo especifica a desempenhar no organismo(ATKINS & JONES, 2001).

Segundo DE SOUSA et al. (2003) as protenas so as biomolculas maisabundantes e ocorrem em grande diversidade, podendo agir como enzimas,anticorpos, hormnios, componentes estruturais e receptores celulares.

Catalisam uma extraordinria quantidade de reaes qumicas, fornecem

rigidez estrutural clula, controlam o fluxo do material atravs da membrana,regulam as concentraes dos metabolitos, atuam como sensores e chaves,produzem movimentos e controlam a funo gentica (NELSON & COX, 2002). Soessenciais para todos os seres vivos, possuindo imensa gama de variaes deatividades que determinam o padro de transformao qumica na clula. Dentresuas funes principais esto: a catlise enzimtica, o transporte, o armazenamentode molculas e ons, sustentao mecnica, proteo imunitria, gerao etransmisso dos impulsos nervosos e no controle do crescimento da clula (BERGet al., 2004).

Do ponto de vista comercial, bilhes de dlares so gerados anualmentepor indstrias que trabalham com protenas (DE SOUSA et al., 2003).

PROTEMICA

A protemica surgiu no final de 1970 quando pesquisadores comearam acriar as bases de dados de protenas usando naquela poca a moderna tcnica deeletroforese bidimensional (OFARREL, 1975).

O termo proteoma foi proposto por Wilkins e Willians em 1994, como sendotodo o contedo de protenas expressas por um genoma ou, no caso de organismosmulticelulares, ao complemento protico expresso por um tecido ou clulasdiferenciadas (WILKINS et al., 1996). Aps a euforia provocada pelo

seqenciamento do genoma de vrios organismos, a comunidade cientificapercebeu que, para se compreender a funo gnica em toda sua plenitude, eranecessrio o estudo em larga escala das protenas expressas. Constatou-se que,embora importante, a anlise das seqncias de nucleotdeos nem sempre refleteuma relao direta com os nveis de protenas expressas e, conseqentemente, deatividade biolgica (GYGI et al., 1999).

Enquanto o genoma de um organismo permanece relativamente estvel aolongo da vida, o proteoma extremamente dinmico e varivel. A anliseprotemica permite saber se um gene esta sendo expresso, a concentrao relativadesse produto e, por fim, as modificaes que podem ocorrer nessas protenas apsa sua traduo (GALDOS, 2009).

A anlise protemica pode mostrar tambm como esses processosmetablicos, regulatrios e de sinalizao se tornam disfuncionais nos estados



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patolgicos e como podem ser manipulados, mediante, por exemplo, aadministrao de medicamentos ou a terapia gnica (GALDOS, 2009).

O objetivo inicial dos estudos protemicos foi a identificao em larga escalade todas as protenas presentes em uma clula ou tecido. Atualmente, consistem na

anlise simultnea de misturas complexas de protenas como as provenientes delisados celulares e extratos de tecidos com o intuito de detectar diferenasquantitativas e qualitativas na expresso protica (WESTERMEIER & NAVEN,2002).

Seus objetivos se diversificaram para a anlise de vrios aspectos funcionaisdas protenas, como modificaes ps-traducionais, interaes protena-protena,existncia de isoformas, atividades e estruturas. O campo de atuao desta cinciaestende-se descoberta de novas drogas, terapias, diagnsticos, microbiologia,bioqumica. A pesquisa protemica torna possvel a identificao e caracterizao demarcadores biolgicos, ou seja, molculas endgenas ou exgenas especficas deum determinado estado patolgico. A capacidade de identificar essas molculas

extremamente til no diagnostico precoce de doenas e no acompanhamento daevoluo do tratamento (CASH, 2002).

A expresso dos padres de protena em clulas e tecidos caracterstica doseu desenvolvimento, fisiologia ou estado patolgico. Assim, muito importantedeterminar os perfis de expresso destas protenas e as alteraes de um estgiono patolgico para um estgio especfico da doena (GALDOS, 2009).

As razes que justificam tal magnitude do protema so as variaes naclivagem do ARN e as modificaes ps-traducionais, que o torna vrias vezesmaior e complexo que o genoma correspondente. Modificaes na abundncia(quantidade) das protenas com o tempo, com o desenvolvimento do organismo e asalteraes do meio ambiente, tornam este desenvolvimento dinmico (WILKINS etal., 1996).

No contexto da protemica comparativa, onde o objetivo identificardiferenas quantitativas e qualitativas entre amostras de protenas, a tcnica deeletroforese bidimensional (2-DE) geralmente o mtodo escolhido, gerando dadosem formato que possibilita uma boa avaliao visual e fornece comparaesquantitativas (RABILLOUD, 2000; 2002).

A anlise de proteomas comea geralmente com os gis bidimensionais (2-DE), que apresentam como resultado uma exposio de spots de protenas, estesgis bidimensionais sero utilizados para criar bases de dados de todas as protenasexpressas. Determinar a identidade das protenas foi difcil por um atraso da

sensibilidade e rapidez dos mtodos analticos para caracterizao de protenas (taiscomo reao da cadeia polimerase e anlise automatizada da seqncia do ADN).Em 1990 a espectrometria de massas emergiu como um poderoso mtodo analticoque removeu a maioria das limitaes da anlise de protenas (DI CIERO&BELLATO, 2003).

Este desenvolvimento, associado com a disponibilidade e o completoseqenciamento do cdigo gentico humano em bases de dados pblicas, marcou ocomeo de uma nova era. Hoje, o termo protemica cobre mais do que uma anlisefuncional dos produtos dos genes ou genmica funcional, inclui estudos em largaescala da identificao ou localizao de protenas. O estudo mais profundo daestrutura de protenas, contudo, usualmente no includo e em vez disso

designado genmica estrutural (BURLEY, 1999).A razo disso que o controle da expresso gnica ocorre desde atranscrio do mRNA at as modificaes ps-traducionais como glicosilao,



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fosforilao, acilao, hidroxilao, carboxilao, ubiquitinao, entre outras, asquais alteram a atividade protica (Figura 1). Pelos motivos expostos, a anliseprotemica hoje um dos meios mais eficientes para o estudo funcional dos genes egenomas de organismos complexos (ROCHA et al., 2005).

FIGURA 1 Maneiras em que a expresso do gene e da protena pode ser reguladaou modificada na transcrio ou na ps-traduo.FONTE: BANKS et al., 2000.

O proteoma indica as protenas expressas em um genoma ou tecido,enquanto o genoma representa a soma de todos os genes de um individuo, oproteoma no uma caracterstica fixa de um organismo. O proteoma altera com oestado de desenvolvimento, do tecido ou mesmo sob as condies nas quais oindividuo se encontra (GALDOS, 2009). Portanto, h muito mais protenas noproteoma do que genes no genoma, especialmente para eucariotos (ROCHA et al.,2005).

Isto porque h vrias maneiras do gene expresso, o RNA total, sofrerreduo (splicing) para construir o RNA maduro. Este ento ir servir de moldepara a traduo de uma protena a qual sofre modificao ps-traduo (DI CIERO& BELLATO, 2003).

Recentemente, um progresso importante pode ser visto no campo daprotemica, com o desenvolvimento de mtodos alternativos para separao eidentificao de protenas, como tecnologias baseadas em chips, nos chamadasarrays de protenas (RAMACHANDRAN et al., 1987), a anlise direta decomplexos proticos por espectrometria de massas (LINK et al., 1999; WASHBURNet al.,2003), o uso de tagsde afinidade (GYGI et al.,1999), sistemas como duplo

hbrido em levedura (UETZ et al.,2000).Entre todas as tcnicas de proteoma de uso atual, a mais utilizada aeletroforese bidimensional (2D-PAGE), acoplada a espectrometria de massas do tipoMALDI-TOF.

No contexto da protemica comparativa, onde o objetivo identificardiferenas quantitativas e qualitativas entre amostras de protenas, a tcnica de 2DPAGE mtodo de escolha, e gera dados em um formato que possibilita uma boaavaliao visual (para amostras pouco complexas) e fornece comparaesquantitativas (RABILLOUD, 2002).

TRATAMENTO DA AMOSTRA

A preparao da amostra a parte mais critica de qualquer experimento, estepasso pode envolver homogeneizao e lise celular (GALDOS, 2009).



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Quando os tecidos ou clulas so lisadas, proteases so liberadas ouativadas iniciando a degradao de protenas atravs da ao de proteasesprejudica os resultados dos analises dos gis bidimensionais, ento medidas temque ser tomadas para evitar este problema (GALDOS, 2009; GORG et al., 2010).

A preparao da amostra continua, sendo o passo mais importante nosexperimentos em protemica, e o desafio est na capacidade de separao,recuperao do material e rendimento especfico. Muitos dos passos da preparaoda amostra mencionados aqui so familiares para os cientistas que estudamprotenas, contudo, muitos desses mtodos no foram desenvolvidos para fornecero grau de pureza ou a recuperao eficiente do material que so necessrios paraestudos protemicos. Desta forma, melhoramentos ou alternativas so necessrias,um tratamento prvio das amostras para 2D-PAGE envolve a solubilizao,desnaturao e a reduo para quebrar completamente s interaes entre asprotenas (RABILLOUD, 1996; GALDOS, 2009).

Muitas das informaes em protemica vem diretamente dos organismos,

seja humano ou no. Em outros casos, os tecidos provem de vrios lugares paracomear a obter populaes homogneas de clula. Ainda tecidos congelados,embora seja mais fcil de obter, elimina a possibilidade de cultura celular ou tcnicasque dependam de clulas vivas. Os tecidos fixados em formalina e embebidos emparafina no so de uso em experimentos protemicos. Protocolos de dissociaode tecidos foram bem estabelecidos, embora alguns estudos tais como a anlise deprotenas da clula precisa de uma dissociao sem proteases (STULTS &ARNOTT, 2005). Para separao de protenas ainda pode ser necessrio forneceruma adequada resoluo e escala dinmica (CORTHALS et al., 2000).

O processo de solubilizao tem como objetivo quebrar as interaesmacromoleculares (incluindo todas as interaes no covalentes e as pontes dedissulfeto). Para o rompimento de interaes no covalentes sero utilizadosagentes caotrpicos, como a uria, que reagente desnaturante que altera osolvente e exerce profundos efeitos sobre todos os tipos de interaes nocovalentes, pois rompe os elementos de estruturas secundrias de modo que osgrupos ionizveis fiquem completamente expostos a soluo. Por esse motivoquando usado em altas concentraes (comumente 8 mol l -1) esse reagente facilita asolubilizao das protenas (RABILLOUD et al., 1997; RABILLOUD, 1998). Funosemelhante uria tambm exercida pela tiouria que um agente caotrpicomais eficiente do que a uria, mas pouco solvel em gua. A mistura de uria-tiouria tem sido muito utilizada, pois mais eficiente do que a uria sozinha

(RABILLOUD et al., 1997).O Ditiotreitol (DTT), que tambm um agente desnaturante e, tem comofuno principal clivar as pontes de dissulfeto formadas entre resduos de cistenas.Por ser mais eficiente e apresentar melhores resultados embora hajam protenascom muita cistena que no so totalmente reduzidas com DTT e para romper asinteraes hidrofbicas sero usados detergentes no-inicos ou zwitterinicos (comcarga liquida neutra), como Triton X-100 e, mais recentemente, CHAPS [(3-Cholamidopropyl) dimethylammido]-1-propanesulfonate so comumenteempregados, pois alem de auxiliar a solubilizao das protenas previnem aagregao atravs de interaes hidrofbicas (DAMERVAL et al., 1986; ROCHA etal., 2005).

Existem evidncias considerveis de que o papel funcional de umadeterminada protena pode ser fortemente dependente do tipo de clula na qual ela expressa e do estado dessa clula (GODOVAC-ZIMMERMANN & BROWN, 2001).



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As protenas controlam a maioria dos processos celulares, os quais ocorrem emgrande diversidade, podendo agir como enzimas, anticorpos, fatores de crescimento,hormnios, componentes estruturais e receptores celulares (DE SOUSA et al. 2003;AEBERSOLD & MANN, 2003).

Nesse sentido, a identificao das diferenas na expresso protica umarea de estudo relevante na pesquisa protemica. Nos ltimos anos, grandesesforos tm sido realizados no desenvolvimento de novas metodologias para oestudo e entendimento da estrutura e funo de protenas em diferentes amostrasbiolgicas.

Em linhas gerais, o estudo da protemica pode ser realizado por meio detcnicas como a eletroforese bidimensional (2DE) seguida da espectrometria demassas (MS), ou ainda, mais recentemente, a associao de mtodos de ionizaoe cromatografia, entre outros, que aumentam ainda mais a sensibilidade dedeteco (KATZ-JAFFE et al., 2009). No entanto, o ponto de partida ainda tem sidoa exposio de um grande nmero de protenas de uma linhagem celular ou

organismo em gis de poliacrilamida bidimensional (WILKINS et al., 1996;ANDERSON & ANDERSON; 1996; WILKINS et al., 1997).

O monitoramento do nvel das protenas permite apreciar o efeito daregulao da expresso gnica que ocorre ps-transcrio e ps-traduo e fornecenumerosas pistas quanto sua funo biolgica e envolvimento nos processosbiolgicos examinados (HOOGLAND et al., 2000). Ao contrrio do que ocorre com ogenoma relativamente esttico e idntico nas clulas somticas de um organismo, aexpresso protica (proteoma) encontra-se em estado dinmico, respondendo aestmulos externos e internos. Por tanto, o proteoma permite maior aproximao dosprocessos metablicos intracelulares (FEY & LARSEN, 2001).

FERRAMENTAS PROTEMICAS

ELETROFORESE

O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever amigrao em colides sob a influncia de um campo eltrico (ALFENAS, 1998).

Em 1937 Tiselius mostrou a separao de protenas, albumina e , e -globulinas do soro que foram estudados de um ponto de vista de homogeneidadequmica e tambm separados dentro de seus principais constituintes, poreletroforese (TISELIUS, 1937).

Alfenas (1998) descreve ainda que a eletroforese visa separao demolculas em funo de suas cargas eltricas, de seus pesos moleculares e desuas conformaes, em suportes porosos e tampes apropriados sob a influncia deum campo eltrico contnuo. Molculas com preponderncia de cargas negativasmigram, no campo eltrico, para o plo positivo (nodo), e molculas com excessode cargas positivas migram para o plo negativo (ctodo). A carga preponderante deuma molcula protica funo dos seus aminocidos.

Segundo Shaw (1969) a eletroforese implica a moo de dissolver oususpender material baixo influncia de um campo eltrico aplicado. um de quatrode todos os fenmenos eletro-cinticos, da qual implica movimento entre as partesrgidas e mveis de uma dupla camada eltrica.

A escolha do meio de suporte depende de preferncias individuais e dosobjetivos, mas de modo geral, para protenas, os gis de poliacrilamida tm sidopreferido por apresentar um maior poder de resoluo graas a ampla variao



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controlvel no dimetro de seus poros. Alm disso, gis de poliacrilamida so muitotranslcidos, o que possibilita quantificar a atividade enzimtica por densitometria(ALFENAS, 1998).

Os mtodos eletroforticos baseiam-se no princpio de que uma molcula

com carga eltrica movimenta-se em um campo eltrico. A velocidade de migraode uma protena depende da intensidade do campo, da carga liquida da protena edo coeficiente de atrito. As separaes eletroforticas so quase sempre feitas emgel, onde os de poliacrilamida so os escolhidos por ser quimicamente inertes eporque o tamanho dos seus poros pode ser controlado (STRYER, 2004).

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

A eletroforese em gel de poliacrilamida tem sido extremamente proveitosacomo uma ferramenta analtica para a separao e quantificao de espcies deprotenas de complexas misturas.

Os fundamentos desta abordagem foram apresentados pela primeira vezem 1975 (KLOSE, 1975; OFARRELL, 1975). Em gis bidimensionais, ospolipeptdios aparecem formando manchas (spots) aps serem corados. Diferentesmanchas podem conter isoformas da mesma protena com coordenadas especficasde ponto isoeltrico (pI) e peso molecular (PM).

Em 1988, Angelika Grg introduziu o uso de gradientes imobilizados de pH(IPG) (BJELLQVIST et al., 1982; GRG et al., 1988), nos quais tampes so co-polimerizados com acrilamida e bisacrilamida, acarretando uma melhorreprodutibilidade dos perfis bidimensionais. A eletroforese bidimensional (2D-PAGE) uma tcnica que pode ser usada para a obteno de perfis bidimensionaiscompletos de uma amostra como tambm para estudos comparativos entreamostras. O aparecimento ou desaparecimento de manchas ou spots pode fornecerinformaes acerca de protenas especficas de um estagio determinado, enquantoa intensidade das manchas fornece informaes quantitativas a respeito daexpresso diferencial dos polipeptdios (GRAVES & HAYSTEAD, 2002).

Em comparao com a eletroforese unidimensional em gis desnaturantesde poliacrilamida, conhecida como SDS-PAGE (Eletroforese em gel depoliacrilamida com dodecil-sulfato de sdio), a eletroforese 2D-PAGE apresenta umamaior capacidade para separar misturas complexas enquanto que na SDS-PAGE asbandas proticas tendem a se sobrepor, os mtodos unidimensionais de separao,podem separar um nmero relativamente pequeno de protenas (geralmente menos

de 50) (GALDOS, 2009).A eletroforese bidimensional, ao combinar dois processos distintos deseparao, pode ser usada para separar mais de 1000 protenas num nico gel(ANDERSON & ANDERSON, 1996).

De acordo com Chromy et al. (2004) e Qualtieri et al. (2007) em eletroforese2D-PAGE, as protenas so separadas com base em duas das suas propriedades:numa primeira dimenso, de acordo com o seu ponto isoeltrico (pI) e numasegunda dimenso, em gel de SDS PAGE de acordo com o seu peso molecular(MW). Ou seja, a eletroforese 2D resulta da combinao de duas tcnicas: afocagem isoeltrica (IEF), seguida por uma separao de SDS PAGE (Figura 2).Quando bem sucedida obtm-se um gel de poliacrilamida contendo numerosos

spots, bem separados, cada um correspondendo a uma protena (ou a uma formaprotica) (SANTOS et al., 2004).



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Figura 2 Eletroforese Bidimensional 2D-PAGE utilizado na anlise deproteomasFONTE: GALDOS, 2009

Primeira dimenso: Focalizao Isoeltrica

A Focalizao Isoeltrica envolve a separao de solutos anfotricos em umgradiente de pH. Sob a influncia do campo eltrico um soluto experimenta regiesde pH progressivamente menor. Assim, uma frao cada vez maior torna-seprotonado, e desta forma, a carga efetiva alterada durante a migrao.Eventualmente, a carga total do soluto torna-se zero, e sua migrao interrompida,cada componente da amostra migra para uma regio onde a carga liquida igual azero, que chamado de ponto isoeltrico, e permanecer nesta posio enquanto ocampo eltrico for operante (TAVARES, 1996).

Segunda dimenso: Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)A eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecilsulfato de

sdio (SDS) um mtodo muito utilizado para a anlise de massas moleculares deprotenas oligomricas. O gel uma matriz constituda de um polmero de acrilamidacom ligaes cruzadas de N,N metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malhapode ser escolhida. Quanto maior a concentrao de acrilamida menores sero osporos da malha formada. A soluo de acrilamida estvel por at um ms. Quandoestocada por perodos prolongados, transforma-se em cido acrlico, que podecausar distores no gel. importante frisar que a acrilamida fotossensvel eneurotxica, devendo, portanto, ser estocada em frasco escuro e manuseada com omaior cuidado possvel (ROCHA et al., 2005; DI CIERO & BELLATO, 2003).

Antes de iniciar a eletroforese, as variveis como so a forma e carga nativadas protenas devem ser eliminadas para que a separao dependa apenas de sua

massa molecular. Para isso, as protenas so homogenizadas com Dodecil sulfatode sdio (SDS), um detergente anfiptico cuja funo desnaturalizao, ou seja,convert-las numa estrutura linear a forma nativa geralmente globular e



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conferir-lhes densidade de carga uniforme (DI CIERO & BELLATO, 2003). O SDStem alta carga negativa e uma carga hidrofbica que interage com as cadeiaspolipeptdicas numa proporo aproximada de 1,4g de SDS para cada grama deprotena, tornado-as negativamente carregadas. Na ausncia do SDS, as protenas

com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido aodiferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais. Alm da adio do SDS, asprotenas podem ser opcionalmente fervidas na presena de um agente redutor,como ditiotreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol, que desfazem as pontes de dissulfetos,ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptdeos (ROCHA et al.,2005).

Aps esse tratamento as protenas so aplicadas no topo de um gel depoliacrilamida e submetidas a uma corrente eltrica, fazendo com que elas migrematravs da malha de acrilamida em direo ao plo positivo. Dependendo do seutamanho, cada protena se mover diferentemente: as protenas menores migraromais rapidamente, enquanto que as maiores tero mais dificuldade em atravessar a

malha do gel e, assim, se movero mais lentamente. Quando se representa amobilidade eletrofortica frente ao logartmo dos pesos moleculares conhecidos dediversas cadeias polipeptdicas (protenas marcadoras), obtm-se uma reta quepode ser utilizada como padro para o clculo do peso molecular das subunidadesda protena de interesse (ROCHA et al., 2005).

CARATERIZAO E IDENTIFICAO DE PROTEINASESPECTROMETRIA DE MASSAS

Desde seu surgimento, no inicio do sculo XX, a espectrometria de massas(MS) tem sido largamente empregada para a anlise de compostos orgnicos debaixa massa molecular. No entanto, nas ltimas dcadas tornou-se valiosa, devidoaos grandes avanos que foram obtidos na identificao das protenas (HAGER,2004).

A espectrometria de massas (MS) uma tcnica que mede a relao entre amassa e a carga (m/z) de molculas ionizadas em fase gasosa (GROSS, 2004). Deuma maneira geral, um espectrmetro de massas constitudo por uma fonte deionizao, um analisador de massas um detector e um sistema de aquisio dedados. Na fonte de ionizao de molculas so ionizadas e transferidas para a fasegasosa. No analisador de massas os ons formados so separados de acordo comsuas relaes m/z e posteriormente detectados (usualmente por eltronmultiplicador) (FENN et al., 1989; GROSS, 2004).

Ate a dcada de 80, a necessidade de ionizar as molculas para obter umespectro de massas era um grande obstculo enfrentando no caso de molculasbiolgicas de alta massa molecular. Nos mtodos de ionizao disponveis napoca, as molculas a serem ionizadas deveriam estar fase gasosa, sob alto vcuoe as altas temperaturas, condies incompatveis com biomolculas Esse problemafoi resolvido com o surgimento de duas tcnicas brandas para ionizar molculasbiolgicas grandes, so: a espectrometria de massas com base na dessoro eionizao das protenas de laser, auxiliado por uma matriz (MALDI Matrix-AssistedLaser Disorption Ionization), que analisa a massa atravs do tempo de vo dos onsno tubo de analise (ToF - Time of Flying); e a espectrometria de massas baseada naionizao por pulsos eltricos em mdio liquido (ESI ElectroSpray Ionization);

(FENN et al., 1989; ROCHA et al., 2005).A espectrometria de massas uma metodologia que permite a determinaoda massa molecular de compostos com altssima preciso. Apenas no incio da



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dcada de 80, a espectrometria de massas comeou a ser mais aplicada emdeterminaes de massas moleculares de protenas (PANDEY & MANN, 2000).Com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais especializados paraprotenas, a espectrometria de massas tornou-se ferramenta revolucionria na

qumica de protenas moderna. A espectrometria de massas vem permitindo aidentificao de protenas por uma metodologia denominada peptide massfingerprinting. Rocha et al. (2003) descreveram que esta metodologia baseada nadigesto da protena a ser identificada por uma enzima proteoltica (por exemplo, atripsina) produzindo fragmentos denominados peptdeos. As massas dessespeptdeos so ento determinadas com grande acuidade (0,1 a 0,5 Da) porespectrometria de massas. As massas obtidas formam uma espcie de impressodigital (fingerprinting.) da protena. Softwares especiais permitem comparar o peptide mass fingerprintingda protena que queremos identificar com os geradosteoricamente para todas as seqncias de protenas presentes nos bancos dedados. Se a seqncia da protena problema estiver no banco de dados ela ser

imediatamente identificada (DE SOUSA et al., 2003).

Tcnicas de IonizaoIonizao por Electrospray (ESI)

Em ESI todo o processo de ionizao ocorre presso e temperaturaatmosfrica. Uma soluo levemente acida (ou bsica) contendo a amostra bombeada a uma vazo de alguns microlitros por minuto atravs de um tubo capilarmetlico submetido a uma alta diferena de potencial (3-5 kV) em relao aoeltrodo cilndrico que circunda a sada do capilar (ARDREY, 2003). Assim, forma-seum spray com gotculas carregadas que passam a travs de um gs secante,ocorrendo evaporao do solvente as gotculas carregadas tornam-se cada vezmenores de modo que a densidade de carga torna-se to alta que as molculascarregadas aprisionadas nas gotculas so ejetadas para a fase gasosa seguindopara o analisador de ons (ARDREY, 2003; DE SOUSA et al., 2003).

Ionizao/desoro a laser assistida por matriz (MALDI)Na ionizao do tipo MALDI, a soluo contendo a amostra misturada a

uma soluo supersaturada de matriz orgnica, a qual absorve fortemente radiaoeletromagntica em um determinado comprimento de onda. A soluo resultantedessa mistura ento aplicada a uma placa metlica de MALDI (volumes da ordemem poucos microlitros). Aps alguns minutos o solvente ter evaporado e ocorrera a

cristalizao da amostra juntamente com o excesso de matriz. A placa entotransferida para dentro do espectrmetro e o cristal formado bombardeado por umfeixe de laser de alta potencia com comprimento de onda correspondente aomximo de absoro de matriz. Essa energia adsorvida em grande parte pelamatriz, a qual esta em excesso, e transferida de maneira branda para a amostra, demodo que ocorre a sublimao e da matriz, resultando em ons em fase gasosa queseguiro para o analisador de massas (ZENOBI & KNOCHENMUSS; 1998).

Analisadores de massastomos e molculas neutras devem ser ionizados para que possam ser

analisados por espectrometria de massas. Os analisadores dependem em geral da

acelerao dos ons, por isso os separam de acordo com a relao massa-carga(m/z), e no apenas em funo das suas massas (DE HOFFMANN et al., 1996;WATSON, 1997). As trs principais caractersticas de um analisador so: o limite de



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carregadas so direcionadas eletrostaticamente dafonte de ionizao para o analisador de massas.Analisadores time-of-flight (TOF) separam ons deacordo com sua relao massa/carga (m/z).

FONTE: (KARAS; HILLENKAMP, 1988).

BIOINFORMTICA APLICADA AO ESTUDO DAS PROTENASOs experimentos desenvolvidos no laboratrio necessitam ser

complementadas pelas anlises virtuais feitas com o auxilio de um computador(HOCHSTRASSER, 1998). Alm de softwares para analisar a separaoeletroforetica, ferramentas bioinformticas foram desenvolvidas. Algumas destasest disponvel atravs da Internet ao usurio: ExPASy(www.expasy.ch/www/tools.html) (HOCHSTRASSER et al., 1995).

Estas bases de dados incluem mapas de protena do plasma humano, daurina, do lquido crebro-espinhal, e dos tecidos da mama, do corao, e da bexiga

e dos carcinomas, assim como de vrios microorganismos. Finalmente, dado anatureza dinmica do proteoma, os detalhes experimentais e os resultadosrelacionados devem ser indicados como importantes chaves bioqumicas ouimplicaes de relevncia nas doenas (BAIROCH & APWEILER, 1998).

Estes softwares permitem no somente a identificao das protenas, mastambm de uma caracterizao adicional que varia do clculo das propriedadesfsico-qumicas bsicas at a predio de potenciais modificaes ps-traducionais ede estruturas tridimensionais 3D. A protena encontrada e as bases de dados dosgis bidimensionais so o ncleo da bioinformtica na pesquisa de proteomas.SWISS-PROT um exemplo tpico de uma base de dados (BAIROCH &APWEILER, 1998).

APLICAES BIOMEDICASA perspectiva oferecida pela protemica tem-se utilizado na pesquisa de

diferentes reas da medicina, includo a biomedicina. Estas pesquisas poderiam seclassificar de distintas formas: em funo do tipo de amostra empregada, da doenaou do tipo de doenas que abordam, da tcnica ou das tcnicas utilizadas, do uso ouda aplicao, etc.

As pesquisa clinicas com protemica se baseiam em torno ao tipo de amostrautilizada. Nesta base de pesquisas destaca-se as pesquisas com linhagenscelulares, com tecidos e protemica de fluidos.

As linhagens celulares so variantes derivadas das clulas cancerosas ou declulas normais fixadas pela inibio dos mecanismos celulares que causam ainterrupo do crescimento. Diferente da maioria de clulas isoladas diretamentedos organismos, estas clulas so capazes de dividirem-se indefinidamente quandose mantm em cultura no laboratrio (HERNNDEZ et al., 2010).

Na pesquisa com linhagens celulares, a protemica tem caracterizado osperfis de expresso de protenas em diferentes tipos destas linhagens como basepara futuros experimentos comparativos (ISSAQ et al., 2003; CHAURAND et al.,2004). Estudos tm demonstrado que o numero de protenas identificadas em cadaproteoma varia de forma importante, o que provavelmente seja o reflexo daexistncia de diferenas no nvel de expresso das distintas protenas em cada

linhagem celular (MOORE; MINOWADA, 1992).As linhagens celulares tumorais humanas podem constituir um modeloimportante para o estudo do cncer. Deste modo, as pesquisas que comparam os



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proteomas das diversas linhagens tumorais humanas (ou clulas obtidasdiretamente de um tumor) com suas correspondentes linhagens celulares normaiscomeam a ser habituais para identificar marcadores da doena ou biomarcadoresque permitam a deteco precoz, classificao e escolha do prognstico dos

tumores assim como para propor novas formas teraputicas de tratamento. Sendoassim, a protemica pode realizar pesquisas para avaliar o potencial maligno de umtumor (potencial metasttico segundo seja a expresso de uma protena especifica),a quimiosensibilidade ou quimiorressistencia deste (LE NAUR, 2001). O uso daprotemica para o desenho, indicao e predio da resposta de um frmaco ou afrmacos seria tambm extrapolavel a outras doenas, o que se conhece comofarmacoprotemica (JAIN, 2004; LAGE, 2004).

Alem das pesquisas em linhagens celulares humanas, a protemica tem-seaplicado atualmente na anlise de tecidos e fluidos para o estudo de situaesfisiolgicas (durante o desenvolvimento, em diferentes estgios metablicos, frente adiversas respostas ambientais) ou patolgicas (cncer, auto-imunidade, infeces)

(GONZLEZ-BUITRAGO, 2006; GONZLEZ-BUITRAGO et al., 2007). Os objetivosdestas pesquisas utilizando tecidos e fluidos so similares s pesquisas comlinhagens celulares (identificao de biomarcadores, farmacoprotemica).

A falta de acesso de amostras teciduais um problema nas pesquisasprotemicas clinicas, mas a informao obtida pode ser determinante e, as vezes, a melhor escolha (BHATTACHARYA et al., 2003).

Na protemica de fluidos apresenta uma maior facilidade de obteno eprocessamento das amostras. A aplicao da protemica tem-se utilizado para oestudo das diversas doenas (neoplsicas, reumticas, endocrinolgicas,toxicolgicas) (GONZLEZ-BUITRAGO, 2006; GONZLEZ-BUITRAGO et al., 2007;PETRICOIN et al., 2004; GONZLEZ-BUITRAGO, 2007). Outro tipo de amostra demais difcil acesso o analise protemica do liquido cefalorraquidiano. Este se temutilizado recentemente no estudo das bases etiopatognicas e na identificao debiomarcadores de doenas neurolgicas, como transtornos neuropsiquitricos,tumores cerebrais e sndromes dolorosas lombares (ROMEO et al., 2005; ZHENG etal., 2003).

O efeito mximo das abordagens protemicas na pesquisa biomdica no foiconseguido ainda, em parte por causa da falta de recursos e informao entre ospesquisadores sobre os avanos tecnolgicos. Entretanto, um grande progressoest sendo feito, e importantes revises, informaes de diversas reas biomdicasso dadas para ilustrar o potencial desta abordagem. As abordagens protemicas

oferecem um grande potencial para decifrar problemas biolgicos complexos taiscomo a natureza de complexos moleculares particulares ou dos caminhos napatognese da doena (NEUBAUER et al., 1998), e de complexos nucleares deleveduras (ROUT et al., 2000). A descoberta de biomarcadores biolgicos dedoenas como cncer (CHO, 2007; MA et al., 2009;), mal de chagas (PABA et al.,2004) e para a comparao dos padres de protena da catarata humana(BENNETT et al., 2010). No campo da nefrologia (THONGBOONKERD, 2004).

DESENVOLVIMENTO DE DROGASO desenvolvimento de drogas baseado geralmente no up-regulate ou down-

regulate que uma atividade especfica implicou na patognese da doena ou no

efeito colateral dos tratamentos associados. As maiorias de drogas exercem seusefeitos em protenas (SCHLAEPPI & WOOD, 2000). A estratgia de trabalhar com ogene usado foi: uma leso gentica especifica identificada e as mudanas



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resultantes na estrutura, na funo, ou na expresso da protena elucidada, de modoque uma droga para neutralizar ou corrigir tais mudanas para que possa serprojetada. Um exemplo o desenvolvimento de um inibidor de tirosina quinase dade BCR-ABL produzidas por pacientes com leucemia mieloide crnica (DRUKER &

LYDON, 2000). Similarmente, a identificao da bio-atividade de uma protena queseja receptiva em um processo biolgico conduz ao projeto das drogas paramanipular estas propriedades, pelo uso de neutralizar anticorpos ou inibidores detirosina quinase do receptor para inibir a angiogense induzida pelo fator endotlialvascular do crescimento em tumores (SCHLAEPPI & WOOD, 2000).

O desafio dos estudos utilizando a protemica encontra-se ainda emidentificar as molculas alvo. Uma anlise detalhada de 51 drogas mostrou queagrupar mecanismos est refletido nos efeitos na protena, (ANDERSON &ANDERSON, 1998) e os investimentos substanciais foram feitos em tecnologiaprotemica por companhias farmacuticas e de biotecnologia. Somente alguns milgenes humanos so provveis candidatos a ser alvos apropriados, (DREWS, 1996).

BLACKSTOCK & WEIR (1999) prepuseram que a protemica aplicada narea farmacutica (embora igualmente vlido para outras reas biomdicas) sendodividida em protemica de expresso e mapeamento celular ou protemica deinterao, tendo um papel distinto no processo geral da descoberta de uma droga.

A protemica de mapeamento celular tem o objetivo de estudar interaes deprotena-protena (Interatoma) caracterizando sistematicamente os componentes decomplexos protenicos e construindo um mapa de chaves e das interaes celularesque podem ser importantes no processo da doena ou no mecanismo da ao deuma droga (LAMOND & MANN, 1997). Pelo uso de anticorpos especficos ou demarcadores introduzidos artificialmente, as protenas especficas podem ser isoladase todas as protenas associadas podem ser identificadas rapidamente porespectrometria de massas. A escolha do objetivo da anlise dos complexos de multi-protenas pode revelar funes provveis de protenas especficas mais rapidamentee indicar estudos biolgicos apropriados (LAMOND & MANN, 1997).

A protemica perfila a expresso da protena em uma clula sobre vriosestmulos, na busca de marcadores responsveis da droga e da toxicologia. Estaaproximao tem formado parte do programa de Desenvolvimento Teraputico noInstituto Nacional do Cncer dos Estados Unidos, onde 3989 compostos foramselecionados de encontro a um painel de 60 linhagens celulares, e sua farmacologiamolecular foi caracterizada por eletroforese bidimensional (MYERS et al., 1997).Entretanto, a protemica da expresso deve competir com os anlogos genmicos

da expresso diferencial do gene e de tecnologias de hibridizao baseadas emchips. Por exemplo, com um microchip do ADN (IYER et al., 1999) as mudanas naexpresso de 8613 genes em fibroblastos humanos que respondem ao soro foramexaminados. Tais tecnologias fornecem resultados rpidos e so menos laboriososdo que as abordagens protemicas correspondentes, mas, devido a baixacorrelao entre o mRNA e o produto da protena, por tanto o importante o valorelevado na informao da protena, um investimento substancial est sendo feitopara automatizar operaes em grande escala da protemica. Claramente, asabordagens genmicas e protemicas complementam-se nos termos da informaoproduzida e suas vantagens e desvantagens relativas.

Alm disso, para alcanar a seleo, que so importantes no processo clinico

os estudos de validao e de toxicidade do alvo. Um exemplo clssico de validao o estudo que mostra as aes de reduo dos ndices de colesterol pela



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lovastatina que afeta as protenas envolvidas com o metabolismo do colesterol(ANDERSON et al., 1991).

AICHER et al., (1998) demonstraram nas avaliaes dos mecanismos detoxicidade da ciclosporina, a diminuio da expresso renal da protena ligadora de

clcio em receptores humano transplante renal e com nefrotoxicidade, que pode serimplicado nos efeitos colaterais tubulares da calcificao desta droga.

CONSIDERAES FINAISA protemica na pesquisa clinica alm de fornecer um conjunto potente de

ferramentas para o estudo em larga escala da funo gentica diretamente ao nvelprotico, tem como objetivo a comparao, a nvel molecular, o nvel protico celularem situaes normais e patolgicas. O estudo da espectrometria de massas dasprotenas separadas por gel bidimensional esta conduzindo a um renascimento nasabordagens bioqumicas sobre a funo protica. A caracterizao protica ir acontinuar em rendimento, sensibilidade e alcance.

Importantes avanos na pesquisa clinica vmse desenvolvendo usandoestas ferramentas protemicas, que sero a chave para novas descobertas dedrogas e tratamentos de doenas que atingem este sculo.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq e FAPESP pelo auxlio financeiro e concesso de bolsas.

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