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Pseudomonas aeruginosa: Mecanismos de resistencia
y pruebas fenotípicas
Prof. Afonso LuProf. Afonso Luíís Barths BarthLABRESIS
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Facultad de Farmacia
Univ. Federal do Rio Grande do Sul
Pseudomonas aeruginosas:
Una bacteria “con más de 130 años... “
Pseudomonas aeruginosa:
• Bastoncillos Gram-negativo no fermentadores aeróbios estrictos.
• Nutricionalmente versátil – ubicuo.
• Reservorios: soluciones y equipamiento hospitalario - infecciones hospitalarias (corriente sanguinea, urinaria, pulmonar y vinculadas a catéter). Pacientes inmunocomprometidos y en CTI.
• Patógeno de las vías respiratorias más común en pacientes con Fibrosis Quística.
• Resistencia a múltiples antibióticos (MDR).
Barth and Pitt – BJID 1998; Potron et al – IJAA 2015
Pseudomonas aeruginosa:
• Bastoncillos Gram-negativo no fermentadores aeróbios estrictos.
• Nutricionalmente versátil – ubicuo.
• Reservorios: soluciones y equipamiento hospitalario - infecciones hospitalarias (corriente sanguinea, urinaria, pulmonar y vinculadas a catéter). Pacientes inmunocomprometidos y en CTI.
• Patógeno de las vías respiratorias más común en pacientes con Fibrosis Quística.
• Resistencia a múltiples antibióticos (MDR).
Barth and Pitt – BJID 1998; Potron et al – IJAA 2015
Pseudomonas aeruginosamorfología colonial
P.aeruginosa mucoide(Fibrosis Quística)
Mecanismos de R en P. aeruginosa
• Bombas de eflujo
• Disminución de permeabilidad
• Modificación proteina-objetivo
• Producción de enzimas que degradan antibióticos Aminoglucósidos β-lactamasas (Carbapenemasas)
MDR se produce por la combinación de mecanismos o por un único mecanismo muy potente
Bombas de eflujo en P. aeruginosa
Bombas de eflujo(sistema de 3 componentes)
Membranaexterna
Membranacitoplasmática
Espacioperiplasmático
Canal de salida(OprM, OprJ, OprN)
Lipoproteina ligante(MexA, MexC, MexE)
Bomba de eflujo(MexB, MexD, MexF)
Livermore – CID - 2001
Bombas de eflujo en P. aeruginosa
§ Expresión constitutiva – MDR§§ Expresión por inducción sustrato-relacionada Zavascki et al – ERAIT - 2010
Inhibidores de bombas de eflujo
L-Phenyl-L-Arginine β-Naphthylamide (PaβN)
La disminución de la CIM del antibiótico (carbapenémico) en presencia de PaβN indica la presencia de bomba de eflujo
tipo “Mex”
Mesaros et al – JAC 2007
Inhibidores de Bombas de eflujo
L-Phenyl-L-Arginine β-Naphthylamide (PaβN)
La disminución de la CIM del antibiótico (carbapenémico) en presencia de PaβN indica la presencia de bomba de eflujo
tipo “Mex”
Mesaros et al – JAC 2007
Método poco “específico”-Concentración de PaβN-Antibiótico “marcador”-Variaciones sutiles de la CIM-Otros mecanismos de R
Pereira et al – to be submitted
Inhibidores de Bombas de eflujo
Disminución de permeabilidaden P.aeruginosa
• La disminución de permeabilidad de la membrana externa a compuestos hidrofílicos es el principal factor relacionado a la alta resistencia intrínseca de P.aeruginosa (β-lactámicos)
• “Primer” mecanismo de resistencia al imipenem (pérdida de la OprD) - tratamiento con imipenem selecciona mutantes OprD
• La mayoría de los canales de porina son inespecíficos (afectan a otros antibióticos hidrofílicos = tetraciclinas, aminoglucósidos y cloranfenicol)
Disminución de permeabilidaden P.aeruginosa
Zavascki et al – ERAIT - 2010
Pérdida (alteración) de Porina
Richardot et al – IJAA 2015
Modificación de la proteína-objetivoen P. aeruginosa
• Modificación de PBPs (P.aeruginosa 1a, 1b, 2, 3, 4, 6 y 7)Resistencia a β-lactámicos – controversial
PBP2 – unión de carbapenémicosPBP3 – cefalosporinas anti-Pseudomonas
• gyrA y parCResistencia a fluoroquinolonas (mutaciones en las QRDRs)
• Metilación del rRNA 16SResistencia a los aminoglucósidos
Producción de enzimasque degradan antibióticos
• Producción de enzimas modificadoras de aminoglucósidos
(AMEs): AAC(6´)-II – R gentamicina, tobramicina y netilmicina; ANT(2´´)-I – R a gentamicina, tobramicina
• β-lactamasas
AmpC β-lactamasa: inducible; R a β-lactámicosOtras β-lactamsas: “BLEE” - PSE, PER, GES y OXA-BLEE Carbapenemasas = VIM, IMP, SPM (NDM)
β-lactamasas en P. aeruginosa
Zavascki et al – ERAIT - 2010
AmpC* en P.aeruginosa:
Inducción in vitro por imipenem
AmpC* en P.aeruginosa:
Inducción in vitro por clavulanato
*PDC: Pseudomonas-
Derived Cefalosporinasas
Cefoxitina e Imipenem = fuertes inductores
Hiperproducción de AmpC puede causar disminuciónde sensibilidad a imipenem
AmpC en P. aeruginosa
β-lactamasas en P. aeruginosa(no-carbapenemasas)
• Clases 2b y 2c (Ambler clase A):
espectro reducido – R a peniclinas y cefalosporinas de 1ª geración (TEM, PSE, CARB)
• Clase 2be (Ambler clase A):
espectro ampliado “BLEE” – R también a cefalosporinas de 3ª y 4ª generación(PER, VEB, GES*, TEM, SHV, CTX-M, BEL, LBT802, PME)*Enzimas tipo GES pueden presentar actividade carbapenemasa (GES-2 y GES-5) debido a mutaciones puntuales
• Clase 2d (Ambler clase D):
espectro reducido – R a penicilinas y cefalosporinas de 1ª generación; grupo con inumerables variantes que pueden presentar aumento de espectro (oximinocefalosporinas y carbapenémicos)OXA-BLEE (frecuentes en P.aeruginosa)OXA-carbapenemasas (infrecuentes en P.aeruginosa)
Zavascki et al – ERAIT 2010
Potron et al – IJAA 2015
Livermore – JAC 2001
…IMP, VIM and SPM metallo-carbapenemases (class B) are increasingly scattered in P. aeruginosa and are slowly but steadily increasing in prevalence!
Livermore and Woodford – Trends Microbiol 2006
…metallo-b-lactamases (MBLs), particularly VIM and IMP types, are the most widespread and have been reported globally!
Wright et al – JAC 2015
...although still rare, MBL of the IMP and VIM families are increasing sources of resistance to carbapenems in P.
aeruginosa.
Livermore – JAC 2001
Carbapenemasas en P. aeruginosa
Cornaglia et al – Lancet 2011Wright et al – JAC 2015
Cornaglia et al – Lancet 2011Wright et al – JAC 2015
FIM
(Italia)TMB (Libia)
Carbapenemasas en P. aeruginosa
• GES-carbapenemsasas: GES-2, GES-5, GES-18
• OXA-carbapenemasas: Constitutivas – OXA-50Adquiridas – OXA-24/40 (“CHDLs”)
• Carbapenemasas clase 2f: serina-carbapenemasas(KPC – casos esporádicos)
• Carbapenemasas clase 3: metalo-carbapenemasasVIM Distribución mundialIMP Distribución mundialSPM BrasilGIM Alemania AIM AustraliaFIM Italia
NDM – casos esporádicos (distribución mundial)
Carbapenemasas en P. aeruginosa
• GES-carbapenemsasas: GES-2, GES-5, GES-18
• OXA-carbapenemasas: Constitutivas – OXA-50Adquiridas – OXA-24/40 (“CHDLs”)
• Carbapenemasas clase 2f: serina-carbapenemasas(KPC – casos esporádicos)
• Carbapenemasas clase 3: metalo-carbapenemasasVIM Distribución mundialIMP Distribución mundialSPM BrasilGIM Alemania AIM AustraliaFIM Italia
NDM – casos esporádicos (distribución mundial)
1)Lectura interpretativa del antibiograma
2)Pruebas con inhibidores
Detección fenotípicade los mecanismos de resistencia
¿Qué debe ser estudiado?
- Importancia clínica
- Importancia Epidemiológica
P.aeruginosa sensiblesolamente a aztreonam
P.aeruginosa sensiblesolamente a aztreonam - Indica MBL
Imipenem
P.aeruginosa resistentesolamente a imipenem
C AZ
IMP
Imipenem
P.aeruginosa resistente solamente a imipenem - Indica pérdida de OprD
C AZ
IMP
La lectura interpretativa del antibiograma no es confiable para la identificación de mecanismos individuales pues está influenciada por la combinación de mecanismos de resistencia... (lo que es común en P.aeruginosa)
¿Cómo buscar carbapenemasasen P. aeruginosa?
…concerns remain about whether carbapenems could be used to treat infections caused by metallo-β-lactamase producers with MICs within the susceptible range.
Cornaglia et al – Lancet 2011
Utilización de quelantes(EDTA y MPA)
Arakawa et al JCM 1999
MBL negativo MBL
positivo
Thiol 3µl thiol
CAZ
MPA
“Nuestra” experiencia
Uso de quelantes
1) ¿Cuál es el mejor quelante?EDTAMPA
2) ¿Cuál es el mejor substrato?CAZIMI
3) ¿Cuál es la mejor técnica?Aproximación de disco (sinergismo)Adición en disco
Uso de quelantes
CAZ con MPA por aproximación de disco = mejor test (aumenta la sensibilidad) para P.aeruginosa (100% E y S)
Picão et al – JCM 2008
CAZ con EDTA por aproximación de disco (1 cm); IMP con EDTA por adición = pruebas con mayor exactitud
Perez et al – BJM 2014
…all phenotypic detection tests for MBLs in P. aeruginosa either lacked sensitivity (meropenem/DPA combinations) or specificity meropenem/EDTA and imipenem/EDTA combinations) when tested on meropenem nonsusceptible isolates in our epidemiological setting.1) Combination of tests (phenotypic and genotypic)2) Carba-NP
Peter et al – EJCMID 2014
Carba-NP para P.aeruginosa
Especificidad y Sensibilidad 100%
P.aeruginosa IMP, VIM, SPM, NDM, GIM y AIM
Desde el punto de vista clínico y epidemiológico, la MDR P.aeruginosa resistente a los carbapenémicos representa uno de los principales problemas de salud pública.
La resistencia a los carbapenémicospor producción de carbapenemasas,
¡aún más preocupante!
Pseudomonas aeruginosa: Mecanismos de resistencia
y pruebas fenotípicas
Prof. Afonso LuProf. Afonso Luíís Barths BarthLABRESIS
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Facultad de Farmacia
Univ. Federal do Rio Grande do Sul
