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PURIFICAÇÃO DA ENZIMA QUITINASE DE UVA PARA A PRODUÇÃO DE POLÍMEROS DE QUITOSANA COM GRAUS DE ACETILAÇÃO
CONTROLADOS
Laidson Paes Gomes
Rio de Janeiro 2009
ii
LAIDSON PAES GOMES Aluno do curso de biotecnologia
Matricula 0623800021
PURIFICAÇÃO DA ENZIMA QUITINASE DE UVA PARA A PRODUÇÃO DE POLÍMEROS DE QUITOSANA COM
GRAUS DE ACETILAÇÃO CONTROLADOS
Trabalho de conclusão de curso, TCC, apresentado ao Curso de Graduação Tecnologia em Biotecnologia, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de tecnólogo em Biotecnologia, sob a orientação do Dr. Eduardo Mere Del Aguila.
Rio de Janeiro 2009
iii
Gomes, Laidson Paes.
Purificação da Enzima Quitinase de Uva para a Produção de Polímeros de Quitosana com
Graus de Acetilação Controlados / Laidson Paes Gomes – Rio Janeiro, 2010. Vii, 45f
Monografia (Graduação Tecnologia em Biotecnologia) – Centro Universitário Estadual
da Zona Oeste – UEZO, Colegiado de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS, 2010
Orientador: Eduardo Mere Del Aguila
Referências Bibliográficas: 12f
Quitinase de uva, purificação e caracterização, desacetilação de quitina.
iv
Purificação da Enzima Quitinase de Uva para a Produção de Polímeros de Quitosana com Graus de Acetilação Controlados
Elaborado por Laidson Paes Gomes Aluno do Curso de Biotecnologia da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau: 9,0
Rio de Janeiro, 16 de dezembro de 2009
_______________________________________ Tereza Cristina Jesus Rocha
Membro, Doutor (a)
_______________________________________ João Bosco de Salles
Membro, Doutor
_______________________________________ Eduardo Mere Del Aguila
Presidente, Doutor
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL DEZEMBRO DE 2009
v
RESUMO
A quitinase (poli (1,4-(N-acetil-beta-D-glicosamina)) glicanohidrolase, EC 3.2.1.14) é uma
enzima produzida por uma grande variedade de plantas como mecanismo de defesa contra
ataques de insetos e fungos. Essa enzima utiliza quitina como substrato produzindo
oligossacarídeos biologicamente ativos de diferentes tamanhos, com aplicações na
indústria de alimentos, indústria farmacológica e nos processos de tratamento de água. A
quitina (um homopolímero formado por monômeros de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc)
ligados entre si por ligações do tipo beta-1,4) é encontrada principalmente no exoesqueleto
de artrópodes, em celenterados, nematóides, protozoários e moluscos, e na parede celular
de muitos fungos. O objetivo desse trabalho foi purificar a quitinase de uva e utilizá-la para
a produção de oligômeros de N-acetilglicosamina. A enzima foi purificada de extrato bruto
de uva, que foi tratado com sulfato de amônio a 80% de saturação, o precipitado foi
ressuspenso em tampão acetato, submetido à diálise e posteriormente filtrado. A análise da
fração purificada por SDS-PAGE 12,5% apresentou duas cadeias peptídicas principais de
24 e 31kDa, que corresponde as duas isoformas da quitinase de uva. A atividade quitinase
na preparação foi determinada com o uso do substrato sintético quitina azure, da Sigma. Os
ensaios apresentaram que a enzima possui valores ótimos de pH e temperatura de 3,0 e
42°C, respectivamente. A quitinase parcialmente purificada será testada quanto a sua
capacidade de hidrolisar quitina cristalina purificada de casca de camarão e uma
preparação comercial de quitina de carapaça de caranguejo.
Palavras chaves: Quitinase, oligômeros de quitosana, desacetilação
vi
ABSTRACT
Chitinase (poly (1,4-(N-acetyl--D-glucosaminide)) glycanohydrolase, EC 3.2.1.14) is
produced by a wide variety of plants (including the grapevine) as a defense against fungal
and insect attack. Chitinases are used for the production of oligosaccharides with different
biological activity. In this work we described a simple partial purification procedure for the
enzyme chitinase from grapes. The enzyme was obtained from a crude extract by
precipitation using 80% ammonium sulfate followed by dialysis and filtration through
22μm sterile membrane. The resultant proteins showed molecular weights ranging from 24
to 31kDa as judged by SDS-PAGE 12.5%. The chitinase preparation was active against
chitin azure as a cromogenic substrate. The optimum pH and temperature of enzymatic
preparation were pH 3.0 and 50°C, respectively. Treatment of crystalline shrimp chitin
with chitinase increased the deacetylation of this substrate by yeast chitin deacetylase by
48.5 fold.
Keywords: grape chitinases, purification and characterization, chitin deacetylation
vii
SUMÁRIO
Páginas
Resumo................................................................................................................................ iv
Abstract............................................................................................................................... v
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 2
1.1 Quitina........................................................................................................................ 2
1.2 Quitosana...................................................................................................................
1.2.1 Aplicação Biotecnológica..................................................................................
3
4
1.3 As quitinases.............................................................................................................
1.3.1 Quitinases em plantas.......................................................................................
1.4 Quitina desacetilase..................................................................................................
9
10
11
2. OBJETIVOS.................................................................................................................... 13
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................ 14
3.1 Extração de proteínas totais e purificação parcial de quitinase........................... 14
3.2 Dosagem da proteína................................................................................................. 14
3.3 Conservação da proteína.......................................................................................... 14
3.4 Precipitação com ácido tricloroacético (TCA) 1M................................................. 14
3.5 Caracterização da preparação parcialmente purificada....................................... 15
3.6 Determinação da atividade enzimática da quitinase.............................................. 15
3.7 Avaliação da desacetilação da quitina de camarão................................................ 15
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 17
5. CONCLUSÔES............................................................................................................... 23
6. REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 24
viii
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 QUITINA
A quitina foi primeiramente isolada por Braconnot em 1881, trinta anos antes do
isolamento da celulose, mas a falta de conhecimento básico sobre suas propriedades,
incluindo a reatividade química, limitou severamente suas aplicações industriais até o
início dos anos 1970 (ROBERTS, 1992). A partir daí surgiu um interesse em estudar as
relações estruturas/propriedades desse polímero e seu derivado.
Quitina é o segundo biopolímero mais abundante na natureza sendo o principal
polissacarídeo estrutural dos artrópodes, celenterados e alguns fungos (CAMPANA-
FILHO et al., 2007). Apresentam uma estrutura polimérica linear que consiste de unidades
de N-acetilglicosamina unidos por ligações β-1,4 (figura 1).
Figura 1. Estrutura primária de quitina, onde n é o grau de polimerização.
O fato de que a quitina pode ser extraída da biomassa, e mesmo a partir de
matérias-primas abundantes e relativamente baratas, consideradas como refugo da
atividade pesqueira voltada para exploração industrial de frutos do mar, tem sido destacado
como um fator importante em favor de sua produção, visando a utilização em larga escala.
Entretanto, deve ser reconhecido que, se tratando de um produto natural cuja biossíntese
não está sob estrito controle genético, ocorrem variações de composição e, além disso, a
quitina raramente ocorre em forma pura (CAMPANA-FILHO et al., 2007).
As principais matérias-primas para produção industrial de quitina são as carapaças
de crustáceos originadas do processamento industrial de frutos do mar (ABRAM &
HIGUERA, 2004). Em alguns países são produzidos mais de 2,5 milhões toneladas de lixo
dessa natureza (HEALEY et al., 1994 e HAKI et al., 2003).
A quitina possui três tipos de estruturas polimórficas na natureza, denominadas -,
- e - quitina. A -quitina é encontrada em estruturas rígidas e resistentes, como a
3
cutícula de artrópodes, e nesses casos ocorre fortemente associada a proteínas, materiais
inorgânicos ou a ambos. As formas - e - quitina ocorrem em estruturas flexíveis
embora também resistentes. A -quitina é a forma mais abundante e é também
considerada a mais estável, visto que a conversão das duas últimas formas na primeira é
irreversível (ROBERTS, 1992).
Quanto à orientação das suas cadeias polimórficas, a α-quitina, que possui cadeias
antiparalelas, é encontrada nas carapaças de camarões e caranguejos, e apresenta grau de
cristalinidade acima de 85%. A β-quitina, que possui cadeias paralelas, é encontrada em
estruturas menos rígidas, mas resistentes, apresentando grau de cristalinidade de
aproximadamente 72% (CAMPANA-FILHO et al., 2007), é encontrada no esqueleto
calcário de alguns animais marinhos (microalga, Thalassiosira fluviatilis, por exemplo), ou
onde uma certa flexibilidade é necessária, como nos gládios dos cefalópodes
(TOLAIMATE et al., 2000; GOW et al., 1987). A γ-quitina possui cadeias paralelas e
antiparalelas e pode ser encontrada nos casulos dos insetos e ainda não é muito conhecida
(MATHUR e NARAG, 1990).
1.2 QUITOSANA
A principal aplicação da quitina é no campo da bioconverção. A modificação
estrutural da quitina leva a formação da quitosana (figura 2), que corresponde a um
copolímero de unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose (GlcNAc) e 2-amino-2-
desoxi-D-glicopiranose (GlcN) unidas pelo mesmo tipo de ligação glicosídica presente em
quitina, com predomínio do segundo tipo de unidade (ROBERTS, 1992).
Essa conversão é realizada convencionalmente por meio da hidrólise dos grupos
acetamida da quitina para a produção de quitosana. Essa reação pode ser realizada tanto em
meio ácido, como alcalino, mas a primeira condição não é empregada devido à
susceptibilidade das ligações glicosídicas à hidrólise ácida. De fato, mesmo quando
realizada em meio alcalino, a desacetilação da quitina raramente é completa, pois o
processo para obtenção de quitosanas geralmente é interrompido quando o grau de
desacetilação atinge cerca de 60%. O prolongamento da reação leva a formação de
produtos completamente desacetilados e provoca uma severa degradação das cadeias
poliméricas (MATHUR, N. K., & NARANG C. K., 1990; LE DUNG, P., et al., 1994).
Este método convencional para obtenção de quitooligômeros, além de utilizar tratamentos
físicos e químicos drásticos e demorados, apresentam baixo rendimento. Entretanto, pode
4
ser feita uma conversão biológica eficiente da quitina em quitosana, mediada pelas
quitinases, que hidrolisam o polímero, diminuindo seu grau de cristalinidade e formando
unidades menores que em seqüência serão desacetilados pela enzima quitina desacetilase
(TSIGOS et al., 2000). Devido a estes fatores, a produção enzimática de
quitooligossacarídeos e seus derivados têm sido estudada e a via enzimática parece ser um
método rápido e simples para obtenção destes compostos (NAKAKUKI, 1993).
O processo de desacetilação tem como objetivo a obtenção de produtos com
diferentes graus de desacetilação e de variadas utilidades. Este processo requer tratamentos
que visem à hidrólise do polímero de quitina, já que geralmente, em condições
heterogêneas, a reatividade deste polissacarídeo tende a aumentar com o decréscimo do
grau de cristalinidade e a reação de desacetilação pode se processar mais rapidamente em
regiões amorfas que em regiões cristalinas (SHIGEMASA, Y. et al., 1999).
Figura 2. Estrutura primária da quitosana, onde n é o grau de polimerização.
1.2.1 Aplicação Biotecnológica
Quitina e quitosana são biopolímeros biodegradáveis e biocompatíveis, que
apresentam baixa toxicidade e baixa alergenicidade, atividades antimicrobianas e
hemostáticas. Estas propriedades os tornam candidatos a inúmeras aplicações
biotecnológicas nas áreas médica, farmacêutica e odontológica, na agricultura, na indústria
de alimentos e de cosméticos (CAMPANA-FILHO et al., 2007). Esses polímeros também
possuem a capacidade de interagir com lipídeos, proteínas, corantes, íons metálicos,
herbicidas e pesticidas, podendo ser usados em aplicações voltadas para a concentração,
recuperação, análise e separação dessas substâncias, como a descontaminação de efluentes
industriais. Em função das propriedades e das aplicações acima mencionadas, e do fato de
quitina e quitosana serem produzidas a partir de matérias primas de baixo custo, esses
polímeros tem despertado muito interesse nas áreas acadêmica e industrial.
O crescente interesse científico e tecnológico sobre estes polímeros pode ser
medido pelo número de artigos publicados em revistas científicas e de patentes registradas
5
mundialmente nos últimos trinta anos. O número de publicações sobre o assunto aumentou
em progressão exponencial nos últimos trinta anos, passando de aproximadamente 480
artigos no início dos anos 1970 para 10700 artigos no período 1998-2002. Em relação às
patentes relacionadas à quitina e quitosana, somente o United States Patent and Trademark
Office registra 7115 patentes no período 1976-2007 (Uspto.gov/patft/index.html), devendo
ainda ser levado em conta os registros de patentes na Europa, Japão, China e Coréia.
As possibilidades de aplicações são ainda aumentadas pelo fato da quitosana poder
ser preparada em diferentes formas, como soluções de viscosidade controlada, géis, filmes
e membranas, microesferas e nanopartículas (CAMPANA-FILHO et al., 2007), e
modificada quimicamente, devido à presença de grupamentos reativos em sua estrutura
(hidroxilas e grupos aminos). Assim, a quitosana pode ser derivatizada com diferentes
grupos funcionais por reações que promovam a formação de ligações covalentes cruzadas
(dentro da mesma cadeia ou entre cadeias diferentes) e complexação com outros
polímeros.
A quitosana pode ser usada para a remoção e recuperação de diferentes resíduos
(VIVEK & TORRES J.A., 2000). Ela tem sido usada como adsorvente para remoção de
metais pesados, como chumbo (NG, J.C.Y., et al., 2003), cobre (NGAH, W.S.W., et al.,
2002), níquel, zinco e cádmio (BECKER, T., et al., 2000) de águas usadas na indústria; na
biotransformação e detecção de pesticidas (DU, D., et al., 2007); na remoção de corantes,
aminoácidos e proteínas (BORDERÍAS, A.J., et al., 2005); e como agente floculante no
tratamento de efluentes aquosos (DÍAZ, E. D. A., et al, 2007). A atuação da quitosana
como agente floculante é possível devido à alta densidade de carga dos grupos amino, que
interagem com substâncias carregadas negativamente. Alguns tipos de membranas de
quitosana estão sendo desenvolvidos para clarificação e purificação de água com boas
propriedades semipermeáveis (KUMAR, R e MAJETI, N.V., 2000).
A quitosana também oferece um amplo espectro de possíveis aplicações na
indústria de alimentos (SHAHIDI, F et al., 1999; BAUTISTA-BAÑOS S et al., 2006 e LI
Y et al., 2007), conforme esquematizado na figura 3.
6
Figura 3. Aplicações da quitosana na indústria de alimentos, reproduzido de CAVALCANTE et al., 2008.
Oligossacarídeos de quitosana ou quitosana de baixa massa molecular podem
apresentar efeitos benéficos seletivos sobre o crescimento e a atividade biológica de
bactérias probióticas, como Bifidobacteria e Lactobacillus (LEE, H.W., et al., 2002 e
BARRETEAU, H et al., 2006 ). Lactobacillus acidophillus, L. plantarum e Lactobacillus
sp. podem ser inseridos em filmes de quitosana conservando sua viabilidade (MARTINEZ-
CASTELLANOS G., et al., 2007). O uso de biofilmes de quitosana associado a bactérias
láticas é de grande potencialidade, visto que Lactobacillus produzem ácido lático,
bacteriocinas e outros compostos que inibem o desenvolvimento de patógenos e
deteriorantes de alimentos, além de serem importantes probióticos (SAAD, S.M.I., 2006).
Na indústria de alimentos minimamente processados, inicialmente desenvolvida
para suprir restaurantes, hotéis e instituições similares, os seguimentos de “fresh-cut” e
“ready-to-eat” requerem uma tecnologia específica para a manutenção apropriada da
qualidade nutricional dos produtos (WILEY, R.C., 1997). Essa indústria se vale de
7
revestimentos comestíveis, que devem ser transparentes, terem aderência suficiente para
não serem removidos no manuseio e não introduzirem alterações no gosto. Entretanto, o
mais importante é que a cobertura comestível possa atuar como uma barreira à perda de
umidade, controlar a respiração do fruto e evitar contaminações microbiológicas e
químicas. Uma série de estudos tem investigado o uso da quitosana como cobertura ou
revestimentos protetores em frutas e legumes processados (COMA, V., et al., 2002). Esses
trabalhos enfocam, essencialmente, as propriedades antifúngicas e antibacterianas da
quitosana (NO, H.K., et al., 2002). Como quitosana não é digerido por humanos, ele não
altera o valor calórico dos alimentos, representando um atrativo a mais para a indústria
alimentícia.
Outros pesquisadores (PATERNO L.G., et al., 2001) estudaram uma alternativa
viável para obtenção de filmes poliméricos pela técnica de automontagem (self-assembly).
Considerando que a quitosana apresenta cargas positivas em meio ácido (devido ao estado
protonado dos grupamentos NH3), substratos com alta densidade de sítios negativos
imersos nessa solução servirão como suportes para atração, e subseqüente formação de um
filme homogêneo. O revestimento com biofilmes de quitosana pode aumentar a vida de
prateleira de frutas, uma vez que o biofilme modifica a atmosfera entre o filme e a fruta,
reduzindo os níveis de O2 e aumentando os níveis de CO2, o que diminui o metabolismo do
vegetal e retarda a senescência (LANA, M.M. e FINGER, F.L., 2000).
A quitosana também tem encontrado utilizações bastante versáteis nas áreas
farmacêutica e médica, como pode ser visualizado na figura 4. Ela é usada como carreador
de fármacos para liberação controlada e de DNA (PARK, J.H., et al 2004), na regeneração
de tecidos epiteliais (NIEKRASZEWICZ, A., et al., 2007), na confecção de membranas
artificiais (COSTA, T.A.C., et al., 2006), como promotor da osteogênese (HAMILTON V.
et al., 2007), como agente antibacteriano (JING, Y.J., et al 2007), como coadjuvante da
higiene oral (HAYASHI, Y., et al., 2007), na absorção de gordura e redução do colesterol
sérico (FEOFILOVA, E.P., 2007) e como componente de cosméticos (KOHEI, H. et al.,
2006).
8
Figura 4. Principais aplicações de quitosana como material biomédico durante o período de 1994 a 2004
(ISSA, M.M et al., 2005).
A utilização de quitosana no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos
via transdérmica é, atualmente, alvo de intenso estudo. A eficiência deste polímero em
promover o aumento da absorção transepitelial foi demonstrada com vários agentes
terapêuticos, como insulina (ASPDEN, T., et al., 1996), morfina (ILLUM, L., et al., 2002),
heparina (THANOU, M., et al., 2001) e hidrocortisona (SENEL, S., et al., 2001 ).
Inclusive, a eficácia terapêutica de fármacos usando esta rota de administração foi
confirmada em testes com humanos em fase I de estudo (ILLUM, L., et al., 2002). O
mecanismo pelo qual a quitosana aumenta a absorção dos fármacos e macromoléculas
permanecem desconhecidas. No entanto, dois aspectos estão associados a esta propriedade.
Primeiramente, credita-se a importância ao seu efeito ocluso sobre a pele, aumentando a
hidratação local e facilitando a absorção. Segundo, e não menos importante, seria sua ação
sobre as junções intercelulares da pele, como se “abrisse” caminho para passagem das
moléculas (SMITH, J. M. & WOOD, E. J., 2003).
O uso de sistemas coloidais como transportadores de fármacos, proteínas, antígenos
e genes é amplamente descrito na literatura. O interesse nesses sistemas ocorre,
principalmente, devido à sua baixa toxicidade e, em alguns casos, ao sinergismo sobre o
efeito terapêutico (KREUTER, J., 1994; STOLNIK, S., et al., 1995).
peptídeos e proteínas
antimicrobiano
engenharia de tecidos
cicatrização
vacinas
vacinas- DNA
genes
drogas
9
A utilização de vírus atenuado continua sendo a principal metodologia de
desenvolvimento de vacinas, e cerca de 80% das vacinas antivirais são produzidas dessa
forma (WIVEL, N. A. & WILSON, J. M., 1998). Contudo, estes sistemas apresentam
limitações, como o aparecimento de reações imunológicas secundárias e oncogenes
(ANDERSON, W. F., 1998). Para solucionar esses problemas, a quitosana tem sido
utilizada como transportador de DNA em processos de transfecção com elevado percentual
de eficiência (RICHARDSON, S. C. W., et al., 1999).
1.3 AS QUITINASES
Na natureza existe uma grande diversidade de oligossacarídeos e polissacarídeos,
desempenhando os mais diversos papéis que vão desde reserva de energia até sinalização.
Da mesma forma, há também uma grande diversidade de enzimas que hidrolisam ligações
glicosídicas, pertencentes à superfamília das glicosilhidrolases, que atuam sobre a ligação
glicosídica entre dois ou mais carboidratos ou entre misturas de carboidratos e demais
biomoléculas. Essa superfamília é composta por 81 famílias de enzimas que hidrolisam os
mais variados substratos (HENRISSAT, 1991).
Dentre as glicosilhidrolases, destacam-se as quitinases (E.C. 3.2.1.14): enzimas que
hidrolisam a quitina, que podem ser divididas em duas categorias, como endoquitinase,
quando cliva as ligações internas na cadeia polimérica, ou exoquitinase quando degrada o
polímero na sua porção terminal (SUBROTO et al., 1999).
Existem duas grandes famílias de quitinases, denominadas família 18 e 19
distinguidas pelas suas seqüências de aminoácidos, em termos de estrutura e mecanismo de
ação catalítica. Família quitinases 19 é encontrada principalmente em plantas, e possui
seqüências muito homólogas, domínio catalítico constituído principalmente por α-hélice e
realiza a reação de hidrólise utilizando mecanismo de catálise ácida gerando produtos com
conformação α. Em contrapartida, a família 18 inclui representantes microbianos
(bactérias, fungos e vírus), encontrado também em plantas e animais, incluindo insetos, e
tem divergência substancial de seqüência, possui sítio catalítico (αβ)8-Barril e utilizam o
mecanismo de catálise substrato assistido, que leva a retenção do carbono anômero do
produto formando produtos com conformação β (KABIR et al., 2006).
Havendo ainda uma subclassificação dentro dessas famílias para as quitinases, que se
subdividem dentro da família 19 nas classes I, II e IV e dentro da família 18, nas classes III
e V (ISELI et al., 1996). Essas cinco classes de quitinases foram distinguidas com base em
10
alinhamentos de seqüência e topologia subcelulares (MELCHERS et al., 1994) e três deles
são sempre encontrados em plantas (GRAHAM & STICKLEN, 1994; KOMBRINK &
SOMSSICH, 1995). Quitinases da classe I possuem pI básico e contem um domínio N-
terminal rico em Cys, que supostamente funciona ligado a quitina. Além disso, uma
dobradiça do domínio foi atribuída, e uma extensão C-terminal foi identificada que é
essencial e suficiente para a localização no vacúolo das células vegetais (NEUHAUS et al.,
1991). Quitinases classe II, que partilham de domínios catalíticos altamente conservadas
como da classe I, são distinguidos pelo seu pI ácido e falta de domínios ricos em Cys ou
extensão C-terminal e são excretados para o espaço extracelular. Quitinases da classe III
são caracterizadas por atividade de lisozima e possuem homologias insignificante de
seqüência com as classes I ou II das quitinases (BERNASCONI et al., 1987; BOLLER &
METRAUX, 1988). Já a classe IV é homóloga à classe I, mas mostra menor peso
molecular e a classe V é homóloga a classe III, mas apresenta menor peso molecular.
(HENRISSAT, B. & BAIROCH, A., 1993)
1.3.1 Quitinase em plantas
As quitinases em plantas estão associadas à defesa contra patógenos e fazem parte
do grupo de proteínas denominadas proteínas PR (Pathogenesis Related Proteins), que são
proteínas capazes de induzir resistência local ou sistêmica ao ataque de fungos e outros
fitopatógenos. Evidências indicam que as quitinases têm um papel direto nessa defesa por
atacar diretamente os polímeros de quitina, que é o maior componente da parede celular da
maioria dos fungos (COLLINGE et al., 1993).
Outros papéis importantes das quitinases em plantas estão ligados à resistência à
pressão osmótica ao envolvimento no processo de amadurecimento de frutos induzido por
etileno (COHEN-KUPIEC & CHET, 1998).
A maioria das plantas expressam constitutivamente níveis relativamente baixos de
quitinases e só produzem níveis mais elevados da enzima quando submetidas a ataques por
fitopatógenos. Nas uvas (Vitis vinifera) as quitinases constituem até 50% de suas proteínas
solúveis (WATERS et al., 1998). Danos mecânicos da planta por fungos ou mastigação de
insetos provocam a liberação de uma variedade de hormônios de plantas, tais como etileno
e ácido salicílico que estimulam produção de quitinase (GIANNIKIS et al., 1998;
DERCKEL et al., 1996). Supõe-se que o nível da síntese e o tempo de exposição ao etileno
afetam a expressão de quitinase induzida por ferimento. Muitos autores observaram que
11
isoformas semelhantes de quitinases induzidas por etileno foram produzidas por ferimento
(HAMEL, F. & BELLEMARE, G., 1995; DERCKEL, J.P., 1996). Tal correlação não foi
observada em outros relatórios. A razão para essa contradição pode ser a diferença no
momento da ferida estimulando a síntese de etileno - alguns destes intervalos de tempo
podem não ser suficientes para a indução do gene de quitinase (AMAC, D.A., 1990).
Existe também a possibilidade de síntese de quitinases pelo ferimento não ser induzida
pelo etileno derivado dos tecidos danificados, mas sua expressão é desencadeada por outra
molécula de transdução de sinal da ferida (RAIKHEL, N.V. & LEE, H.I., 1993).
Além dos fatores descritos acima, a transcrição de genes de quitinase ou o aumento
na atividade enzimática, podem ser induzidos por outros estímulos externos como a
exposição da planta à seca ou ao frio, exposição ao gás ozônio, a metais pesados, excesso
de salinidade e luz UV (HAMEL, F. e BELLEMARE, G., 1995; HANFREY, C., et al,
1996; COHEN-KUPIEC, R. & CHET, I., 1998). Aclimatação ao frio e à desidratação
induzem a expressão do gene responsável pela produção de quitinase de classe II em
Cynodon sp (DE LOS REYES., 2001). Em Cucurbita sp, a síntese de quitinase extracelular
básica é induzida por estresse osmótico e ferimentos (ARIE, M., et al, 2000). O ferimento
também induz a expressão da quitinase classe I nas raízes de plantas do gênero Brassica
(HAMEL, F. & BELLEMARE, G., 1995), e a senescência das folhas provoca a expressão
do gene da quitinase de classe IV (HANFREY, C., et al, 1996). O tratamento com ozônio
causou um rápido aumento intracelular de quitinases em plantas de Nicotiana tabacum
(SCHRAUDNER, M., et al, 1992).
No processo de amadurecimento, as uvas produzem altas concentrações de açúcar e
suas cascas tornam-se mais suscetíveis ao ataque fúngico. Para compensar, as uvas
produzem níveis relativamente elevados de quitinase como uma defesa durante este
período. Esta é uma característica útil, pois torna as uvas mais resistentes à ação fúngica
durante safras com alta umidade (ROBINSON et al., 1997).
1.4 QUITINA DESACETILASE
Na natureza, a etapa de desacetilação da quitina é realizada pela enzima quitina
desacetilase. A aplicação do uso da quitina desacetilase é um método de desacetilação
alternativo que evita rejeitos (MARTINOU et al, 1995). Baseado nisto, foi proposta a
utilização da quitina desacetilase como método de desacetilação.
12
A quitina desacetilase (CDA) é a enzima que catalisa a conversão de quitina para
quitosana através da desacetilação dos resíduos N-acetil-D-glicosamina. Estas enzimas
CDA foram isoladas dos fungos M. roxii e C. lindemuthianum (KAFETZOPOULOS, et
al., 1993; TSIGOS & BOURIOTIS, 1995), e os genes que codificam CDA foram
estudados em M. rouxii e S. cerevisiae (KAFETZOPOULOS, et al., 1993;
CHRISTODOULIDOU, et al., 1996). Para avaliar o papel destas enzimas, na formação da
parede dos esporos de levedura, foram isolados e estudados dois genes que codificam a
quitina desacetilase em levedura: CDA1 e CDA2.
Quitinas desacetilases têm sido purificadas e caracterizadas a partir de diversos
fungos. As enzimas mais bem estudadas são aquelas dos fungos M. roxii
(KAFETZOPOULOS, et al., 1993; MARTINOU et al, 1998), Absidia coerulea (GAO et
al, 1995), Aspergillus nidulans (ALFONSO et al., 1995) e de duas cepas de Colletotrichum
lindemuthianum (TSIGOS & BOURIOTIS, 1995; TOKUYASU et al, 1996).
Com o desenvolvimento de métodos de biologia molecular, novos genes para
quitina desacetilase foram encontrados em diferentes microorganismos, e é possível
expressar em grandes quantidades e de forma controlada esta enzima por estas
metodologias. Hoje, o uso da quitina desacetilase é considerado o mais apropriado para a
produção de quitosana.
Além disso, uma vez que a desacetilação enzimática não é um processo aleatório,
como a desacetilação química, novos polímeros com características físicas e químicas
diferentes podem ser produzidos (TSIGOS, et al., 1999).
As vantagens de um processo enzimático são mais evidentes na desacetilação de
oligômeros de quitina: estes compostos são solúveis em solução aquosa e são,
conseqüentemente, mais acessíveis à ação enzimática. Desta maneira, oligômeros
desacetilados enzimaticamente, podem ser facilmente produzidos e apresentam uma
diferente distribuição de resíduos N-desacetilados, resultando numa variedade de
oligômeros de quitosana bem definidos e que podem ser produzidos pela desacetilação
enzimática.
Baseado nestes estudos pode-se concluir que o desenvolvimento de um processo
controlável usando a desacetilação enzimática de substratos de quitina apresenta um
processo alternativo atrativo, que pode a princípio, resultar na preparação de novos
polímeros de quitosana e oligômeros definidos (TSIGOS, et al., 2000).
13
2. OBJETIVOS:
GERAL:
Purificação da enzima quitinase de Vitis Vinifera para a produção de polímeros de
quitosana com graus de acetilação controlados.
ESPECÍFICOS:
Padronizar o processo de purificação da enzima quitinase.
Caracterizar o produto parcialmente purificado.
Estudar a sua capacidade de hidrolisar a quitina como substrato.
Otimizar o processo de produção de oligômeros de quitosana.
14
3. MATERIAL E MÉTODOS:
3.1 Extração de proteínas totais e purificação parcial de quitinase
A polpa de 200g de uvas Red Globe foi homogeneizada com o tampão acetato de
sódio 50 mM (pH 5,0) (p/v de 1:2,5) em liquidificador doméstico. O homogeneizado foi
filtrado em peneira e centrifugado a 1700 x g a 4°C, durante 10 minutos.
O sobrenadante foi submetido a precipitação com sulfato de amônio (NH4)2SO4 anidro
empregando quatro intervalos de saturação: 0-20% (m/m), 0-40% (m/m), 0-60 (m/m) e
0-80% (m/m) de acordo com COELHO (1993), a reação foi incubada a 4°C overnight.
Os materiais precipitados foram centrifugados à 5500 x g a 4°C por 20 minutos, e
os sedimentos ressuspensos em 1/5 do volume inicial no mesmo tampão. O sedimento foi
dialisado contra 6L de água utilizando uma membrana FISHERBAND® Dialysis Tubing
(semipermeável 10 kDa) por 24 horas a 4°C. O dialisado foi filtrado em membrana
(MILLIPORE MILLEX®GS) com poro de 0,22µm.
3.2 Dosagem da proteína
O conteúdo de proteínas do extrato bruto e dos dialisados foi determinado
utilizando o aparelho QuibitTM fluorometer Invitrogen®, utilizando o kit Protein Assay,
fornecido pelo fabricante.
3.3 Conservação da proteína
Na amostra purificada foi adicionado 20% de glicerol.
3.4 Precipitação com ácido tricloroacético (TCA) 1M
A amostra foi submetida à precipitação com TCA (4:1) que foi incubada a 4ºC por
18 horas, após esse período de incubação foi centrifugada por 10 min a 8800 x g. O
sedimento formado foi lavado com 200 L de acetona gelada e foi centrifugado por 10 min
a 8800 x g, duas vezes. Foi retirada a acetona e deixar evaporar o restante para poder
utilizar o sedimento formado.
15
3.5 Caracterização por SDS-PAGE da preparação purificada
O extrato bruto e as preparações purificadas foram concentradas com ácido
tricloroacético (TCA) (4:1), o sedimento obtido foi ressuspenso em tampão contendo β-
mercaptoetanol (v/v 1:1). As amostras foram aquecidas por 10 min a 95ºC antes de aplicá-
las no gel. Foram analisados em SDS-PAGE (12,5%) como descrito por Laemmli (1970).
O gel foi corado com CoomassieTM Brilliant Blue G-250 USB®, sendo embebido por um
período de 15h de exposição ao corante.
3.6 Determinação da atividade enzimática da quitinase
A atividade enzimática da preparação purificada foi estimada com “chitin azure”
(Sigma), como substrato cromogênico (WIRTH e WOLF, 1990). Nove microgramas da
amostra enzimatica foram adicionados a 200μg da “chitin azure®” e tampão acetato de
sódio 50mM pH 3,0 até um volume final de 700μL. A reação foi incubada a 42°C por 50
minutos e paralisada com a adição de 200 μL de HCl 4M seguida de uma incubação por 20
minutos a 4°C. A quantificação do cromóforo foi realizada a 550nm (SmartSpecTM Plus
Spectrophotometer Bio-Rad). Uma unidade de quitinase foi definida como a quantidade de
proteína capaz produzir o incremento de 1.0 de DO à 550nm, por minuto, sob as condições
descritas.
Este ensaio enzimático foi usado como modelo para determinar os parâmetros
cinéticos e a caracterização da preparação obtida.
3.7 Avaliação da desacetilação da quitina de camarão
Um miligrama da quitina de camarão foi tratado, ou não, com 45μg de quitinase
(0,6U) segundo as condições previamente descritas na reação enzimática da quitinase.
Após a incubação a reação foi paralisada e centrifugada. O sedimento foi ressuspenso em
25mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mg de BSA (Bovine Serum Albumin) e 1μg da preparação de
quitina desacetilase. A esta mistura foram adicionadas 3U de quitina desacetilase de
levedura, purificada como descrito anteriormente (DEL AGUILA, 2006). A reação de
desacetilação foi realizada a 50ºC nos intervalos de 1 ou 2 horas em um volume final de
600L, e paralisada a 100ºC por 10 minutos.
A desacetilação da quitina foi estimada pela quantidade de grupamentos amino
livres (DORRESTEIJN et al, 1996) usando o método colorimétrico. A cada mistura da
16
reação foi adicionado 1mL de uma solução contendo: 0,005% do reagente OPA (ο-
phthalaldehyde – Invitrogen Life Technologies), 0,1% de etanol absoluto, 7mM de
-mercaptanol, em um volume final de 10mL completado com tampão Na2HCO3 50mM
pH 10,5. A reação foi realizada a temperatura ambiente durante 2 minutos e a absorbância
foi determinada a 340nm em espectofotômetro (Beckman DU 640).
A quantidade de aminas livres foi estimada por comparação com soluções de glicina de
concentrações conhecidas, preparadas no mesmo tampão.
17
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho foi obtida e caracterizada uma preparação de quitinase de uva. A
preparação foi a obtida por precipitação das proteínas com sulfato de amônio numa faixa
de saturação de 0-80% na qual foi obtida a maior concentração de proteínas (54,1μg/mL).
Nas faixas de saturação de 0-20, 0-40 e 0-60% foram obtidos homogeneizados com
concentrações de proteína de 13,8μg/mL, 25,4μg/mL e 17,4μg/mL, respectivamente.
A analise por SDS-PAGE 12,5% da preparação purificada mostrou duas cadeias
polipeptídicas de massas moleculares 24 e 30kDa, determinadas segundo o programa
GelQuant (DNR Bio-Imaging Systems) (fig.5 raia 2). As isoenzimas de quitinase, que
possuem peso molecular igual ou superior a 30kDa estão incluídas na família 19 das
quitinases. Já as que possuem massa molecular aproximada de 24kDa pertencem à família
18 (SHIRATA et al., 2008). Estas massas moleculares semelhantes àquelas previamente
identificadas como quitinases e proteínas semelhantes à taumatina, são as que estão
envolvidas na desestabilização de proteínas do vinho e a formação de turbidez (WATERS
et al., 1996; WATERS et al., 1998).
A preparação de quitinase apresentou melhor conservação de sua atividade quando
estabilizada com 20% de glicerol uma vez que ela se mostrou estável quanto à forma e
tempo de conservação, diferentemente da conservação com a utilização do DTT e PMSF,
os quais apresentaram interferência nas etapas posteriores. Foi observado que os processos
de congelamento e descongelamento também interferiam na estabilidade da mesma.
Para verificar se a preparação obtida apresentava atividade enzimática, a preparação
de quitinase foi ensaiada em diferentes concentrações do substrato, entre 25g e 500μg de
“chitin azure®” e estimou-se que a absorbância era crescente quando utilizadas
concentrações de até 200g de substrato, sendo esta absorbância mantida constante com
concentrações superiores a esta, sendo assim as reações posteriores foram feitas com
200g do substrato cromóforo (dados não mostrados).
18
Figura 5. Análise por SDS-PAGE 12,5% da preparação de quitinase.
A preparação parcialmente purificada foi precipitada com (NH4)2SO4 80% de saturação, seguida de diálise contra água. As amostras foram precipitadas por TCA 1M, lavadas com acetona e ressuspensas no tampão de amostra e analisada em SDS-PAGE. Raia P, Padrão de peso molecular (PageRulerTM unstained protein ladder Fermentas®), raia 1, extrato bruto precipitado com TCA e raia 2, preparação de quitinase após precipitação com sulfato de amônio 80%, dialisado e filtrado com uma membrana de poro 0,22µm MILLEX®GS (Millipore) e precipitado com TCA. O gel foi corado com CoomassieTM Brilliant Blue e documentado usando o DNR Bio-Imaging Systems.
O rendimento e a atividade enzimática da preparação foi estimada nas diferentes
etapas de purificação e estão apresentados na tabela 1. Baseado no protocolo de purificação
descrito, as quitinases de uva foram purificadas 16 vezes, com uma recuperação de 87%
(tabela 1), a fração purificada apresentou uma concentração de proteína de 229mg/L com
atividade específica de 563U/g.
A enzima apresentou atividade máxima aos 50 minutos de incubação (fig. 6), sendo
este o tempo escolhido para os ensaios posteriores de atividade enzimática da quitinase,
utilizando 200g do substrato.
20kDa
30kDa
50kDa
P 1 2
30kDa
24kDa
19
Tabela 1. Purificação parcial de quitinase de Vitis vinifera V. Red Globe
O extrato bruto livre de células foi obtido da homogeneização de polpas de uva e tratado com sulfato de amônia a 80%. A fração protéica precipitada foi dializada e filtrada. A atividade enzimática foi determinada incubando-se 45μg da preparação parcialmente purificada com 100μg de chitin azure, em tampão acetato de sódio 50mM pH 3,0 por 50 minutos a 42°C e mantida a 4°C por 20 minutos. A produção do cromóforo foi estimada a 550nm. Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade capaz de produzir absorbância igual a 1.0 por minuto e por mg de proteína.
Passos de Purificação Proteína
(mg/mL)
Volume
(mL)
Proteína
(mg)
Atividade
Total (U)
Atividade
especifica
(.mg-1)
Rendimento
(%)
Purificação
Extrato Bruto
Sulfato de amônio 80%
0,101
0,231
287
7
28,9
1,6
1,03
0,9
35,6
563
100
87
1
16
20
A enzima foi ensaiada em temperaturas entre 22 - 52°C, obtendo-se a maior
atividade enzimática a 42°C. Temperaturas superiores a esta provocaram uma diminuição
da atividade da enzima (fig. 7).
Figura 6. Avaliação do efeito do periodp de incubaçãosobre a atividadeda quitinase purificada.
9μg de quitinase parcialmente purificada foram incubadas com 200g de chitina azure© utilizada como substrato cromogênico. A reação foi realizada como descrito na seção de material e métodos. A absorbância foi determinada a 550nm. Efeito do tempo de incubação sobre a produção do cromóforo a 42C.
Nas reações onde se variou o pH da solução tampão foram observados dois picos de
atividade enzimática nos valores de pH 3,0 e 6,0, como observado na Figura 8. A
preparação apresentou baixa atividade em pH 1,0 e 2,0. Em estudos com quitinases da
folha de abacaxi foram encontrados pHs estáveis na faixa de 3,0 à 12,0 (TAIRA et al.,
2005). Esta estabilidade de pH nesta faixa coincide com as quitinases de plantas terrestres.
O perfil de atividade da preparação nos diferentes pHs obtidos foi diferente dos
anteriormente descritos, já que os limites máximos das atividades foram observados em pH
3,0 e 6,0. Alguns estudos relataram que várias quitinases possuem dois pHs ótimos, um pH
ácido e outro básico.
21
Temperatura (°C)
20 25 30 35 40 45 50 55
Abs
orb
anci
a (
550
nm)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Figura 7. Avaliação do efeito da temperatura sobre a atividade da quitinase purificada.
Efeito da temperatura (22C a 52C) sobre a produção do cromóforo por 50 minutos.
A preparação parcialmente purificada de uva parece ser semelhante, onde a
atividade máxima foi obtida em dois picos. A razão pelas quais algumas quitinases
apresentam dois picos de pH não foi esclarecida ainda (KAWASE et al., 2006). No caso
deste trabalho essa característica pode estar relacionada com a possível presença de duas
famílias de quitinases distintas, onde cada pico de pH pode ser referente a cada uma das
famílias presente na amostra purificada.
pH
0 2 4 6 8 10
Abs
orb
anci
a (5
50nm
)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Figura 8. Avaliação do efeito da alteração do pH sobre a atividade da quitinase purificada.
Efeito da alteração do pH sobre a produção do cromóforo a 42°C por 50 minutos. A atividade enzimática foi avaliada através da hidrolise da chitin azure determinada pela absorbância a 550nm (WIRTH e WOLF, 1990).
22
Para determinar se a preparação parcialmente purificada de quitinase apresenta
atividade sobre seu substrato natural, experimentos iniciais utilizando a quitina extraída de
carapaça de camarão como substrato, tiveram resultados promissores. O tratamento prévio
da quitina com a preparação purificada de quitinase favoreceu a desacetilação da quitina
quando esta foi submetida à ação da quitina desacetilase recombinante (Cda2p). Como
pode ser observado (tabela 2), foi feito um pré-tratamento com 0,6U da preparação de
quitinase a 42ºC por 50 minutos. O produto formado foi incubado com quitina desacetilase
purificada (DEL AGUILA, 2006) por 1 e 2 horas. A determinação de aminas livres pelo
método de OPA foi de 174,7 nmols, 48,5 vezes maior que sem tratamento com quitinase e
com 2 horas foi de 219,4nmols, 9,5 vezes maior que sem quitinase. A pré-hidrolise do
polímero com quitinase favoreceu a desacetilação, indicando que a desacetilação de
oligômeros menores seria mais eficiente. A diferença entre a quantidade de produto obtido
por desacetilação por 1 e 2 horas é pequena (25%), entretanto, isto ajudaria na otimização
da produção de oligômeros de quitosana desacetilados de forma controlada.
Tabela 2. Cinética de desacetilação de quitooligossacarídeos previamente tratados com
quitinase
Tempo de
desacetilação (h)
Quitina não tratada com quitinase
liberação de amina (nmol)
Quitina Hidrolisada por quitinase
Liberação de amina (nmol)
1
3,6
174,7
2 23,1 219,4
Um miligrama de quitina de camarão foi submetido à desacetilacão pela quitina desacetilase purificada, com ou sem tratamento prévio de quitinase (a quitina foi incubada com 0,6U de quitinase por 50 minutos a 42ºC em tampão acetato de sódio 50mM pH 3,0). Quitina desacetilase purificada foi utilizada em cada ensaio, o qual foi realizado em um volume de 0,15 μL de tampão 25mM Tris-HCl em pH 8,0. Após 1h e 2h a 50°C, a reação foi paralisada por aquecimento a 100°C antes da determinação de aminas. Liberação de aminas livres pela atividade da quitina desacetilase foi avaliada usando o método o-phtaldeyde.
23
5. CONCLUSÕES
Utilizando os parâmetros enzimáticos determinados pela preparação purificada de
quitinase, a quitina de camarão foi tratada e foram obtidos resultados que incentivam um
pré-tratamento com quitinase antes da desacetilação pela quitina desacetilase
recombinante. Sabe-se que as interações entre as moléculas da quitina cristalina de
camarão são fortes o que dificulta o acesso da enzima desacetilase recombinante aos
grupos acetil do quitooligossacarídeo. Um pré-tratamento para destruir a estrutura
cristalina da quitina antes da reação de desacetilação parece ser desejável para melhorar o
grau de desacetilação e produzir novos polímeros e oligômeros de quitosana.
A formação de oligômeros de diferentes tamanhos parece facilitar a ação da
proteína Cda2p. Foram obtidos quitosanas com nível de desacetilação de 48,5 vezes
superiores quando a quitina é submetida a um tratamento prévio com a preparação de
quitinase antes de sofrer a ação da quitina desacetilase por uma hora, obtendo-se 174,7
nmols de aminas livres.
Com estes resultados pode-se afirmar que o uso da preparação da quitinase
aumentaria não só a eficiência da desacetilação, como diminuiria o tempo necessário para a
desacetilação, aperfeiçoando o processo de produção de oligômeros de quitosana.
Estes resultados preliminares servirão para melhorar o método de purificação das
quitinases de uvas em próximos trabalhos e identificar as classes presentes na uva para
utilizá-las no campo da bioconversão. O consumo de camarões nos países costeiros é feito
em grande escala, o que provoca um aumento do nível de rejeitos da indústria pesqueira. A
produção de quitosanas com massas moleculares e níveis de desacetilação controlados a
partir destes rejeitos, seria de grande interesse para diferentes segmentos industriais:
alimentício, farmacêutico, biomédico, etc.
O aperfeiçoamento deste processo enzimático baseado na análise da estrutura
molecular das quitosanas obtidas é necessário e desejável, porque a prévia hidrólise do
substrato aumenta a eficiência da desacetilação e o tempo da reação. Também permite a
produção de produtos com níveis de desacetilação controlados e evita a produção de
subprodutos indesejáveis. Estas características da produção de quitooligossacarídeos
servirão para que os produtos sejam utilizados nas diferentes finalidades da quitosana,
como produtos seguros para a utilização biomédica.
24
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