Relatórios técnicosSoft Tissues: Pé e Bisso

2013

GT343Controle do mexilhão-dourado:Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas.

III. Caracterização físico-química

(página deixada em branco intencionalmente)

SOFT TISSUES: PÉ E BISSO

belo HoriZonte, 11 de noVembro de 2013

Este documento constitui um conjunto com três relatórios técnicos sobre o conjunto de tecidos moles do mexilhão-dourado, referentes ao Projeto “GT343 – Controle do Mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas”, realizada durante os anos de 2012 e 2013.

relatÓrioS tÉcnicoS

3

Relatório técnicoSoft Tissues

2013

Através de uma rede que conecta empresas

e o governo, sob a liderança da Cemig,

o Centro de Bioengenharia de Espécies

Invasoras de Hidrelétricas busca soluções para

amenizar os impactos ecológicos, industriais e

econômicos causados por espécies invasoras. A

proliferação descontrolada destes organismos

acaba eliminando outras espécies nativas

e comprometendo atividades humanas que

dependem de recursos naturais, como agricultura,

pecuária e geração de energia hidrelétrica.

Por que o CBEIH foi criado?

A proliferação descontrolada destes organismos

acaba eliminando outras espécies nativas e com-

prometendo atividades humanas que dependem

de recursos naturais, como agricultura, pecuária e

geração de energia hidrelétrica.

Como o CBEIH funciona?

Atuando nas frentes de Bioengenharia, Modela-

gem e Monitoramento Ambiental, o CBEIH tem

por objetivo amenizar e combater os impactos

ecológicos, industriais e econômicos causados por

espécies invasoras.

Quem são os parceiros do CBEIH?

O CBEIH é o resultado de uma união entre o CETEC

e a Cemig, com a gestão financeira da Fundep.

Av. José Cândido da Silveira, 2000 Horto - Belo Horizonte (MG)

www.cbeih.org / contato@cbeih.org

centro de bioengenHaria de eSpÉcieS

inVaSoraS de HidrelÉtricaS (cbeiH)

4

Fig. A

Diagrama das áreas de atuação do CBEIH. Para saber mais, acesse www.cbeih.org.

Fig. B

Mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei) aderido ao substrato natural.

Esta espécie de molusco bivalve é invasora nos ecossistemas brasileiros e é causador de di-

versos problemas de ordem ecológica, econômica e social e tornou-se especialmente danoso

para o funcionamento das hidrelétricas.

B

A

UFMG | CENTRO DEMICROSCOPIA

LABORATÓRIO

MICROSCOPIA

PREVENÇÃO ECONTENÇÃO

CONTROLE EERRADICAÇÃO

CULTIVO DEMEXILHÕESCOLETA EM

CAMPO

EXPERIMENTOS

CONHECERESPÉCIE

bioengenharia

modelagem monitoramento

ÁREASDE RISCO

UHECEMIG

DIVULGAÇÃOCIENTÍFICA

CONVERGIRPESQUISADORES

MODELOS DEDISTRIBUIÇÃO

ÁREASINFESTADAS

comunicaçãocientífica

base colaborativade dados

WEBSITE

O mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei), molusco bivalve da família Mytilidae, é originário dos dois maiores

rios da China, o Yantsé e o Pearl. Introduzido no Japão e em Hong Kong, foi disseminado por grande parte

do sudeste asiático. Possui características de colonizador invasivo bem sucedido: curto período de vida,

crescimento acelerado, altas taxas de fecundidade e ampla tolerância fisiológica aos fatores abióticos.

Sua introdução no continente sul americano se deu provavelmente na água de lastro de navios cargueiros.

Observado inicialmente na Argentina em 1991 (Pastorino et al 1993), entra no Brasil pelo rio Paraguai, na

região do Pantanal, em 1998 (Oliveira et al 2003). Segundo Barbosa (2009), a competição com as comunidades

nativas, a diminuição da turbidez da água, alterações na ciclagem de nutrientes, redução do fitoplâncton e o

aumento das macrófitas aquáticas foram alguns dos problemas que surgiram com a introdução do mexilhão-

dourado no ecossistema. Além desses fatores relacionados à ecologia, esse bivalve tem uma importância

econômica muito grande para o país. Ele obstrui tubulações e motores de usinas hidrelétricas, adere às

grades que permitem a passagem de água e reduz o fluxo da mesma. Os custos anuais para a remoção de

tais animais são muito elevados e cerca de R$ 10 milhões de reais já foram investidos em pesquisas pela

Cemig (PASINI, M., 2011).

introdUÇÃo

1

Fig. 1 - Mexilhão-dourado jovem (3mm) com o pé exposto (imagem obtida com Lupa óptica). O pé se revelou uma importante estrutura na constituição do bisso

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Inicialmente, o projeto propôs estudos compartimentalizados de cada estrutura componente do organismo

Limnoperna fortunei. Porém, na medida em que avançamos na compreensão destas estruturas, a relação

intrínseca entre estas se mostrou patente. Impossível compreender a construção do bisso como estrutura isolada;

sem relacioná-la à organização cito-histológica do pé e as propriedades morfo-fisiológicas deste, perde-se todo o

vasto universo de informações definidas pelo contexto. Da mesma forma, o pé conecta-se ao sistema muscular e

nervoso do mexilhão dourado, atuando não só como membro locomotor (como o nome “pé” sugere) mas também

como órgão táctil, cuja sensibilidade aos estímulos físicos e químicos funciona como interface sensória entre o

organismo e o meio ambiente. Estes estudos também revelaram o papel fundamental desta estrutura na formação

do bisso: através de um canal na porção ventral do pé encontra-se um canal por onde migram secreções mucosas

ali produzidas para que seja formado o bisso.

Assim, frente aos resultados parciais do projeto, e às mais recentes pesquisas em âmbito internacional, o CBEIH

optou por dividir o mexilhão dourado em duas grandes categorias de materiais:

• SOFT TISSUES: termo utilizado na Engenharia de Materiais e de Tecidos para designar aqueles

tecidos orgânicos tidos como “macios”, devido à sua constituição, organização e à acentuada

presença de água. No caso do mexilhão-dourado, soft tissues compreende pé (e naturalmente

o bisso), tecido muscular, nervoso, brânquias, gônadas, glândulas, tecidos de armazenamento e

metabolismo, etc.

• HARD TISSUES: como esperado, abrange aqueles tecidos cuja composição se dá,

majoritariamente, por componentes biomineralizados, como fosfato de cálcio, carbonato de

cálcio, derivados do silício, do ferro, etc. No mexilhão-dourado, essa categoria é representada

pela concha, composta quase exclusivamente por polimorfos de carbonato de cálcio (calcita e

aragonita), organizados em camadas com diferentes organizações arquitetônicas. Entretanto,

é importante ressaltar, que mesmo dentro da categoria hard tissues, encontramos, em

porcentagens pequenas (1 a 5%) matriz orgânica, composta principalmente por água (na forma

de géis) e proteínas. A matriz orgânica atua como scaffold, onde a matriz mineral é depositada

por meio de processos celulares e físico-químicos.

A importância deste estudo reside no fato de que compreendendo a relação e a atuação das estruturas, estudos

posteriores podem buscar estratégias efetivas para controlar processos como o de adesão, e interromper o

biofouling por L. fortunei.

7

FormaÇÃo e conStitUiÇÃo do biSSo

2

Fig. 2 - Filamentos de bisso observados através de microscopia óptica.

Os membros da família Mytilidae são capazes de secretar uma estrutura chamada bisso, estrutura de

fixação formada por um apêndice muscular conhecido como pé (BRAZEE e CARRINGTON, 2006).

Dentre várias possibilidades, o processo de formação do bisso mais bem aceito, foi proposto, inicialmente,

por Brown, em 1952, para o mexilhão Mytilus edulis. Porém, avanços na Ciência dos Materiais, somados

auma compreensão aguçada dos mercanismos biológicos, proporcionam um ponto de vista inovador, onde

os processo são observados e inferidos no contexto ambiental e orgânico. As estruturas fazem parte de um

todo, e funcionam em consonância neste; uma ótica reducionista limitaria a apreensão desse todo.

Percebemos, hoje, que a produção do bisso é um processo complexo, onde processos menores acontecem

simultaneamente em locais distintos do pé. E que esses processos menores também são desencadeados

em etapas, reguladas por mecanismos físicos (tensão superficial, diferença entre densidades, polaridade) e

químicos (ação enzimática, polimerização, oxi-redução, etc.).

8

O bisso é um conjunto de polímeros secretados pelas glândulas do pé, e pode ser divido em três partes:

uma raiz fibrosa ligada aos músculos retratores do bisso; uma haste que se extende da raiz, composta por

bainhas sobrepostas; emaranhados fibrosos que se projetam individualmente de cada bainha. Os fios de

bisso, por sua vez, são produzidos na canaleta ventral do órgão podal do mexilhão. Eles são compostos

por um eixo interior flexível de colágeno revestido por uma proteína polifenólica curada e endurecida,

que compõe a cutícula bissal. Acredita-se que a proteína em questão envolva um processo de quinona-

tanagem com uma enzima catecol oxidase específica. O tipo proteico depende do gênero e da espécie

do animal, por exemplo, a Mefp-1 (Mytilus edulis foot protein-1) para o mexilhão-azul, Mytilus edulis,

e a Lffp-1 (Limnoperna fortunei foot protein-1) para o mexilhão dourado Limnoperna fortunei (BROWN,

1952; SILVERMAN, ROBERTO, 2007). Todo o conjunto é coberto por uma cutícula polimérica que evita a

degradação por fungos e bactérias. A adesão entre o bisso e o substrato se dá em escala nanométrica, por

interações do tipo capilaridade e forças de van der Waals (MEYERS, 2009), permitindo que o mexilhão se

fixe em praticamente qualquer substrato sólido, de pedras, troncos e conchas de outros moluscos a cascos

de barco, redes de pesca e placas de vidro.

Amygdalum (pearly-mussels) (a)

Arcuatula (bag-mussels) (b)

Austromytilus (beaked-mussels) (c)

Brachidontes (mussels) (d)

Gibbomodiola (horse-mussels) (e)

Gregariella (mussels) (f)

Limnoperna (mussels) (g-i)

Modiolus (horse-mussels) (j)

Musculus (mussels) (k-l)

Mytilus (mussels) (m)

algUnS gÊneroS de molUScoS pertencenteS

À FamÍlia mYtilidae

4

3

Fig. 4 - Alguns gêneros de moluscos da família Mytilidae.

FONTE: www.molluscsoftasmania.net / Copyright Simon Grove

Fig. 3 - Mexilhão-azul Mytilus edulis

FONTE: www.wikipedia.com.br

9

50 µm

32Fig. 32

Cutícula do bisso do mexilhão-dourado (MEV, 5000X)

Unidade iii

Caracterização Físico-Química

ObjetivO geral

• Análise das propriedades térmicas do bisso do molusco bivalve

Limnoperna fortunei por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).

ObjetivOs específicOs

• Desenvolver protocolo para a caracterização das fibras e da placa

adesiva do bisso por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).

• Caracterizar as mudanças de fase como a temperatura de transição

vítrea (Tg) e de desnaturação das fibras protéicas (Td) do bisso de

Limnoperna fortunei.

• Avaliar a alteração das propriedades mecânicas e adesivas do bisso

após o tratamento com diferentes agentes químicos e físicos.

obJetiVoS

Análise térmica é um termo que abrange um grupo de técnicas na qual uma propriedade física ou química de

uma substância, ou de seus produtos de reação, é monitorada em função do tempo ou temperatura, enquanto

a temperatura da amostra, sob uma atmosfera específica, é submetida a uma programação controlada.

Existem vários tipos de analise térmica, entre eles está a DSC (Differential Scanning Calorimetry). A DSC

é uma ferramenta de grande valor para a caracterização de materiais e até de estruturas biológicas. Sua

utilização abrange análises de proteínas, enzimas, ácidos nucléicos, células como hemácias e até qualidade de

alimentos (GARCIA, 2004). A DSC é uma técnica muito utilizada no estudo de transição de fase (CARDOSO,

2004) no estudo da estabilidade de enzimas (ROGANA, 2003) e desnaturação de colágeno (MILES, 1995).

As medidas calorimétricas fornecem informações quantitativas e qualitativas sobre processos endotérmicos

e exotérmicos associados a variações químicas e físicas, ou a variações na capacidade calorífica. Com esta

técnica, a determinação da temperatura de desnaturação e de transição vítrea do bisso in natura ou após o

tratamento com agentes físico-químicos pode ser avaliada quanto ao tempo (t) e temperatura (T).

A desnaturação é entendida como qualquer modificação da estrutura da molécula, esta pode acontecer por

agentes físicos (calor, frio, tratamentos mecânicos, irradiação, etc.) e/ou químicos (ácidos, álcalis, metais,

solventes orgânicos, etc.) e pode ser considerada como uma transição irreversível que inclui um calor

endotérmico de desnaturação, quantificada mediante o uso da técnica aqui abordada. Como a desnaturação

das fibras de colágeno do bisso causa a perda de suas propriedades mecânicas e bioadesivas.

A determinação das condições dessa desnaturação juntamente com a análise do bisso e de suas características

morfométrica já realizadas, nos fornecerá parâmetros para procedimentos práticos aplicados com potencial de

redução ou até mesmo de impedimento de adesão do mexilhão em superfícies como plástico, vidros e metais.

calorimetria exploratÓria diFerencial

(dSc): análiSe tÉrmica

caracterizaçãO física dOs fiOs dO bissO e da placa adesiva

A caracterização física envolve ensaios de análise térmica das amostras de bisso e placa adesiva em

calorimetria diferencial de varredura (DSC). Os ensaios permitem a análise das mudanças no estado físico das

moléculas por meio das variações das propriedades termodinâmicas. Assim, a temperatura de desnaturação

(Td) e da transição vítrea (Tg) das proteínas das fibras do bisso e das moléculas da placa adesiva, in natura

e, em presença de agentes físicos (calor, frio, tratamentos mecânicos, irradiação) e químicos (ácidos, bases,

solventes orgânicos, variação do pH e força-iônica) podem ser medidas.

Também foram realizados testes em DSC separadamente para cada parte do bisso.

A seleção dos exemplares se deu de modo aleatório. Cada indivíduo teve seu complexo bissal retirado e foram

armazenados em microtubos (1,5mL) Essa preparação já havia sido realizada previamente. O ensaio, portanto,

não utilizou amostras de bisso frescas.

O procedimento preparatório para a Calorimetria Exploratoria Diferencial (Diamond DSC Perkin Elmer) se deu

com o auxílio de seringas, uma pinça de ponta fina curvada, pinças de pontas grossas retas, um bisturi e uma

placa de Petri. Isolou-se de todas as partes do bisso: raiz, haste, filamentos e placa adesiva. Cada uma das

partes separadas foi armazenada em microtubos (1,5mL). Os exemplares de bisso inteiros, em boas condições,

mas não utilizados, foram armazenados em uma placa de Petri em água deionizada para uso em futuros

experimentos com o DSC. A refrigeração de todas as amostras foi feita em um refrigerador apropriado a 15°C.

Os filamentos bissais foram separados uns dos outros com o auxílio das seringas e os cortes realizados com o

bisturi. Após a remoção dos filamentos da haste, os mesmos foram seccionados em extremidades proximais

(próximas da haste) e distais (perto das placas adesivas) e armazenados em microtubos (1,5mL) separados,

com água deionizada.

Os procedimentos acima descritos foram feitos sob um esteromicroscópio óptico Motic e imagens produzidas

a partir do software Motic 2.0. Diferenças qualitativas na espessura, na coloração e no arranjo das raízes, das

hastes, dos filamentos bissais e das placas adesivas foram avaliadas. O modo de inserção de tais filamentos na

haste também foi estudado.

materiaiS e mÉtodoS para materiaiS

calorimetria exploratoria diFerencial

(diamond dSc perkin elmer)

reSUltadoS

O termograma do bisso do mexilhão dourado, sem tratamento prévio, está apresentado no Gráfico 1. Pode-se

observar na curva a ocorrência de uma endotermia com inflexão no início do pico. A endotermia está associada

à desnaturação das fibrilas de colágeno do bisso, com temperatura de desnaturação (Td) de 52,12ºC e entalpia

de transformação (DHd) de 576,7 J/g. Cabe mencionar que os valores determinados foram para amostra de

bisso úmido, valores diferentes são esperados para análises realizadas considerando somente o peso seco do

bisso.

Em experimentos de análise térmica com o tratamento prévio com diferentes agentes físicos e químicos, à

alteração dos valores de calor endotérmico de desnaturação do bisso previamente tratado pode ser quantificado.

A alteração da estrutura molecular do bisso causa a perda de suas propriedades mecânicas e bioadesivas,

portanto, a determinação das condições dessa desnaturação, nos fornecerá parâmetros para procedimentos

práticos, com potencial de redução ou até mesmo de impedimento de adesão do mexilhão dourado.

A temperatura (Td) e entalpia (DHd) de desnaturação, foram consideradas como a temperatura onde ocorreu o

pico e a área sobre a endotermia, respectivamente. Os valores foram calculados com o emprego do software

original do equipamento.

Gráfico 1 - Termograma do bisso do mexilhão dourado (L. fortunei) sem tratamento prévio.

cOrrida 2: Hastes

No dia 17 de julho de 2012 foi realizado o primeiro ensaio com a haste do complexo bissal de L. fortunei. A

amostra ficou alguns minutos à temperatura ambiente antes do ensaio para a evaporação da água de sua

estrutura. Posteriormente, ela (4,17mg) foi alocada em cadinhos de aço inox com vedação em rosca (299,97mg).

O programa escolhido variou de 10˚C a 150˚C. Após a corrida, o total obtido foi de 625,48mg. O cadinho de

referência utilizado no processo, incluindo as tampas de vedação do mesmo, apresentaram massa de 632,74mg.

No Gráfico 2, na análise térmica das hastes do mexilhão dourado, obteve-se um pico endotérmico significativo

entre 100°C e 150°C aproximadamente para uma amostra de 4,17mg de amostra. Kittur et al. (2002) conseguiu

resultados semelhantes em seus estudos com polissacarídeos. Nas análises dos derivados carboximetilados

da quitina/quitosana amostras com um mínimo de 2,0mg foram necessárias para detectar esse evento. Ele

atribuiu esse pico como sendo a evaporação da água. Isso é condizente com os resultados gerados aqui, já que

a água da amostra provavelmente não foi removida totalmente por evaporação natural.

E importante notar que o equipamento da Perkin Elmer não realiza análises termogravimetricas associadas e os

picos provenientes pelo calorimetro da marca indica os picos endotermicos para cima, ao contrario da maioria

dos equipamentos de DSC, por exemplo, os da Shimadzu.

Gráfico 2 - Termograma da haste do bisso do mexilhão dourado (L. fortunei) sem tratamento prévio.

cOrrida 3: raízes

Amostras com massa de 2,90mg foram obtidas e colocadas sobre cadinhos de aço inox com vedação em rosca

(288,93mg). A amostra total, antes da corrida, foi de 623,44mg e após a mesma, 620,95mg.

Novamente, um grande pico endotérmico foi gerado no intervalo aproximado de 100°C-150°C, podendo

ser devido à evaporação da água. Contudo, a amostra apresentava 2,90mg, o que também pode indicar a

transformação química de algum outro material.

As pequenas transições endotérmicas podem ser ruídos presentes na amostra. Em outras palavras, fatores não

relacionados à análise que por ventura interferiram e foram expressos no gráfico.

Segundo a informação verbal concedida pela Profª Dra. Maria Irene Yoshida do Departamento de Química da

Universidade Federal de Minas Gerais em avaliação do presente trabalho, elas também podem ser pequenas

frações de água que, aos poucos, foram sendo evaporadas por poros presentes nas raízes.

Gráfico 3 - Termograma da raíz do bisso do mexilhão dourado (L. fortunei) sem tratamento prévio.

conclUSÕeS

A análise dos resultados, contagem e mensuração do diâmetro dos fios analisados, anteriormente realizadas

permitiram a caracterização morfométrica parcial do bisso de Limnoperna fortunei. Foi possível observar

as diferenças entre comprimento e tamanho de cada fio estudado, bem como sua morfologia. Já a análise

térmica pelo DSC pode contribuir para entender os mecanismos de adesão do Limnoperna fortunei a diferentes

superfícies e resolver problemas relacionados aos impactos ambientais e econômicos. A análise térmica elucida

o comportamento molecular do bisso em função da temperatura, e auxilia na compreensão da sua composição,

fornecendo conceitos chaves imprescindíveis para a obtenção de novos materiais, de interesse biomédico e de

engenharia.

Cabe salientar que estudos complementares continuam sendo realizados, a fim de elucidar dúvidas levantadas

nos testes acima citados. Umas das linhas busca, por exemplo, compreender o processo de cura dos polímeros

constituintes do bisso, a cronologia de liberação das diferentes enzimas e o desenvolvimento estrutural das

diferentes partes do conjunto bissal.

50

reFerÊnciaS bibliográFicaS

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51

Centro de Bioengenharia de Espécies

Invasoras de Hidrelétricas | CBEIH.org

Equipe CBEIH

Expediente

Endereço

Av. José Cândido da Silveira, 2000

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Web: www.cbeih.org / contato@cbeih.org

Coordenador

Antônio Valadão Cardoso

Pesquisadores

Antônio Valadão Cardoso

Arnaldo Nakamura Filho

Arthur Corrêa de Almeida

Fabiano Alcísio e Silva

Gabriela Rabelo Andrade

Hélen Regina Mota

Hernan Roberto Espinoza Riera

Mônica de Cássia Souza Campos

Estagiários de Iniciação Científica

Anna Carolina Guañabens

Frederico Magalhães Vieira

Gabriel Cardoso Salgado

João Locke Ferreira De Araujo

Vinicius Sergio Rodrigues Diniz

Técnico de Laboratório

Kelly Carneiro de Souza Lima

Revisão: Arthur Corrêa de Almeida

Design Gráfico: Gabriela Rabelo Andrade

Data: Novembro de 2012

crÉditoS

Relatório técnicoSoft Tissues

2013

Piscicultura entre as UHEs Igarapava e Jaguara (MG)

Relatórios Técnicos 2013: Soft Tissues

gt343: controle do Mexilhão-dourado:

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