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Relatório deAdesão2014GT343Controle do Mexilhão-dourado:Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas, realizado em Julho de 2011

(PÁGINA DEIXADA EM BRANCO INTENCIONALMENTE)

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BELO HORIZONTE, MARÇO DE 2014

Este documento apresenta uma investigação de superfíicies naturais com propriedades antiincrustantes que possam direcionar à criação de novos produtos antibiofouling para prevenir a adesão do mexilhão dourado.

RELATÓRIO DE ADESÃO

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Relatório deAdesão2014

REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 INTRODUÇÃO

O mexilhão dourado é uma espécie invasora capaz de produzir alterações relevantes nos sistemas hídricos

naturais ou artificiais que invade. São notáveis os impactos econômicos provocados pela espécie, que

frequentemente obstrui tubulações de captação de água, grades e sistemas de arrefecimento de usinas

hidrelétricas e tanques-rede de pisciculturas. Esses fatores decorrem do comportamento gregário do

animal, intensificados pela alta capacidade adesiva dos pés e dos bissos produzidos pela espécie. No Brasil,

o tratamento contra incrustação do mexilhão dourado, representa um custo de milhões de reais: somente

em 3 usinas hidrelétricas em Minas Gerais o custo anual com tratamento químico é de R$1.494.000,00

(CEMIG, 2014).

Estudos de outras espécies de bivalves fixadores como os mexilhões Mytilus edulis (BROWN, 1952), Perna

viridis (JIANG et al., 2012), Septifer virgatus (SEED e RICHARDSON, 1999) e Tegillarca granosa (LEE et al.,

2012) demonstram que o pé destes animais possui notada importância no processo de fixação, estando

presente desde a fase larval e sendo sua primeira estrutura de adesão aos substratos. Diversas pesquisas

demonstram também a função das glândulas presentes no pé na formação de proteínas altamente adesivas

envolvidas na produção do bisso.

O bisso é um complexo extracelular de natureza proteica associado à fixação de algumas espécies de

bivalves, tal como ocorre no mexilhão dourado. Essas estruturas apresentam uma raiz, uma haste com

uma série de filamentos e placas adesivas nas extremidades distais de cada um deles. Externamente, são

todos revestidos por uma cutícula protetora (HOLTEN-ANDERSEN et al., 2004; BRAZEE e CARRINGTON,

2006).

Os filamentos e as placas adesivas são regiões de suma importância para a adesão. Os primeiros são

formados por uma série de feixes fibrosos de natureza colágena e revestidos externamente por uma

cutícula rica em DOPA (L-β-3,4-diidroxifenil-α-alanina). Sabe-se que tais estruturas também contêm metais,

por exemplo, o ferro, em sua composição (COOMBS; KELLER, 1981; OHKAWA et al., 2001; HOLTEN-

ANDERSEN et al., 2004; HOLTEN-ANDERSEN et al., 2009). As placas adesivas têm uma interface com o

substrato; são achatadas e compostas por proteínas adesivas de natureza polifenólica (SILVERMAN;

ROBERTO, 2007).

O mexilhão dourado, após seu estágio de larva, se adere às grades de tomada de água e às tubulações das

usinas hidrelétricas. Tintas antiincrustantes a base de tributilestanho, foram utilizadas com o objetivo de

controlar o crescimento do microbiofilme - primeira camada de incrustação nas superfícies - das tubulações

de hidrelétricas. Porém, rapidamente as tintas se mostraram prejudiciais, por conterem substâncias tóxicas

e nocivas aos microrganismos aquáticos, interferindo na cadeia alimentar (ARAUJO, 2005). Atualmente, a

pesquisa referente a superfícies está focada no desenvolvimento de tecnologias não poluentes, que sejam

facilmente fabricadas em grande escala.

Estudos têm mostrado que o crescimento do biofilme está relacionado com a molhabilidade das superfícies,

assim, se pudermos controlar o quanto um líquido molha uma superfície, poderemos influenciar a

colonização de superfícies por microrganismos, primeiros responsáveis deste fenômeno (WANG Y, 2006).

O trabalho desenvolvido no Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas- CBEIH, visa

contribuir com o conhecimento de antiincrustação a partir do estudo de mecanismos naturais de

hidrofobicidade e autolimpeza presentes nas superfícies de algumas plantas. Tomou-se como estudo de

caso três espécies de plantas: uma planta aquática, Salvinia molesta, que possui características

surpreendentes de molhabilidade devido, entre outras propriedades, à existência de bolsões de ar retidos

na microestrutura que impossibilita a interação de gotas de água com a superfície da planta; e as espécies

Colocasia esculenta (inhame roxo), e Nelumbo nucifera (lótus sagrada) que possuem propriedades

autolimpantes devido (entre outras caracterísiticas) à existência de cristais de cera que recobrem suas

superfícies.

1.2 0BJETIVO GERAL Y ESPECÍFICO

Objetivo Geral:

Investigar superfíicies naturais com propriedades antiincrustantes que possam direcionar à criação de

novos produtos antibiofouling para prevenir a adesão do mexilhão dourado.

Objetivos Específicos:

1) Investigar os mecanismo de adesão do mexilhão-dourado;

2) Caracterizar três espécies vegetais - Salvinia molesta, Colocasia esculenta e Nelumbo nucifera -

que apresentam características superhidrofóbicas e mecanismos naturais de antiincrustação;

3) Relacionar a adesão do mexilhão dourado com a molhabilidade das superficies;

4) Demostrar como superficies superhidrofóbicas com baixa energia de superfície, evita a incrustação

do mexilhão-dourado.

1.3 MECANISMOS DE ADESÃO DO MEXILHÃO-DOURADO

Estudos microestruturais das superfícies do pé e do bisso do molusco Limnoperna fortunei foram realizados

no Centro de Microscopia da Universidade Federal de Minas Gerais (CM-UFMG) e nas dependências do

CBEIH. O principal objetivo é investigar os mecanismos de fixação do mexilhão dourado, conhecimento

essencial para o desenvolvimento de técnicas mais eficazes e ecológicas, sejam físicas ou químicas, de

controle de incrustações. A pesquisa de materiais e estruturas biológicas abre caminho também para o

desenvolvimento de soluções biomiméticas, como de superfícies adesivas secas, e na área de biomateriais,

no desenvolvimento de colas e adesivos biocompatíveis e biodegradáveis para tecidos vivos (ver Anexo I).

Pé e bisso: uma abordagem microestrutural

Com as imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) obtidas a partir de toda a superfície do pé

do animal, foi possível observar que não somente o dorso, mas todo o pé é recoberto por cílios, os quais

estão intimamente envolvidos com o processo de fixação do mexilhão. Por meio do método de preparo por

criofratura foram produzidas imagens nas quais é possível observar a conexão entre a face externa

(ciliada) e a parte interna do pé.

A parte interna do pé é de aparência compacta, e apresenta semelhanças morfológicas com a parte

externa, que apresenta aspecto fibroso. Foi identificada a presença de uma canaleta no centro da região

ventral, delimitada por um tecido epitelial ciliar e com secreções das glândulas ao longo de sua extensão,

confirmando a função de tal sulco na migração de produtos adesivos para a formação dos filamentos de

bisso (COTÉ, 1994; WAITE et al.; EBLE et al., 2001).

Pode-se notar diferenças na espessura dos filamentos e placas adesivas e a presença de pequenas

rugosidades na face ventral. Além disso, o modo de inserção dos filamentos em seu eixo principal, a haste,

também é visível.

Figura 1.1 - (A) Ilustração de um mexilhão dourado destacando o pé do indivíduo. (B) MEV da região

em que o pé se funde com a massa visceral, apresentando uma baixa densidade de tufos ciliares (C)

Imagem de MEV na qual é possível observar o pé relaxado e alguns filamentos bisso esmagadas

saindo da glândula orifício do bisso na base do pé. (D) Detalhe da porção ventral do pé coberto de

cílios. (E) Detalhe da superfície coberta com cílios. (F) uma imagem panorâmica do pé de L. fortunei

destacando o sulco na região ventral. (G) Imagem de MEV do fragmento do pé obtidos a partir da

técnica de crio-fratura. (H) Imagens de Mev do bisso e placas adesivas.

Figura 1.2 - Durante a análise das imagens pode-se perceber que os cílios do pé de L. fortunei têm

uma forma peculiar de estreitamento na porção distal. Estas características têm sido encontrados em

todas as amostras. Dimensões médias dos cílios obtidos utilizando o software ImageJ.

Figura 1.3 - Diagrama resumindo a anatomia do mexilhão dourado no qual pode ser visto (A) um

mexilhão dourado adulto com as valvas abertas, (B) um dos destaques da região do pé do molusco

em sua parte (C) ventral (D) e dorsal. (E) O orifício da glândula do bisso situada na base do pé e (F)

um mexilhão dourado jovem vivo com o seu pé exposta, observado com estereomicroscopia.

1.4 MOLHABILIDADE DE SUPERFÍCIES.

A molhabilidade de um material é a relação que existe entre algum líquido e a superfície de um sólido, este

fenômeno é crucial em vários processos tecnológicos de fabricação (Figura 1.4). Controlar o nível de

molhabilidade dos sólidos é um dos pontos de maior relevância na engenharia de superfícies.

Figura 1.4 - Importância do fenómeno de molhabilidade em varias áreas. Adaptado de DE GENNES,

et al., 2004

Para entender como funciona o efeito de molhabilidade numa superfície, é necessário compreender a

interação entre líquido-sólido, assim como as propriedades de cada um deles. Nos líquidos, átomos e

moléculas se movimentam livremente buscando ocupar um lugar onde as forças de atração e repulsão se

encontrem em equilíbrio (posição de menor energia livre). Por outro lado, as partículas da superfície no

líquido possuem apenas forças direcionadas para o interior do mesmo (Figura 1.8), motivo pelo qual as

superfícies são regiões de maior energia (CABELLO-RUIZ, J. M., 2009). A Tensão Superficial (TS) é a força

gerada pela superfície para minimizar o número de ligações de interação, além da sua área de superfície

livre. Isto pode ser facilmente observado numa gota de água esférica, que possui o mesmo volume com a

menor área superficial.

Figura 1.5 - Comportamento dos átomos no interior e na superfície de um líquido. Adaptado de SHU-

HAU H. et al., 2011.

Quando colocamos uma gota de água num vidro limpo observamos que se espalha completamente na

superfície, por outro lado se colocamos a mesma gota na superfície de um polímero (ex. poliestireno)

observamos que a gota conserva a forma e se mantem em repouso no material. Podemos concluir que

existem dois regimes de molhabilidade no exemplo anterior, sendo que o parâmetro que os distingue é

chamado de parâmetro de espalhamento (S), que mede a diferença entre a energia E de superfície (por

unidade de área) quando o substrato está seco e molhado:

S = [Esubstrato]seco - [Esubstrato]molhado

ou

S = γSV - (γSL + γLV)

Onde:

γSV, γSL e γLV são as três tensões interfaciais entre sólido/vapor, sólido/líquido e líquido/vapor, que regem a

molhabilidade dos sólidos.

Quando o fator S>0, o líquido tende a se espalhar no sólido por completo, enquanto que para S<0, o líquido

molha parcialmente o sólido e forma um esfera (gota) com um ângulo entre o sólido e o líquido, chamado

ângulo de contato θc.

Figura 1.6 - Tipos de molhabilidade de uma gota em uma superfície plana.

O ângulo de contato θc é definido como o ângulo que se forma da tangente do líquido com a superfície do

sólido, no ponto de contato entre as três interfases: solido-líquido-vapor, que determinam o valor do

mesmo (Figura 1.7).

Figura 1.7 - Esquema do ângulo de contato e tensões interfaciais entre líquido e substrato.

O ângulo de contato é geralmente utilizado para a caracterização quantitativa do fenômeno de molhamento

nos sólidos, pois permite observar como uma gota de qualquer fluido se espalha ou não no substrato,

assim, quando o valor do ângulo é 0º≤ θc ≤ 90º o líquido tende a se espalhar na superfície, chamada de

hidrofílica (ex. vidro, cerâmicas, fibras). Por outro lado, se o ângulo possui um valor de 90º≤ θc ≤ 180º o

líquido tende a se encolher e a superfície se torna hidrofóbica (ex. polímeros, resinas, tintas). Para ângulos

maiores do que 150º as superfícies recebem o nome de superhidrofóbicas (ex. folha de lótus, wafers de

sílica).

Só

lid

o

PEBD1 PS2 PTFE3 Cera de

Carnaúba4

Papel

Alumínio5 Al2O3

6 Vidro7

Gra

us

º

60º- 90º 83º-90º 120º 107º-120º 70º-110º 90º 51º - 65º

Tabela 1.1 - Ângulo de contato de alguns sólidos comuns. Fonte: 1(SOON H. K., 2007); 2(KONDYURIN, 2006); 3(FABRICO, 2013); 4(SHIN-ETSU, 2012); 5(MINYI P., 2013); 6(BERNARDIN, 1996); 7(FENGER K.,

2013).

Se considerarmos uma superfície sólida, plana, lisa e quimicamente homogênea, o ângulo de contato é

determinado pela equação de Young (Figura 1.8a):

cos !" = γSV- γSL / γLV

Onde pressupõe-se que exista um equilíbrio mecânico da gota que repousa sobre a superfície do sólido sob

a ação das tensões de superfícies sólido/vapor, sólido/líquido e líquido/sólido. A equação de Young se aplica

em superfícies lisas, porém a maioria das superfícies na natureza são rugosas. O primeiro a observar a

relação entre rugosidade de superfícies sólidas e ângulo de contato foi Wenzel em 1936 (GOULD, 1964),

descrito pela equação:

cos !" = !t !SV- !SL!!LV

Onde !t é o fator de rugosidade total definido como a relação da verdadeira área do sólido com a área

aparente ou projetada da superfícies do sólido:

!t=# á!"#!!"#$!á!"#!!"#$%&'('

Combinando então a equação de Young com a do Wenzel teremos que:

cos !" =!!t.# cos !" ! O modelo de Wenzel é utilizado quando a rugosidade da superfície é completamente preenchida pelo

líquido (Figura 1.8b); no entanto existem superfícies que possuem rugosidade em escalas micro ou

nanométricas, nestes casos o líquido não molha a superfície real do sólido, isto se deve a existência de

bolsões de ar presos entre a rugosidade (Figura 1.8c). O modelo que explica este fenómeno é o do Cassie-

Baxter, 1944, descrito pela equação:

cos !"# = f!. cos !" + f!. cos !"

Onde, !" é o ângulo de contato intrínseco da superfície original sem rugosidade e !" o ângulo formado

pela superfície com a camada de ar. f!!e!f!!!são as frações de área do sólido e do vapor na superfície,

respetivamente. Quando f! + f! = 1!!e !" = 180°, entende-se que a gota do líquido pousada sobre os

bolsões de ar é perfeitamente esférica, neste caso a equação anterior pode ser descrita (SHU-HAU HSU, et

al, 2011):

cos !"# = f!. (cos !" + 1)!!!1

Figura 1.8 - Esquema do ângulo de contato e tensões interfaciais entre líquido e substrato. Fonte: Adaptado de DE GENNES, et al., 2004.

Quando a gota de um líquido é colocada na superfície de um sólido, as moléculas passam para um estado

desfavorável de energia. Se as forças de coesão por molécula, no interior do líquido é de “F”, quando

colocada na superfície torna-se F/2, assim, a tensão superficial é a medida direta da perda de energia por

unidade de área e expressa nas unidades mN/m (millinewtons por metro). A tensão superficial nos líquidos

depende de suas ligações interatômicas. A água, por exemplo, possui ligações de hidrogênio (consideradas

ligações secundárias fortes) e sua tensão superficial é de aproximadamente de 72 mN/m, já o mercúrio que

possui forte coesão líquido-metal possui uma tensão superficial de 500 mN/m (DE GENNES, et al, 2004).

Líq

uid

o

Água Água (100ºC) Acetona Mercúrio Glicerol Etanol

TSγ

(mN

/m)

72 58 24 485 63 23

Tabela 1.2 - Tensão Superficial de alguns líquidos comuns ( 20ºC). Fonte: DE GENNES, et al., 2004.

Nos sólidos, a molhabilidade está relacionada com a energia de superfície. Se o sólido possui maior energia

que o líquido, este tende a se espalhar na superfície do sólido, caso contrario, se o sólido possuir menor

energia que o líquido, a tendência é que o líquido não molhe a superfície do sólido. Temos como exemplo o

vidro que é um material hidrofílico devido à alta tensão superficial crítica (γC) próxima de 250 mN/m,

porém é possível diminuir a tensão superficial do vidro se o revestimos com uma camada molecular

hidrofóbica do tipo –(CH2)– ou –(CF2)– , que pode tornar a superfície de baixa energia, próximo a ordem de

20 mN/m, similar ao Teflon® (PTFE), um polímero fluoretado.

Só

lid

o

Nylon1 PS2 PTFE PEBD Cera Papel Alumínio Al2O3 Vidro

TS

(mN

/m)

72 40 19 70 30-60 47,9 169 250-500

Tabela 1.3 - Tensão Superficial de alguns sólidos comuns. Fonte: DE GENNES, et al., 2004.

1.5 ABORDAGEM DE MECANISMOS BIOINSPIRADOS DE ANTIINCRUSTAÇÃO.

Materiais na natureza possuem propriedades como superhidrofobicidade, auto-limpeza e antiincrustação.

Estas propriedades são de interesse industrial, para a criação de materiais que controlem o crescimento de

biofilme.

As estruturas presentes na superfície de algumas folhas e animais são complexas, e exibem hierarquia,

criando um equilíbrio entre os atributos físicos e químicos da superfície.

Como na maioria dos materiais da natureza, as superfícies biológicas se desenvolvem em diferentes

escalas, hierarquias e complexidades químicas. Um dos aspetos mais importantes das superfícies é a

relação entre morfologia, sinergia e composição química em diferentes escalas e hierarquicamente auto-

organizadas, isto proporciona diferentes interfaces multifuncionais com o meio, além de propriedades

autolimpantes, óticas, adesivas e mecânicas. Quase sempre estruturas com micro rugosidade ou piliformes

são responsáveis pelas propriedades hidrofóbicas ou hidrofílicas do material, assim superfícies biológicas

podem ser resumidas em três características principais (Figura 1.9).

Figura 1.9 - Principais características de superfícies biológicas hidrofóbicas.

A microestrutura da superfície pode formar rugosidades em diferentes escalas, aumentando as

características hidrofóbicas do material. A Flor de Lotus (Figura 1.10) é o exemplo mais emblemático desta

morfologia. A topografia da folha, formada por pequenas protuberâncias cobertas de cristais de cera,

permite que a gota não penetre por completo na superfície e se posicione no topo da estrutura, além disso,

a propriedade hidrofóbica da cera, contribui ainda mais para a repelência da água.

Figura 1.10 - Imagem e micrografia da superfície da flor de Lotus, Nelumbo nucifera. Fonte: KOCH K., 2011.

A sinergia da microestrutura pode se dar pela junção de componentes tanto intrínsecos como externos ao

material. Como por exemplo, a samanbaia aquática Salvinia Molesta, que possui em sua superfície

estruturas piliformes com propriedades hidrofóbicas em conjunto com o fenómeno de retenção de ar.

Ambas caracterisitcas com o mesmo objetivo: não permitir que gotas de água penetrem e molhem a

superfície da planta (Figura 1.11).

Figura 1.11 - Estrutura tipo “batedor de ovos” presente na superfície da folha da planta aquática Salvinia Molesta.

A hidrofobicidade química da superfície ocorre pela presença de diferentes polímeros formados por longas

cadeias de ácidos graxos que tem como função tonar as folhas impermeáveis à gases e à água. (SHU-HAU

H. et al., 2011). A investigação de superfícies com características de molhabilidade heterogêneas ultrapassa

o interesse do conhecimento da biologia, podendo inspirar a criação de novos materiais industrializados a

partir da natureza, como por exemplo, materiais com propriedades antibacterianas, ou materiais que

diminuam o atrito entre os barcos e a água.

Superfícies Biológicas Superhidrofóbicas

Com o objetivo de aprofundar no conhecimento de superfícies biológicas que possuem propriedades de

antiincrustação, foi realizado um estudo comparativo de três espécies de plantas com estas características.

(ver AnexoII). Apresentamos neste relatório os resultados da pesquisa:

Obtenção de amostras

As amostras para caracterização foram coletadas na cidade de Belo Horizonte, estado de Minas Gerais,

Brasil. Definiu-se três espécies de plantas que apresentam características similares na superfície das folhas,

mais especificamente, todas possuem folhas cobertas por ceras epicuticulares que proporcionam diferentes

propriedades de molhamento. Sendo as espécies listadas abaixo:

1. Salvinia molesta: samambaia aquática nativa do sudeste do Brasil, considerada uma problema em

vários países por sua reprodução extremamente rápida. Sua população pode dobrar em dois ou

três dias. A espécie analisada neste estudo foi doada pela pesquisadora Dr. Sylvia Therese Meyer,

coletada do viveiro do Instituto em Meio Ambiente do Centro de Tecnologia CETEC/ SENAI.

2. Colocasia Esculenta: popularmente conhecida como inhame roxo ou taro, foi doada pela Fundação

de Parques de Belo Horizonte e coletada no viveiro do Parque das Mangabeiras.

3. Nelumbo Nucifera (lótus): a espécie utilizada neste estudo foi cultivada a partir de sementes

importadas da Inglaterra, que foram semeadas em caixas d’água e mantidas sob cuidados

especiais devido a grande fragilidade desta espécie perante pragas.

Figura 1.12 - Espécies pesquisadas: 1.Salvinia Molesta; 2. Colocasia Esculenta; 3. Nelumbo Nucifera.

Caracter ização Morfológica

O estudo comparativo das três espécies de planta demonstra que todas as superfícies possuem

propriedades relacionadas com hidrofobicidade, devido principalmente a dois fatores: 1) ao crescimento de

ceras epicuticulares e, 2) à rugosidade na superfície da folha. Notamos que as espécies Colocasia Esculenta

e Nelumbo Nucifera possuem morfologias similares e estão em uma escala próxima, na ordem de mícrons.

Já na espécie Salvinia Molesta, a superfície apresenta estruturas numa escala milimétrica.

Espécie Salv ín ia Molesta

Os testes de microscopia ótica (MO) realizados com a planta aquática Salvínia Molesta demonstram que a

superfície desta espécie apresenta uma morfologia formada por estruturas piliformes em forma de

“batedor de ovos”, chamadas tricomas (Figura 1.13c) (BARTHLOTT, et al, 2011). Com este mecanismo, a

planta garante que o líquido não penetre e molhe sua superfície, preservando a folha de predadores como

bactérias e fungos que dependem de água para se reproduzirem. Mesmo com esta característica, a espécie

em questão não possui propriedade autolimpante, ao contrário das outras duas espécies descritas neste

trabalho. Os tricomas (Figura 1.13a) são estruturas multicelulares que se arranjam em quatro hastes

cobertas de cristais de cera, que se unem formando uma ponta (cabeça) de células mortas.

Figura 1.13 - Imagem de Microscópio Óptico da samambaia aquática Salvinia Molesta. (a) Vista de topo das pontas de células mortas. (b) Gota de água presa nas pontas hidrofílicas. (c) Gota de 7µl em repouso

na superfície dos tricomas.

No entanto, a geometria dos cílios não é suficiente para impedir a infiltração da água na folha da planta.

Cada cílio é coberto por ceras epicuticulates que garantem a impermeabilização da cutícula, e ainda, na

ponta de cada tricoma existe uma área de células mortas sem revestimento de cera, que apresenta uma

superfície lisa com características hidrofílicas. Com este mecanismo, a planta garante fisicamente que a

superfície se mantenha seca, pois entre as pontas hidrofílicas de cada cílio, a tensão superficial aumenta,

exigindo maior energia para a água ingressar nos espaço vazios (Figura 1.13b).

Porém, as caraterísticas antes mencionadas não garantem um efetivo anti-molhamento; tanto a Salvina Molesta, como as demais espécies analisadas possuem ainda uma camada de ar presa entre os cílios hidrofóbicos. Os bolsões de ar criam uma barreira contra a água, transformando a superfície da planta em um compósito formado por sólido/liquido e ar. Esta característica foi denominada “Efeito Salvinia” por BARTHLOTT em 2010 (Figura 1.14). Cabe destacar que a presença de câmaras de ar (aerênquimas) distribuídas nas raízes, caules e folhas da planta correspondem mais de 70% de seu volume.

(a)

(b)

(c)

Figura 1.14 - Esquema do “Efeito Salvínia”, compósito de interface sólido/líquido/ar. (a) Simulação do comportamento da água sem pontas hidrofílicas (b) Comportamento da água com pontas hidrofílicas,

demostra a tensão superficial criada entre os tricomas para impedir a entrada de água no bolsões de ar. Fonte: Adaptado de BARTHLOTT. et al., 2010

Os crescimento dos tricomas acontece da periferia para o centro da folha (figura 1.15a).

Consequentemente, a medida em que nos direcionamos para a borda da folha, observamos que existe um

adensamento maior de tricomas atrofiados (figura 1.15b). Este fato contribui para que a folha torne-se mais

hidrofílica nas bordas, onde há presença de pontas escuras. Fato importante para a flutuação da planta na

água, pois, mecanicamente a planta se mantém presa à tensão superficial da água, impedindo que a

mesma afunde, ainda que, sob efeitos do vento, chuva e/ou turbidez (Figura 1.15c).

Figura 1.15 - (a) e (b) Pontas hidrofílicas do perímetro da folha (c) Mecanismo de adesão à tensão superficial da água da planta Salvínia Molesta.

(a) (b)

O teste de microscopia ótica permite observar a interação entre água e superfície, porém para obter

detalhes da microestrutura da planta, foram realizados testes com o microscópio eletrônico de varredura

(MEV). Os resultados mostram em outra escala a morfológica de cada tricoma, assim como o recobrimento

de cristais de cera presentes na cutícula das plantas.

Na Figura 1.16 podemos observar que a folha da espécie Salvinia Molesta possui estrutura hierárquica

formada por: (a) uma superfície primária de biopolímero chamada cutícula, cuja função é proteger a planta

da perda de água; (b) estruturas tridimensionais em forma de hastes, na ordem de mícrons, que terminam

em uma forma similar a um “batedor de ovos”, que por sua vez terminam em pontas de células mortas

(pontas escuras) com características hidrofílicas; e (c) ceras epicuticulares, hidrofóbicas, que cobrem

aproximadamente 2% de toda a folha. Cada uma destas estruturas se organiza com a finalidade de permitir

que a planta estabilize a camada de ar presa entre cada cílio, garantindo as propriedades hidrofóbicas e

antiincrustantes da planta.

Figura 1.16 - Micrografias eletrônicas da folha de Salvinia Molesta. (a) Tricomas da superfície da folha, nota-se a cutícula levantada na base do tricoma. (b) Varredura do meio da superfície da folha para a

periferia. (c) Detalhe da base do tricoma. (d) Detalhe da borda da folha (tricomas truncados).

A cutícula é coberta por cristais de cera quimicamente auto-montados (self-assembly) em 3D, responsáveis

pelas propriedades hidrofóbicas da superfície. Estudos com difração de raio X (DRX) e ressonância

magnética nuclear (RNM) comprovaram a cristalinidade da cera e o crescimento em diferentes formatos

como plaquetas, varetas e túbulos (BARTHLOTT W. et al. 2000). No caso da espécie estudada, as ceras

possuem forma tubular, atingem aproximadamente 1µm de comprimento e cobrem praticamente toda a

superfície da folha (cutícula+tricoma), com exceção das terminações de cada cílio que apresenta um

superfície lisa e livre de cera (Figura 1.17).

Figura 1.17 - Micrografias eletrônicas da folha de Salvinia Molesta. Detalhe do crescimento de ceras epicuticulares e interface hidrofílico/hidrofóbica na ponta de cada tricoma.

Para comprovar a importância da cera como principal componente no comportamento de molhabilidade da

folha, realizamos o experimento de extração de cera. Como mostrado na Figura 4.6, a planta sem cera não

sem mantém na superfície da água e perde completamente as propriedade de flutuação, e por

consequência suas propriedades hidrofóbicas. Este teste nos permite concluir que a cera, além de proteger

a planta contra insetos e possíveis ataques de fungos e bactérias, é responsável pela estabilidade, flutuação

e reprodução da planta.

Colocasia esculenta e Nelumbo nucifera

Os resultados da caracterização morfológica das espécies Colocasia esculenta e Nelumbo nucifera

demostram que, apesar de possuírem formatos de folhas diferentes, elas possuem similares características

na microestrutura da superfície. Como na maioria das plantas, a superfície está formada por um

biopolímero (poliéster) chamado cutícula que, além de proteger a planta contra a perda de água, funciona

como elemento de estabilização mecânica da folha. A cutícula das duas espécies apresenta uma rugosidade

formada por várias protuberâncias (células da epiderme) poligonais convexas de 20 a 25µm

aproximadamente. E por sua vez, cada célula possui outra protuberância menor nas pontas chamadas de

“tipo mamilo” (like nipple) por Barthlott (1998), sendo que na espécie Nelumbo nucifera as protuberâncias

são maiores que na Colocasia esculenta. Também é importante ressaltar que a estrutura da espécie

Nelumbo nucifera está coberta por cristais de cera na forma de túbulos, enquanto a espécie Colocasia

esculenta possui cristais de cera na forma de plaquetas. Em ambas espécies a cera não está distribuída de

maneira uniforme ao logo da folha, apresentando maior densidade na parte superior de cada

protuberância.

A estrutura hierárquica da superfície em escala micrométrica, a combinação de propriedades químicas de

hidrofobicidade (ceras) e a formação de bolsões de ar presos na microestrutura, atribuem às superfície das

duas espécies altos níveis de hidrofobicidade, aumentando o ângulo de contato aparente para próximo de

150º. Este fenómeno é explicado pela lei de Cassie-Baxter

Realizando a análise comparativa entre a microestrutura hierárquica das duas espécies, observamos que

ambas apresentam os mesmos níveis hierárquicos. No primeiro nível, em escala milimétrica, as folhas

apresentam ondulações que desestabilizam as gotas de água presentes na superfície. No caso da espécie

Colocasia esculenta, por não ser uma planta aquática, as folhas ainda são inclinadas, facilitando o

deslocamento da água para fora da folha.

No segundo nível, em escala micrométrica, as duas espécies apresentam células de epiderme

protuberantes auto-organizadas ao longo da superfície, ainda que a geometria e o tamanho destas células

sejam diferentes nas duas espécies. As células da Colocasia esculenta apresentam forma mais

arrendondada com base maior e menor altura (Figura 1.18b), já as células da Nelumbo nucifera

apresentam forma mais alongada com menor tamanho na base e maior altura (Figura 1.19b). Outra

diferença fundamental para o molhamento de cada superfície é o formato das terminações “tipo mamilo”.

Na folha de Colocasia esculenta, podemos observar uma pequena protuberância no topo da estrutura

(Figura 1.18c), já na Nelumbo nucifera, estas protuberâncias são maiores e mais finas (Figura 1.19c),

fazendo com que nesta última, a gota de água repouse nos topos dos mamilos, resultando em menor área

de contato da gota com a superfície, aumentando consequentemente o ângulo de contato da interface com

o líquido.

Finalmente, no terceiro nível, pode se observar uma cobertura de ceras epicuticulares compostas pela

mistura de cadeias longas de hidrocarbonetos e seus derivados (BARTHLOTT, et al. 1998). A forma das

ceras se difere nas duas espécies: na Colocasia esculenta apresenta-se como plaquetas incrustadas na

cutícula (Figura 1.18e,f) e na Nelumbo nucifera apresenta-se como túbulos distribuídos em grande

quantidade ao longo da superfície (Figura 1.19f,g).

Figura 1.18 - Micrografias da espécie Colocasia esculenta (inhame roxo). (a) Superfície da folha vista pelo microscópio ótico. (b) Superfície da folha no MEV. (c) e (d) Células arredondadas que possuem pequenas pontas protuberantes. (e) e (f) Ceras epicuticulares em forma de plaquetas incrustadas ao

longo de toda a epiderme.

Figura 1.19 - Micrografias da espécie Nelumbo nucifera (lótus). (a) Superfície da folha vista pelo microscópio ótico. (b) Superfície da folha no MEV. (c) e (d) Células alongadas que possuem pontas

protuberantes em forma de mamilos. (e) e (f) Ceras epicuticulares em forma de túbulos incrustadas em grande quantidade ao longo de toda a epiderme.

A alta hidrofobicidade das folhas estudadas impede que as gotas permaneçam em repouso na superfície,

provocando o deslocamento das gotas de água para fora da superfície da folha, sempre que esta

apresentar uma leve inclinação. Este efeito, denominado “roll-off” (arrasto) (HAINES et al 1985), é essencial

como mecanismo de defesa para estas plantas, seja contra insetos, patologias superficiais ou crescimento

de biofilme, pois ao se deslocarem, as gotas arrastam consigo partículas existentes na superfície, fazendo

com que as folhas estejam em constante processo de autolimpeza (Figura 1.20).

Figura 1.20 - Efeito de “Roll-off “ na espécie Colocasia esculenta. Este efeito proporciona à planta propriedades de autolimpeza.

Grande parte dos estudos realizados sobre superhidrofobicidade de superfícies atribui grande importância

ao formato das protuberâncias da microestrutura, porém mediante a elaboração dos experimentos

realizados neste trabalho, conclui-se que além desta característica, também a escala e o formato dos

cristais de cera presentes na rugosidade contribuem para o aumento dos níveis de hidrofobicidade.

Isto explica o motivo pelo qual na espécie Colocasia esculenta, que possui maior escala de rugosidade e

menor altura dos mamilos, apresenta maiores valores de ângulos de contato. As ceras presentes nesta

espécie possuem o formato de plaquetas incrustadas na cutícula da folha. Estas plaquetas se auto-

organizam distantes umas das outras, realizando um nível de hierarquia bem definido na interface

cera/líquido. Por outra lado, na espécie Nelumbo nucifera, as ceras possuem formato de túbulos e não se

distribuem espaçadamente na superfície, chegando ao ponto dos túbulos de cera se fundirem e formar

grandes aglomerados que proporcionam maior área de contato com a água, diminuindo os níveis de

hidrofobicidade.

1.6 CONCLUSÕES

O mexilhão dourado se adere à superfícies mediante dois tipos de mecanismo, o primeiro é feito através da

estrutura do pé por meio de forças interatômicas de Van der Waals e o segundo através da estrutura bissal,

especificamente a placa adesiva por meio de proteínas adesivas de natureza polifenólica. No primeiro

mecanismo, o pé se adere com mais facilidade a substratos que apresentem crescimento de biofilme, já

que auxilia na adesão dos cílios presentes em toda a estrutura do pé do mexilhão. No segundo mecanismo

as proteínas adesivas presentes na placa adesiva têm preferência por superfícies que apresentem alta

energia de superfície e que sejam porosas, como por exemplo concreto, vidro, fibras naturais, etc. Para os

dois tipos de mecanismo a relação água/superfíice é fundamental para controlar a adesão.

As superfícies pesquisadas apresentaram mecanismo naturais de hidrofobicidade, autolimpeza e

antiincrustação, que impede, tanto o crescimento de biofilme, como apresentam baixa energia de

superfície. Isto dificulta a adesão do mexilhão dourado.

O crescimento de biofilme é controlado pelas protuberâncias auto-organizadas na superfície, que mantem o

ar preso dentro de uma matriz de "pedestais" propiciando uma barreira impenetrável para as bactérias e

biomoléculas em solução (figura 1.21), e ,por conseguinte, atuando como um muro virtual entre os

elementos da matriz. Organismos na escala nanométrica que eventualmente conseguem se aderir aos

topos destes pedestais, ficam isoladas e sem interação com outras bacteriais, dificultando assim a

proliferação ao longo da superfície.

Figura 1.21 – Relação entre uma bactéria formadora de biofilme e superfície superhidrofóbicas. A adesão é minimizada devido aos bolsões de ar presentes na microestrutura.

A cobertura de cristais de cera presente na superfície da folhas, associada a nanotopografia da

microestrutura, afetam a molhabilidade da superfície, tonando-a heterogênea. Este fenômeno diminui a

energia de superfície da folha (ver anexo) e a coloca próxima de materiais sintéticos hidrofóbicos como o

PTFE - Teflon®.

Com base na nossa pesquisa podemos concluir que a adesão do mexilhão-dourado pode ser evitada

satisfatoriamente mediante materiais: superhidrofóbicos, apolares, com baixa energia de superfície e ainda

que apresentem nanotopografia com uma camada de ar presa na microestrutura. (figura 1.22). No entanto,

estudos ainda apresentam limitações na estabilização subaquática da camada de ar por longos períodos de

tempo. O uso de materiais que possuam alguma de estas características poderiam auxiliar na diminuição da

adesão do mexilhão, como por exemplo o uso de materiais com recobrimento de cera (tubulações

encerada), que por ser um material apolar e hidrofóbico com um ângulo de molhamento próximo de 110º,

dificulta o crescimento de biofilme e adesão da placa adesiva.

Figura 1.22 – Relação do pé do mexilhão-dourado com a superfície superhidrobfóbica. A camada de ar preso na microestrutura e a turbidez da água garatem a antiincrustação primária do invasor.

Técnicas de recobrimento como a asperção de nanopartículas de Politetraflouretileno (PTFE) conhecido no

mercado como Teflon®, poderia diminuir drasticamente a adesão do mexilhão, porém a maior

preocupação dos fabricantes de materiais antiincriustantes, é a toxicidade dos produtos no meio aquático.

Para garantir que os revestimentos não agridam outros organismos nativos, testes rigorosos de toxicidade

devem ser realizados.

A abordagem de mecanismos bioinspirados de antiincrustação se mostra como uma alternativa para

solucionar problemas de adesão que sejam ambientalmente corretos e menos agressivos com o meio.

Trabalhos futuros do Cbeih, visam a elaboração de um produto com baixos níveis de toxicidade inspirado

nas folhas pesquisadas.

(PÁGINA DEIXADA EM BRANCO INTENCIONALMENTE)

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Relatório de adesão 2014

GT343: Controle do Mexilhão-dourado:Bioengenharia e novos materiais para aplicações em

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