RELATORIO DE ESTÁGIO - ULisboarepositorio.ul.pt/jspui/bitstream/10451/15304/1/Relatorio_Final_MAC... · INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO GENTIL, ENTIDADE

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FÁRMACIA

RELATORIO DE ESTÁGIO

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes

LISBOA, 2010

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FÁRMACIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO

GENTIL, ENTIDADE PÚBLICA EMPRESARIAL (IPOPFG, E.P.E.)

Serviço de Hematologia Clínica,

Serviço de Imunologia, Laboratório de Imunologia Celular

Serviço de Genética, Laboratório de Genética Molecular e Laboratório de Citogenética

HOSPITAL CURRY CABRAL

Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia

LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A.

Secção de Bioquímica Clínica

Secção de Microbiologia

MATERNIDADE ALFREDO DA COSTA

Serviço de Procriação Medicamente Assistida

ORIENTAÇÃO: DR. CARLOS MENDES, SERVIÇO HEMATOLOGIA CLÍNICA, IPO PORTO

DRª GABRIELA MARTINS, SERVIÇO DE IMUNOLOGIA, IPO PORTO

DRª SUSANA BIZARRO, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO

DRª CECÍLIA CORREIA, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO

DRª MARIA DO CÉU SANTOS, SERVIÇO NEFROLOGIA, H. CURRY CABRAL

DRª MARGARIDA BAPTISTA, LAC. DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A.

DRª SÓNIA CORREIA, SERVIÇO PMA, MATERNIDADE ALFREDO COSTA

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes

LISBOA, 2010

iii

Resumo

O presente trabalho consiste no relatório de estágio curricular, efectuado como

parte integrante e conclusivo do Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de

Farmácia da Universidade de Lisboa. Tem em conta as normas regulamentares do ciclo

de estudos definidas pelo Decreto-lei nº 74/2006 de 24 de Março.

O relatório está estruturado em duas partes. A Parte I consiste no registo resumo

da aprendizagem teórica e prática obtida durante todo o período de estágio nas

diferentes áreas. A Parte II aborda um tema específico - Metodologias Laboratoriais

para Diagnóstico e Seguimento Terapêutico em Patologias Auto-Imunes.

A Parte I é constituída por sete capítulos nos quais se descreve o trabalho

realizado durante o estágio. O primeiro capítulo refere-se ao estágio realizado em

Colheitas de Análises Clínicas. O segundo capítulo resume o estágio da valência de

Hematologia, realizado no Serviço de Hematologia Clínica do IPO Porto, segundo a

orientação do Dr. Carlos Mendes. O terceiro capítulo resume o estágio da valência de

Imunologia, realizado no Serviço de Imunologia do IPO Porto, segundo a orientação da

Drª Gabriela Martins (estágio em Imunologia Celular – Citometria de Fluxo) e no

Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral, segundo a orientação da Drª Maria do

Céu Santos (estágio em Imunologia Humoral – Auto-Imunidade); a referência ao

estágio realizado no Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral é bastante breve,

dado ser este o tema desenvolvido na Parte II do relatório de estágio. O quarto capítulo

resume o estágio da valência de Genética Molecular Humana, realizado no Serviço de

genética di IPO Porto, Laboratório de Genética Molecular, segundo a orientação da Drª

Susana Bizarro (estágio em Biologia Molecular) e Laboratório de Citogenética, segundo

a orientação da Drª Cecília Correia (estágio em Citogenética Clássica e FISH). O quinto

capítulo resume o estágio das valências de Bioquímica Clínica e Endocrinologia,

realizados na Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel

Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª Margarida Baptista. O sexto capítulo

resume o estágio da valência de Microbilogia, realizado na Secção de Microbiologia do

Laboratório de Análises Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª

Margarida Baptista (abordagem geral da área de Microbiologia) e no Serviço de

Procriação Medicamente Assistida da Maternidade Alfredo da Costa, segundo a

iv

orientação da Drª Sónia Correia (realização de espermogramas). Por fim, o sétimo

capítulo aborda o Controlo de Qualidade Interno e Externo realizado nas diferentes

áreas de estágio.

A Parte II deste relatório desenvolve as Metodologias Laboratoriais para

Diagnóstico e Seguimento Terapêutico nas Doenças Auto-Imunes, focando com maior

relevo a técnica de Imunofluorescência Indirecta. O trabalho referente a esta segunda

parte foi desenvolvido em consequência dos conhecimentos apreendidos no estágio de

Imunologia Humoral realizado no Serviço de Imunologia do Hospital Curry Cabral,

segundo a orientação e acompanhamento permanente da Drª Maria do Céu Santos. A

escolha do tema por parte da estagiária deveu-se ao facto dos conhecimentos

apreendidos terem possibilitado a implementação de uma nova técnica de análise no

Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, onde hoje a estagiária

trabalha – a Imunofluorescência Indirecta.

Palavras-Chave:

ANA • Análises Clínicas • Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos • Auto-

Anticorpos Anti-Nucleares • Auto-Imunidade • Bioquímica Clínica • Citometria de

Fluxo • Doenças Auto-Imunes • ELISA • Endocrinologia • Ensaio Imunoenzimático

• FISH • Genética Molecular • Hematologia • Imunologia • Imunoflourescência

Indirecta • Microbiologia.

v

Abstract

The present work represents a curriculum internship report, made conclusive as

well has an integrant part of Master in Clinical Analysis, School of Pharmacy,

University of Lisbon (Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade

de Lisboa), according to decree of law...

This report is structured in two main parts. The first part (Part I) contains the

resumed registry of the practical and theoretic learning obtain in different areas of

study during the occurring internship. The second part (Part II) goes to a specific

theme of study - Laboratory Methods for Diagnosis and Therapeutic Action in

Autoimmune Pathology.

In Part I there are seven different chapters where it is described the work done

during the internship in seven different areas of scope. Chapter one references the

work done in Clinical Analysis crops. Chapter two is a résumé of work developed in

Hematology, work that was performed, according to Dr. Carlos Mendes orientation,

at the Clinical Service of Hematology IPO OPorto (Serviço de Hematologia Clínica

do IPO Porto). Chapter three summarizes the work performed in Immunology field,

with the orientation of Dr. Gabriela Martins (internship in Cellular Immunology –

Flow Citometry), at the Clinical Service of Immunologyy IPO OPorto (Serviço de

Hematologia Clínica do IPO Porto) and with the orientation of Dr. Maria do Céu

Santos (internship in Humoral Immunology – Autoimmunity) at the Nephrology

Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral); as

a note, in this first part (Part I) of the work, the citation of the developed work in

Nephrology Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital

Curry Cabral ) is very brief, since this is the subject that is vastly reported in Part II.

Chapter four is dedicated to Human Molecular Genetics, and the internship was

performed in Genetics Service IPO Oporto (Serviço de genética do IPO Porto) under

the supervising of Dr. Susana Bizarro (internship in Molecular Biology) and in

Cytogenetics Laboratory (Laboratório de Citogenética) under guidance of Dr. Cecília

Correia (internship in Classic Cytogenetics and FISH). This chapter five is dedicated

to the analysis of Clinical Biochemistry and Endocrinology, performed in Clinical

vi

Biochemistry Department of Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão

Pinto, S.A. (Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel

Reymão Pinto, S.A) under guidance of Dr. Margarida Baptista. Chapter six is

accredit to studies in Microbiology, conducted in Microbiology Department of

Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. under guidance of Dr.

Margarida Baptista and also in Service of Medical Assisted Procreation of the

Alfredo da Costa Maternity (Serviço de Procriação Medicamente Assistida da

Maternidade Alfredo da Costa), which was guided by Dr. Sónia Correia (breading

spermiograms). Lastly, chapter seven addresses the internal and external quality

control achieved in different areas of the internship.

In Part II of this report there’s a development on the laboratory methodologies

for diagnose and therapeutic follow-up in autoimmune diseases, with bigger strength on

a specific technique, Indirect Immunofluorescence. The work carried out in this second

part (Part II) of the report is an accumulation of experience and knowledge gathered in

the internship of internship in Humoral Immunology – Autoimmunity at the Nephrology

Service, Hospital Curry Cabral and with the orientation and permanent follow-up by Dr.

Maria do Céu Santos. This choice fell down to the fact that this learning’s enabled an

implementation of a new technique at the laboratory workplace of the intern, Laboratory

of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. - Indirect Immunofluorescence.

Keywords:

ANA • Anti-Citoplasmatic Auto-Antibodys • Anti-Nuclear Auto-Antibodys •

Autoimmune Diseases • Autoimmunity • Clinical Analysis • Clinical Biochemistry •

ELISA • Endocrinology • FISH • Flow Citometry • Hematology •

Immunoenzymatic Essay • Immunology • Indirect Immunofluorescence

Microbiology • Molecular Genetics.

vii

Índice de Páginas

Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1

1. Colheitas ................................................................................................................................ 2

2. Hematologia .......................................................................................................................... 6

2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100 ................................................................................... 9

3. Imunologia ........................................................................................................................... 18

3.1. Imunologia Celular ...................................................................................................... 20

3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo........................................................................ 20

3.1.2. Preparação das Amostras .................................................................................... 23

3.1.3. Marcadores Celulares .......................................................................................... 24

3.2. Imunologia Humoral .................................................................................................... 26

4. Genética Molecular Humana .............................................................................................. 29

4.1. Biologia Molecular....................................................................................................... 30

4.1.1. PCR ...................................................................................................................... 30

4.1.1.1. Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction) .... 30

4.1.1.2. RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) ........................................................... 32

4.1.1.3. RT-PCR Nested ............................................................................................. 32

4.1.1.4. PCR Específico de Alelo (ASO-PCR) .............................................................. 33

4.1.1.5. PCR de Longa Distância (PCR-LD) ................................................................ 33

4.1.1.6. PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo .......................... 34

4.1.2. Restrição Enzimática ........................................................................................... 37

4.1.3. Electroforese ....................................................................................................... 37

4.1.3.1. Electroforese em Gel de Agarose ................................................................ 37

4.1.3.2. Electroforese Capilar ................................................................................... 38

4.2. Citogenética ................................................................................................................ 42

4.2.1. Citogenética Clássica ........................................................................................... 42

4.2.2. FISH (Fluorescente in situ Hibridization) ............................................................. 44

4.2.3. Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias ......................................... 50

5. Bioquímica Clínica e Endocrinologia ................................................................................... 55

5.1. Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados .............................................. 55

5.1.1. Modular Hitachi SWA, Roche .............................................................................. 55

5.1.2. Hydrasys Sebia, Phadia ........................................................................................ 58

5.1.3. Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................................................................ 58

viii

5.1.4. Urisys 2004, Roche .............................................................................................. 59

5.1.5. Immulite 2000, Amerlab...................................................................................... 59

5.1.6. Vidas, bioMérieux................................................................................................ 60

5.1.7. Vidia, bioMérieux ................................................................................................ 61

5.1.8. Serologia Manual................................................................................................. 62

5.2. Métodos Analíticos...................................................................................................... 62

5.2.1. Potenciometria .................................................................................................... 62

5.2.2. Fotometria ........................................................................................................... 63

5.2.3. Electroforese ....................................................................................................... 63

5.2.4. Imunoturbidimetria ............................................................................................. 64

5.2.5. Aglutinação .......................................................................................................... 64

5.2.6. Fluorescência Polarizada ..................................................................................... 64

5.2.7. ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) ............................................... 65

5.2.7.1. ELISA para a detecção de Ag ....................................................................... 66

5.2.7.2. ELISA para a detecção de Ac ....................................................................... 66

6. Microbiologia ...................................................................................................................... 68

6.1. Meios de Cultura ......................................................................................................... 69

6.2. Condições de Incubação das Sementeiras .................................................................. 70

6.3. Equipamentos ............................................................................................................. 70

6.3.1. Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux ................................................................ 70

6.4. Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos .......................................... 71

6.4.1. Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux ................................................ 71

6.4.2. Coloração de Gram .............................................................................................. 71

6.4.3. Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de Kinyoun modif. ou de

Tan - Thiam - Hok) ............................................................................................................... 71

6.4.4. Teste da Catalase................................................................................................. 72

6.4.5. Prova da Coagulase ............................................................................................. 72

6.4.6. SLIDEX Strepto Plus ............................................................................................. 72

6.4.7. Teste do Tubo Germinal ...................................................................................... 72

6.4.8. Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China ............................................ 72

6.5. Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos Biológicos: ............................ 72

6.5.1. Urina Asséptica .................................................................................................... 72

6.5.2. Exsudado Uretral e Vaginal ................................................................................. 73

6.5.3. Exsudado Nasofaríngeo ....................................................................................... 73

ix

6.5.4. Expectoração ....................................................................................................... 73

6.5.5. Fezes .................................................................................................................... 73

6.5.6. Hemoculturas ...................................................................................................... 73

6.6. Espermogramas ........................................................................................................... 74

6.6.1. Avaliação Macroscópica Inicial ............................................................................ 74

6.6.1.1. Liquefacção e Viscosidade ........................................................................... 74

6.6.1.2. Aparência..................................................................................................... 75

6.6.1.3. Volume ........................................................................................................ 75

6.6.1.4. pH ................................................................................................................ 75

6.6.2. Avaliação Microscópica Essencial ....................................................................... 75

6.6.2.1. Estimativa da Concentração Espermática ................................................... 75

6.6.2.2. Motilidade ................................................................................................... 76

6.6.2.3. Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides ........... 77

6.6.2.4. Agregação e Aglutinação ............................................................................. 77

6.6.2.5. Concentração Espermática .......................................................................... 77

6.6.2.6. Morfologia ................................................................................................... 78

6.6.3. Avaliação Microscópica Complementar .............................................................. 80

6.6.3.1. Teste da Vitalidade ...................................................................................... 80

6.6.3.2. Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides ................................ 81

6.6.3.3. Testes Opcionais – Testes Bioquímicos ....................................................... 81

6.6.4. Nomenclatura ...................................................................................................... 82

7. Controlo de Qualidade ........................................................................................................ 84

7.1. Controlo de Qualidade Interno ................................................................................... 84

7.2. Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) ....................................................................... 85

Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento

Terapêutico ................................................................................................................................. 87

1. Sistema Imunológico e Auto-Imunidade ............................................................................. 88

2. Doenças Auto-Imunes (DAI) ................................................................................................ 94

2.1. DAI Multi-Sistémicas ................................................................................................... 94

2.2. DAI Específicas de Orgão ............................................................................................. 99

3. Metodologias Laboratoriais .............................................................................................. 103

3.1. Imunofluorescência Indirecta (IFA) ........................................................................... 104

3.1.1. Fundamento ...................................................................................................... 104

x

3.1.2. Aplicação ........................................................................................................... 106

3.1.3. Células e Tecidos Utilizados .............................................................................. 107

3.1.3.1. Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2 .............. 107

PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO .................................. 112

PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO ..................... 135

PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO ...................... 140

3.1.3.2. Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae ............. 148

3.1.3.3. Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos ..................................... 150

3.1.3.4. Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos ............................... 162

3.2. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio em “Sanduíche” .................... 167

3.2.1. Fundamento ...................................................................................................... 167

3.2.2. Aplicação ........................................................................................................... 168

3.2.3. Ensaios Executados ........................................................................................... 169

3.2.3.1. ANA Screen ................................................................................................ 169

3.3. Immunoblotting - Imunodot’s ................................................................................... 170

3.3.1. Fundamento ...................................................................................................... 170

3.3.2. Aplicação ........................................................................................................... 172

3.3.3. Perfis Executados .............................................................................................. 173

3.3.3.1. Perfil ANA (“ANA Profile 3”) ...................................................................... 173

3.3.3.2. Perfil Hepático “Liver Profile” ................................................................... 174

3.3.3.3. Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”).......................................................... 175

3.3.3.4. Perfil Gástrico ............................................................................................ 176

3.4. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Quantitativo, ensaio em “Sanduíche” .................. 177

3.4.1. Fundamento ...................................................................................................... 177

3.4.2. Aplicação ........................................................................................................... 178

3.4.2.1. Ac. anti-DNAds .......................................................................................... 178

3.4.2.2. Ac. anti-Nucleossoma ................................................................................ 178

3.4.2.3. Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM .................... 178

3.4.2.4. Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA ........................................................ 178

3.4.2.5. Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA ............................................... 179

3.4.2.6. Ac. anti-CCP ............................................................................................... 179

3.4.3. Outros Ensaios Executados ............................................................................... 179

3.4.3.1. Ac. anti-ICC e anti-C1q ............................................................................... 179

3.4.3.2. Ac. anti-GBM ............................................................................................. 180

xi

3.4.3.3. Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA) ................ 180

3.4.3.4. Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180 .......................................................... 181

4. O Futuro… .......................................................................................................................... 182

5. Observações e Sugestões .................................................................................................. 183

Bibliografia ................................................................................................................................ 186

Agradecimentos ........................................................................................................................ 188

Anexo 1 ...................................................................................................................................... 189

Anexo 2 ...................................................................................................................................... 192

Anexo 3 ...................................................................................................................................... 193

xii

Índice de Figuras

Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1

Figura 1 –Câmara DIFF do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................................. 11

Figura 2 - Câmara WBC/BASO do aparelho Sysmex XE 2100 ...................................................... 12

Figura 3 – Câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 .............................................................. 13

Figura 4 – Histogramas RBC e PLT do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................ 14

Figura 5 – Canal RET do aparelho Sysmex XE 2100. .................................................................... 16

Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100 ..................................................................... 17

Figura 7 –Gráfico com FSC versus SSC nos contadores hematológicos ...................................... 21

Figura 8 – Imagens obtidas num Citómetro de Fluxo ................................................................. 21

Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto ...................... 23

Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR ................................................................. 34

Figura 11 – Actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RT-PCR. ............. 35

Figura 12 – Leitura do produto de PCR na fase exponencial ...................................................... 36

Figura 13 – Electroforese em gel de agarose .............................................................................. 38

Figura 14 – Sequenciação Automática ........................................................................................ 40

Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) ........................................................ 42

Figura 16 - Cariótipo com anomalia numérica constitucional e anomalia estrutural adquirida. 43

Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas. ...................................... 43

Figura 18 – FISH, Sondas de Painting .......................................................................................... 45

Figura 19 – FISH , Sondas Alfa-Satélite ........................................................................................ 46

Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. ............................................................................ 46

Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion ....................................................................... 47

Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal .......................................................................................... 48

Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color, Dual Fusion ....................................................................... 49

Figura 24 – FISH, Sondas Dual Color, Break Apart ...................................................................... 49

Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento

Terapêutico ................................................................................................................................. 87

Figura 25 – Estrutura dos Anticorpos .......................................................................................... 89

Figura 26 – “Buttelfly rash”, LES, DAI Multi-Sistémica ................................................................ 94

Figura 27 – Sinovite das mãos, AR, DAI Multi-Sistémica ............................................................ 95

Figura 28 – Aumento das parótidas, SS, DAI Multi-Sistémica ..................................................... 95

xiii

Figura 29 – Depósito de cálcio nas mãos, Esclerodermia, DAI Multi-Sistémica ......................... 96

Figura 30 – Necrose do dedo, F. de Raynaud, DAI Multi-Sistémica ............................................ 96

Figura 31 – Músculo Estriado destruído, Miosite, DAI Multi-Sistémica ...................................... 97

Figura 32 – Glossite, Anemia Perniciosa, DAI Específica de Orgão ........................................... 101

Figura 33 – Intestino sem vilosidades, Doença Celíaca, DAI Específica de Orgão .................... 101

Figura 34 – Separação da epiderme, Pênfigo, DAI Específica de Orgão ................................... 102

Figura 35 – Pênfigo foliáceo, vulgaris e bulhoso. ...................................................................... 102

Figura 36 – Reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina. ........................................... 105

Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular ............................................................................. 110

Figura 38 – A célula durante a Interfase ................................................................................... 110

Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. .............................................................................. 111

Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2 ................................................................... 112

Figura 41 – Padrão homogéneo em células HEp-2. Cromossomas positivos em profase,

metafase, anafase e telofase .................................................................................................... 113

Figura 42 – Padrão homogéneo em tecido hepático de macaco. ............................................. 113

Figura 43 – DNA, Histonas e Nucleossoma ............................................................................... 114

Figura 44 – Padrão de Scl-70 em células HEp-2 ........................................................................ 115

Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2 .................................................................. 116

Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B .......................................................................... 117

Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. ........................................................................ 118

Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP ........................................................................................ 118

Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2 ........................................................ 119

Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2. ............................................................................. 120

Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2 ................................................................ 121

Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear em células HEp-2. ...................................................... 122

Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco. ................................ 123

Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear em células HEp-2. ....................................... 124

Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear. .... 124

Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2. ................................................. 125

Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2.. ........................................................ 127

Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2. ....................................................... 127

Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2. ....................... 128

Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2. ........................................................ 129

Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2. .................................................. 130

xiv

Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2 ............................................... 131

Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2 .................................................................. 132

Figura 64 – Localização das proteínas centroméricas. .............................................................. 133

Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2. ...................................................................... 134

Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial em células HEp-2. ......................................... 135

Figura 67 – Padrão Actina em células HEp-2 ............................................................................. 136

Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2 ................................................................................ 137

Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2. ................................................................................ 138

Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2. .................................................................... 139

Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2. ....................................................... 140

Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2. ................................................................ 141

Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2.. ..................................................................... 142

Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2. ..................................................................... 142

Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2. ................................................................ 143

Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2. ........................................................................ 144

Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2. .................... 144

Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2. .................................................................... 145

Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2. ................................................................ 146

Figura 80 – Protozoário Crithidia luciliae. ................................................................................. 149

Figura 81 – Fluorescência em células de Crithidia luciliae ........................................................ 150

Figura 82 – Tecidos utilizados para pesquisa de auto-anticorpos citoplasmáticos .................. 152

Figura 83 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-mitocôndriais

(AMA) ........................................................................................................................................ 155

Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-actina (ASMA)

................................................................................................................................................... 152

Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-LKM1 ........... 152

Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-células parietais

(APCA) ....................................................................................................................................... 152

Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares

................................................................................................................................................... 162

Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de

Langerhans em pâncreas de macaco. ....................................................................................... 163

Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em

córtex adrenal de macaco. ........................................................................................................ 164

Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-endomísio (EMA)

em esófago de macaco.............................................................................................................. 165

xv

Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado

em músculo esquelético de macaco. ........................................................................................ 166

Figura 92 – Reacção de ELISA. ................................................................................................... 167

Figura 93 – Immunoblotting ...................................................................................................... 172

Figura 94 – ELISA Quantitativa, Curva de calibração absorvância vs concentração. ................ 177

Figura 95 – ANCAs. .................................................................................................................... 184

Todas as figuras da Parte II têm como fonte os pontos 3 e 4 da Bibliografia:

3. Bradwell A. R., Hughes R. G., Atlas of HEp-2 Patterns, third edition, The Binding Site, 2007

4. Bradwell A. R., Stokes R. P., Johnson G. D., Atlas of Autoantibody Patterns on Tissues, second

edition, The Binding Site, 2004

xvi

Índice de Tabelas

Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche .............................. 58

Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................ 58

Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia ........................................ 59

Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche ............................................... 59

Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab ...................................... 60

Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux ................................................ 61

Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux ................................................. 61

Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual .............................................................. 62

Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática. ................... 76

Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas. ................................................................. 98

Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão. ........................................................ 102

Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos.. ..................................................... 147

Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. . 148

Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais

(AMAs). .............................................................................................................................. 154

Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira

do ANA Profile 3. ............................................................................................................... 173

Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas................ 175

Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas .................... 176

Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no

Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............................................................ 191

Tabela 19 – Estudos moleculares, Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............. 192

Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae. ......................... 193

Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.

........................................................................................................................................... 194

Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp. ............................ 194

Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae. .................................. 194

Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp. ......................... 195

Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes. .................. 195

Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp. ........................... 196

Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp. ...................... 196

Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares. ........................ 197

1

ParteI

Apreciação Global dos Estágios

Realizados

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 2 |

1. Colheitas

O estágio decorreu no Posto de Colheitas Eça de Queiroz do Laboratório

Lababa, integrado no grupo ReymãoLabs, durante o mês de Janeiro de 2009, sob a

orientação da técnica Manuela.O estágio perfez um total de 80 horas.

Para a colheita de sangue periférico total, deverão encher-se os tubos

necessários às análises requeridas pela seguinte ordem:

1. Tubo de citrato;

2. Tubo de EDTA;

3. Tubo seco.

Regra geral, o tubo de citrato utiliza-se para provas de coagulação, o tubo de

EDTA para hemograma e VS e o tubo seco para a maioria das análises bioquímicas. O

tubo de citrato e de EDTA exigem agitação suave após o seu enchimento, a fim de que o

sangue se misture com o anticoagulante.

No que respeita as provas de tolerância aos hidratos de carbono:

- Pós-Prandial (PP): tirar sangue em jejum, dar 50g de glucose oral ao utente e

voltar a tirar sangue ao fim de 60 minutos; caso o clínico der indicações específicas,

seguir à risca as mesmas;

- Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTOG): fazer a colheita de sangue em

jejum ao utente e executar o teste rápido da glicémia em equipamento próprio. Caso o

resultado obtido seja inferior a 150 mg/dL, dar 75g de glucose oral e tirar sangue aos

30, 60, 90 e 120 minutos; se o utente for uma mulher grávida, dar 100g de glucose oral

e tirar sangue aos 60, 120 e 180 minutos. Caso o resultado obtido esteja entre 150 e 200

mg/dL, o utente prossegue a prova com 50g de glucose oral. Caso o resultado obtido

seja superior a 200 mg/dL, o utente prossegue a prova com o pequeno-almoço. Colher

sempre sangue e urina em paralelo.

A optimização das condições de colheita de produtos para exame

microbiológico visa manter a viabilidade dos microrganismos mais sensíveis e a não

Colheitas


contaminação da amostra a estudar com anti-sépticos, com flora saprófita do doente ou

com microrganismos do meio ambiente. Assim, exigem-se algumas regras para a sua

colheita:

- Colheita feita em rigorosas condições de assepsia e antes de se iniciar

terapêutica anti-microbiana e sob rigorosas condições de assepsia;

- Enviar rapidamente ao Laboratório, os produtos para exame Microbiológico; o

intervalo de tempo entre a colheita e a sementeira não deve ultrapassar duas horas;

- Urina Asséptica: amostras da 1ª urina da manhã ou, se não for possível, de

urina que tenha estado pelo menos durante 3 horas na bexiga; obtenção do jacto médio,

mantendo o prepúcio retraído ou os pequenos lábios da vagina afastados; para pesquisa

de BK fazer 3 colheitas de toda a urina da manhã. Conservar no frio;

- Exsudados Uretrais e Vaginais: não efectuar a higiene íntima de manhã; para

o exsudado uretral introduzir uma zaragatoa fina até 2 a 4 cm no interior da uretra,

rodando-a lentamente; para o exsudado vaginal utilizar espéculo ao nível do fundo da

vagina, do colo e do endocolo uterino. Colher com duas zaragatoas, uma colocada em

meio de transporte de carvão previamente aquecido a 37ºC e outra que se utiliza para

efectuar o esfregaço em lâmina. As colheitas para pesquisa de Chlamydia trachomatis

devem ser feitas por raspagem vigorosa;

- Quando para o mesmo utente for pedido urina asséptica e exsudado

uretral/vaginal, estes últimos devem ser colhidos em primeiro lugar;

- Exsudados Nasofaríngeos: Evitar tocarem com a zaragatoa do exsudado

faríngeo nos lábios, na língua ou na úvula, pressionando a língua para baixo, com uma

espátula; efectuar a colheita ao nível das amígdalas e em zonas que se encontrem

inflamadas. Inserir uma zaragatoa nas fossas nasais até encontrar resistência e rodá-la.

Colocar as zaragatoas de imediato num meio de transporte. Conservar à temperatura

ambiente;

- Exsudados Purulentos (Feridas, Auriculares e Oculares): os produtos de

feridas abertas são colhidos com zaragatoas e os das colecções purulentas fechadas e/ou

para pesquisa de microrganismos anaeróbios, com seringa. As zaragatoas devem ser

mergulhadas no meio de transporte adequado, previamente aquecido a 37C;

- Derrames das Serosas (Líquido Ascítico, Pleural, Pericárdico e Sinovial):

enviar um volume mínimo de 10 mL e de 50-100 mL se se suspeitar de um derrame de

etiologia tuberculosa;

Colheitas


- Expectoração: em jejum, depois de o utente fazer a sua higiene oral e se

assoar; não cuspir; para a pesquisa de BK 3 a 5 amostras em dias sucessivos. Conservar

à temperatura ambiente;

- Fezes: para pesquisa de ovos, quistos e parasitas as amostras devem ser

colhidas de 2 em 2 ou de 3 em 3 dias, até um total de 3, abrangendo um período de

tempo no mínimo de 8 dias. Fazer o teste da Fita Adesiva para pesquisa de Enterobius

vermicularis ou de Taenia sp., sem que o utente faça previamente a sua higiene matinal.

Conservar no frio, excepto para pesquisa de Entamoeba histolytica;

- Hemoculturas: colher no início da subida da temperatura; efectuar 3 colheitas

com intervalo de duas horas. Desinfectar a região a puncionar com éter, betadine e

etanol a 70%¸“injectar” o sangue no frasco do meio de cultura com uma seringa

diferente da utilizada para a punção. Conservar a 37ºC.

Segue-se a descrição para as condições de colheita de espermogramas:

1. Avaliação inicial:

Mínimo duas amostras, com intervalo entre 1 a 3 semanas;

Se a motilidade da primeira avaliação for baixa (< 25% com motilidade

progressiva) a segunda avaliação deverá ser feita o quanto antes, dado que a

motilidade diminui com o tempo;

Se os resultados entre a primeira e a segunda avaliação forem muito

diferentes, deve fazer-se uma terceira avaliação;

Os dias de abstinência para as várias avaliações deverão ser os mesmos.

2. Condições de Colheita:

Abstinência sexual mínima de 2 dias e máxima de 7 dias; menos de 2 dias de

abstinência poderá resultar em diminuição da concentração; mais de 7 dias

de abstinência poderá resultar em diminuição da motilidade e vitalidade;

Ausência de medicação e febre; febre pode causar alterações espermáticas

observáveis 10 a 12 semanas depois.

3. Colheita:

Feita por masturbação para um recipiente estéril;

Colheitas


A colheita de esperma tem que ser completa; a perda da primeira fracção

resultará na diminuição da concentração, visto ser nesta fracção que se

encontram a maioria dos espermatozóides;

O recipiente de colheita deverá ser identificado com o nome/nº do utente,

data e hora da colheita;

Feita preferencialmente no laboratório; quando feita no domicílio terá que

ser entregue ao laboratório num período máximo de 1 hora e deverá ser

transportada à temperatura do corpo (no bolso);

Se for necessária uma análise microbiológica, o utente deverá urinar antes e

depois desinfectar-se; só em seguida será feita a colheita de esperma; a

abstinência sexual deverá ser de 5 a 7 dias;

Em caso de ejaculação retrógrada, o utente deverá ingerir bicarbonatos de

véspera, para neutralizar a urina; na colheita deverá urinar antes e depois

masturbar-se; só depois deverá urinar para o recipiente de colheita;

Se for necessário o uso de preservativo, este deverá ser livre de

espermicidas; os preservativos de látex diminuem a viabilidade dos

espermatozóides;

Coitus interruptus não é aceitável para colheita: a primeira porção de

esperma (a mais rica em espermatozóides) pode perder-se; o pH ácido

vaginal diminui a motilidade, as formas normais e a concentração dos

espermatozóides; poderá haver contaminação celular e bacteriológica do

esperma com as secreções vaginais.


2. Hematologia

O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco

Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Hematologia

Clínica, durante os meses de Fevereiro e Abril de 2009 do IPO Porto, sob a orientação

do Dr. Carlos Mendes. O estágio perfez um total de 294 horas.

Trata-se de uma Entidade Pública Empresarial, de prestação de serviços de

saúde no domínio da oncologia, bem como a investigação, o ensino e o rastreio

oncológico. Pelo prestígio conquistado adquiriu hoje dimensão europeia e internacional,

sendo membro activo da European Organization of Research and Treatment of Cancer

(EORTC).

No Serviço de Hematologia Clínica procede-se à elaboração e interpretação de

hemogramas, mielogramas e outras técnicas manuais inseridas no contexto da área

(colorações citoquímicas várias), bem como à contagem de células sanguíneas em

citoesfregaços de LCR e outros líquidos biológicos. O laboratório divide-se em três

principais áreas distintas: uma área onde se efectuam as punções digitais para

monitorização do estado geral de crianças em ambulatório com patologias oncológicas

diagnosticadas, uma área onde se encontram os diferentes aparelhos e uma terceira área

destinada à validação dos resultados. O serviço recebe, em média, 400 hemogramas

diariamente.

Para o estágio realizado foi de extrema utilidade para a estagiária os

conhecimentos teóricos apreendidos na cadeira de Hematologia II do Mestrado em

Análises Clínicas. O défice de aulas práticas da referida cadeira justificou a escolha do

Instituto para a realização do estágio.

Assim, o estágio decorreu maioritariamente na área destinada à validação dos

resultados, onde o tempo foi sobretudo empregue na visualização de lâminas de sangue

periférico e medula óssea e realização da respectiva fórmula leucocitária para as

diferentes patologias oncológicas. Visualizaram-se lâminas que apareceram durante a

http://www.eortc.be/

Hematologia


rotina laboratorial diária e também lâminas de arquivo do Instituto. Visualizaram-se

lâminas das seguintes patologias oncológicas:

Neoplasias Mieloproliferativas:

Leucemia Mielóide Crónica (LMC), BCR-ABL1 positiva;

Leucemia Neutrofílica Crónica;

Policitémia vera;

Mielofibrose Primária;

Trombocitémia Essencial;

Leucemia Eosinofílica Crónica.

Neoplasias Mielodisplásicas/Mieloproliferativas:

Leucemia Mielóide Crónica atípica, BCR-ABL1 negativa.

Síndromes Mielodisplásicos vários (subclassificação é impossível pelo sangue

periférico)

Leucemias Mieloblásticas Agudas (LMA):

LMA com t(8;21)(q22;q22), ETO-AML1;

LMA com inv(16)(p13.1q22), CBFB-MYH11;

Leucemia Aguda Promielocítica com t(15;17)(q22;q12), PML-RARA;

LMA com t(9;11)(p22;q23), AF9-MLL;

LMA (megacarioblástica) com t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1;

LMA Com Diferenciação Mínima;

LMA Sem Maturação;

LMA Com Maturação;

Leucemia Mielomonocítica Aguda;

Leucemia Monocítica e Monoblástica Aguda;

Leucemia Eritróide Aguda;

Leucemia Megacarioblástica Aguda;

Leucemias Bifenotípicas

Hematologia


Neoplasias de Precursores Linfóides:

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(9;22)(q34;q11.2), BCR-ABL1;

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(4;11)(q21;q23), AF4-MLL;

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(12;21)(p13;q22), TEL-AML1;

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(1;19)(q23;p13.3), E2A-PBX1;

Leucemia Linfoblástica Aguda T;

Neoplasias de Células B Maturas:

Leucemia Linfocítica Crónica (LLC);

Leucemia Prolinfocítica B;

Linfoma Esplénico da Zona Marginal;

Leucemia a Hairy-Cell (tricoleucemia);

Mieloma Múltiplo;

Linfoma da Zona Marginal;

Linfoma Folicular;

Linfoma do Manto;

Linfoma Difuso de Grandes Células B;

Linfoma de Burkitt.

Neoplasias de Células T e NK Maturas:

Leucemia Prolinfocítica T;

Leucemia Linfocítica T a Grandes Células Granulares;

Desordem Linfoproliferativa Crónica a Células NK;

Síndrome de Sézary;

Linfoma Anaplásico.

Houve também oportunidade para realizar colorações citoquímicas (Fosfatase

Alcalina dos Leucócitos, Mieloperoxidase, Naftol-Cloroacetato Esterase, α-Naftil-

Acetato Esterase, Ácido Periódico de Schiff e Coloração de Perl’s).

Durante o estágio, a estagiária reorganizou ainda os dossies de arquivo do

Instituto segundo a classificação da OMS 2008 (visto estarem até à data organizados

pela classificação FAB), adicionou novas lâminas ao arquivo e fotografou todas as

Hematologia


lâminas relevantes, a fim de criar um arquivo de imagens com patologias diagnosticadas

no próprio Instituto. Por outro lado, houve ainda a possibilidade da estagiária criar a sua

própria laminoteca com as lâminas de interesse que foram surgindo no dia-a-dia.

Pela experiência adquirida durante o estágio, os parâmetros definidos para

visualização de lâminas de sangue periférico no laboratório onde a estagiária trabalha

foram afinados. Por outro lado, o laboratório alterou o seu equipamento de Hematologia

para o existente no IPO Porto – Sysmex XE 2100.

2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100

Utiliza os seguintes métodos para determinação dos vários parâmetros:

1. Citometria de fluxo:

Todas as células da amostra passam individualmente entre dois pólos, criando

assim um fluxo laminar. À medida que passam individualmente neste fluxo, faz-se

incidir sobre cada célula três tipos de radiação diferentes:

- FSC, Forward Scattered Light: radiação que incide de frente na célula, sendo

difundida através da célula; avalia o tamanho celular;

- SSC, Side Scattered Light: radiação que incide lateralmente na célula, sendo

dispersa; avalia a complexidade/granularidade celular;

- SFI, Side Fluorescent Light: radiação que incide lateralmente na célula; indica

a actividade fluorescente celular, relacionada com a quantidade de DNA e RNA que a

célula contém; faz com que as histonas directamente ligadas ao material genético

fluoresçam.

Através da informação obtida (tamanho celular, complexidade celular e

conteúdo em material genético), o aparelho faz a contagem total e diferencial dos

leucócitos, conta os eritrócitos imaturos (NRBC), os reticulócitos e as plaquetas

imatura.

Hematologia


2. Método de Capacitância Eléctrica / Medição de Resistência Eléctrica (fluxo

DC):

As células da amostra são colocadas individualmente num espaço entre dois

eléctrodos com cargas opostas. A presença de uma célula irá alterar a resistência

eléctrica; a alteração da resistência eléctrica gerada pela presença de uma célula entre os

dois eléctrodos é medida, sendo esta proporcional ao volume celular.

3. Método Colorimétrico:

A formação de um composto corado é medida em solução por determinação

fotométrica da sua absorvância, sendo comparada com a absorvância da mesma solução

sem o composto corado.

4. Método de Impedância Eléctrica (método RF-DC):

A amostra de sangue (mau condutor de corrente eléctrica) é diluída numa

solução electrolítica e é exposta a uma corrente eléctrica entre dois eléctrodos. A

presença de uma célula sanguínea entre os dois eléctrodos vai aumentar a resistência na

corrente eléctrica (DC), gerando uma alteração no potencial entre os eléctrodos e,

consequentemente, gerando um impulso eléctrico; a intensidade do impulso gerado é

proporcional ao tamanho celular. Por outro lado, a densidade relativa das células

(estrutura molecular interna) poderá determinar-se por radiofrequência (RF). Este

processo melhora a precisão e reprodutibilidade das contagens de células sanguíneas em

relação ao método de capacitância eléctrica.

A análise dos diferentes parâmetros é feita em 7 câmaras de detecção distintas:

1. Câmara DIFF:

Utiliza a técnica de citometria de fluxo.

Nesta câmara é feita a contagem diferencial das diferentes populações de

leucócitos, excepto dos basófilos.

Hematologia


Para isso inicialmente são lisados os eritrócitos. Aos leucócitos são apontados

raios laser no bloco óptico de detecção; a luz difundida e dispersa são medidas, o que

permite tirar conclusões sobre o tamanho e complexidade celular, respectivamente.

Assim, o aparelho consegue distinguir as diferentes populações de leucócitos,

apresentando os resultados sobre a forma de um gráfico com o tamanho celular (FSC)

em ordenadas e a complexidade celular (SSC) em abcissas.

Figura 1 – Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara DIFF do aparelho

Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche).

As células imaturas presentes na amostra também podem ser observadas neste

gráfico, uma vez que apresentam um tamanho muito superior à das células maturas.

Assim, irão aparecer no gráfico para cima, tipo foguetes, como prolongamentos das

respectivas células maturas. Sempre que estejam presentes estes foguetes justifica-se,

portanto, a visualização da lâmina de sangue periférico; estes poderão corresponder a

uma infecção bacteriana ou viral (mononucleose infecciosa) ou a um processo

neoplásico.

Esta tecnologia apresenta, no entanto, dois possíveis problemas. O primeiro

reside no facto de, por vezes, existirem eritrócitos resistentes à lise celular. Estes

eritrócitos são geralmente mais imaturos na sua diferenciação e aparecem muitas vezes

em amostras de sangue periférico de recém-nascidos ou em certas neoplasias

(Mielofibrose Primária, alguns SMD, LMA Eritróide). Irão aparecer no canto esquerdo

inferior do gráfico. Por outro lado, se a amostra contiver linfócitos fragilizados, como

acontece em certas patologias oncológicas linfóides, estes poderão não resistir ao

processo de lise destinado aos eritrócitos, sendo assim quantificados por defeito. Os

Hematologia


seus restos celulares irão aparecer na mesma zona do gráfico que os eritrócitos

resistentes à lise.

Através desta distribuição não é possível, no entanto, visualizar os basófilos,

uma vez que eles se localizam na mesma zona de distribuição que os linfócitos e, sendo

geralmente poucos, são encobertos pela população linfocitária. Assim, a contagem de

basófilos é feita numa câmara diferente.

2. Câmara WBC/BASO:


Nesta câmara é feita a contagem de basófilos, bem como a contagem total de

leucócitos.

Para isso, lisam-se inicialmente os eritrócitos maturos para que a contagem total

de leucócitos possa ser feita no bloco óptico de detecção. No caso da amostra conter

eritrócitos nucleados, estes irão resistir à lise celular e ser quantificados como

leucócitos. Esta correcção é feita por recurso a outra câmara do aparelho.

Seguidamente, todos os leucócitos excepto os basófilos são lisados, o que

permite a quantificação destes últimos no bloco óptico de detecção.

Assim, sempre que a mancha correspondente aos basófilos neste gráfico estiver

aumentada, justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois pode estar-se

na presença de uma LMC.

Figura 2 - Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara WBC/BASO do

aparelho Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche).

Hematologia


3. Câmara NRBC:


Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos imaturos nucleados (NRBC), a fim de

que não seja necessário fazer a correcção do número total de leucócitos por contagem

manual dos NRBCs em amostras de sangue periférico onde precursores eritróides estão

presentes.

Para isso lisam-se as membranas dos eritrócitos maturos, ficando intactos

NRBCs e os leucócitos. Seguidamente tinge-se o material genético (mais precisamente

as histonas) dos NRBCs e dos leucócitos, de forma a que este material genético

fluoresça quando a SFI incidir sobre ele. Uma vez que os leucócitos apresentam mais

histonas do que os NRBCs e visto que o tamanho de leucócitos e NRBCs é claramente

distinto, é possível quantificá-los separadamente. A sua distribuição faz-se num gráfico

com tamanho em abcissas e nível de fluorescência emitida em ordenadas.

Sempre que este canal indicar a presença de NRBCs, caso não se trate de um

recém-nascido, a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada, pois é possível que

se esteja na presença de uma anemia regenerativa mas também de um processo

neoplásico (Policitémia vera, Mielofibrose Primária, SMD com displasia da série

eritróide ou LMA Eritróide).

Figura 3 – À esquerda, imagem correspondente à visualização de um sangue periférico sem

NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, imagem correspondente à visualização

de um sangue periférico com NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas

pela Roche).

Hematologia


4. Canal RBC:

Utiliza a técnica de capacitância eléctrica / medição de resistência eléctrica

(fluxo DC).

Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos (RBC) e as plaquetas (PLT).

Discriminadores automáticos separam as duas populações celulares.

Sempre que os valores obtidos para os eritrócitos ou plaquetas forem muito

baixos justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois muitos processos

neoplásicos conduzem a uma baixa destas duas séries por invasão da medula óssea por

precursores leucocitários.

Figura 4 – À esquerda, histograma RBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, histograma

PLT do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche).

5. Canal de fluxo:

Utiliza o método colorimétrico.

Neste canal quantifica-se a hemoglobina (Hb) da amostra.

Para tal, a amostra é diluída numa solução electrolítica que conduz a corrente

eléctrica, ocorrendo assim a lise dos eritrócitos e a consequente libertação da

hemoglobina (Hb). Segue-se a conversão da Hb em cianometahemoglobina (SLS-Hb),

um composto corado cuja absorvância a 540 nm é medida fotometricamente. A

absorvância da SLS-Hb é comparada com a absorvância da solução electrolítica sem

amostra diluída.

A partir dos parâmetros determinados no canal RBC e canal de fluxo, os índices

eritrocitários podem ser calculados pelo aparelho.

Hematologia


6. Canal RET:


Nesta câmara quantificam-se os reticulócitos e as plaquetas muito imaturas

(PLT-fl).

Para isso tinge-se o material genético (mais precisamente as histonas) de todas

as células presentes na amostra: leucócitos, NRBCs, reticulócitos e plaquetas muito

imaturas. As plaquetas maturas não apresentam núcleo e, portanto, não têm material

genético que possa ser corado; só as muito imaturas apresentam vestígios de material

genético.

Como a intensidade de fluorescência dos leucócitos e dos NRBCs é muito

elevada em relação à dos reticulócitos e das plaquetas imaturas, estas populações

conseguem facilmente distinguir-se das populações que se desejam avaliar nesta câmara

e o cut-off no gráfico é feito de forma a que leucócitos e NRBCs nem sequer sejam

visualizados.

À medida que maturam, os reticulócitos vão perdendo material genético e,

assim, intensidade de fluorescência. Como tal, num diagrama em que se avalia o

tamanho celular em abcissas e o grau de fluorescência emitida em ordenadas, é possível

distinguir as diferentes populações de reticulócitos, desde os mais imaturos (HFR - high

fluorescence ratio), passando pelos de maturidade intermédia (MFR – middle

fluorescence ratio), até aos reticulócitos mais maturos (LFR – low fluorescence ratio),

acabando nos eritrócitos maturos (RBC-o) já sem fluorescência emitida.

Adicionalmente, a fracção da população muito precoce de reticulócitos (IRF,

reticulócitos imaturos) é analisada.

As plaquetas imaturas (PLT-fl), que ainda emitem fluorescência, são muito mais

pequenas que os reticulócitos e, para além disso, emitem menos fluorescência que estes

últimos, podendo assim distinguir-se no gráfico. Estas plaquetas imaturas não são

quantificadas no canal que mede usualmente as plaquetas (canal RBC). Assim, se as

plaquetas forem quantificadas no canal RET, o seu valor será ligeiramente superior

dado a suplementar quantificação das plaquetas imaturas. Esta quantificação é muito

importante sobretudo para doentes que apresentam níveis baixos de plaquetas, exibindo

um valor próximo do cut-off entre o fazer ou não uma transfusão, receber ou não o seu

tratamento de quimioterapia. Assim, no IPO sempre que um doente apresenta um valor

de plaquetas ligeiramente inferior a 20x10^9/L (nível de cut-off importante para muitas

Hematologia


decisões terapêuticas, quase que como os 150x10^9/L do limiar inferior que geralmente

se admite fora de um instituto de oncologia), este parâmetro é quantificado no canal

RET, podendo, assim, evitar-se transfusões em certos casos ou permitir-se a

quimioterapia noutros.

Figura 5 – Localização das diferentes fracções de reticulócitos imaturos e de plaquetas

fluorescentes no canal RET do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche).

7. Canal IMI:

Utiliza a método de impedância eléctrica (método RF-DC).

Neste canal quantificam-se as células imaturas: as stem cell (HPC – Human

Progenitor Cells) e os granulócitos imaturos (IG – Immature Granulocytes).

O reagente utilizado afecta os constituintes lipídicos das membranas celulares.

Assim, eritrócitos e leucócitos maturos são lisados. Os leucócitos imaturos permanecem

intactos, dado o seu menor conteúdo em lípidos a nível das membranas celulares.

Assim, em amostras de sangue normais (isto é, sem precursores), nenhumas células

aparecem no gráfico correspondente ao canal IMI visto que todas as células são lisadas.

Este gráfico comporta em ordenadas o sinal RF (corresponde à estrutura molecular

interna das células) e em abcissas o sinal DC (correspondendo ao volume celular). Em

amostras de sangue de pacientes sujeitos a quimioterapia, a visualização dos HPC

permitirá concluir que o doente está a arrancar; o parâmetro IG permitirá detectar

precocemente uma possível infecção.

Assim, sempre que o gráfico correspondente ao canal IMI indicar a presença de

células precursoras a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada.

Hematologia


Por outro lado, este canal também dá uma ideia da existência de agregados

plaquetários (PLT Clumps), que no caso de existirem aparecerão como prolongamentos

das plaquetas isoladas. Poderá, nesse caso, ponderar-se uma pseudo-trombocitopénia,

devendo visualizar-se a lâmina a fim de a confirmar. Para a objectiva de 100x, a

observação de 5 plaquetas por campo corresponde sensivelmente a uma contagem de

100x10^9/L plaquetas.

Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100; imagem de um sangue periférico sem

percursores mielóides nem agregados plaquetários (imagem cedidas pela Roche).


3. Imunologia

O estágio decorreu:

- No Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil, Entidade

Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), Serviço de Imunologia, Laboratório de

Imunologia Celular, durante o mês de Março de 2009, sob a orientação da Drª Gabriela

Martins (Imunologia Celular). O estágio perfez um total de 154 horas.

- No Hospital Curry Cabral, Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia,

entre 7 de Setembro e 16 de Outubro, sob a orientação da Drª Maria do Céu Santos

(Imunologia Humoral). O estágio perfez um total de 150 horas.

Antes da realização do estágio, a estagiária tinha pouco conhecimento teórico da

área, adquirido na valência de Hematologia II e Imunologia do Mestrado de Análises

Clínicas. Os estágios, contudo, permitiram o adquirir de conhecimentos teóricos mais

sólidos e a sua aplicação prática.

Os conhecimentos apreendidos e praticados no estágio de Imunologia Humoral

permitirão a implementação da Técnica de Imunofluorescência Indirecta no Laboratório

onde a estagiária trabalha.

O serviço de Imunologia do IPO Porto recebe, em média, cinco amostras

diariamente.

Durante a primeira semana de estágio, a estagiária teve a oportunidade de

aprender a preparar as amostras que foram surgindo na rotina diária; durante a segunda

semana adquiriu amostras nos dois Citómetros de Fluxo do serviço; a terceira e quarta

semanas de estágio foram dedicadas à análise de resultados no programa Infinicyt.

Durante o estágio, a estagiária teve ainda oportunidade de frequentar um curso

nocturno de Iniciação à Citometria de Fluxo leccionado pela Enzifarma.

O Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral executa semanalmente,

em média, 80 amostras para pesquisa de ANAs por Imunofluorescência Indirecta, 30

amostras para pesquisa de Auto-Anticorpos Anti-DNAds, 20 amostras para pesquisa

Imunologia Celular


geral de Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos e 30 amostras para pesquisa de ANAs

específicos por Dot’s.

Durante o estágio, a estagiara teve oportunidade de executar lâminas

manualmente e automaticamente para as diferentes técnicas de Imunofluorescência

Indirecta e visualizá-las. Teve ainda oportunidade de executar automaticamente testes

de ELISA, verificar o funcionamento do aparelho de ELISA e executar Dot’s para as

diferentes técnicas disponíveis no hospital.

Imunologia Celular


3.1. Imunologia Celular

3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo

A Citometria de Fluxo exibe a capacidade de medir propriedades (parâmetros

celulares) de partículas em suspensão, uma a uma.

Quando uma amostra em solução é injectada num Citómetro de Fluxo, as

partículas em suspensão são aleatoriamente distribuídas no espaço tridimensional.

Assim, é necessário que as partículas da amostra sejam alinhadas, de forma a que o

sistema de detecção do Citómetro de Fluxo as consiga avaliar individualmente. Este

processo é conseguido pelo sistema de fluidos do aparelho, que consiste num canal

central apertado através do qual a amostra é injectada com uma determinada velocidade

de fluxo. Sob condições optimizadas, obtém-se um fluxo laminar, sendo cada partícula

analisada individualmente.

Após focagem hidrodinâmica, cada partícula é atravessada por um feixe de luz

(laser). Estando cada partícula ligada a um fluorocromo, após a absorção de energia do

feixe de luz incidente, a emissão de fluorescência pelo fluorocromo fornecerá

informação acerca das propriedades da partícula a que está ligado. A radiação emitida

na direcção do feixe de luz incidente é captada por uma lente conhecida por “Forward

Scatter Channel” (FSC); fornece informação acerca do tamanho da partícula e

distingue partículas inteiras (células vivas, maiores) de partículas alteradas (restos

celulares, menores). A radiação emitida aproximadamente a 90 graus do feixe de luz

incidente é captada por uma lente conhecida por “Side Scatter Channel” (SSC); fornece

informação acerca da complexidade (conteúdo em granulação) da partícula. As duas

informações em simultâneo permitem distinguir vários tipos de células numa amostra

heterogénea.

Imunologia Celular


Figura 7 – Imagem obtida nos contadores hematológicos. Gráfico com FSC (tamanho celular) no

eixo dos y, versus SSC (granularidade) no eixo dos x. Só estes dois parâmetros permitem distinguir a

população normal de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e restos celulares (ghost). Os poucos

basófilos são encobertos pela vasta população de linfócitos normais (imagem cedida pela Enzifarma).

Figura 8 – Imagens obtidos num Citómetro de Fluxo. Na imagem à esquerda, gráfico com SSC

(granularidade) no eixo dos y e FSC (tamanho) no eixo dos x; é possível distinguir linfócitos (vermelho),

monócitos (azul escuro), neutrófilos (verde), eosinófilos (roxo) e restos celulares (laranja); os monócitos

(azul claro) misturam-se com os linfócitos. Na imagem à direita, gráfico com CD45 (marcador

leucocitário) no eixo dos y e SSC (granularidade) no eixo dos x; é possível isolar a população

monocitóide da linfóide (imagem cedida pela Enzifarma).

A medição da fluorescência emitida a diferentes comprimentos de onda,

seleccionados com recurso a diferentes filtros, fornece informação quantitativa e

qualitativa acerca dos fluorocromos ligados tanto à superfície das partículas (receptores

celulares) como ao seu interior (moléculas intracelulares, como DNA e citocinas).

Imunologia Celular


Quando a luz emitida atinge um fotodetector gera-se uma pequena corrente

eléctrica, cuja voltagem é proporcional ao número de fotões recebidos pelo detector.

Esta voltagem é convertida em sinal digital e, seguidamente, expressa graficamente.

Nem todos os fluorocromos podem ser utilizados em Citometria de Fluxo. É

necessário que a diferença entre a Energia de Absorção e a Energia de Emissão do

fluorocromo seja suficientemente elevada para que apresentem diferentes cores no

espectro de luz visível. Por exemplo, o fluorocromo FITC (“Fluorecein Isothiocyanate”)

absorve luz entre os 400-550 nm (luz azul) e emite o seu máximo de radiação a 525 nm

(luz verde).

Como escolher o melhor laser e o melhor filtro para cada fluorocromo? O pico

de absorção para o FITC ocorre para 490 nm. Assim, o laser escolhido para a sua

excitação deve excitar próximo deste valor (escolhe-se o laser Azul de Argon, que

excita a 488 nm), pois quanto mais o fluorocromo se excitar, maior intensidade de

fluorescência irá emitir. Por outro lado, embora emita o seu máximo de radiação a 525

nm (luz verde), o FITC emite radiação num espectro mais alargado que vai de 475 a 700

nm (abrange a zona do azul-verde-amarelo-laranja). Consoante o filtro escolhido, assim

a zona do espectro onde irá emitir radiação, assim a cor que evidenciará. O filtro

escolhido deverá seleccionar o máximo de radiação emitida para o fluorocromo, para

que este apresente a maior intensidade possível. Para o FITC deve escolher-se um filtro

que seleccione a radiação emitida a 525 nm (luz verde); daí dizer-se que o FITC é um

fluorocromo verde.

Utilizando-se vários fluorocromos é possível analisar vários parâmetros

celulares ao mesmo tempo numa determinada amostra. Assim, é possível que, por

exemplo, o fluorocromo FITC se ligue a todos os CD45 (marcador leucocitário) da

superfície celular, enquanto que o fluorocromo PerCP se liga a todos os CD19

(marcador de linfócitos B). Conjugando vários fluorocromos é possível obter-se

informação acerca de múltiplas propriedades celulares numa só análise.

Imunologia Celular


Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto nos dois

citómetros existentes no serviço (imagem cedida pelo Serviço de Imunologia do IPO, Porto).

Uma consideração a ter em conta quando se utilizam múltiplos fluorocromos é a

possível sobreposição espectral. Isto é, há possibilidade do espectro de emissão de dois

(ou mais) fluorocromos coincidir, tornando a medição da fluorecência do fluorocromo

que de facto emitiu a radiação difícil. Esta interferência é evitável porque actualmente o

próprio Citómetro faz automaticamente a chamada compensação de fluorescência; isto

é, selecciona diferentes comprimentos de onda para a leitura da emissão de radiação

para fluorocromos cujo espectro de emissão seja em parte sobreponível.

3.1.2. Preparação das Amostras

Utilizam-se amostras de sangue periférico total, aspirado medular, biopsia

aspirativa de gânglios, fragmentos de biopsia excisionais de gânglios, lavado bronco-

alveolar, líquido cefalo-raquidiano e líquido ascítico. O EDTA é o anticoagulante de

eleição.

As amostras deverão ser analisadas pouco tempo após a colheita, para que se

evite a morte celular.

A amostra deverá apresentar uma densidade celular que ronde os 10^6

células/mL para evitar entupir o Citómetro. Assim, a densidade celular da amostra é

medida previamente, sendo a amostra diluída numa solução isotónica.

À amostra adicionam-se os anticorpos-monoclonais (marcados com

fluorocromos) cuja presença se pretende analisar. Sempre que se utilizam anticorpos-

monoclonais que marcam as imunoglobulinas leves de superfície (κ e λ), adiciona-se

Imunologia Celular


uma solução de albumina à amostra antes de se adicionaram os anticorpos-

monoclonais; esta solução irá eliminar as imunoglobulinas serológicas que, de outra

forma, interfeririam com a determinação pretendida. Sempre que se utilizam anticorpos-

monoclonais que marcam antigénios citoplasmáticos, adiciona-se uma solução fixadora

e uma permeabilizadora antes de se adicionar o monoclonal à amostra, a fim de que

este consiga atingir o conteúdo intracelular, sem contudo destruir a célula.

Adiciona-se depois uma solução de lise dos eritrócitos para que estes não

interfiram na análise das populações leucocitárias.

Lava-se depois o preparado com a solução isotónica para que os eritrócitos

lisados e os monoclonais que não se ligaram aos antigénios celulares sejam removidos.

Entre as diferentes adições é necessário incubar o preparado no escuro (evitar a

perda de fluorescência do fluorocromo).

Procede-se, por fim, à aquisição do preparado no Citómetro de Fluxo.

3.1.3. Marcadores Celulares

Todas as células normais expressam uma variedade de marcadores de superfície

(receptores celulares) e marcadores intracitoplasmáticos (marcadores

intracitoplasmáticos, DNA, citocinas), dependendo do seu tipo celular e do seu grau de

maturação. Contudo, um crescimento celular anormal (neoplasia) pode interferir com a

expressão normal dos marcadores. Assim, qualquer alteração seguidamente descrita,

obriga a confirmar e caracterizar essa alteração, na tentativa de sugerir uma hipótese de

diagnóstico.

- Intensidade e/ou modo de expressão dos marcadores característicos de um

determinado tipo celular;

- Cronologia de expressão dos diferentes marcadores durante o processo de

maturação celular;

- Características de tamanho e complexidade celulares;

- Percentagens relativas de expressão de uma determinada população celular em

relação às restantes populações;

- Tipo de receptores que uma determinada linhagem celular costuma expressar

(expressões anormais).

Como tal, a técnica de Citometria de Fluxo é de extrema utilidade não só no

diagnóstico, como também na classificação, no prognóstico, na monitorização

Imunologia Celular


terapêutica e na avaliação de recaída de leucemias, Síndromes Mieloproliferativos,

Síndromes Mielodisplásicos, linfomas e mielomas.

Imunologia Humoral


3.2. Imunologia Humoral

As Doenças Autoimunes (DAI) caracterizam-se por uma resposta imune onde

os linfócitos T e B respondem contra antigénios do próprio, com consequente produção

exagerada de auto-anticorpos, sem que se detecte a presença de um agente infeccioso ou

a presença de antigénios tumorais. Podem ser inespecíficas ou específicas de órgão,

sendo a sua prevalência felizmente baixa entre nós.

Assim, os testes laboratoriais imunológicos que detectam a presença de auto-

anticorpos fornecem informação relevante no que respeita o diagnóstico, prognóstico e

monitorização das DAI. Contudo, a presença de auto-anticorpos nem sempre reflecte a

presença de doença, uma vez que em indivíduos saudáveis verifica-se por vezes a

existência destes auto-anticorpos, embora geralmente em títulos baixos. Por outro lado,

a utilização inadequada destes testes poderá conduzir a um diagnóstico incorrecto e a

um aumento dos custos no tratamento destas patologias. Exige-se, portanto, uma

marcha analítica metódica e rigorosa, executada por pessoal especializado na área.

No Hospital Curry Cabral (HCC), sempre que é feito um pedido de um

anticorpo-antinuclear (ANA) começam por se realizar duas técnicas de

imunofluorescência indirecta (IFA) em células HEp-2 (identificação de todos os ANAs,

com elevada sensibilidade e baixa especificidade) e células de Crithidia luciliae

(identificação específica de DNAds).

Nas células HEp-2, caso as células exibam um padrão de fluorescência nuclear

identifica-se o tipo de padrão (homogéneo, fino granular, granular, matriz nuclear,

perinuclear, poros da membrana nuclear, etc) e titula-se a fluorescência (1:160, 1:320,

1:640 ou > 640). Para estas amostras positivas por IFA realiza-se depois o teste de

ELISA ANA Screen que permite confirmar a existência de alguns auto-anticorpos

(DNAds, histonas, Sm e hnRNP para LES, Scl-70 para Escleroderma Difusa, SS-A e

SS-B para Síndrome de Sjögren, U1-snRNP para DMTC, centrómero para CREST e Jo-

1 para Miosites). Para as amostras positivas para o teste ANA Screen ou negativas para

ANA Screen mas com títulos altos por IFA (possível existência de um auto-anticorpo

não identificável por ANA Screen) segue-se a marcha analítica por execução de

Imunodot’s – reacções de ELISA que permitem a identificação do(s) auto-anticorpo(s)

presente(s) no soro do doente. O(s) Imunodot(‘s) escolhido(s) depende(m) do(s) auto-

Imunologia Humoral


anticorpo(s) que se desconfia que o doente possa ter ou da informação clínica

disponível:

- Perfil ANA (DNAds, Histonas, Nucleossoma, Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-

snRNP, PCNA, hn-RNP, PM-Scl, CENP-B, AMA-M2, Jo-1, estando sublinhados os

anticorpos não pesquisados no ANA Screen);

- Perfil Hepático (M2, M2-3E, gp210, sp100 e PML sobretudo associados a

Cirrose Biliar Primária; Ro-52 associado a Cirrose Biliar Primária e Hepatite

Autoimune I; LKM-1 e LC-1 sobretudo associados a Hepatite Autoimune II; SLA e LP

sobretudo associados a Hepatite Autominue III);

- Perfil Miosites (Mi-2, PM-Scl 75, PM-SCl 100, Ku, Jo-1, SRP, PL-7, PL-12 e

EJ). Os testes de ELISA caracterizam-se por apresentar menor sensibilidade mas maior

especificidade que as células HEp-2 para os ANAs.

No caso da amostra conter um auto-anticorpo anti-DNAds ou anti-nucleossoma,

identificável no Perfil ANA, segue-se a sua quantificação por um ELISA Quantitativo.

Para as amostras positivas nas células de Crithidia luciliae segue-se

directamente a quantificação do DNAds por um ELISA Quantitativo.

Se nas células HEp-2 se suspeitar da existência de um padrão citoplasmático

mitocondrial ou de actina procede-se de imediato à pesquisa destes auto-anticorpos em

substratos mais adequados do que as células HEp-2 à sua identificação: lâminas

compostas por seis tipos de tecidos (células HEp-2, tecido hepático de rato e macaco,

tecido renal, tecido gástrico e células VSM-47).

Sempre que é feito um pedido de um anticorpo anti-citoplasmático são as

lâminas compostas pelos seis tecidos já mencionados que se utilizam para a pesquisa

inicial por IFA. As lâminas permitem a identificação/suspeita de auto-anticorpos anti-

actina (característicos de Hepatite Autoimune tipo 1), anti-mitocôndrias (por vezes

característicos de Cirrose Biliar Primária), anti-LKM1 (característicos de Hepatite

Autoimune 2) e anti-Células Parietais (característicos de Gastrite Atrófica Crónica e

Anemia Perniciosa). A presença dos auto-anticorpos anti-actina é confirmada nas

próprias células VSM-47 das referidas lâminas. A suspeita de auto-anticorpos anti-

mitocôndrias e anti-LKM1 é confirmada por Imunodot’s realizando-se o Perfil

Hepático. A suspeita de auto-anticorpos anti-células parietais é confirmada por

Imunodot’s realizando-se o Perfil Gástrico.

Por outro lado, sempre que o pedido médico é específico para um determinado

tipo de auto-anticorpos utilizam-se lâminas com tecidos indicados para a sua pesquisa

Imunologia Humoral


por IFA: auto-anticorpos anti-ductos-salivares (característico de Síndrome de Sjögren),

anti-Ilhéus de Langerhans (característicos de Diabetes Mellitus tipo I), anti-Supra-

Renais (característicos de Doença de Addison Primária), anti-Endomísio (característicos

de Doença Celíaca) e anti-Músculo Estriado Esquelético (característicos de Myasthenia

gravis).

Para além da quantificação dos auto-anticorpos anti-DNAds e anti-nucleossoma

já referida é essencial ao diagnóstico / à monitorização clínica a quantificação dos

ANCAs (pANCA MPO e cANCA PR3) para as vasculites e auto-anticorpos anti-

Cardiolipina e anti-β2-Glicoproteína 1 IgM e IgG para o Síndrome Antifosfolipídico.

Para além destes, também se quantificam no HCC os auto-anticorpos anti-ICC e C1q, os

anti-CCP (específicos para Artrite Reumatóide), os anti-GBM (característicos de

Síndrome de Goodpasture) os anti-Gliadina e anti-Transglutaminase IgA e IgG

(característicos da Doença Celíaca) e os anti-Desmogleinas 1 e 3 e BP180

(característicos dos vários tipos de Pênfigo). Sempre que um destes pedidos médicos é

feito, realiza-se directamente a quantificação destes auto-anticorpos por um ELISA

Quantitativo, sem que nenhum teste de rastreio se realize previamente.

Por uma questão de organização do serviço, à 2ª feira realizam-se as lâminas das

células HEp-2, das células de Crithidia luciliae e as lâminas compostas por seis tecidos

para pesquisa inicial de auto-anticorpos anti-nucleares e anti-citoplasmáticos. À 3ª feira

lêem-se estas lâminas por IFA e realizam-se os testes ANA Screen necessários. À 4ª

feira executam-se os Imunodot’s adequados. À 5ª realizam-se os ELISAs Quantitativos.

A 6ª é o dia das repetições e confirmações necessárias. Os tecidos para pesquisa de

auto-anticorpos específicos por IFA executam-se sempre que o número de amostras a

executar o justifica.

Desta forma garante-se no HCC organização no serviço e identificação de todos

os tipos de auto-anticorpos disponíveis até ao momento no mercado, sendo o auxílio

dado à clínica médica o melhor possível.


4. Genética Molecular Humana

O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco

Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Genética, nos

seguintes laboratórios:

- Laboratório de Genética Molecular, durante o mês de Maio de 2009, sob a

orientação da Drª Susana Bizarro (Biologia Molecular). O estágio perfez um total de

140 horas.

- Laboratório de Citogenética, durante o mês de Junho, sob a orientação da Drª

Cecília Correia (Citogenética Clássica e FISH). O estágio perfez um total de 126

horas.

O Serviço de Genética recebe, em média, cinco amostras diariamente para cada

um dos dois laboratórios.

Antes da realização do estágio de Biologia Molecular, a estagiária já tinha algum

conhecimento teórico da área, adquirido na valência de Biologia Molecular do Mestrado

de Análises Clínicas. O estágio, contudo, permitiu a consolidação e a aplicação prática

dos conhecimentos teóricos previamente adquiridos, tendo-se revelado muito útil. A

estagiária teve a oportunidade de observar e executar todas as técnicas moleculares que

seguidamente se descrevem.

Assim, foi possível propor ao Laboratório de Análises Clínicas onde a estagiária

trabalha a implementação de Técnicas Moleculares, actualmente já em curso.

Antes da realização do estágio de Citogenética, a estagiária não tinha

praticamente nenhum conhecimento da área, dado que só uma aula da cadeira de

Hematologia II abordou o assunto de forma genérica durante todo o Mestrado de

Análises Clínicas. Durante o estágio, a estagiária teve oportunidade de apreender

conhecimentos teóricos relacionados com a Citogenética Clássica e FISH, executar

lâminas para Citogenética Clássica e FISH, aprender a nomenclatura dos cromossomas

para a realização de cariótipos, realizar cariogramas e observar lâminas de FISH ao

microscópio de fluorescência.

Genética Molecular Humana – Biologia Molecular


4.1. Biologia Molecular

Nas últimas décadas, numerosas alterações genéticas foram detectadas em

neoplasias hematológicas. Hoje sabe-se que uma determinada alteração genética

específica está na génese de um tumor hematológico em particular, por causar uma

alteração no equilíbrio proliferação celular / apoptose. Esta alteração genética é sempre

clonal e adquirida, sendo limitada às células malignas do organismo. As alterações que

conduzem ao processo neoplásico podem ocorrer em quatro diferentes grupos de genes:

genes de reparação do DNA, genes que interferem com a apoptose, genes que

interferem com o Ciclo Celular, genes que controlam a proliferação celular (Proto-

Oncogenes – genes que estimulam a proliferação celular – ou Genes Supressores

Tumorais – genes que inibem a proliferação celular). Os estudos moleculares são

imprescindíveis nas alterações neoplásicas hematológicas. Revelam-se excelentes

marcadores de diagnóstico, prognóstico, orientação terapêutica, avaliação de doença

residual mínima e avaliação de resposta/resistência à terapêutica instituída.

As amostras de sangue e medula óssea processadas no Laboratório de Genética

Molecular do IPO Porto são colhidas em EDTA (a heparina inibe a reacção de PCR). O

processo de extracção do material genético (DNA e RNA) é feito por salting-out, sem

recurso a kits de colunas hidrofílicas. O material genético extraído é analisado com

recurso às técnicas que seguidamente se descrevem.

4.1.1. PCR

4.1.1.1.Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction)

Uma reacção de PCR Simples é um processo automatizado que envolve a

amplificação de “genes” in vitro. A reacção necessita essencialmente do seguinte:

- Sequência de DNA que se pretende amplificar (DNA molde);

- Um par de primers (RNA primases) sintéticos de cadeia simples e

complementares às extremidades 3’ dos fragmentos de DNA molde;

- Nucleótidos livres (dNTPs);



- Enzima para a síntese do DNA (DNA Polimerase), resistente a altas

temperaturas;

- MgCl2 – cofactor da DNA Polimerase;

- Tampão de reacção ideal ao funcionamento da DNA Polimerase utilizada.

Consiste numa série de ciclos, cada um dos quais envolvendo reacções

efectuadas a temperaturas diferentes. Cada ciclo de PCR envolve os seguintes passos:

- Desnaturação da dupla cadeia de DNA (94 a 96ºC, 2 a 5 minutos);

- Emparelhamento (annealing) dos primers foward e reverse (55 a 70ºC

consoante os primers utilizados, 30 segundos a 1 minuto); os primers vão emparelhar

com as cadeias simples de DNA porque estão presentes em concentração muito elevada

em relação à concentração de DNA existente no meio reaccional;

- Síntese de DNA por acção da DNA Polimerase (polimerização), que usa como

molde a cadeia simples de DNA a que cada primer está emparelhado (1 a 2 minutos, 72

a 74ºC - temperatura mais elevada que para o emparelhamento mas variável consoante a

enzima utilizada - 72ºC para a Taq Polimerase).

O ciclo é repetido várias vezes no aparelho de PCR, demorando cada ciclo

apenas alguns minutos e, por isso, todo o processo é muito rápido. O resultado é a

grande amplificação das sequências de DNA delimitadas pelos dois primers usados na

reacção. Cada n ciclos leva à produção de 2^n moléculas de DNA. No final da reacção o

termociclador mantém-se a 4ºC a fim de conservar o produto de reacção. A quantidade

de DNA que se obtém é suficiente para que este seja directamente visualizado num gel

de agarose, sem recurso a técnicas mais sensíveis.

Se a reacção de PCR for contaminada com DNA estranho, este pode emparelhar

com os primers, mesmo que só parcialmente, e ser amplificado. Para que se evitem

contaminações devem respeitar-se as seguintes condições:

- A área de trabalho deve ser arejada (ar condicionado ou janela) e não ter

ligação com áreas de contaminação;

- A sala de pipetagem dos reagentes, a sala de PCR e a sala de electroforeses

(que está sempre ultra-contaminada) deverão ser isoladas umas das outras;

- As bancadas de trabalho deverão ser descontaminadas com álcool a 100%;

- Todo o material utilizado terá de ser esterilizado, podendo para isso utilizar-se

uma câmara de UV; trabalhar numa câmara de UV é sobretudo importante quando se

manipula produtos de PCR, cujos aerossóis podem contaminar o meio; o operador

deverá mudar de luvas regularmente;



- Todo o material utilizado para PCR (exº: micropipetas) não deverá ser utilizado

para outros fins;

- As micropipetas deverão ser resistentes à formação de aerossóis quando se

trabalha com produtos de PCR;

- Os reagentes devem ser congelados em alíquotas individualizadas para evitar

perdas de actividade e contaminações que iriam fazer perder todo o material;

- Os reagentes deverão estar em gelo durante todo o processo de pipetagem,

sobretudo se se trabalhar com RNA porque trata-se de uma molécula mais facilmente

degradável que o DNA e porque no frio as RNAses (existentes em todo o ambiente e

sem necessidade de co-factor para actuarem) não têm actividade;

- A DNA Polimerase deverá ser o último reagente pipetado;

- Para mix’s que serão distribuídas por 10 amostras, será conveniente pipetar

reagentes para 11 amostras; para 20 amostras, pipetar reagentes para 22 amostras; etc;

- Evitar vortexar os tubos de PCR, agitando os reagentes da reacção com o

auxílio do dedo indicador;

- Para controlo de cada reacção de amplificação deverá sempre utilizar-se um

controlo negativo (feito com tudo excepto com o DNA a amplificar cujo volume é

substituído por água) e um controlo positivo (fornecido pela casa comercial ou com um

resultado fortemente positivo anterior).

4.1.1.2.RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

A reacção de RT-PCR é utilizada sempre que se pretende trabalhar com RNA

em vez de DNA. Tal poderá ser vantajoso porque o RNA não contém os intrões que o

DNA possui, amplificando-se uma zona menor do material genético. Para tal, apenas

tem que se utilizar uma outra enzima, a Transcriptase Reversa (e os respectivos

primers), que converte o RNAm em DNA complementar (cDNA). A partir daí, o cDNA

é amplificado da mesma forma que o DNA por PCR.

4.1.1.3.RT-PCR Nested

O RT-PCR Nested envolve uma primeira reacção de RT-PCR normal em que se

utilizam os chamados primers externos. Segue-se uma segunda reacção de RT-PCR -

realizada com o produto da primeira reacção mas num tubo diferente - em que se



utilizam primers mais internos em relação aos utilizados na primeira reacção; esta

segunda reacção designa-se por Nested.

Este segundo conjunto de primers utilizado na segunda reacção funciona como

um controlo extra ou uma confirmação do primeiro RT-PCR, aumentando a

sensibilidade da reacção aproximadamente de 1:1000 para 1:1x10^6. Ou seja, poderá

acontecer que os primers na primeira reacção se liguem a uma zona diferente

(inespecífica) da que se pretende amplificar, mas nesse caso o segundo conjunto de

primers (mais internos) não se irá ligar ao produto da primeira reacção não havendo

amplificação do sinal; se se fizesse correr num gel de agarose, o produto da primeira

reacção visualizar-se-ia como uma banda (que até poderia apresentar o mesmo peso

molecular que a banda esperada), mas ao se fazer correr noutro gel o produto da

segunda reacção não se obteria qualquer banda.

Também a especificidade do processo aumenta, passando a visualizar-se muito

menos bandas inespecíficas no gel de agarose realizado para o produto da segunda

reacção.

4.1.1.4.PCR Específico de Alelo (ASO-PCR)

Trata-se de uma variação à reacção de PCR utilizada para pesquisar mutações

pontuais. Utiliza um conjunto de primers em que um deles se liga especificamente à

zona de uma mutação pontual no caso de esta estar presente; assim, só nesse caso

haverá amplificação do sinal. Utiliza-se como controlo um terceiro primer (que faz

“pare” com o primer que se liga fora do local da mutação) que se liga a uma zona fora

do local da mutação e que, portanto, deverá amplificar um sinal independentemente de

existir ou não mutação. Como tal, caso haja mutação obter-se-ão duas bandas no gel de

agarose, enquanto que se não houver mutação apenas se obterá uma banda

correspondente ao controlo.

4.1.1.5.PCR de Longa Distância (PCR-LD)

Trata-se de uma variação à reacção de PCR que utiliza uma DNA Polimerase

(com actividade de proofreading) que tem a capacidade de amplificar um fragmento

muito maior de DNA, de 5 kb a 40 kb.



4.1.1.6.PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo

O PCR/RT-PCR determina se o DNA/cDNA em pesquisa está ou não presente

na amostra (avaliação qualitativa). O PCR em Tempo Real determina a quantidade de

DNA/cDNA presente na amostra (avaliação quantitativa).

Teoricamente, a quantidade de produto de PCR obtida duplica no final de cada

ciclo de amplificação (relação exponencial), o que pressupõe que a reacção ocorra com

100% de eficácia em todos os ciclos de amplificação. Contudo, a existência de

inibidores de reacção altera este pressuposto. Para além disso, amplificações tardias são

realizadas com menos eficácia que as primeiras amplificações. Assim, a reacção não é

eternamente exponencial, exibindo uma fase linear e, no final, uma fase de plateau.

Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR (imagem cedida pelo Serviço de Genética,

IPO Porto).

Na fase exponencial de reacção o produto de PCR obtido duplica ao fim de cada

ciclo (100% eficácia); a reacção é muito específica e precisa. Na fase linear os

componentes da reacção começam a esgotar e a reacção começa a abrandar; o produto

de PCR já não duplica no final de cada ciclo. Na fase de plateau os componentes

esgotam-se, não se forma mais produto de PCR, a reacção pára e os produtos de PCR

começam a degradar-se.

Numa reacção de PCR/RT-PCR qualitativo avalia-se o DNA/cDNA obtido no

final da reacção (fase de plateau). Essa avaliação é feita por observação de uma banda

num gel de agarose; contudo, a espessura da banda não permite quantificar o

DNA/cDNA obtido (baixa sensibilidade), apenas permitindo dizer se houve ou não



R Q forward

primer

reverse

primer

3

' 3

' 5

'

5

'

3

' 5

'

5

'

1.

polymerisatio

n

pr

ob

e

R Q

3'

3'

5'

5' 3'

5'

5'

2. strand displacement

Q 3'

3'

5'

5' 3'

5'

5'

3. cleavage

R

3'

5'

5' 3'

5'

5'

4. polymerisation completed

Q R

3'

amplificação, isto é, se o DNA/cDNA está ou não presente na amostra. O PCR

quantitativo avalia a quantidade de DNA/cDNA formada, não na fase de plateau, mas

antes na fase exponencial (específica e precisa), através do uso de um sistema

informático, por análise da cinética da reacção de PCR.

Para quantificação do material genético da amostra pode utilizar-se a técnica de

FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer). Esta técnica baseia-se no princípio de

que quando uma fonte de energia elevada está próxima de uma fonte de energia mais

baixa, haverá transferência de energia da primeira para a segunda.

Segundo esta técnica, um oligonucleótido (sonda TaqMan) é adicionado à mix

de reagentes de PCR/RT-PCR. A sonda é desenhada de forma a ligar-se

especificamente a uma sequência do DNA/cDNA molde entre o primer foward e o

reverse. Assim, a sonda encontrar-se-à no caminho da DNA Polimerase quando esta

começar a copiar o DNA/cDNA. A sonda é desenhada com uma extremidade 5’ de alta

energia (Reporter) e uma extremidade 3’ de menor energia (Quencher). Quando a sonda

está intacta e é excitada por uma fonte luminosa, o Reporter fornece parte da sua energia

ao Quencher, dada a proximidade existente entre ambos, e assim o Reporter não emite

quase nenhuma fluorescência (abaixo do limiar de detecção do instrumento). Quando a

sonda é clivada pela DNA Polimerase a distância entre o Reporter e o Quencher

aumenta, o Reporter deixa de conseguir transferir a sua energia ao Quencher e passa a

emitir toda a sua energia sob a forma de fluorescência. O aumento de fluorescência

emitida pelo Reporter atinge um nível que consegue ser detectado pelo instrumento,

dando origem a uma curva de amplificação.

Figura 11 – Esquema de actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RT-

PCR (imagem cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).



A curva de amplificação contém informação essencial para a quantificação de

DNA/cDNA da amostra. A linha “threshold” correponde ao ponto em que a reacção

atinge uma intensidade de fluorescência detectada pelo aparelho. Esta linha atinge-se na

fase exponencial da reacção de PCR/RT-PCR. O ciclo ao qual a amostra atinge este

nível designa-se por “Cycle Threshold” (CT). Teoricamente, existe uma relação

quantitativa entre a altura em que a amplificação entra em fase exponencial e a

quantidade de DNA/cDNA da amostra; isto é, quanto maior a quantidade de

DNA/cDNA que a amostra contiver, mais rapidamente a sua amplificação entra em fase

exponencial, maior o aumento da fluorescência emitida pelo Reporter e menor o CT da

amostra.

Figura 12 – Leitura do produto de PCR na fase exponencial (threshold of detection); quanto mais

cedo o produto entrar na fase exponencial, maior o número de cópias, maior a quantidade inicial de

material genético da amostra (imagem cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).

A quantidade de DNA/cDNA na amostra a analisar é calculada com base numa

curva de calibração, construída a partir de padrões de concentração rigorosamente

conhecida, que correm na reacção de PCR em Tempo Real ao mesmo tempo e nas

mesmas condições que a amostra.

PCR cycles (

End point

not quantitative

quantiquantitative

) threshold of

detection

detection

C

T

T

TT

Low CT

(high copy no.)

High CT

(low copy no.)

fluorescent signal



4.1.2. Restrição Enzimática

A ocorrência de uma mutação pontual pode originar a criação ou a abolição de

um local de restrição (local de corte do DNA por uma enzima de restrição) e essa

característica pode ser usada para diagnóstico da mutação.

O método consiste na amplificação por PCR Single da região do DNA a

analisar, utilizando-se para isso primers que flanqueiam a região de interesse. O produto

da amplificação é então digerido com a enzima de restrição e os diferentes fragmentos

resultantes da digestão (RFLPs) são separados por electroforese de acordo com o seu

tamanho. Por exemplo, se a mutação não estiver presente a enzima não corta e obtém-se

apenas um fragmento correspondente ao DNA amplificado não digerido; se a mutação

estiver presente a enzima corta e obtêm-se dois fragmentos. Para indivíduos

heterozigóticos obter-se-ão 3 fragmentos, um correspondente ao produto de PCR não

digerido (cromossoma/gene normal) e os outros dois correspondentes ao produto da

digestão enzimática (cromossoma/gene alterado).

4.1.3. Electroforese

4.1.3.1.Electroforese em Gel de Agarose

O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa

solução tampão e deixando polimerizar numa “forma” apropriada. Colocando

previamente um pente, obtém-se um gel contendo uma fileira de poços numa das

extremidades, onde posteriormente serão colocadas as amostras a analisar.

O gel é colocado num tanque de electroforese, imerso em tampão, ficando entre

dois eléctrodos posicionados paralelamente à fileira de poços do gel. Cada amostra é

colocada num poço do gel e, com a aplicação de um campo eléctrico, vão migrar para o

pólo positivo (ânodo), uma vez que os ácidos nucleicos têm carga negativa em pH

neutro.

A agarose funciona como uma peneira, deixando passar mais facilmente as

moléculas mais pequenas que, assim, vão migrar mais do que as moléculas maiores; a

migração é inversamente proporcional ao tamanho. A relação entre o peso molecular do

DNA e a distância percorrida no gel é aproximadamente linear, sendo possível estimar o



tamanho de fragmentos de DNA obtidos quando parando a sua migração em gel com a

migração de fragmentos cujo tamanho é conhecido (marcador de peso molecular, que se

faz correr como uma amostra).

As moléculas do mesmo tamanho migram conjuntamente e formam bandas que

podem depois ser visualizadas com o auxílio de luz ultravioleta num transiluminador.

Para tal, é necessário incluir no gel brometo de etídio, uma substância mutagénica que

se intercala nas cadeias de DNA e que, após exposição a raios UV, emite fluorescência

alaranjada.

Figura 13 – Electroforese em gel de agarose. Marcador de peso molecular à esquerda (imagem

cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).

4.1.3.2.Electroforese Capilar

Sequenciação Automática

Trata-se de um método automático que permite determinar a sequência de

nucleótidos que compõem um fragmento de DNA.

O primeiro passo da reacção de PCR de Sequenciação (feita numa aparelho de

PCR normal, com recurso ao kit próprio para sequenciação) é a desnaturação da dupla

cadeia de DNA. Em seguida, um primer é emparelhado numa zona do DNA cuja

sequência é conhecida. Uma DNA Polimerase é utilizada para sintetizar DNA a partir

da zona de ligação do primer. Contudo, em vez de se adicionar ao meio reaccional

apenas dNTPs normais, adicionam-se também e em excesso derivados didesoxi dos



nucleótidos normais (ddNTPs) que, não possuindo o grupo OH na posição 3’ da

desoxirribose, impedem as ligações fosfodiestéricas do DNA e, assim, que a cadeia de

DNA continue a ser sintetizada.

Cada ddN está marcado com um fluorocromo de cor diferente; isto é, por

exemplo, os ddA estão marcados com um fluorocromo amarelo, os ddC com um

fluorocromo azul, os ddG com um verde e os ddT com um vermelho. Cada ddN está

presente numa proporção que permite que, de quando em quando, seja incorporado no

DNA em vês do dNTP normal correspondente e termine a síntese da cadeia de DNA.

Assim, vão ser sintetizadas uma série de cadeias de DNA com, sucessivamente um

nucleótido de diferença. A relação entre a quantidade de dNTPs e ddNTPs presentes no

meio reaccional é muito importante, sendo essencial que os ddNs estejam em excesso

em relação aos dNTPs para que se obtenham produtos de PCR mais curtos, com apenas

um nucleótido de diferença entre as diferentes cadeias formadas.

Fazendo também uma reacção de sequenciação com um primer que emparelha

com a outra cadeia de DNA, é possível ler a sequência de ambas as cadeias, o que é

sempre aconselhável para evitar erros resultantes de ligações inespecíficas. Assim, para

o PCR de Sequenciação prepara-se uma mix com o tampão, a DNA Polimerase, os

dNTPs, os ddNTPs e a água e essa mix é distribuída por dois tubos – um que leva o

primer foward e outro que leva o primer reverse.

Uma posterior reacção de electroforese irá separar as diferentes cadeias de DNA

formadas de acordo com o seu tamanho. A electroforese capilar apresenta sensibilidade

suficiente para separar cadeias de DNA que apenas diferem em peso 1 bp. As cadeias de

DNA formadas, com carga negativa devido aos grupos fosfato, irão passar através de

um capilar migrando do cátodo para o ânodo devido a uma diferença de potencial que é

gerada pelo aparelho. Os produtos mais leves serão os primeiros a serem transferidos,

conseguindo-se, assim, a separação pretendida. O capilar funciona aqui como o gel de

agarose – polímero que permite a separação.

Por outro lado, o aparelho emite um laser que é feito incidir sobre as cadeias de

DNA à medida que estas passam ao longo do capilar. O laser vai excitar o fluorocromo

a que está ligado o ddNTP terminal de cada cadeia, havendo uma emissão de

fluorescência cujo comprimento de onda (cor) depende do ddNTP em causa. Os sinais

de fluorescência emitidos são detectados, processados e interpretados pelo sistema

informático acoplado ao instrumento. A sequência é automaticamente lida e o resultado

final é um gráfico de “picos” (cromatograma) cada um correspondente a um nucleótido



do DNA sequenciado. Quanto mais altos e agudos forem os picos mais qualidade

apresentam.

Figura 14 – Esquema que representa o processo de Sequenciação Automática (imagem cedida

pelo Serviço de Genética, IPO Porto).

Contudo, quando o DNA que se pretende sequenciar provém de uma prévia

reacção de PCR, antes de se realizar a sequenciação, é necessário remover todos os

“resíduos” da reacção de PCR que iriam interferir com o processo de sequenciação,

como os primers utilizados (para evitar múltiplas sequenciações), os dNTPs (para

manter uma ideal relação dNTPs/ddNTPs), os sais (interferem com a acção da DNA

Polimerase) e produtos de PCR inespecíficos que eventualmente se tenham formado

(para evitar artefactos na sequenciação). Para purificar o produto de PCR inicialmente

feito basta utilizar uma coluna hidrofílica que irá agarrar as moléculas de DNA pela sua

carga negativa e deixar passar todos os “resíduos”; depois basta eluir as moléculas de

DNA. Só no fim desta purificação é que se realiza, então, o PCR de Sequenciação.

Por outro lado, depois de se realizar o PCR de Sequenciação e antes de se

realizar a electroforese capilar, também é necessário executar uma segunda purificação

a fim de se eliminarem os ddNTPs soltos (que iriam interferir com a leitura no aparelho

de sequenciação) e os sais (que iriam interferir com a injecção electrocinética do

aparelho).

Análise de Fragmentos

O processo de separação é idêntico ao utilizado para a sequenciação automática.

Cada pico obtido no cromatograma também corresponde a um fragmento de DNA, seja



ele resultante de digestão enzimática ou o produto inteiro de PCR. Contudo, neste caso

os fluorocromos estão agarrados aos primers que se utilizam na reacção de PCR prévia.

No Anexo 1 encontram-se descritas as alterações genéticas associadas a

determinados processos neoplásicos hematológicos que são pesquisadas no Laboratório

de Genética Molecular do IPO Porto.

No Anexo 2 encontram-se descritos os estudos moleculares realizados no

Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto.

Genética Molecular Humana – Citogenética


4.2. Citogenética

4.2.1. Citogenética Clássica

A Citogenética Clássica é a ciência que estuda o DNA da célula através da

observação individualizada dos cromossomas.

Durante a interfase do Ciclo Celular o material genético da célula está relaxado

e os cromossomas não se conseguem observar individualizados. É só durante a mitose

que o material genético se condensa e conseguem observar-se os cromossomas

individualizados. Das diferentes fases que constituem a mitose, é na metafase que os

cromossomas atingem o máximo de condensação e o centrómero e os dois cromatídeos

de cada um são perfeitamente visíveis ao microscópio óptico. Assim, é apenas neste

período que a análise por Citogenética Clássica detalhada pode ser efectuada, sendo

para isso necessário que as células entrem em divisão celular.

O posterior tratamento e coloração (obtenção de padrões de bandeamento,

definindo-se uma banda como uma parte do cromossoma que é claramente distinta dos

segmentos adjacentes por aparecer mais clara os mais escura) dos cromossomas,

permitem a construção do cariograma - desenho esquemático dos cromossomas

metafásicos da célula do indivíduo, agrupados aos pares e dispostos de acordo com o

seu tamanho, posição do centrómero e padrão de bandas - e a elaboração do cariótipo -

nomenclatura utilizada para descrever a constituição cromossómica, normal ou anormal,

constitucional ou adquirida, do indivíduo.

Tanto o cariograma como o cariótipo fornecem informação acerca do número de

cromossomas por célula, da composição dos cromossomas sexuais (XX para mulher e

XY para homem) e identificam anomalias cromossómicas numéricas ou estruturais,

constitucionais (congénitas) ou adquiridas (alteração neoplásica).

Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) (imagem cedida pelo Laboratório de

Citogenética do IPO Porto).



Figura 16 - Cariótipo com S. Down (47,XY,+21) à esquerda - anomalia numérica constitucional.

Cariótipo com cromossoma Ph - t(9;22)(q34;q11.2) à direita - anomalia estrutural adquirida (imagem

cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).

Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas (imagem cedida pelo

Laboratório de Citogenética do IPO Porto).



Os estudos citogenéticos clássicos envolvem a análise dos cromossomas

encontrados no sangue periférico (cariótipos constitucionais), na medula óssea

(leucemias), em gânglios linfáticos (linfomas), em biopsias de tumor (tumores sólidos)

ou em líquido amniótico (suspeita de invasão o LCR por células neoplásicas). A

colheita é feita em heparina de lítio.

4.2.2. FISH (Fluorescente in situ Hibridization)

A Citogenética Clássica permite visualizar todo o cariótipo de um indivíduo,

detectando quer as alterações genéticas de que o clínico à partida desconfia, quer outras

imprevistas. Contudo, esta técnica não consegue, por si só, identificar todo o tipo de

alterações genéticas até hoje já descritas. As alterações não visualizadas por esta técnica

designam-se por alterações “crípticas” para Citogenética Clássica. Para estas só uma

técnica de Citogenética mais sensível, como o FISH, as consegue detectar.

O FISH (Fluorescente in situ Hibridization – Hibridação Fluorescente in

situ) pode definir-se como a localização morfológica de sequências genéticas, com

recurso a técnicas de fluorescência.

O seu objectivo consiste na determinação da presença ou ausência de fragmentos

específicos de DNA ou RNA e na localização desses fragmentos particulares no

material genético. A identificação de sequências específicas de genes ao longo do

material genético consegue-se explorando as propriedades fundamentais do material

genético, isto é, a sua capacidade de emparelhar de uma maneira específica formando

híbridos entre uma cadeia natural e uma cadeia artificial de ácidos nucleicos, em que a

cadeia artificial constitui a chamada sonda.

Assim, os requisitos básicos para a realização da técnica são a utilização de uma

sonda complementar para a sequência de material genético de interesse e o uso de um

fluorocromo ligado a essa sonda, a fim de que se permita a sua detecção.

Para que a técnica se realize é necessário, antes de mais, ligar o DNA alvo à

superfície de uma lâmina de vidro a fim de manter a estrutura morfológica do material

genético. Segue-se a desnaturação do DNA, por forma a que uma cadeia simples do

DNA alvo e a cadeia simples da sonda complementar à sequência de genes de DNA que

se pretende pesquisar hibridizem (“annealing” da sonda). Segue-se a lavagem do

excesso de sonda, não ligada ao material genético, podendo-se, por fim, detectar o sinal



de fluorescência (emitida pelo fluorocromo ligado à sonda) num microscópio de

fluorescência.

O FISH pode ser utilizado para analisar uma grande variedade de material

biológico, como sangue, medula óssea, gânglios linfáticos, biopsias e até a partir de uma

lâmina de esfregaço de sangue periférico ou medula óssea. Não necessita que o material

genético esteja em metafase, podendo interfases ser analisadas.

Segue-se uma breve explicação de cada um dos tipos de sonda existentes.

Sondas de “Painting” (WCP)

Trata-se de muitas sondas específicas que se unem ao longo de um cromossoma,

parecendo pintar todo o cromossoma.

Figura 18 – FISH, Sondas de Painting para os cromossomas 19, a verde, permitindo confirmar a

presença de material deste cromossoma num cromossoma marcador (imagem cedida pelo Laboratório de


Sondas Alfa-Satélite

O DNA alfa-satélite é composto por elementos de sequência repetitiva,

localizado junto aos centrómeros. Na maioria das vezes, trata-se de sequências

repetitivas específicas de cada cromossoma.

As sondas alfa-satélite vão-se ligar a estes locais, perto dos centrómeros.

Consoante a sua sequência, vão-se ligar especificamente a um determinado

cromossoma. São utilizadas para determinar a ploidia.



Figura 19 – FISH, Sondas Alfa-Satélite para os cromossomas 4, 6, 17, 10, 18 e 21; observa-se

trissomia dos cromossomas 4, 6, 17, 18 e 21 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO

Porto).

Sondas de Sequência Única

São sondas que se ligam a sequências específicas dos cromossomas, sendo úteis

no estudo de micro-delecções.

Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. Uma sonda verde ligada a 5p15.2 (região génica

D5S721 e D5S722) e outra vermelha ligada a 5q31 (região génica EGR1) do cromossoma 5. No exemplo

dado existe delecção do braço longo (q) de um cromossoma 5 - SMD com del(5q) - de onde resulta a

ausência de um sinal vermelho para 5q31 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO

Porto).

D5S721/D5S722

EGR1



Dual Color, Single Fusion

Neste caso os alvos das sondas utilizadas flanqueiam os pontos de quebra de

uma translocação. São úteis na detecção de translocações específicas quando elevadas

percentagens de células apresentam essa translocação.

Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion. Uma sonda flanqueia a região 9q34 do

cromossoma 9 (sinal a vermelho) e outra flanqueia a região 22q11.2 do cromossoma 22 (sinal a verde).

Sempre que existe LMC com t(9;22)(q34;q11.2) com genes de fusão BCR-ABL, em 22q11.2 e em 9q34

respectivamente, a sonda vermelha funde-se com a sonda verde, originando um sinal de fusão amarelo.

“Dual color” (vermelho e verde) corresponde aos cromossomas 9 e 22 não translocados; cor “single”

(amarelo, junto com o sinal vermelho e verde) corresponde a “fusion” dos outros dois cromossomas 9 e

22 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).

ES (Extra Signal)

Com recurso às sondas dual color, single fusion muitas vezes obtêm-se falsos

resultados positivos porque pode acontecer que haja sobreposição casual do sinal

vermelho e verde, originando um sinal amarelo, se os cromossomas estiverem

sobrepostos sem que, no entanto, exista translocação.

Para que se reduza a frequência de falsos positivos devido a co-localização

acidental dos sinais, recorre-se a sondas extra signal; isto é, utiliza-se uma sonda

idêntica à utilizada nas sondas dual color, single fusion (que flanqueia o ponto de

quebra de um gene) e outra sonda grande que, em vez de flanquear o ponto de quebra do

outro gene, cobre / ultrapassa o ponto de quebra. Assim, sempre que ocorrer



translocação, para além do sinal de fusão terá de se observar também um sinal extra que

corresponde ao bocado da sonda grande que partiu como resultado da translocação.

Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal. Uma sonda flanqueia a região 12p13 do cromossoma 12

(sinal a verde) e outra cobre o ponto de quebra 21q22 do cromossoma 21 (sinal vermelho). Sempre que

existe LMA com t(12;21)(p13;q22), com genes de fusão TEL-AML1 nas regiões 12p13 e 21q22

respectivamente, a sonda vermelha funde-se com a verde dando origem a um sinal de fusão amarelo no

cromossoma translocado e a um sinal extra vermelho que resulta da quebra da sonda que cobre a região

21q22. Serão ainda visíveis outro sinal verde e vermelho que correspondem aos cromossomas 12 e 21 não

translocados, respectivamente. Na imagem não se consegue visualizar o sinal verde individualizado do

cromossoma 12 não translocado (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).

Dual Color, Dual Fusion

Trata-se de duas sondas grandes que cobrem os dois pontos de quebra

envolvidos numa translocação em particular. São sondas com elevada especificidade,

reduzindo muito falsos resultados positivos, tal como as sondas extra sinal. Para além

disso, apresentam elevada sensibilidade, uma vez que detectam percentagens baixas de

núcleos com translocação envolvida.

TEL

AML1



Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color Dual Fusion. Uma sonda cobre o ponto de quebra na

região 14q32 do cromossoma 14 (sinal a verde) e outra cobre o ponto de quebra na região 18q21 do

cromossoma 18 (sinal a vermelho). Sempre que existe LNH Folicular com t(14;18)(q32;q21), com genes

de fusão IgH-Bcl2 nas regiões 14q32 e 18q21 respectivamente, metade da sonda verde funde-se com a

sonda vermelha e a outra metade da sonda verde funde-se com a outra metade da sonda vermelha,

originando dois sinais de fusão. O outro cromossoma 14 não translocado dará origem a um sinal verde,

enquanto que o outro cromossoma 18 não translocado originará um sinal vermelho (imagem cedida pelo

Laboratório de Citogenética do IPO Porto).

Dual Color, Break Apart

Este tipo de sonda é útil nos casos em que há vários parceiros possíveis

associados com um ponto de quebra conhecido. É o caso do gene MLL em 11q23 que

pode fundir-se com inúmeros parceiros. Utilizam-se duas sondas de cores diferentes que

flanqueiam o ponto de quebra conhecido, havendo sobreposição do sinal entre elas.

Figura 24 – FISH, Sonda Dual Color, Break Apart para o gene MLL em 11q23, com ligeira

sobreposição das cores verde e vermelha da sonda. O cromossoma 11 não translocado apresenta um sinal



de fusão amarelo. O cromossoma 11 translocado origina a quebra do gene MLL e, assim, das duas

sondas, levando à separação da sonda, com consequente observação de um sinal verde e outro vermelho

separados. Não se sabe com que gene o MLL está translocado (imagem cedida pelo Laboratório de


4.2.3. Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias

Nas últimas décadas numerosas alterações cromossómicas específicas foram

detectadas em neoplasias. Hoje sabe-se que certas alterações citogenéticas estão na

própria origem do próprio processo tumoral. A análise citogenética nas alterações

neoplásicas revela-se importante para o diagnóstico, prognóstico, orientação e

monitorização terapêutica, identificação precoce de recaída e evidência de progressão

tumoral.

Em seguida descrevem-se as alterações citogenéticas mais características de

neoplasias em particular, detectadas por técnicas de citogenética.

Leucemia Mielóide Crónica (LMC)

Translocação entre a banda q34 do cromossoma 9 e a sub-banda q11.2 do

cromossoma 22, envolvendo a fusão dos genes BCR do cromossoma 22 e ABL1 do

cromossoma 9. A presença desta translocação confere bom prognóstico na LMC. A

translocação é identificável por Citogenética Clássica e por FISH com recurso a uma

sonda dual color, single fusion.

LMA com t(8;21)(q22;q22); ETO-AML1

Translocação que envolve a fusão dos genes ETO do cromossoma 8 e AML1 do

cromossoma 21. Encontra-se em cerca de 5% das LMAs e em cerca de 10% das LMA-

M2 da antiga classificação FAB e tem bom prognóstico nas LMAs.É observada por

Citogenética Clássica.

LMA com inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11

Inversão que envolve a fusão dos genes CBFB e MYH11 ambos no cromossoma

16. Encontra-se em 5 a 8% de todas as LMAs e corresponde à antiga LMA-M4eos da

antiga classificação FAB. Confere bom prognóstico. É necessário que as metafases

estejam muito boas (cromossomas bem separados) para que esta alteração seja visível



por citogenética clássica, sendo por isso sempre necessária a avaliação por FISH no

diagnóstico.

Leucemia Promielocítica Aguda com t(15;17)(q22;q12); PML-RARA

Translocação com fusão dos genes PML em 15q22 e RARA em 17q12.

Encontra-se em 5 a 8% de todas as LMAs e corresponde à antiga LMA-M3 (clássica e

variante hipogranular) da antiga classificação FAB. Actualmente todas as antigas LMA-

M3 estão associadas a esta alteração citogenética. Confere bom prognóstico. Alguns

casos são crípticos por citogenética clássica. Nos casos em que há suspeita da

translocação mas ela não é detectada por citogenética clássica a pesquisa é feita por

FISH.

LMA com t(9;11)(p22;q23); AF9-MLL

Translocação com fusão dos genes AF9 em 9p22 e MLL em 11q23. Está

presente em 9-12% das LMAs de crianças e 2% das LMAs de adultos. Está, sobretudo,

relacionada com as antigas LMA-M4 e LMA-M5 da classificação FAB, mas também

por vezes associada às antigas LMA-M1 e LMA-M2. Confere prognóstico intermédio.

O gene MLL pode fundir-se com inúmeros parceiros. As translocações que

envolvem o MLL mais frequentes dão-se com o gene AF9 já descrito (resultando

predominantemente em LMA) e com o gene AF4 (resultando sobretudo em LLA),

embora existam muitas outras. Um terço das translocações que envolvem o gene MLL

não são detectadas por Citogenética Clássica, tendo que ser identificadas por FISH.

Assim, sempre que se suspeita de uma LMA e a Citogenética Clássica não identifica

nenhuma alteração característica, recorre-se ao FISH, utilizando-se para isso uma sonda

dual color, break apart que flanqueia a região 11q23, onde se encontra o gene MLL.

LLA/Linfoma com t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1

Esta translocação é semelhante à que ocorre na LMC, não sendo as duas

situações distintas por citogenética clássica. Só a análise por RT-PCR confere a sua

distinção, por síntese de diferentes transcriptos. Neste caso, a presença da translocação

confere mau prognóstico.



LLA/Linfoma com t(v;11q23); rearranjos do MLL

Tal como já referido, é possível que o gene MLL localizado em 11q23 se

recombine com inúmeros. A fusão que mais frequentemente conduz ao

desenvolvimento de uma LLA dá-se entre o gene MLL e o gene AF4 em 4q21,

originando a t(4;11)(q21;q23). Confere mau prognóstico. Sempre que se suspeita desta

alteração, faz-se por FISH uma sonda dual color, break apart para o gene MLL em

11q23.

LLA/Linfoma com t(12;21)(p13;q22); TEL-AML1

Esta alteração é críptica por Citogenética Clássica, sendo necessário recorrer a

FISH para detectá-la, com uma sonda extra signal para esta translocação. Com esta

sonda é também possível observar a ploidia do cromossoma 21; assim, caso se verifique

hiperploidia deste cromossoma, realiza-se o painel hiperdiplóide para LLA’s

recorrendo a sondas alfa satélite para os cromossomas 4, 6, 10, 17, 18 e 21. É frequente

este tipo de translocação estar associado a triploidias dos cromossomas referidos.

LLA/Linfoma com t(1;19)(q23;p13.3); E2A-PBX1

Translocação que envolve os genes de fusão E2A em 1q23 e PBX1 em 19p13.3,

constituindo 6% dos casos de LLA-B em crianças. Associada a prognóstico

intermédio. Observável por Citogenética Clássica, não sendo pesquisada por FISH.

Leucemia Linfocítica Crónica B (LLC-B)

As alterações citogenéticas mais características são trissomia 12, del(11q22-

23), del(17p13), del(6q21) e del(13)(q14.3). Todas estas alterações são visíveis por

Citogenética Clássica, excepto a del(13)(q14.3). Contudo, sempre que se suspeita de

LLC faz-se o seguinte painel por FISH: trissomia 12, del(11)(q23), del(17)(p13) e

del(13)(q14.3). Para avaliar a trissomia 12 recorre-se a uma sonda alfa satélite. Para

avaliar a del(11)(q23), a del(17)(p13) e a del(13)(q14.3) utilizam-se sondas de

sequência única dirigidas a essas regiões.



Mieloma Múltiplo (MM)

A alteração mais frequentemente detectada envolve uma translocação em 14q32

(gene IgH) conferindo mau prognóstico – t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16.3;q32),

t(14;16)(q32;q23), t(6;14)(p21;q32) e t(14;20)(q32;q11).

Os MM que apresentam uma destas translocações geralmente são não

hiperdiplóides, estando associados a pior prognóstico. Os restantes geralmente são

hiperdiplóides, com ganhos frequentes nos cromossomas 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 ou 21, e

sobrevidas mais longas. Monossomia do cromossoma 13 é detectada em muitos casos,

conferindo mau prognóstico, bem como del(13)(q14) e a del(17)(p13), esta última

associada a progressão da doença.

A t(4;14)(p16.3;q32), a del(13)(q14) e a del(17)(p13) são crípticas por

Citogenética Clássica; a t(14;16)(q32;q23) é muito difícil de visualizar por esta técnica.

Assim, sempre que se desconfia desta patologia faz-se o seguinte painel por FISH:

del(13)(q14) e del(17)(p13) com sondas de sequência única para estas regiões. Recorre-

se também a uma sonda dual color, break apart para a região 14q32 e no caso desta

última dar como resultado a existência de uma translocação envolvendo o cromossoma

14, pesquisam-se as translocações t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16.3;q32) e

t(14;16)(q32;q23) por sondas dual color, dual fusion. Para além disso, sempre que a

Citogenética Clássica revela um cariótipo hiperdiplóide, utiliza-se um kit para a

pesquisa de hiperploidia nos cromossomas 5, 9 e 15.

Linfoma Folicular

Este linfoma caracteriza-se por rearranjos no gene Bcl2 em 18q21, sobretudo

pela t(14;18)(q32;q21) (gene IgH), observável por Citogenética Clássica. Contudo,

sempre que há suspeita de um LNH Folicular, utiliza-se também por FISH uma sonda

dual color, dual fusion para a t(14;18)(q32;q21).

Linfoma do Manto

A alteração citogenética mais característica é a t(11;14)(q13;q32), estando

presente na maioria dos casos e sendo considerada a anomalia primária. Contudo, esta

alteração não é patognomónica da patologia, podendo aparecer noutras alterações

neoplásicas. Esta alteração é observável por Citogenética Clássica. No entanto, sempre

que há suspeita de um LNH do Manto, utiliza-se também por FISH uma sonda dual

color dual fusion para esta translocação.



Linfoma Difuso de Grandes Células B

Cerca de 30% dos casos apresentam anomalias em 3q27, envolvendo o gene

Bcl6, como a t(3;14)(q27;q32) (gene IgH em 14q32). Translocações envolvendo o gene

Bcl2 em 18q21, como a t(14;18)(q32;q21) característica também de linfoma folicular,

estão presentes em 20 a 30% dos casos. Estas duas translocações são observáveis por

Citogenética Clássica. Contudo, sempre que há suspeita deste LNH pesquisam-se

alterações envolvendo o gene Bcl6 em 3q27 com recurso a uma sonda dual color, break

apart, e pesquisa-se a t(14;18)(q32;q21) com recurso a uma sonda dual color, dual

fusion por FISH.

Linfoma de Burkitt

A maioria dos casos apresenta rearranjos do gene MYC em 8q24, originando a

t(8;14)(q24;q32) (gene IgH em 14q32) ou, mais raramente, a t(8;22)(q24;q11) (gene

IgL κ) ou a t(2;8)(p12;q24) (gene IgL loci), todas elas visíveis por Citogenética

Clássica. Sempre que se suspeita deste tipo de linfoma faz-se também por FISH a

pesquisa de alterações envolvendo o gene MYC em 8q24, utilizando-se uma sonda dual

color, break apart.


5. Bioquímica Clínica e Endocrinologia

Os estágios decorreram no Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão

Pinto, SA, em Lisboa, na secção de Bioquímica Clínica, durante os meses de Julho e

Agosto, sob a orientação da Drª Margarida Baptista. Os estágios perfizeram um total de

344 horas (264 horas de Bioquímica Clínica e 80 horas de Endocrinologia).

No Laboratório Reymão Pinto a secção de Bioquímica Clínica compreende as

áreas de Bioquímica, Endocrinologia, Serologia, Imunologia e Alergologia. O

laboratório recebe, em média, 500 amostras por dia.

Antes da realização do estágio, a estagiária já tinha algum conhecimento da área,

tanto a nível teórico, com os conhecimentos adquiridos nas valências de Bioquímica

Clínica I e II, Fisiopatologia, Imunologia, Virologia e Métodos Instrumentais de Análise

do Mestrado de Análises Clínicas, como a nível prático, dado que passou todo o ano de

2008 a trabalhar nesta secção do Laboratório.

A estagiária percorreu todas as fases do processo laboratorial - pré-analítica,

analítica e pós-analítica -, debruçou-se sobre os fundamentos de funcionamento e a

manutenção de todos os equipamentos, sobre os métodos bioquímicos que apoiam as

determinações analíticas e sobre a validação dos diferentes parâmetros analíticos.

Participou, ainda, nos programas de controlo de qualidade interno e externo.

5.1. Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados

5.1.1. Modular Hitachi SWA, Roche

Analisador especificamente adaptado para a quantificação de parâmetros

imunológicos (Módulos E) e bioquímicos (Módulos P e ISE) e. Aplica métodos de

medição por Potenciometria, Espectrofotometria, Imunoturbidimetria e

Quimioluminescência.

Bioquímica Clínica e Endocrinologia


Módulos E:

Parâmetro Método Amostra

Ac Anti-HAV Totais Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Ac Anti-HAV IgM Electroquimioluminescência (Captura) Soro/Plasma

Ac Anti-HBe Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Ac Anti-HBc Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Ac Anti-HBs Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Ac Anti-HCV Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Ac Anti-Tiroglobulina (Anti-Tg) Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Ac Anti-Peroxidase (Anti-TPO) Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Ag HBe Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

AgHBs Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

CA 19-9 Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

CA 125 Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

CA 15-3 Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

CEA Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Estradiol (E2) Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Ferritina Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Folato Electroquimioluminescência (Competição) Soro

FSH Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

FT3 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

FT4 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

LH Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Prolactina (PRL) Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Progesterona Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

PSA Livre Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

PSA Total Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

T3 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

T4 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

Tiroglobulina (Tg) Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

TSH

(hormona estimuladora da tiróide) Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma

Vitamina B12 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma



Módulos P:

Parâmetros Método Amostra

Ácido Úrico Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma/Urina

Albumina Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma

Aldolase Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma

Amilase Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma

Aminotransferase Alanina (ALT) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma

Aminotransferase Aspartato (AST) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma

Ac. Anti-estreptolisina O (ASLO) Imunoturbidimetria Soro/Plasma

Bilirrubina Directa Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma

Bilirrubina Total Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma

Cálcio Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma Hep/Urina

Colesterol HDL Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma Hep.

Colesterol LDL Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma Hep.

Colesterol Total Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma

Creatina Cinase (CK) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma

Creatinina Espectrofotometria (M. Cinético) Soro/Plasma/Urina

Desidrogenase Láctica (LDH) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma

Factor Reumatóide Imunoturbidimetria Soro/Plasma

Ferro Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma Hep

Fosfatase Alcalina (ALP) Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma Hep.

Fósforo Espectrofotometria (UV) Soro/Plasma/Urina

Frutosamina Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma

Gama Glutamil Tranferase (GGT) Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma

Glucose Espectrofotometria (M. Enzimático UV) Soro/Plasma /Urina/LCR

IgA Imunoturbidimetria Soro/Plasma

IgG Imunoturbidimetria Soro/Plasma

IgM Imunoturbidimetria Soro/Plasma

Magnésio Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma /Urina

Microalbuminúria (MAU) Imunoturbidimetria Urina

Proteína C Reactiva (PCR) Imunoturbidimetria Soro/Plasma

Proteínas Totais Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma

Proteínas Totais na urina e LCR Imunoturbidimetria Urina/LCR

Transferrina Imunoturbidimetria Soro/Plasma Hep.

Treponema Pallidum (TPLA) Imunoturbidimetria Soro

Trigliceridos (TG) Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma

Ureia Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma /Urina



Módulo ISE:

Parâmetros Método Amostra

Ionograma (Sódio, Potássio e Cloro) Pontenciometria Indirecta com Eléctrodos Selectivos Soro

Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche

5.1.2. Cobas Integra 400 Plus, Roche

Sistema que permite consolidar todos os testes de bioquímica clínica – enzimas,

substractos, iões, drogas de abuso e terapêuticas e proteínas específicas – com rapidez e

facilidade. Integra quatro métodos diferentes: absorvância fotométrica para enzimas e

substractos; imunoturbidimetria para proteínas específicas; fluorescência polarizada

para drogas terapêuticas; potenciometria, com eléctrodo selectivo para iões.


Ácido Valpróico Fluorescência Polarizada Soro

Alfa1-Antitripsina Espectrofotometria Soro

Apoliporoteína A Imunoturbidimetria Soro

Apoliporoteína B Imunoturbidimetria Soro

C3 Imunoturbidimetria Soro

C4 Imunoturbidimetria Soro

Carbamazepina Fluorescência Polarizada Soro

Digoxina Fluorescência Polarizada Soro

Enzima Conversão Angiotensina (ECA) Espectrofotometria Soro

Fenitoína Fluorescência Polarizada Soro

Hemoglobina A1C Imunoturbidimetria Sangue Total EDTA

Lipase Espectofotometria Soro

Lítio Potenciometria Soro

Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche

5.1.3. Hydrasys Sebia, Phadia

Permite processar de um modo semi-automático análises electroforéticas de

proteínas humanas no soro e urina.



Técnica Método Amostra

Electroforese das Proteínas Electroforese de zona em gel de agarose 8 g/L,

com tampão tris-barbital pH 9.2 Soro

Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia

5.1.4. Urisys 2004, Roche

É um fotómetro de reflectância totalmente automatizado, para medições semi-

quantitativas in vitro de tiras teste de urina.


Densidade Específica Refracção Fotométrica

Urina

Turvação Transmitância Fotométrica

Cor

Reflectância Fotométrica Tir

as

pH

Nitritos

Proteínas

Glicose

Cetonas

Urobilinogénios

Bilirrubinas

Leucócitos

Eritrócitos

Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche

5.1.5. Immulite 2000, Amerlab

Equipamento que efectua imunoensaios por quimioluminescência,

automatizando todo o procedimento.




ACTH

Fotoquimioluminescência

(Sandwich)

Plasma EDTA

Fetoproteína (AF) Soro/Liquido Amniótico

Calcitonina Soro/Plasma Hep.

Cortisol Soro

Creatina Quinase-MB (CK-MB) Soro/Plasma Hep.

Delta–4–Androstenediona Soro

Estriol Livre Soro

Fosfatase Ácida Prostática (PAP) Soro

Globulina de transporte das hormonas sexuais (SHBG) Soro

Gonadotropina Coriónica Humana (β – HCG) Soro/Urina

Gonadotrofina Coriónica Humana Livre

(β – HCG livre) Soro

Homocisteina Plasma/Soro

Insulina Soro/Plasma Hep.

Péptido C Soro/Plasma Hep.

Proteína A do plasma associada à gravidez (PAPP–A) Soro

PTH Plasma EDTA /Soro

Somatomedina (IGF-1, Factor de Crescimento I da Insulina) Soro/Plasma Hep.

Somatotrofina (hGH, Hormona do Crescimento Humano) Soro

Sulfato de De-hidroepiandrosterona (DHEA-SO4) Soro

Testosterona Total Soro

Testosterona Livre (Testosterona Total/SHBG)

x100 Soro

Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab

5.1.6. Vidas, bioMérieux

É um sistema multiparamétrico de imunoensaio cujo princípio de doseamento

associa o método imunoenzimático sandwich em duas etapas com uma detecção final

em fluorescência (ELFA- Enzyme Linked Fluorescent Assay).



Testes de Diagnóstico:


β2–Microglobulina


(Sandwich)

ELFA

Soro/Plasma

Citomegalovirus IgG

Citomegalovirus IgM

Citomegalovirus IgG Avidez

Helicobacter pylori IgG

HIV Duo (I e II)

Mioglobina

NT-ProBNP

Toxoplasmose IgG Avidez

Troponina I

Testes Confirmatórios:


Ac Anti-HBc


(Sandwich)

ELFA

Soro/Plasma

Ag HBs

Rubéola IgG

Rubéola IgM

Toxoplasmose IgG

Toxoplasmose IgM

Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux

5.1.7. Vidia, bioMérieux

Equipamento de imunoensaio que utiliza a tecnologia de

fotoquimioluminescência, recorrendo a diferentes métodos, todos baseados na

tecnologia ELISA. Para os parâmetros realizados no laboratório Reymão Pinto utiliza o

método da ELISA Indirecta na detecção de IgG’s e o método de Imuno-Captura na

detecção de IgM’s.


Rubéola IgG Fotoquimioluminescência (ELISA Indirecto) Soro/Plasma

Rubéola IgM Fotoquimioluminescência (Imuno-Captura) Soro/Plasma

Toxoplasmose IgG Fotoquimioluminescência (ELISA Indirecto) Soro

Toxoplasmose IgM Fotoquimioluminescência (Imuno-Captura) Soro

Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux



5.1.8. Serologia Manual

Parâmetro Agente/Patologia Método Amostra

Reacção de Wuddleson / Reacção de

Wright, BioSystems Brucella abortus

Aglutinação Soro Reacção de Rosa de Bengala, Weybridge Brucella abortus

Células LE / LE Teste, Omega Diagnostics Lúpus Eritematosos Sistémico (LES)

MonoTeste / Paul Bunnell, Innovacon Mononucleosa Infecciosa Cromatografia Soro/ Plasma/

Sangue total

Reacção de Weil Félix, BioSystems Proteus

Aglutinação

Soro Reacção de Widal, BioSystems

Salmonella typhi e Salmonella

paratyphi

RPR / VDRL / Reacção de Wassermann,

Bio Rad Treponema pallidum Soro/Plasma

Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual

Todas as reacções serológicas, à excepção do teste para diagnóstico da

mononucleose infecciosa, têm como princípio reacções de aglutinação entre o antigénio

do reagente e os anticorpos da amostra.

5.2. Métodos Analíticos

5.2.1. Potenciometria

Potenciometria é a medida da diferença de potencial eléctrico entre dois

eléctrodos, numa célula electroquímica. Baseia-se na medição do potencial de um

eléctrodo indicador (eléctrodo constituído pelo elemento que se deseja determinar) em

relação a um eléctrodo de referência (eléctrodo para o qual o potencial eléctrico é, por

definição, igual a zero), quando não passa corrente através da solução em que estão

mergulhados. Este potencial depende das actividades das espécies que entram nas

reacções redox correspondentes, através da equação de Nernst.



5.2.2. Fotometria

A fotometria é um método de medição que consiste na determinação da

intensidade da luz absorvida pela amostra a um determinado comprimento de onda da

radiação incidente.

A absorvância varia linearmente com a concentração da amostra. A

determinação da concentração da amostra é feita por extrapolação gráfica, a partir da

absorvância lida pelo aparelho, com base na Lei de Lambert Beer.

Abs= K.[ ]. l

sendo, Abs, a absorvância calculada pelo aparelho

K, a constante de absortividade molar (valor tabelado)

l, a espessura do percurso óptico

[ ], a concentração que se pretende calcular

O Método Colorimétrico é o método que quantifica a intensidade da cor

formada por um composto. Trabalha-se, para isso na zona do visível, entre os 400 e os

800 nm.

Os métodos de determinação que envolvem enzimas incluem a determinação da

actividade enzimática a um tempo fixo (Método Enzimático) e a monitorização

contínua da actividade enzimático (Método Cinético). O Método Enzimático mede a

actividade de uma enzima baseado apenas nos pontos inicial e final da reacção. O

Método Cinético monitoriza a velocidade de aparecimento ou de desaparecimento de

um determinado composto, sendo mais preciso e sensível que o Método Enzimático.

5.2.3. Electroforese

Refere-se à migração de solutos ou partículas com carga, num meio líquido, sob

a influência de um campo eléctrico (mobilidade electroforética). Na electroforese de

zona a migração faz-se sobre um suporte sólido poroso, que poderá ser um gel de

agarose. As moléculas que possuam uma carga eléctrica em virtude da ionização

movem-se para o cátodo ou para o ânodo no sistema de electroforese, dependendo do

tipo de carga que apresentem; a migração dar-se-á para o pólo de sinal contrário à sua

carga. O tampão tem não só a função de conferir carga às partículas, como também a de

conduzir a corrente eléctrica. A mobilidade electroforética é inversamente proporcional



ao tamanho da molécula. O electroretrograma gerado é identificado por corantes

específicos e susceptível de ser quantificado.

5.2.4. Imunoturbidimetria

A turvação causa diminuição da intensidade de um feixe de luz quando este

passa através de uma solução de partículas. A turbidimetria é uma medida da

diminuição da intensidade da luz incidente causada pela dispersão, reflecção e absorção

do feixe de luz incidente de uma dada intensidade. A turvação é medida a 180º em

relação ao feixe incidente, o que significa que o detector está na mesma direcção que o

feixe de luz incidente (diferença em relação à nefelometria).

A Imunoturbidimetria é um método de medição da taxa de formação de

imunocomplexos Ag/Ac in vitro, com misturas mais concentradas de reagentes, de

forma a que os imunocomplexos tornem a solução suficientemente turva. Utiliza-se uma

quantidade constante e em excesso de anti-soro específico e, ao se adicionar a amostra

com Ag, vai-se medindo a formação progressiva de imuncomplexos numa célula

fotoeléctrica, na forma de densidade óptica.

5.2.5. Aglutinação

Os ensaios de aglutinação que pesquisam a presença de Ac dependem da

disponibilidade de uma partícula recoberta com o Ag apropriado (reagente). A partícula

pode consistir num eritrócito, exibindo os seus Ag naturais, ou numa partícula sintética

(por exemplo, uma partícula de látex) que é artificialmente recoberta com Ag. Na

presença do Ac específico no soro do doente, as partículas sofrem agregação. A

formação de agregados pode ser visualizada numa simples lâmina de vidro.

O processo pode ser invertido e utilizado para a detecção de Ag. Neste caso, a

partícula é coberta com Ac específicos.

5.2.6. Fluorescência Polarizada

O fenómeno de fluorescência corresponde à emissão de radiação sob a forma de

luz de um dado composto. Pressupõe, portanto, a prévia absorsão de radiação. Assim,



ao ser excitado, o composto fluorescente absorve radiação de uma determinada energia

e a um determinado c.d.o; ao passar ao estado fundamental liberta energia sob a forma

de radiação/luz/cor (fluorescência), sendo essa libertação menos energética que a

absorção de radiação prévia e, portanto, a radiação será emitida a um c.d.o. superior ao

c.d.o. da absorção.

Na fluorescência polarizada mede-se a mudança na despolarização de

fluorescência após reacções imunológicas. Se o relaxamento de um composto for mais

lento que o seu tempo de declínio de fluorescência (como é o caso de moléculas grandes

marcadas com fluoróforos), a fluorescência emitida será polarizada. As pequenas

moléculas têm tempos de relaxamento mais curtos que os seus tempos de declínio de

fluorescência. Como tal, a fluorescência emitida é despolarizada. Contudo, se essa

molécula for ligada a uma grande molécula ou se for colocada numa solução viscosa,

emitirá luz polarizada.

5.2.7. ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay)

Trata-se de ensaios imunoenzimáticos que funcionam por fixação de Ag ou Ac a

uma superfície sólida, como, por exemplo, um orifício de uma placa de microtitulação

ou uma partícula de plástico (esfera, cone, etc). A amostra é aplicada e os Ac ou os Ag

em pesquisa, vão-se ligar especificamente aos Ag ou Ac da superfície sólida,

respectivamente, durante um período de incubação. Segue-se uma lavagem da superfície

sólida para que o material não ligado seja retido do meio reaccional. O material ligado é

depois detectado por um segundo Ac marcado com uma enzima. O conjugado que não

estiver ligado é removido com uma segunda lavagem. A revelação final é feita por

acção posterior da enzima sobre um substrato, em que o produto da reacção origina cor

ou quimioluminescência. Os resultados são interpretados após leitura utilizando um

espectrofotómetro de absorvância (quando o produto da reacção é corado) ou de

emissão (quando o produto da reacção emite radiação/fluorescência). A

absorvância/fluorescência será proporcional à quantidade de Ag ou de Ac específico

presente na amostra testada.

Os testes de ELISA possuem muitas variações. Descrevem-se seguidamente as

mais utilizadas e aplicadas no laboratório Reymão Pinto.



5.2.7.1.ELISA para a detecção de Ag

ELISA Sandwich

Trata-se da versão mais comum de ELISA. Um Ac monoclonal é fixado à

superfície sólida. Adiciona-se posteriormente a amostra com os Ag em pesquisa,

incuba-se e lava-se. Junta-se depois ao meio reaccional um Ac secundário específico

para o Ag em pesquisa (que pode ser o mesmo que o Ac ligado à superfície sólida)

conjugado com a enzima. Finalmente, após lavagem do meio reaccional, adiciona-se o

substrato sobre o qual a enzima ligada vai actuar, originando um produto corado ou

quimioluminescente.

ELISA de Competição

A amostra é incubada inicialmente com uma solução que contém Ac específicos

para o Ag em pesquisa. Seguidamente esta mistura é incubada com a superfície sólida

revestida com Ac. Os Ag da amostra que previamente se tiverem ligado ao Ac da

solução já não se irão ligar aos Ac da superfície sólida. Segue-se uma lavagem que irá

remover os complexos Ag/Ac em solução, não removendo, no entanto, os complexos

formados na superfície sólida. Um Ac secundário marcado enzimaticamente é depois

adicionado, indo ligar-se aos Ag da amostra fixados à superfície sólida. Finalmente,

após lavagem do meio reaccional, adiciona-se o substrato sobre o qual a enzima ligada

vai actuar, originando um produto corado ou quimioluminescente. Assim, no ensaio

competitivo quanto maior a concentração de Ag na amostra inicial, menor será a

absorvância ou fluorescência lida.

5.2.7.2.ELISA para a detecção de Ac

ELISA Indirecta

É o método mais utilizado para a detecção de Ac. Consiste na sensibilização da

superfície sólida com um Ag específico para o Ac em pesquisa. Posteriormente



adiciona-se a amostra, indo os Ac presentes ligar-se especificamente aos Ag

imobilizados na superfície sólida e não serão removidos na lavagem. Seguidamente

adiciona-se o Ac secundário marcado enzimaticamente que apresenta especificidade de

ligação para o Ac em pesquisa (trata-se de um anti-Ac). Incuba-se, lava-se novamente e

adiciona-se por último o substrato sobre o qual a enzima vai actuar.

ELISA de Competição

Funciona como a Elisa de Competição para pesquisa de Ag, mas neste caso a

amostra é previamente incubada com uma solução com Ag específicos para os Ac em

pesquisa, sendo superfície sólida revestida com Ag.

ELISA de Captura de Ac

A superfície sólida é recoberta com anti-IgM ou anti-IgG, resultando na

captação de toda a IgM ou IgG do paciente, respectivamente. Seguidamente adiciona-se

ao meio reaccional uma solução com Ag específico na ligação aos Ac IgM ou IgG do

paciente. Segue-se a incubação, a lavagem e a adição de um Ac monoclonal secundário

enzimaticamente marcado específico para o Ag da solução.


6. Microbiologia

O estágio decorreu:

- Na Maternidade Alfredo da Costa, no Serviço de Procriação Medicamente

Assistida, durante a segunda quinzena do mês de Outubro, sob a orientação da Drª Sónia

Correia. O estágio perfez um total de 80 horas.

- No Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, SA, em

Lisboa, na Secção de Microbiologia, durante os meses de Novembro e Dezembro de

2009 sob a orientação da Drª Margarida Baptista. O estágio perfez um total de 320

horas.

Antes da realização do estágio, a estagiária já tinha algum conhecimento da área,

tanto a nível teórico, com os conhecimentos adquiridos nas valências de Microbiologia,

Parasitologia, Micologia e Anatomofisiologia (espermogramas) do Mestrado de

Análises Clínicas, como a nível prático, dado que passou todo o ano de 2007 a trabalhar

na secção de Microbiologia do Laboratório Dr. Manuel Reymão Pinto, SA.

A necessidade sentida por parte da estagiária em aperfeiçoar a técnica de

realização de espermogramas, feita, regra geral, com muito mais pormenor e com outros

critérios, sobretudo morfológicos, na área da Fertilização in Vitro, fê-la recorrer à

Maternidade Alfredo da Costa, especificamente com esse fim. Assim, os aspectos

descritos relacionados com a realização de espermogramas são os aplicados na

Maternidade.

O Laboratório Reymão Pinto, SA, recebe em média 150 amostras

microbiológicas diariamente.

Na Maternidade Alfredo da Costa analisam-se 8 espermogramas por dia.

Na área da Microbiologia o principal objectivo é fornecer informação relevante e

válida, que dê ao clínico ferramentas para o processo de diagnóstico de uma doença

infecciosa, o que significa detectar e identificar o agente causal, para que seja possível

estabelecer o diagnóstico e o tratamento adequado à infecção

Microbiologia


6.1. Meios de Cultura

C.P.S. ID3: Meio cromogénico usado para o isolamento, identificação e contagem das

colónias das bactérias presentes na urina; E. coli (produtoras de ß-glucuronidase):

coloração vermelho escuro; Enterococcus (produtor de glucosidase): coloração

turquesa; Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) (exprimem ß-

Glucosidase): coloração verde a castanha esverdeada; Proteae (exprime desaminase):

coloração castanha.

COLUMBIA ANC + 5% DE SANGUE (CNA): Meio selectivo que permite o

desenvolvimento das bactérias Gram (+); a presença de sangue permite a expressão da

hemólise.

CHOCOLATE POLYVITEX (PVX): Meio selectivo para o isolamento do género

Neisseria, Haemophilus e Streptococcus pneumoniae.

CHOCOLATE POLYVITEX + VCAT: Meio selectivo para o isolamento da

Neisseria gonorrhoeae.

CHOCOLATE HAEMOPHILUS: Meio selectivo para o isolamento do género

Haemophilus.

MacCONKEY: Meio selectivo para o isolamento das bactérias Gram negativas; tendo

cristal de violeta, permite evidenciar a fermentação de lactose pela viragem do vermelho

neutro; os microorganismos que fermentam a lactose originam colónias rosas ou

vermelhas; os outros originam colónias incolores ou ligeiramente beges.

CHAPMAN (Manitol Salgado): Meio selectivo para o isolamento do Staphilococcus

aureus.

GELOSE SS: Meio selectivo para o isolamento do género Salmonella e Shigella;

SM ID 2 (SM2): Meio selectivo cromogéneo para identificação de Salmonelas que

aparecem com coloração rosa pálido a roxo.

Microbiologia


CALDO de TODD – HEWITT: Meio de enriquecimento para Streptococcus spp. Os

antibióticos presentes inibem a maioria dos microorganismos Gram (-).

LOWENSTEIN – JENSEN: Meio selectivo em tubo, para o isolamento do género

Mycobacterium;

ALBICANS ID 2 (CAN2): Meio selectivo, cromogéneo, para isolamento dos fungos e

identificação imediata da Candida albicans (colónias azuis); as restantes colónias do

género Candida são pigmentadas de rosa.

6.2. Condições de Incubação das Sementeiras

Estão disponíveis comercialmente geradores que permitem obter as diferentes

atmosferas necessárias para a cultura de microrganismos patogénicos em laboratório:

CO2, microaerofília e anaerobiose.

A temperatura óptima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos

ronda os 35-37ºC; alguns, contudo, podem desenvolver-se a temperaturas mais baixas,

como a Listeria spp. (4ºC), e outros a temperaturas mais elevadas, como o

Campylobacter spp. (42ºC).

A maioria dos microrganismos tem desenvolvimento optimizado com uma

humidade igual ou superior a 70%. Para manter a humidade numa estufa pode colocar-

se um recipiente com água no seu interior.

6.3. Equipamentos

6.3.1. Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux

Utilizam-se as seguintes cartas de identificação:

Cartas de Identificação de Gram-Negativos (GN);

Cartas de antibiograma Gram-Negativos (AST-N020);

Cartas de identificação Gram-Positivos (GP);

Microbiologia


Cartas de antibiograma Gram-Positivo (AST-P534), para analisar a

sensibilidade aos antibióticos dos estreptococos dos grupos B e

enterococos;

Cartas de antibiograma Gram-Positivo (AST-P536), para analisar a

sensibilidade aos antibióticos dos estafilococos;

Cartas de identificação bioquímica das Leveduras (YST).

6.4. Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos

6.4.1. Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux

Utilizada para a identificação de Neisseria, Haemophylus e Moraxella

catarralis. Permite fazer a fenotipagem do Haemophylus influenza e do Haemophylus

parainfluenza, bem como detectar a presença da penicillinase.

6.4.2. Coloração de Gram

De acordo com as diferenças estruturais da parede celular, existem bactérias que

retêm o complexo cristal de violeta - Iodo, após descoloração com uma mistura de

Álcool - Éter, ficando com uma cor púrpura (Gram-Positivas), enquanto que outras

não o retêm ficando com a coloração dada pelo corante de contraste utilizado, vermelho

(Gram-Negativas).

6.4.3. Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de

Kinyoun modif. ou de Tan - Thiam - Hok)

O método baseia-se na capacidade de alguns microrganismos, designadamente o

género Mycobacterium e algumas espécies do género Nocardia (N. asteroides, N.

brasiliensis e N. caviae), em virtude das composição da sua parede celular em ácidos

micólicos, em reterem a Fucsina básica fenicada. Esta não é removida pela acção de

uma mistura descorante, constituída por Etanol e um Ácido mineral forte. Assim, os

bacilos álcool-ácido-resistentes coram de vermelho sobre um fundo azul, dado pelo

corante de contraste (solução aquosa de azul de metileno).

Microbiologia


6.4.4. Teste da Catalase

A catalase desdobra o peróxido de hidrogénio (3%) em água e oxigénio. O teste

é positivo se se observar a formação de bolhas oxigénio.

6.4.5. Prova da Coagulase

A coagulase é uma enzima termoestável produzida principalmente pelas estirpes

de S. aureus, servindo a prova para identificar esta espécie. A prova é positiva no caso

de se observar a existência de coagulação.

6.4.6. SLIDEX Strepto Plus

Este teste identifica o grupo a que a estirpe de Streptococcus pertence.

6.4.7. Teste do Tubo Germinal

Prova da filamentação para identificação de Candida albicans.

6.4.8. Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China

Permite a visualização de espiroquetas e das cápsulas de Cryptococcus

neoformans.

6.5. Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos

Biológicos:

6.5.1. Urina Asséptica

Enterobacteriaceae; Enterococcus; Pseudomonas sp.; Acinetobacter sp.;

Staphylococcus aureus, S. saprophyticus, Mycobacterium sp. e Candida albicans.

Microbiologia


6.5.2. Exsudado Uretral e Vaginal

Trichomonas vaginalis; Gardnerella vaginalis (só vaginal); Candida albicans;

Neisseria gonorrhoeae; Streptococcus do Grupo-B de Lancefield (só vaginal em

grávidas). Outros microorganismos patogénicos são Treponema pallidum sp.,

Haemophilus ducrey e Calymatobacterium granulomatis.

6.5.3. Exsudado Nasofaríngeo

Streptococcus - hemolíticos. Quando solicitado ou em cultura abundante

valorizar também Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenzae e H.

parainfluenzae; Staphylococcus aureus; Corynebacterium diphtheriae; Neisseria

meningitidis; Bordetella pertussis.

6.5.4. Expectoração

Streptococcus pneumoniae; H. influenzae e H. parainfluenzae; Mycobacterium

sp.; apenas nos bronquíticos crónicos e/ou quando é isolada em cultura predominante ou

pura Nocardia sp. e Branhamella catarrhalis.

6.5.5. Fezes

Salmonella sp. (S. typhi; S. cholerasuis; S. enteritidis); Shigella sp.;

Campylobacter fetus spp. jejuni; Yersinia enterocolitica.

6.5.6. Hemoculturas

Streptococcus - hemolítico (se for S. pneumoniae, houver endocardite ou se

voltar a ser isolado numa segunda hemocultura); Staphylococcus epidermidis (se houver

material de prótese implantado no doente).

Microbiologia


No Anexo 3 encontra-se um resumo da selecção de agentes anti-microbianos

feita para os diferentes microorganismos na secção de Microbiologia do Laboratório

Reymão Pinto, SA.

6.6. Espermogramas

6.6.1. Avaliação Macroscópica Inicial

- Deverá ser feita logo que o esperma esteja liquefeito e, no máximo, uma hora

após a colheita;

- Entre a colheita e a análise o esperma poderá ficar à temperatura ambiente

(preferencialmente) ou na estufa a 37º (diminui mais a motilidade);

- Homogeneizar gentilmente o esperma no recipiente original; não vortexar e,

em caso de se utilizar uma pipeta, optar pelas de grande calibre;

6.6.1.1.Liquefacção e Viscosidade

- Uma amostra normal liquefaz no máximo em 60 minutos; caso o esperma

forme um fio com mais de 2 cm considerar “liquefacção incompleta” e “aumento da

viscosidade”;

- O aumento da viscosidade poderá estar associado a diminuição da motilidade

ou da concentração de espermatozóides e poderá dever-se a:

Presença de auto-Ac;

Infecção do tracto reprodutor masculino;

Disfunção prostática (o líquido prostático é responsável pela liquefacção

espermática);

- Em caso de liquefacção incompleta/aumento da viscosidade deverá proceder-se

gentilmente a liquefacção mecânica (com uma seringa e agulha) ou adicionar-se ao

esperma uma enzima digestiva.

Microbiologia


6.6.1.2.Aparência

- Aparência normal: opalescente;

- Aparência anormal:

Transparente: baixa concentração espermática;

Esbranquiçado: presença de leucócitos;

Avermelhado: presença de eritrócitos;

Amarelado: icterícia ou toma de vitaminas.

6.6.1.3.Volume

- Medido por pipeta de vidro elevado calibre (o plástico interfere com a

motilidade espermática);

- 2 mL < Valores de Referência < 5,0 mL.

6.6.1.4.pH

- Medido com papel indicador, ao fim de 30 segundos;

- 7.2 < pH Valores de Referência < 8.3;

- pH baixo é sugestivo défice de liquido das vesículas seminais (confere pH

alcalino); pH elevado é sugestivo de défice de líquido prostático (confere pH ácido).

6.6.2. Avaliação Microscópica Essencial

- Deverá ser feita logo que o esperma esteja liquefeito e, no máximo, uma hora

após a colheita;

- Realizada preferencialmente num microscópio de contraste de fase;

6.6.2.1.Estimativa da Concentração Espermática

- Preparação a fresco;

- Serve para decidir a diluição que será feita, a fim de determinar posteriormente

a concentração espermática;

Microbiologia


Nº de spz por campo de 40x Diluição

1 - 2 -

3 - 15 1:5

15 – 40 1:10

40 – 200 1:20

> 200 1:50

Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática.

-

Amostras com 1 – 2 spz / campo deverão ser centrifugadas (600 RPM; 15

minutos), rejeitando-se o sobrenadante, a fim de se avaliar posteriormente a motilidade

e morfologia; a concentração será dada como < 2x10^6;

- Amostras sem espermatozóides deverão ser centrifugadas (3000 RPM; 15

minutos), rejeitando-se o sobrenadante; só se considera que a amostra é azoospérmica se

em todo o sedimento obtido não se visualizar nenhum espermatozóide; se se

visualizarem espermatozóides a concentração será dada como < 1x10^6;

- Para ejaculados sem espermatozóides deverão fazer-se os seguintes testes

subsequentes:

Teste da Frutose (fornece energia aos espermatozóides, entrando no

conteúdo das vesículas seminais);

Exame de esperma numa urina após masturbação (possível ejaculação

retrógrada).

6.6.2.2.Motilidade

- Preparação a fresco de duas lâminas;

- Avaliar, no mínimo, 5 campos por lâmina;

- Classificação dos espermatozóides (dar valor percentual):

(a) Motilidade progressiva rápida (≥ 4 cabeças/segundo);

(b) Motilidade progressiva lenta;

(c) In situ;

(d) Imóveis (se >50% deve fazer-se o teste da vitalidade).

- Valores de Referência:

a + b > 50% ou

a > 25%

Microbiologia


6.6.2.3.Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides

- Poderão estar presentes:

Células Epiteliais;

Eritrócitos (hematospermia);

Leucócitos (leucocitospermia para > 5 leucócitos/campo);

Células Germinativas Imaturas;

Cristais;

Microorganismos:

o Gardnerella vaginalis;

o Leptotrix vaginalis;

o Trichomonas vaginalis;

o Candida albicans;

o Sarcoptes scabiei;

o Pthirus púbis.

6.6.2.4.Agregação e Aglutinação

- Agregação: aderência de espermatozóides imóveis entre si ou de

espermatozóides móveis a outras células que não espermatozóides;

- Aglutinação:

Aderência de espermatozóides móveis entre si, agarrados cabeça a

cabeça, cauda a cauda ou uma mistura das duas aparências;

Poderá indicar a presença de:

- Infecção, geralmente associada a leucocitospermia;

- Auto-Ac anti-espermatozóides, devendo fazer-se o teste da

sua presença.

6.6.2.5.Concentração Espermática

- Efectuar a diluição pré-determinada numa solução feita com:

Formol 5 mL;

Azul de Metileno 2,25 mL;

Microbiologia


NaCl 0,9% 42,75 mL.

- Agitar mediante vórtex a mistura durante pelo menos 15 segundos;

- Encher a Câmara de Neubauer (em cima e em baixo) com a diluição preparada

e aguardar 5 minutos para que a amostra sedimente;

- Contar os espermatozóides inteiros e as cabeças em:

Todos os quadrados, se existirem menos de 10 espermatozóides por

quadrado;

Dez quadrados, se existirem 10 a 40 espermatozóides por quadrado;

Cinco quadrados, se existirem mais de 40 espermatozóides por quadrado.

- No mínimo deverão contar-se 200 espermatozóides em cada uma das duas

contagens; se as duas contagens derem valores muito diferentes, deverá fazer-se uma

nova diluição e contagem;

- Por cada quadrado, contar os espermatozóides que apenas se encontrem em

cima de duas linhas;

- Cálculo da Concentração Espermática (nº de spz/mL):

Nº espermatozóides contados x Nº de quadrados contados x Factor de Diluição x 1000

Nº de quadrados totais da Câmara de Neubauer

NOTA: 1000 tem em conta a espessura da Câmara de Neubauer.

- Valores de Referência:

Concentração Espermática: ≥ 20x10^6 spz/mL;

Número total de Espermatozóides: ≥ 40x10^6 por ejaculado

(concentração x volume ejaculado).

6.6.2.6.Morfologia

- Poderá ser feita directamente a partir da Câmara de Neubauer, embora se

prefira o recurso a uma técnica de coloração, como o Papanicolaou;

- Valor de referência: >15% de espermatozóides normais.

- Contar 200 espermatozóides com a objectiva de imersão de 100x, anotando os

espermatozóides:

Microbiologia


Normais:

- Cabeça com comprimento 4-5 μm e largura 2,5-3,5 μm

(usar micrómetro), com relação comprimento/largura de 1,5 a

1,75;

- O acrossoma (contém enzimas que ajudam os spz a

penetrar na zona pelúcida dos óvulos) compreende 40 a 70% da

cabeça; a região pós-acrossómica contém o núcleo dos spz;

- Vacúolos ocupam menos de 20% do tamanho da cabeça;

- Gotas citoplasmáticas (resíduos da maturação

espermática; alteração da maturação final no epidídimo) ocupam

menos de 1/2 do tamanho da cabeça;

- Cauda 1,5 vezes maior que a cabeça, não enroladas e

mais fina que a peça intermédia.

Com anomalia da cabeça:

- Alteração do tamanho (macrocéfalos, microcéfalos);

- Alteração da forma (piriforme, redonda, amorfo/forma

anormal);

- Com vacuolização que ocupe mais de 20% da cabeça;

- Acrossoma que ocupa menos de 40% da cabeça;

- Cabeças duplas;

- Pinhead (caudas sem cabeça; não contar; só referir se

forem muitos).

Com anomalia da peça intermédia:

- Peça intermédia forma um ângulo de 90º com a cauda;

- Inserção assimétrica na cabeça;

- Partida (a cabeça descai);

- Estreita, grossa ou Irregular.

Com a anomalia da cauda:

- Curta;

Microbiologia


- Múltipla;

- Partida,

- Enrolada;

- Gota citoplasmática que ocupa mais de 1/2 da cabeça.

Com anomalia mista (associação de 2 ou mais defeitos em zonas

diferentes);

6.6.3. Avaliação Microscópica Complementar

6.6.3.1.Teste da Vitalidade

- Deve executar-se se a percentagem de espermatozóides imóveis exceder os

50%;

- Reflecte a percentagem de espermatozóides vivos;

- Devem contar-se 200 espermatozóides;

- Valor de Referência: ≥ 50% espermatozóides vivos.

- Técnicas existentes utilizadas:

Teste da Eosina-Nigrosina:

- Misturar eosina, nigrosina e sémen; observar uma gota do preparado

ao microscópio;

- Os espermatozóides mortos (membrana rota) irão incorporar a eosina,

aparecendo vermelhos; os espermatozóides vivos manter-se-ão

incolores; a nigrosina origina um fundo escuro que facilita a

visualização da lâmina;

Teste da Hipo-Osmolaridade (HOS):

- Mistura uma solução hipo-osmótica e sémen; observar uma gota do

preparado ao microscópio;

Microbiologia


- Os espermatozóides mortos não irão sofrer transformação; os

espermatozóides vivos, por estarem numa solução hipo-osmótica irão

entumescer e, consequentemente, enrolar a cauda;

6.6.3.2.Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides

- Deverá ser feito sempre que se observe aglutinação entre espermatozóides

(móveis);

- Avalia a produção de IgA e IgG contra os espermatozóides do próprio;

- Os espermatozóides são antigénicos; geralmente existe uma barreira que evita

o seu contacto com o sangue; quando esta barreira se rompe (traumatismo,

infecção ou vasectomia) os linfócitos B entram em contacto com o sémen, o que

leva à produção de Auto-Ac. anti-espermatozóides;

- Contagem de 200 espermatozóides;

- Técnica efectuada:

MAR Teste (Mixed Antiglobulin Reaction test):

- Misturar sémen e partículas de látex com Ig (IgA ou IgG); depois

adicionar o anti-soro anti-Ig (A ou G); ver ao microscópio 3 a 10

minutos depois;

- A presença de aglutinados entre espermatozóides e as partículas de

látex indica a presença de auto-Ac anti-Ig (A ou G);

- Valor de Referência: < 50% dos spz sem partículas de látex aderidas.

6.6.3.3.Testes Opcionais – Testes Bioquímicos

- Devem ser executados no líquido seminal desprovido de espermatozóides;

Para a próstata:

o Zinco:

- Valor de Referência ≥ 2,4 μmol/ejaculado;

Para as vesículas seminais:

o Fructose:

- Valor de Referência ≥ 13 μmol/ejaculado;

Microbiologia


Para o epidídimo:

o α-glucosidase neutra;

- Valor de Referência ≥ 20 um/ejaculado;

6.6.4. Nomenclatura

NORMOZOOSPERMIA

Ejaculado normal definido pelos vários Valores de Referência.

ASPERMIA

Ausência de ejaculado.

HIPOSPERMIA

Volume de esperma abaixo dos Valores de Referência.

HIPERESPERMIA

Volume de esperma acima dos Valores de Referência.

AZOOSPERMIA

Ausência de espermatozóides no ejaculado.

POLIZOOSPERMIA

Concentração espermática > 250x10^6 spz/mL.

OLIGOZOOSPERMIA

Concentração espermática < 20x10^6 spz/mL.

OLIGOZOOSPERMIA GRAVE

Concentração espermática < 5x10^6 spz/mL.

ASTENOZOOSPERMIA

Motilidade abaixo dos Valores de Referência.

Microbiologia


TERATOZOOSPERMIA

Morfologia abaixo do Valor de Referência.

OLIGOASTENOTERATOZOOSPERMIA (OTA)

Combinação das 3 definições anteriores.

NECROZOOSPERMIA

Vitalidade abaixo do Valor de Referência.


7. Controlo de Qualidade

O processo de controlo da qualidade tem por objectivo prever os problemas que

possam alterar a estabilidade das amostras e dos reagentes e verificar o estado de bom

funcionamento dos sistemas analíticos, de forma a assegurar que os resultados obtidos

cumprem os requisitos de qualidade exigidos, para que tenham utilidade clínica.

O controlo da qualidade dos resultados inicia-se na fase pré-analítica com a

correcta preparação do doente, colheita das amostras biológicas, seu transporte e

conservação. Passa pela fase analítica através dos procedimentos de manutenção dos

equipamentos, controlo e calibração dos sistemas analíticos, avaliação dos métodos

utilizados, correlação entre dados clínicos e laboratoriais e ensaios inter-laboratoriais.

Engloba também a fase pós-analítica com uma adequada validação dos resultados.

7.1. Controlo de Qualidade Interno

O objectivo do controlo de qualidade interno é garantir a fiabilidade e

reprodutibilidade dos resultados diários do laboratório e indicar a possível necessidade

de efectuar acções correctivas em situações de não conformidade, de forma a permitir

que os resultados obtidos cumpram os requisitos de qualidade exigidos.

Para além do treino prévio do pessoal envolvido, compreende essencialmente

duas fases operacionais: o controlo interno e a calibração.

Para controlo interno recorre-se a um material de controlo, que é um produto

biológico com valores conhecidos usado na verificação do desempenho das técnicas,

reagentes e equipamentos usados para o diagnóstico analítico. O controlo interno é

efectuado diariamente de forma a garantir a qualidade dos resultados. É executado e

avaliado antes de se processarem as amostras e, periodicamente, no decorrer da fase

analítica. Os resultados são registados num gráfico e comparados com os Limites

Aceitáveis de Erro (média ± 2 desvios padrões), apenas sendo validado se os resultados

se encontrarem dentro do intervalo de confiança.

Quando um determinado parâmetro analítico está fora do controlo realiza-se

uma calibração e os resultados do controlo de qualidade desse analito são novamente

processados e analisados.

Controlo de Qualidade


A calibração dos parâmetros analíticos consiste num conjunto de operações que

estabelecem, em condições especificadas, a relação entre valores de grandeza indicados

por um instrumento de medição ou um material de referência e os correspondentes

valores obtidos através de padrões. Para tal recorre-se a um calibrador - um material de

referência de composição qualitativa ou quantitativa bem definidas, adequado para o

analito a analisar, adaptado ao método utilizado e aferido por padrões de referência.

A partir desta fase, o equipamento encontra-se pronto para processar as

amostras.

Para todos os aparelhos bioquímicos e hematológicos das instituições onde a

estagiária passou efectou-se no mínimo um nível de controlo interno diariamente antes

do início do trabalho e outro a meio do trabalho.

Para cada reacção de PCR realizada no Laboratório de Genética Molecular do

IPO Porto, utiliza-se um controlo negativo (água de PCR) e um controlo positivo.

Para cada série de lâminas de imunofluorescência utiliza-se um controlo interno

positivo e outro negativo no Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral.

Na secção de Microbiologia do Laboratório Reymão Pinto, SA, utiliza-se um

controlo interno sempre que se executam os testes da catalase e coagulase.

Semanalmente utiliza-se um controlo interno para testar as colorações utilizadas. Para

verificar a validade do procedimento de determinação de Urinas Assépticas utilizam-se

semanalmente cartas de estirpe padrão para Staphylococcus aureus (ATCC 25923),

Escherichia coli (ATCC25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853).

7.2. Avaliação Externa da Qualidade (AEQ)

A Avaliação Externa de Qualidade é efectuada mediante a realização de ensaios

inter-laboratoriais, permitindo a cada laboratório avaliar a exactidão dos seus resultados.

O Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil participa em

ensaios inter-laboratorias a nível nacional com o INSA (Instituto Nacional de Saúde Dr.

Ricardo Jorge)1 e a nível internacional com o UK-NEQAS

3 (United Kingdom National

External Quality Assessment Service).

Controlo de Qualidade


O Laboratório Reymão Pinto participa em ensaios inter-laboratorias a nível

nacional com o INSA e a nível internacional com o RIQAS (Randox International

Quality Assessment Sample), com o UK-NEQAS e com o Quality Club da Phadia.


ParteII

Auto-Imunidade

Metodologias Laboratoriais para

Diagnóstico e Seguimento

Terapêutico

Hospital Curry Cabral,

Serviço de Nefrologia

Laboratório de Imunologia

Orientadora Drª Maria do Céu Santos

Auto-Imunidade


1. Sistema Imunológico e Auto-Imunidade

A resposta imunológica é uma sequência complexa e regulada de eventos,

envolvendo vários tipos de células, que permite a eliminação de agentes invasores

estranhos ao organismo. Inicia-se quando um antigénio penetra no organismo e entra

em contacto com células apresentadoras de antigénio (APC); estas células possuem na

sua superfície antigénios leucocitários humanos (HLA II) e exibem a capacidade de se

ligar (através dos HLA II superficiais) e processar o antigénio exógeno de forma a que

este possa ser depois reconhecido por linfócitos T Auxiliares CD4 antigénio-

específicos. Estes linfócitos tornam-se activos e, por sua vez, promovem a activação de

outras classes de linfócitos, como os linfócitos T Citotóxicos CD8 e os linfócitos B.

Seguidamente, estes linfócitos activados executam as suas funções efectoras específicas

que, na maioria dos casos, eliminam com sucesso o antigénio. Os linfócitos T

Citotóxicos produzem enzimas (perforina e granzimas) que conduzem à morte por lise

de células do hospedeiro infectadas intracelularmente com o antigénio. Os linfócitos B,

por seu turno, produzem anticorpos, conduzindo à formação de imunocomplexos

(conjunto antigénio-anticorpo); os imunocomplexos formados neutralizam o antigénio

ou conduzem à activação do sistema do complemento ou à fagocitose do antigénio

(ADCC – Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos); em qualquer um dos três

casos, o resultado é sempre a inactivação/destruição do agente invasor. Em cada etapa

deste processo as células imunológicas comunicam entre si por contacto directo ou

através da produção de citocinas reguladoras. Todas as respostas são fisiologicamente

controladas com precisão e normalmente terminam após a eliminação do antigénio

estimulador.

Os HLA II exibidos na superfície das células APC de diferentes indivíduos são

ligeiramente diferentes, variando em alguns aminoácidos da sua estrutura. Estas

pequenas variações determinam que diferentes indivíduos respondam de forma desigual

quando expostos ao mesmo antigénio. Justificam, assim, a maior propensão que certos

indivíduos apresentam para resistir a determinados antigénios ou, pelo contrário, para

desenvolver certo tipo de patologias.

Cada anticorpo (imunoglobulina) produzido pelos linfócitos B é constituído por

duas cadeias leves iguais entre si (κ ou λ) e duas cadeias pesadas iguais entre si (γ, μ, ε,

α ou δ). Consoante o tipo de cadeias pesadas que constitui o anticorpo, assim a sua

classe: γ para IgG (os anticorpos mais abundantes), μ para IgM (os primeiros anticorpos

Auto-Imunidade


a serem produzidos durante a resposta imunológica), ε para IgE (os anticorpos

especialmente produzidos durante reacções alérgicas), α para IgA (os principais

anticorpos produzidos nas mucosas do organismo) e δ para IgD (sem grande função

reconhecida). A porção Fc do anticorpo determina as suas propriedades físicas e

biológicas, sendo igual para anticorpos da mesma classe; a porção Fab é aquela que se

liga, de forma específica, ao antigénio invasor. Designa-se por epítopo o grupo de

resíduos de aminoácidos do antigénio que se liga ao anticorpo e contra o qual a resposta

imunológica é dirigida.

Figura 25 – Estrutura dos anticorpos (imunoglobulinas). A verde representa-se as duas cadeias

pesadas e a azul as duas cadeias leves, unidas por pontes dissulfureto. A fracção Fab é a zona de ligação

ao antigénio. As regiões hipervariáveis da região Fab são as responsáveis pela maior especificidade na

ligação antigénio-anticorpo.

Toda a referida resposta imunológica é específica. Isto é, o sistema imunológico

tem a capacidade de detectar diferenças subtis entre inúmeros antigénios, respondendo a

cada um deles de forma individualizada e única; consoante o antigénio invasor, será

diferente a sua ligação ao HLA II das células APC, a sua ligação (depois de processado)

ao receptor TCR dos linfócitos T e a sua ligação ao anticorpo (tem de existir

complementaridade antigénio-anticorpo para que haja ligação). Por este motivo, o

sistema imunológico tem a capacidade de discriminar entre o próprio (“self”) e o não

próprio, de modo que em condições normais responde de forma vigoroso a antigénios

que lhe são estranhos, mas coexiste pacificamente com proteínas que compõem o

hospedeiro.

Auto-Imunidade


As Doenças Autoimunes (DAI) caracterizam-se por uma resposta imunológica

exagerada contra os antigénios do próprio indivíduo (perda do “self”), com consequente

formação excessiva de auto-anticorpos (anticorpos dirigidos contra antigénios

próprios), sem que se detecte a presença de um agente infeccioso ou antigénio tumoral.

Felizmente a prevalência destas doenças é baixa, sendo apenas de cerca de 5%.

O reconhecimento de auto-antigénios dentro de certos limites é fisiológico e até

essencial para o desenvolvimento de respostas imunes efectivas. Naturalmente

reconhece-se a presença de anticorpos circulantes que reconhecem auto-antigénios;

estes anticorpos designam-se por “auto-anticorpos naturais” e são geralmente IgG,

embora também possam ser IgA ou IgM.. Parecem ser essenciais para a manutenção da

vida (papel fisiológico da Autoimunidade controlada), uma vez que:

- Efectuam a clearance dos corpos apoptóticos que resultam da apoptose e dos

imunocomplexos formados;

- São importantes na vigilância imunológica de células cancerígenas;

- Desencadeiam uma resposta imune rápida, por reagirem rapidamente com

agentes patogénicos que exprimem epítopos semelhantes aos auto-antigénios (reacção

cruzada);

- Criam circuitos reguladores que evitam a Autoimunidade patogénica/excessiva

(como se explica, mais a diante).

Mas como é que surgem estes auto-anticorpos naturais?

Em circunstâncias normais, logo a nível dos órgãos linfóides primários, de entre

todos os linfócitos produzidos pelo organismo, são apenas seleccionados os que

apresentam receptores (BCR no caso dos linfócitos B e TCR no caso dos linfócitos T)

com afinidade média para os auto-antigénios. Assim, no timo, os linfócitos T com TCR

que confere:

- Baixa afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, não

existe transmissão de sinal; este linfóctito T sem nenhuma reactividade ao “self” sofre

morte intra-tímica;

- Elevada afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, é

induzida uma força de sinalização excessivamente forte que conduz a um sinal

apoptótico; o linfócito T também sofre morte intra-tímica (Selecção Negativa);

Auto-Imunidade


- Média afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, é

induzido um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); são estes linfócitos T com alguma

afinidade para auto-antigénios que sofrem uma consequente maturação intra-tímica,

saindo depois para o sangue periférico.

Os linfócitos B, na medula óssea, com BCR que confere:

- Baixa afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, não

existe transmissão de sinal; estes linfócitos B sem nenhuma reactividade ao “self”

sofrem morte intra-medular;

- Elevada afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, sofrem

edição do receptor BCR (rearranjo genético do BCR que conduz à substituição de uma

fracção da porção Fab). Se a edição do receptor falhar, os linfócitos B também sofrem

morte intra-medular (Selecção Negativa). Se o rearranjo for bem sucedido, é induzido

um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); estes linfócitos B com alguma afinidade para

auto-antigénios sofrem consequente maturação intra-medular, saindo depois para o

sangue periférico;

- Média afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, é

induzido um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); estes linfócitos B com alguma

afinidade para auto-antigénios também sofrem uma consequente maturação intra-

medualr, saindo depois para o sangue periférico.

Como nem todos os auto-antigénios são apresentados aos linfócitos no timo e

medula óssea, verifica-se a presença de linfócitos auto-reactivos no sangue periférico

que são depois sujeitos a uma Selecção Negativa nos órgãos linfóides secundários, a

nível dos quais os linfócitos que apresentam reactividade aos auto-antigénios aí

existentes também são eliminados (Tolerância Periférica).

Isto é, em circunstâncias normais, dentro dos precursores dos linfócitos T e B,

sobrevivem apenas os que reconhecem, dentro de certos limites, auto-antigénios.

Contudo, dois processos podem contribuir para a alteração dos fenómenos

imunológicos, conduzindo a um super-reconhecimento de auto-antigénios, surgindo

assim as DAI:

1- Disfunção do Sistema Imunitário (deficiência nos mecanismos de regulação

dos processos imunitários):

Normalmente os linfócitos B e T auto-reactivos existem mas estão inactivos em

circulação por estarem directamente ligados a certas citocinas ou ligados a linfócitos T

Auto-Imunidade


Reguladores; estas ligações directas conduzem à tradução de sinais inibitórios que

impedem a activação dos linfócitos auto-reactivos. Assim, distúrbios nas citocinas ou

falência na supressão podem conduzir à activação dos linfócitos auto-reactivos,

induzindo a uma Autoimunidade excessiva e patológica.

2- Reacções cruzadas por semelhança nos epítopos dos auto-antigénios e dos

antigénios estranhos:

As reacções cruzadas podem ocorrer por dois motivos:

- O antigénio estranho induz alterações celulares nos auto-antigénios que fazem

com que os linfócitos deixam de os reconhecer como próprios;

- O antigénio estranho mimetiza os auto-antigénios, estimulando directamente os

linfócitos auto-reactivos por ser molecularmente semelhante aos auto-antigénios.

A etiologia das DAI é geralmente multi-factorial, onde factores extrínsecos e

intrínsecos contribuem para a patogénese e progressão da patologia:

1. Factores Extrínsecos:

- Infecções (promovem alterações celulares);

- Tabaco;

- Drogas;

- Radiação UV;

- Metais pesados;

- Produtos químicos.

2. Factores Intrínsecos:

- Idade;

- Factores hormonais (embora a progesterona seja imunossupressora, os

estrogénios e a prolactina potenciam a resposta imunológica; daí que as DAI sejam,

regra geral, mais frequentes nas mulheres);

- Deficiências na via do Complemento (défice no C1q e C4 impedem a remoção

eficiente dos corpos apoptóticos) e nas células reguladoras (Imunodeficiência);

- Factores Genéticos (Predisposição Genética):

o Sistema HLA (a expressão de haplotipos particulares do Sistema HLA

aumenta a susceptibilidade para as DAI; praticamente todas as DAI

Auto-Imunidade


revelam uma associação com este Sistema; o mesmo é dizer que existem

genes de susceptibilidade à doença; por exemplo, quem expressa HLA

DR2 ou 3, apresenta uma maior proporção para o desenvolvimento de

Lúpus Eritematoso Sistémico);

o Activação e regulação celular (genes não HLA também regulam a

resposta imunitária, pelo que podem contribuir para uma predisposição

genética para certas DAI; por exemplo, genes localizados no

cromossoma X parecem desempenhar papel importante no

desenvolvimento das DAI);

o Apoptose (deficiência no gene Fas leva a que a apoptose não ocorra,

perpetuando-se o estado de proliferação);

Geralmente, nas DAI verifica-se a presença de “antigen speading” que se

define como a exposição de autoantigénios crípticos como consequência do

processoauto-imune, o que leva à presença de novos auto-anticorpos ao longo da

doença, com consequente aparecimento de novas DAI.

Auto-Imunidade


2. Doenças Auto-Imunes (DAI)

2.1. DAI Multi-Sistémicas

DAI

Multi-sistémica Fisiopatologia

Epidemiologia e

Associação HLA

Manifestações Clínicas e

Laboratório Auto-anticorpos Presentes

Lúpus Eirtematoso

Sitémico

(LES)

Os queratócitos que sofrem

apoptose geralmente concentram-se

em vesículas (corpos apoptóticos),

evitando a sua exposição ao meio

envolvente.

Nos doentes com LES, por factores

genéticos, existe comprometimento

da remoção destes corpos

apoptóticos (deficiente depuração),

o que conduz à exposição de

antigénios à superfície celular e à

sua acumulação em circulação. Com

o tempo estes antigénios sofrem

alterações estruturais tornando-se

imunogénicos. Verifica-se, então,

desenvolvimento de uma resposta

imunológica inespecífica de órgão,

sendo activados linfócitos B, T e

células APC. Os linfócitos B

produzem auto-anticorpos contra os

antigénios, formando-se

imunocomplexos (Ag-Ac). Os

imunocomplexos formados activam

a via comum do complemeto,

havendo deposição destes

complexos a nível dos tecidos

(glomerulonefrite).

Os defeitos imunológicos combinam-

se com factores ambientais, como

infecções virais e radiações UV (daí

a fotossensibilidade). Estes agentes

aumentam o processo de apoptose

e favorecem alterações estruturais

nos antigénios deficientemente

depurados, exacerbando todo o

processo pré-existente.

Afecta 40 em 100 000

pessoas.

Proporção

mulheres:homens 9:1 (os

estrogénios aumentam a

formação de auto-ac anti-

DNA).

Afecta todas as idades.

Afecta sobretudo negros.

HLA DR2 e DR3.

Geral envolvimento de

todos os orgãos:

-Poliartrite (artralgias

simétricas) 90%;

- Rubor e lesões cutâneas,

fotossensibilidade,

“butterfly rash” 85%;

- Glomerulonefrite 70%;

- Atingimento do SNC

(AVC, intelecto, memória,

aprendizagem) 70%;

- Miopatias 30 a 50%;

- Alterações do

parênquima pulmonar

18%;

- Alterações do TGI (dor

abdominal) 20%;

- Alterações cardíacas;

- Manifestações

hematológicas (anemia

hemolítica, linfopénia,

trombocitopénia);

- Manifestações

inespecíficas (fadiga,

febre, anorexia, dor de

cabeça, queda de cabelo,

úlceras orais);

- (…)

Laboratório:

- Hemograma: anemia

hemolítica, neutropénia,

linfopénia,

trombocitopénia;

- Diminuição do Fe sérico

e transferrina;

- Urina: possível

proteinúria e hematúria (se

glomerulonefrite

associada)

Auto Ac. Principais:

- DNAds (elevada

especificidade, sendo critério de

diagnóstico; importante também

na monitorização porque se

relaciona com a actividade da

doença; pode surgir até 10

anos antes do diagnóstico);

- Sm (elevada especificidade,

sendo critério de diagnóstico;

aparece em 30% dos casos

mas só se manifesta nesta

patologia; aparece pouco antes

do diagnóstico; não serve para

monitorização porque não varia

com a actividade da doença);

Outros Auto Ac. Importantes:

- DNAss;

- Histonas (LES induzido por

drogas);

- Nucleossoma (importante na

monitorização porque altos

títulos relacionam-se com

elevada actividade da doença e

envolvimento renal; aparece em

indivíduos com LES sem

DNAds);

- SS-A (Ro) e SS-B (La)

(relacionam-se com Síndrome

de lúpus neonatal – bloqueio

congénito cardíaco em recém-

nascidos; presente em 50% dos

casos);

- PCNA (elevada especificidade

mas aparece apenas em 3%

dos casos).

- Scl-70; - RNA Polimerase II e III; - U1-snRNP; - hn-RNP; - Lâmina A, B, B2 e C;

- RNA Polimerase I;

- NOR;

- RNA helicase II;

- sp100 e PML;

- Ku.

- Ribossomal (geralmente

envolvimento do SNC e sem

DNAds);

- Mitocondrial;

- Golgi.

Outros Ac.:

- Anti-Cardiolipinas IgG e IgM;

- Anti-C1q (relaciona-se com

LES em risco de doença renal –

nefrite lúpica)

Figura 26 – “Butterfly

rash”, LES, DAI Multi-

Sistémicas.

Auto-Imunidade


DAI

Multi-sistémica Fisiopatologia

Epidemiologia e

Associação HLA


Laboratório Auto-anticorpos Presentes

Síndrome Antifosfolipídico

(SAF)

Presença de auto-anticorpos

dirigidos contra a proteína β2-

Glicoproteina I. Esta proteína vai

depois ligar-se à maioria das

cargas negativas das cabeças dos

fosfolípidos, como a cardiolipina (é

co-factor da cardiolipina). Os

fosfolípidos atacados encontram-

se, sobretudo, nas camadas

endoteliais capilares e membranas

plaquetares.

Afecta 40 em cada

100 000 pessoas.

Sobretudo

mulheres entre 15 e

30 anos ou acima

dos 60 anos.

Afecta sobretudo

indivíduos com

LES.

- Tromboses arteriais e venosas

recorrentes;

- Trombocitopénia;

- Em grávidas conduzem a abortos

repetidos, HTA, pré-eclampsia e

Diabetes gestacional.

Laboratório:

- Hemograma: trombocitopénia

moderada;

- Presença de anticoagulante

lúpico.

Anticorpos anti-fosfolipídicos:

- Anti-Cardiolipina IgG e IgM

(presentes em SFA mas

também em infecções);

- Anti-β2-Glicoproteina I

(diferencia os ac. cardiolipina

relacionados com infecções

dos não relacionados com

infecções, embora um nº

significativo de doentes com

infecções permaneça positivo

também com β2-Glicoproteina

I); só altos títulos

correspondem a SAF,

podendo baixos títulos

corresponder a infecções;

Artrite Reumatóide

(AR)

Produção de auto-anticorpos anti-

IgM (factor reumatóide), com

consequente deposição de

imunocomplexos nas articulações.

Segue-se um chamamento de

leucócitos a este local com

produção de citocinas e

proliferação das células sinoviais

das articulações com formação do

panus (tecido granular que crece

tipo tumor benigno). Tal evento

leva à libertação de enzimas que

gradualmente vão destruindo a

cartilagem e o osso. As citocinas

libertadas entram em circulação,

sendo as responsáveis pelas

manifestações extra-articulares.

Afecta 40 em cada

100 000 pessoas.

Sobretudo

mulheres, na

proporção de 3:1.

Afecta todas as

idades.

HLA DRB1 e DR4

(80% dos casos).

- Sinovite (inflamação das

articulações) simétrica , sobretudo

das mãos e pulsos, mas também

pés, tornozelos, ombros e coluna;

- Destruição das artticulações e

formação de nódulos em torno das

articulações interfalângeas, com

dor crónica associada;

- Anquilação (dificuldade de

movimento), sobretudo logo pela

manhã;

- Manifestações extra-articulares:

coração, pulmões, SNC, olho,

músculos, rins, TGI, etc;

- Manifestações inespecíficas

(febre, anorexia, fadiga, anemia).

Laboratório:

- Hemograma: anemia

normocrómica e normocítica;

possível trobocitose e eosinofilia.

Auto Ac. Principais:

- Factor Reumatóide (baixa

especificidade);

- Anti-CCP “cyclic citrullinated

peptides” (especificidade de

95% para AR; a mesma

sensibilidade que FR; pode

aparecer anos antes das

manifestações clínicas).

Outros Auto Ac.:

- hnRNP;

- RNA Polimerase I;

- NOR.

Síndrome de Sjögren (SS)

Etiologia desconhecida. Os auto-

anticorpos atacam os tecidos

epiteliais glandulares (glândulas

exócrinas salivares e lacrimais) e

extra-glandulares.

Sobretudo

mulheres na

proporção 9:1.

Aparecimento entre

os 30 e os 60 anos.

- Inflamação com aumento das

glândulas salivares; redução da

salivação;

- Inflamação das glândulas

lacrimais; olhos secos, com ardor

e sensíveis à luz; conjuntivite;

- Manifestações extra-glandulares:

envolvimento do SNC (depressão),

envolvimento pulmonar,

envolvimento renal (nefrite

intersticial, glomerulonefrite),

envolvimento hepático

esplenomegália, linfoadenopatias,

úlceras nas pernas;

- Manifestações inespecíficas

(fadiga).

Laboratório:

- Crioglobulinas (20%).

Auto Ac. Principias:

- SS-A (Ro);

- SS-B (La) (mais especifico

mas menos sensível que SS-

A);

Outros Auto Ac.:

- RNA Polimerase II e III;

- sp100;

- Centrómero;

- Centríolo;

- Mitocôndria;

- Golgi.

Fig 27 – Sinovite das

mãos, AR, DAI Multi-

Sistémicas.

Fig 28– Aumento das

parótidas, SS, DAI Multi-

Sistémicas

Auto-Imunidade


Fig 30 – Necrose do dedo,

F. Raynaud, DAI

MSSistémicas

DAI Multi-sistémica

Fisiopatologia Epidemiologia e Associação HLA


Laboratório

Auto-anticorpos Presentes

Esc

lero

se P

rog

ress

iva

Sis

tém

ica

ou

Esc

lero

der

mia

(sub

-div

isão

con

soan

te a

pel

e af

ect

ada)

Lim

itad

a C

utâ

nea

(m

ãos

e fa

ce)

(C

RE

ST

)

Desordem do tecido conjuntivo com excesso de depósito de colagénio,

caracterizada por disfunção endotelial (disfunção vascular, com alteração dos vasos), fibrose e atrofia da maioria dos

órgãos.

Afecta 2 em 1000 000 pessoas.

Sobretudo mulheres na

proporção de 4:1.

Raça negra mais afectada.

Sobretudo 40 a 50 anos. Muito raro em crianças.

- Fenómeno de Raynaud (vasoespasmos dos dedos com inchaço mãos e face de manhã (1º sintoma); - Espessamento esclerótido da pele; - Ulceração das impressões digitais; - Decréscimo na transpiração; - Telangiectasia (dilatação dos vasos superficiais, causando marcas vermelhas na pele); - Rugas periorais (“tobacco bag mouth”; - Depósitos de cálcio na pele; - Envolvimento vascular de outros órgãos (músculos, ossos, TGI, pulmão, rim, coração), sobretudo na forma difusa. CREST: - Calcinose cutânea - Raynaud’s fenómeno - Esofágica, disfunção (diminuição peristaltismo esófago e refluxo gastroesofágico) - eSclerodactilia (espessamento dedeos e mãos, dobrando os dedos) - Telangiectasia Laboratório: - Níveis do C diminuídos;

Auto Ac. Principais: - centrómero (CENP) (elevada especificidade); Outros Auto Ac.: - AMA-M2 (maior susceptibilidade para CBP); - Scl70 (raro); - RNA Polimerase II e III (raro); - U1-snRNP; - Histonas; - SS-A e SS-B; - hnRNP; - RNA helicase II; - centríolos; - Ku (polimiosite com escleroderma); - MSA-2.

Dif

usa

Cu

tân

ea

(pro

gres

são

rápi

da d

os d

edos

par

a o

tron

co)

Auto Ac. Principias: - Scl-70 (elevada especificidade); - RNA Polimerase II e III (relação com crise renal e hipertensão pulmonar); - U1-snRNP; - PM-Scl; -Fibrilharina (U3-nRNP) (elevada especificidade, embora presente em menos de 12% dos casos); - RNA Polimerase I Outros Auto Ac: - AMA-M2 (maior susceptibilidade para CBP); - NOR; - centrómero (raro); - Histonas; - SS-A e SS-B; - hnRNP; - RNA helicase II; - centríolos; -ku; -MSA-2.

Fenómeno de Raynaud

-Aumento da actividade do SN Simpático;

- Elevada reactividade vascular dos dedos a estímulos que conduzem à vasoconstrição (exº: frio e stress);

- Aumento de substâncias vasoactivas em circulação;

- Diminuição da pressão intravascular; ↓

Vasoespasmos das artérias e arteríolas. Consequente destruição dos

vasos sanguíneos com alteração do fluxo sanguíneo, activação plaquetar, aumento da fibrinólise, aumento da viscosidade e do stress oxidativo.

O Fenómeno de Raynaud Secundário

advém de outras patologias.

Sobretudo mulheres na proporção de 5:1.

Sintomas geralmente antes dos 40 anos.

Sobretudo em países

frios.

Fenómeno de Raynaud Primário (Doença de R): - Ataques com 1º palidez; 2º cianose periférica, 3º rubor das mãos e pés; - Dor ao fim de alguns ataques; - Parestesias simétricas; Fenómeno de Raynaud secundário (Síndrome de R): associação com outras patologias como LES, AR, SS, escleroderma e polimiosite - Parestesias assimétricas mais intensas e dolorosas; - Ulceração e gangrena dos dedos das mãos e pés

O diagnóstico não é feito por auto-anticorpos. Contudo, os seguintes podem estar presentes: - Scl-70; - NOR; - Centrómero; - Centríolo; - MSA-2; - Mitocôndria.

Fig 29 – Depósitos de cálcio nas

mãos, Esclerodermia, DAI Multi-

Sistémicas.

Auto-Imunidade




Manifestações Clínicas e Laboratório


Miosites

(miopatias)

Po

limio

site

s

As fibras musculares expressam um MHC-I anormal, o que leva à invasão e activação local de linfócitos T CD8, com consequente destruição das fibras musculares. Uma vez activados, os linfócitos T produzem citocinas que perpetuam a resposta auto-imune.

2 a 8 casos por 1 000 000 pessoas. Sobretudo mulheres de meia idade. Rara em crianças.

- Fraqueza e dor aguda muscular durante semanas ou meses; por vezes, fraqueza dos músculos respiratórios; - Manifestações extra-musculares mais raras que nas dermatomiosites mas podem ocorrer manifestações cardíacas, artralgias, doença intersticial pulmonar; - (Rara) associação com neoplasia maligna da mama, pulmão ou TGI Laboratório: - CK aumento mais de 50x; - Possível aumento de AST, ALT, LDH e aldolase.

Auto Ac. Principais: - SRP (elevada especificidade; pior prognóstico); - Jo-1 (elevada especificidade); - PL-7, PL-12, EJ e OJ (específicos). Outros Auto Ac.: - SS-A (Ro); - gp210; - PM-Scl (“Overlap Syndrome”); - Ku (polimiosite com escleroderma).

Der

mat

om

iosi

tes Activação do complemento e depósito

do complexo C5b-C9 a nível dos capilares, causando um infiltrado inflamatório local, com consequente lise dos capilares e isquémia muscular. As lesões cutâneas demonstram inflamação perivascular com células CD4 na derme.

2 a 8 casos por 1 000 000 pessoas. Sobretudo mulheres com uma proporção de 2:1. Afecta tanto adultos, quanto crianças.

- 1º Rubor e lesões da pele (junções interfalângeas, joelhos e outros ossos proeminentes, pálpebras, cara, pescoço, peito e parte dos braços); úlceras digitais, calcificação do tecido submucoso - 2º Fraqueza e dor muscular aguda (dias) ou insidiosa (meses); por vezes, fraqueza dos músculos do pescoço, deixando cair a cabeça, fraqueza dos músculos do esófago e respiratórios - Manifestações articulares, pulmonares, cardíacas e renais (glomerulonefrite) como resultado da mioglobinúria mantida - Maior risco de desenvolver neoplasia (30% de incidência) Laboratório: - CK aumento mais de 50x; - Possível aumento de AST, ALT, LDH e aldolase.

Auto Ac. Principais: - Mi-2 (específico; presente em 25% dos casos; associa-se à fase aguda, a um bom prognóstico e a uma boa resposta terapêutica); - Jo-1 (elevada especificidade; presente em 10 a 25% dos casos; associado a fibrose pulmonar e doença severa); -SRP (elevada especificidade; raramente associado); - PL-7, PL-12, EJ e OJ. Auto Auto Ac.: - SS-A (Ro); - PM-Scl (“Overlap Syndrome”).

Doença Mista do Tecido Conjuntivo (DMTC)

ou Síndrome de Sharp

Síndrome de sobreposição de sintomas característicos de LES, escleroderma e polidermatomiosite, com quadro clínico indiferenciado.

Muito variadas, mas mais frequentemente: - Fenómeno de Raynaud; - Inchaço dos dedos; - Artrites; - Miosites; - Disfunção esofágica; - Hipertensão pulmonar; - Rash cutâneo; - Envolvimento cardíaco; - Geralmente, sem manifestações renais e neurológicas.

Principais Auto Ac.: - U1-snRNP (altos títulos; não são específicos). Outros Auto Ac.: - SS-A (Ro); - SS-B (La); - RNA Polimerase II e III; - hnRNP; - RNA Polimerase I: - RNA Helicase II; - Actina.

Fig 31 – Músculo

Estriado destruído,

Miosites, DAI

Multi-Sistémicas

.

Auto-Imunidade




Manifestações Clínicas e Laboratório Auto-anticorpos

Presentes

VA

SC

UL

ITE

S S

IST

ÉM

ICA

S (

infla

maç

ão d

os v

asos

)

Po

liart

rite

No

do

sa (

PA

N)

Afecta sobretudo as artérias de tamanho médio, mas também algumas de grande

tamanho. Essa destruição deve-se em parte à presença de linfócitos CD4 e células dendríticas nas zonas vasculares.

Muitas vezes associada a infecções virais (HBV, HCV, HIV, CMV, PVB19).

Doença muito rara.

Atinge os dois sexos e todas as idades de

igual forma.

A ocorrência de hemorragia e isquémia em qualquer tecido conduz a múltiplas manifestações clínicas possíveis: -Envolvimento dos nervos periféricos; - Envolvimento da pele (púrpura, nódulos sub-cutâneos, Fenómeno de Raynaud, isquémia digital) - Possível atingimento de TGI, rins (hematomas sem glomerulonefrite), coração e SNC - Manifestações inespecíficas (náuseas, anorexia, febre, mialgia, artralgia)

- pANCA (MPO) (raramente); - cANCA (PR3) (raramente). NOTA: Geralmente os doentes não manifestam ANCAs.

P

olia

ng

ite

Mic

rosc

óp

ica

(MP

A)

Afecta os pequenos vasos. Os ANCAs (MPO e PR3) activam os

neutrófilos para a produção de ROS e para a libertação de enzimas líticas, o

que conduz à lise do endotélio dos pequenos vasos.

Afecta 20 em cada 1 000 000 de pessoas.

Sobretudo homens na

proporção 2:1..

Pico de incidência aos 60-65 anos.

- Envolvimento primário dos pequenos vasos dos rins (desenvolvimento de glomerulonefrite de progressão rápida / crescêntica com proteinúria e hematúria) e pulmões (dispneia, tosse, hemoptises) - Possível envolvimento de outros órgãos: pele (púrpura), nervos periféricos, fígado, coração; - Manifestações inespecíficas (anorexia, febre, artralgia, mialgia) Laboratório: - Urina: oligúria, proteinúria, hematúria microscópica, cilindros celulares.

- pANCA (MPO) em 70% dos casos; - cANCA (PR3) em 25% dos casos.

Gra

nu

lom

ato

se d

e W

eneg

er (

WG

)

Lesões granulomatosas inflamatórias com destruição tecidular local e procedem depois para uma fase

sistémica, afectando os pequenos e médios vasos.

Deve-se aos auto-ac anti-PR3 que fazem as células dendríticas apresentarem

MHC 1 aos linfócitos T, que se transformam em Th1. Os Th1 produzem

citocinas necessárias à formação do granuloma.

Afecta 12 em cada 1 000 000 de pessoas.

Sobretudo homens na

proporção 2:1.

Idade máxima 40 anos.

- Necrose dos pequenos e médios vasos; - Formação de granuloma nos seguintes tecidos: . Nariz (crosta, obstrução e hemorragia nasal, sinusite, destruição da cartilagem com deformação do nariz); . Rim (glomerulonefrite com proteinúria); . Pulmão (nódulos difusos, hemorragia alveolar, tosse seca); - Possível envolvimento do SNC, dos olhos (conjuntivite) e pele (úlceras, pápulas); - Manifestações inespecíficas (febre, anorexia, artralgias, miopatias). Laboratório: - Urina: proteinúria.

- cANCA (PR3) em 95% dos casos com doença generalizada e 50% dos casos com doença localizada; (- Raramente pANCA - MPO).

Sín

dro

me

de

Ch

urg

-

Sta

uss

(C

SS

) Afecta os pequenos e médios vasos. Os eosinófilos libertam as suas enzimas

citotóxicas levando à lesão tecidular. Nos doentes com auto-anticorpos anti-MPO, os auto-ac levam à libertação da mieloperoxidase dos neutrófilos, o que

acentua a vasculite.

Afecta 4 em cada 1 000 000 pessoas.

Idade máxima 50 anos.

Afecta os dois sexos de

igual modo.

1ª fase: asma e manifestações alérgicas; 2ª fase: hipereosinofilia; os eosinófilos infiltram os tecidos, conduzindo a: - Infiltrados pulmonares; - Granulomas necrotizantes extravasculares (pele, músculos, TGI, rins, coração) - Necrose vascular dos pequenos vasos Laboratório: - Hemograma: anemia, eosinofilia; - IgE aumentada (75%); - Factor reumatóide positivo (60%).

- pANCA (MPO) em cerca de 40% dos casos

D

oen

ça d

e G

oo

dp

astu

re

(Do

ença

an

ti-G

BM

)

Presença de auto-anticorpos anti-GBM dirigidos contra as cadeias α3 do colagénio tipo IV da membrana

glomerular basal dos nefrónios, o que causa glomerulonefrite.

Atinge 1 em cada 1 000 000 de pessoas.

Pico de incidência aos

30 e 70 anos.

Atinge tanto homens, como mulheres.

- Glomerulonefrite com micro-hematúria e falência renal progressiva rápida; - Possível presença de hemorragia pulmonar. Laboratório: - Urina: micro-hematúria.

- Anti-GBM

Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas.

Auto-Imunidade


2.2. DAI Específicas de Orgão

DAI Endócrinas Específicas de Órgão


Manifestações Clínicas e Laboratório Auto-anticorpos

Presentes

Diabetes Mellitus tipo 1

A presença de genes de susceptibilidade ligados ao HLA conduzem à expressão de

baixos níveis de CD28 nos linfócitos T – uma molécula superficial de regulação negativa

dos linfócitos T. Assim, surgem em circulação mais linfócitos T auto-reactivos que atacam as

células β dos ilhéus de Langerhans do pâncreas. A destruição destas células expõe moléculas anteriormente “escondidas” no seu

interior, o que conduz, por sua vez, à formação de auto-anticorpos anti-células β

(ICAs) pelos linfócitos B. Estes auto-anticorpos vão destruindo ainda mais células β, com consequente diminuição progressiva da síntese de insulina. Quando mais de 80% das células β estão destruídas, instala-se a Diabetes Mellitus tipo 1. Estes doentes são,

portanto, todos insulino-dependentes.

Manifesta-se na idade jovem.

Associação a HLA

DR3 e DR4, DQ2 e DQ8.

Manifestações agudas: - Aumento do glicogenólise: hiperglicémia, glicosúria, desidratação, poliúria, hipotensão, hipoperfusão, extremidades frias, aumento da pulsação, possível coma hiperosmolar; - Aumento da proteólise: amoniémia, vómito; - Aumento da lipólise: cetonémia, acidose metabólica, disrritmias ou enfarto, possível coma cetogénico; - Polidipsia, polifagia, perda de peso; Manifestações crónicas: - Dermopatia diabética (infecções cutâneas frequentes, ulceração, pé diabético); - Retinopatia diabética (glaucoma, cataratas, cegueira); - Nefropatia diabética (síndrome nefrótico, insuficiência renal crónica, aterosclerose renal, pielonefrites frequentes) - Macroangiopatia diabética (HTA, aterosclerose, claudicação) - Neuropatia diabética (parestesias, obstipação) Laboratório: - Sangue: hiperglicémia, HbA1c aumentada, amoniémia, cetonémia, acidose metabólica; - Urina: glicosúria, poliúria, cetonúria.

- ICAs (ac anti-células dos ilhéus); - IAAs (ac anti-insulina); - GAD (ac anti-descarboxilase do ácido glutâmico).

Doença de Addison Autoimune

(Addison Primário)

Presença de auto-anticorpos (ACAs), por diminuição de linfócitos T supressores, que destroem todos as zonas do cortéx adrenal

(supra-renais): zona externa glomerulosa com diminuição da produção de

mineralocorticóides (exº aldosterona), zona média fasciculada com diminuição da

produção de glucocorticóides (exº cortisol) e zona interna reticulada com diminuição da

produção de androgénios (exº DHEA, androstenediona). Consequentemente, por

feedback, verifica-se aumento da produção de CRH (hipotálamo) e ACTH (hipófise).

Por vezes a medula adrenal também é destruída deixando de haver produção de

catecolaminas (noradrenalina e adrenalina).

Afecta 1 em cada 8000 pessoas.

Sobretudo homens

durantes as primeiras duas

décadas de vida. Mulheres após os 40

anos.

Associa-se a HLA B8, DR3 e DR4.

- Por diminuição da aldosterona: hipotensão arterial, hiponatrémia com avidez por sal, hipercaliémia, desidratação com possível choque hipovolémico e coma; - Por diminuição de cortisol: hipoglicémia, anorexia, perda de apetite, náuseas, vómitos, dor abdominal, febre, apatia, depressão; - Por diminuição dos androgénios nas mulheres: diminuição da libido e da pilosidade; - Por aumento do ACTH: hiperpigmentação da pele. Laboratório: - Diminuição da aldosterona, hiponatrémia, hipercaliémia; - Diminuição do cortisol, hipoglicémia; - Diminuição da DHEA e androstenediona; - Aumento de ACTH

- ACAs (ac. anti-córtex adrenal) (altos títulos)

Auto-Imunidade


DAI Hepatobiliares Específicas de Órgão




Hepatite Crónica Autoimune

1, 2 e 3

Inflamação hepática perpetuada no tempo (mais de seis meses) de origem desconhecida, com

presença de auto-anticorpos hepáticos e destruição da arquitectura hepática com fibrose.

A doença progride para cirrose. Agentes ambientais, infecciosos e genéticos

podem estar envolvidos na sua génese.

50 a 200 casos por 1 000 000 de pessoas.

Sobretudo em

mulheres.

HAI 1 sobretudo entre os 15 e 30

anos e depois dos 50 anos. HAI tipo 2

sobretudo em crianças (50 a 75%). HAI tipo 3 em todas

as idades.

- Icterícia; - Hepatomegália; - Dor no quadrante direito acima do abdómen; - Anorexia; - Fadiga; - Possíveis complicações: ascite, hemorragia gastrointestinal, cirrose; - Hepatite tipo 2 apresenta sintomas extra-hepáticos (artralgias, glomerulonefrite, vitiligo, doença inflamatória crónica óssea). Laboratório: - Elevados níveis de bilirrubina livre, trasaminases e γ-GT; - PAL ligeiramente aumentada;

Hepatite tipo1 (80% das HCA): Principais Auto Ac..: - Actina (elevados títulos). Outros Auto Ac.: - ANAs (DNAss, nucleossoma, histonas, SS-A, SS-B, lâminas A, B, B2 e C, p80 coilina) Hepatite tipo 2 (10-15% das HAI): - LKM-1; - LC-1. Hepatite tipo 3: - SLA; - LP.

Cirrose Biliar Primária

(CBP)

A exposição a factores ambientais (bactérias, químicos) e factores genéticos diminuem a tolerância ao self. Verifica-se infiltração de

linfócitos B e T em torno dos canalículos biliares do fígado, com consequente colestase e

destruição dos hepatócitos com fibrose. A doença progride para cirrose.

Sobretudo mulheres (mais de 90%).

Sobretudo entre os

40 e 60 anos.

- Assintomáticos (60%); - Icterícia (por aumento da bilirrubina não conjugada); - Prurido (por regurgitação dos sais biliares para o sangue); - Hipercolestolémia (por regurgitação do colesterol para o sangue); - Dor na zona superior direita do abdómen; - Hepatoesplenomegália; - Fadiga; - Esteatorreia; - Osteopénia ou osteoporose; - Hipertensão portal; - Carcinoma hepatocelular; - Cirrose; Laboratório: - Elevados níveis de bilirrubina livre e PAL; - Ligeiro aumento de transaminases e γ-GT; - Aumento dos sais biliares e do colesterol; - Aumento do TP; - Fezes esteatorreicas e claras; - Urina escura.

Principais Auto Ac.: - AMA-M2 (também M4, M8 e M9) Outros Auto Ac.: - gp 210; - p80 coilina; - sp100; - PML; - Actina (elevados títulos)

Auto-Imunidade


DAI Gastrointestinais Específicas de Órgão




Gastrite Autoimune do tipo A (Gastrite Atrófica

Crónica) e Anemia Perniciosa

A Gastrite Atrófica Crónica caracteriza-se por uma infiltração celular inflamatória (linfócitos, granulócitos e plasmócitos) da mucosa gástrica devido à presença de auto-anticorpos anti-células parietais. Esta reacção inflamatória crónica vai aos poucos substituindo as células pépticas e parietais gástricas por células mucóides (metaplasia gástrica). Com o tempo, as células parietais deixam de produzir vitamina B12; por outro lado, surgem ac. anti-factor intrínseco (FI) que impedem a síntese gástrica de FI e a consequente absorção intestinal da vitamina B12 exógena; desenvolve-se, assim, Anemia Perniciosa.

Anemia Perniciosa sobretudo

mulheres idosas do norte da

Europa.

Gastrite Atrófica Crónica; - Assintomática por muito tempo; Anemia Perniciosa: - Anemia megaloblástica, com consequente palidez e fadiga; - Glossite atrófica, com consequente perda de apetite e língua vermelha; - Alterações intestinais (diarreia) por falta de absorção da vitB12, com risco aumentado para adenocarcinoma gástrico; - Desmielinização dos neurónios por défice de vitB12, com consequente neuropatia periférica (tremores, diminuição dos reflexos, etc). Laboratório: - Diminuição do HCl e do pepsinogénio; aumento da gastrina; - Hemograma: anemia megaloblástica, hipersegmentação neutrófilos, leucopénia, trombocitopénia (A. Perniciosa); - Diminuição da vitB12 (A. Perniciosa); - Ac. anti-FI (A. Perniciosa)

Gastrite Atrófica Crónica: - Ac. anti-células parietais (APCA) (presentes em 90% dos casos). Anemia Perniciosa: - Ac. anti-células parietais (APCA) (presentes em 90% dos casos; não presentes em doença avançada); - Ac anti-factor intrínseco (FI) (presentes em 70% dos casos).

Doença Celíaca

(DC)

A presença de certos HLA conduz a incapacidade geneticamente

determinada de induzir tolerância oral à gliadina – uma das fracções

do glúten, presente no trigo, cevada, centeio, aveia. Assim, no intestino delgado – zona de maior contacto

com a gliadina ingerida – após a sua absorção na mucosa intestinal, a

gliadina é desaminada pela enzima transglutaminase tecidular do

endomísio (Tg), o que substitui resíduos de glutamina por resíduos

de ácido glutâmico. Esta transformação conduz à formação

de um infiltrado de macrófagos, células dendríticas e linfócitos B e T.

As células APC processam e apresentam os péptidos da gliadina

aos linfócitos T; por seu lado, os linfócitos B produzem auto-ac. anti-gliadina (sobretudo IgA) e ac. anti-endomísio (incluem ac específicos contra complexos de gliadina e ac

anti-transglutaminase). Com o tempo esta reacção inflamatória

conduz à destruição das vilosidades intestinais, com consequente malabsorção dos alimentos.

Afecta 1 em cada 100 pessoas.

Actualmente

afecta todas as idades.

Associação HLA DQ2 e DQ8, B8 e

DR3.

-Sintomas gastrointestinais (diarreia, flatulência, enjoo, vómitos, dor de estômago); - Distúrbios na reprodução (distúrbios menstruais, adolescência atrasada, fertilidade diminuída, perda fetal); - Distúrbios do sistema esquelético e muscular (dor óssea, artrites, nanismo, destruição dentes, osteoporose); - Alterações metabólicas (anemia, edema, hemorragias, espasmos); - Alterações neuropsíquicas (neuropatia periférica, ansiedade, depressão, epilepsia); - Erupção da pele; - Manifestações inespecíficas (mal estar, fraqueza, perda de peso, fadiga, mau temperamento).

- Ac anti-Endomísio EMA IgA (trata-se dos ac mais sensíveis 99% e específicos 99% para a DC; contudo têm que se analisar por IFA); - Ac. anti-Transglutaminase tTg IgA e IgG (funcionalmente semelhantes aos EMA mas feitos por ELISA – técnica menos sensíveis 95% e menos específica 90%, embora não exija visualização subjectiva por IFA); - Ac anti-Gliadina AGA IgA e IgG (menos sensíveis 90% e menos específicos 85% que os ac Tg, com falsos positivos de 20% para IgG e 3% para IgA; contudo, são úteis no diagnóstico para pessoas que não têm ac. Tg e na avaliação da progressão da patologia)

Fig 32 – Glossite, Anemia

perniciosa, DAI Específica

de Orgâo

Fig 33 – Intestino

sem vilosidades,

Doença Celíaca,

DAI Específica de

Orgâo

Auto-Imunidade


DAI Neurológicas Específicas de Órgão




Myasthenia gravis

Activação de linfócitos T CD4, o que conduz à

activação de linfócitos B com produção de auto-

anticorpos contra os receptores da

acetilcolina, impedindo a ligação deste

neurotransmissor ao seu receptor. Por outro lado,

a resposta imunitária conduz também à

degradação da acetilcolina e à

destruição da fenda pós-sináptico. Todos estes factores resultam em

deficiente transmissão neuromuscular.

Atinge 20 em cada 100 000 pessoas.

Atinge 40% de pessoas com

timoma, com maior incidência em

mulheres.

Sobretudo na terceira década de

vida nas mulheres e na terceira e sexta década de vida nos

homens.

HLA B8 e DR3.

- Fraqueza muscular (músculo esquelético), sobretudo durante o exercício físico, dos seguintes músculos: . Olho; . Face; . Pescoço; . Respiratórios (pode dificultar a respiração e levar à morte); . Cintura escapular e pélvica. Laboratório: - Ac. anti-receptores da acetilcolina

- Anti-músculo estriado esquelético (presente em 80 a 90% dos doentes com timoma; mau prognóstico);

DAI Cutâneas Específicas de Órgão

Fisiopatologia Epidemiologia e Associação

HLA Manifestações Clínicas


Pênfigo

Fo

liáce

o

Produção de auto-anticorpos (anti-

desmogleinas ou anti-BP) contra proteínas da

epiderme, o que resulta na perda de adesão

célula a célula. As desmogleinas são caderinas – proteínas importantes na adesão

celular. Os antigénios BP são

estruturas de adesão que ancoram as células

basais da epiderme à derme.

Sobretudo idades entre os 50 e 60

anos.

Distribuição igual entre sexos.

Atinge uma em cada 1 000 000

pessoas.

O pênfigo vulgaris é o mais comum.

- Desmogleina 1

Vu

lgar

is

- Lesão inicial na mucosa orofaríngea; - Lesão secundária na pele (bolhas flácidas que rebentam formando uma erosão larga e dolorosa), sobretudo no couro-cabeludo, na cara e tronco; - Genitálias e conjuntivas possivelmente afectadas.

Auto ac principal: - Desmogleina 3. Outros auto ac também possivelmente presentes: - Desmogleina 1.

Bu

lho

so

- Apresentação inicial tipo pápulas ou placas, sobretudo nas extremidades e dobras, que causam comichão; - Aparecimento seguinte de bolhas sub-epidérmicas, com depósito de autoanticorpos, complemento e polimorfonucleares na base da epiderme; consequente separação da epiderme da derme. (- Melhor prognóstico)

- BP180 (colagénio tipo XVII); - BP230.

Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão.

Figura 35 – Da esquerda para a direita, pênfigo foliáceo, vulgaris (duas imagens) e bulhoso.

Fig 34 – Separação

da epiderme,

Pênfigo, DAI

Específica de Orgâo

Auto-Imunidade


3. Metodologias Laboratoriais

Em Imunologia a detecção de anticorpos e de antigénios depende sempre da

formação de imunocomplexos (ligação antigénio-anticorpo). Assim, no caso de se

pretender detectar um anticorpo utiliza-se como sonda para investigar a sua presença um

antigénio ao qual o anticorpo se ligue, e vice-versa. Com frequência, o anticorpo ou o

antigénio sonda é fixado a um suporte sólido, permitindo a separação do

imunocomplexo formado dos outros componentes da mistura de ligação. Seguidamente,

determina-se a presença/quantidade do complexo através de uma segunda reacção de

ligação com um reagente marcado.

As técnicas que a seguir se descrevem são utilizadas no Laboratório de

Imunologia do HCC para detectar a presença de auto-anticorpos reactivos no soro do

paciente. A sua pesquisa compreende uma série de procedimentos que diferem em

termos de métodos, sensibilidade, especificidade e correlação com a clínica. Trata-se de

testes úteis em DAI nas seguintes situações:

- Prognóstico das DAI: podem existir auto-anticorpos muito antes de se

manifestar a patologia; assim, sempre que auto-anticorpos são detectados com patologia

ausente deve-se fazer uma avaliação do título do auto-anticorpo em causa de seis em

seis meses e o paciente deverá adoptar medidas que previnam o aparecimento da

patologia;

- Diagnóstico / auxílio no diagnóstico das DAI: só alguns auto-anticorpos

servem de critério de diagnóstico para DAI; contudo, muitos outros podem auxiliar no

diagnóstico clínico;

- Monitorização das DAI: a repetição periódica de alguns auto-anticorpos é um

meio de monitorizar a actividade da doença, o envolvimento de órgãos / a falência

orgânica e a resposta à terapêutica instituída.

Estes métodos permitem actualmente a identificação simultânea de muitos auto-

anticorpos ao mesmo tempo num mesmo ensaio. Assim, por vezes os auto-anticorpos

detectados não são solicitados pelo clínico. Nesse caso, o achado só deverá ser

referenciado se o auto-anticorpo detectado tiver relevância clínica; isto é, se o título for

elevado ou se a presença do auto-anticorpo for critério de diagnóstico de uma DAI. Tal

Auto-Imunidade


é exigido porque a presença de auto-anticorpos nem sempre reflecte a presença de

patologia auto-imune; baixos títulos são frequentes em indivíduos saudáveis, sobretudo

idosos, ou em processos não auto-imunes, como infecções crónicas ou doenças

malignas. Mesmo tendo relevância clínica, o resultado deverá ser sempre confirmado

por um segundo método antes de se dar a informação ao médico. Muitas vezes, possuir

histórico do doente ou alguma informação clínica poderá ajudar na tomada de decisões

acertadas.

Assim, a utilização adequada destes testes é de extrema importância clínica;

contudo, a sua utilização inadequada poderá conduzir a um diagnóstico incorrecto e a

um aumento dos custos no tratamento das DAI. Exige-se, portanto, uma marcha

analítica metódica e rigorosa, executada por pessoal especializado na área.

3.1. Imunofluorescência Indirecta (IFA)

3.1.1. Fundamento

A técnica utiliza lâminas onde estão fixados os antigénios complementares aos

auto-anticorpos que se pretendem detectar. Assim, ao se adicionar à lâmina o soro do

doente (com diluição que varia segundo os auto-anticorpos em pesquisa), no caso dos

anticorpos em pesquisa estarem presentes na amostra, estes ir-se-ão ligar aos antigénios

da lâmina formando um imunocomplexo durante o período de incubação que se segue

em câmara húmida e à temperatura ambiente. Depois, a lâmina é abundantemente

lavada para que os componentes da amostra que não se ligaram à lâmina sejam

removidos. Seguidamente, adiciona-se um segundo anticorpo IgG* dirigido contra um

epítopo da região Fc do anticorpo em pesquisa no soro do doente; este segundo

anticorpo está marcado com um fluorocromo (Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) e o

conjunto “anticorpo-fluorocromo” designa-se por conjugado. Após uma segunda

incubação em câmara húmida à temperatura ambiente que permitirá que o conjugado se

ligue ao imunocomplexo, segue-se uma segunda lavagem para remoção de todos os

componentes que não estão ligados no meio reaccional. Monta-se depois uma lamela

com o auxílio de glicerina. As lâminas podem ser executadas manualmente ou

automaticamente.

Auto-Imunidade


Até serem observadas ao microscópio as amostras deverão ficar no frio numa

câmara húmida, a fim de se conservarem frescas.

Quando excitado com luz aproximadamente a 480-490 nm, o FITC emite

radiação sob a forma de luz por volta dos 530 nm (cor verde). Com o recurso a um

microscópio de fluorescência com um filtro que permita a visualização nesse

comprimento de onda é possível avaliar a presença do auto-anticorpo em pesquisa na

amostra do paciente.

Figura 36 – Esquema ilustrativo de uma reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina.

O padrão de ligação dos auto-anticorpos do paciente aos antigénios fixados à

lâmina observado no microscópio de fluorescência (ampliação de 400x) correlaciona-se

com a especificidade particular do auto-anticorpo e com a presença de distúrbios auto-

imunológicos específicos.

Para se evitar falsos resultados, devem-se ter alguns cuidados durante a

execução da técnica:

- As lâminas devem estar congeladas ou refrigeradas conforme as indicações do

kit e devem estar à temperatura ambiente a quando da execução da técnica;

- Não tocar com as pontas das pipetas na lâmina, pois pode danificar o substrato

conduzindo a falsos resultados negativos;

- Os soros devem ser congelados, caso não se efectue a técnica no dia da

colheita;

Auto-Imunidade


- Antes de se iniciar a técnica os soros devem estar à temperatura ambiente e

homogeneizados;

- Verificar o pH da solução tampão;

- Proteger o conjugado e as lâminas após adição do conjugado da luz directa;

- As lavagens devem ser executadas correctamente e o número de vezes

requeridas; uma lavagem não cuidada pode provocar ruptura do substrato ou o

descoloramento do mesmo; lavagens insuficientes podem provocar falsos resultados

positivos, uma vez que o anticorpo do conjugado não é específico para o anticorpo em

pesquisa, podendo ligar-se a qualquer anticorpo presente no meio reaccional;

- Devem respeitar-se os tempos de incubação;

- Entre os diferentes passos da técnica nunca deixar que o substrato seque.

Por outro lado, antigénios mal fixados à lâmina logo durante o fabrico também

poderão conduzir a falsos negativos. A contaminação bacteriana das lâminas é outro

factor que poderá conduzir à visualização de padrões alterados; por exemplo, as células

HEp-2 contaminadas apresentam-se sem conteúdo nuclear, com um forte rebordo

citoplasmático e com algumas membranas que parecem rompidas; é de desconfiar desta

contaminação se no mesmo poçeto se apresentarem dois padrões distintos, sendo um

deles semelhante ao descrito.

A fim de se evitarem falsos resultados, além dos cuidados já descritos, para

cada sessão utiliza-se um controlo positivo e um controlo negativo. Uma amostra é

considerada positiva se o padrão de fluorescência observado for mais intenso que o

controlo negativo da série elaborada. É também importante visualizar-se o resultado no

centro do poçeto da lâmina, uma vez que os bordos podem conter anticorpos

inespecíficos não eliminados por lavagem insuficiente.

3.1.2. Aplicação

As técnicas de imunofluorescência indirecta são geralmente utilizadas como

técnicas de rastreio inicial das DAI, uma vez que são técnicas baratas e geralmente de

elevada sensibilidade, evitando falsos resultados negativos (a excepção são as células de

Auto-Imunidade


Crithidia luciliae, com elevada especificidade e baixa sensibilidade). Para além disso,

apresentam a vantagem de detectar qualquer tipo de auto-anticorpo presente no soro do

paciente (desde que o substrato escolhido seja o adequado) sendo este

identificável/conhecido ou não, tendo sido pedido pelo clínico ou não.

Contudo, exigem pessoal altamente qualificado para a sua interpretação e

exibem baixa especificidade, sendo necessário uma posterior confirmação dos

resultados positivos por outro método mais específico, que evite, portanto, falsos

resultados positivos.

Assim, no Laboratório de Imunologia do HCC quase todos os pedidos de

detecção/quantificação de auto-anticorpos são iniciados com uma técnica de

imunofluorescência indirecta, adequada ao auto-anticorpo em pesquisa. Só no caso

desta inicial técnica de rastreio dar positiva é que o estudo segue com outro tipo de

técnicas mais específicas.

3.1.3. Células e Tecidos Utilizados

3.1.3.1.Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2

O diagnóstico laboratorial das DAI geralmente inicia-se pela pesquisa de auto-

anticorpos dirigidos contra constituintes nucleares das células (ANA). Para esta

pesquisa recorre-se no Laboratório de Imunologia do HCC a células HEp-2.

Trata-se de células tratadas de carcinoma humano da laringe. As células crescem

em monocamada na lâmina de IFA, fornecendo um substrato altamente sensível para a

detecção dos ANA. São células vantajosas para a observação destes auto-anticorpos

uma vez que são de origem humana (maior especificidade do que as células de rato

previamente utilizadas), o seu núcleo é largo (possível observação de detalhes

nucleares) e apresentam uma actividade mitótica elevada, o que permite a observação de

células em todas as fases do ciclo celular. Esta última característica revela-se pertinente

uma vez que, embora quase todos os auto-anticorpos anti-nucleares se visualizem em

interfase, determinados ANA apenas se observam / são mais facilmente observáveis em

mitose – PCNA, centrómero, centríolo, tubulina, NuMa e Midbody.

Auto-Imunidade


A amostra do doente é inicialmente diluída de 1:160 – título a partir do qual se

poderá considerar clinicamente significativa a presença de ANA por estudos feitos em

pessoas saudáveis. No caso do resultado ser positivo para a diluição da amostra

efectuada é necessário realizarem-se sucessivas diluições até que deixe de se observar

fluorescência, a fim de que se dê o título adequado: 1:160, 1:320, 1:640 ou > 1:640. A

titulação dos auto-anticorpos é dada pela maior diluição que ainda apresenta um

resultado positivo. O título é sempre dado comparando a fluorescência da amostra ao

padrão negativo e positivo da série de ensaios realizada.

Consoante o ANA envolvido na DAI, assim o padrão que se observa nestas

células ao microscópio de fluorescência. Estão descritos mais de 35 padrão de IFA

observados com células HEp-2, o que corresponde a mais de 100 auto-anticorpos

diferentes. Alguns padrões são específicos de determinados auto-anticorpos, mas muitos

auto-anticorpos diferentes originam o mesmo tipo de padrão. Por outro lado, o soro do

paciente frequentemente contém diferentes auto-anticorpos que resultam em padrões

mistos. Também é possível que a presença de um determinado padrão não permita a

visualização de outro padrão, que fica como que coberto pelo primeiro.

Para cada amostra dever-se-á também observar se os auto-anticorpos são

positivos em células em divisão celular, identificando-se o padrão como exibindo

cromossomas positivos (se os cromossomas apresentarem fluorescência) ou mitoses

positivas (se os restantes componentes celulares que não os cromossomas apresentarem

fluorescência quando em divisão celular). Esta indicação permite por vezes chegar a

algumas conclusões. Por exemplo, na presença conjunta de um padrão homogéneo e

granular, o primeiro poderá encobrir o segundo; contudo, a presença de mitoses

positivas em metafase é característica do padrão granular, enquanto que a presença de

cromossomas positivos em metafase é característico do padrão homogéneo; assim, se se

observar um padrão homogéneo com cromossomas e mitoses positivas, é provável que

o doente expresse também algum auto-anticorpo que exiba padrão granular. A

confirmação poderá ser feita por diluições sucessivas da amostra, o que permitirá

visualizar o padrão encoberto.

Para certas DAI a presença de determinados ANA é quase certo ou mesmo certo

da existência de patologia; contudo, para outras DAI a relação não é directa. É

importante reter que:

Auto-Imunidade


- Um teste positivo para um ANA raramente é diagnosticante, sendo o

diagnóstico quase sempre feito por critérios clínicos;

- Indivíduos com DAI podem ser ANA negativos;

- Os ANA podem ser positivos em indivíduos sem DAI, sendo que geralmente

estes ANAs não apresentam especificidade antigénica e são de títulos baixos;

- Os resultados dos ANA variam grandemente com o método utilizado na sua

detecção.

A grande vantagem na utilização deste substrato inespecífico para testes tão

importantes como os relacionados com as DAI é o seu valor de rastreio para os ANA.

As células HEp-2 são substratos altamente sensíveis que fornecem informação

qualitativa /semi-quantitativa (título determinado) que deverá ser utilizada como o passo

inicial para uma identificação mais específica e quantitativa dos ANA. Assim, sempre

que um resultado é positivo, o resultado deverá ser confirmado com um segundo teste

mais específico. A escolha do teste a realizar posteriormente é feita consoante o padrão

de fluorescência encontrado.

A visualização de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos também é possível neste

tipo de substrato. Contudo, muitos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos diferentes

podem parecer semelhantes e confundir-se por visualização das células HEp-2. Para a

sua identificação é sempre preferível o recurso a outros substratos mais adequados.

Assim, sempre que na pesquisa de um ANA se visualizam nas células HEp-2 aquilo que

parecer ser um auto-anticorpo anti-citoplasmático com significado clínico, a sua

pesquisa deverá ser feita com recurso a um substrato indicado.

A fim de se contornar um pouco esta limitação da técnica, no HCC recorre-se a

lâminas que incorporam dois tipos de células para cada doente: células HEp-2 para

melhor visualização dos ANA, e tecido de fígado de macaco para melhor visualização

de determinado tipo de auto-anticorpos que deixam algumas dúvidas quando

visualizados nas células HEp-2, tanto anti-nucleares, como anti-citoplasmáticos.

Auto-Imunidade


Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular. Durante a interfase a membrana nuclear está

delimitada, observam-se melhor os nucléolos e os organelos e fibras citoplasmáticos. A mitose inclui:

profase (a condensação do DNA permite a visualização individualizada dos cromossomas; formação do

fuso mitótico com visualização dos centríolos), metafase (rotura da membrana nuclear; cromossomas com

os seus centrómeros no plano equatorial), anafase (cada pare de cromatídeos separa-se pelo centrómero e

inicia a sua migração para pólos equatoriais opostos) e telofase (reconstrução da membrana nuclear em

torno de cada núcleo filho, reaparecimento dos nucléolos, descondensação dos cromossomas). À mitose

segue-se a citocinese, que ocorre na região “midbody”; enquanto a membrana citoplasmática invagina o

“midbody” vai progressivamente sendo constrito, até que desaparece quando se formam as duas células

filhas.

Figura 38 – A célula durante a Interfase. Boa visualização dos nucléolos e das proteínas do

citosqueletos: actina, tubulina, citoqueratina e vimentina; proteínas motoras, como a miosina e proteínas

de ancoragem, como a desmina; organelos e proteínas estruturais, como a clatrina e o Golgi.

Auto-Imunidade


Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. O envelope nuclear mantém a integridade do núcleo

durante a interfase. É constituído, de dentro para fora, por lâmina nuclear, membrana nuclear interna e

membrana nuclear externa. A heterocromatina (condensada) encontra-se perto da lâmina nuclear,

enquanto que a eucromatina (laxa) se encontra no centro do núcleo. Atravessando o envelope nuclear

estão os poros nucleares. O retículo endoplasmático liso é uma extensão do envelope nuclear. Os

ribossomas ligados ao retículo endoplasmático liso constituem o retículo endoplasmático rugoso.

Segue-se a descrição dos padrões observados nas células HEp-2 e no tecido

hepático (sempre que útil) e os auto-anticorpos que lhes poderão estar associados. As

patologias a negrito são as mais significativas para os auto-anticorpos mencionados.

Auto-Imunidade


PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO

1. Padrão Nuclear Homogéneo

Descrição do Padrão:

Células HEp-2:

Fluorescência difusa uniforme em todo o núcleo das células em interfase.

Cromossomas positivos em células em mitose (profase, metafase, anafase ou telofase).

Mitoses negativas; isto é, restantes constituintes nucleares que não os cromossomas,

positivos nas células em mitose.

Títulos muito elevados ou amostras envelhecidas podem apresentar mais

fluorescência à periferia do núcleo do que no centro (aquilo a que se chama padrão

Periférico Nuclear).

Este padrão pode encobrir outros padrões não permitindo a sua visualização.

Sempre que se desconfiar disso (por exemplo, se as mitoses estiverem positivas) dever-

se-á diluir a amostra, o que permitirá visualizar o outro padrão no caso deste estar

presente.

Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2. À esquerda, cromossomas positivos numa

célula em metafase e noutra em anafase. À direita, cromossomas positivos numa célula em anafase quase

terminada.

Auto-Imunidade


Figura 41 – Da esquerda para a direita, cromossomas positivos em profase, metafase, anafase e

telofase em células HEp-2. A positividade dos cromossomas de células em mitose é característica do

padrão homogéneo.

Tecido hepático de macaco:

Fluorescência difusa uniforme em todo o núcleo das células.

Figura 42 – Padrão homogéneo em tecido hepático de macaco.

Auto-Anticorpos Associados:

DNAds (cadeia dupla de DNA);

DNAss (cadeia simples de DNA);

DNP (“DNA histone complexes” – histonas, sobretudo H2A e H2B;

Nucleossoma.

Associação Clínica:

LES;

LES induzido por drogas;

Auto-Imunidade


AR;

Escleroderma;

Hepatite Autoimune tipo 1.

Figura 43 – São as histonas que permitem o super-enrolamento do DNA. Quando o material

genético é semi-desenrolado verifica-se que só a histona H1 se localiza na zona linear do DNA. As

restantes histonas (H2A, H2B, H3 e H4) mantêm parte do DNA enrolado. O conjunto dessas histonas

(todas excepto a H1) com o DNA designa-se por nucleossoma.

2. Padrão Nuclear Fino Granular

2.1. Scl-70


Células HEp-2:

Destribuição uniforme de grânulos tão finos que por vezes pode parecer padrão

homogéneo em células em interfase. Os nucléolos podem os não estar positivos em

interfase. Durante a mitose o auto-anticorpo associa-se aos cromossomas (cromossomas

positivos, mitoses negativas).

Auto-Imunidade


Figura 44 – Padrão do auto-anticorpo Scl-70 em células HEp-2. Na imagem à esquerda os

nucléolos são negativos enquanto que na imagem à direita são positivos. Em ambas as imagens verifica-

se que o padrão é fino granular nuclear, com cromossomas positivos em células em mitose.

Auto-Anticorpo Associado:

Scl-70 – Produto funcional da degradação da Topoisomerase I, cuja

função é desenrolar o DNA antes da actuação da DNA Polimerase.


Escleroderma difusa;

LES;

Fenómeno de Raynaud.

2.2. Outros Auto-anticorpos


Células HEp-2:

Distribuição uniforme de grânulos muito finos em todo o núcleo nas células em

interfase. Cromossomas negativos em células em mitose. Mitoses positivas.

Auto-Imunidade


Frequentemente associado a padrão homogéneo, o que poderá encobrir o padrão

fino granular. Desconfiar da existência de padrão fino granular com homogéneo se as

mitoses forem positivas.

Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2. Mitoses positivas mas cromossomas

negativos em duas células em metafase.


Distribuição uniforme de grânulos muito finos em todo o núcleo nas células ou

ausência de positividade.

A vantagem do uso deste tecido verifica-se quando pelas células HEp-2 não se

consegue perceber se se trata de um padrão homogéneo ou fino granular (a dúvida surge

sobretudo para títulos baixos de 1:160). Neste caso, se o núcleo das células hepáticas

não apresentar positividade, confirma tratar-se de um padrão fino granular, visto que o

padrão homogéneo é sempre positivo no fígado, enquanto que o padrão fino granular

pode ou não sê-lo.


SS-A (Ro52 e Ro60) – Duas ribonucleoproteínas de 52 e 60 kDa

associadas a uma das quatro Y-RNAs; está envolvida no processamento

do RNAm. Por vezes desnatura durante a fixação das células HEp-2, não

Auto-Imunidade


sendo possível a sua visualização; uma boa fixação é exigida para a sua

visualização;

SS-B (La) – Proteína de 48 kDa associada a vários RNAs. Envolvida na

transcrição da RNA polimerase III;

Mi-2;

RNA Polimerase II e III;

Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B. Estes auto-anticorpos estão frequentemente

associados.


LES Neonatal (SS-A, SS-B);

Síndrome de Sjögren (SS-A, SS-B, RNA Polimerase II e III);

Escleroderma Difusa (RNA Polimerase II e III; SS-A; SS-B,);

Dermatomiosite (Mi-2);

AR;

DMTC;

Miosites;

Hepatite Auto-Imune tipo 1.

3. Padrão Nuclear Granular


Células HEp-2:

Auto-Imunidade


Distribuição uniforme em todo o núcleo de grânulos médios ou grandes nas

células em interfase, sendo visível o contorno nuclear (o que é importante para a

distinção do padrão matriz). Em células em mitose cromossomas negativos e mitoses

positivas.

Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. Mitoses positivas e cromossomas negativos em

duas células em metafase e em uma célula em anafase.


Distribuição uniforme de grânulos médios ou grossos em todo o núcleo nas

células ou ausência de positividade.


Sm – Constitui 8 polipéptidos do complexo Sm-U1-snRNP;

U1-snRNP ou snRNP - “Small nuclear riboproteins”;

Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP. Este complexo facilita a produção de RNAm maduro.

Auto-Imunidade


Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2, visto que estes dois padrões são

indistintos, uma vez que os auto-anticorpos pertencem ao mesmo complexo nucleoproteico.


LES (Sm – 99% de especificidade, encontrando-se em 20% dos

pacientes com LES, U1/2-snRNP);

DMTC (U1-snRNP – 95-100%, ausência de Sm);

Escleroderma (U1-snRNP).

4. Padrão PCNA


Células HEp-2

Padrão fino granular ou granular intensamente fluorescente em cerca de 60% das

células em interfase (fase S e G2). As restantes células em interfase (G1) não exibem

fluorescência. Nucléolos negativos. Mitose e cromossomas negativos em células em

divisão celular.

Auto-Imunidade


Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2.


PCNA (Ciclina) – “Proliferating cell nuclear antigen”. A sua produção

aumenta logo antes da fase S do ciclo celular, daí que as células em fase

S apresentem intensa fluorescência. Envolvida na replicação e reparação

do DNA.


LES (PCNA só aparece em 3-6% de doentes com LES mas é muito

específico para LES) – frequentemente associado a glomerulonefrite.

5. Padrão Matriz Nuclear


Células HEp-2

Nas células em interfase grânulos grandes distribuídos pela zona central no

núcleo; a periferia do núcleo não apresenta fluorescência, não sendo visível o contorno

nuclear (ou contrário do que acontece no padrão granular). Assemelha-se a múltiplos

Auto-Imunidade


dots nucleares mas mais grossos ou a uma rede nuclear esponjosa. Nucléolos negativos

(mas vêem-se os contornos dos nucléolos, o que poderá distinguir este padrão do padrão

centrómeros, em que as células estão em divisão, não se visualizando por isso o

contorno dos nucléolos). Cromossomas negativos em células em mitose. Mitoses

positivas.

Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2. Reparar no detalhe da imagem à direita que

o contorno nuclear não é nítido, ao contrário do que se passa no padrão granular nuclear.


hnRNP (A1, A2, B1, B2, C1 e C2) – Proteínas Ribonucleares

heterogéneas. Trata-se de um conjunto de proteínas nucleares insolúveis

resistentes a DNAses, RNAses e tratamento salino.


LES;

AR;

Escleroderma;

DMTC.

Auto-Imunidade


6. Padrão Membrana Nuclear


Células HEp-2

Fluorescência fina e linear da membrana nuclear presente nas células em

interfase e algumas células em mitose (profase e telofase). Nucléolos negativos. Células

em mitose com cromossomas negativos (distinção do Padrão Periférico Nuclear) e

mitoses positivas.

Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear. Observa-se uma célula em telofase em que uma fina

membrana rodeia os dois núcleos jovens das futuras células filhas.


Este padrão é mais facilmente visível no tecido hepático do que nas células HEp-

2, onde se pode por vezes confundir o padrão membranar nuclear com o homogéneo

nuclear. No tecido hepático apenas se visualiza um halo em torno dos núcleos das

células.

Auto-Imunidade


Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco.


Lâmina A, B1, B2, C – Sítios de ancoragem dos cromossomas durante a

interfase.


LES associado a outras patologias (distúrbios mistos crónicos);

Vasculites associadas a outras patologias (distúrbios mistos crónicos);

Hepatite Autoimune tipo 1.

7. Padrão Poros da Membrana Nuclear


Células HEp-2:

Membrana nuclear com grânulos finos ou mais grossos (tipo dots) nas células

em interfase que se observam focando e desfocando a preparação; é como se a

membrana nuclear apresentasse interrupções; padrão fino granular. Durante a mitose os

cromossomas são negativos e as mitoses são positivas, apresentando um padrão fino

granular denso. Auto-anticorpos anti-mitocondriais estão frequentemente associados

(padrão citoplasmático).

Auto-Imunidade


Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear.


gp210 – Glicoproteína de 210 kDa que entra na constituição do

complexo proteico que forma o poro nuclear, cuja função é a de permitir

o movimento de substâncias entre o núcleo e o citoplasma da célula;

Nucleopurina p62 – Apresenta a mesma função que a gp210;

Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear.


Polimiosite (é raro estar presente);

Cirrose Biliar Primária (doença mais avançada quando a gp210 está

presente, mas é raro estar presente).

Auto-Imunidade


8. Padrão Nucleolar


Qualquer sub-tipo de padrão nucleolar está geralmemte associado a esclerose

sistémica ou alguma patologia do mesmo forro clínico.

8.1. Padrão Nucleolar Homogéneo:


Células HEp-2:

Nucléolos positivos homogeneamente fluorescentes, associado a um padrão

fraco homogéneo ou fino granular do núcleo nas células em interfase. Em mitose os

cromossomas são negativos.

Por vezes associado a padrão centrómeros.

Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2.


PM-Scl – Complexo polipeptídico envolvido na biossíntese ribossomal.

Auto-Imunidade



DMTC (25-50% dos casos), sendo menos frequente nas manifestações

isoladas destas patologias;

Escleroderma Difusa com envolvimento renal.

8.2. Padrão Nucleolar Clumpy:


Células HEp-2:

Largos grânulos agrupados em cada nucléolo com aspecto homogéneo nas

células em interfase. Geralmente não existe fluorescência do restante núcleo, embora

dots nucleares possam ser visíveis. Em mitose os cromossomas são positivos.

Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2. Visualiza-se uma célula em mitose

com os cromossomas positivos.


Fibrilharina 1 (U3-nRNP) – Subunidade proteica das pequenas

ribonucleoproteinas nucleolares (snoRNP); envolvida no processamento

do RNA ribossómico.

Auto-Imunidade



Escleroderma Difusa (presente em 5-10% dos casos, sendo altamente

específico), sobretudo em homens jovens.

8.3. Padrão Nucleolar Fino Granular


Células HEp-2

Nucléolos com padrão granular nas células em interfase. Durante a mitose

visualizam-se raros pontos brilhantes na zona dos cromossomas. Frequentemente

associado a padrão granular no resto do núcleo.

Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2.


RNA Polimerase I (RNAP I) – Enzima localizada no nucléolo.

Transcreve genes para moléculas precursoras do RNA ribossómico.

Frequente reacção cruzada com RNAP II e III (localização nuclear).

Auto-Imunidade



Escleroderma Difusa (30% dos casos, sendo altamente específico para

esta patologia), sobretudo com envolvimento cutâneo, dos rins e do

coração;

LES;

AR;

DMTC.

8.4. Padrão Nucleolar Fino Granular com Dots Mitóticos


Células HEp-2:

Nucléolos com padrão granular nas células em interfase. Durante a mitose

visualizam-se vários pontos brilhantes na zona dos cromossomas – local que se designa

por NOR, “Nucleolar Organising Regions” (local onde os nucléolos se organizam

depois da mitose).

Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2.

Auto-Imunidade



NORs (RNA Polimerase I, NOR-90 – factor de transcrição da RNA

Polimerase I, ASE-1).


LES;

AR;

Escleroderma;

Escleroderma com Fenómeno de Raynaud;

8.5. Padrão Nucleolar Granular


Células HEp-2:

Nucléolos com granulação grosseira, podendo parecer homogéneo.

Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2.


RNA Helicase II – Responsável pelo enrolamento do DNA.

Auto-Imunidade



LES;

Escleroderma;

DMTC.

9. Padrão Dots Nucleares (NSP1 – “Nuclear Speckled type 1”)

9.1. Poucos Dots Nucleares


Células HEp-2:

Dois a seis dots (pontos) nucleares discretos em células em interfase,

frequentemente perto dos nucléolos. Células em mitose com cromossomas negativos e

mitoses frequentemente negativas.

Geralmente associado a padrões granulares ou nucleolares nucleares ou a

padrões citoplasmáticos (mitocondrial ou actina), embora seja um padrão muito raro.

Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2.

Auto-Imunidade



p80-coilina – snRNP associado a fibrilarina; maturação do snRNP e seu

transporte do núcleo para o citoplasma.


Hepatite Autoimune tipo1;

Cirrose Biliar Primária (30% dos casos) (frequentemente associado a padrão

mitocondrial).

9.2. Múltiplos Dots Nucleares


Células HEp-2:

Mais de seis dots nucleares (geralmente até dez) por cada célula HEp-2 em

interfase, geralmente separados dos nucléolos. Células em mitose com mitoses positivas

mas com cromossomas negativos, o que permite a sua distinção do padrão centrómeros

onde os cromossomas são positivos.

Por vezes associado a padrão mitocondrial.

Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2. Nas células em mitose observam-

se cromossomas negativos (ao contrário do que acontece no padrão centrómeros) e mitoses positivas.

Auto-Imunidade



sp100 – Proteína de função desconhecida;

PML (“Promyelocytic Leukaemia Protein”).


Cirrose Biliar Primária (>30% dos casos) (frequentemente associado a

padrão mitocondrial);

LES;

Síndrome de Sjögren, sobretudo se associado a Cirrose Biliar Primária;

Colangite Esclerosante Primária.

10. Padrão Centrómeros


Células HEp-2:

Muitos dots discretos distribuídos por todo o núcleo das células em interfase.

Células em mitose com os cromossomas positivos, mas como que às riscas,

correspondendo à zona dos centrómeros dos cromossomas condensados (característica

única deste padrão).

Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2. Para além dos múltiplos dots nucleares em

células em interfase, verifica-se que os cromossomas são positivos mas tracejados (característica única

deste padrão) em células em mitose.

Auto-Imunidade



Centrómeros (ACA – “anti-centromere antibody”) – Zona central dos

cromossomas. Existem quatro tipos de proteínas centroméricas: CENP-

A, CENP-B (mais frequentes) e CENP-C e CENP-D (mais raras). O

padrão não é visível por existência de auto-anticorpos anti-CENP-F.

Figura 64 – Diagrama ilustrativo da localização das proteínas centroméricas. A localização do

CENP-D não está definida.


CREST (em 55% dos casos);

Síndrome de Sjögren (infrequente);

Esclerose Difusa;


11. Padrão Centríolos/Centrossomas


Células HEp-2:

Em células em interfase visualiza-se um ou dois pontos no citoplasma junto ao

núcleo. Células em metafase exibem dois pontos, um em cada pólo do núcleo.

Auto-Imunidade


Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2.


Centríolo / Centrossoma – Conjunto de proteínas (PCM-1, pericentrina,

Cep250) importantes na organização do citosqueleto em interfase; sítio a

partir do qual os microtúbulos se polimerizam para formar o fuso

acromático.


Síndrome de Sjögren;

Escleroderma;


NOTAR que muitas vezes este padrão surge após uma infecção viral.

Auto-Imunidade


PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO

1. Padrão Mitocondrial


Células HEp-2:

Citoplasma rendilhado, como as contas de um rosário.

Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial.


Mitocôndrias, das quais a M2 (inclui o complexo piruvato desidrogenase – PDC

– e outras proteínas) é a mais frequentemente detectada, mas também se detecta

M3 e M6 (M1 e M5 não são detectados em células HEp-2).


Cirrose Biliar Primária (95% dos doentes apresentam M2);

LES induzido por drogas (M3 e M6);

Síndrome de Sjögren;

Escleroderma;


Auto-Imunidade


2. Padrão Actina


Células HEp-2:

Finas fibras fluorescentes que atravessam o núcleo e o citoplasma das células.

Frequentemente associado a dots nucleares. Dificilmente visível nestas células, devendo

utilizar-se outro substrato para se confirmar um caso suspeito. Semelhante aos padrões

tropomiosina, vinculina, vimentina e citoqueratina, todos sem significado clínico.

Figura 67 – Padrão Actina nas células HEp-2. Geralmente a imagem ao vivo não é tão evidente

como a aqui ilustrada, sendo facilmente confundida com os padrões tropomiosina, vinculina, vimentina e

citoqueratina.


Actina – Subunidade dos microfilamentos do citoesqueleto, envolvidos nos

movimentos celulares, como a contracção muscular e movimentos

intracitoplasmáticos.


Hepatite Auto-Imune tipo 1;

DMTC;

Cirrose Biliar Primária.

Auto-Imunidade


NOTAR que apenas títulos elevados são significativos, já que baixos títulos podem

relacionar-se com uma infecção viral (exº: mononucleose).

3. Padrão Jo-1:


Células HEp-2:

Finas granulações dispersas por todo o citoplasma, sendo menos evidentes na

periferia do mesmo e mais evidentes junto ao núcleo.

Difícil de visualizar em células HEp-2. Semelhante aos padrões lisossomal e

peroxissomal, ambos sem interesse clínico.

Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2. Este padrão é por vezes confundido com os padrões

lisossomal e peroxissomal.


Jo-1 (anti-PL1) – Enzima citoplasmática responsável pela ligação da

histidina ao RNA transferência (sintetase do RNAt).


Polimiosites (20 a 40% dos casos);

Auto-Imunidade


Dermatomiosites, mais raramente.

Sobretudo associado a doença intersticial pulmonar.

4. Padrão SRP (“Signal Recognition Particle”)


Células HEp-2:

Citoplasma com padrão fino granular ou granular, sem fluorescência do núcleo ou

nucléolos.

Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2.


Signal Recognition Particle (SRP) – Complexo ribonucleoproteico que

direcciona proteínas recém-formadas para o retículo endoplasmático; trata-se

de um receptor para os péptidos proteicos localizado no retículo

endoplasmático.


Polimiosites;

Dermatomiosites.

Auto-Imunidade


5. Padrão Ribossomal


Células HEp-2:

Citoplasma com padrão fino granular, granular ou quase homogéneo, muito denso

(quase totalmente preenchido), com acentuação perinuclear. Fluorescência nucleolar

com núcleos sem fluorescência.

Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2.


Ribossomais – Três fosfoproteínas ribossomais (P0, P1 e P2) existentes nos

nucléolos e transferidas para o citoplasma. Formam um domínio GTPase

numa subunidade dos ribossomas.


LES (10-20% dos casos, por vezes sem DNAds), sobretudo com

envolvimento do SNC.

Auto-Imunidade


PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO

1. Padrão Complexo de Golgi


Células HEp-2:

Padrão composto por largos grânulos irregulares e polares na parte mais interna do

citoplasma adjacentes a uma parte do núcleo.

Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2.


Golgi – Conjunto de proteínas com interesse na organização das membranas

do Golgi.


LES (raramente associado);

Síndrome de Sjögren (raramente associado).

Auto-Imunidade


2. Padrão Tropomiosina


Células HEp-2:

Fibras citoplasmáticas tipo Actina parecendo manter a célula sob tensão.

Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2.


Tropomiosina – Associada à actina, sendo importante na contracção muscular.

3. Padrão Vinculina


Células HEp-2:

Fibras citoplasmáticas semelhantes à actina. Nas células em mitose o padrão é

citoplasmático granular, descartando-se, assim, a hipótese de se tratar de uma actina.

Auto-Imunidade


Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2. Observa-se uma célula em mitose com o

citoplasma granulat, afastando-se a hipótese de se tratar de uma actina.


Vinculina – Proteína localizada nas junções aderentes, sendo importante na

ligação dos microfilamentos à membrana celular.

4. Padrão Vimentina


Células HEp-2:

Abundante quantidade de fibras citoplasmáticas, que parecem ligar-se à membrana

nuclear e citoplasmática.

Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2.

Auto-Imunidade



Vimentina – Filamento do citosqueleto de função desconhecida.

5. Padrão Citoqueratina


Células HEp-2:

Filamemtos citoplasmáticos de forma reticular nas células em interfase. Nas células

em mitose os filamentos partem-se, apresentando aspecto granular.

Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2.


Citoqueratina.

6. Padrão Desmina


Células HEp-2:

Auto-Imunidade


Finos filamentos citoplasmáticos que parece formarem uma malha de suporte à

maquinaria contráctil da célula. Mitoses positivas em células em mitose.

Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2.


Proteína filamentosa tipo III

7. Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto


Células HEp-2:

Extensões fibrosas curtas do citoplasma das células, ligando os filamentos do

citosqueleto à membrana plasmática da célula e à matriz extracelular de células

vizinhas.

Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2.

Auto-Imunidade



Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto (Tensina, Paxilina, Zixina) – Proteínas

importantes na adesão celular, na morfogénese, na motilidade celular e na

regulação de estruturas membranares.

8. Padrão Lisossomal


Células HEp-2:

Granulação grande e irregular distribuída por todo o citoplasma.

Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2.


Anticorpos anti-lisossomais.

9. Padrão Peroxissomal


Células HEp-2:

Auto-Imunidade


Granulação fina e uniforme distribuída aleatoriamente no citoplasma.

Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2.


Desconhecidos.

Auto-Imunidade


Auto-Ac Nuclear Padrão Nuclear Patologia(s)

de Maior Interesse Outras Patologias Outras Situações

DNAds Homogéneo

(cromossomas +) LES AR Tratamento com TNFα

DNAss e

Nucleossoma

Homogéneo

(cromossomas +)

LES; Hepatite Auto-Imune

1 Tratamento com TNFα

DNP (histonas) Homogéneo

(cromossomas +)

LES induzido por

drogas

LES; Escleroderma;

Hepatite Auto-Imune 1 Tratamento com TNFα

Scl-70

Fino Granular

(nucléolos +/-; cromossomas +)

Escleroderma

Difusa

LES; CREST; Fenómeno de

Raynaud;

SS-A (Ro) Fino Granular

(mitoses +) LES Neonatal; SS

LES; Escleroderma;

Miosites; DMTC; Hepatite

Autoimune 1

Doenças Sistémicas; Paragem Cardíaca

SS-B (La) Fino Granular

(mitoses +) LES Neonatal; SS

LES; Escleroderma;

DMTC; Hepatite

Autoimune 1

Doenças Sistémicas; Paragem Cardíaca

RNA Polimerase

II e III

Fino Granular

(mitoses +)

Escleroderma

Difusa

LES; AR; SS; CREST;

DMTC

Mi-2 Fino Granular

(mitoses +) Dermatomiosite

Sm Granular

(mitoses +) LES

U1-snRNP Granular

(mitoses +) DMTC LES; Escleroderma

PCNA

Fino Granular /

Granular (interfase + /-;

mitoses +)

LES Hepatite Crónica B ou C;

Linfomas

hnRNP Matriz

(mitoses +)

LES; AR; Escleroderma; DMTC

Lâmina A, B,

B2, C

Membranar Nuclear

(mitoses +)

LES; Vasculites associadas a outra patologia; Hepatite

Auto-Imune 1

Trombocitopénia; Anemia; Síndrome de Cansaço

Crónico

gp210 e

nucleopurina

p62

Poros Membrana Nuclear

(mitoses +)

Polimiosite; Cirrose Biliar

Primária

PM-Scl Nucleolar Homogéneo DMTC Escleroderma Difusa com

envolvimento renal

Fibrilharina 1

(U3-nRNP)

Nucleolar Clumpy

(cromossomas +)

Escleroderma

Difusa Carcinoma Hepatocelular

RNA Polimerase

I

Nucleolar Fino

Granular

(poucos dots nos cromossomas)

Escleroderma

Difusa LES; AR; DMTC

NOR

Nucleolar Fino

Granular com Dots (muitos dots nos

cromossomas)

LES; AR; Escleroderma

Difusa; Fenómeno de

Raynaud

Neoplasias (sobretudo hepatocelular)

RNA Helicase II Nucleolar Granular LES; Escleroderma; DMTC Ectasia Gástrica Vascular

Antral

p80-coilina NSP1 (poucos dots

nucleares)

Hepatite Crónica

Autoimune 1; Cirrose Biliar Primária

Doença Viral Hepática

sp100 e PML

NSP1 (muitos dots

nucleares) (mitoses +)

Cirrose Biliar

Primária

LES; SS; Colangite

Esclerosante Primária

ACA

(centrómeros)

Centrómeros

(cromossomas + riscas) CREST

SS; Esclerose Difusa;


Centríolo Centríolo SS; Escleroderma;


Infecção viral (EBV,

CMV); Diversas Afecções

Ku Ku LES; Polimiosite com

Escleroderma

MSA-2 Midbody Escleroderma; Fenómeno de

Raynaud; Estado Inflamatório

Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos. A azul apontam-se as patologias para as quais

os ANAs são específicos.

Auto-Imunidade


Auto-Ac

Citoplasmático

Padrão

Citoplasmático Patologia Interesse Outras Patologias Outras Situações

Mitocôndrias

(M2; M3; M6) Mitocondrial

Cirrose Biliar

Primária

LES; SS; Escleroderma;

Fenómeno de

Raynaud;

Actina Actina

Hepatite Autoimune

1

(elevados títulos)

DMTC; Cirrose

Biliar Primária

(elevados títulos)

Infecção viral (baixos títulos)

Jo-1 Jo-1

Polimiosite; Dermatomiosite,

sobretudo com

fibrose pulmonar

SRP SRP

Polimiosite;

Dermatomiosite

(rara associação)

Ribossoma Ribossomal

(nucléolos +) LES

Sintomas Neuropsiquiátricos?

Golgi Golgi LES; SS

Doenças Crónicas

Reumáticas;

Desgenerescência

(Esclerose Múltipla);

Ataxia Cerebral; Neoplasias

Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. A

azul apontam-se as patologias para as quais os auto-anticorpos anti-citoplasmáticos são específicos.

3.1.3.2.Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae

Os auto-anticorpos anti-DNAds são específicos para o LES, raramente estando

presentes em doentes com outras DAI. O título destes auto-anticorpos está directamente

relacionado com a actividade da doença, tendendo a desaparecer durante os tratamentos

imunossupressores e durante a remissão clínica, daí a sua importância para o

diagnóstico e monitorização clínica. Outros auto-anticorpos presentes no LES não são

específicos da patologia podendo manifestar-se noutras doenças, ou o seu título não se

relaciona com o estado da doença.

As células HEp-2 podem ser utilizadas para a pesquisa de auto-anticorpos anti-

DNAds, como já referido, mas os padrões raramente são específicos. O padrão

homogéneo, característico dos auto-anticorpos anti-DNAds, também ocorre para os

auto-anticorpos anti-DNAss, anti-histonas e anti-nucleossoma – auto-anticorpos que não

só se podem manifestar no LES como em outras patologias. Assim, sempre que o

clínico faz um pedido específico de auto-anticorpos anti-DNAds, em vez de se recorrer

às células HEp-2 como substrato de imunofluorescência indirecta, no HCC recorre-se às

lâminas com Crithidia luciliae.

Auto-Imunidade


A Crithidia luciliae é um protozoário unicelular e uniflagelado que apresenta

uma mitocôndria gigante – o cinetoplasto – que contém apenas elevadas quantidades

DNAds, e não DNAss, histonas ou nucleossoma. Assim, recorrendo-se a este organismo

como substrato antigénico da imunofluorescência indirecta, no caso do cinetoplasmo

apresentar fluorescência garante-se a presença de auto-anticorpos anti-DNAds no soro

do doente. Trata-se, portanto, de um ensaio altamente específico para a pesquisa destes

auto-anticorpos (95%), embora pouco sensível (70%).

Para além do cinetoplato, o protozoário apresenta um núcleo, onde se pode

encontrar tanto DNAds, como outro tipo de material genético. Assim, se o núcleo

apresentar fluorescência o resultado não é necessariamente positivo para DNAds. Não é

também invulgar a zona de inserção do flagelo brilhar, podendo este brilho confundir-se

com o cinetoplasto. Assim, importa, esclarecer que só se o cinetoplasto brilhar,

independentemente do núcleo ou zona de inserção do flagelo brilharem ou não, o

resultado é positivo para DNAds.

Se 2/3 dos cinetoplastos das células da lâmina apresentarem fluorescência o

resultado é dado como positivo; se apenas 1/3 brilhar o resultado é dado como negativo;

se 1/2 brilhar é conveniente repetir o ensaio.

A amostra do doente é inicialmente diluída de 1:10 – título a partir do qual se

poderá considerar clinicamente significativa a presença de DNAds por estudos feitos em

pessoas saudáveis. No caso do resultado ser positivo para a diluição da amostra

efectuada poder-se-iam efectuar diluições sucessivas até que se deixasse de observar

fluorescência, a fim de se obter uma quantificação semi-quantitativa do DNAds. No

entanto, sempre que um resultado é positivo por imunofluorescência indirecta, dado a

elevada relação entre os títulos de DNAds e a actividade do LES, opta-se no HCC por

se fazer uma posterior quantificação rigorosa por métodos de ELISA.

Figura 80 – Esquema representativo do protozoário Crithidia luciliae. O cinetoplasto localiza-se

no terço superior da Crithidia luciliae, quase junto à zona de inserção do flagelo. O núcleo, de maiores

dimensões, localiza-se numa zona mais inferior do organismo.

Núcleo

Cinetoplasto (só

DNAds)

Flagelo

Base de inserção do

flagelo

Auto-Imunidade


Figura 81 – À esquerda, imagem de um resultado positivo para DNAds; verifica-se fluorescência

em todos os cinetoplastos das células de Crithidia luciliae (o núcleo e a zona de inserção do flagelo

também brilham, neste caso). À direita, resultado negativo; geralmente a zona de inserção do flagelo

brilha quando os resultados são negativos.

3.1.3.3.Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos

Para a pesquisa de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos as células HEp-2 não

constituem o substrato ideal. O ideal é recorrer a tecidos onde geralmente se encontrem

os auto-anticorpos que se pretende identificar. Isto é, por exemplo, se se pretender

averiguar a presença de auto-anticorpos anti-células parietais deve utilizar-se como

substrato tecido gástrico, onde se encontram as células parietais.

O tecido utilizado poderá ser de rato ou de macaco. O tecido de rato apresenta a

desvantagem de não ter uma homologia elevada em relação ao tecido humano, o que

significa que a ligação “antigénio do tecido de rato – IgG do soro do paciente” não é

perfeita; pode, portanto, verificar-se a ligação de anticorpos inespecíficos (heterófilos)

humanos aos antigénios do tecido do rato, o que conduzirá a falsos resultados positivos

(fluorescência inespecífica). O tecido de macaco, por apresentar elevada homologia com

o humano, garante que só as IgG do soro do paciente elevadamente complementares aos

antigénios do tecido de macaco se liguem; observa-se, assim, menos fluorescência de

fundo inespecífica.

Tecido hepático, renal e estomacal constituem os substratos tradicionais para a

pesquisa inicial de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos, onde se pode avaliar a presença

destes auto-anticorpos mais frequentes e com maior significado clínico.

Auto-Imunidade


No HCC, sempre que é feito um pedido de pesquisa de auto-anticorpos anti-

citoplasmáticos, recorre-se a um kit que apresenta em cada poçeto da lâmina seis tecidos

diferentes: células Hep-2, tecido hepático de macaco, tecido hepático de rato, tecido

renal de rato, tecido gástrico de rato e células VSM47.

Cada amostra é diluída a 1:40 e, depois de se realizar a técnica de

imunofluorescência indirecta, a amostra é avaliada em cada um destes seis tipos de

tecidos. A fluorescência que o conjunto dos seis tecidos apresentarem irá permitir

identificar o auto-anticorpo anti-citoplasmático eventualmente presente. No caso de se

verificar a presença de um ANA nas células HEp-2, tal também é mencionado ao

clínico.

Para cada um dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos com interesse clínico,

segue-se a descrição do padrão de fluorescência característico para cada tecido negativo.

Auto-Imunidade


Figura 82 – Esquema que ilustra a posição dos seis tipos de tecidos em cada poçeto da lâmina.

As imagens correspondem aos tecidos sem fluorescência (negativos).

Tecido hepático de

rato

Células HEp-2 Tecido hepático

de macaco

Tecido renal

de rato

Tecido gástrico

de rato Células VSM47

Muscularis

mucosa

Células parietais

Trabéculas

Auto-Imunidade


1. Auto-Anticorpos Anti-Mitocondriais (AMA)

Os auto-anticorpos anti-mitocondriais (AMA) constituem a marca de uma

Cirrose Biliar Primária. 95% dos pacientes com esta patologia apresentam elevados

títulos destes anticorpos.

De entre os nove tipos de AMA existentes (M1 a M9), os auto-anticorpos anti-

M2 contra o complexo enzimático da desidrogenase láctica são os mais importantes,

uma vez que estão presentes em cerca de 96% dos casos de Cirrose Biliar Primária,

estando presentes em não mais de 30% de outras patologias hepáticas crónicas. Para

além dos M2, também os auto-anticorpos anti-M4, M8 e M9 se associam à mesma

patologia, embora estejam presentes numa menor percentagem de casos.

Os títulos de AMA não se correlacionam com o estadio da doença ou com o seu

prognóstico, não tendo, por isso, significado a sua quantificação.

Auto-Imunidade


AMA Patologias Associadas Prevalência

M1

LES 50%

AR, Esclerose Sistémica, S. Sjögren, S. Sharp

5 – 15%

M2

Cirrose Biliar Primária > 96%

Outras doenças crónicas hepáticas 30%

Esclerose Sistémica 7 – 25%

M3 Síndrome Pseudo-Lúpus; LES induzido

por drogas 100%

M4 Cirrose Biliar Primária > 55%

M5 Doenças do Colagénio raro

M6 Hepatite induzida por iproniazida; LES

induzido por drogas 100%

M7

Miocardite aguda 60%

Cardiomiopatias 30%

M8 Cirrose Biliar Primária > 55%

M9

Cirrose Biliar Primária 37 – 82%

Hepatites 3 – 10%

Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais

(AMAs).

Na figura seguinte descrevem-se os padrões característicos dos seis tipos de

tecidos para os AMA.

Auto-Imunidade



Tecido renal

de rato

Tecido gástrico

de rato

Células VSM47

Muscularis

mucosa

negativa

Células parietais

positivas

Trabéculas

negativas

Glomérulo

negativo

Hepatócitos com

fluorescência

granular

Padrão

citoplasmático

rendilhado

Padrão

citoplasmático

rendilhado

Figura 83 – Padrões de fluorescência caraterísticos para os AMA. Células HEp-2 e VSM47

com padrão citoplasmático rendilhado, fazendo lembrar um rosário; não é invulgar a associação deste

padrão citoplasmático com a presença de dots nucleares nas células HEp-2, também característico de

Cirrose Biliar Primária. Tecidos hepáticos com o citoplasma dos hepatócitos com padrão granular

(muitos pontinhos). Tecido renal com túbulos com fluorescência granular (sobretudo os distais, embora

na prática, não dê para distinguir e todos pareçam brilhar); brush border (contorno interno dos túbulos)

negativa; glomérulos com fraca ou nenhuma fluorescência. Tecido gástrico com células parietais

positivas; muscularis mucosa negativa; trabéculas (fibras contrácteis de actina inter-glandulares)

negativas.

Túbulos com

fluorescência granular

basal

Auto-Imunidade


2. Auto-Anticorpos Anti-Músculo Liso (ASMA)

Existem vários tipos de fibras que constituem o músculo liso: fibras de actina,

vimentina, vinculina, desmina, citoqueratina, tubulina, entre outras. Os auto-anticorpos

dirigidos contra este tipo de células designam-se, na sua generalidade, por ASMAs.

ASMAs em elevados títulos encontram-se presentes em cerca de 90% dos

pacientes com Hepatite Autoimune tipo I. Contudo, à excepção dos auto-anticorpos

anti-actina, os restantes ASMAs são inespecíficos, podendo encontrar-se em inúmeras

diferentes patologias reumáticas e doenças inflamatórias, bem como em indivíduos

normais.

Assim, só os auto-anticorpos anti-actina apresentam interesse no diagnóstico da

Hepatite Autoimune tipo 1 e se presentes em títulos elevados (> 1:40) são suficientes

como critério de diagnóstico. Por isso, é importante semi-quantificar títulos positivos de

ac. anti-actina em 1:40 ou > 1:40, observando particularmente as células VSM47 – o

substrato ideal para visualizar estes anticorpos.

Na figura seguinte descrevem-se os padrões característicos dos seis tipos de

tecidos para os auto-anticorpos anti-actina.

Auto-Imunidade



Tecido renal de rato

Tecido gástrico de rato

Vasos de tecido gástrico de rato

Células VSM47

Padrão

citoplasmático

fibroso

Vasos com média

intensamente

corada

Hepatócitos com

forma poligonal

por coloração

canalicular

Glomérulos

positivos

áreas

peritubulares

positivas

Muscularis mucosa positiva

Trabéculas positivas

Células parietais negativas

média positiva

íntima negativa

Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para os anticorpos anti-actina. Células HEp-2 com fibras no

citoplasma que atravessam o núcleo; este substrato não é específico para Ac. anti-actina, podendo confundir-se com outros

ASMAs. Tecido hepático com coloração da actina dos canalículos que rodeiam os hepatócitos, conferindo contornos

poligonais aos hepatócitos (diagrama artificial na imagem); vasos com a média intensamente corada. Tecido renal negativo;

para títulos elevados pode existir reacção cruzada com a tubulina do glomérulo (glomérulos positivos) e as áreas

peritubulares podem apresentar fluorescência às pintinhas ou mesmo tipo espículas (diagrama artificial na imagem). Tecido

gástrico com a Muscularis mucosa positiva; trabéculas (fibras contrácteis de actina inter-glandulares) positivas; células

parietais negativas; vasos com a íntima (dentro) negativa e a média intensamente positiva. Células VSM47 (substrato ideal

para os ac. anti-actina) com fibras citoplasmáticas marcadas que atravessam o núcleo da célula; o mesmo não se verifica para

os restantes ASMAS.

Auto-Imunidade


3. Auto-Anticorpos Anti-Microssomais (LKM – “Liver & Kidney

Microssomes”)

Os auto-anticorpos anti-microssomais são invulgares, podendo encontrar-se em

vários tipos de hepatites; são úteis para a classificação da patologia hepática.

Embora também possa estar presente em caso de hepatite C, o LKM-1 é

considerado o marcador de Hepatite Autoimune tipo II; os ANA e ASMA são

geralmente negativos para este tipo de hepatite autoimune. O LKM-2 está presente em

caso de hepatite induzida por ácido tienílico (fármaco já retirado do mercado). O LKM-

3 manifesta-se nalguns pacientes com Hepatite Autoimune II e hepatite crónica D. Os

títulos de LKM em hepatites virais tendem a ser mais baixos que os títulos presentes em

hepatites autoimunes.

Qualquer tipo de LKM conduz à fluorescência do tecido hepático (L=liver) e

renal (K=kidney). Contudo, diferentes LKMs conduzem a diferentes tipos de padrões de

fluorescência nestes dois tecidos.

A figura que se segue evidencia o padrão característico do LKM-1 nos seis

tecidos diferentes utilizados, uma vez que este é dos três o LKM com maior interesse

clínico.

Auto-Imunidade



Tecido renal

de rato

Tecido gástrico

de rato

Células VSM47

Muscularis

mucosa

negativa

Negativas

Negativas

Células parietais

negativas

trabéculas

negativas

Hepatócitos com

citoplasma

positivo e núcleo

negativo

Túbulos proximais

positivos

Túbulos distais

negativos

Brush border dos

túbulos proximais

positiva

Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para o LKM1. Tecido hepático com o

citoplasma dos hepatócitos completamente fluorescente (mais ainda que o padrão granular

característico das M2); núcleo negativo. Tecido renal com glomérulos negativos e apenas alguns

túbulos positivos - os túbulos proximais e, portanto, os túbulos mais largos, embora a diferenciação seja

difícil de se fazer. Brush border (contorno interno) dos túbulos proximais fortemente positiva (em

pormenor em baixo do tecido renal). Células HEp-2, células VSM47 e tecido gástrico negativos.

Auto-Imunidade


4. Auto-Anticorpos Anti-Células Parietais (APCA)

Os auto-anticorpos anti-células parietais estão presentes em quase todos os

doentes que apresentam Gastrite Autoimune do tipo A – Gastrite Atrófica Crónica – e

em cerca de 90% dos doentes com Anemia Perniciosa, sendo úteis no diagnóstico

destas patologias. A presença de auto-anticorpos anti-células parietais vai diminuindo

com a progressão da patologia, daí poderem estar ausentes em alguns casos de doença

avançada.

Contudo, estes auto-anticorpos também estão frequentemente presentes em

várias endocrinopatias (exª Tiroidite de Hashimoto, Doença de Graves, Diabetes

Mellitus) e até em indivíduos saudáveis, apresentando, portanto baixa especificidade.

Como tal, o diagnóstico da Gastrite Atrófica Crónica e Anemia Perniciosa deverá

sempre incluir também a pesquisa da presença de auto-anticorpos anti-factor intrínseco.

A figura que se segue evidencia o padrão característico destes auto-anticorpos

nos seis tecidos diferentes utilizados.

Auto-Imunidade



Células VSM47

Tecido renal

Tecido gástrico

Muscularis mucosa

negativa

Células parietais

positivas

Trabéculas negativas

Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para os auto-anticorpos anti-

células parietais (APCA). Só o citoplasma das células parietais do estômago apresenta

positividade (padrão granular). Todas as outras estruturas do tecido gástrico e todos os outros

tecidos são negativos. Contudo, é importante a sua observação (sobretudo das restantes

estruturas gástricas e da brush border do tecido renal) devido à possível presença de anticorpos

heterófilos. Assim, se as células parietais brilharem tanto quanto a Muscularis mucosa no

estômago ou a brush border nos túbulos renais, não se deverá considerar o resultado como

positivo. Também não se deverá considerar uma amostra como positiva se for o núcleo, e não

o citoplasma, das células parietais a apresentar fluorescência; se tal acontecer provavelmente

estra-se-à na presença de um ANA ou de um anticorpo heterófilo.

Auto-Imunidade


3.1.3.4.Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos

1. Auto-Anticorpos Anti-Ductos Salivares

Os auto-anticorpos dirigidos contra o citoplasma das células epiteliais das

glândulas salivares estão presentes em cerca de 50% dos pacientes com Síndrome de

Sjögren e menos frequentemente em pacientes com AR (20%), LES (20%) e outros

tipos de DAI. O seu significado clínico é, contudo, incerto. Outros tipos de auto-

anticorpos frequentemente coexistem, como ANAs (SS-A e SS-B).

O tecido eleito para a sua pesquisa é de glândula paratiroideia de macaco, sendo

este o tecido utilizado no kit executado no HCC. A imagem que se segue ilustra o

padrão característico.

Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares.

Os auto-anticorpos ligam-se a grânulos no citoplasma das células epiteliais dos

ductos salivares, particularmente do lado do lúmen, mas não às células dos ácinos.

Como os doentes frequentemente têm ANAs associados, é possível que o núcleo das

células também apresente fluorescência.

http://www.ii.bham.ac.uk/clinicalimmunology/CISimagelibrary/images/GPC.jpg

Auto-Imunidade


2. Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de Langerhans (ICAs)

Os auto-anticorpos anti-ilhéus de Langerhans no pâncreas são geralmente

encontrados em doentes com Diabetes Mellitus tipo 1, estando envolvidos na

patogénese da doença. Estão presentes em 70 a 80% dos diagnósticos de novo da

Diabetes Mellitus tipo 1, sobretudo em crianças e desaparecem ao fim de algum tempo

após o diagnóstico. Alguns parentes dos doentes também apresentam estes auto-

anticorpos.

Para pesquisa dos ICAs utiliza-se no HCC pâncreas de macaco. A figura

seguinte ilustra um resultado positivo.

Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de

Langerhans em pâncreas de macaco.

Existem vários tipos de anticorpos que se podem utilizar. Os da figura são

anticorpos dirigidos contra todo o ilhéu (células β, α e δ). No HCC, os anticorpos

utilizados são apenas dirigidos contra as células β; assim, a fluorescência não é tão

abrangente resumindo-se a conjuntos de cerca de 3 a 4 células.

Auto-Imunidade


3. Auto-Anticorpos Anti-Supra-Renais (ACAs)

Os auto-anticorpos anti-glândulas supra-renais (adrenais) estão na origem de

cerca de 60 a 80% dos casos de Doença de Addison Primária, em que estes auto-

anticorpos destroem todo o córtex adrenal, instalando-se, assim, insuficiência cortico-

supra-renal global.

Os auto-anticorpos contra o córtex adrenal são detectados em cerca de 80% dos

pacientes com Doença de Addison, não se correlacionando com a evolução clínica da

doença.

Para pesquisa destes auto-anticorpos o HCC recorre a um kit com tecido de

córtex adrenal de macaco. A imagem seguinte ilustra um resultado positivo.

Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em

córtex adrenal de macaco.

Verifica-se fluorescência, de fora para dentro da glândula, na zona glomerulosa e

na zona fasciculada do córtex adrenal. O corte também inclui a zona reticulada (não

visível na figura); fluorescência nessa zona obriga ao despiste da presença de AMA, que

conferem um padrão semelhante (granular a fino granular) nessa zona.

Cápsula de tecido

conjuntivo

Zona glomerulosa

(aldosterona)

Zona fasciculada

(cortisol)

Auto-Imunidade


4. Auto-Anticorpos Anti-Endomísio (EMA)

O endomísio é uma estrutura de suporte, que rodeia as fibras de músculo

estriado e liso de uma parte do esófago, sendo constituído por reticulina e colagénio. Os

auto-anticorpos dirigidos contra esta estrutura (EMA) encontram-se em várias partes do

corpo humano, como a nível do esófago, estômago, jejuno e fígado.

Os EMA da classe IgA (e raramente da classe IgG e IgM) são altamente

específicos (99%) para doentes com Doença Celíaca não tratada e Dermatite

Herpetiforme de Duhring (geralmente associada com enteropatia sensível ao glúten). A

sua sensibilidade também é elevada (99%), uma vez que raramente são detectados em

indivíduos saudáveis e em doentes com outras patologias intestinais. Revelam-se,

portanto, muito úteis no diagnóstico destas patologias.

Para avaliação da presença dos EMA recorre-se no HCC a um kit que utiliza

como substrato esófago de macaco – tecido onde é mais fácil de interpretar o resultado

do que no estômago. O kit detecta em simultâneo IgA, IgG e IgM.

A figura seguinte ilustra um resultado positivo.

Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-Endomísio (EMA)

em esófago de macaco.

O endomísio brilha, apresentando a forma característica de um ninho de abelha.

Localiza-se internamente ao epitélio da membrana mucosa e rodeando a camada de

fibras de músculo liso e estriado que constitui a Muscularis mucosa.

Epitélio negativo

Muscularis

mucosa negativa

Endomísio positivo

(ninho de abelha)

Auto-Imunidade


5. Auto-Anticorpos Anti-Músculo Estriado Esquelético

Os auto-anticorpos anti-músculo estriado esquelético reagem com os elementos

citoplasmáticos contrácteis do músculo. Encontram-se em cerca de 80 a 90% dos

doentes com Myasthenia gravis, sobretudo se acompanhados de timoma. No entanto, só

elevados títulos são relevantes para o diagnóstico, visto também se poderem encontrar

em várias outras formas de miopatia e na doença de Chagas.

O kit utilizado no HCC para a detecção destes auto-anticorpos utiliza músculo

esquelético de macaco. Um resultado positivo aparece como descrito na figura seguinte.

Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado em

músculo esquelético de macaco.

Visualiza-se um padrão fluorescente de estriação típica no citoplasma das fibras

do músculo esquelético. Para além disso, poderá observar-se o contorno fluorescente

das fibras, o que não é característico de positividade, visto também poder ocorrer em

caso de um resultado negativo.

Auto-Imunidade


3.2. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio

em “Sanduíche”

3.2.1. Fundamento

As técnicas de ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assays) são semelhantes

às técnicas de IFA. O suporte sólido é aqui uma placa de microtitulação, em vez de ser

uma lâmina, onde são fixados (em vez dos extractos das células HEp-2) os antigénios

complementares aos auto-anticorpos que se pretendem pesquisar. Os passos da reacção

também incluem a adição da amostra, seguida de incubação e lavagem. Depois

adiciona-se de igual forma o conjugado à amostra, mas desta vez, em vez da anti-IgG

estar ligada a um fluorocromo, está ligada a uma enzima; segue-se nova incubação e

lavagem. Seguidamente adiciona-se à amostra um substrato sobre o qual a enzima tem

capacidade de actuar transformando-o, durante a terceira incubação do processo, num

produto com cor. Por fim adiciona-se uma solução stop a fim de que a reacção de

conversão do substrato em produto da reacção pare simultaneamente para todas as

amostras e as posteriores leituras espectrofotométricas possam ser uniformizadas. O

processo pode ser feito manualmente ou de forma automatizada.

Figura 92 – Esquema Ilustrativo de uma reacção de ELISA. À direita, placa de ELISA.

Auto-Imunidade


A medição espectofotométrica da intensidade da cor produzida a um

determinado comprimento de onda permite relacionar a extensão da reacção e,

consequentemente, a quantidade de auto-anticorpos presentes na amostra do doente.

Num ELISA qualitativo, juntamente com as amostras dos doentes, analisa-se no

mesmo ensaio um calibrador que funciona como “cut-off”. Assim, as amostras que

apresentarem valores iguais ou acima do calibrador são consideradas positivas (valor

amostra/valor calibrador = ou > 1), enquanto que as que apresentarem valores abaixo do

calibrador são consideradas negativas (valor amostra/valor calibrador < 1).

Falsos resultados poderão surgir por lavagem insuficiente (falsos positivos) ou

por problemas impossíveis de controlar pelo executor, como a má fixação dos

antigénios à placa de ELISA ou a aderência dos auto-anticorpos da amostra à película

utilizada para ligar os antigénios ao poçeto da placa (e não aos próprios antigénios).

3.2.2. Aplicação

Relativamente aos testes de IFA, os testes de ELISA requerem menos pessoal

especializado, sendo passíveis de automatização completa, mas são mais dispendiosos

que os testes de IFA. Por outro lado, relativamente à sua sensibilidade e especificidade:

- Em comparação aos testes de IFA para células HEp-2, os ELISA são testes

menos sensíveis mas mais específicos. Assim, sempre que um resultado é considerado

positivo por IFA em células HEp-2 justifica-se a confirmação da sua positividade por

um teste de ELISA.

- Em comparação aos testes de IFA para células de Crithidia luciliae, os testes

de ELISA são mais sensíveis e menos específicos, visto que podem ocorrer falsos

resultados positivos para DNAds por ELISA, por desnaturação espontânea do DNAds

em DNAss e consequente quantificação do DNAss como DNAds.

No HCC, sempre que um teste de IFA para células HEp-2 ou células de

Crithidia luciliae é considerado positivo, segue-se a realização de um teste de ELISA

qualitativo (ver Observações e Sugestões 1). Neste teste, cada poçeto da microplaca

está revestido com uma poll de antigénios, considerados os principais marcadores das

DAI. Se o teste for positivo significa que a amostra do doente contém pelo menos um

Auto-Imunidade


dos auto-anticorpos em pesquisa. Este rastreio irá detectar a maioria dos ANAs, mas

haverão sempre algumas amostras com ANAs não contidos no poll que não serão

detectados e que podem ter sido visualizados previamente por IFA.

3.2.3. Ensaios Executados

3.2.3.1.ANA Screen

O teste de ELISA qualitativo utilizado no HCC designa-se por ANA Screen.

Neste teste, para o qual as amostras são diluídas de 1:200, cada poçeto da placa de

ELISA está revestido com uma pool dos antigénios considerados os principais

marcadores das DAI:

- DNAds (LES);

- Histonas (LES Induzido por drogas);

- Scl-70 (Escleroderma Difusa);

- SS-A e SS-B (Síndrome de Sjögren);

- Sm (LES);

- nRNP ou U1snRNP (DMTC);

- Centrómero (CREST);

- Jo-1 (Polimisosites e Dermatomiosites).

Para além destes antigénios, que qualquer teste screening de ELISA contém, o

teste ANA Screen inclui também:

- Proteínas P-Ribossomais ou hnRNP (LES).

Outros testes semelhantes mas de outras casas comerciais contêm, por vezes,

para além dos antigénios principais:

- PCNA (LES);

Auto-Imunidade


- PM-Scl (“Overlap Syndrome: LES, Miosite e Escleroderma);

- Fibrilarina (Escleroderma Difusa);

- Ku (LES; Polimiosite com Escleroderma).

De todos os auto-anticorpos que os testes de ELISA Screen pesquisam, aqueles

para os quais os testes são mais sensíveis são os ENA – anticorpos contra antigénios

nucleares extraíveis (“Extractable Nuclear Antigens”): Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-

snRNP e Jo-1. Trata-se de componentes nucleares e citoplasmáticos solúveis que,

tirando o Jo-1, aparecem em IFA com padrão fino granular.

Se a amostra for fracamente positiva por IFA (1:160 para padrões homogéneos e

1:160 ou 1:320 para padrões finos granulares) e negativa para ANA Screen, a marcha

analítica termina por aqui e o resultado é dado como negativo ao clínico. Tal verifica-se

porque, por vezes, em IFA, a observação em ambiente escuro artificial pode conduzir à

sobrevalorização de padrões de fraca intensidade de fluorescência, sendo difícil

distinguir-se um resultado negativo de um fracamente positivo. A aceitação de um

resultado de 1:320 por IFA para um padrão fino granular como negativo se der negativo

por ANA Screen deve-se à elevada sensibilidade deste teste para os ENA.

Em todas as outras situações a marcha analítica prossegue com Immunoblotting

(ver Observações e Sugestões 2).

3.3. Immunoblotting - Imunodot’s

3.3.1. Fundamento

Trata-se de um ensaio de Western blot, em que as proteínas (antigénios)

extraídas de culturas celulares são separadas por electroforese num gel de

poliacrilamida, sob condições desnaturantes (presença de SDS). As proteínas no gel são

depois electrotransferidas para um papel de nitrocelulose que proporciona um suporte

sólido para os antigénios. O papel de nitrocelulose é seguidamente cortado em tiras de

forma a que cada tira contenha um conjunto de antigénios individualizados (para os

Auto-Imunidade


quais se pretendem pesquisar os respectivos anticorpos) e um controlo interno. Para

cada amostra é, assim, utilizada uma destas tiras.

Vários métodos podem depois ser utilizados a fim de se detectar a ligação

antigénio-anticorpo, nomeadamente um ELISA, como é o caso dos kits utilizado no

HCC.

Nestes kits, as tiras de nitocelulose já vêm preparadas, bastando, apenas, que

sejam hidratadas com tampão por cinco minutos, colocando-se para isso cada tira (uma

para cada amostra e outra para um controlo externo) num dos canais do aparelho.

Segue-se a pipetagem das amostras (diluídas previamente de 1:100) e do controlo

externo. Depois todo o processo é automatizado: incubação de trinta minutos, lavagem

das tiras, segunda incubação de trinta minutos com um conjugado com enzima, nova

lavagem, adição do substrato da reacção e nova incubação de 10 minutos e, por último,

adição de uma solução stop. Após a secagem das tiras, os resultados são lidos num

scanner automático que os quantifica como -, +, ++, ou +++, consoante a intensidade da

coloração negra obtida para cada antigénio. Assim, é possível identificar-se os auto-

anticorpos presentes na amostra do doente.

Os resultados só serão válidos se para cada tira a zona do controlo interno

apresentar coloração negra e se a tira do controlo externo apresentar coloração para os

auto-anticorpos descritos na bula como pertencentes ao controlo externo.

Auto-Imunidade


Figura 93 – Exemplo de tiras utilizadas para vários doentes do kit de Immunoblotting “ANA

Profile”; verifica-se que para todas as tiras o controlo interno está positivo o que permite a aceitação dos

resultados; para o primeiro doente, por exemplo, verifica-se a presença do auto-anticorpo PCNA (tira

negra na zona do respectivo antigénio).

3.3.2. Aplicação

Os dot’s permitem a identificação dos auto-anticorpos presentes na amostra de

um doente. De uma maneira geral, são executados no HCC nas seguintes situações:

Para pesquisa prévia de auto-anticorpos em células HEp-2 e/ou células de

Crithidia luciliae por IFA:

- Se a amostra for positiva para ANA Screen, uma vez que permite a

identificação de quais os auto-anticorpos responsáveis pela positividade do ANA

Screen;

- Se a amostra for fortemente positiva por IFA (>1:160), mesmo que seja

negativa para ANA Screen, uma vez que é possível que o/os auto-anticorpo(s)

presente(s) na soro do doente possam não constar no ANA Screen e serem

identificáveis por dot’s;

- Se a amostra for negativa para ANA Screen (independentemente do título

obtido por IFA) mas se se tiver informação clínica do doente que possa indiciar

uma possível positividade por Immunoblotting (por exemplo se o doente tiver

uma miosite, o que pode ser detectado por Immunoblotting e não ser detectado

por ANA Screen, uma vez que o perfil de antigénios pesquisados para miosites

por dot’s é mais alargado que o simples Jo-1 pesquisado por ANA Screen).

Para pesquisa prévia de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos em seis tipos

diferentes de tecidos por IFA:

- Se se visualizar a presença de algum auto-anticorpo de interesse (AMA,

LKM ou APCA).

Auto-Imunidade


3.3.3. Perfis Executados

Existem vários tipos de tiras (dot’s) que podem ser utilizadas para pesquisa de

auto-anticorpos. Cada tipo/perfil de tira contém um determinado conjunto de antigénios.

Os perfis são escolhidos de acordo com os auto-anticorpos que se desconfia que o

doente possa ter.

3.3.3.1.Perfil ANA (“ANA Profile 3”)

É realizado no HCC sempre que se desconfia que o doente tenha um ANA. Isto

é, para a pesquisa prévia de auto-anticorpos em células HEp-2 e/ou células Crithidia

luciliae por IFA:

- Se a amostra for positiva para ANA Screen, uma vez que permite a

identificação de quais os auto-anticorpos responsáveis pela positividade do ANA Screen;

- Se a amostra for fortemente positiva para um ANA por IFA (>1:160), mesmo

que seja negativa para ANA Screen, uma vez que é possível que o/os auto-anticorpo(s)

presente(s) na soro do doente possam não constar no ANA Screen e serem identificáveis

na ANA Profile 3.

ANA Screen ANA Profile Patologia

DNAds

Histonas

Scl-70

SS-A

SS-B

Sm

U1-snRNP

hn-RNP

Centrómeros

Jo-1

DNAds

Histonas

Nucleossoma

Scl-70

SS-A

SS-B

Sm

U1-snRNP

PCNA

hn-RNP

PM-Scl

CENP-B

AMA-M2

Jo-1

LES

LES induzido por drogas

LES

CREST, Escleroderma II

Síndrome de Sjögren

Síndrome de Sjögren

LES

DMTC

LES

LES

Miosite com Escleroderma

CREST; Escleroderma I


Polimiosite

Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira

do ANA Profile 3.

Auto-Imunidade


Uma vez que o ANA Profile 3 possui mais quatro antigénios que o ANA Screen

(nucleossoma, PCNA, PM-Scl e AMA-M2), é possível que um prévio resultado

negativo por ANA Screen dê positivo no ANA Profile para estes auto-anticorpos.

O contrário também se poderá eventualmente verificar, uma vez que a

sensibilidade do ANA Screen para os ENA (Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-snRNP e Jo-1)

é maior que a sensibilidade do ANA Profile. Tal poderá acontecer uma vez que no

processo de desnaturação proteica que os Immunobloting’s envolvem, poder-se-á

destruir a estrutura nativa dos antigénios mais sensíveis ao processo de desnaturação, o

que conduzirá a falsos resultados negativos, uma vez que o auto-anticorpo de soro do

doente poderá não se ligar convenientemente ao antigénio alterado fixado na tira de

nitrocelulose.

3.3.3.2.Perfil Hepático “Liver Profile”

É executado no HCC sempre que:

Por pesquisa anterior em células HEp-2 se identifica um dos seguintes

padrões:

- Poros da Membrana Nuclear (possível gp210);

- Múltiplos dots nucleares (possível sp100 ou PML);

- Mitocondrial citoplasmático (possível AMA-M2).

Por pesquisa anterior em tecidos de auto-antigénios citoplasmáticos se

identificam padrões nos seis tecidos característicos de:

- AMA-M2;

- LKM-1.

O pedido médico é específico de algum dos auto-anticorpos que este perfil

identifica;

Se sabe que o doente tem uma patologia hepática.

Auto-Imunidade


Perfil Hepático “Liver Profile”

Antigénios Patologia de Interesse Outras Patologias

Hepáticas Outras Patologias

AMA-M2


Hepatite C Esclerose Sistémica

M2-3E

(sub-unidade da M2 que é o principal

auto-antigénio da CBP; maior

sensibilidade que M2)

gp210 Colangite Esclerosante

Primária LES; S. Sjögren; DMTC

sp100

PML Polimiosite; Colangite

Ro-52 (parte do SS-A) Cirrose Biliar Primária

Hepatite Autoimune I Hepatite Viral Crónica

LES; AR; Esclerose

Sistémica;S. Sjögren;

DMTC; Polimiosite

LKM-1 Hepatite Autoimune II

(crianças, sobretudo)

Hepatite C

LC-1

(“cytosolic liver antigen type 1”)

SLA/LP

(”soluble liver antigen/liver-pancreas

antigen”)

Hepatite Autoimune III

Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas.

3.3.3.3.Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”)

É executado no HCC sempre que:

Por pesquisa anterior em células HEp-2 se identifica um dos seguintes

padrões:

- Padrões nucleolares (possível PM-Scl) (ver Observações e Sugestões 3);

- Padrão nuclear Ku;

- Padrão citoplasmático Jo-1;

- Padrão citoplasmático SRP.

O pedido médico é específico de algum dos auto-anticorpos que este perfil

identifica;

Se sabe que o doente tem uma (poli)miosite.

Auto-Imunidade


Perfil Miosites “Myositis Profile 3”

Antigénios Nucleares Patologia de Interesse Outras patologias

Ro-52 Miosites

LES; AR; DMTC; Esclerose

Sistémica;; S. Sjögren; Cirrose Biliar

Primária; Hepatite Autoimune

Mi-2

Dermatomiosite

PM-Scl 75 “Overlap Syndome” (polimiosite,

dermatomiosite e esclerose sistémica)

Escleroderma com envolvimento

renal PM-Scl100

Ku Polimiosite com Escleroderma LES

Antigénios Citoplasmáticos Patologia de Interesse Outras Patologias

Jo-1 Polimiosite; Dermatomiosite, sobretudo com

doença intersticial pulmonar

SRP Polimiosite; Dermatomiosite (raramente)

PL-7

Miosites PL-12

EJ

OJ

Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas (ver

Observações e Sugestões 4).

Excepto o Ro-52 que pode estar presente numa grande variedade de DAI, todos

os outros antigénios apresentam elevada especificidade para miosites.

3.3.3.4.Perfil Gástrico

É executado no HCC sempre que nos seis tecidos executados para rastreio de auto-

anticorpos citoplasmáticos se desconfia da presença de um APCA.

O teste permite a identificação não só de auto-anticorpos anti-células parietais

(APCA), como de auto-anticorpos anti-factor intrínseco (FI).

Auto-Imunidade


3.4. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Quantitativo, ensaio

em “Sanduíche”

3.4.1. Fundamento

Os ensaios de ELISA quantitativos são feitos exactamente da mesma forma que

os ELISA qualitativos. A única diferença é que, em vez de se utilizar apenas um

calibrador que serve nos ELISA qualitativos como “cut-off”, utilizam-se vários

calibradores de concentração rigorosamente conhecida que são processados em

simultâneo com as amostras. Com os valores de absorvância obtidos para os diferentes

calibradores é, assim, possível traçar-se uma curva de calibração (absorvância vs

concentração). Determinando-se a absorvância de cada uma das amostras analisadas, é

possível por extrapolação gráfica (manual ou automática) determinar-se a sua

concentração rigorosa.

Figura 94 – Exemplo de uma curva de calibração absorvância vs concentração.

Absorvância

Auto-Imunidade


3.4.2. Aplicação

Só para alguns auto-anticorpos é conhecida uma relação directa quantificação /

influência na actividade da patologia. Só para estes auto-anticorpos se justifica utilizar

um ensaio de ELISA quantitativo. Para todos os outros, os ensaios de identificação já

descritos são suficientes.

Justifica-se realizar um ELISA quantitativo só para os auto-anticorpos

seguidamente mencionados:

3.4.2.1.Ac. anti-DNAds

A sua quantificação é importante para o diagnóstico e monitorização de doentes

com LES. A sua presença é indispensável ao diagnóstico da patologia. O seu título está

directamente relacionado com a actividade da doença.

3.4.2.2.Ac. anti-Nucleossoma

A sua quantificação é importante para a monitorização de doentes com LES.

Elevados títulos relacionam-se com elevada actividade da doença e, geralmente, com

envolvimento renal. Por outro lado, 18% dos doentes com LES apresentam este auto-

anticorpo e não apresentam DNAds.

3.4.2.3.Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM

A sua quantificação é importante no diagnóstico do Síndrome Anti-fosfolipídico.

Só elevados títulos destes auto-anticorpos se relacionam com SAF; baixos títulos poder-

se-ão relacionar com infecções e outras DAI, como LES, AR, SS, escleroderma e

miosites.

3.4.2.4.Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA

Auto-Imunidade


Estes auto-anticorpos manifestam-se nas vasculites, como no Granulomatose de

Wegener e, por vezes, na Poliangite Microscópica e Poliartrite Nodosa. A sua

quantificação é indispensável na Granulomatose de Wegener. Uma persistência de

cANCA positivo ou um aumento deverá influenciar a terapêutica.

3.4.2.5.Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA

Estes auto-anticorpos manifestam-se em algumas vasculites como na Poliangite

Microscópica e Síndrome Churg-Strauss; por vezes também estão presentes na

Granulomatose de Weneger e Poliartrite Nodosa (ver Observações e Sugestões 5).

3.4.2.6.Ac. anti-CCP

Os auto-anticorpos anti-CCP (“Cyclic Citrullinated Peptides”) são dirigidos contra

péptidos citrulinados cíclicos, para os quais a arginina é substituída pela citrulina. Estão

associados a doentes com AR, apresentando uma sensibilidade de cerca de 78% e uma

especificidade de 98%. Podem aparecer no soro muitos anos antes da instalação da

doença. A sua quantificação é importante para monitorização da doença.

A sua importância enquanto marcadores serológicos é muito maior que o outro

marcador de AR, o Factor Reumatóide (FR), uma vez que as suas sensibilidades para a

patologia são semelhantes, enquanto que a especificidade do anti-CCP é muito mais

elevada, uma vez que o FR está presente em muitas outras situações.

3.4.3. Outros Ensaios Executados

Para além dos auto-anticorpos cuja quantificação tem interesse clínico, o HCC

quantifica outros auto-anticorpos (ver Observações e Sugestões 6).

3.4.3.1.Ac. anti-ICC e anti-C1q

Auto-Imunidade


Sempre que existem ICC (Imuno-Complexos Circulantes), isto é, um antigénio

ligado ao anticorpo complementar em circulação, a fracção C1q do complemento tem a

capacidade de se ligar ao ICC, activando a via comum do complemento. Os ICC não

são específicos de nenhuma patologia, podendo estar presentes em caso de LES, mas

também em caso de doenças reumáticas e outras DAI, doenças infecciosas, alergias ou

neoplasias hematológicas, uma vez que são formados sempre que o sistema imunitário é

activado. Contudo, os auto-anticorpos anti-C1q são específicos de LES.

O presente kit utilizado pelo HCC utiliza como antigénio ligado à placa de ELISA

C1q, detectando em simultâneo ICCs e Ac. anti-C1q. Não apresenta, portanto, grande

valor clínico uma vez que não é específico de LES.

Contudo, existe já no mercado um kit que apenas detecta Ac. anti-C1q, específicos

de LES, sendo este muito mais útil do ponto de vista clínico. Um objectivo futuro do

HCC passa por substituir o kit ICC/C1q pelo kit C1q.

3.4.3.2.Ac. anti-GBM

Os auto-anticorpos anti-GBM (“Glomerular Basement Membrane”) são dirigidos

contra o colagénio tipo IV da membrana basal glomerular renal. Estão associados a

qualquer tipo de glomerulonefrite, incluindo o Síndrome de Goodpasture.

3.4.3.3.Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA)

Os anticorpos anti-endomísio (EMA) são, sem dúvida os anticorpos que apresentam

maior sensibilidade e especificidade para a Doença Celíaca, na ordem dos 99%.

Contudo, a sua análise é feita por IFA, o que implica experiência na técnica.

Os anticorpos anti-Tg são um tipo de EMA, podendo, no entanto, ser determinados

por ELISA (IgA e IgG). A sua sensibilidade (90 a 99%) e especificidade (85 a 99%)

são, contudo, um pouco mais baixas. Ainda assim, são essenciais no diagnóstico da

Doença Celíaca.

Auto-Imunidade


Os anticorpos anti-gliadina IgA e IgG foram os primeiros (dos três referidos) a

surgir no mercado. Apresentam menor sensibilidade (90%) e especificidade (85 a 88%)

que os anti-Tg. Contudo, são ainda úteis no diagnóstico desta patologia uma vez que

crianças com menos de dois anos frequentemente não apresentam EMA nem anti-tTg.

São ainda importantes na monitorização da progressão da patologia e na sua relação

com a dieta instituída.

No HCC sempre que o pedido médico inclui EMA, anti-Tg e anti-Gliadina, caso os

anti-Tg IgA já tenham sido feitos e se derem positivo, já não se pesquisam os EMA por

IFA, dando-se o resultado como positivo ao clínico (ver Observações e Sugestões 7).

3.4.3.4.Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180

A desmogleina 1 e 3 são caderinas expressas no epitélio escamoso estratificado. A

desmogleina 1 é o antigénio contra o qual anticorpos são dirigidos no pênfigo foliáceo,

embora também se detecte em 60% dos casos de pênfigo vulgaris. A desmogleina 3 é o

antigénio contra o qual os anticorpos são dirigidos no pênfigo vulgaris, não se

encontrando em doentes com pênfigo foliáceo.

No pênfigo bulhoso verifica-se a produção de auto-anticorpos contra a base da

lesão na pele, como os auto-anticorpo BP 180.

Auto-Imunidade


4. O Futuro…

Actualmente, uma vez iniciada a resposta autoimune, a única maneira disponível de

a atenuar/bloquear é por imunossupressão inespecífica.

O objectivo no futuro passa por realizar individualmente para cada doente estudos

proteómicos que permitam:

- Detectar um perfil de auto-anticorpos que representem a “impressão digital” do

doente autoimune, o que pode ser útil para classificar doentes em diferentes sub-

populações com diferentes prognósticos;

- Monitorizar o “antigen spreading” que pode conduzir a DAI progressiva e mais

severa, a fim de se melhorar o conhecimento sobre o prognóstico do doente;

- Determinar a especificidade da resposta do auto-anticorpo, o que poderá conduzir

ao aparecimento de terapêuticas específicas para um determinado antigénio;

- Em última instância, identificar um componente celular ou sérico só por si com

potencial para conduzir ao aparecimento posterior de um auto-anticorpo importante para

o diagnóstico de uma DAI, a fim de se ser capaz de evitar (talvez por vacinação) que a

resposta autoimune para um dado antigénio ocorra.

No futuro, pertende-se que aumente o nosso conhecimento sobre a predisposição

genética, sobre biomarcadores precoces que identifiquem indivíduos e populações em

risco e sobre os mecanismos gerais que regulam a resposta imunológica. O verdadeiro

sucesso no tratamento das DAI só virá com estes conhecimentos acrescidos, pois só eles

permitirão que, com uma intervenção precoce, se possa estabelecer a homeostase

imunológica antes que ocorra a destruição tecidular irreversível.

Muito ainda há por saber e fazer…

Auto-Imunidade


5. Observações e Sugestões

1. Os testes de ELISA para DNAds são mais sensíveis e menos específicos que as

células de Crithidia luciliae por IFA para pesquisa do DNAds. Assim, a estagiária

considera que fazer um teste de ANA Screen após um resultado positivo para DNAds

em células Crithidia luciliae revela-se desnecessário. O posterior teste de ELISA

quantitativo é, obviamente, importante.

2. Sempre que um padrão por IFA dá 1:320 / 1:640 / > 1:640 homogéneo ou 1:640 /

> 1:640 fino granular, independentemente do teste de ANA Screen dar positivo ou

negativo, é feito sempre a seguir um Immunoblotting para a amostra. Assim, a

estagiária sugere que nos referidos casos não se realize o teste de ANA Screen e se

passe de imediato ao teste de Immunoblotting adequado à situação.

3. O único auto-anticorpo associado a miosites com padrão nucleolar (nucleolar

homogéneo) é o PM-Scl. Uma vez que este antigénio, embora não esteje incluído no

poll de antigénios do ANA Screen, está incluído no ANA Profile, a estagiária considera

que sempre que se tem um padrão nucleolar poderá optar-se por se fazer ou o ANA

Profile ou o Liver Profile, não sendo necessário realizar os dois ensaios.

4. Uma vez que o antigénio Mi-2 poderá estar associados a miosites e os testes ANA

Screen e ANA Profile não o pesquisam, sempre que o padrão obtido por IFA é fino

granular e os testes ANA Screen e ANA Profile dão ambos negativos poder-se-ia fazer

um Myosite Profile para despiste de um eventual Mi-2.

5. Os ANCAs (anticorpos dirigidos contra os grânulos citoplasmáticos dos

neutrófilos) são clinicamente importantes na assistência a doentes com desordens

vasculares. Existem lâminas no mercado para a sua pesquisa por IFA.

Em lâminas fixas com etanol, os cANCAs (anticorpos anti-citoplasmáticos dos

neutrófilos: Proteinase 3) conferem fluorescência ao citoplasma dos neutrófilos,

enquanto que os pANCAs (anticorpos anti-perinucleares dos neutrófilos:

mieloperoxidase, lactoferrina, elastase, catepsina, lisozima e β-glucuronidase) conferem

fluorescência em torno do núcleo dos neutrófilos.

Auto-Imunidade


Figura 95 – ANCAs. À esquerda cANCA. À direita pANCA.

Alguns padrões de ANA (homogéneo nuclear; membranar nuclear) podem, no

entanto, também conferir o mesmo padrão perinuclear, podendo assim confundir-se um

ANA com um pANCA. Assim, sempre que os neutrófilos apresentam fluorescência

perinuclear em lâminas fixas com etanol testa-se a mesma amostra numa lâmina fixa

com formol. O formol irá fazer com que os pANCA se passem a observar-se como

cANCA, com o padrão citoplasmático dos neutrófilos; pelo contrário, o formol não irá

surtir nenhum efeito nalguns ANA (o padrão pANCA mantém-se) e irá destruir outros

ANAs (deixa de se visualizar fluorescência). Assim, só se o padrão perinuclear passar a

padrão citoplasmático na lâmina fixa com formol é que se considera que o doente tem

um pANCA.

A pesquisa de ANCAs por IFA não permite a sua quantificação nem a identificação

da MPO como sendo o pANCA eventualmente presente. Contudo, tratando-se de um

método mais sensível e barato que um teste de ELISA quantitativo, permite um rastreio

inicial, possibilitando que depois só as amostras positivas por IFA sejam quantificadas

por ELISA.

6. Os mesmos kits que são utilizados como ELISA Quantitativos podem ser

utilizados como ELISA Qualitativos, bastando para isso utilizar-se no ensaio apenas um

calibrador (o calibrador recomendado pelo fornecedor), em vez de se utilizarem todos

os calibradores necessários para se traçar a curva de calibração. No caso dos auto-

anticorpos cuja quantificação não tem interesse clínico (ICC, CCP, GBM, Gliadina e

Auto-Imunidade


Transglutaminase), a estagiária sugeriria a utilização de apenas o calibrador necessário a

um ELISA Qualitativo.

7. A especificidade dos anti-Tg IgA por ELISA (85 a 99%) é mais baixa que a

especificidade dos EMA por IFA (99%). Assim, é possível obter-se um resultado

positivo para anti-Tg IgA que não seja positivo para EMA.

Auto-Imunidade


Bibliografia

1. Bain Barbara J., Blood Cells - A Practical Guide, fourth edition, Blackwell, 2006

2. Bain Barbara J., Leukaemia Diagnosis, third edition, Blackwell, 2003

3. Bradwell A. R., Hughes R. G., Atlas of HEp-2 Patterns, third edition, The Binding

Site, 2007

4. Bradwell A. R., Stokes R. P., Johnson G. D., Atlas of Autoantibody Patterns on

Tissues, second edition, The Binding Site, 2004

5. Bruce Alberts, Johnson Alexander, Lewis Julian, Raff Martin, Roberts Keith, Walter

Peter, Molecular Biology of The Cell, fifth edition, Garland Science, 2008

6. D. E. Rooney, B. H. Czepulkowski, Human Cytogenetics – A Practical Approach,

volume I, Elsevier, 1992

7. Dieusaert P., Como Prescrever um Exame Laboratorial – Guia Prático de Análises

Médicas, segunda edição, Andrei, 2001

8. Gillespie, Stephen H., Hawkey, Peter M, Principles and Practice of Clinical

Bacteriology, second edition, Wiley, 2006

9. Hagemann P., Kimling H., Zawta B., Fundamental of Laboratory Testing – Urine,

Roche Diagnostics, 2003

10. http://atlasgeneticsoncology.org.

11. http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman.

12. Murray, Patrick R., Medical Microbiology, fifth edition, Elsevier Mosby, 2005

13. Oliveira J., Exames Laboratoriais para o Clínico, segunda edição, Medsi, 2003

14. Parslow T.G., Stites D.P., Terr A.I., Imboden J.B., Imunologia Médica, décima

edição, Guanabara Koogan, 2001

15. Rautenstraub B., Liehr T., FISH Technology, Spinger Lab Manual, 2002

http://atlasgeneticsoncology.org/

http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman

Auto-Imunidade


16. Shaffer Lisa G., Tommerup Niels, An International System for Human Cytogenetic

Nomenclatura - Cytogenetic and Genome Research, ISCN, 2005

17. Shoenfeld Y., Cervera R., Gershwin M.E., Diagnostic Criteria in Autoimmune

Diseases, Humana Press, 2005

18. Steven H. Swerdlow, Elias Campo; WHO Classification of Tumours of

Haematopoietic and Lymphoid Tissues, International Agency for Research on Cancer,

2008

19. Sverre Heim, Felix Mitelman; Wiley-Liss, Cancer Cytogenetics – Chromosomal and

Molecular Genetic Aberrations of Tumor Cells, Elsevier, 1995

20. www.ii.bham.ac.uk

http://www.ii.bham.ac.uk/


Agradecimentos

A todos os trabalhadores do Laboratório Reymão Pinto, aos

trabalhadores dos diferentes Laboratórios do IPO Porto e aos trabalhadores

do Laboratório de Imunologia do Serviço de Nefrologia do Hospital Curry

Cabral, o meu obrigado pelo tempo dispensado e pelos conhecimentos

transmitidos.

Agradeço também a todos os professores do Mestrado de Análises

Clínicas da Faculdade de Farmácia de Lisboa, sem os quais não teria tido a

hipótese de realizar este estágio, que em muito contribuío para a minha

formação académica.


Anexo 1

Grupo da Neoplasia

Alteração molecular e

citogenética

Função gene

Efeito da Alteração

Genética

Prognóstico

SMP

PV

Mutação pontual

V617F no gene JAK2 (troca de uma Valina

por uma Fenilalanina

na posição 617) na stem cell, estando

presente em todas as

células mielóides.

A proteína JAK2

cinase está

intracelularmente ligada ao receptor da

EPO e TPO. Quando a

EPO ou TPO se ligam aos seus receptores a

proteína JAK2 é

fosforilada, conduzindo à

transcrição nuclear e

consequente proliferação celular.

Ganho de função de

proto-oncogene;

vantagem

proliferativa: Na presença da

mutação V617F a

proteína JAK2 cinase é hiper-activada

(hipersensibilidade das

células à EPO e TPO), conduzindo à

proliferação celular

descontrolada. O rácio

JAK2V617F/JAK2

wild-type determina o fenótipo de SMP (PV,

MFP ou TE).

Sobrevida média > 10

anos.

MFP Sobrevida média de 3 a

7 anos.

TE Sobrevida média de 10

a 15 anos (~ à da

população geral).

LMC

Translocação entre o

gene ABL do cromossoma 9 em 9q34

e o gene BCR do

cromossoma 22 em 22q11.2 –

ABL-BCR;

t(9;22)(q34;q11.2). Resulta no cromossoma

de Philadelphia 22 -

der(22q)

O gene BCR tem função desconhecida.

O gene ABL conduz à

transcrição de uma proteína cinase que:

- induz a proliferação

celular; - exibe actividade anti-

apoptótica.


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa e

alteração da apoptose:

A fusão do gene ABL

com o gene BCR conduz à formação de

uma proteína quimérica

p210, que aumenta a actividade da tirosina

cinase, induzindo:

- Aumento da proliferação celular;

- Bloqueio da apoptose.

Bom prognóstico.

LMAs*


gene ETO do cromossoma 8 em 8q22

e do gene AML1 do

cromossoma 21 em 21q22 –

ETO-AML1;

t(8;21)(q22;q22) O gene AML1, CBFβ e

RARα conduzem cada um deles à síntese de

uma proteína que, ao

se ligar a factores de trancrição leva à

trancrição de genes

importantes para a diferenciação

mielóide.


proto-oncogene;

bloqueio da

diferenciação:

A fusão ETO-AML1,

CBFβ-MYH11 ou PML-RARα conduz à

formação de uma

proteína quimérica que atrai co-repressores da

transcrição (Sin3A,

NCoR e HD), impedindo assim a

transcrição de genes

importantes para a diferenciação mielóide.

Bom prognóstico.

Translocação ou

inversão entre o gene

CBFβ do cromossoma 16 em 16p13.1 e do

gene MYH11 do

cromossoma 16 em 16q22 –

CBFβ-MYH11; inv(16)

(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1 ;q22)


gene PML do cromossoma 15 em

15q22 e do gene RARA

do cromossoma 17 em

17q12 –

PML-RARα ;

t(15 ;17)(q22 ;q12)

LLAs B

Translocação entre o gene ABL do

cromossoma 9 em 9q34

e o gene BCR do cromossoma 22 em

22q11.2 –

ABL-BCR; t(9;22)(q34;q11.2).

Resulta no cromossoma

O gene BCR tem função desconhecida.

O gene ABL do

cromossoma 9 conduz à síntese de uma

proteína cinase que:

- induz a proliferação celular;

- exibe actividade anti-


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa e

alteração da apoptose:

A fusão do gene ABL

com o gene BCR conduz à formação de

uma proteína quimérica

Mau prognóstico.


de Philadelphia 22 - der(22q)

apoptótica. p190 ou p210, que aumenta a actividade da

tirosina cinase,

induzindo:

- aumento da

proliferação celular;

- bloqueio da apoptose.

Translocação entre o gene AF4 do


e o gene MLL do cromossoma 11 em

11q23 –

AF4-MLL; t(4;11)(q21;q23)

O gene AF4 conduz à

síntese de uma proteína que activa a

transcrição genética.

O gene MLL conduz à síntese de uma

proteína que regula a

transcrição genética.


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa:

Na presença de

translocação do gene MLL com outro gene, a

proteína é hiper-

activada, conduzindo à transcrição nuclear e

consequente

proliferação celular descontroladas.

Mau prognóstico.


gene TEL do

cromossoma 12 em 12p13 e o gene AML1

do cromossoma 21 em 21q22 –

TEL-AML1;

t(12;21)(p13;q22)

O gene AML1 conduz

à síntese de uma

proteína que, ao se ligar a factores de

transcrição, leva à transcrição de genes

importantes para a

série linfóide.


proto-oncogene;

bloqueio da

diferenciação:

A fusão TEL-AML1

conduz à formação de uma proteína quimérica

que atrai co-repressores da transcrição (Sin3A,

NCoR e HD),

impedindo assim a transcrição de genes

importantes para a

diferenciação linfóide.

Bom prognóstico.


gene E2A do cromossoma 1 em 1q23

e o gene PBX1 do

cromossoma 19 em 19p13.3 –

E2A-PBX1;

t(1;19)(q23;p13.3)

Os genes E2A e PBX1 conduzem cada um à

síntese de uma

proteína que, ao se ligar a factores de

transcrição, leva à

transcrição de genes importantes para a

série linfóide.


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa: A fusão E2A-PBX1

conduz à formação de

uma proteína quimérica que:

- Activa o processo de

transcrição nuclear; - Interfere no normal

funcionamento dos

factores de transcrição codificados pelos genes

E2A e PBX1.

Prognóstico Intermédio (antigamente associada

a mau prognóstico).

T

Delecção no

cromossoma 1 em

1p32, que origina o gene de fusão SIL-

TAL1.

O gene TAL1 conduz à formação de factores

de transcrição

importantes na diferenciação e

proliferação de células

da série linfóide.


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa: A fusão SIL-TAL

conduz à formação de

uma proteína quimérica que leva à expressão

aberrante do gene

TAL1, o que se traduz na alteração da

diferenciação e

proliferação linfóides.

Mau prognóstico.

Linfoma B

MM


gene MMSET do

cromossoma 4 em

4p16.3 e o gene IgH do cromossoma 14 em

14q32 –

MMSET-IgH; t(4;14)(p16.3;q32)

O gene IgH é

responsável pela

síntese constitutiva da

IgH – cadeias pesadas

das Imunoglobulinas

nos linfócitos B. O gene MMSET é

expresso de forma

indutiva, induzindo a proliferação e

sobrevivência

celulares.


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa:

A translocação faz com que o gene MMSET

passe a ser controlado

pelo promotor da IgH, passando a ser expresso

constitutivamente.

Sobrevida média ~ à da população geral.


L.

Foli

cu

lar


gene IgH do

cromossoma 14 em

14q32 e o gene Bcl2 do

cromossoma 18 em

18q21 – IgH-Bcl2;

t(14;18)(q32;q21)

O gene IgH é responsável pela

síntese constitutiva da


das Imunoglobulinas

nos linfócitos B.

O gene Bcl2 é responsável pela

síntese da proteína

anti-apoptótica Bcl2.

Bloqueio da apoptose: A translocação faz com

que o gene Bcl2 passe a

ser controlado pelo promotor da IgH,

passando a ser expresso

constitutivamente.

Trata-se de um linfoma

de baixo grau. Prognóstico variável.

L.

Ma

nto


gene Bcl1 (Ciclina D1)

do cromossoma 11 em 11q13 e o gene IgH do

cromossoma 14 em

14q32 – Bcl1-IgH;

t(11;14)(q13;q32)

O gene IgH é

responsável pela

síntese constitutiva da IgH – cadeias pesadas

das Imunoglobulinas

nos linfócitos B. O gene Bcl1 (Ciclina

D1) é responsável pela

entrada da célula em fase S do Ciclo

Celular.

Alteração do Ciclo

Celular: A translocação faz com

que o gene Bcl1 passe a ser controlado pelo

promotor da IgH,

passando a ser expresso constitutivamente. Há

desregulação do Ciclo

Celular.

Trata-se de um linfoma de baixo grau.

Sobrevida média de 3 a

5 anos.

L. B

url

itt


gene MYC do


e do gene IgH do cromossoma 14 em

14q32 –

MYC-IgH; t(8;14)(q24;q32)

O gene IgH é

responsável pela síntese constitutiva da


das Imunoglobulinas nos linfócitos B.

O gene MYC é expresso de forma

indutiva levando à

síntese de factores de transcrição.


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa:

A translocação faz com que o gene MYC passe

a ser controlado pelo

promotor da IgH, passando a ser expresso

constitutivamente.

Trata-se de um linfoma

de alto grau.

Bom prognóstico

quando detectado precocemente.

Mau prognóstico

quando detectado em fase avançada.

T

Translocação entre o gene ALK do

cromossoma 2 em 2p23

e do gene NPM1 do cromossoma 5 em 5q35

– ALK-NPM1; t(2;5)

(translocação típica de L. Anaplásico T)

O gene ALK codifica

uma proteína cinase pertencente a um

receptor de insulina,

sendo geralmente silenciado nos

linfócitos.

O gene NPM1 modula supressores tumorais

no núcleo e controla a

duplicação dos centrossomas durante

o ciclo celular .


proto-oncogene;

vantagem

proliferativa:

A fusão ALK-NPM1

conduz à formação de uma proteína

quimérica. A proteína

NPM1, uma vez fundida com a proteína

ALK, mimetiza o

ligando da ALK, activando-a /

sobrerregulando-a. A

ALK activada nos linfócitos exibe

propriedades

oncogénicas. A fusão da NPM1 com

outras proteínas resulta também na activação

do potencial

oncogénico dos parceiros de fusão.

Mau prognóstico.

Sobrevida média de 5

anos ou menos.

Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no Laboratório de

Genética Molecular do IPO Porto. (SMP = Síndomes Mieloproliferativos. PV = Policitémia Vera. MFP = Mielofibrose

Primária. TE = Trombocitémia Essencial. EPO = Eritropoietina. TPO = Trombopoietina. LMC = Leucemia Mielóide Crónica. LMA

= Leucemia Mielóide Aguda. LLA= Leucemia Linfoblástica Aguda.)

* Para além das translocações e inversões primárias que caracterizam as LMAs, também podem associadamente ocorrer mutações

pontuais secundárias à patologia, como mutações no gene FLT3. Estas mutações conferem mau prognóstico nas LMAs.


Anexo 2

Neoplasia Suspeita Pesquisa Material Genético

Utilizado Técnica Molecular

Revelação do

Material Genético

Síndrome

Mieloproliferativo

(PV; MFP; TE)

- mutação pontual

V617F no gene JAK2 DNA

- (só) Diagnóstico:

ASO-PCR

Electroforese em gel de

agarose 2%

LMC

- BCR-ABL1; t(9;22)

(transcrito b2a2 ou

b3a2; proteína p210)

RNA

- Diagnóstico: RT-

PCR e PCR Tempo Real

- Follow-up: Nested

PCR e PCR Tempo Real

- RT-PCR e Nested

PCR: Electroforese em gel de agarose 2%

- PCR Tempo Real:

FRET com sonda TaqMan

- mutações pontuais no

gene ABL RNA

Sequenciação

Automática Electroforese capilar

LMA

- ETO-AML1; t(8;21) - CBFB-MYH11;

inv(16) ou t(16;16)

- PML-RARA ; t(15 ;17)

RNA

- Diagnóstico: RT-PCR e PCR Tempo

Real

- Follow-up: 1º Nested PCR

2º (só se Nested der

positivo) PCR Tempo Real

- RT-PCR e Nested

PCR: Electroforese em

gel de agarose 2% - PCR Tempo Real:

FRET com sonda

TaqMan

- mutações ITD e mutação pontual D835

no gene FLT3

DNA - (só)Diagnóstico: PCR

Single / Restrição

Enzimática (RFLPs)

Electroforese capilar

LLA

B

- BCR-ABL1; t(9;22)

(transcrito b2a2 ou b3a2; proteína p210;

transcrito e1a2;

proteína p190) - AF4-MLL; t(4;11)

- TEL-AML1; t(12;21)

- E2A-PBX1; t(1;19) RNA

- Diagnóstico: RT-PCR e PCR Tempo

Real

- Follow-up: 1º Nested PCR

2º (só se Nested der

positivo) PCR Tempo Real

NOTA: para SIL-TAL1

não se faz PCR Tempo Real

- RT-PCR e Nested

PCR: Electroforese em

gel de agarose 2%

- PCR Tempo Real:

FRET com sonda

TaqMan

T - SIL-TAL1; del1p32

Linfoma

B

- Suspeita MM:

MMSET-IgH; t(4;14)

- Suspeita L. Folicular: IgH-Bcl2; t(14;18)

- Suspeita L. Manto:

Bcl1-IgH; t(11;14) - Suspeita L. Burkitt:

MYC-IgH; t(8;14)

DNA PCR Single

(MYC-IgH: PCR-LD) Electroforese em gel de

agarose 2%

T - NPM1-ALK; t(2;5) RNA - RT-PCR

Tabela 19 – Estudos moleculares realizados no Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto.


Anexo 3

Selecção de agentes anti-microbianos feita para os diferentes microorganismos

na secção de Microbiologia do Laboratório Reymão Pinto:

ENTEROBACTERIACEAE

Produto 1ª Linha 2ª Linha

Urina

Ampicilina

Amoxicilina+Ác.Clavulânico

Cotrimoxazol;

Nitrofurantoina

Ácido Nalidíxico

Cefalotina

Cefoxitina ou Cefuroxime; Gentamicina

Amicacina

Norfloxacina

Pus, Expectoração e Hemoculturas

Ampicilina

Amoxicilina + Ác.Clavulânico

Carbenicilina

Cotrimoxazol;

Cefalotina;

Cefoxitina ou Cefuroxime;

Ceftazidima;

Gentamicina;

Amicacina;

Imipenem

Ofloxacina

Aztreonam

Piperacilina

Ceftriaxona

Abcesso Cerebral Cloranfenicol

Cefalotina;

Coproculturas

Ampicilina


Cotrimoxazol;

Ofloxacina;

Salmonella typhi

Cloranfenicol;

Ampicilina;

Amoxicilina+Ác.Clavulânico

Cotrimoxazol;

Ofloxacina;

Liquor

Ampicilina

Gentamicina;

Amicacina;

Cloranfenicol;

Cotrimoxazol;

Ceftriaxona;

Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae.


PSEUDOMONAS SPP. e ACINETOBACTER SPP.:

1ª Linha 2ª Linha

Carbenicilina;

Gentamicina;

Amicacina;

Ceftazidima

Imipenem

Piperacilina

Norfloxacina

Aztreonam

Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.

HAEMOPHILUS SPP


Pus, Expectoração

Ampicilina;


Eritromicina;

Cloranfenicol;

Tetraciclina;

Cotrimoxazol;

Ofloxacina

Ceftriaxona;

Hemoculturas e Liquor Ampicilina

Cloranfenicol;

Ceftriaxona;

Ofloxacina

Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp.

NEISSERIACEAE

Microorganismo 1ª Linha 2ª Linha

Meningococcus

Penicilina;

Cloranfenicol;

Sulfadiazina

Gonococcus

Penicilina (ß-Lactamase neg.)

Tetraciclina

Espectinomicina

Cefalotina;

Eritromicina;

Cefoxitina ou Cefuroxime;

Ceftriaxona;

Ofloxacina

Moraxella catarrhalis Antibioticos idênticos aos usados p/ Haemophilus sp

Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae.


STAPHYLOCOCCUS SPP


Pus, Expectoração e Hemoculturas

Penicilina

Cefalotina;

Oxacilina

Eritromicina;

Tetraciclina

Gentamicina;

Amicacina;

Ofloxacina;

Vancomicina;

Rifampicina

Abcesso Cerebral

Penicilina

Cefalotina;

Ácido fusídico

Oxacilina

Exsudado Nasal

Penicilina

Eritromicina;

Oxacilina

Urina

Penicilina

Nitrofurantoina;

Cotrimoxazol;

Sulfafurazol;

Norfloxacina

Amoxicilina+Ác. Clavulânico Vancomicina

Novobiocina (S. saprophyticus são resistentes)

Oxacilina

Liquor

Penicilina

Cloranfenicol;

Gentamicina;

Amicacina;

Oxacilina

Cotrimoxazol;

Rifampicina;

Vancomicina

Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp.

LISTERIA MONOCITOGENES

1ª Linha

Ampicilina

Gentamicina

Cotrimoxazol

Ofloxacina

Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes.


STREPTOCOCCUS SPP

Microorganismo Produto 1ª Linha 2ª Linha

S. viridans Penicilina

Gentamicina Vancomicina

S. pneumoniae

Expectoração e

Exsudados

Oxacilina

Eritromicina

Tetraciclina

Hemoculturas e Liquor Oxacilina

Cloranfenicol Ceftriaxona; Vancomicina

Enterococcus

Pús

Ampicilina


Cotrimoxazol; Estreptomicina

Gentamicina

Urina

Ampicilina

Amoxicilina+ Ác.Clavulânico

Cotrimoxazol; Nitrofurantoina;

Norfloxacina;

Hemoculturas e Liquor

Ampicilina

Gentamicina;

Vancomicina;

Estreptomicina

Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp.

CORYNEBACTERIUM SPP

1ª Linha

Tetraciclina

Eritromicina

Cefuroxime;

Gentamicina;

Amicacina;

Ceftazidima;

Ceftriaxona;

Ofloxacina;

Vancomicina;

Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp.


EXSUDADOS OCULARES (conjuntivais):

Microorganismos 1ª Linha

S. pneumoniae; S. aureus; H. influenzae; H.

aegiptius

Cloranfenicol

Tetraciclina

Enterobacteriaceae

Cloranfenicol

Tetraciclina

Colistina

Gentamicina

Pseudomonas sp Colistina

Gentamicina

Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares.

Documents

RELATORIO DE ESTÁGIO - ULisboarepositorio.ul.pt/jspui/bitstream/10451/15304/1/Relatorio_Final_MAC... · INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO GENTIL, ENTIDADE