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[ ] Bioquímica I
Índice
1. Objectivo......................................................................................................................................... 3
2. Introdução...................................................................................................................................... 3
3. Material e Reagentes....................................................................................................................... 5
3.1. Reagentes..............................................................................................................................................5
3.2. Material................................................................................................................................................6
4. Procedimento Experimental........................................................................................................... 6
4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido............................................................................6
4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato....................................7
5. Apresentação e tratamento de resultados.......................................................................................8
5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido...........................................................................8
5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima (μmol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten)........................................................................................10
5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax...................................15
6. Discussão /Conclusão.................................................................................................................... 17
7. Bibliografia................................................................................................................................... 19
8. Anexos........................................................................................................................................... 21
8.1. Anexo 1- Segurança e riscos...............................................................................................................21
8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk...........................................................................22
8.3. Anexo 3- Preparação de soluções.......................................................................................................23
2
[ ] Bioquímica I
1. Objectivo
O objectivo da actividade experimental é estudar a cinética enzimática invertase num
substrato de sacarose, ou seja, determinar o valor da velocidade máxima e a respectiva
afinidade enzimática para o substrato.
2. Introdução
Com o desenvolvimento da bioquímica fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres vivos,
existiam substâncias capazes de catalisar de modo muito específico determinadas reacções
químicas.3 Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo em baixas concentrações
aumenta a velocidade da reacção.4 As enzimas diminuírem a energia de activação, mas não
afectam o equilíbrio da reacção.4
A invertase (β-fructofuranosidade) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose em
“açúcar convertido”, isto é, nos seus dois monómeros constituintes: glicose e frutose
(figura 1). 2,5 O seu substrato preferencial é a sacarose porém, também, pode hidrolisar
ramonose e estaquiose.7
A
invertase encontra-se presente nos animais, mas também em plantas superiores, fungos e
bactérias.5 É possível obter o extracto não purificado da enzima, destruindo as células de
fermento por autólise e removendo os detritos celulares por centrifugação, após a qual a
invertase ficará no líquido sobrenadante.5 Existem actualmente várias aplicações desta
enzima, principalmente na indústria alimentar, onde a enzima usada tem origem na
levedura.2
A cinética enzimática estuda a acção das enzimas, a sua actividade catalítica e seu estudo
é feito in vitro.3 Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima, preparações
que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto, quanto mais purificada
estiver a preparação enzimática mais fácil será o seu estudo cinético.3
O mecanismo mais simples para explicar a acção enzimática é o modelo de Michaelis-Menten:
Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um complexo enzima-
substrato (E-S). A quantidade de produto (P) formada, assim como a velocidade da reacção
vão depender directamente da concentração em complexo E-S, isto é, da concentração de
enzima que se liga ao substrato.4,8
3
Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose são açúcares redutores.
Gráfico 1. Variação da velocidade de reacção em função da concentração de substrato
Gráfico 2. Gráfico de Lineweaver-Burk.
[ ] Bioquímica I
O modelo de Michaelis-Menten parte da hipótese que o passo limitante da velocidade é a
quebra do complexo E-S para formar o produto e a enzima livre.9
(1)
A representação gráfica da velocidade da reacção em função da concentração de substrato
(gráfico 1) é uma hipérbole. A assímptota horizontal corresponde à Vmáx. O valor de Km
também pode ser obtido através do gráfico, uma vez que quando a [S]= Km , a equação de
Michaelis-Menten prevê que velocidade de reacção é
metade de Vmáx.4,8
Km é uma medida de afinidade da enzima para o substrato
e essa afinidade é igual a 1/ Km.4,8 Para um Km elevado,
existe uma baixa afinidade (é necessária uma elevada [S]
para se atingir a V igual na 1/2Vmáx, para um Km baixo
existe uma elevada afinidade.4,8
O gráfico de velocidade vs [S] mostrado anteriormente não é linear, pelo que se torna
difícil estimar os valores de Km e Vmáx , sendo assim necessário desenvolver métodos de
linearização da equação de Michaelis-Menten. . Podemos transformar a equação de
Michaelis-Menten, invertendo-a:
O gráfico de Lineweaver-Burk (gráfico 2) é a forma mais comum, e simples, de mostrar
os dados cinéticos, apesar de não ser o mais fiável.
Como se pode observar pelo gráfico 2, não se podem tomar valores negativos para 1/[S], sendo o mínimo valor possível é 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de substrato, e daí 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intersecção entre a recta e o eixo x é uma extrapolação de dados experimentais. Assim sendo, os gráficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a estimativas não muito exactas de Vmax e de Km.10
3. Material e Reagentes
3.1. Reagentes
4
(2)
[ ] Bioquímica I
Tabela 1- Características gerais dos reagentes utilizados
ReagentesFórmulaQuímica
MassaMolar(g/mol)
Grau de Pureza (%)
Densidade(g/cm3)
Riscos e Segurança1
Solução aquosa de invertase
diluída 1:400
Hidrogeno-carbonato de
sódioNaHCO3 84,01 99,5 2,159 -
Ácido 3,5-dinitrosalicílic
o (DNS)
Hidróxido de Sódio
NaOH 39,997 98,6 2,13 CorrosivoR: 35
S: 2-26-37/39
Ácido 3,5- dinitrosalicílico
(DNS)
C7H4N2O7
228,12 99 - NocivoR: 22
S: 22-24/25
Tartarato de sódio e potássio
tetrahidratado
C4H4KNaO6.4H2O
282,23 99-102 - -
Tampão acetato
Acetato de sódioCH3COO
Na82,03 99 1,52
IrritanteCorrosivo
R: 36/37/38S: 16-29/56
Ácido Clorídrico(37%)
HCl 36,46 37 1,19 CorrosivoR: 34-37S: 26-45
Solução de sacarose
SacaroseC12H22O
11342, 30 - 1,587 -
Solução equimolar de
glucose/frutose
Frutose C6H12O6 180,16 - 1,54 -
Glucose C6H12O6. 180,16 99,5 -
Água Destilada - H20 18,02 - 1 -
3.2. Material
Tubos de ensaio Suporte para tubos de ensaio Micropipetas Pipetas graduadas
Pipetador Vórtex Banho com água 100°C Banho com água fria
1 Anexo 1
5
[ ] Bioquímica I
Espectrofotómetro Cronómetro
Placa de aquecimento Pompete
4. Procedimento Experimental
4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido
Para a construção da recta de calibração preparar 5 tubos de ensaio de acordo com a tabela
1.
Tabela 2- Preparação de soluções
Vsol (mL)Tubo1
(branco)Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
Gluc/frut
0,0025M0,00 0,10 0,40 0,70
1,00
H2O dest. 2,00 1,90 1,60 1,30 1,00
Tampão
acetato1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Sacarose
0,25M1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
DNS 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Agitar no vórtex.
Aquecer os tubos num banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos.
Arrefecer num banho com água fria.
Adicionar 4mL de água destilada a cada tubo e agitar no vórtex.
Vsol (mL) Tubo1
(branco)
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
H2O dest. 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Ler absorvância a 540 nm (Calibrar com tubo 1).
4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato
6
Perfazer com água destilada o volume total
de 2 ml
[ ] Bioquímica I
Para o estudo da actividade enzimática preparar 7 tubos de ensaio de acordo com a tabela 2.
Tabela 3- Preparação de soluções
Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7
Sacarose
0,25M0,00 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80
1,60
H2O dest. 2,00 1,95 1,90 1,80 1,60 1,20 0,40
Tampão
acetato1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Incubar a 25°C durante 5 minutos.
Em intervalos de 60s adicionar.
Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7
Enzima
1:4001,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Agitar no vórtex.
Incubar a 25°C durante 10 minutos exactos.
Em intervalos de 60s adicionar.
7
Perfazer com água destilada o volume total
de 2 ml
[ ] Bioquímica I
Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7
DNS 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Agitar no vórtex.
Aquecer em banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos.
Arrefecer em banho de água fria.
Adicionar 4mL de água destilada e agitar no vórtex.
Vsol (mL)Tubo1
(branco)Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
H2O dest. 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Ler absorvância a 540 nm (usar tubo 1 como branco).
5. Apresentação e tratamento de resultados
5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido
[solução equimolar de glicose/frutose] (M)
[solução]conc. = 0,0025M
Vfinal = 10mL
Tubo 2
Vinicial 2 = 0,10mL
[solução]tubo 2 = ?
ninicial=nfinal ⇔
[ solu çã o ]conc . ×V inicial 2=[ solu çã o ]tubo2 ×V final⇔
8
[ ] Bioquímica I
[ solu çã o ]tubo2=0,0025 M ×0,1 mL
10 mL⇔
[ solu çã o ]tubo2=2,5× 10−5 M ⇔ [ solu çã o ]tubo2=0,025× 10−3 M
Tubo 3
Vinicial 3 = 0,40mL
[solução]tubo 3 = ?
ninicial=nfinal ⇔
[ solu çã o ]conc . ×V inicial 3=[ soluçã o ]tubo 3×V final⇔
[ solu çã o ]tubo3=0,0025 M ×0,40 mL
10 mL⇔
[ solu çã o ]tubo3=2,5 ×10−5 M ⇔ [ solu çã o ]tubo3=1,0× 10−4 M
Tubo 4
Vinicial 4 = 0,70mL
[solução]tubo 4 = ?
ninicial=nfinal ⇔
[ solu çã o ]conc . ×V inicial 4=[ so lu çã o ]tubo4 ×V final ⇔
[ solu çã o ]tubo 4=0,0025 M × 0,70 mL
10 mL⇔
[ solu çã o ]tubo 4=2,5 ×10−5 M ⇔ [ solu ção ] tubo4=1,75 × 10−4 M
Tubo 5
Vinicial 5 = 1,0mL
[solução]tubo5 = ?
ninicial=nfinal ⇔
[ solu çã o ]conc . ×V inicial 5=[ soluçã o ]tubo 5×V final⇔
[ solu çã o ]tubo5=0,0025 M ×1,0 mL
10 mL⇔
[ solu çã o ]tubo5=2,5 ×10−5 M ⇔ [ solu çã o ]tubo5=2,5× 10−4 M
9
[ ] Bioquímica I
Tabela 4 – Registo de resultados com os dados necessários á construção da recta de calibração do DNS
para o açúcar invertido
Tubo Vsolução equimolar de glicose/frutose[solução equimolar de
glicose/frutose]Absorvância
1 - Branco 0 0 0
2 0,1 0,000025 0,005
3 0,4 0,0001 0,134
4 0,7 0,000175 0,293
5 1 0,00025 0,433
0.0000 0.0001 0.0002 0.00030.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
f(x) = 1801.15606936415 x − 0.0251271676300578R² = 0.990372671086214
Recta de calibração do DNS para o açucar invertido
concentração equimolar de glicose /frutose (M)
Abso
rvân
cia (n
m)
Gráfico 3 – Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido
5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima (μmol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten).
5.2.1. Cálculos necessários à construção da curva Michaelis-Menten
Cálculo da concentração de açúcar invertido após os 10 minutos de incubação
com a enzima
Pela lei Lambert-Beer, a absorvância em função da concentração deve ser uma linha recta,
logo existe uma relação entre a lei e a equação da recta.
y = m . x + b
A = Ɛ . l . c
10
[ ] Bioquímica I
Este cálculo é feito com base na recta de calibração do gráfico 3 e com as absorvâncias
medidas experimentalmente substituindo-as na equação obtida:
y=1801,2 x−0,0251
Tubo 2
[gluc / frut ]=0,003+0,02511801,2
=1,560 ×10−5 M
Tubo 3
[gluc / frut ]=0,022+0,02511801,2
=2,615 ×10−5 M
Tubo 4
[gluc / frut ]=0,213+0,02511801,2
=1,322 ×10−4 M
Tubo 5
[gluc / frut ]=0,381+0,02511801,2
=2,255 ×10−4 M
Tubo 6
[gluc / frut ]=0,528+0,02511801,2
=3,071 ×10−4 M
Tubo 7
[ glucfrut ]=0,616+0,0251
1801,2=3,559× 10−4 M
Cálculo do número de moles de açúcar invertido presentes em solução após os 10
minutos de encubação com a enzima.
Tubo 2
na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔
na ç. inv .=1,560× 10−5 M × 0,010 dm3 ⇔
na ç. inv .=1,560× 10−7 mol
Tubo 3
na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔
na ç. inv .=2,615× 10−5 M × 0,010 dm3⇔
11
[ ] Bioquímica I
na ç. inv .=2,615× 10−7 mol
Tubo 4
na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔
na ç. inv .=1,322× 10−4 M × 0,010 dm3⇔
na ç. inv .=1,322× 10−6 mol
Tubo 5
na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔
na ç. inv .=3,071× 10−4 M × 0,010 dm3⇔
na ç. inv .=3,071× 10−6 mol
Tubo 6
na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔
na ç. inv .=2,931× 10−4 M ×0,010 dm3⇔
na ç. inv .=2,931× 10−6 mol
Tubo 7
na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔
na ç. inv .=3,559× 10−4 M ×0,010 dm3⇔
na ç. inv .=3,559× 10−4 × 10−6 mol
Cálculo da actividade enzimática durante o tempo de encubação (10 minutos)
v=na ç uc. inv .(μ mol)
∆ t(min .)×V enzima(mL)
A enzima encontrava-se diluída 1:400, pelo que para a realização do cálculo da actividade
enzimática tem de entrar em linha de conta esse factor de diluição. Assim:
v=naçuc .inv .
∆ t ×V enzima
400
Tubo 2
v=1,560 × 10−7 ×106 μmol
10 min ×1mL400
⇔ v=6,240 μmol . min−1 .mL−1
12
[ ] Bioquímica I
Tubo 3
v=2,615× 10−7 ×106 μmol
10 min ×1mL400
⇔ v=10,460 μmol .min−1. mL−1
Tubo 4
v=1,322 ×10−6× 106 μmol
10 min ×1mL400
⇔ v=52,876 μmol .min−1. mL−1
Tubo 5
v=2,255× 10−6 ×106 μmol
10 min ×1mL400
⇔ v=90,184 μmol .min−1 . mL−1
Tubo 6
v=3,071 ×10−6 ×106 μmol
10 min ×1mL400
⇔ v=122,829 μmol . min−1 . mL−1
Tubo 7
v=3,559 × 10−6 ×106 μmol
10 min ×1mL400
⇔ v=142,372 μmol . min−1 . mL−1
Tabela 5 – Dados utilizados para construção da curva de Michaelis-Menten
Tubo V Sac (mL) [Sac] (M) Absorvância[Açúcar
Invertido]n açúcar invertido
Activ. Enz (μmol.min-1mL-1)
Branco 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 0,05 1,25E-03 0,003 1,560E-05 1,560E-07 6,240
3 0,10 2,50E-03 0,022 2,615E-05 2,615E-07 10,460
4 0,20 5,00E-03 0,213 1,322E-04 1,322E-06 52,876
5 0,40 1,00E-02 0,381 2,255E-04 2,255E-06 90,184
6 0,80 2,00E-02 0,528 3,071E-04 3,071E-06 122,829
7 1,60 4,00E-02 0,616 3,559E-04 3,559E-06 142,372
13
[ ] Bioquímica I
5.2.2. Construção do gráfico da curva de Michaelis-Menten
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.0450.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
140.0
160.0
Activ. Enz (μmol.min-1mL-1)
Concentração de sacarose (M)
Vel
ocid
ade
da r
eaçã
o (μ
mol
.min
-1m
L-1)
Gráfico 4 – Curva de Michaelis-Menten
5.2.3. Determinação dos valores de KM e Vmax (pela representação Michaelis-Menten)
A equação de Michaelis-Menten permite uma visualização rápida e directa, mas não muito
precisa dos valores de Vmáx e de Km, uma vez que esta depende do observador.
A velocidade atingirá o ponto máximo quando a enzima estiver saturada, ou seja, quando
todos os locais de ligação do centro activo estiverem ocupados com os ligandos e quando a
concentração de substrato não influenciar a velocidade. Como a curva relativa ao gráfico
de Michaelis-Menten tende para o infinito, não existe um valor preciso para Vmáx mas sim
uma estimativa deste. Neste caso, o valor foi de aproximadamente 145 μmol.min-1mL-1
O Km corresponde ao valor da concentração de substrato (eixo xx) lido a partir de V0 (eixo
dos yy) que equivale à metade de Vmáx. Assim:
k m=V máx
2=145
2=72,5μmol .min−1 . mL−1
Observando o gráfico, extrapolou-se que o Km será de aproximadamente 0,0075 M
14
[ ] Bioquímica I
5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax.
Cálculos necessários à construção do gráfico de Lineweaver-Burk
A dedução da equação de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten é
dada por:
Y = m x + b
Assim, esta é a equação de uma recta onde 1/v representa a ordenada, 1/[S] a abcissa, o
declive é dado por KM/vmax e a ordenada na origem 1/ vmax.
Tabela 6 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk
1/[sacarose] 800 400 200 100 50 25
1/V 1,602E-01 9,561E-02 1,891E-02 1,109E-02 8,141E-03 7,024E-03
0 100 200 300 400 500 600 700 800 9000.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0.180
f(x) = 0.000211280752766364 x − 0.00529118432755426R² = 0.966195181877005
Recta de Lineweaver- Burk
1/[sacarose] (M-1)
1/V
(m
ol-1
min
.mL)
Gráfico 5 - Representação gráfica da equação Lineweaver-Burk
Visto que o valor de b obtido é negativo, não é possível calcular o valor de Vmáx e consequentemente o valor de Km, uma vez que o valor da velocidade calculado daria negativo, o que é impossível.
15
[ ] Bioquímica I
Tabela 7 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk desprezando 2 pontos
1/[sacarose] 800 400 50 25
1/V 1,602E-01 9,561E-02 8,141E-03 7,024E-03
0 100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0000.0200.0400.0600.0800.1000.1200.1400.1600.180
f(x) = 0.000203258708455223 x + 0.00296615068356586R² = 0.988972140606615
Recta de Lineweaver-Burk
1/[sacarose] (M-1)
1/V
(m
ol-1
min
.mL)
Gráfico 6 - Representação gráfica da equação Leneweaver-Burk desprezando 2 pontos
De forma a obter um valor de velocidade máxima aceitável, foi desprezado o ponto 3 e 4,
obtendo a recta: Y=0,0002 x+0,003
b= 1Vmáx
⇔Vm= 10,003
≈ 333,33 μmolmin−1ml−1
m= KmVm
⇔ Km=m× Vm⇔ Km=333,33 ×0,0002=0,0667 M
Tabela 8 – Resultados obtidos pela curva de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten Lineweaver-BurkVmáx 145 333,33KM 0,0075 0,0667
16
[ ] Bioquímica I
6. Discussão /Conclusão
Com o intuito de realizar esta experiência laboratorial e para efectuar o cálculo dos
parâmetros cinéticos relativos à enzima invertase, onde se relaciona a velocidade
reaccional com a concentração do substrato presente, procedeu-se à realização de uma
recta de calibração. Esta recta relaciona a concentração de glucose/frutose com as
absorvâncias lidas para cada uma das concentrações padrão. Na segunda parte do trabalho
e com recurso a esta recta, foi possível calcular efectivamente a concentração do produto
da reacção (concentração de glucose/frutose derivado da degradação da sacarose pela
invertase) e efectuar de novo a leitura das absorvâncias para as amostras com diferentes
concentrações de substrato. Dependendo da concentração de substrato presente na amostra,
a concentração dos produtos foi variando no decurso da reacção enzimática, o que nos
permitiu estudar a actividade da enzima invertase para com o substrato, ou seja, a sua
afinidade para com este.
O estudo desta mesma actividade enzimática foi feito com recurso a duas representações
gráficas: a curva de Michaelis-Menten e a recta de Lineweaver-Burk.
O gráfico 4 mostra a variação da [Sacarose] quando a [Invertase] é constante. Como se
pode observar, para concentrações relativamente baixas de sacarose, V0 aumenta quase
linearmente com o aumento da [Sacarose], fruto da grande quantidade de enzima livre que
se pode ligar ao substrato. Para concentrações elevadas deste mesmo substrato, V0 aumenta
cada vez menos em resposta ao aumento da concentração de sacarose, atingindo um
patamar que representa o valor de Vmáx. Esta tendência para o infinito representa o
momento em que os centros activos da invertase se encontram todos ligados à sacarose
(saturação da enzima), em que a velocidade reaccional não aumenta mais
independentemente dos aumentos da concentração da sacarose.
Este gráfico permitiu então uma determinação empírica das constantes cinéticas
enzimática: Km e Vmáx. No nosso caso, os valores foram ≈0,0075 M e ≈145 µmol.min-
1.mL-1, respectivamente. Contudo, estes parâmetros não são muito precisos dado que Vmáx
não é um valor preciso mas sim assimptótico (tende para o infinito) e por consequência, Km
também não é rigoroso porque depende de Vmáx.
De forma a colmatar as falhas relativas a esta observação empírica, recorreu-se a uma das
formas linearizadas da equação de Michaelis-Menten – Equação de Lineweaver-Burk
17
[ ] Bioquímica I
(inverso de Michaelis-Menten). Esta equação permite uma leitura mais correcta dos
parâmetros cinéticos Km e Vmáx (cálculos matemáticos).
Não obstante, no nosso trabalho prático, os valores acima referidos não puderam ser
calculados uma vez que a equação que representa a recta de Lineweaver-Burk tinha o
parâmetro b negativo (-0,0053) (gráfico 5). Se assim fosse, Vmáx daria negativo (Vmáx
=1/b) bem como Km (Km = m xVmáx). Uma possível explicação para este facto ocorrido é
de que este método provoca uma distorção do erro experimental – para baixos valores de
V0, um pequeno erro em V0 corresponde a um enorme erro em 1/V0; pelo contrário, para
valores elevados de V0, o mesmo pequeno erro em V0 corresponderá a erros desprezáveis
em 1/V0.
Se pelo contrário desprezássemos dois pontos da recta de Lineweaver-Burk
(nomeadamente o 3º e 4º pontos), obteríamos um b positivo (0,003) (gráfico 6), o que nos
permitiria obter valores de Vmáx ≈ 333,33 µmol.min-1.mL-1 e Km = 0,0667 M. Este valor
calculado esta dentro do limite teórico previsto (10−8 a 10−2 M). No entanto, como não
existem valores de referência para actividade enzimática da invertase não se pode inferir
quanto aos erros analíticos cometidos, nem à exactidão dos resultados experimentais.
Tendo em conta o valor obtido para Km (6 ,67 ×10−2, tem-se uma má actividade
enzimática visto que este se aproxima do limite superior teórico previsto (
10−8<6,67 ×10−2 M <10−2). Todavia, este resultado não pode ser considerado
estatisticamente significativo, uma vez que foram desprezados 2 pontos e o r2 é inferior a
0,999 (correlação fiável).
Outro motivo para os resultados não serem considerados fiáveis é que segundo o descrito
na literatura, a enzima invertase não tem uma actividade significativa (24%), mesmo na
capacidade máxima de actuação (actividade óptima). De referir ainda que apesar da baixa
actividade, o pH óptimo (4,5) foi proporcionado pelo tampão acetato de sódio.
Outra ilação que podemos retirar da realização deste trabalho prático foi que a sacarose não
foi precisa para a preparação da recta de calibração (gráfico 3), uma vez que só os açúcares
glucose e frutose têm a capacidade de reduzir o DNS devido à presença de carbonos
anoméricos (carbonos capazes de participar na formação de ligações glicosídicas). Pelo
contrário, como a sacarose já apresenta uma ligação glicosídica, não apresenta o carbono
livre necessário à redução do DNS. No entanto, utilizou-se a sacarose nesta primeira parte
18
[ ] Bioquímica I
da experiência para que na medição das absorvâncias houvesse os mesmos constituintes
em ambas as partes do trabalho, pois na segunda parte a enzima invertase não é capaz de
degradar a sacarose na sua totalidade.
De referir ainda que os valores não foram de encontro ao esperado, possivelmente por
terem ocorrido erros sistemáticos e experimentais, tais como: má preparação das soluções-
padrão, desfasamento temporal entre a primeira parte e a segunda da experiência, más
leituras no espectrofotómetro devido a células danificadas e mau funcionamento do
aparelho.
Em suma, podemos então afirmar que os parâmetros cinéticos podem ser calculados tanto
pela curva de Michaelis-Menten como pela recta de Lineweaver-Burk. Pela curva de
Michaelis-Menten o calculo de Km não é rigoroso, pois depende da determinação do Vmáx
que é calculada por aproximação, sendo que também exige um numero elevado de
determinações. Contudo, o segundo método é mais expedito, rigoroso e rápido e são
necessárias menos leituras experimentais, pois o traçado da recta exige um menor número
de pontos da curva. Para além disto, a recta de Lineweaver-Burk não implica
aproximações, mas sim cálculos matemáticos.
7. Bibliografia
1. Adão, M. H. et al. (1997). Bioquímica. LIDEL- Edições Técnicas. ISBN: 972-757-
042-9;
2. http://legion.geleia.net/Guia_Laboratorios.pdf;
3. http://users.med.up.pt/ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados_anos_anteriores/2006-
2007/enzimas_e_cinetica_enzimica.pdf;
4. Nelson, D.L., Cox, M.M. (2001). “Lehninger, Principles of Biochemistry”, 3a
edição, Worth Publishers,;
5. Protocolo da actividade prática fornecido pelos docentes da cadeira;
6. Fiedurek, J.; Pielecki, J.; Skowronek, M. (2000). Direct methods for selecting
mutants with increased production of invertase from mutagenised cultures of
Aspergillus fumigatus. Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 111-118;
7. http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/Enzimas.htm;
8. Campos L. (1999). “Entender a Bioquímica”Escolar Ed, 2ª edição,. Capítulo 2,
Cinética das Reacções Bioquímicas;
19
[ ] Bioquímica I
9. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/
Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf;
10. Tseng SJ, Hsu JP. (1990). A comparison of the parameter estimating procedures
for the Michaelis–Menten model. J Theor Biol. Aug 23;145(4):457–64. PMID
2246896;
11. http://www.scielo.br/scielo.php?
pid=S010466322000000400051&script=sci_arttext
20
[ ] Bioquímica I
8. Anexos
8.1. Anexo 1- Segurança e riscos
NaOH:
R 35: Provoca queimaduras graves.
S 2: Manter fora do alcance das crianças.
S 26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e
chamar um especialista.
S 37/39: Usar luvas adequadas e protecção para os olhos/cara
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS):
R 22: Nocivo por ingestão.
S 22: Não respirar o pó
S24/25: Evitar o contacto com os olhos e com a pele
Ácido Cloridrico:
R34: Provoca queimaduras
R37: Irritante para as vias respiratórias.
S26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e
chamar um especialista
S45: Em caso de acidente ou indisposição consultar imediatamente um médico (se possível
mostrar-lhe o rótulo do produto)
Acetato de sódio:
R 36/37/38: Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele.S 16: Conservar longe de fontes de ignição - Não fumar.S 29: Não deitar os resíduos no esgotoS56: Não despejar na rede de esgotos nem no meio aquático. Utilizar para o efeito um local apropriado para o tratamento dos resíduos
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[ ] Bioquímica I
8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk
Dedução da equação de Lineweaver-Burk por linearização da equação de Michaelis-
Menten.
vvmax
=[ S ]
K M+[ S ]⇔
vmax
v=
K M+[ S ][ S ]
⇔
1v=
KM+ [ S ]vmax . [ S ]
⇔
1v=
K M
vmax . [ S ]+
[ S ]vmax . [ S ]
⇔
1v=
K M
vmax . [ S ]+ 1
vmax
⇔
1v=
KM
vmax
×1
[S ]+ 1
vmax
22
[ ] Bioquímica I
8.3. Anexo 3- Preparação de soluções
Extracto não purificado de enzima
Homogeneizar muito bem 50 g de fermento de padeiro em 100 ml de solução NaHCO3 0,1
M, durante 1 ou 2 minutos. Transferir a mistura para um erlenmeyer de 250 ml, vedar com
um pouco de algodão e incubar num banho termostatizado a 40ºC, durante 24 h.
Após a autólise da células de fermento, centrifugar a mistura durante 15 min. Transferir o
líquido sobrenadante, límpido, para uma proveta e registar o volume, guardando este
extracto de enzima no frigorífico.
Reagente de DNS
Dissolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 200 ml de NaOH 2 N, aquecendo e agitando
vigorosamente (solução A). Dissolver 300 g de tartarato de sódio e potássio em 500 ml de
água destilada (solução B). Misturar 30 ml da solução A com 75 ml da solução B e
perfazer o volume para 150 ml com água destilada.
Tampão acetato 20 mM, pH 4.5
Pesar a quantidade de acetato de sódio necessária para preparar 500 ml de solução 20 mM,
colocar num copo de 500 ml, adicionar cerca de 400 ml de água e homogeneizar. Verificar
o pH da solução resultante com o medidor de pH. Se necessário, acertar o pH no valor
pretendido (4.5), adicionando pouco a pouco, com um conta gotas, ácido clorídrico
concentrado, agitando continuamente a solução através de um agitador magnético.
Transferir a solução para um balão de 500 ml e aferir com água destilada. Homogeneizar.
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