Bioquímica I2010/2011Estudo cinético da invertase da leveduraAlunas: Andreia Sousa n.º 40261 Alexandra Salvado n.º 4026717 de Maio de 20111.º Ano - 2.º Semestre2Estudo cinético da invertase da leveduraResumoEste trabalho laboratorial teve como objectivos estudar a cinética do enzima invertase (beta-fructofuranosidase) na reacção de hidrólise da sacarose e a determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx. Pretendeu-se também comparar a velocidade da reacção de hidrólise da sacar
Bioqumica I
2010/2011
Estudo cintico da invertase da levedura
Alunas: Andreia Sousa n. 40261 Alexandra Salvado n. 40267
17 de Maio de 20111. Ano - 2. Semestre
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Estudo cintico da invertase da levedura
ResumoEste trabalho laboratorial teve como objectivos estudar a
cintica do enzima invertase (beta-fructofuranosidase) na reaco de
hidrlise da sacarose e a determinao dos parmetros cinticos Km e
Vmx. Pretendeu-se tambm comparar a velocidade da reaco de hidrlise
da sacarose num ensaio com actividade enzimtica e outro sem
actividade enzimtica. No estudo cintico do invertase utilizou-se
uma soluo de enzima de concentrao 1,0 U/mL, a qual foi preparada
por diluio de uma soluo stock 1mg/mL, usando tampo Tris-HCl (pH
7,5) 0,01 M. Aps a sua preparao, a soluo de enzima foi mantida a
uma temperatura prxima de 0C. No ensaio com actividade enzimtica, o
reagente de Nelson foi adicionado 10 minutos aps a adio do
invertase; como desactivador da aco enzimtica; aos tubos do segundo
ensaio, o reagente de Nelson foi adicionado antes da adio do
enzima. Os parmetros cinticos, Vmx e Km, foram obtidos a partir da
construo de um grfico das velocidades iniciais em funo da
concentrao de sacarose. Para a obteno dos valores das velocidades
iniciais determinaram-se as diferentes concentraes de oses
redutores produzidas durante um intervalo de 10 minutos. Estes
parmetros foram calculados por 4 mtodos diferentes e no final foi
eleito o mais eficiente. Para a obteno dos valores e dos grficos
destes parmetros cinticos, foi utilizado um programa de computador,
Hyper. Os valores obtidos de Km e Vmx no correspondem ao esperado,
sendo que o valor de Km desta enzima se situa entre os 25 e os 30
mM e se obteve um valor de Km = 9,482 4,903. A velocidade mxima, ao
contrrio da constante de Michaelis obtida, maior do que o esperado,
Vmx = 3,93 9,722. Este facto devido s altas absorvncias medidas
para a hidrlise total e a sua diferena para as absorvncias medidas
para a hidrlise no
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enzimtica, uma vez que a diferena grande, altas absorvncias
correspondem anteriormente: a velocidades inicias altas pela equao
deduzida
Segundo a apresentao destes grficos e valores de K m e Vmx, o
mtodo mais rigoroso foi o mtodo directo, uma vez que por todos
apresentarem um valor negativo, o mais prximo do valor da
literatura foi o calculado por este mtodo. O menos rigoroso ser
sempre o mtodo de Lineweaver-Burk, uma vez que os parmetros
utilizados na construo do grfico so o inverso dos valores obtidos,
assim, os valores de erro reduzido so apresentados com erro grande
e os valores de erro maior so apresentados com erro diminudo.
Aferiu-se que estes resultados obtidos resultaram de erros
experimentais que podiam estar relacionados com a preparao da soluo
de enzima, com a preparao do reagente de Nelson, com o perodo de
incubao, com os valores de absorvncia e com as condies do meio pH e
temperatura, principalmente.
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Estudo cintico da invertase da levedura
Registo e discusso dos resultadosClculo da concentrao exacta das
vrias solues de invertase preparadasPreparao das solues
Soluo de invertase 1,0 U/mL Deve retirar-se soluo anterior ( de
50 mL):
E perfazer-se a soluo at aos 25 mL com tampo Tris-HCl (pH 7,5)
0,01M, obtendo ento a concentrao de:
Soluo de invertase 2,5 U/mL Deve retirar-se soluo anterior ( de
50 mL):
E perfazer-se a soluo at aos 25 mL com tampo Tris-HCl (pH7,5)
0,01M, obtendo ento a concentrao de:
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Medies Cada grupo ficou com uma dada concentrao de invertase
para preparar (1,0 ou 2,5 U/mL). O nosso grupo preparou a soluo de
1,0U/mL.
Concentrao terica da soluo de invertase 1,0 U/mL
Concentrao exacta da soluo de invertase preparada
Para determinar a concentrao exacta da soluo de enzima preparada
utilizou-se a frmula correspondente lei de Beer-Lambert (
absorvncia, ). Sendo a
o coeficiente de absoro molar ao comprimento de onda
utilizado e o percurso ptico, ou seja, a largura da cuvette.
Para esta medio da absorvncia da soluo preparada utilizou-se a
cuvette de quartzo devido ao comprimento de onda utilizado, uma vez
que a 280 nm a cuvette que menos absorve, como visvel no quadro
abaixo (Quadro 1).Quadro 1. Gama de aplicao das cuvettes de acordo
com o seu tipo de material.
Gama Espectral Visvel UV
Material Plstico Vidro Quartzo
Gama de Aplicao 340-800 nm 334-2500 nm 170-2600 nm
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Estudo cintico da invertase da levedura
Concentrao exacta:
Concentrao esperada:
A concentrao exacta foi bastante mais elevada do que a
concentrao esperada. Isto vai resultar em absorvncias altas, como
se ver mais frente no relatrio.
Base de actuao do reagente de NelsonO cobre presente no reagente
de Nelson reduzido pelos glcidos redutores (glicose e frutose) em
meio alcalino e quente. A forma reduzida do sal de cobre actua
sobre o reactivo arsenomolibdato determinando o aparecimento de cor
azul, cuja intensidade proporcional ao teor de glcidos redutores da
soluo. Sob a aco do calor os glcidos redutores decompemse
parcialmente em fragmentos oxidveis pelo hidrxido cuproso existente
no reagente de Nelson, resultando em cido etanodiico, cido
propanodiico, entre outros. Nesta reaco o hidrxido de cobre (azul)
reduz-se a hidrxido cuproso (amarelo). Continuando o aquecimento, o
hidrxido cuproso perde uma molcula de gua, transformando em xido
cuproso (vermelho). O xido cuproso assim formado, vai reduzir o
reagente de arsenomolibdato dando o xido de molibdnio (MO3O8) de
colorao azul, cuja intensidade proporcional a quantidade de glcidos
redutores existentes na amostra, que pode ser determinada
espectrofotometricamente a 510 nm. O invertase, como todos os
enzimas, apresenta um pH ptimo de actuao, onde apresenta uma
actividade elevada, o seu intervalo de actuao17 de Maio de 2011
Estudo cintico da invertase da levedura
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de pH entre 3,5-5,5, sendo o pH ptimo 4,5, a 55C. Se o enzima no
se encontrar em soluo, a hidrlise da sacarose ocorre facilmente se
o meio for cido. Tendo por base estes factores, podemos deduzir que
o reagente de Nelson altera o pH da soluo, basificando-o, inibindo
a actuao do enzima. Este facto deve-se alterao do estado de ionizao
de um grupo funcional do enzima, independentemente da existncia do
tampo de acetato de sdio, pois este no tem capacidades de
neutralizar uma base to forte. A alterao dos estados inicos dos
grupos dos resduos dos aminocidos, principalmente do centro activo,
conduz a uma alterao da sua configurao pelo que a ligao com o
substrato impossibilitada, levando a uma perda da sua actividade
cataltica e consequente paragem da reaco catalisada pela enzima.
Este facto em conjunto com o posterior aumento de temperatura, leva
desnaturao do enzima, impedindo-o de voltar a reagir, sendo a reaco
de hidrlise da sacarose dada por terminada.
Resultados obtidos nos controlos efectuadosAo longo de toda a
actividade laboratorial foram utilizados tubos de controlo para
cada quadro preparado. No quadro 1, em que foi estudado a influncia
da concentrao de substrato na actividade enzimtica do invertase da
levedura, foi utilizado para o zero do espectrofotmetro o tubo 1,
pois no havendo sacarose no meio reaccional no foi formado nenhum
produto (glucose e frutose) e consequentemente a concentrao de
glcidos redutores o que identificado pelo mtodo de Nelson nula. O
tubo 10 foi utilizado para controlar o efeito do reagente de Nelson
na actividade enzimtica. Este reagente foi adicionado neste tubo
antes do enzima, ao contrrio do sucedido nos outros tubos. Assim,
visto que este inibe
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a actuao do enzima, obteve-se uma menor concentrao de glcidos
redutores glucose e frutose - pois a hidrlise do disido no foi
catalisada por um enzima. O tubo 11 permitiu seguir a dissociao da
sacarose sem a aco do enzima. Ao comparar este tubo com o tubo
anterior (tubo 10) possvel concluir que a dissociao ocorrida no
tubo 10 se deve a uma dissociao qumica natural da sacarose sem
enzima, pois uma vez que as absorvncias medidas foram idnticas, as
concentraes de glcidos redutores foram idnticas. No quadro 2, em
que foi controlada a hidrlise no enzimtica da sacarose, foi
utilizado para o zero do espectrofotmetro o tubo 1, pelos mesmos
motivos que no quadro 1. Quanto a este quadro todos os tubos de
ensaio podem ser considerados tubos de controlo, uma vez que em
relao a estes que se vai comparar a reaco com enzima.
Dados obtidos no estudo da hidrlise total e no enzimtica Grfico
Absorvncia VS concentrao de sacaroseConcentrao terica da sacarose
em cada soluo (V T =10 mL)
[
]
Tubo 1
Tubo 2
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Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Tubo 8
Tubo 9
Registo dos resultados Soluo 1,0 U/mL de invertaseQuadro 2. .
Concentrao de sacarose (substrato) e respectivas absorvncias a 510
nm em cada quadro, utilizando a soluo de invertase 1,0 U/mL.
Tubos [Sacarose] (mM)
Abs510nm Hidrlise total (enzimtica e no enzimtica) 0,000 1,984
1,544
Abs510nm Hidrlise no enzimtica 0,000 0,287 0,397
Abs510nm Hidrlise enzimtica 0,000 1,697 1,14717 de Maio de
2011
1 2 3
0,0 0,5 1,0
10
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4 5 6 7 8 9
1,5 2,5 3,5 5,0 10,0 15,0
1,755 1,875 1,917 2,232 1,892 1,979
0,343 0,413 0,489 0,390 0,548 1,044
1,412 1,462 1,428 1,842 1,344 0,935
Absorvncia VS concentrao de sacarose2,400 2,250 2,100 1,950
1,800 1,650 1,500 1,350 1,200 1,050 0,900 0,750 0,600 0,450 0,300
0,150 0,000 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 Concentrao de
Sacarose (mM)
Absorvncia a 510 nm
Hidrlise total (enzimtica e no enzimtica)
Hidrlise no enzimtica
Hidrlise enzimtica (diferena entre a hidrlise total e a hidrlise
no enzimtica)
Grfico 1. Representao do estudo da hidrlise enzimtica total
(enzimtica e no enzimtica), hidrlise enzimtica e hidrlise no
enzimtica, utilizando a soluo de invertase 1,0 U/mL.
Soluo 2,5 U/mL de invertaseQuadro 3. Concentrao de sacarose
(substrato) e respectivas absorvncias a 510 nm em cada quadro,
utilizando a soluo de invertase 2,5 U/mL.
Tubos [Sacarose] (mM)
1 2 3 4
0,0 0,5 1,0 1,5
Abs510nm Hidrlise total (enzimtica e no enzimtica) 0 1,560 1,670
2,120
Abs510nm Hidrlise no enzimtica 0 1,333 1,349 1,421
Abs510nm Hidrlise enzimtica 0 0,000 0,227 0,321
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5 6 7 8 9
2,5 3,5 5,0 10,0 15,0
2,540 2,757 2,777 2,777 2,777
1,492 1,503 1,539 1,589 1,603
0,699 1,048 1,254 1,238 1,188
Absorvncia VS concentrao de sacarose3,000 2,850 2,700 2,550
2,400 2,250 2,100 1,950 1,800 1,650 1,500 1,350 1,200 1,050 0,900
0,750 0,600 0,450 0,300 0,150 0,000 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
14,0 16,0 Concentrao de Sacarose (mM)
Absorvncia a 510 nm
Hidrlise total (enzimtica e no enzimtica)
Hidrlise no enzimtica
Hidrlise enzimtica (diferena entre a hidrlise total e a hidrlise
no enzimtica)
Grfico 2. Representao do estudo da hidrlise enzimtica total
(enzimtica e no enzimtica), hidrlise enzimtica e hidrlise no
enzimtica, utilizando a soluo de invertase 2,5 U/mL.
Discusso dos grficos obtidos A reaco de hidrlise da sacarose
tanto pode ocorrer naturalmente como pode ocorrer na presena de
enzima.
Imagem 1. Reaco de hidrlise da sacarose.
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Os enzimas, sendo protenas com funes catalticas, aumentam a
velocidade com que se atinge o estado de equilbrio da reaco. Assim,
duas solues que contenham a mesma concentrao de substrato (neste
caso, sacarose), se uma tiver na presena de enzima (neste caso,
invertase da levedura) e outra no, a soluo que estiver na presena
do enzima ir obter uma maior concentrao de produto (glcidos
redutores frutose e glucose) no mesmo intervalo de tempo. Tanto no
Grfico 1 como no Grfico 2 as absorvncias mais altas correspondem
hidrlise total, como era esperado. Uma vez que na hidrlise total
tanto ocorre hidrlise enzimtica como no enzimtica, levando a uma
obteno maior de glcidos redutores. Estes dados correspondem aos
obtidos atravs da aplicao do quadro 1 do procedimento. O conjunto
de pontos que se referem absorvncia medida para a actividade no
enzimtica deveria corresponder aos menores valores de todos, uma
vez que no enzimaticamente a reaco de hidrlise da sacarose mais
lenta (obtm-se uma menor quantidade de glcidos redutores). O facto
descrito anteriormente deveria ser independente da concentrao do
enzima no meio reaccional. No entanto, isso s aconteceu quando a
concentrao da soluo de invertase era 1,0 U/mL. Estes dados
correspondem aos obtidos atravs da aplicao do quadro 2 do
procedimento. Quanto hidrlise enzimtica, as absorvncias deviam
estar
compreendidas entre as absorvncias da hidrlise total e da
hidrlise no enzimtica e deveriam aumentar at uma dada concentrao de
sacarose e depois manter-se estvel, uma vez que para concentraes de
enzima muito menores que concentraes de substrato chega a um ponto
em que todos os centros activos dos enzimas esto ocupados, no sendo
possvel aumentar mais a velocidade de reaco. Como todos os enzimas
estiveram nas solues o mesmo tempo e na mesma quantidade, a partir
de uma dada concentrao, a absorvncia medida deve ser igual para
todos. Uma vez que as concentraes de sacarose em cada um dos casos
anteriores foi a mesma para cada tubo de ensaio, concluiu-se que
as
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concentraes de frutose e glucose obtidas no enzimaticamente
seriam as mesmas que na situao onde ocorreu a hidrlise total.
Assim, para se obter as absorvncias e consequentemente as
concentraes dos glcidos redutores obtidos enzimaticamente
procedeu-se ao seguinte clculo:
No Grfico 1 aconteceu o esperado quanto ao intervalo de valores
em que devia estar a absorvncia (entre as absorvncias da hidrlise
total e a hidrlise no enzimtica) mas quanto aos valores de
absorvncia manterem-se aproximadamente iguais aps uma dada
concentrao, no aconteceu o esperado pois obtiveram-se valores muito
dispersos, no seguindo qualquer tendncia. No Grfico 2 ocorreu
exactamente o contrrio do descrito para oGrfico 1.
Cintica de Michaelis-Menten Clculo da velocidade inicial da
reaco de hidrlise da sacarose enzimtica utilizada Sabendo que na
hidrlise total existem dois tipos de reaco, a enzimtica e a no
enzimtica, pode considerar-se que a concentrao da soluo no
enzimtica na hidrlise total igual concentrao obtida nos outros
tubos de ensaio correspondentes hidrlise no enzimtica, sendo que as
solues, teoricamente, continham a mesma concentrao de sacarose.
Assim, subtraindo o valor da absorvncia da hidrlise no enzimtica
hidrlise total da sacarose obtm-se apenas a concentrao dos glcidos
redutores originados pela reaco enzimtica, como explicado
anteriormente. A partir desta variao de absorvncia e sabendo que o
coeficiente de absoro molar dos produtos da reaco da glucose no
mtodo de Nelson a 510 nm igual a 510nm = 7,1 mM-1cm-1, pode-se
calcular a concentrao de glcidos na mistura reaccional para cada (v
T = 1mL) devido de aco
(M/min)
concentrao
substrato
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catalisados enzimaticamente. No entanto, apesar do mtodo de
Nelson reagir com os dois glcidos redutores obtidos (glucose e
frutose), vai-se considerar para o clculo da velocidade que s
identifica a glucose, pois s para este glcido que se sabe o valor
do coeficiente de absoro molar. Assim, o valor desta concentrao por
unidade de tempo corresponde velocidade inicial que se pode
determinar atravs da seguinte frmula: [ ]
Quadro 4. Registo das variaes das absorvncias - hidrlise
enzimtica - para as vrias concentraes de sacarose nos diferentes
tubos
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Abs510 Hidrlise enzimtica 0,000 1,697 1,147 1,412 1,462 1,428
1,842 1,344 0,935
Para determinar a velocidade inicial para cada tubo de ensaio
deduziuse uma frmula que permitiu calcular a velocidade inicial
atravs da absorvncia registada e da frmula da prpria velocidade. [
]
[
]
Velocidade inicial
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Concentrao da sacarose na mistura reaccional
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
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Estudo cintico da invertase da levedura
Tubo 7
Tubo 8
Tubo 9
Representao grfica de v o em funo da concentrao de sacarose na
mistura reaccional (v T = 1 mL). Determinao dos parmetros cinticos
K m e V m x usando um mtodo grfico adequado. Justificao da escolha
do mtodo efectuado. Comparao do valor obtido para Km com valores da
literatura.
Quadro 5. Concentrao de sacarose na mistura reaccional (1mL) e
velocidade inicial correspondente.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
[Sacarose] (mM) 0 5 10 15 25 35 50 100 150
Velocidade inicial ( (M min-1) 0 23,9 16,2 19,9 20,6 20,1 25,9
18,9 13,2
)
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Grfico 3. Representao da velocidade inicial (M min-1) em funo da
concentrao de substrato, neste caso, sacarose (mM) na mistura
reaccional.
Pela observao do grfico obtido, podemos notar que deve ter
ocorrido algum tipo de erro experimental, pois era esperado que se
observasse um grfico onde fosse possvel identificar facilmente que
a velocidade de reaco aumenta com o aumento da concentrao se
substrato. Para alm disso era tambm esperado que fosse perceptvel
ver como a velocidade da reaco tende para um valor limite onde
todos os enzimas tm os seus centros activos ocupados, encontram-se
saturados - sendo esta a velocidade mxima. Os parmetros cinticos
que se podem retirar do grfico obtido, K m e Vmx no correspondem,
portanto, ao esperado, sendo que o valor de K m desta enzima se
situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve um valor de Km = 9,482
4,903. A velocidade mxima, ao contrrio da constante de Michaelis
obtida, maior do que o esperado, Vmx = 3,93 9,722. Este facto
devido s altas absorvncias medidas para a hidrlise total e a sua
diferena para as absorvncias medidas para a hidrlise no enzimtica,
uma vez que a diferena grande, altas absorvncias correspondem a
velocidades inicias altas pela equao deduzida anteriormente:
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Estudo cintico da invertase da levedura
Como as velocidades iniciais tm um valor elevado, a velocidade
mxima tambm o ter. Para obter valores credveis de Km e Vmx o grfico
deveria apresentar uma curva hiperblica rectangular, isto , uma
curva onde medida que a concentrao de substrato aumenta, a
velocidade da reaco tambm aumenta, sendo que inicialmente aumenta
muito rapidamente, passando progressivamente a tender para um
determinado valor, correspondente velocidade mxima. Assim, seria de
esperar que se observasse que o grfico obedecia a uma cintica de
Michaelis-Menten. A constante de Michaelis, Km, seria igual
concentrao de substrato para a qual a velocidade inicial da reaco
metade da sua velocidade mxima. De seguida est apresentado o grfico
esperado para uma cintica de Michaelis.
Imagem 2. Equao de Michaelis-Menten e representao da curva de
saturao para um
enzima mostrando a relao entre a concentrao do substrato (eixo
das abcissas) e a velocidade de reaco (eixo das ordenadas).
Apesar dos resultados obtidos, a equao de Michaelis-Menten
apresenta alguns problemas que dificultam os clculos dos parmetros
cinticos, tais como:
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Estudo cintico da invertase da levedura
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1. Vmx uma assmptota da hiprbole
2. Os dois parmetros cinticos esto extremamente
correlacionados
3. Erros experimentais
Para uma melhor determinao dos parmetros cinticos, a equao de
Michaelis-Menten pode ser algebricamente rearranjada em formas que
so mais teis no tratamento grfico dos dados experimentais. So
conhecidos trs mtodos (transformaes lineares) distintos para a
determinao dos parmetros cinticos (Vmx e Km): Mtodo de
Lineweaver-Burk; Mtodo de Hanes; Mtodo de Eadie-Hofstee.
Mtodo de Lineweaver-Burk O grfico de Lineweaver-Burk ou
representao de duplo recproco a forma mais comum e simples de
mostrar os dados cinticos, apesar de no ser a mais fivel. Neste
mtodo, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equao de
Michaelis-Menten:
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Estudo cintico da invertase da levedura
Como se pode observar na figura, o resultado deste tipo de
representao uma linha recta cuja equao do tipo y = mx + b, sendo o
ponto de interseco entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente
a , e o ponto de interseco entre a recta e o eixo de abcissas .
equivalente a
Imagem 3. Representao do grfico de Lineweaver-Burk.
Geralmente, os grficos de Lineweaver-Burk distorcem as medidas
realizadas a baixas concentraes de substrato e isto pode dar lugar
a estimativas no muito exactas de Vmx e de Km. A principal
desvantagem deste mtodo a de que, ao calcular-se os inversos,
altera-se por completo a distribuio dos erros experimentais um
pequeno erro experimental passa a ser um grande erro aps a inverso
da equao de Michaelis-Menten. No entanto tambm apresenta a sua
vantagem permite uma determinao de Vmx precisa. O grfico obtido
neste trabalho experimental para o mtodo de Lineweaver-Burk o que
se ilustra a seguir.
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Estudo cintico da invertase da levedura
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Imagem 4. Grfico obtido no mtodo de Lineweaver-Burk.
Para este mtodo obteve-se os seguintes parmetros cinticos: Vmx =
17,93 M/ min Km = -1,018 mM
Mtodo de Hanes Neste mtodo multiplica-se por [S] na expresso do
duplo recproco, vista anteriormente. Esta representao no causa
alterao do desvio experimental ao longo da escala de [S], da ser o
mais indicado para a estimativa por transformao linear e/ou
grfica.
Imagem 5. Equao do mtodo de Hanes e respectiva representao
grfica.
Neste mtodo a
[ ] varia linearmente com [S]. O declive da recta igual
. A interseco da recta com o eixo das ordenadas
numericamente
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Estudo cintico da invertase da levedura
igual a
e a interseco da recta com o eixo das abcissas
numericamente igual a Km.
Imagem 6. Grfico obtido no mtodo Hanes.
Para este mtodo obteve-se os seguintes parmetros cinticos: Vmx =
13,85 M/ min Km = -8,714 mM
Mtodo de Eadie-Hofstee Este mtodo consiste na multiplicao por V
na expresso do duplo recproco e no seu rearranjo.
Imagem 7. Equao do mtodo de Eadie-Hofstee e respectiva
representao grfica.
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Estudo cintico da invertase da levedura
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O declive desta recta numericamente igual a - Km. A interseco da
recta com o eixo das ordenadas numericamente igual V mx e com o
eixo das abcissas numericamente igual a .
Este um bom mtodo para testar desvios equao de
MichaelisMenten.
Imagem 8. Grfico obtido no mtodo de Eadie-Hofstee.
Para este mtodo obteve-se os seguintes parmetros cinticos: Vmx =
18,56 M/ min Km = -1,032 mM
Mtodo de Eisenthal e Cornish-Bowden Existe ainda um mtodo
(linear) directo. um mtodo no paramtrico e denominado mtodo de
Eisenthal e Cornish-Bowden. Neste mtodo Km e Vmx podem ser
determinados pelo uso da forma integrada da equao de
velocidade:
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Estudo cintico da invertase da levedura
Ordenada na origem V = V0 Abcissa na origem Km = - [S]Imagem 9.
Equao usada no mtodo de Eisenthal e Cornish-Bowden.
[S]i, V0i Aps a sua determinao experimental, cada par de valores
de [S] i e V0i passa a ser constante; V e Km Para cada experincia,
a incgnita determinar qual o par de parmetros cinticos que satisfaz
simultaneamente todos os valores experimentais de [S] e V0.
Imagem 10. Representao grfica pelo mtodo de Eisenthal e
Cornish-Bowden.
Para cada [S]i traa-se uma recta que une os pontos (- [S]i, 0) e
(0, V0i); Cada recta traada inclui todos os pares de valores de K m
e V que satisfazem os valores experimentais de [S]i e V0i;
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Estudo cintico da invertase da levedura
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O ponto de interseco das duas rectas corresponde ao nico par de
valores de Km e V que satisfaz simultaneamente os dois pares de
valores experimentais de [S] e V0 Km* e V*.
A estimativa dos parmetros cinticos feita atravs da mediana das
n.(n1)/2 interseces obtidas onde n o nmero de pontos experimentais.
As vantagens deste mtodo so as seguintes: No requer clculos, Com
dois ou trs [S] obtm-se uma estimativa de Km e do desenho
experimental, Insensvel a outliers.
Imagem 11. Resultados ideias do clculo dos parmetros cinticos
pelo mtodo de Eisenthal e CornishBowden.
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Estudo cintico da invertase da levedura
Imagem 12 Grfico obtido no mtodo de Eisenthal e
Cornish-Bowden.
Para este mtodo obteve-se os seguintes parmetros cinticos: Vmx =
18,84 M/ min Km = -0,9963 mM
Como visvel em todos os mtodos que resultam do rearranjo da
equao de Michaelis-Menten, os dados experimentais obtidos no
correspondem, nem aproximadamente, aos valores esperados, uma
vez que seria de esperar um K m entre 25 e 30 mM e se obteve
valores negativos de K m. Sendo Km o valor de uma concentrao
impossvel ter um valor negativo. Quanto Vmx seria de esperar uma
menor velocidade. Segundo a apresentao destes grficos e valores de
K m e Vmx, o mtodo mais rigoroso foi o mtodo directo, uma vez que
por todos apresentarem um valor negativo, o mais prximo do valor da
literatura foi o calculado por este mtodo. O menos rigoroso ser
sempre o mtodo de Lineweaver-Burk, uma vez que os parmetros
utilizados na construo do grfico so o inverso dos valores obtidos,
assim, os valores de erro reduzido so apresentados com erro grande
e os valores de erro maior so apresentados com erro diminudo.
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Estudo cintico da invertase da levedura
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O facto de se obter valores to distantes dos esperados leva a
considerar que ocorreram uma srie de erros na realizao do
procedimento que afectaram os resultados. Esses erros podem comear,
por exemplo, na preparao da soluo de invertase e continuar na
preparao do reagente de Nelson. Uma m preparao deste reagente pode
ter como consequncia a no paragem da actividade enzimtica, levando
a uma maior produo de glcidos redutores e consequentemente a uma
absorvncia maior. Uma adio tardia deste reagente a cada tubo
conduziria a um aumento do tempo de incubao e como tal a uma maior
concentrao de produto formado. Alm da preparao de solues podem
tambm ter ocorrido erros na medio das absorvncias nos diferentes
tubos, uma vez que a linearidade entre a absorvncia e concentrao
limitada por diversos factores qumicos e instrumentais, tais como:
disperso da radiao devido presena de partculas na soluo ou desvios
nos coeficientes de absoro molar devido a interaces
intermoleculares entre molculas muito prximas, a utilizao radiao no
totalmente monocromtica e possibilidade de fluorescncia da amostra,
assim como alteraes do ndice de refraco das cuvvetes e alteraes no
equilbrio das solues analisadas. Ao obter absorvncias muito altas,
ir obter-se concentraes de produto formado muito altas, o que vai
influenciar a velocidade inicial obtida em cada tubo de ensaio
e
consequentemente os parmetros cinticos. A obteno de valores de
Km muito baixos pode dever-se alta afinidade entre enzima e
substrato. Cada enzima apresenta um valor caracterstico de K m e de
Vmx. Para a maioria das enzimas, o valor de Km est entre 10-1 e
10-7 M. Esse valor depende do substrato em particular e tambm das
condies no sistema de reaco, tais como pH, temperatura e fora
inica. Km corresponde concentrao de substrato em que metade dos
centros activos da enzima est preenchida e mostra a afinidade pela
enzima ao substrato; um Km baixo implica uma grande concentrao do
complexo enzima substrato em soluo, portanto, muito substrato em
soluo, isto , pequeno Km implica velocidade maior. Existem outros
factores que podem influenciar a actividade enzimtica, como o pH e
a temperatura do meio:17 de Maio de 2011
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Estudo cintico da invertase da levedura
pH
As protenas como j foi visto, so construdas a partir de
aminocidos. Estas unidades bioqumicas possuem grupos bsicos,
neutros e cidos.
Consequentemente, a enzima intacta pode conter ambos os grupos
ou
carregados
positiva
negativamente a um dado pH. Deste modo, grupos ionizveis
so,Imagem 13. Efeito do pH na actividade enzimtica.
aparentemente, muitas vezes parte do centro activo visto que a
aco
cataltica de cidos e bases est ligada a vrios mecanismos
enzimticos. Alm disso, variaes do pH podem alterar a estrutura
tridimensional das enzimas. Por essas razes, as enzimas so activas
somente dentro de uma certa faixa de pH. O pH do meio pode afectar
a velocidade mxima da reaco, Km, e a estabilidade da enzima. Em
alguns casos, o substrato pode conter grupos inicos, e o pH do meio
influi na afinidade do substrato com a enzima.
Temperatura A velocidade das reaces catalisadas por enzimas
cresce at
um certo limite. Acima de uma determinada temperatura, a
actividade da enzima diminui devido sua desnaturao. A velocidade de
uma reaco qumica afectada pela temperatura isso pode ser explicado
pela teoria de Arrhenius que se baseia na hiptese de que duas
partculas devem se colidir na orientao correcta e com energia
cintica suficiente para que os reagentes sejam transformados em
produtos. Pode-se dizer que o mesmo acontece com as reaces
catalisadas por enzimas, lembrando que a variao de temperatura
afecta as constantes cinticas (Km e Vmx).
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Estudo cintico da invertase da levedura
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Em baixas temperaturas, as reaces so mais lentas devido queda da
energia cintica do sistema. Porm, como as enzimas so protenas, o
aumento da temperatura no causa apenas o aumento da velocidade de
reao, mas, sim, dois efeitos opostos: At determinada temperatura,
ocorre um aumento da
velocidade de reao; A partir de determinada temperatura, h uma
diminuio na
velocidade de reao. A actividade enzimtica da invertase atinge
um mximo aos 55C, a temperatura ambiente do
laboratrio era 29C. medida que a temperatura aumenta, a
actividade cataltica
aumenta tambm, at atingir um determinado valor - Temperatura
ptima. A partir desta temperatura, que corresponde ao valor mximo
de actividade enzimtica, a actividade cataltica comea a diminuir,
pois, a temperaturas elevadas inicia-se a desnaturao trmica das
protenas.Imagem 14. Efeito da temperatura na actividade
enzimtica.
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Estudo cintico da invertase da levedura
Bibliografia Alexander, R.R., Griffiths, J.M., e Wilkinson, M.L.
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Addison-Wesley: Reading, MA, pp.299-321. Cornish-Bowden, A. (1995)
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D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison
Wesley Longman: New York. Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998)
Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and
Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp.
199-206.
Questionrio1. Porque que a soluo de invertase foi preparada em
tampo Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M e os ensaios foram realizados
usando-se tampo acetato de sdio (pH 4,5) 0,2 M? O enzima invertase
catalisa a hidrlise da ligao glicosdica (12) do dixido no redutor,
sacarose, originando glucose e frutose na proporo de 1:2 - por cada
molcula de sacarose hidrolisada, formam-se duas molculas de oses
redutoras.
A invertase apresenta uma actividade elevada num intervalo
alargado de valores de pH (3,5 5,5), apresentando um valor de pH
ptimo igual a 4,5. O pH tem uma grande influncia na actividade
enzimtica. Os enzimas sofrem os mesmos efeitos estruturais
observados nas protenas globulares17 de Maio de 2011
Estudo cintico da invertase da levedura
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pela variao de pH - mudanas extremas de pH podem alterar a
estrutura da enzima devido a uma repulso de cargas. Assim, a soluo
de enzima foi preparada a valor de pH igual a 7,5 pois para este
valor de pH, o enzima bastante estvel. Nesta fase o importante foi
preparar uma soluo diluda assegurando que o enzima estaria presente
na sua forma estvel para que mais tarde fosse possvel estudar a sua
actividade. Os ensaios foram realizados usando-se tampo acetato de
sdio (pH 4,5) 0,2 M pois este o valor de pH ptimo do enzima, ou
seja, o valor de pH para o qual o enzima tem mxima potncia e
eficincia. Caso a preparao da soluo fosse realizada para outros
valores de pH, o enzima poderia no ser estvel e, mais tarde, ao
realizar os ensaios, poderia ocorrer o caso extremo de no se
encontrar enzima em soluo para catalisar a reaco, sendo impossvel
de atingir o objectivo do trabalho. 2. Como comprovaria que a
ocorrncia de uma reaco num
homogenato ou extracto celular era devida aco cataltica de um
enzima, presente nesse homogenato, sobre o substrato utilizado?
Para comprovar que a ocorrncia de uma reaco num homogenato ou
extracto celular era devida aco cataltica de um enzima
realizar-se-ia um estudo cintico, traando-se o grfico da velocidade
inicial em funo da concentrao de substrato. Se nesse grfico se
obtivesse uma hiprbole rectangular, concluir-se-ia que a reaco era
devida aco cataltica de um enzima que obedece a uma cintica de
Michaelis-Menten.
No
entanto,
existem
vrios
enzimas
que
no
possuem
um
comportamento Michaeliano e, por isso, seria necessrio recorrer
a outra forma de confirmar a existncia de actividade cataltica.
Poder-se-ia, ento, efectuar um ensaio com um agente interferente,
causando, por exemplo, uma variao significativa de pH e/ou
temperatura. Caso se obtivesse um grfico de velocidades iniciais em
funo da concentrao de substrato em que a velocidade inicial da
reaco tivesse diminudo ou mesmo desaparecido em17 de Maio de
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Estudo cintico da invertase da levedura
relao ao ensaio cintico sem agentes interferentes, saber-se-ia
que o enzima era responsvel pela actividade cataltica. Os agentes
interferentes actuariam como agentes desnaturantes dos enzimas
catalticos da reaco, de natureza proteica, perdendo assim a sua
actividade devido a alterao das condies experimentais do meio.
3.
Um enzima que apresenta um pH ptimo a 6,8, tem uma
actividade muito reduzida a pH 4,2. Como poderia determinar se
esta reduo na actividade resulta de uma ionizao reversvel do
substrato e/ou enzima ou causada por uma desnaturao irreversvel do
enzima?
O pH determina o estado de ionizao dos diferentes grupos
constituintes dos diversos componentes do vaso reaccional,
nomeadamente dos enzimas e do substrato. Variaes acentuadas deste,
podero levar impossibilidade de estabelecer ligaes
enzima-substrato, devido
modificao do centro activo do enzima. Estas modificaes podero
ser de tal modo significativas que alteram a estrutura da protena,
pois as alteraes das foras electroestticas de diferentes grupos
ionizveis levam a um aumento da instabilidade do enzima, levando
sua desnaturao e consequente perda da actividade cataltica.
Para verificar experimentalmente se ocorreu desnaturao
irreversvel do enzima ou ionizao reversvel do substrato e/ou
enzima, realizar-se-ia um ensaio cintico para um pH ptimo de 6,8.
De seguida realizar-se-ia um outro ensaio adicionando um cido, de
modo a diminuir o pH at ao valor de 4,2. Analisando a velocidade da
reaco, verificar-se-ia que no ltimo ensaio ocorreria uma diminuio
da mesma. Se, ao voltarmos ao pH 6,8, adicionando base, se
verificasse um aumento da velocidade da reaco, significaria que
tinha ocorrido uma ionizao reversvel do substrato e/ou enzima. Caso
contrrio, se a velocidade se mantivesse inaltervel, significaria
que tinha ocorrido uma desnaturao irreversvel.
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4.
Qual a forma geral da curva que representa a dependncia
da velocidade de uma reaco enzimtica com a temperatura do meio?
Justifique sucintamente. A temperatura apresenta uma grande
influncia na catlise enzimtica. Existe uma temperatura para a qual
a actividade do enzima mxima temperatura ptima diferente de enzima
para enzima (Imagem 14. Efeito da temperatura na actividade
enzimtica.) Esta influncia sobre a cintica da reaco enzimtica deve
ser entendida em duas fases distintas: no princpio, aumentos de
temperatura levam a aumentos da velocidade de reaco, por aumentar a
energia cintica das molculas componentes do sistema este efeito
observado num intervalo de temperatura compatvel com a manuteno da
estrutura espacial do enzima. No entanto, temperaturas muito mais
elevadas levam desnaturao do enzima por alterarem as ligaes qumicas
que mantm a sua estrutura tridimensional. A temperatura que provoca
a desnaturao est, geralmente, pouco acima da sua temperatura ptima.
Deste modo, verifica-se uma diminuio da actividade enzimtica medida
que a temperatura aumenta a partir da temperatura ptima. Por outro
lado, a temperaturas inferiores temperatura ptima, a velocidade da
reaco pequena devido existncia de menor energia envolvida nas
colises entre o enzima e o substrato, originando uma menor
actividade enzimtica.
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