UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período : Agosto/2014 a Julho/2015

( ) PARCIAL

(X) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Engenharia biológica de microalgas e cianobactérias: da prospecção de linhagens à produção de bioenergia.

Nome do Orientador: Evonnildo Costa Gonçalves

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade : Universidade Federal do Pará

Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Laboratório de Tecnologia Biomolecular

Título do Plano de Trabalho: Prospecção de aminoácidos tipo micosporinas de cianobactérias

de água doce da Amazônia

Nome do Bolsista: Thiago Tavares Lopes

Tipo de Bolsa:

(x) PIBIC/ CNPq

( ) PIBIC/CNPq – AF

( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador

( ) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/UFPA – AF

( ) PIBIC/ INTERIOR

( )PIBIC/PARD

( ) PIBIC/PADRC

( ) PIBIC/FAPESPA

( ) PIBIC/ PIAD

( ) PIBIC/PIBIT

2

1 INTRODUÇÃO

As cianobactérias possuem uma vasta distribuição ao longo do globo,

colonizando ecossistemas de água doce, marinhos e terrestres, e nos quais

possui uma grande importância ecológica no ciclo do carbono e como fixadoras

de nitrogênio. Recentemente, as cianobactérias têm despertado interesse na

área de bioenergia, sendo alvo de diversos projetos para a produção de

biodiesel, bioetanol e biohidrogênio (ERDRICH et al., 2014; KÄMÄRÄINEN et

al., 2012).

As cianobactérias apresentam vantagens sobre as atuais tecnologias e

matérias-primas utilizadas, pois não competem com solos agriculturáveis e

possuem grande capacidade para converter dióxido de carbono em lipídios ricos

em carbono e etanol, por exemplo. O estado do Pará possui uma grande

diversidade de cianobactérias em diferentes corpos d’água como o reservatório

da hidrelétrica de Tucuruí, de uma lagoa salina localizada no município de

Bragança ou dos reservatórios de abastecimento de Belém (BARAÚNA et al.,

2013, DALL’AGNOL et al.,2012, GRAÇAS et al.,2011, PUREZA et al.,2013).

Com base nos estudos do grupo de pesquisa do proponente, que identificou, em

algumas linhagens cianobacterianas, os genes responsáveis pela produção de

hidrogênio molecular (hidrogenases e nitrogenases), bem como codificantes de

lipases com potencial aplicação no processo de transesterificação para

produção de biodiesel.

Nesse sentido, a natureza dos projetos de bioenergia de microalgas e/ou

cianobactérias requer uma abordagem multidisciplinar envolvendo engenheiros,

biólogos e químicos, isto é, enquanto os engenheiros têm foco na projeção de

aparatos para a otimização de cultivo, os biólogos e químicos focam na seleção

de espécies e linhagens, na caracterização molecular das vias metabólicas de

produção de biocombustíveis e na manipulação genética tanto destas vias como

naquela de fixação e armazenamento de carbono (LIMA et al., 2014).

2 JUSTIFICATIVA

3

As cianobactérias são microrganismos fotossintetizantes de morfologia

unicelular ou filamentosa, que colonizam uma grande variedade de ambientes,

como oceanos, corpos de água doce, rochas, desertos, placas de gelo, bem

como apresentam relação simbiótica com plantas, liquens e protozoários (ABED

et al. ,2009). Elas realizam fotossíntese na presença de luz e, em sua ausência,

a fermentação. Devido à diversidade de hábitats onde se encontram, seu

metabolismo adaptou-se de modo a produzir uma gama de substâncias com

potencial biotecnológico.

Neste contexto, dentre outras aplicações as cianobactérias têm sido utilizadas

na biorremediação de áreas degradadas por vazamento de petróleo, na

produção de biocombustíveis e bioplásticos (ABED, 2009; RASTOGI & SINHA,

2009) e na produção de aminoácidos capazes de absorver a radiação

ultravioleta, isto é os MAAs (SHINA, 2008). Os MAAs, encontrados em muitos

microrganismos aquáticos e em alguns poucos terrestres, como fungos, algas

eucarióticas e cianobactérias, são substâncias solúveis em água caracterizadas

por um anel aminociclohexenimina ligado a um aminoácido, aminoálcool ou

aminogrupo (BANDARANAYAKE, 1998). O anel geralmente tem uma

subunidade de glicina no terceiro carbono.

Alguns MAAs também contêm ésteres de sulfato ou ligações glicosídicas

através dos substituintes iminas. Diferenças nos espectros de absorção dos

MAAs ocorrem devido às variações nos grupos laterais e nos substituintes do

nitrogênio. Um número de MAAs tem seu máximo de absorção na região da

radiação UV-B enquanto outros absorvem na UV-A. Sua forte absorção entre os

comprimentos de onda 310 a 360 nm, seu alto coeficiente de extinção molar

(€=28,100-50,000 M-1cm-1) (KLISCH, 2008) e fotoestabilidade em água doce ou

salgada apoiam a ideia de que eles apresentam papel fotoprotetor, visto que

estes compostos podem dissipar a radiação absorvida como calor sem produzir

espécies reativas de oxigênio.

Enquanto os MAAs conferem proteção aos organismos que possuem a via do

chiquimato. As cianobactérias produtoras de MAAs são abundantes em

ambientes hipersalinos. Dois MAAs foram obtidos de uma linhagem de

4

Euhalothece sp. que crescia, sob luminosidade intensa, em uma crosta de

gesso em uma lagoa hipersalina, um tendo máximo de 331 e outro de 362 nm.

O primeiro, deles, identificado como micosporina-2-glicina, foi pela primeira vez

descrito em cianobactérias, e o segundo foi identificado como Euhalothece-362,

o que se fazia inferir que Euhalothece sp. utiliza micosporina-2-glicina e

Euhalothece-362 para proteger sua maquinaria celular dos efeitos danosos da

radiação.

Na cianobactéria Synechocystis sp. PCC 6803 também foram identificados três

MAAs: o desidroxi-usujireno e o M-343, que são induzíveis por radiação UV-A, e

M-tau, induzidos tanto pela radiação UV-A como pela UV-B (ZHANG, 2007). Os

MAAs asterina-330, chinorina, palitinol e micosporina-glicina têm sido descrito

como tendo um papel fotoprotetor em cianobactérias epilíticas (que crescem em

rochas) de água doce (SOMMARUGA, 1999). Adicionalmente, chinorina e

porphyra-334 já foram observadas em Microcystis aeruginosa, o que talvez

explique sua habilidade de desenvolver e manter florações superficiais mesmo

em grandes quantidades de radiação solar (LIU, 2004). Uma colônia de

Leptolygbya da antártica foi significantemente inibida sob UV-B suplementar

enquanto a inibição de Phormidium foi menos proeminente devido seu conteúdo

25 vezes maior de MAAs que em Leptolygbya.

A indução da síntese de MAAs dependente de UV-B em Anabaena sp., Nostoc

commune e Scytonema sp. resulta na síntese de chinorina somente. A

localização exata dos MAAs nas cianobactérias não é exatamente conhecida,

porém, em Nostoc commune é extracelular e ligada a oligossacarídeos da

bainha. Os MAAs são osmoticamente ativos. Isto se deve ao fato de que

populações halotolerantes de cianobactérias acumulam altas concentrações de

MAAs.

O câncer de pele têm se tornado um problema de saúde pública. Segundo a

Organização mundial de saúde ocorrem anualmente, 2 a 3 milhões de casos de

câncer de pele do tipo não-melanoma e 132,000 casos do tipo melanoma. Com

a diminuição da camada de ozônio, a atmosfera perde sua proteção filtrante e

uma maior quantidade de radiação UV alcança a superfície da terra. Estima-se

5

que uma diminuição de 10% nos níveis de ozônio resultará em 300.000 casos

adicionais de câncer de pele do tipo não-melanoma, e 4.500 casos do tipo

melanoma. A incidência global do melanoma continua a aumentar. Entretanto,

os principais fatores que predispõe ao desenvolvimento do melanoma parecem

estar associados à exposição recreacional ao sol e a história de queimaduras

solares (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2013).

Atualmente a melhor forma de minimizar esses efeitos da radiação ultra-violeta,

consiste no uso de produtos cosméticos contendo filtros solares, em especial os

de origem natural como é o caso do Helioguard®, que contem um extrato da

alga eucariótica vermelha Porphyra sp. que é rico em MAAs. Assim, dada sua

condições climáticas as cianobactérias da região amazônica apresentam grande

potencial para a produção de MAAs que possam vir a ser utilizados na

formulação de novos produtos com atividade fotoprotetora.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Prospectar aminoácidos tipo micosporinas em extratos de cianobactérias da

região amazônica.

3.2 Objetivos Específicos

- Otimizar um protocolo de obtenção de extratos de cianobactérias;

- Otimizar método LC/MS para análise das MAAs nos extratos das

cianobactérias;

- Identificar MAAs produzidos por linhagens cianobacterianas da região

amazônica.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostragem

6

As amostras utilizadas constaram das linhagens CACIAM 14, CACIAM 53,

CACIAM 54 e CACIAM 57 da Coleção Amazônica de Cianobactérias e

Microalgas (CACIAM) do Laboratório de Tecnologia Biomolecular/UFPA,

isoladas de água doce. As linhagens foram cultivadas em meio BG-11 (ALLEN,

1968) em estufa de fotoperíodo com a programação de 13 horas claro e 11

horas escuro, com uma temperatura de 28ºC, durante 49 dias.

4.2 Obtenções de Extratos

As culturas dedicadas à análise de metabólitos foram centrifugadas em

condições estéreis numa rotação de 5500 rpm por 45 minutos a 20°C. Após

desprezo do sobrenadante, à biomassa precipitada foi, então, adicionado 5 mL

de metanol. Esta mistura foi sonicada com uso do sonicador Unique DES500

por 60 segundos e armazenada a 4°C por 12 h. Em seguida, após centrifugação

durante 5 minutos e 5500 rpm a 20°C o sobrenadante foi retirado e monitorado

espectrofotometricamente entre 310 e 360 nm, com uso do espectrofotômetro

Biospectro SP-220. À biomassa foi adicionado um novo volume de 5 ml de

metanol (grau HPLC), seguida de mistura em vórtex por 1 min. Após nova

centrifugação por 5 minutos e 5500 rpm a 20°C, o sobrenadante foi novamente

monitorado como descrito acima. Estas extrações com metanol foram repetidas

até a não absorção espectrofotométrica. Os volumes de sobrenadante coletados

foram misturados até um total de 50 mL de extrato bruto. Esse extrato bruto (50

mL) foi particionado líquido-líquido de acordo com a seguinte proporção: 50 mL

de extrato bruto, 20 mL de metanol, 60 ml de clorofórmio, e 30 mL de água

ultrapura. Com auxílio de um funil de decantação, a fase superior foi transferida

para um novo frasco Erlemeyer. À fase inferior (do funil de decantação) foram

adicionados mais 60 mL de clorofórmio, 40 mL de metanol e 10 mL de água.

Essa mistura foi mais uma vez particionada, com recolhimento da fase superior,

que foi adicionada àquela coletada anteriormente. As amostras obtidas foram

secas em speedvac a 30°C e redissolvidas em 1 mL de ácido acético 0,02%.

4.3 Análises de MAAs por Espectrometria de massas

Uma análise preliminar foi feita por infusão direta num espectrômetro de massas

AB Sciex QTRAP 5500 com analisador triplo quadrupolo, de baixa resolução.

7

Tal espectro MS1(figura 1) foi obtido e apresenta uma faixa de varredura de

relação m/z 300 a 600. A fonte de ionização utilizada foi a de electrospray. Na

configuração das condições de fonte, foram testadas utilizadas voltagem de

cone no valor de 35 e 40 eV, e a voltagem do spray de 3500 e 4000 V.

4.4 Análises de MAAs por Cromatografia líquida de Alta Eficiência.

Cem microlitros da amostra obtida foram diluídos para 1 mL de ácido acético

0,02% em Metanol. As amostras foram analisadas com auxilio de um HPLC

Agilent 1200 series com bomba capilar binária, injetor automático e coluna em

temperatura ambiente (17°C). A programação da fase móvel constou de um

sistema isocrático com tempo de corrida de 20 minutos, sendo o solvente A

solução de ácido acético na concentração de 0,02% e o solvente B, metanol.

Utilizou-se uma coluna Zorbax 300SB-C8 150 x 0,3 com tamanho de partícula

de 3,5 micrômetros. O fluxo utilizado foi de 10 μL/min.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Extrações de MAAs

Em sua maioria os métodos descritos na literatura mostram extrações de

cianobactérias com metanol. Foram descritos extrações com metanol 20% em

água (FERRONI et al., 2010; KEDAR; KASHMAN; OREN, 2002) e metanol

100% (BALSKUS; WALSH, 2010; SINGH et al., 2008b, 2010; SINHA et al.,

2003) e em diferentes temperaturas (SINGH et al., 2008b, 2010; SINHA et al.,

2003, KEDAR; KASHMAN; OREN, 2002, BALSKUS; WALSH, 2010; FERRONI

et al., 2010). Os trabalhos de extração também envolvem extração líquido-

líquido (SINGH et al., 2008b, 2010), filtração em MWCO (KEDAR; KASHMAN;

OREN, 2002) e Centrifugação (SINHA et al., 2003).

O método de preparo de amostra, para análises em HPLC capilar, neste

trabalho foi baseado em Cardozo (2006) e Whitehead (2002) com pequenas

alterações que se mostraram eficientes para mais um possível método de

obtenção de extratos de cianobactérias.

5.2 Análises de MAAs por LC/MS

8

Os valores de voltagem do Ionspray e da voltagem de cone para os

experimentos de MS1 que resultou em melhor intensidade de ionização foi

voltagem de cone de 40 eV, e a voltagem de Ionspray é de 4000V. A faixa de

varredura de relação m/z 300 a 600 foi escolhida numa tentativa de encontrar

MAAs sem a necessidade de fragmentação dos mesmos. Neste experimento de

MS1 não foram observados íons de relação massa/carga sugestiva de MAAs

(Tabela 01). Contudo, a presença de íons mais concentrados pode mascarar a

de íons menos concentrados.

Tabela 01: Relações massa/carga a serem monitoradas

MAA Peso molecular [MH+] Micosporina-glicina 246

Palitina 245 Palitinol 303

Asterina-330 289 Chinorina 333

Porphyra-334 347 Paliteno 286

Ácido Palitênico 329

Figura 01: Espectro de massas modo full scan (MS1) dos metabólitos da linhagem CACIAM 14(Cyanobium

sp.)

9

Para o experimento de MS2 os valores da voltagem do ionspray foram de 4000 V, alta pressão de colisão, voltagem de cone de 60 eV e energia de colisão de 20 eV. As aquisições dependentes de informação selecionaram cinco dos íons mais abundantes que excederam a intensidade de 10000. Os valores de massa analisadas foram os valores protonados de palitina, micosporina-glicina, paliteno, asterina-330, palitinol, chinorina, ácido palitênico e porphyra-334, conforme a tabela 01.

O espectrograma de MS2 (Figura 02) foi obtido e foi possível observar um padrão de fragmentação que indica a presença do MAA Chinorina que possui a relação m/z de 333(Ver Tabela 01). Outros indícios que apontam a presença da Chinorina são os íons de fragmentos entre ele, o fragmento de m/z 186(Tabela 02), o qual de acordo com Whitehead & HEDGES (2002) é diagnóstico da presença de MAAs. Além de fragmentos de m/z 255, 241, 230 e 211(Tabela 02), também reportados por Whitehead & Hedges (2002), que reforçam a presença de chinorina.

Figura 02: Espectro de fragmentação (MS2) dos íons m/z 333 observados no experimento de

infusão direta dos metabólitos da linhagem cianobacteriana CACIAM 14 (Cyanobium sp.).

Tabela 02: Dados espectrais de massa em Whitehead (2002).

MAA Peso molecular

Fragmentos Referências

Micosporina-glicina

245 [MH+] 246, 228, 210, 200, 182, 168, 146

Palitina 244 [MH+] 245, 230, 209, 199, 186, 184, 162, 155, 150, 137

(WHITEHEAD; HEDGES,

10

Palitinol 302 [MH+] 303, 288, 243, 231, 199, 197, 186, 168, 150, 137.

2002)

Asterina-330 288 [MH+] 289, 273, 243, 230, 213, 199, 197, 186, 168, 150, 137

Chinorina 332 [MH+] 333, 255, 241, 230, 211, 197, 186, 185, 168, 137

Porphyra-334 346 [MH+] 347, 303, 243, 231, 199, 197, 186, 168, 151, 137

Paliteno 284 [MH+] 285, 241, 223, 205, 197, 195, 193, 179, 166, 149, 137

Ácido Palitênico 328 [MH+] 329, 314, 296, 283, 268, 251, 241, 237, 225, 197, 193, 182, 175, 150, 138

5.2.1 Análise cromatográfica

O cromatograma (Figura 03) mostra o resultado da análise preliminar cromatográfica do extrato obtido para a linhagem CACIAM 14, sendo este um cromatograma de íons totais. A identificação de MAAs por cromatografia concentrou-se primeiramente em íons precursores com relação m/z 333 (Chinorina), resultantes do experimento de MS1. Contudo, pela falta de um padrão de identificação de injeção capilar de MAAs não foi possível identificar a presença da chinorina.

Figura 03: Cromatograma de íons totais. CACIAM14(Cyanobium sp.).

11

Em relação aos íons precursores do experimento MS2 revela a presença de

isóbaros que pode ser confirmada pela detecção de vários íons de m/z 333 em

diferentes tempos de retenção (Figura 04) na análise cromatográfica. No

presente estudo, estes íons fragmentos (m/z= 186 e 197) apareceram no

mesmo tempo de retenção de m/z 333 (Figura 05), sugerindo a produção de

chinorina, cuja m/z = 333, pela linhagem CACIAM 14 (Cyanobium sp.).

Figura 04: Seleção de íons precursores de m/z 333. CACIAM (Cyanobium sp.).

Na figura 05 têm-se o extrato de fragmentos oriundos dos íons de m/z 333, no tempo de retenção 9 minutos, é possível observar os fragmentos 186 e 197, que tanto Whitehead & Hedges (2002) quanto Cardozo (2006) sugerem como diagnóstico para a presença de MAAs.

Figura 05: Seleção de íons filho (mz/ 186 em azul e 197 em vermelho) dos íons precursores de m/z 333. CACIAM14(Cyanobium sp.).

6 PUBLICAÇÕES

Até o fim da execução deste projeto não foi gerada nenhuma publicação relativa a esses resultados.

12

7 CONCLUSÃO

O meio de cultivo BG-11 para cianobactérias foi baseado em Allen (1968), e

mostrou-se eficiente tanto para o crescimento das linhagens como para a

produção de biomassa. O método de extração também se mostrou eficiente,

porém há necessidade de realizar otimizações na extração para minimizar a

quantidade de contaminantes interferentes nas amostras. A cromatografia

capilar é uma técnica que pode ser utilizada para análise de MAAs

especialmente acoplada a espectrometria de massas com fonte de ionização de

Electrospray, devido sua alta sensibilidade, e também por necessitar de

pouquíssima quantidade de amostra.

Os dados até então obtidos nos levam a creditar que a cianobactéria CACIAM

14 (Cyanobium sp.) é um potencial alvo para a produção de MAAs. Devido ter

sido isolada do ambiente regional, possui adaptação para as condições locais o

que facilitaria sua utilização em aplicações biotecnológicas que gerem produtos

de alto valor agregado e ao mesmo tempo valorizem a biodiversidade

amazônica de maneira sustentável.

8 REFERÊNCIAS

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DIFICULDADES: Houveram problemas técnicos relacionados ao LC/MS que atrasaram as análises dos espectros preliminares dos MAAs, porém os mesmos foram resolvidos permitindo identificação preliminar de alguns dos componentes.

PARECER DO ORIENTADOR: O Thiago realizou suas atividades com interesse e responsabilidade e considero seu desempenho excelente.

DATA : 10/08/2015

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ASSINATURA DO ORIENTADOR

_________________________________________

ASSINATURA DO ALUNO

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