1

4 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é o tipo de cromatografia por eluição

mais usada para separar e quantificar as mais diversas substâncias químicas.

Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido ou mistura de solventes

líquidos, onde a amostra líquida é introduzida.

O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido pelo

mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária.

(1) partição ou cromatografia líquido-líquido;

(2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido;

(3) permuta iónica ou cromatografia iónica;

(4) cromatografia por exclusão;

(5) cromatografia por afinidade e

(6) cromatografia quiral

2

4.1 Distribuição dos diferentes tipos de cromatografia líquida com a massa

molar e a polaridade dos solutos

Mas

sa m

ola

r

Iónico

Permuta

iónica

Polar não-iónico

3

4.2 Guia para a seleção do tipo de cromatografia líquida mais adequado em

função do tipo de amostra

4

.

5

4.3 Instrumentação e equipamento auxiliar

Degasser

6

4.4 Colunas e fase estacionária

Não é comum usar-se colunas capilares com a fase estacionária suportada nas paredes

da coluna em HPLC, tal como sucede em GC

A viscosidade de um líquido é 100 a 1000 vezes superior à viscosidade de um gas

Em cromatografia líquida usam-se colunas de empacotamento

As colunas de empacotamento têm comprimento reduzido (5 - 30 cm), pelo que a sua

contribuição para a eficiência da coluna não será tão elevada como nas colunas

capilares (GC).

É necessário procurar outras contribuições para o aumento da eficiência, nomeadamente

o diâmetro médio das partículas que constituem a fase estacionária

A eficiência de separação de uma coluna de empacotamento aumenta com a diminuição

do diâmetro das partículas que constituem a fase estacionária.

7

As partículas usadas em colunas de HPLC têm:

forma esférica e

diâmetros entre 3 e 10 μm

A diminuição do tamanho da partícula confere:

i) empacotamento regular, dando origem a fluxos uniformes, o que provoca a

diminuição do termo A da equação de van Deemter

ii) equilíbrio mais rápido do soluto entre a fase móvel e estacionária, o que

provoca a diminuição do termo C da equação de van Deemter

iii) maior resistência à passagem do eluente, o que provoca o aumento da pressão

para o mesmo fluxo

O número de pratos teóricos (N) de uma coluna de comprimento L e empacotada com

partículas sólidas de diâmetro médio dp é dado aproximadamente por:

md

cmLN

p

3000

8

As colunas de HPLC são, em geral:

i) tubos de aço;

ii) comprimento entre 5 e 30 cm;

iii) diâmetro interno entre 1 e 5 mm (id = 4,6 mm, o mais usual)

Fatores de degradação das colunas

i) partículas sólidas provenientes dos eluentes ou das amostras mal filtradas

ii) interação irreversível de compostos com a fase estacionária e que a inativam

9

Proteção das colunas

uso de pré-coluna: mesma fase estacionária que a coluna analítica,

comprimento muito menor. É colocada antes da coluna e após o injetor

Retém as partículas sólidas que não conseguiriam passar através do coluna e os

compostos que iriam interagir irreversívelmente com a fase estacionária

Influência da temperatura

O aumento da temperatura favorece:

i) a degradação da fase estacionária

ii) criação de bolhas gasosas

iii) A diminuição da viscosidade da fase móvel (diminuição da pressão)

iv) diminuição do tempo de retenção (menor constante de partição e maior

coeficiente de difusão)

10

4.4.1 Características das fases estacionárias

Quanto mais regulares forem as partículas das fases estacionárias mais reprodutível é a

separação e mais eficientes são as colunas

Tipo de partículas usadas em colunas de HPLC:

i) quanto à rigidez: sólidos rígidos, semi-rígidos ou maleáveis

ii) quanto à porosidade: porosos ou com camada pelicular

iii) quanto à forma: esféricos ou irregulares

iv) quanto ao tamanho: preferem-se partículas de diâmetros reduzido.

Sólidos rígidos:

Cromatografia líquido-sólido (adsorção) e líquido-líquido (partição)

Partículas de sílica (menos vulgarmente de alumina)

i) elevada estabilidade mecânica e resistência a pressões elevadas

ii) passíveis de ligação à superfície de grupos funcionais (modificação das

características superficiais das partículas)

iii) partículas microporosas e esféricas com dimensões regulares e com elevado

grau de pureza

11

iv) solubilidade em água apreciável para pH > 8 (não se podem usar eluentes com

pH > 8)

v) hidrólise das ligações covalentes das fases ligadas para pH < 2 (as fases ligadas

só podem ser utilizadas para pH entre 2 < pH < 8)

Estrutura química da sílica

A fase estacionária mais comum em HPLC são partículas de sílica microporosas com

grau de pureza muito elevado com formato esférico e uniforme e com a superfície

modificada (cromatografia líquida com fase ligada)

12

Sílica com a superfície modificada com organosilanos

13

Parâmetro indicador da qualidade de uma modificação de fase

% de carbono da fase estacionária indica o grau de recobrimento das partículas

Indicador muito importante sobretudo se a fase ligada for apolar.

Se a cobertura for deficiente, os grupos silanol superficiais que restam, de

características polares, afectam a separação

Devido a limitações estereoquímicas, os grupos silanol superficiais nunca são todos

modificados, ficando alguns activos.

Em geral, após a modificação da superfície faz-se uma posterior modificação com um

reagente (ClSiR3 em que R = CH3) para aumentar a extensão de grupos silanol

modificados (end capping)

Compostos com grupos ácidos ou básicos podem dar origem a picos arrastados

(assimétricos) devido a interações com grupos silanol desprotegidos (não

modificados)

14

4.5 Fase móvel

As fases móveis usadas em HPLC devem:

i) ter elevada pureza

ii) dissolver os componentes da amostra, mas não reagir com eles

iii) não alterar a fase estacionária

iv) ter baixa viscosidade

v) ser compatíveis com o modo de deteção

Solventes mais utilizados como eluentes com a fase estacionária do tipo C18 (HPLC de

fase reversa)

Metanol

Acetonitrilo

Tetrahidrofurano

Água

Baixa viscosidade

pureza elevada

Janela de transmitância no UV

São miscíveis uns com os outros

15

A seleção da fase móvel é mais complexa do que em GC.

Em HPLC a fase móvel interage diretamente com os solutos e diferentes solutos têm

interações específicas com diferentes solventes.

Contudo, a característica mais importante na seleção de um solvente é a

polaridade

i) um solvente polar interage mais com solutos polares e um solvente pouco polar

interage mais com solutos pouco polares

ii) a polaridade de um solvente pode ser avaliada através do índice de polaridade,

P’ (solventes polares têm valores de P’ maiores)

A SÉRIE ELUOTRÓPICA permite obter indicações sobre a polaridade de solventes.

O índice de polaridade, P’, procura quantificar a polaridade dos solventes, desde não

polar até muito polar. A “força de eluição” de um solvente é definida para uma dada

fase estacionária (depende da fase).

16

.

17

A polaridade de uma mistura de solventes pode ser estimada a partir dos índices de

polaridade dos solventes individuais. Adopta-se média aritmética pesada.

Exemplo: Mistura de metanol e água (30:70)

P’metanol/água = 0,30P’metanol + 0,70P’água

Fase estacionária polar: deve-se usar solvente pouco polar

Solventes polares têm grande poder de eluição (exemplo: a água pode ficar

irreversivelmente ligada à sílica, tem grande poder de eluição)

Fase estacionária pouco polar: deve-se usar solvente polar

Solventes apolares têm grande poder de eluição (exemplo: solventes imiscíveis com a

água podem ficar irreversivelmente ligados à coluna, têm grande poder de eluição)

18

4.5.1 Eluição isocrática e eluição gradiente

Em HPLC pode-se alterar o poder de eluição do eluente ao longo de uma separação

através da variação da composição do eluente

Eluição isocrática: a eluição é realizada mantendo constante a composição da fase

móvel

Eluição gradiente: a eluição é realizada variando a composição da fase móvel

Separação isocrática de uma mistura de

compostos aromáticos: (1) álcool benzílico; (2)

fenol; (3) 3,4-dimetoxiacetofenona; (4)

benzoina; (5) benzoato de etilo; (6) tolueno; (7)

2,6-dimetoxitolueno; (8) 2-fenilanisol.

Eluente: Solução tampão pH 3,5 (A) e

acetonitrilo (B)

Coluna: fase reversa (C18 em partículas de

sílica - 5 µm); 25 cm x 4,6 mm

19

.

20

Eluição gradiente de uma mistura de

compostos aromáticos: (1) álcool benzílico; (2)

fenol; (3) 3,4-dimetoxiacetofenona; (4)

benzoina; (5) benzoato de etilo; (6) tolueno; (7)

2,6-dimetoxitolueno; (8) 2-fenilanisol.

Eluente: Solução tampão pH 3,5 (A) e

acetonitrilo (B)

Coluna: fase reversa (C18 em partículas de

sílica - 5 µm); 25 cm x 4,6 mm

21

Vantagens da eluição gradiente:

i) menor tempo de eluição

ii) melhor definição dos picos cromatográficos e optimização da resolução da

separação de misturas complexas

Desvantagens:

incompatibilidade com certos tipos de cromatografia e certos detectores

A utilidade de uma eluição gradiente pode ser estimada do seguinte modo:

(i) Faz-se uma variação gradiente numa gama extensa, por exemplo, entre 10% e

90% de solvente orgânico (aumento do poder de eluição) em 40 min (tg).

(ii) Se a diferença entre os tempos de retenção do soluto menos retido e mais

retido (Δtr) for tal que Δ tr /tg > 0,25, então será útil fazer uma eluição

gradiente

22

4.6 Bombas

Principais requisitos a que deve obedecer uma bomba de HPLC:

i) elevada estabilidade (fluxo sem pulsos) e reprodutibilidade do caudal debitado

ii) inerte quimicamente aos solventes usados em HPLC

Características gerais das bombas:

i) fluxos reprodutíveis até 10 mL/min (aplicações analíticas)

ii) pressão até 40 MPa (400 bar)

23

Princípio de funcionamento das bombas:

em geral, são utilizadas bombas de pistão recíproco

Utiliza-se uma bomba com dois

pistões recíprocos, de tal forma

que quando um suga a fase móvel

o outro expulsa-a para fora da

bomba (coluna)

Vantagens:

fluxo constante

permite fazer gradiente

alimenta o sistema continuamente

Desvantagens:

pode ocorrer pulsação do fluxo

24

4.6.1 Criação de gradientes

Gradiente de baixa pressão

é produzido através de um sistema de válvulas de admissão que controla a

quantidade de solvente de cada canal.

25

Gradiente de alta pressão

A mistura dos solventes é feita após o seu bombeamento. Cada solvente é bombeado

por uma bomba própria

Sistema muito preciso

dispendioso pois usa

uma bomba para cada

canal de solvente

26

4.7 Válvulas de injeção

As válvulas de injeção são

constituídas por ‘loops’ de

capacidade entre 2 e 1000 μL.

i) suportam as elevadas pressões

de funcionamento do sistema

ii) possuem duas posições, de

carga do ‘loop’ e de injeção

iii) são inertes quimicamente

iv) podem ser manuais ou automáticas

26

.

27

4.8 Detetores

Permite monitorizar o eluato que sai da coluna, dando preferência à deteção dos solutos.

Para isso, precisa de ter sensibilidade distinta para os solutos e para a fase móvel.

A propriedade física medida deverá ser específica dos solutos e pouco sensível à fase

móvel

Características gerais de um detetor:

i) elevada sensibilidade

ii) capacidade de resposta adequada às mudanças de composição do eluato

iii) resposta linear num intervalo alargado de quantidade de substância

iv) estável e período curto de estabilização

v) não deve contribuir para a dispersão (volume de célula desprezável)

vi) pouco sensível a alterações de fluxo, temperatura, composição da fase

móvel (compatível com eluição gradiente) e pressão

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Detetores de HPLC mais comuns:

i) detector espectrofotométrico UV-Vis

ii) detector espectrofotométrico de “diode array”

iii) detector fluorimétrico

iv) detector de índice de refracção

v) detector electroquímico

vi) detector de condutividade eléctrica (cromatografia iónica)

4.8.1 Detetores espectrofotométricos

A fase móvel não deve absorver ao comprimento de onda da

medição de absorvância para se conseguir a sensibilidade

máxima

Baseia-se na medição da absorvância a um dado comprimento

de onda fixo

é selectivo e de aplicação muito generalizada em HPLC

é muito versátil (200 – 900 nm)

é pouco sensível a alterações de temperatura e composição do eluente

(compatibilidade com eluição gradiente)

29

Esquema de um detector de UV-Vis.

eluente

sol. referência

monocromador

lente

janelas de quartzo

filtrofonte de radiação

policromática

fotodetector

30

Nos últimos anos surgiu um outro detetor espectrofotométrico designado por “diode

array”.

Nestes detetores consegue-se fazer a medição da absorvância a vários comprimentos de

onda simultaneamente, obtendo-se os espectros do eluato a qualquer momento da

separação cromatográfica.

31

.

32

4.8.2 Detetor de Fluorescência

Baseia-se na medição da fluorescência do eluato

i) tem elevada sensibilidade (1000 vezes mais sensíveis que os detectores de

UV-Vis)

ii) tem aplicação muito específica em HPLC (poucos compostos são

fluorescentes)

iii) dada a sua elevada sensibilidade, é comum derivatizar os solutos por forma

a torná-los fluorescentes

33

4.8.3 Detetor de Índice de Refração

Baseia-se na medição comparativa entre o índice de refracção da fase móvel pura e o

eluente que sai pela coluna

i) é um detector quasi-universal

ii) baixa sensibilidade

iii) elevada sensibilidade a alterações de temperatura e pressão

iv) resposta linear restrita

v) não é compatível com a eluição

gradiente

vi) aplica-se principalmente em

cromatografia de exclusão

34

4.8.4 Detetor Electroquímico

Baseia-se na medição da intensidade de corrente resultante de processos de oxidação ou

redução, quando se fixa o potencial aplicado ao eléctrodo de trabalho

i) elevada sensibilidade

ii) a selectividade depende do potencial aplicado

iii) é pouco reprodutível em alguns eluatos

iv) não é compatível com a eluição gradiente

eléctrodo de trabalho

eléctrodo de referênciaeléctrodo auxiliar

potenciostato de

3 eléctrodos

eluente

eluente