17 - DM_Validação de Um Método de Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) Para Doseamento Da Vitamina D Em Géneros Alimentícios. Aplicação Do Método Em Diferentes

ISEL INSTITUTO SUPERIOR DE ENGENHARIA DE LISBOA

REA DEPARTAMENTAL DE ENGENHARIA QUMICA

Validao de um mtodo de cromatografia lquida de

alta resoluo (HPLC) para doseamento da vitamina D

em gneros alimentcios. Aplicao do mtodo em

diferentes matrizes alimentares.

DIANA ISABEL SILVA PARREIRA (Licenciada)

Trabalho Final de Mestrado para obteno do grau de Mestre

em Engenharia Qumica e Biolgica

Orientadores: Doutora Maria da Graa Serras Leito Dias

Doutora Maria Celeste Serra

Jri: Doutora Isabel Maria da Silva Joo

Doutor Amin Karmali

Mestre Mariana Ramos Coelho Santos

DEZEMBRO DE 2013

Determinao da vitamina D em gneros alimentcios 2013

Instituto Superior de Engenharia de Lisboa i

Resumo

O objetivo deste trabalho foi o de realizar os ensaios de validao necessrios

acreditao de um mtodo analtico para determinao da vitamina D em matrizes

alimentares. Aps validao, o mtodo foi aplicado a matrizes que incluram papas

infantis, iogurtes, cereais, leite, ovos e massas infantis.

De forma a atingir este fim, foram otimizados procedimentos de tratamento das

amostras e validado um mtodo analtico baseado na norma europeia, EN 12821, o

qual permitiu a determinao do teor em vitamina D atravs de cromatografia lquida

de alta eficincia (HPLC) pelo mtodo do padro interno.

De forma a quantificar a vitamina D na matriz alimentar, as amostras sofreram um

processo de saponificao seguido de extrao lquido-lquido, e por fim isolamento e

concentrao atravs de cromatografia de HPLC semi-preparativa em fase normal e,

quantificao atravs de HPLC analtica em fase reversa a um comprimento de onda

de 265 nm.

De forma a validar o mtodo de HPLC foram determinados os parmetros de

validao: preciso (repetibilidade e preciso intermdia), limite de deteo e de

quantificao, recuperao e exatido.

Utilizando os resultados da validao, preciso intermdia e exatido, foi determinada

a incerteza do resultado da medio. A avaliao da incerteza total conduziu ao valor

de 26%, para o nvel de confiana de 95%.

O teor em vitamina D nas amostras analisadas variou entre 0,28 g/100 g e

22 g/100 g. Os resultados da anlise das amostras mostraram que 14% destas

apresentavam valores superiores aos indicados nos respetivos rtulos e 43% valores

inferiores aos rotulados. Tendo em consideraes as pores definidas na rotulagem

das amostras analisadas duas amostras ultrapassaram a dose diria recomendada

(5 g) se for consumida apenas uma poro (30 g).

Os resultados obtidos permitiram concluir que o mtodo validado adequado para a

determinao da vitamina D nas diversas matrizes analisadas.

Palavras-chave: Vitamina D, gneros alimentcios, validao, incerteza, HPLC.

2013 Determinao da vitamina D em gneros alimentcios

ii Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

Abstract

The objective of this study was to perform the required validation tests for accreditation

of an analytical method for determination of vitamin D in food matrices. After validation,

the method was applied to matrices that included infant porridge, yogurts, cereals, milk,

eggs and infant pasta.

In order to achieve this end, the procedures for processing samples were optimized

and was validated an analytical method based on the European standard, EN 12821,

which allowed the determination of vitamin D content using high performance liquid

chromatography (HPLC) by the method of internal standard.

In order to quantify the vitamin D in the food matrix, the samples were subjected to a

process of saponification followed by liquid-liquid extraction and finally concentration

and isolation by a normal phase HPLC semi-preparative and quantified by reverse

phase HPLC analytical on a wavelength of 265 nm.

In order to validate the HPLC method were determined the validation parameters:

precision (repeatability and inter-run precision), limit of detection and quantification,

recovery and accuracy.

Using the results of the validation, inter-run precision and accuracy, the uncertainty of

the measurement result was determined. The assessment of total uncertainty led to a

value of 26% for the confidence level of 95%.

The vitamin D content in the samples ranged from 0.28 g/100 g and 22 g/100 g. The

results of the samples analysis showed that 14% of these were higher than the values

indicated by the label and 43% lower than labeled values. Taking into consideration the

portions size defined in the samples lable, two samples exceeded the recommended

daily dose (5 g) if consumed only a portion (30 g).

The results showed that the validated method is suitable for the determination of

vitamin D in different matrices analyzed.

Keywords: Vitamin D, foodstuffs, validation, HPLC, uncertainty.


Instituto Superior de Engenharia de Lisboa iii

Agradecimentos

Em primeiro lugar gostaria de agradecer ao Instituto Nacional de Sade Doutor

Ricardo Jorge, IP, pela oportunidade de estgio e financiamento do projeto.

Ao projeto TDS EXPOSURE, o qual este trabalho est inserido e sem o qual no seria

possvel a sua realizao.

Ao Departamento de Alimentao e Nutrio e um agradecimento especial, Doutora

Antnia Calhau, por me receber com amabilidade e possibilitar a realizao deste

trabalho durante os meses de trabalho.

s minhas orientadoras, Doutora Maria Celeste Serra e Doutora Maria da Graa Dias,

pela orientao ao longo dos meses de trabalho principalmente na fase final, pela

permanente disponibilidade, amizade e apoio incondicional demonstrados em todas as

etapas, o meu muito obrigada.

Ao meu colega e melhor amigo, Bruno Sargao, pelo apoio nos momentos mais

difceis, sempre com palavras de motivao e orientao e pela parceria no s

durante a realizao do estgio mas durante todo o nosso percurso acadmico.

Aos meus pais, Jernimo Parreira e Vitorina Parreira, e irm, Sara Parreira, por todo o

apoio e presena em todas as etapas importantes na minha vida.


iv Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

ndice Geral

Resumo ......................................................................................................................... i

Abstract ........................................................................................................................ ii

Agradecimentos ............................................................................................................ iii

ndice de Figuras ......................................................................................................... vi

ndice de Tabelas ........................................................................................................ vii

Lista de Abreviaturas .................................................................................................. viii

1. Enquadramento do Tema ...................................................................................... 1

2. Introduo .............................................................................................................. 3

2.1. Vitaminas ........................................................................................................ 3

2.2. Vitamina D ...................................................................................................... 3

2.2.1. Histria e Descoberta da Vitamina D ....................................................... 3

2.2.2. Sntese da Vitamina D ............................................................................. 4

2.2.3. Ocorrncia Natural da Vitamina D ........................................................... 7

2.2.4. Caraterizao Fsico-Qumica da Vitamina D .......................................... 7

2.2.5. Funes da Vitamina D ........................................................................... 9

2.2.6. Deficincia em Vitamina D ..................................................................... 10

2.2.6.1. Fatores de Risco ............................................................................ 11

2.2.6.2. Deficincia em Vitamina D na Europa ............................................ 12

2.2.6.3. Sintomas de Deficincia em Vitamina D ......................................... 13

2.2.7. Optimizao dos Nveis de Vitamina D no Soro ..................................... 14

2.3. Suplementao da Vitamina D...................................................................... 14

2.4. Dose Diria Recomendada ........................................................................... 15

2.5. Toxicidade da vitamina D .............................................................................. 17

2.6. Hipersensibilidade vitamina D .................................................................... 18

3. Mtodos Analticos para a Determinao de Vitamina D ..................................... 18

3.1. Princpios de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) .................... 21

4. Validao de um Mtodo Analtico ....................................................................... 24

5. Objetivos.............................................................................................................. 34

6. Materiais e Mtodos ............................................................................................ 35

6.1. Reagentes e Padres ................................................................................... 35

6.2. Equipamento ................................................................................................ 36

6.3. Preparao de Solues............................................................................... 38

6.3.1. Solues Padro ................................................................................... 38

6.4. Amostras ...................................................................................................... 41


Instituto Superior de Engenharia de Lisboa v

6.4.1. Preparao das amostras ...................................................................... 43

6.4.2. Procedimento Experimental ................................................................... 45

6.4.3. Quantificao do Teor de Vitamina D .................................................... 47

7. Resultados e Discusso ...................................................................................... 48

7.1. Estudos de Otimizao dos Mtodos de Tratamento das amostras .............. 48

7.2. Validao do Mtodo de Anlise ................................................................... 52

7.3. Teor de vitamina D nas amostras ................................................................. 64

8. Concluso ............................................................................................................ 69

9. Propostas de Trabalho Futuro ............................................................................. 70

10. Referncias Bibliogrficas ................................................................................ 71

ANEXOS ..................................................................................................................... 80

Anexo 1 ...................................................................................................................... 81

Anexo 2 ...................................................................................................................... 87

Anexo 3 ...................................................................................................................... 88

Anexo 4 ...................................................................................................................... 89

Anexo 5 ...................................................................................................................... 90

Anexo 6 ...................................................................................................................... 95

Anexo 7 ...................................................................................................................... 96

Anexo 8 ...................................................................................................................... 99


vi Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

ndice de Figuras

Figura 1 Estrutura molecular do 1,25-di-hidroxiergocalciferol (1,25(OH)2D2) e do

1,25-di-hidroxicolecalciferol (1,25(OH)2D3) ou calcitriol [14] .......................................... 5

Figura 2 Esquema do processo sofrido pela vitamina D at sua ativao [16] ........ 6

Figura 3 Estrutura molecular da vitamina D2 (ergocalciferol) e da vitamina D3

(colecalciferol) [14] ........................................................................................................ 8

Figura 4 - Componentes de um cromatografo de HPLC [113] ..................................... 22

Figura 5 Equipamento de HPLC analtico ................................................................ 36

Figura 6 - Equipamento de HPLC semi-preparativo .................................................... 37

Figura 7 Reta de calibrao para a anlise da vitamina D3 ...................................... 53

Figura 8 Incerteza padro combinada relativa para as amostras de papa infantil .... 62

Figura 9 Cromatograma dos padres de vitamina D3 e D2, 1 Vitamina D2 (TR:

20,423 minutos) e 2 Vitamina D3 (TR: 21,673 minutos) ............................................ 63

Figura 10 Cromatograma da amostra de papa A, 1 Vitamina D2 (TR: 20,517

minutos) e 2 Vitamina D3 (TR: 21,730 minutos) ....................................................... 63

Figura 11 Teores em vitamina D determinados para as amostras analisadas .......... 66


Instituto Superior de Engenharia de Lisboa vii

ndice de Tabelas

Tabela 1 Recomendaes da ingesto diria de vitamina D segundo o IOM [79] .... 16

Tabela 2 Amostras em estudo neste trabalho .......................................................... 42

Tabela 3 Teores de vitamina D3 em amostras de papa infantil C sujeitas a

saponificao com diferentes volumes de soluo de KOH a 60% ............................. 49

Tabela 4 Teores de vitamina D3 determinados na papa infantil C para os dois tempos

de saponificao ......................................................................................................... 50

Tabela 5 Teores de vitamina D3 em amostras de papa infantil C sujeitas a extrao

com diferentes solventes ............................................................................................ 51

Tabela 6 Teores de vitamina D e volumes de soluo me (10 g/mL) para construir

as curvas .................................................................................................................... 53

Tabela 7 Teor de vitamina D3 na amostra papa A .................................................... 54

Tabela 8 Razo sinal/rudo para os teores de 0,1, 0,15 e 0,5 g/mL em vitamina D 55

Tabela 9 Recuperao no LQ e presena do pico no LD para a vitamina D2 e D3 ... 56

Tabela 10 Coeficiente de variao da repetibilidade ................................................ 57

Tabela 11 Coeficiente de variao da preciso intermdia ...................................... 57

Tabela 12 Recuperao de vitamina D2 em papas infantis ...................................... 58

Tabela 13 Efeito do tempo de armazenamento nas reas dos picos de vitamina D2 e

de vitamina D3 de 0,5 g/mL ....................................................................................... 60

Tabela 14 Repetibilidade do injetor .......................................................................... 61

Tabela 15 Vitamina D nas amostras analisadas (rotulado e determinado) ............... 65


viii Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

Lista de Abreviaturas

1,25(OH)2D 1,25-di-hidroxivitamina D

25OHD 25-hidroxivitamina D

AOAC Association of Official Analytical Chemists

CEN Comit Europeu de Normalizao

CV Coeficiente de Variao

DAN Departamento de Alimentao e Nutrio

DAD Detetor com Rede de Dodos

DBP Protena transportadora de vitamina D

D Binding Protein

DDR Dose Diria Recomendada

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ESI Ionizao por eletrospray

Electrospray ionization

HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

HR Humidade Relativa

INSA Instituto Nacional de Sade Doutor Ricardo Jorge, IP

IOM Institute of Medicine

KOH Hidrxido de Potssio

LD Limite de Deteo

LQ Limite de Quantificao

MEOH Metanol

MRC Material de Referncia Certificado

MS Espetrometria de Massa

MS/MS Espetrometria de Massa sequencial

Tandem MS/MS

NIST National Institute of Standards Technology

NP-HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia de fase normal

OMS Organizao Mundial de Sade

PI Padro Interno

PTH Hormona Paratiride

RIA Radioimunoensaio

Radioimmunoassay

RP-HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia de fase reversa

SPE Extrao de fase slida


Instituto Superior de Engenharia de Lisboa ix

TR Tempo de Reteno

UHPLC Cromatografia Lquida de Ultra Eficincia

UI Unidades Internacionais

UV Ultravioleta


Instituto Superior de Engenharia de Lisboa 1

1. Enquadramento do Tema

Ao longo dos sculos, a vitamina D tem sido alvo de grande interesse e estudo devido

sua ao sobre a sade ssea. Nos dias de hoje, ainda motivo de investigao,

sendo o seu consumo associado preveno de vrias doenas, tais como raquitismo

e osteomalacia.

Em muitos pases desenvolvidos tem-se verificado um crescimento da suplementao

em vitamina D em vrios produtos alimentares. Este facto est relacionado com a

crescente deficincia desta vitamina, devido a inmeros fatores: alteraes dos

hbitos alimentares; estilo de vida com cada vez menos exposio solar; utilizao de

vesturio que cobre uma grande percentagem de pele; cor de pele (quantidade de

melanina), e tambm a idade [1].

A deficincia em vitamina D pode originar inmeros malefcios para a sade humana,

nomeadamente deformaes na estrutura ssea e hiperparatiroidismo secundrio.

Deste modo, em populaes em que a ingesto de vitamina D atravs da alimentao

no suficiente existe a necessidade de suplementao preventiva para que os

indivduos ingiram uma quantidade prxima da dose diria necessria. A dose diria

recomendada (DDR) em Portugal apresenta um valor de 5 g/dia [2].

Considerando o facto de os alimentos conterem teores relativamente baixos de

vitamina D e o facto de que a sua ingesto em quantidades elevadas pode conduzir a

toxicidade, esta vitamina constitui um desafio em termos analticos no que se refere ao

limite de quantificao.


2 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa



2. Introduo

2.1. Vitaminas

As vitaminas so compostos orgnicos essenciais para o normal funcionamento do

corpo humano, apresentando um papel importante em muitas das suas funes

biolgicas, pertencendo por isso ao grupo dos micronutrientes. O corpo humano no

consegue produzir a maioria das vitaminas, sendo estas obtidas atravs da

alimentao e de suplementos vitamnicos.

As vitaminas podem ser classificadas em dois grupos de acordo com a sua

solubilidade, as hidrossolveis e as lipossolveis.

As vitaminas solveis em gua, vitaminas do complexo B e a vitamina C, no so

armazenadas nos tecidos corporais em elevadas quantidades e os excessos so

geralmente excretados na urina.

Pelo contrrio, as vitaminas solveis em lpidos esto ligadas ao metabolismo lpidico

e so geralmente insolveis ou pouco solveis em gua, incluindo-se neste grupo as

vitaminas A, D, E e K, e os carotenides (alguns dos quais percursores da vitamina A).

Estas vitaminas so armazenadas nos tecidos do corpo humano, no tecido adiposo,

podendo a toma excessiva deste tipo de vitaminas, em alguns casos, originar efeitos

txicos nomeadamente leses no fgado (vitamina A) [3,4].

2.2. Vitamina D

2.2.1. Histria e Descoberta da Vitamina D

O efeito benfico da luz solar na cura do raquitismo em crianas foi conhecido no

incio de 1800, mas apenas um sculo depois foi descoberta a causa desse efeito.

Em 1921, Sir Edward Mellanby, foi o primeiro a demonstrar que o raquitismo se tratava

de uma doena nutricional e que o leo de fgado de bacalhau apresentava um fator

que a prevenia. Em 1922, McCollum e os seus colaboradores realizaram estudos com

o leo de fgado de bacalhau, no qual foi injetado oxignio. Neste processo, os

investigadores conseguiram identificar a presena de um fator A posteriormente

denominado de vitamina A e de um outro fator, a vitamina D. Ainda em 1922, foi

descoberto que a vitamina D estava presente na frao insaponificvel do leo de

fgado de bacalhau, tendo sido sugerido que esta apresentava uma estrutura

semelhante ao colesterol.

Em 1924, dois investigadores (Steenbock e Black) descobriram que ao irradiarem

raes para ratos com luz ultravioleta (UV), estas apresentavam os mesmos



benefcios que a irradiao nos prprios ratos raquticos. Pouco depois desta

descoberta, os investigadores Hess e Weinstock conseguiram com sucesso aumentar

a concentrao de vitamina D em alimentos expostos luz UV [5].

Em 1927, o ergoesterol foi identificado como o precursor do ergocalciferol (vitamina

D2) e o 7-des-hidrocolesterol como precursor do colecalciferol (vitamina D3) em 1934

[6]. Em 1928, o prmio nobel de qumica foi atribuido a Adolf Windaus devido aos seus

estudos acerca da constituio dos esteris e da sua relao com as vitaminas [7],

sendo este o primeiro prmio atribudo a um estudo com enfoque nas vitaminas. A

vitamina em estudo neste trabalho tratava-se da vitamina D.

2.2.2. Sntese da Vitamina D

Depois da descoberta da vitamina D por Sir Mellanby em 1921, foram realizadas

diversas pesquisas com o objetivo de obter uma melhor compreenso das suas

propriedades fisiolgicas. Este nutriente foi primeiramente classificado como uma

vitamina essencial para o desenvolvimento normal do esqueleto e a manuteno do

equilbrio em clcio no corpo humano. Contudo, foi revelado que a vitamina D pode ser

classificada como uma hormona devido ao facto de ser sintetizada como resultado da

exposio a raios UVB (280 a 320 nm), mas atualmente continua a ser referida como

uma vitamina.

Esta vitamina apresenta-se sob a forma de vitamina D2 (ergocalciferol) existente

naturalmente em plantas e fungos e vitamina D3 (colecalciferol) existente em animais,

sendo ambas denominadas vitamina D [8].

A vitamina D2 sintetizada pela irradiao dos raios UV do ergosterol, esterol presente

na membrana de fungos [9].

A sntese de vitamina D3 realizada pela ao dos raios UV no substrato 7-des-

hidrocolesterol presente na pele dos animais. A radiao absorvida pelo 7-des-

hidrocolesterol, convertendo-o em pr-vitamina D3. Com a temperatura corporal, a pr-

vitamina D3 convertida em vitamina D3, mas este processo bastante moroso,

podendo demorar vrias horas. A contnua irradiao converte a pr-vitamina D3 ou a

vitamina D3 em vrios produtos denominados por produtos sobreirradiados [10].

Uma vez produzida na pele ou absorvida por ingesto, a vitamina D transportada na

corrente sangunea por uma protena transportadora de vitamina D (formando um

complexo protena-vitamina D (DBP - D Binding Protein)) at ao fgado onde

submetida a uma hidroxilao pela enzima 25-hidroxilase no carbono 25 formando

assim a 25-hidroxivitamina D (25OHD), o metabolito circulante maioritrio de vitamina



D. Outros tecidos, como a pele, a glndula supra-renal, os pulmes, rins e ossos,

tambm apresentam a capacidade de produo deste metabolito [11].

A absoro de vitamina D largamente refletida na concentrao de 25OHD na

corrente sangunea [12], e essa concentrao utilizada como avaliao da

concentrao da vitamina D no sangue [9,13].

O metabolito 25OHD no apresenta a atividade biolgica necessria para as funes

biolgicas realizadas pela vitamina D, sendo necessria nova hidroxilao. Esta

hidrlise d origem ao metabolito 1,25-di-hidroxivitamina D, a forma ativa da vitamina

D.

A hormona ativa 1,25-di-hidroxivitamina D, figura 1, tambm denominada de calcitriol,

produzida nos rins e exportada para a corrente sangunea [9,13]. A enzima

responsvel pela produo do calcitriol a 1--hidroxilase. Esta enzima sintetizada

em vrios tecidos como os do clon, prostata, pulmo, tecido mamrio, em

macrfagos e clulas paratirides [15], mas o calcitriol produzido em tecidos no

renais apenas apresenta efeito local [9].

Na figura 2 apresentado um esquema sntese da produo da hormona ativa

1,25(OH)2D.

Figura 1 Estrutura molecular do 1,25-di-hidroxiergocalciferol (1,25(OH)2D2) e do 1,25-di-

hidroxicolecalciferol (1,25(OH)2D3) ou calcitriol [14]



Tanto o calcitriol como o 25OHD sofrem processos catablicos. O calcitriol

catabolizado na maioria das clulas pela 24-hidroxilase, sendo a produo desta

enzima induzida pelo prprio calcitriol, quando se encontra em nveis anormalmente

elevados no organismo, e forma a 1,24,25-tri-hidroxivitamina D. A 25OHD tambm

catabolizada por essa enzima e convertida em metabolitos altamente polares e

excretados pela blis, tais como cido calcitrico, que so solveis em gua [17,18].

conhecido que o metabolismo de inativao da 25OHD atravs desta via

acelerado com a ingesto de pouco clcio ou a presena de nveis elevados de

hormona paratiride e calcitriol no organismo [19].

A vitamina D pode tambm ser obtida a partir de vrias fontes de alimentao, como

por exemplo a ingesto de peixes gordos [8].

Figura 2 Esquema do processo sofrido pela vitamina D at sua ativao [16]



2.2.3. Ocorrncia Natural da Vitamina D

A maioria dos produtos naturais apresenta-se como uma fonte pobre em vitamina D,

contribuindo com menos de 10% para a dose diria recomendada [9].

As fontes naturais mais ricas em vitamina D3 so os leos de fgado de peixe,

especialmente leo de fgado de bacalhau, sendo que possuem igualmente uma

grande quantidade de vitamina A, a qual interfere com a atividade da vitamina D de

onde podem resultar efeitos adversos para os ossos [20].

Pequenas quantidades da vitamina D3 podem ser tambm encontradas em partes

comestveis de peixes com uma elevada percentagem de gordura, fgado de

mamferos, ovos e produtos lteos. A concentrao de vitamina D3 no leite apresenta

uma variao sasonal, que pode estar relacionada com a quantidade de luz solar

disponvel para a converso da 7-des-hidrocolesterol da pele do animal em

colecalciferol.

A vitamina D2 pode ser encontrada em cogumelos selvagens ou cogumelos que

sofreram um processo de radiao com raios UV, podendo apresentar um teor entre

30 a 100 g de vitamina D2 por 100 g de cogumelos [9].

Os cereais, vegetais e fruta no apresentam vitamina D, enquanto a carne, aves e

peixes brancos apresentam uma quantidade insignificante de vitamina D3 [3,5].

Como as fontes dietticas naturais de vitamina D so escassas, tem sido necessrio a

sua suplementao em alguns dos produtos mais consumidos com o objetivo do

consumidor ingerir a dose diria recomendada. Estes produtos alimentares

enriquecidos, como os produtos lteos (leite e iogurtes), cereais e po que esto

disponveis no mercado em algumas reas geogrficas, como por exemplo, nos

Estados Unidos da Amrica e no norte da Europa, fazem parte de uma poltica de

preveno da sade [21,22].

2.2.4. Caraterizao Fsico-Qumica da Vitamina D

A vitamina D3 e a vitamina D2, classificadas quimicamente como seco-esteris (um dos

quatro anis que as constituiem apresenta-se quebrado), so estruturalmente

semelhantes sendo a sua origem atribuda a irradiao UV dos esteris das pro-

vitaminas respetivas [4].

Estruturalmente, a vitamina D2 e D3 diferem apenas no carbono 17 da cadeia lateral,

onde a vitamina D2 apresenta uma ligao dupla e um grupo metil adicional, como

pode ser observado na figura 3 [5].



Figura 3 Estrutura molecular da vitamina D2 (ergocalciferol) e da vitamina D3

(colecalciferol) [14]

As vitaminas D2 e D3 quando puras apresentam-se sob a forma de pequenos cristais

brancos amarelados que no possuem odor [5].

As formas comercialmente disponveis incluem cristais solveis em lpidos para o uso

em alimentos com grande percentagem de gordura e verses encapsuladas e

estabilizadas para o uso em produtos secos que so posteriormente re-hidratados ou

em produtos base de gua [3].

As vitaminas D2 e D3 so insolveis em gua, solveis em etanol a 95%, acetona,

vrias gorduras e leos e tambm em benzeno, clorofrmio e ter [5].

O estudo do efeito da temperatura (25 e 40C) e da humidade relativa (HR) (ar seco a

45% HR e ar muito hmido a 85% HR) na estabilidade da vitamina D sob a forma de

p e na ausncia de luz foi realizado pelos investigadores Grady e Thakker em 1980.

Estes investigadores observaram que depois de 21 dias, as amostras de vitamina D2

armazenadas em ar seco a 25C apresentavam apenas 66% de ergocalciferol,

enquanto as amostras armazenadas sob ar muito hmido apresentavam teores acima

de 95%. A vitamina D3 apresentou-se mais estvel, e em ambos os cenrios

apresentaram uma percentagem superior a 99%. No entanto, ambos os compostos

so menos estveis a temperaturas mais elevadas. As amostras de vitamina D2

armazenadas a 40C e 85% HR apresentavam 87% de vitamina D2 e as armazenadas

a 40C e 45% HR apenas apresentava 20%. Sob as mesmas condies, as amostras

de vitamina D3, armazenadas durante 7 dias a 40C e 85% HR continham apenas 15%

de vitamina D3 restante, as armazenadas a 40C e a 45% HR continham cerca de 65%

[23].



Em solues oleosas a 0C, a vitamina D perde cerca de 50% da sua atividade

biolgica entre 3 a 5 anos, enquanto em emulses esta perda demora apenas trs

semanas [24]. A vitamina D tambm instvel em solues cidas ou sob condies

moderamente acdicas, que provocam a isomerizao das suas molculas em dois

ismeros, o ismero 5,6-trans e o ismero isotaquisterol [25].

Em soluo, as vitaminas D2 e D3 exibem uma isomerizao termicamente reversvel

originando as suas pr-vitaminas correspondentes, formando um equilbrio na mistura.

As taxas de isomerizao da vitamina D2 e D3 so aproximadamente iguais e no so

afetadas pelo solvente, luz ou catlise [26,27].

Contudo no estado slido, a vitamina D no isomeriza. Alm da isomerizao trmica,

as solues de vitamina D em solventes orgnicos so bastante estveis, sendo que

no deve existir contacto entre estas e oxignio, luz ou cidos [5].

Deste modo, quando libertada da matriz alimentar, a vitamina D suscetvel

decomposio na presena do oxignio, luz, cidos e gua, o que pode ser

comprovado atravs da diminuio de absorvncia a 265 nm (UV). As principais

condies que promovem a destruio da vitamina D incluem a exposio a correntes

de ar (especialmente com correntes quentes) e condies cidas. Contudo, os

produtos resultantes da sua decomposio, que podem ser diferentes em cada caso,

so separveis da vitamina D atravs de cromatografia [25,28].

A vitamina D resiste ao processo de fumagem do peixe, ao processo de pasteurizao

e esterilizao do leite, e secagem por pulverizao de ovos. Quando utilizada para

enriquecimento de leites infantis, comum ocorrer destruio de 25 a 35% da vitamina

D adicionada durante o processo de secagem [29].

Todos os compostos de vitamina D, quando numa soluo etanlica, possuem um

amplo espetro de absoro na regio ultravioleta que atinge um mximo a 265 nm

[30].

2.2.5. Funes da Vitamina D

A funo mais conhecida e estudada do composto ativo da vitamina D, o calcitriol, est

relacionada com a regulao do metabolismo de clcio e do fsforo. O composto

maximiza a absoro de clcio nos intestinos e contribui para uma melhor

mineralizao ssea, reduzindo o risco de fraturao [8,9,10]. Como a maioria dos

alimentos no contribui com um grande aporte de clcio e a sua absoro no



particularmente eficiente, uma absoro ativa bastante importante para compensar

as perdas inevitveis de clcio que ocorrem na sua maioria atravs da urina [31,32].

Os compostos de vitamina D apresentam tambm um papel importante no

funcionamento muscular e mais recentemente, tem sido especulado que uma

concentrao adequada de vitamina D pode proteger contra inmeras doenas, entre

as quais, a diabetes, infees e at alguns tipos de cancro [33].

A sntese de vitamina D e o seu metabolismo na pele podem contribuir para uma

fotoproteo endgena. A sntese dos anlogos de vitamina D com menos efeitos

secundrios clcemicos est a resultar no desenvolvimento de uma nova classe de

agentes anticancerigenos. Alm disso, dados epidemolgicos salientam tambm a

importncia da concentrao da vitamina D no sangue na proteo contra o cancro [8].

2.2.6. Deficincia em Vitamina D

A deficincia em vitamina D apresenta-se como uma das situaes mais comuns e

no diagnosticada um pouco por todo o mundo. Alguns estudos recentes comprovam

que esta deficincia pode tornar-se pandmica [34,35]. No existe uma concordncia

cientfica sobre a quantidade de 25OHD necessria no soro para um nvel de vitamina

D adequado. A maioria dos investigadores concorda que a concentrao de 25OHD

no soro (combinao de D2 e D3) deve ser superior a 50 nmol/L, mas outros afirmam

que dever ser superior a 75 ou 100 nmol/L [36].

Em geral, considera-se que h deficincia em vitamina D quando os nveis totais de

25OHD so inferiores a 50 nmol/L. Por outro lado a insuficincia definida para

valores de 25OHD no soro compreendidos entre 50 a 74 nmol/L [37,38].

Uma deficincia em vitamina D severa (



e deformaes na estrutura ssea. Em adultos, pode originar a osteomalacia, fraqueza

muscular [44], osteoporose e fraturas [45].

As duas formas de vitamina D, vitamina D2 (ergocalciferol) e vitamina D3

(colecalciferol), esto disponveis como suplementos e esto presentes em alimentos

fortificados. Embora ambas as formas possam aumentar os nveis de vitamina D no

sangue, a vitamina D3 aparenta, em alguns casos produzir quantidades mais elevadas

de vitamina D circulante durante o seu tempo de reteno no corpo [1].

O nvel de vitamina D influenciado pela exposio luz solar, pigmentao da pele,

vesturio, utilizao de protetor solar, nutrio e administrao de suplementos.

Contudo apenas uma pequena percentagem da concentrao de 25OHD resulta da

dieta, sendo a ingesto de vitamina D tanto mais importante quanto menor for a

exposio solar [46]. A concentrao da 25OHD circulante varia consoante a geografia

(latitude), cultura, e legislao (leis sobre a fortificao de alimentos) dos locais onde

as pessoas habitam.

As metodologias utilizadas para a medio da 25OHD no soro incluem na sua grande

maioria imunoensaios, tais como ensaios radioimunolgicos (RIA), ensaios

imunoenzimticos, como o teste ELISA, e imunoensaios por quimioluminescncia [47].

Contudo, a determinao dos compostos de vitamina D realizada atravs de

metodos fsico-qumicos, tais com cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

[48,49].

2.2.6.1. Fatores de Risco

O desenvolvimento de deficincia em vitamina D est associado a inmeros fatores:

pigmentao da pele - indivduos com um maior teor em melanina na pele

necessitam de um perodo de tempo superior para a sntese da mesma

quantidade de vitamina D quando comparados com indivduos de pele mais

clara [46];

uso de protetor solar que bloqueie os raios UVB [46];

uma dieta reduzida em peixes e produtos lteos [46];

a ausncia ou reduzida exposio solar ou uma grande superfcie da pele

coberta por vesturio [46,50];

no sair de casa ou estar num estado no ambulatrio;

reduzido grau de converso do percursor da vitamina D em pele envelhecida,

tal como em idosos e indivduos de pele escura [51];



existncia de cicatrizes de queimadura e de zonas de pele normal adjacente s

queimaduras que apresentam menor capacidade de transformar o 7-des-

hidrocolesterol em pr-vitamina D [52];

a utilizao a longo prazo de alguns medicamentos tais como, anticonvulsivos,

glucocortisides ou qualquer medicamento que aumente o catabolismo da

vitamina D ou diminuia a sua absoro [53,54].

Como referido nos pontos acima, a exposio solar reduzida ou penetrao reduzida

dos raios UV devido absoro pelo elevado teor em melanina ou pela roupa

aumentam o risco de deficincia em vitamina D [55].

possivel admitir a existncia de grupos de risco nas populaes com elevado teor de

melanina na pele, tais como indivduos de origem asitica e africana que imigram para

a Europa ou para a Amrica do Norte. Estes apresentam baixos nveis de 25OHD no

soro e uma maior incidncia de raquitismo e osteomalacia do que caucasianos [56,57].

O maior grupo de risco de deficincia em vitamina D o constitudo por indivduos de

pele escura [55,58]. Contudo, indivduos de pele clara podem tambm apresentar

deficincia em vitamina D devido fraca exposio a luz solar. Para muitos grupos, o

aumento da exposio solar no apropriado ou prtico, sendo que nestes casos a

suplementao o mais indicado [59].

Os indivduos idosos apresentam-se, tambm, como um grupo com grande incidncia

de deficincia em vitamina D devido em parte reduo da exposio solar, possvel

reduo da capacidade de sntese de vitamina D na pele e ingesto baixa de clcio

associada falta de apetite [60].

2.2.6.2. Deficincia em Vitamina D na Europa

conhecido que a exposio casual luz solar pode providenciar a maioria da

quantidade de vitamina D necessria populao humana [61]. Contudo a sntese

cutnea de vitamina D pode no ser suficiente, devido ao facto do continente europeu

estar localizado a uma elevada latitude o que torna muito difcil ou quase impossvel a

sntese cutnea de vitamina D nos meses de Inverno (Novembro a Maro), nos pases

nrdicos.

De facto, alguns estudos realizados em vrios pases europeus demonstram que a

concentrao de vitamina D exibe uma variao sasonal, ou seja, a concentrao da



25OHD apresenta-se bastante elevada nos meses de Vero e diminui nos meses de

Inverno [62,63].

O nvel de vitamina D na populao da Europa, varia de acordo com a latitude,

estao do ano, pigmentao da pele da populao, alimentao e polticas de

fortificao de alimentos implementadas por alguns pases. A concentrao em

25OHD mais elevada no norte europeu do que no sul e tambm mais elevado no

oeste europeu do que no leste, devido ao consumo de uma maior quantidade de

alimentos fortificados e suplementos vitamnicos. Os valores elevados na Noruega e

na Sucia so, provavelmente, devidos a uma maior ingesto de peixes com uma

elevada composio em gordura e de leo de fgado de bacalhau. A baixa

concentrao em 25OHD em Espanha, Itlia e Grcia pode ser devida a uma maior

pigmentao da pele e a um comportamento de evitar a exposio solar ou quando

existe exposio serem utilizados protetores solares com ndices de proteo

elevados. Em Portugal no so conhecidos os valores da concentrao em 25OHD,

mas no de esperar que sejam diferentes dos outros pases do sul europeu [46,64].

2.2.6.3. Sintomas de Deficincia em Vitamina D

Hoje em dia, existe uma grande variedade de efeitos na sade associados a uma

baixa concentrao em vitamina D. Mas dada a natureza no especfica dos sinais

clinicos e dos sintomas desta deficincia, torna-se um pouco difcil o seu diagnstico.

Os nveis no soro devem-se manter muito reduzidos durante um longo perodo de

tempo para que o paciente exiba os sinais clssicos e sintomas associados

deficincia em vitamina D, tais como raquitismo em crianas ou osteomalacia em

adultos [10]. Outros sinais e sintomas de deficincia em vitamina D incluem letargia,

aumento de incidncia de infees, irritao ou o agravamento de doenas crnicas

tais como, artrite reumatoide, dores generalizadas, dor na regio lombar, dores

musculares e dores nos ossos [65]. A deficincia em vitamina D est a ser cada vez

mais identificada em pacientes com doenas renais crnicas e naqueles que

frequemente sofrem quedas e esto fisicamente debilitados [50,66]. Outras doenas,

de carter autoimune e que esto relacionadas com a baixa concentrao em vitamina

D, incluem a esclerose mltipla, doena dos intestinos irritveis, asma e artrite

reumatoide [67]. A deficincia em vitamina D tambm tem sido associada

hipertenso e ao aumento da mortalidade por doena cardiovascular [68].



2.2.7. Optimizao dos Nveis de Vitamina D no Soro

Muitos indivduos em climas temperados e frios no passam o tempo suficiente no

exterior para uma adequada exposio luz solar ou podem no ingerir vitamina D

suficiente atravs da sua dieta para a proteo da sua sade ssea. De facto, para a

produo de vitamina D suficiente em indivduos de pele clara, necessrio uma

exposio corporal de 15% - mos, cara e braos ou uma rea equivalente luz

solar durante 10 a 15 minutos, quatro a seis vezes por semana, dependendo um

pouco da quantidade do seu precursor, 7-des-hidrocolesterol, presente na pele [69,70].

Em indivduos de pele clara com uma exposio tima luz solar e com uma irritao

mnima, a pele deve gerar aproximadamente 10000 UI de vitamina D3 em 24 horas de

exposio. Normalmente, o aumento do nvel de vitamina D demora entre 7 a 14 dias

aps exposio solar.

Deste modo, uma exposio solar, uma dieta adequada e eventualmente alguma

suplementao em vitamina D pode prevenir a deficincia nesta vitamina D uma vez

que a maioria dos adultos necessitam de 600 a 2000 UI de vitamina D por para manter

os nveis fisiolgicos da vitamina no soro [1].

Quanto aos nveis de 25OHD no soro, idealmente, devem situar-se entre 50 60

nmol/L, no final do Inverno e por isso, no final do Vero a sua concentrao deve ser

mais elevada de forma a permitir o decrscimo que ocorre no Inverno [71].

Considerando os factos disponveis, a introduo de uma poltica nacional de

fornecimento de uma rotina de suplementao de vitamina D a populaes

vulnerveis, como as residentes em lares, iria auxiliar na reduo de quedas e fraturas

[1].

2.3. Suplementao da Vitamina D

Atualmente, a preocupao com a ingesto de vitamina D tem-se tornado importante

devido ao crescente reconhecimento de que a sua sntese atravs da exposio solar

pode no ser suficiente conforme referido anteriormente. Devido a vrios fatores, tais

como tipo de roupa, cor da pele e latitude do local, que podem dificultar a sntese

cutnea da vitamina D, pode ser necessrio recorrer a fontes alimentares para

satisfazer as necessidades de vitamina D [72].



Ao contrrio de muitos suplementos, a adio de vitamina D tem, normalmente por

objetivo corrigir uma deficincia ambiental existente (menor exposio radiao

ultravioleta) e no de corrigir a sua falta devido a razes nutricionais [73].

Nos Estados Unidos, os produtores h j alguns anos que adicionam vitamina D a

determinados alimentos, tais como leite, sumo de laranja fortificado com clcio,

margarina e manteiga, e cereais de pequeno-almoo. Alm disto, a vitamina D por

vezes adicionada a produtos lteos para alm do leite, tais como iogurte e queijo

fatiado americano, e tambm em massas [73,74].

Em Portugal, existem no mercado vrios suplementos vitamnicos contendo a vitamina

D, a maioria em associao com outros elementos. Nestes suplementos, a vitamina D

disponibilizada sob a forma de vitamina D2 ou D3. Tal como nos Estados Unidos e

em outros pases europeus, em Portugal existem no mercado alimentos fortificados

tais como iogurtes, leite, cereais de pequeno-almoo, frmulas infantis entre outros,

embora no caso portugus no corresponda a qualquer poltica de sade que

constitua uma obrigao por parte dos fabricantes [64].

2.4. Dose Diria Recomendada

Existe alguma variao nas recomendaes dietticas para a vitamina D nos pases

europeus. A dificuldade em estabelecer doses dirias recomendadas para a vitamina

D resulta da dupla natureza do fornecimento desta vitamina [75]. Na maioria dos

pases, a DDR apresenta-se entre 5 a 10 g/dia, normalmente superior para os idosos

e crianas com menos produo de vitamina D cutnea. Antes de 1997, a DDR de

vitamina D para bbes e crianas era cerca de 10 g (400 IU) nos Estados Unidos da

Amrica [76]. Este valor teve como base o facto de corresponder, aproximadamente,

quantidade existente numa colher de ch (5 mL) de leo de fgado de bacalhau, que

h muito tempo foi considerado seguro e eficaz na preveno do raquitismo [77].

Em Novembro de 2010, o Institute of Medicine (IOM) emitiu um breve relatrio sobre a

ingesto de clcio e vitamina D e sobre as doses dirias recomendadas para cada

faixa etria (tabela 1) [78].

As quantidades de vitamina D so apresentadas normalmente em g, sendo que 1 g

equivalente a 40 UI ou 2,6 nmol de vitamina D3 [73].



Tabela 1 Recomendaes da ingesto diria de vitamina D segundo o IOM [78]

Faixa etria Necessidade mdia

(estimada) (UI/dia)

DDR

(UI/dia)

Mximo admitido

(UI/dia)

0 a 6 meses 400 400 1000

6 a 12 meses 400 400 1500

1 a 3 anos 400 600 2500

4 a 8 anos 400 600 3000

9 a 13 anos 400 600 4000

14 a 18 anos 400 600 4000

19 a 30 anos 400 600 4000

31 a 50 anos 400 600 4000

51 a 70 anos 400 600 4000

> 70 anos 400 800 4000

14 a 18 anos, grvidas /

amamentando 400 600 4000

19 a 50 anos, grvidas /

amamentando 400 600 4000

Apesar da nova DDR para a vitamina D nos EUA apresentar o valor de 15 g (600 UI)

/dia [79], para a maioria dos adultos, vrios estudos referem que a quantidade

benfica mais adequada seria entre 20-25 g (800-1000 UI)/dia, com base na medio

da densidade ssea e na preveno de fratura em idosos [80,81]. Por este motivo nos

EUA, a DDR foi aumentada para 800 UI/dia para indivduos com idades superiores a

70 anos. O aumento da DDR vai permitir diminuir a probabilidade do aparecimento de

hiperparatireoidismo secundrio induzido pela deficincia de vitamina D e originar

concentraes sricas de 25OHD mais prximas s necessrias para outros

benefcios para a sade.

As recomendaes recm-publicadas do IOM conduzem a um aumento significativo

dos valores anteriormente publicados, nomeadamente, referem a triplicao das doses

recomendadas de vitamina D para crianas e o aumento de 1,5 a 3 vezes para adultos

at a idade de 70 anos, em consequncia do progresso cientfico no campo da

vitamina D.

A Organizao Mundial de Sade, OMS, recomenda a ingesto diria de vitamina D

de 5 g (200 UI) para crianas e adultos at 50 anos (inclusive mulheres grvidas e a

amamentar), 10 g (400 UI) a partir de 51 - 65 anos e 15 g (600 UI) para pessoas

com mais de 65 anos [82]. Nos pases da Europa as recomendaes para a ingesto



de vitamina D variam e tendem a ser mais elevadas do que os valores prospostos pela

OMS [83]. Em Portugal, a DDR atual de 5 g/ dia para qualquer faixa etria [2].

Se o objetivo da suplementao de vitamina D simplesmente evitar uma

osteomalacia severa, ento um requisito mnimo de 2,5 g (100 UI/dia) pode ser

adequado em alguns casos. Quando a suplementao apresenta o valor de 10 g

(400 UI) vitamina D/dia, o nvel de 25OHD aumenta para aproximadamente 45 nmol/L

[84,85]. Contudo, a ingesto de vitamina D diria de 5 g (200 UI) pode ser adequada

para manter as concentraes mdias de 25OHD no soro a 25 nmol/L, embora no

exista informao suficiente para esta concluso.

Existe uma viso predominante de que a exposio ocasional do rosto e das mos

luz solar ser "suficiente" para um nvel de vitamina D adequado. Na verdade, esta

exposio pode fornecer 5-10 g (200-400 UI) de vitamina D durante os meses de

maior luminosidade.

No entanto, uma exposio de 5% da pele produz uma concentrao mdia de

25OHD de apenas 35 nmol/L, o que deixaria mais de metade da populao com

deficincia em vitamina D [86].

Outra forma de aumentar a ingesto de vitamina D tem sido a administrao de uma

nica dose com concentrao elevada de vitamina D, quer oralmente quer por injeo.

Devido ao tempo de meia vida da vitamina D ser superior a 1 ou 2 meses, esta

metodologia pode fornecer nveis de vitamina suficientes para uma grande parte do

ano [73].

2.5. Toxicidade da vitamina D

A vitamina D txica quando ingerida em elevadas quantidades. Em adultos, tomas

dirias de vitamina D acima de 50000 UI produzem sintomas de toxicidade, tais como,

anorexia, desidratao, fraqueza muscular, enxaqueca, nasea, vmitos, poliria

(produo excessiva de urina) e polidiosia (beber frequentemente devido a uma sede

extrema). Os nveis de clcio no soro aumentam como consequncia da

desmineralizao ssea e o clcio depositado nos rins causando hipertenso,

insuficincia renal, insuficincia cardaca e anemia. A hipervitaminose D resulta de

sobressuplementao com produtos farmacuticos e no do consumo de gneros

alimentcios usuais. A hipervitaminose D tambm no gerada por uma exposio

solar ilimitada, uma vez que o bronzeamento da pele cria um filtro para a luz UV que



previne a converso do 7-des-hidrocolesterol em colecalciferol. A toxicidade da

ingesto excessiva de vitamina D est relacionada com os efeitos farmacuticos do

25OHD em elevada concentrao, mas mesmo assim a concentrao de 1,25(OH)2D

no aumenta abruptamente em pacientes intoxicados com vitamina D [87,88].

Contudo, a ocorrncia de toxicidade no se verifica, normalmente, com doses de

vitamina D at 5000 UI/dia mesmo com um tratamento a longo prazo [89,90].

2.6. Hipersensibilidade vitamina D

O hiperparatiroidismo primrio provavelmente o exemplo mais comum de

hipersensibilidade vitamina D, promovendo a reabsoro ssea e a absoro

intestinal do clcio [91]. Em indivduos com hiperparatiroidismo, a vitamina D aumenta

a hipercalcemia, nveis elevados de clcio no sangue, devido ligao entre a

ingesto de vitamina D e a produo 1,25(OH)2D.

A hipercalcemia pode ser observada em indivduos que sofrem de sarcoidose,

tuberculose ou linfoma devido ao aumento da toma de vitamina D, podendo nestes

casos especficos ser prudente reduzir ou evitar quaisquer fontes dietticas ou

ambientais de vitamina D [92].

3. Mtodos Analticos para a Determinao de Vitamina D

Durante muitos anos, a determinao da vitamina D em alimentos foi realizada atravs

de mtodos bioqumicos. Estas tcnicas, embora especficas para a vitamina D, eram

demoradas e com grande incerteza associada, no distinguindo os diferentes

componentes bioativos da vitamina D [93].

Os mtodos mais especficos, utilizando cromatografia lquida de alta eficincia

(HPLC), surgiram h trs dcadas atrs, e foram aplicados inicialmente

determinao da vitamina D3 em leite e em pescado [94]. Este mtodo consistia numa

saponificao lipdica, extrao lquido-lquido, a purificao por HPLC semi-

preparativa e quantificao por HPLC com padres externos e deteo de UV.

Desde o mtodo de Thompson publicado em 1982 [94], muitas modificaes e

melhorias para a anlise de vitamina D em produtos alimentares tm sido publicadas.

No mesmo ano, Sivell e Jackson relataram a utilizao de vitamina D2 como um

padro interno (PI) na determinao da vitamina D3 em ovos [95,96].



Para a determinao da vitamina D3 em gema de ovo por Mattila em 1992, foi relatada

a introduo de uma extrao em fase slida (SPE), antes do passo de purificao em

fase normal e a deteo com um detetor com uma rede de dodos (DAD) [97].

O mesmo autor referiu a determinao da 25OHD3 na mesma matriz alimentar com

um princpio semelhante, utilizando a 25OHD2, como padro interno [98].

Posteriormente, estes investigadores relataram a anlise de ambos os compostos

utilizando um mtodo nico para produtos lteos, carne crua e fgado [99].

Existem inmeros mtodos para a determinao da vitamina D, conforme referido no

anexo 1, porm a grande maioria destes mtodos so baseados em mtodos oficiais

publicados por organizaes como Association of Official Analytical Chemists (AOAC)

International, Comit Europeu de Normalizao (CEN), International Dairy Federation,

EUA Pharmacopeia e International Organization for Standardization (ISO).

Existem inmeros mtodos publicados pela AOAC International, a organizao

responsvel por estabelecer mtodos oficiais. Destes mtodos, sete mtodos qumicos

so referentes vitamina D:

Mtodo 992.26 - vitamina D3 em frmulas infantis base de leite utilizando

cromatografia lquida (1992 1995);

Mtodo 995.05 - vitamina D nas frmulas infantis utilizando HPLC (1995);

Mtodo 2002.05 vitamina D3 em alimentos selecionados (leite e queijo)

utilizando HPLC de fase reversa, RP-HPLC-DAD/UV (2002);

Mtodo 2011.11 Vitamina D em fmulas infantis e suplementos nutricionais

para adultos/peditricos utilizando cromatografia lquida de ultra performance

com deteo por espetrometria de massa sequencial, UHPLC MS/MS (2011);

Mtodo 2011.12 Vitamina D2 e D3 em frmulas infantis e suplementos

nutricionais para adultos/peditricos utilizando UHPLC MS/MS (2011);


nutricionais para adultos/peditricos utilizando HPLC MS/MS (2011);


nutricionais para adultos/peditricos utilizando HPLC com espetrometria de

massa sequencial com fonte de ionizao, ESI LC MS/MS (2012).

A metodologia de determinao da vitamina D foi constantemente desenvolvida e

aperfeioada, incluindo o uso de um PI de vitamina D2, resultando no mtodo da

norma europeia EN 12821 [100], seguida neste trabalho.

Existem quatro mtodos oficiais que utilizam a quantificao por PI na determinao

da vitamina D, o AOAC 995.05, o AOAC 2002.05, o AOAC 2011.12 e a EN 12821.



Os padres internos devem ser adicionados amostra o mais cedo possvel,

geralmente imediatamente aps a preparao das alquotas de amostras. Alm disso,

as suas propriedades qumicas e fsicas devem ser o mais semelhantes possvel s

dos analito. A utilizao do PI na determinao da vitamina D corrige as variaes de

concentrao ocorridas durante o procedimento experimental, ou seja, a

transformao da vitamina D em pr-vitamina D durante a saponificao [102]. A

determinao de vitamina D3 pode ser efetuada utilizando a vitamina D2 como padro

interno, e a vitamina D3 como padro interno quando necessrio a determinao da

vitamina D2 nas amostras, pois as duas formas no se apresentam normalmente

juntas em produtos alimentares fortificados [101].

A quantificao por padro interno realizada atravs de rcios de resposta do

analito/padro interno, sendo as alteraes sofridas por ambos durante o

procedimento corrigidas. O fator de resposta define-se como a razo entre a rea do

pico do analito e a rea do pico padro interno, no cromatograma obtido. Como o

padro interno adicionado amostra apresenta as mesmas propriedades que o

analito, as alteraes sofridas por este iro ser proporcionais s sofridas pelo analito

[102,103].

Tm sido publicados na literatura muitos estudos em que se recorre anlise de

HPLC de fase normal (NP-HPLC), na determinao da vitamina D no leite e nas

frmulas infantis [104,105]. Uma vantagem de NP-HPLC reside no facto dos

triglicridos e de outros compostos serem facilmente eluidos da coluna. Assim, uma

injeo direta no sistema de HPLC da amostra , portanto, possvel, evitando a

necessidade de um tratamento prvio. Na NP-HPLC, a vitamina D3 e D2 so

isocrticamente separadas dos respetivos ismeros de pr-vitamina, mas no

possvel a resoluo entre as vitaminas D2 e D3 [106].

Por sua vez tambm tm sido usados mtodos com base em HPLC de fase reversa

(RP-HPLC) para determinar a vitamina D no leite e frmulas infantis [107,108]. Com

esta metodologia foi possvel separar a vitamina D2 da vitamina D3. Este facto permite

que a vitamina D2 possa ser usada como um padro interno para quantificar a forma

de vitamina D3, e torna possvel corrigir as perdas potenciais de vitamina D durante o

longo processo de tratamento da amostra. Uma desvantagem de RP-HPLC a

impossibilidade de uma injeo direta de extrato uma vez que os compostos solveis

em gordura (interferentes) podem afetar a eficincia da coluna, a forma do pico e

reprodutibilidade dos ensaios [106].

Nos ltimos 10 anos, foram publicados mtodos de HPLC com sistemas de deteo

bastante distintos, tais como espetrometria de massa (MS) e espetrometria de massa



sequencial (MS/MS), em complemento aos DAD-UV, utilizados exclusivamente at

ento.

Com o aparecimento das tcnicas de HPLC-MS e HPLC-MS/MS, estas tambm foram

aplicadas determinao da vitamina D. Apesar da alta seletividade e sensibilidade da

tcnica de HPLC-MS/MS, os analistas ainda enfrentam dificuldades analticas como

demoradas etapas de pr-purificao, saponificao, ou extrao da fase slida

(SPE), devido natureza complexa do analito e da matriz, que dificulta anlises de

rotina [109].

Os diferentes mtodos utilizados para a determinao da vitamina D so bastante

semelhantes no que se refere aos passos de preparao da amostra at ser injetada

nos sistemas de HPLC. As amostras so saponificadas de forma a hidrolisar os lpidos

e extrair as vitaminas D2 e D3. Estas vitaminas so recolhidas em seguida como um

nico pico usando NP-HPLC e so posteriormente separadas utilizando cromatografia

analtica de fase reversa com deteo UV utilizando uma rede de dodos e em alguns

casos espectrometria de massa. Existem variaes a este mtodo devido ao uso de

diferentes temperaturas e tempos de saponificao, de diferentes solventes de

extrao (hexano ou ter/ter de petrleo) e na utilizao de PI [110].

Existem dois problemas com os mtodos normalizados para alimentos enriquecidos.

Em primeiro lugar, os mtodos apresentam-se bastante longos e detalhados, sendo

necessria uma ateno redobrada, exigindo um analista qualificado para a diminuio

do potencial erro e m preciso.

Em segundo lugar, os mtodos s foram validados para vitamina D em produtos lteos

enriquecidos, e no para outros tipos de alimentos. Alargar a aplicabilidade dos

mtodos obrigatrio para que os dados sobre a composio de alimentos sejam

confiveis. Atualmente, isto especialmente crtico uma vez que muitos dos novos

alimentos enriquecidos (por exemplo, sumo de laranja nos EUA e cereais) tm

caratersticas diferentes, o que pode afetar a extrao e separao de vitamina D3

[110].

3.1. Princpios de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

O equipamento de HPLC apresenta vrios componentes, tais como, reservatrios para

a fase mvel, bomba, injetor, coluna de separao, onde se encontra a fase

estacionria, um detetor e um sistema de aquisio de dados. Muitos modelos

permitem a regulao da temperatura da coluna o que indiretamente regula a



temperatura da fase mvel, e das amostras atravs de sistemas de

arrefecimento/aquecimento [4].

Num procedimento usual, a amostra injetada atravs do injetor automtico e

arrastada pela fase mvel que se encontra sob presso, atravs da coluna que contm

a fase estacionria. Os componentes da amostra so separados atravs de interaes

com a fase mvel e com a fase estacionria. Estes analitos, ao sairem da coluna,

passam por um detetor que gera um sinal eltrico proporcional quantidade de analito

que est a passar na clula do detetor [111].

O equipamento encontra-se ligado a um computador onde se registam e processam

os dados necessrios de forma a gerar o cromatograma, o qual utilizado para

identificar e quantificar os componentes da mistura. Cada constituinte tem um tempo

de reteno caraterstico, que permite a sua anlise qualitativa. A anlise quantitativa

realizada comparando a resposta do analito presente na mistura com a resposta

(rea do pico) de solues padro cuja concentrao exatamente conhecida [111].

Os diferentes componentes de um sistema de HPLC so apresentados no diagrama

na figura 4.

Figura 4 - Componentes de um cromatografo de HPLC [112]

Por vezes, necessrio isolar e purificar o composto desejado presente numa mistura,

antes da a sua identificao e quantificao, utilizando uma HPLC preparativa. Esta

tcnica cromatogrfica permite a recolha da frao da amostra contendo o composto

desejado. Com o composto purificado, procede-se sua identificao e quantificao

atravs de uma HPLC analtica. A diferena entre estes dois tipos de HPLC reside no

tamanho da partcula que atravessa a coluna e por consequente o dimetro da coluna

utilizado [113].

Existem dois modos de eluio em HPLC: eluio isocrtica em que, a composio da

fase mvel constante ao longo do tempo, quer se trate de um solvente puro ou uma

Sistema de

aquisio de dados

Amostra

Coluna

Resduo

Reservatrio

de fase

mvel

Bomba Injetor Detetor



mistura de solventes [4]. A eluio gradiente, ao contrrio do modo anterior, quando

ocorrem mudanas de composio da fase mvel durante a separao. A eluio em

modo gradiente til para amostras que contm compostos com uma vasta gama de

polaridade. medida que os rendimentos de separao diminuem, a fora de eluio

da fase mvel aumenta, de forma a eluir os componentes da amostra mais fortemente

retidos na fase estacionria [4].

Os modos de separao em HPLC podem seguir vrios mecanismos. Em anlise

alimentar frequente a utilizao de HPLC em fase normal e em fase reversa.

Em fase normal, a fase estacionria polar e a fase mvel apolar, pelo que aquela

retm durante mais tempo os compostos polares. Tipicamente a fase estcionria

deste tipo de separao constituida por slica e a fase mvel constituda por

compostos orgnicos, no sendo utilizada gua na fase mvel neste tipo de separao

[4,114].

Hoje em dia, porque mais reproduzvel e tem maior gama de aplicabilidade, a

cromatografia de fase reversa, a utilizada com maior frequncia. A maioria dos

protocolos utiliza como fase mvel uma soluo aquosa de um solvente orgnico

polar, tal como acetonitrilo ou metanol. Esta mistura permite uma boa interao entre

os analitos e a superfcie das partculas no-polares, hidrofbicas da fase estacionria

[114,115]. Em fase reversa, oposto ao de fase normal, a fase mvel polar e a fase

estacionria apolar, sendo por isso os compostos menos polares, os mais retidos na

coluna.

O enchimento da coluna realizado com slica modificada quimicamente de forma a

torn-la no polar, recorrendo ligao de cadeias de hidrocarbonetos na sua

superfcie, usualmente com 8 ou 18 tomos de carbono, denominando-se colunas C8

ou C18, respetivamente. A reteno em fase reversa baseada na interao da parte

hidrofbica do analito e as zonas hidrofbicas da fase estacionria [4,115]. O solvente

polar e as molculas polares presentes na amostra a analisar vo interatuar

fortemente entre si medida que estas atravessam a coluna, no sendo significativa a

sua interao com as cadeias de carbono ligadas slica (apolares). Sendo assim

estas molculas iro eluir rapidamente da coluna [114]. Os compostos no polares na

mistura so atrados pelos grupos de hidrocabonetos ligados slica da fase

estacionria devido a foras de disperso de van der Waals. Assim, as molculas no

polares iro atravessar a coluna mais lentamente do que as polares [116].



4. Validao de um Mtodo Analtico

A norma ISO/IEC 17025 - Requerimentos gerais para Laboratrios de Ensaio e

Calibrao, define validao de um mtodo analitico como a comprovao, atravs do

fornecimento de evidncia objetiva, de que o mtodo cumpriu os requisitos para uma

aplicao ou uso especfico pretendido [117].

O principal objetivo da validao de um mtodo o de demonstrar a fiabilidade deste

para a determinao do teor de um analito numa determinada matriz analtica [118].

O processo de validao de um mtodo deve estar descrito num procedimento

laboratorial, e as determinaes dos parmentros de validao devem ser realizadas

em equipamentos e instrumentos dentro das especificaes, funcionando

corretamente e adequadamente calibrados [119].

Os parmetros de validao de um mtodo analtico incluem: gama de

trabalho/linearidade; limiares analticos (limite de deteo e limite de quantificao);

sensibilidade; preciso; exatido; recuperao.

Gama de Trabalho

Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma gama de concentraes do analito no

qual o mtodo pode ser aplicado. Dentro desta gama pode existir uma faixa de

resposta linear e dentro desta, a resposta do sinal ter uma relao linear com a

concentrao de analito. A gama linear de trabalho de um mtodo de ensaio

representa o intervalo entre os nveis inferior e superior de concentrao do analito no

qual foi demonstrado ser possvel a determinao com a preciso, exatido e

linearidade exigidas, sob as condies especificadas para o ensaio [119].

Quando se utiliza uma metodologia que envolve o traado de uma curva de calibrao,

a gama de trabalho pode ser avaliada pelo teste de homogeneidade das varincias.

recomendado seguir a norma ISO 8466-1 para modelos lineares e a norma ISO 8466-

2 para modelos polinomiais de 2 grau. De acordo com a Norma 8466-1, analisam-se

10 rplicas independentes dos padres de concentraes mais baixa e mais elevada e

calculam-se as respetivas varincias.

Teste de homogeneidade de varincias

Determinam-se as varincias associadas ao primeiro e ltimo padro (S12 e S10

2) de

acordo com a equao 1.



Si2= j

yi j -yi

ni- (1)

sendo yi

yi j j

ni , em que yi o valor do sinal (rea) no ponto i e yi a mdia dos valores

de yi, para i=1 e i=10,

i - o nmero do padro (neste caso i vai de 1 a 10)

j o nmero de repetio efetuadas para cada padro

As varincias so testadas para examinar se existem diferenas significativas entre

elas, nos limites da gama de trabalho, efectuando o clculo do valor teste PG:

a) PG S

S quando S

210>S

21 (2)

b) PG S

S quando S

21>S

210 (3)

Compara-se este valor de PG com o valor F tabelado da distribuio de

Snedecor/Fisher, para n-1 graus de liberdade:

Se PG F, as diferenas de varincias no so significativas e a gama de trabalho

est bem ajustada.

Se PG > F, as diferenas de varincias so significativas e a gama de trabalho deve

ser reduzida at que a diferena entre as varincias relativas ao 1 e ltimo padro

permitam obter PG F [120].

Linearidade/ Curva de Calibrao

A linearidade relaciona-se com a capacidade de um mtodo analtico para produzir

resultados diretamente proporcionais concentrao do analito em amostras, numa

dada gama de concentrao. Assim, a quantificao requer que se conhea a

dependncia entre a resposta medida e a concentrao do analito, que no caso de

uma reta corresponde a conhecer o declive e a interseo na ordenada da origem.

A calibrao atravs de uma reta pode ser obtida utilizando padres externos e

formulada como uma expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do

analito a ser determinado na amostra real.



A equao da reta que relaciona as duas variveis :

y = a + bx

em que,

y - resposta medida (altura ou rea do pico em cromatografia);

x - concentrao;

b - declive da curva de calibrao;

a - interseo com o eixo y.

A linearidade de um mtodo pode ser observada pelo grfico dos resultados dos

ensaios em funo da concentrao sendo a equao da regresso linear,

determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados.

Para avaliar se a correlao linear adequada como modelo matemtico usado o

coeficiente de correlao o qual dever ser igual ou superior a 0,995 [119].

O modelo de ajuste linear pode ser avaliado atravs de um modelo estatstico, referido

na norma ISO 8466-1. A partir do conjunto dos pontos da gama de trabalho, e de

forma a verificar se o modelo linear adequado compara-se este com um modelo de

ajuste polinomial utilizando os respetivos desvios-padro residuais, Sy/x e Sy2.

A diferena das varincias (DS2) calculada pela equao 4:

DS2= (N - 2) S2y/x- (N - 3) S2

y2 (4)

em que N o nmero de padres de calibrao.

Calcula-se o valor teste, PG:

PG S

Sy

(5)

Compara-se este valor de PG com o valor F tabelado da distribuio de

Snedecor/Fisher:

Se PG F, a funo de calibrao linear, o ajuste polinomial no significamente

melhor que o linear;

Se PG > F, a funo de calibrao no linear, ou seja, o ajuste polinomial

significativamente melhor que o linear [120].



Sensibilidade

A sensibilidade um parmetro que demonstra a variao da resposta em funo da

variao da concentrao do analito. No caso de mtodos em que a calibrao feita

atravs de uma reta a sensibilidade pode ser expressa pelo declive da reta de

regresso de calibrao, conforme a equao 6.

S dy

dc (6)

em que,

S - sensibilidade;

dy - variao da resposta do aparelho;

dc - variao da concentrao [119,120].

Limiares analticos

Existem diversas formas de calcular os limiares analticos, limite de deteo e limite de

quantificao. As abordagens mais utilizadas no clculo destes limites so

apresentadas em seguida [120].

Limite de deteo (LD)

O limite de deteo (LD) definido como o teor mnimo medido, a partir do qual

possvel detectar a presena do analito com uma certeza estatstica razovel. Este

limiar analtico corresponde mais pequena quantidade de substncia a analisar que

pode ser detetada numa amostra, mas no necessariamente quantificada como valor

exato, e os mtodos mais utilizados para a sua determinao so a partir da razo

sinal/rudo e a partir da curva de calibrao.

Em termos qualitativos, o conceito de limite de deteo corresponde concentrao

mnima que possvel distinguir do branco [120].

O mtodo da razo sinal/rudo consiste na comparao entre a medio dos sinais do

composto de interesse na matriz em concentraes conhecidas e baixas do composto

de interesse e um branco destas amostras. A razo sinal/rudo pode ser de 3:1 ou 2:1,

propores geralmente aceites como estimativas do limite de deteo, dependendo

dos autores [121].



Se o LD, for determinado a partir da curva de calibrao, neste caso ter-se-:

[ Sy x]

b (7)

em que:

Sy/x - desvio padro residual da curva de calibrao

b - declive da mesma [119].

Limite de Quantificao (LQ)

O limite de quantificao a menor concentrao do analito que pode ser determinada

com um nvel aceitvel de exatido e preciso.

Na maioria dos casos corresponde ao padro de calibrao de menor concentrao.

Este limite, aps ter sido determinado, deve ser confirmado com matrizes contendo a

concentrao do analito prxima do limite de quantificao para averiguar se a

preciso satisfatria [119,120].

Tal como o LD, o LQ pode ser determinado a partir da razo sinal/rudo (em geral,

10:1) e ou atravs da curva de calibrao, apresentada na equao 8, [121]:

Q [ Sy x]

b (8)

em que:

Sy/x - desvio padro residual da curva de calibrao

b - declive da curva de calibrao [119].

Preciso

A preciso um termo geral para avaliar a disperso de resultados entre ensaios

independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres,

em condies definidas.

normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as duas

formas mais comuns de express-la so por meio da repetibilidade e da preciso

intermdia, sendo usualmente expressas atravs do desvio-padro [118].

O desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV (%)), equao 9, pode

ser mais til neste caso, pois normalizado com base na concentrao e deste modo

praticamente constante ao longo da faixa de interesse, no devendo ultrapassar os

15% [118].



CV (%) = s x

x 100 (9)

em que:

s - desvio padro;

x - concentrao mdia determinada

Repetibilidade

A repetibilidade representa o grau de concordncia entre os resultados de medies

sucessivas de uma mesma amostra, efetuadas sob as mesmas condies de

medio: mesmo procedimento de medio, mesmo observador, mesmo instrumento

utilizado sob mesmas condies, mesmo local, sendo que as repeties devem ser

realizadas num curto espao de tempo, normalmente no mesmo dia de anlise [120].

Para avaliar a repetibilidade de um mtodo, efectuam-se uma srie de medies sobre

uma mesma matriz, nas condies de repetibilidade referidas anteriormente. A

estimativa da variao, varincia (S2r) de um mtodo de anlise pode ser determinada

pela mdia ponderada das estimativas das variaes de w sries de anlises

realizadas nas condies de repetibilidade. Tendo em conta que a repetibilidade pode

variar com o teor do elemento a dosear, esta ltima condio assegura, em princpio, a

igualdade estatstica das variaes de w sries de anlises. Assim, a varincia

associada repetibilidade (S2ri) do mtodo de ensaio, para cada nvel i de

concentrao dada por:

Sri *(nwi )Swi

+pw

(nwi )pw

(10)

em que,

S2ri - varincia de repetibilidade associada aos resultados considerados, para cada

laboratrio;

S2wi - varincia associada aos resultados considerados, para cada laboratrio;

(nwi-1) - graus de liberdade da srie de anlises;

p - nmero de laboratrios participantes [120].

Preciso intermdia

A preciso intermdia refere-se preciso avaliada sobre a mesma amostra ou

amostras idnticas, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio, variando as



condies de anlise, de forma a reproduzir as variaes normalmente observadas no

laboratrio, tais como, diferentes analistas, diferentes equipamentos, diferentes

tempos.

Esta medida de preciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade

dos resultados em um laboratrio e para a sua determinao efetuam-se uma srie de

medies sobre a amostra, nas condies pr-definidas. Quando aplicvel, este

procedimento pode repetido sobre outras amostras, abrangendo outros nveis de

concentrao, j que pode variar com a concentrao e a matriz.

Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da preciso intermdia,

existem vrios mtodos para determinao e controlo deste parmetro de qualidade,

tais como, por meio da equao:

Si j k

t n (y

jk yj)

n

k

t

j

(11)

em que:

Si(j,k) - desvio padro de preciso intermediria (onde os smbolos relativos s

condies intermedirias de preciso podem aparecer entre parntesis, ex: Si (T.O.)

significa tempo e operadores diferentes)

t total de amostras ensaiadas;

n total de ensaios efetuados por amostra;

j n da amostra, j = 1, t

k n do ensaio da amostra j, k = 1, n

yjk valor do resultado k para a amostra j

yi - representa a mdia aritmtica dos resultados da amostra j [119,120].

Exatido

A exatido de um mtodo analtico definida como a aproximao entre o resultado

da medio e o valor verdadeiro da amostra (normalmente desconhecido), podendo

ser determinado de variadas formas:

atravs da participao em ensaios interlaboratoriais;

pelo estudo de materiais de referncia certificados;

por comparao com resultados obtidos atravs de mtodos de referncia, em

que se assume o valor do mtodo de referncia como o valor verdadeiro.



Sempre que possvel, os materiais de referncia certificados (MRC) devem ser

utilizados no processo de validao de um mtodo de ensaio. Um MRC possui um

valor certificado por um organismo competente para o teor de um determinado analito

na amostra e uma incerteza associada. muito importante, portanto, que o

fornecimento desses MRC seja realizado por organismos reconhecidos e confiveis

(como por exemplo: National Institute of Standards and Technology (NIST), LGC

Standards).

Na avaliao da exatido utilizando um material de referncia certificado, os valores

obtidos pelo laboratrio, mdia e o desvio padro de uma srie de ensaios em

duplicado, devem ser comparados com os valores certificados do material de

referncia. Para esta comparao podem ser utilizados diversos critrios de deciso,

entre os quais o erro relativo, teste de hipteses, ndice z (z-score), erro normalizado

[119,120].

No caso de se recorrer ao ndice z, que tambm se utiliza para avaliar o desempenho

de um laboratrio num ensaio interlaboratorial, tem-se de acordo com a equao 12:

z = lab - v

s (12)

em que,

Xlab - valor obtido pelo laboratrio;

Xv - valor aceito como verdadeiro (valor certificado do MRC ou valor aceite como

verdadeiro num ensaio interlaboratorial);

s - desvio-padro dos ensaios realizados (em todos os laboratrios, no caso de

ensaios interlaboratoriais).

A avaliao feita de acordo com o seguinte critrio de deciso:

|z| 2 => resultado satisfatrio;

2 resultado questionvel;

|z|> 3 => resultado insatisfatrio.

Recuperao

A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras fortificadas com

quantidades conhecidas desse mesmo analito. s amostras pode ser adicionado o

analito em pelo menos trs concentraes diferentes, por exemplo, prximo do limite

de deteo, prximo da concentrao mxima permitida e uma concentrao prxima

da mdia da gama de trabalho do mtodo.



Em geral, os valores de recuperao devem estar compreendidos entre 80 e 120%

[122], e calculam-se atravs da equao 13:

Recupera o

(13)

em que,

C1 - concentrao determinada na amostra adicionada,

C2 - concentrao determinada na amostra no adicionada,

C3 - concentrao adicionada [119].

Estimativa da incerteza dos resultados

A determinao de um parmetro est sempre associada a uma incerteza de medio.

O Guia ISO/IEC 99:2008 caracteriza a incerteza de um resultado como parmetro

no-negativo que caracteriza a disperso dos valores de uma grandeza que so

atribudos mensuranda a partir das informaes usadas [123].

O clculo das incertezas dos resultados pode ser realizado com base no Guia para a

Quantificao da Incerteza em Ensaios Qumicos [124]. Este guia refere vrias

abordagens de determina o da incerteza de medi o: abordagem passo a passo;

abordagem baseada em dados interlaboratoriais e abordagem baseada nos dados de

validao.

A abordagem baseada nos dados obtidos ao longo da validao envolve a utilizao

dos resultados obtidos na avaliao da preciso intermdia e da exatido.

Quantificao da incerteza associada preciso

Na avaliao da incerteza associada preciso devem ser apenas utilizados os

valores de preciso intermdia em vez dos valores de repetibilidade pois os valores de

preciso intermdia refletem variaes do mtodo que usualmente so constantes no

mesmo dia de trabalho [124]. Assim, a incerteza relativa associada preciso

(ur,preciso), obtida atravs da equao 14:

ur precis o Si(j k)

x

(14)

em que:

Si(j,k) desvio padro da preciso intermdia obtido a partir da equao 11



x mdia da concentrao determinada

Quantificao da incerteza associada exatido

A determinao da incerteza associada exatido do mtodo est relacionada com o

erro sistemtico que ocorre em todas as anlises. Quando no mtodo se avalia um

MRC, estima-se a recuperao mdia do mtodo (Rm cobs

c R ) e os valores obtidos so

utilizados na avaliao da incerteza relativa associada exatido, ur(Rm ), equao 15

[125].

ur Rm sobs

n cobs

(u(c R )

c R )

Documents

17 - DM_Validação de Um Método de Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) Para Doseamento Da Vitamina D Em Géneros Alimentícios. Aplicação Do Método Em Diferentes