1
4 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é o tipo de cromatografia por eluição
mais usada para separar e quantificar as mais diversas substâncias químicas.
Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido ou mistura de solventes
líquidos, onde a amostra líquida é introduzida.
O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido pelo
mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária.
(1) partição ou cromatografia líquido-líquido;
(2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido;
(3) permuta iónica ou cromatografia iónica;
(4) cromatografia por exclusão;
(5) cromatografia por afinidade e
(6) cromatografia quiral
2
4.1 Distribuição dos diferentes tipos de cromatografia líquida com a massa
molar e a polaridade dos solutos
Mas
sa m
ola
r
Iónico
Permuta
iónica
Polar não-iónico
3
4.2 Guia para a seleção do tipo de cromatografia líquida mais adequado em
função do tipo de amostra
4
.
5
4.3 Instrumentação e equipamento auxiliar
Degasser
6
4.4 Colunas e fase estacionária
Não é comum usar-se colunas capilares com a fase estacionária suportada nas paredes
da coluna em HPLC, tal como sucede em GC
A viscosidade de um líquido é 100 a 1000 vezes superior à viscosidade de um gas
Em cromatografia líquida usam-se colunas de empacotamento
As colunas de empacotamento têm comprimento reduzido (5 - 30 cm), pelo que a sua
contribuição para a eficiência da coluna não será tão elevada como nas colunas
capilares (GC).
É necessário procurar outras contribuições para o aumento da eficiência, nomeadamente
o diâmetro médio das partículas que constituem a fase estacionária
A eficiência de separação de uma coluna de empacotamento aumenta com a diminuição
do diâmetro das partículas que constituem a fase estacionária.
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As partículas usadas em colunas de HPLC têm:
forma esférica e
diâmetros entre 3 e 10 μm
A diminuição do tamanho da partícula confere:
i) empacotamento regular, dando origem a fluxos uniformes, o que provoca a
diminuição do termo A da equação de van Deemter
ii) equilíbrio mais rápido do soluto entre a fase móvel e estacionária, o que
provoca a diminuição do termo C da equação de van Deemter
iii) maior resistência à passagem do eluente, o que provoca o aumento da pressão
para o mesmo fluxo
O número de pratos teóricos (N) de uma coluna de comprimento L e empacotada com
partículas sólidas de diâmetro médio dp é dado aproximadamente por:
md
cmLN
p
3000
8
As colunas de HPLC são, em geral:
i) tubos de aço;
ii) comprimento entre 5 e 30 cm;
iii) diâmetro interno entre 1 e 5 mm (id = 4,6 mm, o mais usual)
Fatores de degradação das colunas
i) partículas sólidas provenientes dos eluentes ou das amostras mal filtradas
ii) interação irreversível de compostos com a fase estacionária e que a inativam
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Proteção das colunas
uso de pré-coluna: mesma fase estacionária que a coluna analítica,
comprimento muito menor. É colocada antes da coluna e após o injetor
Retém as partículas sólidas que não conseguiriam passar através do coluna e os
compostos que iriam interagir irreversívelmente com a fase estacionária
Influência da temperatura
O aumento da temperatura favorece:
i) a degradação da fase estacionária
ii) criação de bolhas gasosas
iii) A diminuição da viscosidade da fase móvel (diminuição da pressão)
iv) diminuição do tempo de retenção (menor constante de partição e maior
coeficiente de difusão)
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4.4.1 Características das fases estacionárias
Quanto mais regulares forem as partículas das fases estacionárias mais reprodutível é a
separação e mais eficientes são as colunas
Tipo de partículas usadas em colunas de HPLC:
i) quanto à rigidez: sólidos rígidos, semi-rígidos ou maleáveis
ii) quanto à porosidade: porosos ou com camada pelicular
iii) quanto à forma: esféricos ou irregulares
iv) quanto ao tamanho: preferem-se partículas de diâmetros reduzido.
Sólidos rígidos:
Cromatografia líquido-sólido (adsorção) e líquido-líquido (partição)
Partículas de sílica (menos vulgarmente de alumina)
i) elevada estabilidade mecânica e resistência a pressões elevadas
ii) passíveis de ligação à superfície de grupos funcionais (modificação das
características superficiais das partículas)
iii) partículas microporosas e esféricas com dimensões regulares e com elevado
grau de pureza
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iv) solubilidade em água apreciável para pH > 8 (não se podem usar eluentes com
pH > 8)
v) hidrólise das ligações covalentes das fases ligadas para pH < 2 (as fases ligadas
só podem ser utilizadas para pH entre 2 < pH < 8)
Estrutura química da sílica
A fase estacionária mais comum em HPLC são partículas de sílica microporosas com
grau de pureza muito elevado com formato esférico e uniforme e com a superfície
modificada (cromatografia líquida com fase ligada)
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Sílica com a superfície modificada com organosilanos
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Parâmetro indicador da qualidade de uma modificação de fase
% de carbono da fase estacionária indica o grau de recobrimento das partículas
Indicador muito importante sobretudo se a fase ligada for apolar.
Se a cobertura for deficiente, os grupos silanol superficiais que restam, de
características polares, afectam a separação
Devido a limitações estereoquímicas, os grupos silanol superficiais nunca são todos
modificados, ficando alguns activos.
Em geral, após a modificação da superfície faz-se uma posterior modificação com um
reagente (ClSiR3 em que R = CH3) para aumentar a extensão de grupos silanol
modificados (end capping)
Compostos com grupos ácidos ou básicos podem dar origem a picos arrastados
(assimétricos) devido a interações com grupos silanol desprotegidos (não
modificados)
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4.5 Fase móvel
As fases móveis usadas em HPLC devem:
i) ter elevada pureza
ii) dissolver os componentes da amostra, mas não reagir com eles
iii) não alterar a fase estacionária
iv) ter baixa viscosidade
v) ser compatíveis com o modo de deteção
Solventes mais utilizados como eluentes com a fase estacionária do tipo C18 (HPLC de
fase reversa)
Metanol
Acetonitrilo
Tetrahidrofurano
Água
Baixa viscosidade
pureza elevada
Janela de transmitância no UV
São miscíveis uns com os outros
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A seleção da fase móvel é mais complexa do que em GC.
Em HPLC a fase móvel interage diretamente com os solutos e diferentes solutos têm
interações específicas com diferentes solventes.
Contudo, a característica mais importante na seleção de um solvente é a
polaridade
i) um solvente polar interage mais com solutos polares e um solvente pouco polar
interage mais com solutos pouco polares
ii) a polaridade de um solvente pode ser avaliada através do índice de polaridade,
P’ (solventes polares têm valores de P’ maiores)
A SÉRIE ELUOTRÓPICA permite obter indicações sobre a polaridade de solventes.
O índice de polaridade, P’, procura quantificar a polaridade dos solventes, desde não
polar até muito polar. A “força de eluição” de um solvente é definida para uma dada
fase estacionária (depende da fase).
16
.
17
A polaridade de uma mistura de solventes pode ser estimada a partir dos índices de
polaridade dos solventes individuais. Adopta-se média aritmética pesada.
Exemplo: Mistura de metanol e água (30:70)
P’metanol/água = 0,30P’metanol + 0,70P’água
Fase estacionária polar: deve-se usar solvente pouco polar
Solventes polares têm grande poder de eluição (exemplo: a água pode ficar
irreversivelmente ligada à sílica, tem grande poder de eluição)
Fase estacionária pouco polar: deve-se usar solvente polar
Solventes apolares têm grande poder de eluição (exemplo: solventes imiscíveis com a
água podem ficar irreversivelmente ligados à coluna, têm grande poder de eluição)
18
4.5.1 Eluição isocrática e eluição gradiente
Em HPLC pode-se alterar o poder de eluição do eluente ao longo de uma separação
através da variação da composição do eluente
Eluição isocrática: a eluição é realizada mantendo constante a composição da fase
móvel
Eluição gradiente: a eluição é realizada variando a composição da fase móvel
Separação isocrática de uma mistura de
compostos aromáticos: (1) álcool benzílico; (2)
fenol; (3) 3,4-dimetoxiacetofenona; (4)
benzoina; (5) benzoato de etilo; (6) tolueno; (7)
2,6-dimetoxitolueno; (8) 2-fenilanisol.
Eluente: Solução tampão pH 3,5 (A) e
acetonitrilo (B)
Coluna: fase reversa (C18 em partículas de
sílica - 5 µm); 25 cm x 4,6 mm
19
.
20
Eluição gradiente de uma mistura de
compostos aromáticos: (1) álcool benzílico; (2)
fenol; (3) 3,4-dimetoxiacetofenona; (4)
benzoina; (5) benzoato de etilo; (6) tolueno; (7)
2,6-dimetoxitolueno; (8) 2-fenilanisol.
Eluente: Solução tampão pH 3,5 (A) e
acetonitrilo (B)
Coluna: fase reversa (C18 em partículas de
sílica - 5 µm); 25 cm x 4,6 mm
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Vantagens da eluição gradiente:
i) menor tempo de eluição
ii) melhor definição dos picos cromatográficos e optimização da resolução da
separação de misturas complexas
Desvantagens:
incompatibilidade com certos tipos de cromatografia e certos detectores
A utilidade de uma eluição gradiente pode ser estimada do seguinte modo:
(i) Faz-se uma variação gradiente numa gama extensa, por exemplo, entre 10% e
90% de solvente orgânico (aumento do poder de eluição) em 40 min (tg).
(ii) Se a diferença entre os tempos de retenção do soluto menos retido e mais
retido (Δtr) for tal que Δ tr /tg > 0,25, então será útil fazer uma eluição
gradiente
22
4.6 Bombas
Principais requisitos a que deve obedecer uma bomba de HPLC:
i) elevada estabilidade (fluxo sem pulsos) e reprodutibilidade do caudal debitado
ii) inerte quimicamente aos solventes usados em HPLC
Características gerais das bombas:
i) fluxos reprodutíveis até 10 mL/min (aplicações analíticas)
ii) pressão até 40 MPa (400 bar)
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Princípio de funcionamento das bombas:
em geral, são utilizadas bombas de pistão recíproco
Utiliza-se uma bomba com dois
pistões recíprocos, de tal forma
que quando um suga a fase móvel
o outro expulsa-a para fora da
bomba (coluna)
Vantagens:
fluxo constante
permite fazer gradiente
alimenta o sistema continuamente
Desvantagens:
pode ocorrer pulsação do fluxo
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4.6.1 Criação de gradientes
Gradiente de baixa pressão
é produzido através de um sistema de válvulas de admissão que controla a
quantidade de solvente de cada canal.
25
Gradiente de alta pressão
A mistura dos solventes é feita após o seu bombeamento. Cada solvente é bombeado
por uma bomba própria
Sistema muito preciso
dispendioso pois usa
uma bomba para cada
canal de solvente
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4.7 Válvulas de injeção
As válvulas de injeção são
constituídas por ‘loops’ de
capacidade entre 2 e 1000 μL.
i) suportam as elevadas pressões
de funcionamento do sistema
ii) possuem duas posições, de
carga do ‘loop’ e de injeção
iii) são inertes quimicamente
iv) podem ser manuais ou automáticas
26
.
27
4.8 Detetores
Permite monitorizar o eluato que sai da coluna, dando preferência à deteção dos solutos.
Para isso, precisa de ter sensibilidade distinta para os solutos e para a fase móvel.
A propriedade física medida deverá ser específica dos solutos e pouco sensível à fase
móvel
Características gerais de um detetor:
i) elevada sensibilidade
ii) capacidade de resposta adequada às mudanças de composição do eluato
iii) resposta linear num intervalo alargado de quantidade de substância
iv) estável e período curto de estabilização
v) não deve contribuir para a dispersão (volume de célula desprezável)
vi) pouco sensível a alterações de fluxo, temperatura, composição da fase
móvel (compatível com eluição gradiente) e pressão
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Detetores de HPLC mais comuns:
i) detector espectrofotométrico UV-Vis
ii) detector espectrofotométrico de “diode array”
iii) detector fluorimétrico
iv) detector de índice de refracção
v) detector electroquímico
vi) detector de condutividade eléctrica (cromatografia iónica)
4.8.1 Detetores espectrofotométricos
A fase móvel não deve absorver ao comprimento de onda da
medição de absorvância para se conseguir a sensibilidade
máxima
Baseia-se na medição da absorvância a um dado comprimento
de onda fixo
é selectivo e de aplicação muito generalizada em HPLC
é muito versátil (200 – 900 nm)
é pouco sensível a alterações de temperatura e composição do eluente
(compatibilidade com eluição gradiente)
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Esquema de um detector de UV-Vis.
eluente
sol. referência
monocromador
lente
janelas de quartzo
filtrofonte de radiação
policromática
fotodetector
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Nos últimos anos surgiu um outro detetor espectrofotométrico designado por “diode
array”.
Nestes detetores consegue-se fazer a medição da absorvância a vários comprimentos de
onda simultaneamente, obtendo-se os espectros do eluato a qualquer momento da
separação cromatográfica.
31
.
32
4.8.2 Detetor de Fluorescência
Baseia-se na medição da fluorescência do eluato
i) tem elevada sensibilidade (1000 vezes mais sensíveis que os detectores de
UV-Vis)
ii) tem aplicação muito específica em HPLC (poucos compostos são
fluorescentes)
iii) dada a sua elevada sensibilidade, é comum derivatizar os solutos por forma
a torná-los fluorescentes
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4.8.3 Detetor de Índice de Refração
Baseia-se na medição comparativa entre o índice de refracção da fase móvel pura e o
eluente que sai pela coluna
i) é um detector quasi-universal
ii) baixa sensibilidade
iii) elevada sensibilidade a alterações de temperatura e pressão
iv) resposta linear restrita
v) não é compatível com a eluição
gradiente
vi) aplica-se principalmente em
cromatografia de exclusão
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4.8.4 Detetor Electroquímico
Baseia-se na medição da intensidade de corrente resultante de processos de oxidação ou
redução, quando se fixa o potencial aplicado ao eléctrodo de trabalho
i) elevada sensibilidade
ii) a selectividade depende do potencial aplicado
iii) é pouco reprodutível em alguns eluatos
iv) não é compatível com a eluição gradiente
eléctrodo de trabalho
eléctrodo de referênciaeléctrodo auxiliar
potenciostato de
3 eléctrodos
eluente
eluente