UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCANTARA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI

GUSTAVO PASSOS MEDROS LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS

THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1 EXPERIÊNCIA 1 – ESPECTROFOTOMETRIA

SANTO ANDRÉ

FEVEREIRO / 2010

Sumário

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................3

2. OBJETIVOS.......................................................................................................................5

3. METODOLOGIA...............................................................................................................5

3.1. Materiais ......................................................................................................................5

3.2. Métodos .......................................................................................................................5

4. RESULTADOS ..................................................................................................................6

5. DISCUSSÃO......................................................................................................................9

6. CONCLUSÃO..................................................................................................................11

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................11

8. ANEXOS..........................................................................................................................13

8.1. Anexo 1 - Exercício ...................................................................................................13

8.2. Anexo 2 – Tabela de dados espectrofotômetro..........................................................13

3

1. INTRODUÇÃO

O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a

intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de

medida estão duas formas principais de verificação de misturas a espectroscopia e a

espectrofotometria.

Espectroscopia é a separação, detecção e registro de mudanças de energia

envolvendo núcleos, átomos, íons ou moléculas. Essas mudanças podem ser

decorrentes de emissão, absorção, dispersão da radiação eletromagnética ou

partículas. [1]

Já a espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos

de onda entre o ultravioleta e o infravermelho, seus valores estão especificados na

Tabela 1. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luz monocromática

através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa

solução. Um prisma contido no aparelho separa a luz em feixes com diferentes

comprimentos de onda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática

através da amostra. O equipamento permite saber que quantidade de luz é

absorvida a cada comprimento de onda. [2]

Tabela 1 – Divisão do espectro eletromagnético na região do infravermelho até o ultravioleta.

Região Denominação

>16 µm Infravermelho distante 16µ m até 2,5 µm Infravermelho no NaCl

2500nm até 780nm Infravernelho próximo

780nm até 380nm Visível 380nm até 200nm Ultravioleta próximo 200nm até 10nm Ultravioleta no vácuo

O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um

composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância.

Como diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a

espectrofotometria permite identificar e quantificar substâncias com base no seu

espectro. A quantificação é realizada com a relação entre quantidade de luz

absorvida e concentração da substância. [2]

4

A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela

atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da

amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert –Beer (Eq. (1):

A clλ λ

ε= (1)

Sendo: Aλ = absorbância a fixo

ελ = constante para um fixo

c = concentração da solução absorvente

l = distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra

Ou seja, a absorbância da luz a cada comprimento de onda é diretamente

proporcional à concentração da solução contida na cubeta, sendo essas

normalmente com 1 cm de comprimento. Esta linearidade deixa de ocorrer a

concentrações muito elevadas da substância, sendo necessário diluir a amostra

antes de medir. [2]

Outra característica da Lei de Beer é a aditividade das absorbâncias. É

possível determinar simultaneamente duas ou mais espécies diferentes presentes

em uma amostra através dessa mesma lei. Isto pode ser realizado desde que não

ocorra nenhuma interação entre as espécies e que o espectro de absorção

observado pela mistura seja a soma dos espectros individuais que seriam obtidos

caso cada uma das espécies estivesse presente sozinha na solução e sob as

mesmas condições experimentais. Na prática essas condições não ocorrem, mas

mesmo assim é possível essa determinação. Para cada comprimento de onda, a

absorbância total devido às espécies presentes na solução pode ser expressa como

a soma das absorbâncias de cada uma delas. [1]

A lei de Beer é eficaz ao medir o comportamento da absorção de meios

contendo concentrações de analito relativamente baixas, sendo limitante. Para altas

concentrações, geralmente maior de 0,01M, a distância média entre as moléculas

responsáveis pela absorção diminui a ponto de cada molécula afetar a distribuição

de carga de suas vizinhas. Essa interação pode alterar a capacidade das moléculas

de absorver um determinado comprimento de onda da radiação. Como a interação

depende da concentração, ocorre um desvio da relação linear entre absorbância e

concentração. [3]

5

Atualmente existem tecnologias tão avançadas que se torna possível descrever

com precisão a estrutura exata de uma molécula. Os equipamentos permitem

detectar os tipos de elementos presentes no composto, a quantidade de cada um

deles, a posição tridimensional de cada átomo e muito mais.

2. OBJETIVOS

Esta experiência tem por objetivo compreender os conceitos e aplicações da

espectrofotometria.

Também são objetivos determinar o espectro UV-visível do complexo formado

entre os íons Cu2+ e as proteínas, utilizar o comprimento de onda de máxima

absorbância para elaboração de curva-padrão e determinação de absortividade e

calcular a concentração de proteínas de uma solução de albumina.

3. METODOLOGIA

3.1. Materiais

• Reagente de Biureto pré-preparados.

• Água destilada.

• Espectrofotômetro.

• Cubeta.

• Papel absorvente macio para limpeza das cubetas.

• 2 micropipetas volumétricas.

• Estante com 8 tubos de ensaio.

• Agitador tipo vórtex..

• Soluções-padrão de soro albumina bovina (BSA) com as concentrações

em %(m/v): 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,75.

• Amostra de concentração desconhecida.

3.2. Métodos

Adicionou-se 0,5 mL das amostras de diferentes concentrações em cada tubo

com auxílio de uma das micropipetas e um tubo com apenas água – denominado

branco. Em seguida com o uso da outra micropipeta foram adicionados 1,0 mL de

água destilada para completar 1,5 mL de solução.

6

Todos os tubos foram agitados manualmente e em seguida adicionados 1,5 mL

do reagente de Biureto e tornou-se a agitar, mas desta vez com o uso do agitador de

vórtex. Após 5 minutos de espera, a absorbância de cada amostra foi determinada

com o uso do espectrofotômetro.

O espectrofotômetro foi ajustado para o comprimento de onda 550nm, pois

este comprimento era o comprimento esperado de máxima absorbância da solução.

Mesmo assim, este valor foi ratificado pela análise da amostra de concentração

0,25% comparada ao branco em outro espectrofotômetro que varia automaticamente

os comprimentos de onda e calcula a máxima absorbância agilizando o

procedimento. Esta análise foi feita dentro dos comprimentos e 400nm a 800nm com

incremento de +5nm a cada novo teste.

O cálculo da amostra desconhecida foi feito com base nos dados coletados das

outras amostras.

4. RESULTADOS

Pretende-se preparar 100mL da solução de biureto, as unidades de % (m/v)

representam x g de soluto para 100mL de solução, para o CuSO4 0,15 % (m/v) é

necessário 0,15g e para o tartarato de sódio e potássio 0,06% (m/v) é necessário

0,06g. Já para o NaOH (0,75 mol/L), temos:

0,75 mol - 1L 1 mol - 40g

X – 0,1 L 0,075 mol - Y

X = 0,075 mol Y= 3 g de NaOH

Para a preparação de cada solução padrão temos o mesmo procedimento

citado acima para a unidade de % (m/v), porém como se quer obter 1mL de solução

deve-se dividir todos os valores por 100, para obter as massas necessárias.

0,125% → 1,25. 10-3 g

0,25%→ 2,5. 10-3 g

0,5%→ 5. 10-3 g

0,75%→ 7,5. 10-3 g

1%→ 1. 10-2 g

1,25%→ 1,25. 10-2 g

1,75%→ 1,75. 10-2 g

7

De acordo com a Figura 1, cujos dados encontram-se na Tabela 3 no Anexo

8.2, o valor obtido para o comprimento de onda de máxima absorção foi de 550nm.

Figura 1 – Curva-padrão.

De posse do valor de comprimento de onda utilizou-se tal valor e mediu-se a

absorbância em cada amostra (Tabela 2).

Tabela 2 – Absorbância coletada de cada amostra.

Concentração % Absorbância 0,125 0,07 0,25 0,12 0,5 0,23 0,75 0,33

1 0,44 1,25 0,52 1,75 0,62

Desconhecida 0,19

Com tais valores montou-se o gráfico da Figura 2. Utilizando o método de

aproximação linear no gráfico e utilizando a equação da reta obtida.,

8

Figura 2 – Gráfico da absorbância em função da concentração.

De acordo com o gráfico a função linear da absorbância no comprimento de

onda de 550 nm é dada por (2):

0,3528 0,0494y x= + (2)

Sendo o índice R2 de ajuste deste gráfico é igual a 97,78%, portanto esta reta

descreve satisfatoriamente uma função para os pontos inseridos no gráfico.

Considerando Lei de Lambert –Beer (Eq. (1)):

Como b = 1cm,

Pela comparação com o gráfico obtido, observar-se-á que a absortividade é

numericamente igual ao coeficiente angular da reta, cujo valor é 0,3528 L.cm-¹mol-1.

Os cálculos para a análise da amostra desconhecida foram feitos a partir da

equação da na Figura 2. Sendo x a concentração correspondente da absorbância y

medida.

0,3528 0,0494

0,0494 0,19 0,04940,3985 0, 40

0,3528 0,3528

y x

yx

= +

− −= = = ≈

(3)

Portanto a concentração da amostra desconhecida é de 0,40% (m/v).

Ambos os gráficos condizem com os exemplos da página 281 de [3] a respeito

dos gráficos obtidos em análises da Lei de Beer.

9

5. DISCUSSÃO

Como pode ser observado no decorrer do relatório, os resultados obtidos

permitem que se possam fazer análises, as quais podem estabelecer elementos de

comparação com as teorias existentes, bem como obter subsídeos didáticos, que

constatados na prática fortalecem e retificam a base teórica.

No decorrer do experimento, depois que os 9 tubos de ensaio foram

preenchidos, foi possível fazer a comparação devido a coloração. Além das

constatações quantitativas a cerca da amostra desconhecida, que estabeleceu a

comparação com as demais, também foi possível fazê-la tomando como base as

colorações das amostras, as quais tiveram variação de seu gradiente, onde as

amostras com maior concentração apresentavam cores mais escuras. A título de

observação, já poderia se constatar o intervalo da concentração da amostra

desconhecida, pois sua coloração ficou entre aquelas dos tubos 2 e 3, ou seja,

0,25% e 0,5%, respectivamente. Entretanto, há a necessidade de se determinar com

maior precisão, a medida do possível, quanto ao valor da concentração, como a

função do gráfico Absorbância x Concentração aproxima-se de uma reta, pôde-se

estimar a concentração da amostra desconhecida.

Conforme observado graficamente, existe um comportamento da absorbância

em função da concentração, considerando uma mesma substância. Sendo esta a

mesma, ao serem utilizadas amostras com concentrações diferentes, a absorbância

varia na mesma proporção, pois é diretamente proporcional. Intuitivamente faz

sentido, seguindo a linha de raciocínio baseada no fato de que quanto maior é o

número de partículas, maior concentração, maior é a probabilidade de fótons serem

absorvidos e, consequentemente, maior será a absorbância. Entretanto, embora não

seja possível visualizar neste experimento, para altas concentrações, a curva

padrão, depois de um certo ponto, tende a ser uma curva. [5]

A absorbância seria, de maneira grosseira, uma medida quantitativa para se

obter a quantidade de luz absorvida. Em contrapartida, existe uma outra variável que

está relacionada a absorbância denominada transmitância, que seria o quanto foi

transmitido, sem absorção, de luz. Existe uma relação simples entre estas duas

variáveis, determinada como:

10

, onde A é a absorbância e T a transmitância. Todavia, tal relação não

foi utilizada neste experimento, mas é passível de ser representada a fim de

apresentar a variável transmitância e sua relação com a absorbância [5].

Para este experimento utilizou-se outro método para a determinação numérica

da absorbância, sendo esta a equação (1). Fazendo uso dessa fórmula e realizando

a demonstração encontrada nos Resultados, pode-se achar uma relação com outra

variável, chamada absortividade, que, conforme determina a demonstração, é igual,

numericamente, ao coeficiente angular da reta do gráfico Absorbância x

Concentração. Portanto, quanto maior for a absortividade maior será a variação da

absorbância em função da concentração.

O gráfico plotado foi gerado a partir de medições realizadas com o mesmo

comprimento de onde, 550 nm. Entretanto, tal valor não é arbitrário, ele é fixado

devido ao uso do espectrofotômetro. Este aparelho utiliza a amostra em branco e

uma amostra qualquer, no caso 0,25%, e a partir delas faz medições, variando de 5

nm em 5 nm, encontrando, assim, a absorbância em cada comprimento de onde no

intervalo 400-800 nm. É a mesma função do espectrofotômetro, entretanto, ele é

capaz de fazer as mudanças automaticamente. Estas têm por objetivo fazer com

que seja encontrado o comprimento de onde haja a maior absorbância, cujo valor foi

registrado, como pode ser observado na Figura 1, como sendo 550 nm. Portanto,

tudo acima citado foi medido para este comprimento de onde, e, então, os números

devem receber a observação de que são para a maior absorbância possível, mas

que de qualquer forma, se fosse mudado o comprimento para outro, as propriedades

e características não se alterariam.

É importante destacar a função da amostra branca para o experimento. Tal

amostra deve servir como base para o espectrofotômetro, a fim de que ela seja a

referência para as medições das outras amostras.

Existem muitos erros que podem exercer papel significativo na alteração dos

resultados obtidos.

Possíveis erros gerados pelo instrumento de medição podem ser considerados,

no que diz respeito, inclusive, as casas de precisão do resultado. Considerando

ainda como parte do instrumento, as cubetas utilizadas podem provocar certo erro,

pois podem conter marcas provocadas pelo manuseio, bem como riscos ou outras

imperfeições que alterem a medição. Ainda referindo-se à cubeta, por se fazer uso

11

da mesma cubeta para mais de uma medição, pode acontecer de haver alguma

alteração de concentração, embora tenha ocorrido a medição na ordem crescente,

se existe uma concentração baixa no recipiente e nele é acrescido uma de

concentração maior, esta tende a ser diminuída. Embora as quantidades restantes

na cubeta sejam pequenas, não se pode descartar tal possibilidade.

Embora as micropipetas volumétricas tenham boa precisão, ainda existe um

certo erro aplicado a ela, mínimo, porém existente.

Os erros citados até então são previsíveis, porém existem outros que não são,

como o manuseio. Devido a se tratar de manuseio humano para a realização das

tarefas que não dependem da medição por instrumento, podem ocorrer

determinados erros, como, por exemplo, a colocação de maneira inadequada ou não

totalmente perfeita da substância no tubo de ensaio, o que faz com que possa haver

alguma pequena mudança.

6. CONCLUSÃO

Pode-se concluir, a partir da análise dos resultados e da teoria aplicada, que a

espectrofotometria, apesar das limitações, enunciadas no anexo deste relatório, é

um método que permite analisar compostos sensíveis à luz (em destaque a

albumina, utilizada neste experimento).

Tal método permite, além da medição da concentração, a identificação dos

compostos de determinada substância, através de comparação de resultados

obtidos por outros métodos, previamente calibrados.

A absortividade obtida, que é numericamente igual ao coeficiente angular da

reta obtida na Figura 2, vale 0,3528 Lcm-¹mol-1 e a concetração 0,40% (m/v).

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ. Base teórica da Espectrofotometria e da Colorimetria. Disponível em <http://www.ufpa.br/ccen/quimica/base%20teorica% 20da%20espectrofotometria.htm>. Acesso em 23 de fev. 2010.

[2] SECA, Ana Maria L. da. Espectrofometria. Universidade dos Açores. Disponível em <http://www.uac.pt/~anaseca/pdf_bioquimica/introd_espectrof.pdf>. Acesso em 27 de fev. 2010.

[3] SKOOG, Douglas A., HOLLER, F. J.; NIEMAN, Timothy A. Princípios de Análise Instrumental. 5.ed. Porto Alegre, Bookman, 2002. p.278-282.

12

[4] PROTEÍNAS. Disponível em <http://sitebiomedico.br.tripod.com/proteinas.htm>. Acesso em 23 de fev. 2010.

[5] Universidade de São Paulo. Lei de Beer. Disponível em http://plato.if.usp.br/1-2004/fap0181d/Lei%20de%20Beer.htm. Acessado em 03 de março de 2010.

13

8. ANEXOS

8.1. Anexo 1 - Exercício

Descreva o princípio do método de Biureto para a dosagem de proteínas,

relacionando suas vantagens e desvantagens em relação a outros métodos para

dosagem de proteínas.

Resp.:

O método por biureto foi proposto por Riegler em 1914, baseado na

observação de que substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam

um complexo de cor roxa com sai de cobre em soluções alcalinas. A intensidade da

cor formada é proporcional à quantidade de proteína, e a medida é feita num

colorímetro. [4]

Este método tem como vantagens ser bastante específico por não apresentar

problemas interferentes e também ser simples, rápido e barato. Também é vantajoso

por envolver uma reação com a ligação peptídica, assim o método determina

número de proteínas, ao contrário dos métodos de Kjeldahl e de Dumas que

determinam o Nitrogênio total. [4]

Porém ele tem duas desvantagens que são a necessidade de uma curva de

calibração tomada com um padrão conhecido de proteína, por exemplo, uma

proteína determinada por Kjeldahl. A cor formada no complexo não é idêntica para

todas as proteínas, porém os desvios causados são menores do que em outros

métodos colorimétricos. [4]

8.2. Anexo 2 – Tabela de dados espectrofotômetro

Tabela 3 – Dados do espectrofotômetro.

Nm Abs

400.0 0.088

405.0 0.076

410.0 0.065

415.0 0.056

420.0 0.049

425.0 0.044

430.0 0.041

435.0 0.039

440.0 0.038

445.0 0.038

450.0 0.039

455.0 0.042

460.0 0.045

465.0 0.049

470.0 0.053

475.0 0.059

480.0 0.064

485.0 0.069

490.0 0.076

14

495.0 0.083

500.0 0.089

505.0 0.095

510.0 0.101

515.0 0.107

520.0 0.112

525.0 0.116

530.0 0.119

535.0 0.122

540.0 0.123

545.0 0.124

550.0 0.124

555.0 0.123

560.0 0.121

565.0 0.119

570.0 0.116

575.0 0.113

580.0 0.110

585.0 0.106

590.0 0.101

595.0 0.096

600.0 0.091

605.0 0.086

610.0 0.079

615.0 0.073

620.0 0.068

625.0 0.062

630.0 0.056

635.0 0.050

640.0 0.045

645.0 0.040

650.0 0.035

655.0 0.030

660.0 0.026

665.0 0.022

670.0 0.018

675.0 0.015

680.0 0.012

685.0 0.009

690.0 0.007

695.0 0.005

700.0 0.003

705.0 0.001

710.0 -0.001

715.0 -0.002

720.0 -0.003

725.0 -0.004

730.0 -0.004

735.0 -0.005

740.0 -0.005

745.0 -0.006

750.0 -0.006

755.0 -0.006

760.0 -0.006

765.0 -0.006

770.0 -0.006

775.0 -0.006

780.0 -0.006

785.0 -0.006

790.0 -0.005

795.0 -0.005

800.0 -0.005