UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCÂNTARA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI

GUSTAVO PASSOS MEDROS LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS

THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1 EXPERIÊNCIA 5 – CARACTERIZAÇÃO DO AMIDO

SANTO ANDRÉ

ABRIL / 2010

Sumário

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................2 2. OBJETIVOS.......................................................................................................................4 3. METODOLOGIA...............................................................................................................4

3.1. Materiais .....................................................................................................................4 3.2. Reagentes....................................................................................................................4 3.3. Métodos ......................................................................................................................5

3.3.1. Parte 1: Extração do amido da batata. ................................................................5 3.3.2. Parte 2: Preparo da suspensão de amido.............................................................5 3.3.3. Parte 3: Exame microscópico dos grânulos de amido. .......................................6 3.3.4. Parte 4: Reação de caracterização com iodo. .....................................................6 3.3.5. Parte 5: Pesquisa do poder redutor. ....................................................................6

4. RESULTADOS ..................................................................................................................7 5. DISCUSSÃO......................................................................................................................9 6. CONCLUSÃO..................................................................................................................12 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................12 8. ANEXOS..........................................................................................................................13

8.1. Anexo 1 – Outros testes com Benedict.....................................................................13

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1. INTRODUÇÃO

Muitos produtos utilizados pelo mundo têm como fonte a flora brasileira, tendo

como exemplos: medicamentos, alimentos e seus aditivos, fibras, óleos naturais e

essenciais, cosméticos, produtos químicos, bio-combustível. Diversas são as classes

de compostos químicos que podem ser extraídos das nossas espécies vegetais,

sendo uma delas representada pelos polissacarídeos.

Os polissacarídeos pertencem ao grupo dos carboidratos e são formados por

polímeros naturais, constituídos de um único ou de diferentes tipos de

monossacarídeos podendo formar cadeias lineares como na celulose ou ramificadas

como no amido e no glicogênio. Possuem aplicações industriais diversas, sendo

extraídos de plantas (incluindo as algas), animais e fungos ou são obtidos via

fermentação microbiológica.

O amido é um composto que apresenta duas frações principais: a amilose e a

amilopectina, que correspondem respectivamente a cerca de 20% e 80% do amido

na maioria das plantas podendo ser encontrado em grande quantidade em certas

raízes (mandioca, batata doce), caules (batatinha) e sementes (trigo, arroz, milho) e

como todos os açucares possui papel energético no metabolismo destas [1, 2].

A amilose é composta por cadeias laterais de resíduos de glicose unidos pelo

carbono 1 (com configuração α) e 4, ligações α-1,4. A amilopectina, a fração

principal, contém cadeias lineares semelhantes à amilose, mas mais curtas (24-30

unidades de glicose) e contendo ramificações formadas por ligações entre carbono 1

e 6 (ligação α-1,6) [1].

As cadeias de amilopectina organizam-se em estruturas de complexidade

crescente, formando uma matriz semicristalina à qual se associam as cadeias

amilose, e que resultam na construção de grânulos de amido [1].

Na Figura 1 pode-se ver as ligações entre os monômeros de glicose para

formar a amilose.

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Figura 1 – Pequeno segmento de amilose, composto por unidades de D-glicose com lig. α-1,4. Uma

única cadeia pode conter milhares de unidades. Destaca-se que apenas uma extremidade terá

capacidade redutora, (grupo aldeído) [3].

A Figura 2 mostra a ramificação na amilopectina e como ela e a amilose se

ligam para formar o grão de amido.

Figura 2 – À esq. ponto de ramificação da amilopectina (lig. α-1,6). À dir. agregado de amilose e

amilopectina, a amilopectina forma duplas hélices com outras e com a amilose [3].

O uso do amido é muito diversificado, ocorrendo principalmente em indústrias

alimentícias, além de metalúrgica, mineração, construção, cosmética, farmacêutica,

papel e papelão, têxtil, entre outras.

Experimentalmente existem formas de identificar o amido que originalmente

possui uma coloração branca adicionando ao amido algumas gotas de solução de

Iodo (ou Lugol - Solução com 0,75 g de iodo, 3,75g de iodeto de potássio,

dissolvidos em 250 ml de água destilada) no qual produz uma coloração preto-

azulada (arroxeada) [2,4].

Uma forma de identificar açúcares redutores é através do reagente de Benedict

composto por uma solução a base de sulfato de cobre (CuSO4).

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2. OBJETIVOS

Os objetivos deste experimento são extrair amido da batata e purificá-lo;

caracterizar morfologicamente o amido por meio de microscópio óptico, analisando-o

antes de fervido e após ferver com e sem reagente Lugol e verificar qualitativamente

os açúcares redutores com uso de Benedict.

3. METODOLOGIA

3.1. Materiais

• Liquidificador.

• Béquer 200 ml.

• Gaze.

• Estufa de secagem.

• Papel de filtro.

• Funil de Büchner.

• Balança analítica.

• Papel de pesagem (ou vidro de relógio) e espátulas.

• Proveta 50 ml.

• Tubos de ensaio e estante.

• Banho de aquecimento fervente (~ 100ºC).

• Pipetas.

• Conta-gotas.

• Pinça de madeira.

• Microscópio Óptico Primo Star Zeiss, (n° de série 3124000417).

• Lâminas de microscopia.

3.2. Reagentes

• Batatas in natura.

• Água destilada.

• Lugol.

• Reagente de Benedict.

• Solução de glicose 1,0 % (m/v).

• Solução de sacarose 1,0 % (m/v).

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• Suspensão de amido 1,0 % (m/v).

3.3. Métodos

3.3.1. Parte 1: Extração do amido da batata.

Antes do inicio desta etapa era preciso coletar 50 g de batata descascada

utilizando a balança analítica para mensurar a massa obtida. No nosso caso, foi

obtida uma massa final de 50.614g com a utilização de uma batata e meia.

Feita, a coleta da amostra esta foi homogeneizada em um liquidificador com

200 ml de água destilada por 2 minutos obtendo uma solução viscosa de coloração

marrom. Feito isso, a solução resultante foi filtrada para separação entre a parte

sólida (restos de batata não homogeneizados) e liquida da solução deixando a parte

liquida em repouso por aproximadamente 5 minutos para que todo amido presente

na solução depositar-se no fundo do béquer.

Com o amido depositado no fundo do béquer a solução obtida na

homogeneização foi descartada deixando só o amido no fundo do béquer

inicialmente desprezando o sobrenadante.

Para a lavagem do amido, foram adicionados 100 mL de água ao amido

depositado no fundo do béquer seguido de agitação para que o amido se misturasse

á água e depois deixar a solução em repouso por 5 minutos para que o amido

voltasse a se depositar no fundo do béquer removendo completamente o

sobrenadante deixando só o amido no béquer. Repita esse procedimento por 5

vezes para lavagem completa do amido.

Por fim foi adicionado 200 mL de água ao amido purificado (após as 5 etapas

de lavagem), e deixado na bancada para que um técnico responsável o levasse para

ser filtrado em um funil de Büchner e conseqüente secagem na estufa.

3.3.2. Parte 2: Preparo da suspensão de amido.

Adicionou-se aproximadamente 0,5g do amido seco em um béquer, medindo a

massa em balança analítica. Em seguida foram adicionados 50 mL de água

destilada, formando uma suspensão de amido 1% (m/v).

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3.3.3. Parte 3: Exame microscópico dos grânulos de amido.

Em 2 tubos de ensaio foram adicionadas 2mL da solução de amido 1% (m/v)

obtida na seção 3.3.2, sendo o tubo 1 levado para o banho-maria até ficar

opalescente.

Foram analisadas 4 combinações ao microscópio óptico, 2 do tubo 2 (sem

ferver) e 2 do tubo 1 (fervido), sendo que cada tubo foi analisado com e sem a

adição de lugol.

Para a análise adicionou-se 1 gota da respectiva substância na lâmina de

microscopia e com uma lamínula sobre, a amostra foi levada ao microscópio óptico.

3.3.4. Parte 4: Reação de caracterização com iodo.

Foram adicionados 3 soluções em 3 tubos de ensaios, uma em cada, sendo as

soluções todas de 1 % (m/v) de amido (Tubo 1), água destilada (Tubo 2) e glicose

(Tubo 3).

Em cada tubo foram adicionadas 3 gotas de solução de lugol e observado o

resultado.

3.3.5. Parte 5: Pesquisa do poder redutor.

Em 4 tubos de ensaio foram preparadas as soluções conforme Tabela 1.

Tabela 1 – Preparação de tubos de ensaio para análise de poder redutor com Benedict.

Tubos Amostra (mL) H2O (mL) Benedict (mL)

B – 1,5 1,0

1 1,0 0,5 1,0

2 1,0 0,5 1,0

3 1,0 0,5 1,0

O tubo B (de Branco) serve como referência para o caso do Benedict não

realizar nenhuma reação com alguma das amostras. Os tubos foram fervidos em

banho-maria por 5 minutos e observadas as suas respectivas alterações. Sabe-se

de antemão que as amostras 1, 2 e 3 são de glicose, amido e sacarose, sendo que a

sua correta identificação dar-se-á após ferver as amostras, ou seja, após o Benedict

reagir com as amostras.

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4. RESULTADOS

Tendo em vista a massa de batata empregada e a baixa quantidade de amido

obtida no processo, percebeu-se que o procedimento é inviável uma vez que o

rendimento da reação é muito baixo o que geraria a perda de muita matéria prima

(no caso a batata) na obtenção de uma quantidade baixíssima do produto (amido).

A Figura 3 consiste de um esboço da visualização feita no microscópio óptico

dos grãos sem adição de lugol. Antes de aquecer o grão tem aparência compacta,

só se vê o contorno bem definido. Após aquecer o grão parece maior e rompido,

como se tivesse estourado, isso se explica pois as cadeias da amilase e da

amilopectina são unidas por ligações de hidrogênio que são desfeitas no

aquecimento, apresentou coloração esverdeada.

Figura 3 – Esboço em AutoCad 2004 da visão em microscópio para o amido sem lugol, antes e

depois de ferver. A cor verde é uma forma de retratar os limites vistos ao microscópio..

A Figura 4 consiste de um esboço da visualização feita no microscópio óptico

dos grãos com adição de lugol. Antes de aquecer há poucas partículas por área,

com coloração roxa dentro e fora delas, predominantemente dentro.

Após o aquecimento, visualiza-se muitas partículas por área de forma bem

definida e coloração roxa intensa que parece até de “derramado” para fora das

partículas

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Figura 4 – Esboço em AutoCad 2004 da visão do microscópio para o amido com lugol, antes e

depois de ferver. O Roxo simboliza o lugol, antes de ferver ele se encontrar bem acomodado no

amido, após ferver, é como se vazasse lugol para fora da molécula.

A Figura 5 mostra as alterações de cores após a colocação de 3 gotas de lugol

nos tubos com amido (Tubo 1), água destilada (Tubo 2) e glicose (Tubo 3), assim

pode-se caracterizar o amido pela adição de iodo.

Percebe-se que a mistura em todos os casos ficou amarelada, no entanto,

nota-se o tom mais escuro do tubo que continha amido.

Figura 5 – Tubos após adição de lugol. Da esquerda para direita: Tubo 1, 2 e 3.

Para a análise do poder redutor foram montados 4 tubos de ensaio conforme

Tabela 1, na Figura 6 é vista a coloração azul clara característica do Benedict.

Figura 6 – Tubos após da adição de Benedict e antes de ferver. Todos os tubos encontram-se azuis

claro devido ao Benedict. A partir da esquerda: Tubo Branco, 1, 2 e 3.

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Após levá-los para o aquecimento, nota-se claramente a mudança de

coloração em alguns tubos (Figura 7).

Figura 7 – Tubos após adição de Benedict e ferver. O tubo Branco (extrema esquerda) permaneceu

sem alteração. O tubo 1 apresentou coloração amarela no fundo (sacarose). O tubo 2 ficou marrom

(glicose) e o tubo 3 (extrema direita) assim como o Branco permaneceu inalterado (amido).

Como o fundo do tubo 1 apresentou coloração amarela, optou por agitá-lo,

obtendo uma mistura verde-musgo (Figura 8).

Figura 8 – Tubo 1 após ser agitado, verificou-se a coloração verde, mistura entre a cor amarela e a

cor azul.

5. DISCUSSÃO

A coloração roxa ocorre pois o amido se conforma espacialmente numa

estrutura capaz de aprisionar em seu interior o Iodo do lugol formando este

composto mais roxo.

Isto ocorreu devido ao amido ser constituído por amilose e amilopectina estas

são moléculas de alto peso molecular e podem sofrer complexação com iodo

formando complexos coloridos, sendo que a amilose forma um complexo azul com o

iodo e a amilopectina forma um complexo vermelho, a Figura 9 esquematiza a

formação do complexo amido-iodo [5].

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Figura 9 – Complexo Amido-Iodo.

No caso dos tubos com água e glicose, o iodo não teve com o que se

complexar originando a cor amarela clara. No tubo com amido a coloração deveria

ter sido um pouco mais escura, para o lado do azul, entretanto é suficientemente

diferente das demais, talvez a adição de mais uma gota poderia ter dado a

tonalidade ideal, mas isso não foi pensado no momento.

Sobre o teste com Benedict, o Tubo 3 que permaneceu inalterado como o

branco deve conter a amostra de amido pois este, de acordo com [5], não reage com

o Benedict devido a fato de ser um polímero.

O Tubo 2 trata-se da amostra de glicose (Figura 10), açúcar redutor de acordo

com [1,4], a coloração marrom (avermelhado) é característica dos óxido de cobre I

(cuproso – Cu2O) formados pelo íons Cu+ reduzidos dos íons Cu2+ da solução com

Benedict (a base de CuSO4).

A Reação de redução do Cu2+ para o Cu2O que caracteriza a cor marrom é

dada por (1).

22 2( ) 4 ( ) ( ) ( ) ( ) 2 ( )Cu aq OH aq RCHO aq RCCOH aq Cu O s H O l

∆+ −+ + → + + (1)

O Tubo 1 possui a amostra de sacarose (Figura 11), a sacarose não é um

açúcar redutor [3]. Conforme [3], a “propriedade não redutora (da sacarose) a

protege do ataque oxidativo ou hidrolítico por parte de enzimas vegetais até que ela

atinja seu destino no interior da planta”, no entanto, o resultado positivo neste teste

decorre da pequena presença de glicose e frutose no produto comercial [5]. A

sacarose pode ainda ser sido hidrolisada no meio alcalino, produzindo assim a

glicose [5], mas esse não é o caso do experimento.

O poder redutor de um açúcar vem da oxidação de seu carbono anomérico,

onde seu grupo carbonila é oxidado a carboxila. No caso da glicose (e também da

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frutose) por ser um monossacarídeo seu carbono anomérico está disponível para a

redução.

Figura 10 – Cadeias da glicose (Estruturas α e β)[3].

A sacarose (glicose + frutose) é um dissacarídeo que se caracteriza por ser

não redutor, justamente por seu carbono anomérico está comprometido na ligação

glicosídica entre os anéis da glicose e da frutose. Dessa forma não se espera que

ela reduza o Benedict tal como feito pela glicose.

Figura 11 – Cadeia da sacarose [3].

No Anexo 8.1 encontram-se imagens de outros testes de açúcares com o

reagente Benedict, que servem para ilustrar e corroborar com os resultados obtidos

neste experimento.

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6. CONCLUSÃO

O amido é uma cadeia de carboidratos utilizada pelos vegetais como reserva

energética por ser constituído de diversos monômeros de glicose.

Como o amido forma uma estrutura espacial de hélice, ele é capaz de

aprisionar iodo em sua cadeia formando o composto amido-iodo, dessa forma é

possível verificar a presença de amido numa solução com a adição de lugol (a base

de iodo), pela coloração adquirida pelo complexo, como foi confirmado na

visualização ao microscópio óptico.

O teste do Benedict mostra-se como uma ferramenta interessante para a

identificação de açúcares redutores devido à capacidade destes açúcares de reduzir

os íons de cobre advindos do Benedict e formar compostos com cores como

vermelho e marrom que são bem distintas do azul claro inicial do reagente. De

acordo com os testes, as amostras desconhecidas 1, 2 e 3 são respectivamente:

sacarose, glicose e amido.

De onde se conclui que a glicose possui poder redutor notável, a sacarose

pode conter vestígios de glicose e frutose em sua solução, além destes compostos

também poderem ser obtidos a partir da sacarose por hidrólise e, o amido apesar de

possuir uma extremidade redutora, não é capaz de formar o óxido de cobre I de cor

marrom avermelhada quando na presença do Benedict.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo B. Bioquímica Básica. 3.ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2007. p.89;165.

[2] FONSECA, Albino. Biologia. 1.ed. Editora IBEP p17-18.

[3] LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica, 4. ed. New York: Worth Publishers, 2006, p.236-248.

[4] PDAMED- Dicionário Digital de Termos Médicos 2007. Disponivel em: <(http://www.pdamed.com.br/diciomed/pdamed_0001_10781.php) > >. Acesso em 21 de abr. 2010.

[5]DE FREITAS, J. C. R (FAFIRE); MATOS, A, A (UFRPE); DA SILVA, M. C (FAFIRE); FREITAS FILHO, J. R (UFRPE). Identificando Açúcares em Alimentos: Aula Experimental Como Ferramenta Facilitadora Para o Processo Ensino-Aprendizagem. Disponível em: <http://www.abq.org.br/cbq/2009/trabalhos/6/6-271-437.htm>. Acesso em 22 de abr. 2010.

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8. ANEXOS

8.1. Anexo 1 – Outros testes com Benedict.

As Figura 12 e Figura 13 ilustram resultados do teste do Benedict para

açúcares redutores.

Figura 12 – Resultados do teste com Benedict para glicose, sacarose e frutose. Glicose e frutose são

redutores, perceba a cor marrom-avermelhada como a obtida no neste experimento. Fonte da

imagem:

http://jchemed.chem.wisc.edu/JCeSoft/CCA/CCA5/MAIN/1ORGANIC/ORG18/TRAM18/B/0591308/M

OVIE.HTM.

Figura 13 – Água. Glicose. Cebola. Batata. Amido.

Água e Amido não sofrerão anteração de cor. A Glicose se tornou vermelha, parecida com o marrom

deste experimento. A Cebola e a Batata também mudarão de cor, a cor é relativa à quantidade e tipo

de açúcar presente. Fonte da imagem:

http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/bio%20101%20laboratory/ch

emical%20composition%20of%20cells/chemical%20composition%20of%20cells.htm