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Trabalho apresentado como avaliação parcial da disciplina de Transformações Bioquimicas do BC&T da UFABC.Trata sobre Aminoácidos.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH
FELIPE SILVA DE ALCÂNTARA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI
GUSTAVO PASSOS MEDROS LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS
THIAGO RODRIGUES BRITO
RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1 EXPERIÊNCIA 2 – AMINOÁCIDOS
SANTO ANDRÉ
MARÇO / 2010
Sumário
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................2 2. OBJETIVOS.......................................................................................................................5 3. METODOLOGIA...............................................................................................................5
3.1. Materiais .....................................................................................................................5 3.2. Métodos ......................................................................................................................5
4. RESULTADOS ..................................................................................................................6 5. DISCUSSÃO....................................................................................................................11 6. CONCLUSÃO..................................................................................................................12 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................13
2
1. INTRODUÇÃO
As proteínas são compostos orgânicos de estrutura complexa e elevado peso
molecular e apresentarem funções variadas, são sintetizadas a partir de apenas 20
aminoácidos diferentes. Mesmo o número de monômeros diversos parecendo
pequeno, como as proteínas são compostas por centenas de aminoácidos e cada
um deles podendo estar presente mais de uma vez, a probabilidade de construção
de moléculas diferentes é muito grande [1].
Os aminoácidos são compostos que apresentam, na sua molécula, um grupo
amino e um grupo carboxila, com exceção da prolina. Tem uma fórmula básica
comum, na qual os grupos amino e carboxila estão ligados ao carbono α, ao qual
também se liga um átomo de hidrogênio e um grupo variável chamado cadeia lateral
ou grupo R (Figura 1)[1].
Figura 1 – Fórmula básica de um aminoácido.
Uma de suas classificações é de acordo com a polaridade do grupo R,
dividindo-os em duas grandes categorias: aminoácidos apolares (Hidrofóbicos) e
aminoácidos polares (Hidrofílicos).
Os aminoácidos apolares (Figura 2) têm grupos R constituídos por cadeias com
caráter de hidrocarboneto, que não interagem com a água. Têm geralmente uma
localização interna na molécula [1].
Figura 2 – Aminoácidos Apolares.
3
Já os aminoácidos classificados como polares (Figura 3) são os que têm, nas
cadeias laterais, grupos com carga elétrica líquida ou grupos com cargas residuais,
que os capacitam a interagir com a água. São geralmente encontrados na superfície
da molécula protéica. Estes aminoácidos são subdivididos em três categorias,
segundo a carga apresentada pelo grupo R em pH 7: aminoácidos básicos, se a
carga for positiva; aminoácidos ácidos, se a carga for negativa; e aminoácidos
polares sem carga, se a cadeia lateral não apresentar carga liquida [1].
Figura 3 – Aminoácidos Polares
Em geral os aminoácidos podem formar polímeros pela ligação do grupo
carboxila de um aminoácido com o grupo amino de outro. Esta ligação carbono-
nitrogênio, chamada ligação peptídica, é obtida pela exclusão de uma molécula de
água [1].
As propriedades da ligação peptídica impõem restrições ao dobramento do
polímero formado. A ligação peptídica, apesar de ser representada por um único
traço de ligação, tem características intermediárias entre uma ligação simples e uma
dupla ligação, devido às interações entre duas formas de ressonância (Figura 4) [1].
Figura 4 – Ressonância da ligação peptídica.
4
A consequência desse caráter parcial de dupla ligação é que não há
possibilidade de rotação em torno da ligação peptídica. Dessa forma, os quatro
átomos dos grupamentos que participam da ligação peptídica ficam dispostos em
um plano rígido, constituindo o que se costuma chamar de grupo peptídico ou
unidade peptídica. Mesmo assim, existem pontos de dobramento entre as unidades
peptídicas rígidas, graças à possibilidade de rotação em torno das ligações com o
carbono α, que são ligações efetivamente simples [1].
O polímero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia
constituída por unidades planares, unidas entre si por uma articulação flexível. Esta
cadeia chama-se cadeia polipeptídica.
A cadeia polipeptídica pode conter de dois a milhares de aminoácidos mas,
qualquer que seja o número de aminoácidos, os peptídeos sempre apresentam um
grupamento amino livre em uma das extremidades (amino terminal) e um grupo
carboxila livre na outra (carboxila terminal) [1].
Uma forma de analisar o poder tamponante dos aminoácidos é analisar sua
curva de titulação. Na Figura 5, tem-se como exemplo a titulação da glicina. Os
valores de seus pKa’s são os pontos de inflexão da curva ao longo do eixo x, no
caso da glicina o ponto isoelétrico é o ponto médio entre os dois pKa’s e fica na
região cujo pH cresce abruptamente com pouca adição de NaOH.
Figura 5 – Poder tamponante e curva de titulação da glicina. [2] e [3].
H+ dissociados por molécula. Adição da NaOH
5
O ponto isoelétrico é o ponto onde cada molécula possui carga elétrica total
nula, sendo possível calcular o pH neste ponto de acordo com a equação (1.1).
2
i jpK pK
PI+
= (1.1) (VOET, 2006 p.70)
Sendo pKi e pKj valores de pKa antes e depois da espécie neutra,
respectivamente. No caso de aminoácidos sem cadeia polar, como a glicina, pKi e
pKj representam pKa 1 e pKa 2. Em aminoácidos com cadeia lateral polar, com uma
função carboxila (ácidos aspártico e glutâmico), pKi representa pKa1 e pKj o pKaR
(pKa do radical R). No caso de aminoácidos com amina em sua cadeia lateral, pKi
representa o pKaR e pKj o pKa2 [2].
2. OBJETIVOS
Esta experiência tem por objetivos a determinação dos valores de pKa de
aminoácidos por meio da construção dos gráficos das titulações ácido-base. E
comparar os perfis das curvas e correlacionar os valores de pKa com os grupos
presentes nos aminoácidos.
3. METODOLOGIA
3.1. Materiais
• Soluções 0,1 mol/L de glicina, arginina e ácido glutâmico.
• Solução 4 mol/L de HCl.
• Solução 0,25 mol/L de NaOH.
• pHmetro.
• 1 pipeta volumétricas de 20 mL.
• 1 pipeta de Pasteur.
• 1 Bureta.
• 3 béqueres de 100 mL.
3.2. Métodos
Foram pipetados 20 mL de solução 0,1 mol/L da solução de um dos
aminoácidos em um béquer de 100 mL. Em seguida, o pH da solução foi medido
com uso do pHmetro e anotado.
6
O próximo passo foi acidificar a solução do aminoácido com solução HCl
4mol/L, inserido gota a gota, até o pH do meio atingir 1,0.
Para a construção das curvas de pH do aminoácido, utilizou-se NaOH. Para tal,
uma bureta foi completada com uma solução de NaOH 0,25mol/L. O pH era medido
a cada adição de 1 mL de NaOH, sempre agitando o béquer antes da inserção do
eletrodo do pHmetro, até o pH atingir 12,5. Quando o pH encontrava-se na casa de
12,17, passou-se a adicionar 0,5 mL de NaOH.
Apenas a glicina foi titulada. Os dados referentes a arginina e ao ácido-
glutâmico foram levantados por outrem.
4. RESULTADOS
Os resultados das titulações dos três aminoácidos encontram-se na Tabela 1
Tabela 1 – pH em função do NaOH adicionado aos 3 aminoácidos.
Glicina Arginina Ácido Glutâmico pH inicial = 7,5 pH inicial = 10,85 pH inicial = 2,83
V NaOH (mL) pH Glicina V NaOH (mL) pH Arginina V NaOH (mL) pH 0,00 1,04 0,5 1,01 0,00 0,97 1,00 1,18 1,00 1,06 0,50 1,00 2,00 1,26 1,50 1,13 1,00 1,06 3,00 1,40 2,00 1,17 1,50 1,12 4,00 1,55 2,50 1,22 2,00 1,18 5,00 1,72 3,00 1,27 2,50 1,26 6,00 1,88 3,50 1,32 3,00 1,33 7,00 2,06 4,00 1,38 3,50 1,40 8,00 2,25 4,50 1,44 4,00 1,49 9,00 2,45 5,00 1,50 4,50 1,58
10,00 2,66 5,50 1,57 5,00 1,66 11,00 2,99 6,00 1,63 5,50 1,76 12,00 3,68 6,50 1,66 6,00 1,85 13,00 8,70 7,00 1,75 6,50 1,96 14,00 9,19 7,50 1,82 7,00 2,00 15,00 9,51 8,00 1,91 7,50 2,05 16,00 9,75 8,50 1,94 8,00 2,27 17,00 9,96 9,00 2,00 8,50 2,40 18,00 10,21 9,50 2,10 9,00 2,54 19,00 10,40 10,00 2,21 9,50 2,70 20,00 10,76 10,50 2,32 10,00 2,83 21,00 11,26 11,00 2,41 10,50 3,02 22,00 11,84 11,50 2,56 11,00 3,40 23,00 12,17 12,00 2,79 11,50 3,53
7
23,50 12,24 12,50 2,97 12,00 3,65 24,00 12,32 13,00 3,30 12,50 3,78 24,50 12,39 13,50 4,50 13,00 3,97 25,00 12,42 14,00 8,11 13,50 3,98 25,50 12,47 15,00 8,81 14,00 4,04 26,00 12,50 16,00 9,08 14,50 4,20
17,00 9,33 15,00 4,31 18,00 9,55 15,50 4,47 19,00 9,77 16,00 4,61 20,00 10,03 16,50 4,80 21,00 10,41 17,00 5,04 22,00 11,13 17,50 5,28 23,00 12,08 18,00 6,21 23,50 12,24 18,50 8,49 24,00 12,37 19,00 8,82 24,50 12,47 19,50 9,04 25,00 12,56 20,00 9,23
20,50 9,36 21,00 9,50 21,50 9,63 22,00 9,77 22,50 9,89 23,00 9,97 23,50 10,07 24,00 10,21 24,50 10,35 25,00 10,54 25,50 10,88 26,00 11,29 26,50 11,70 27,00 11,95 27,50 12,12 28,00 12,23 28,50 12,35 29,00 12,42 29,50 12,50
Com dados da Tabela 1 foram confeccionados os gráficos (Figura 6 a Figura 9)
das titulações de cada aminoácido com uso do Microsoft Excel.
8
pH Glicina
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00NaOH (mL)
pH
Figura 6 – Titulação da Glicina (titulação própria).
De acordo com a Figura 6 o 1º ponto de inflexão da curva está no região em
torno de 5,00 mL de NaOH, ou seja,do pH 2,00. O 2º ponto de inflexão encontra-se
na região ao redor do pH 10,00. Utilizando a equação (1.1), o Ponto Isoelétrico é
igual a 6.
pH Arginina
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00NaOH (mL)
pH
pH Arginina
Figura 7 – Titulação da arginina (titulação externa).
Segundo a Figura 7 o 1º ponto de inflexão da curva está no região em torno de
5,00 mL de NaOH, que tal como na Figura 6, possui pH ao redor de 2,00. O 2º ponto
de inflexão encontra-se ao redor do pH 9,00. O 3º ponto a partir do zero, representa
o pKaR, cujo valor está na região do pH 12,00 [2] a [3].
Usando a equação (1.1) e o pKa2 = 9,00 e pKaR = 12,00, o Ponto Isoelétrico é
igual a 10,50.
9
pH ácido Gluitâmico
0
2
4
6
8
10
12
14
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
NaOH (mL)
pH
pH
Figura 8 – Titulação da ácido-glutâmico (titulação externa).
Pelo gráfico da Figura 8, vê-se que a curva de titulação do ácido glutâmico é
ligeiramente diferente das dos outros aminoácidos. O ponto de inflexão parece ser
menos acentuado e se encontra na região ao redor de 5 mL de NaOH que implica
numa região no eixo do pH centrada em 2,00. O 2º ponto fica próximo do 1º, na
região do pH 4,00 e o 3º ponto na região do pH 10,00. O 2º ponto é o pKaR do
radical carboxila [2] e [3].
O Ponto Isoelétrico calculado com a equação (1.1) e usando o pKa1 e o pKaR
é igual a 3.
Na Figura 9 encontram-se os três gráficos sobrepostos de forma a permitir a
comparação entre os mesmos.
Curvas Sobrepostas
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
NaOH (mL)
pH
pH Glicina pH Arginina pH
Figura 9 – Sobreposições das titulações.
10
É possível ver Figura 9 que a concentração de NaOH requerida para aumentar
o pH do ácido-glutâmico foi a maior entre os três aminoácidos.
Nota-se que cada gráfico possui ao menos dois pontos de inflexão, um antes e
o outro depois do ponto que apresenta uma brusca mudança de pH do meio, na
região do pH 6, de certo modo pode-se também interpretar como a mudança do
meio de ácido para básico, similar a uma titulação ácido-base forte.
Antes do pH 6, o grupo COOH (COO–) atua como tamponante devido a sua
afinidade por prótons na faixa do pH 2. Depois do 6, grupo NH2 (NH3+) passa a atua
como o tampão na faixa do pH 9, dada também sua afinidade por prótons neste pH.
[3]. Conforme observado em cada curva na Figura 9.
Dos três aminoácidos analisados, somente a glicina não possui cadeia lateral
ionizável, ou sequer possui uma cadeia lateral, apenas um átomo de Hidrogênio em
seu grupo R associado.
A Tabela 2 compara os valores de pKa dos gráficos com os encontrados nas
literaturas de [2] a [3]:
Tabela 2 – Comparação dos valores de pKa determinados e da literatura [2] a [3].
Gráfico Calc. Graf. Literatura
pKa1 pKa2 pKaR PI pKa1 pKa2 pKaR PI
Glicina 2 10 ----- 6,0 2,35 9,87 ----- 6,1
Arginina 2 9 12 10,5 1,82 8,99 12,548 10,75
Ácido glutâmico 2 10 4 3,0 2,10 9,5 4,07 3,1
É interessante agora, analisar as equações de equilíbrio dos aminoácidos.
Iniciando pela glicina (1.2):
(1.2)
Analisando as formas em equilíbrio da esquerda para a direita, tem-se a forma
ácida � neutra � básica, assim nas formas possíveis do aminoácido, que o grupo
NH3+ só se dissocia se o grupo –COOH já estiver completamente dissociado em –
COO– [3].
Equação de Equilíbrio para a Arginina (1.3):
11
(1.3)
Analisando as formas em equilíbrio da esquerda para a direita, tem-se a forma
altamente básica � levemente básica � neutra � ácida. Isso justifica a existência
de três pKa's, sendo dois do lado básico da curva da Figura 7.
Equação de equilíbrio para o Ácido Glutâmico (1.4):
(1.4)
Analisando as formas em equilíbrio da esquerda para a direita, tem-se a forma
básica � neutra � levemente ácida � altamente ácida. Isso justifica a existência de
três pKa's, sendo dois do lado ácido da curva da Figura 8.
5. DISCUSSÃO
Poder-se-ia utilizar soluções de concentrações menores de NaOH tal como
analisar em intervalos de adição menores Provavelmente facilitaria a visualização
dos valores de pKa pois aumentaria o número de pontos da curva, tornando a
visualização mais precisa.
No caso da glicina, que não possui grupo ionizável na cadeia lateral, não
haveria necessidade de maior quantidade de pontos na curva (menor concentração
da base) por ser apolar, ela não apresenta outro pKa intermediário que interferiria na
construção do gráfico.
12
No caso dos outros dois aminoácidos, ambos polares, a presença de um pKa
intermediário requer mais pontos para uma melhor identificação dos pKa's na curva.
Todavia, o experimento tornar-se-ia muito longo, exigindo maior cautela e
atenção do titulador.
No caso específico do grupo carboxila (-COOH), que como visto anteriormente,
funciona como tampão na faixa de pH 2. Como neste aminoácido a cadeia ionizável
é um radical carboxila, acabava ocorrendo uma “espécie de interferência” entre os
dois grupos, de forma que o aminoácido atue como tamponante em pH 2 e 4, assim
espera-se que com mais pontos de medição neste intervalo e com incrementos
menores, se torne possível uma melhor definição destes dois pKa’s.
Também é possível estimar qual a espécie dominante em cada aminoácido
antes da titulação, comparando o pH inicial com os pKa’s calculados / tabelados.
• Glicina: pH inicial 7,5. Próximo de PI, porém do lado no NH3+.
• Arginina: pH inicial 10,85. Acima de PI, próximo do pKaR do lado no NH3+.
• Ácido-Glutâmico: pH inicial 2,83. Abaixo de PI, próximo do pKa1 do lado no
COO–.
6. CONCLUSÃO
Conclui-se que é possível determinar os valores de pKa dos aminoácidos por
titulações ácido-base sendo os valores de pKa1 e pKa2, respectivamente, para a
glicina, 2 e 10; arginina 2, 9.5 e pKaR = 10; ácido glutâmico 2,10 e pKaR = 4.
Como os aminoácidos possuem os grupos COOH- e NH3+, os valores de pKa
serão próximos de 2 e 9, variando para cada aminoácido.
Também se conclui que as curvas de titulação são similares quanto à forma da
curva no gráfico permitindo comparar seus pKa entre si e também analisar o
comportamento em diferentes pH.
13
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo B. Bioquímica Básica. 3.ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2007. p.11-30.
[2] VOET, Donald; VOET. Judith G. et al. Bioquímica. 3.ed. Porto Alegre, Artmed, 2006. p.65-71.
[3] CARLINI, Célia R. Aminoácidos e a Ligação Peptídica: a base estrutural das proteínas. Universidade Federal do RS. Disponível em <http://www.ufrgs.br/laprotox/ Biof%20prot/Aula%20on-line%201%20-%20aminoacidos-peptideos.ppt>. Acesso em 11 de mar. 2010.
