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• Alto campo magnético externo cria uma magnetização (alinha os spins) quebra a degenerescência dos níveis de energia • Campo eletromagnético oscilante gira a magnetização provoca transições entre os níveis de energia • Interações deslocamento químico; dipolar; escalar; núcleo-elétron; quadrupolar) deslocamento e/ou desdobramento dos níveis de energia definem as posições das linhas de ressonância no espectro • Relaxação longitudinal; transversal decaimento da magnetização retorno ao equilíbrio FID (Free Induction Decay) linhas de largura não nula e intensidade finita
Relembrando - RMN
Núcleo (relativo) 0 em 14 T abundância sensibilidade natural (relativa)
Núcleos de spin ½
Bo
E
2
0BhE
14T
1H = 600 MHz
13C = 150 MHz
14T
Núcleos de spin ½
Experimento 1D mais simples Parâmetros:
• número de repetições – aumentar relação sinal/ruído • número de repetições “dummy” – equilibrar a amostra • largura espectral (ppm) • centro do espectro (ppm) • resolução espectral (pontos) – define tempo da aquisição (acq) • tempo morto (d1) entre as repetições (ms) – para sistema relaxar • duração (p1) e potência do pulso de 90 (us, dB) • ganho do sinal
Relaxação
Relaxações Induzidas por processos a nível molecular Interações dos spins nucleares com sua vizinhança (trocas de energia) Processos dependentes do tempo (movimento Browniano molecular) Flutuações do campo magnético local
• Relaxação longitudinal ou spin-rede (R1,T1) Troca de energia entre spin e rede Sistema dissipa excesso de energia aos arredores Volta ao equilíbrio térmico (mínima entalpia) T1 mede o tempo para que a magnetização longitudinal (em z) seja recuperada Determina, predominantemente, a intensidade do sinal observado
• Relaxação transversal (R2, T2) Troca de energia entre spin e spin Sem mudança da energia total do sistema Processos independentes do tempo também irão contribuir Difusão dos spins sobre o cone (máxima entropia) T2 mede o tempo para que a magnetização transversal (em xy) seja perdida Determina a largura do sinal observado
http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/other/t1t2/t1t2.html
Medida de T1 (longitudinal; spin-rede)
Após pulso de (180)x: Após : Após um novo pulso de (90)x é feita a aquisição. A intensidade do sinal será nula em:
http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/other/t1t2/t1t2.html
Medida de T2 (transversal; spin-spin)
Após pulso de (90)x:
A magnetização começa a perder a coerência no plano xy:
Após é dado um novo pulso de (180)y que irá refocalizar a magnetização. Após a refocalização estará completa, e é feita a aquisição. Variar =2 e obter os espectros. Simular seus máximos pela equação acima.
Mecanismos de relaxação
Cinco mecanismos de relaxação são relevantes em RMN de sistemas biológicos: • Relaxação pela anisotropia de descolamento químico (desprezível em 1H) Campo magnético local causado pela núvem eletrônica é anisotrópico, variando com o movimento Browniano molecular.
• Relaxação dipolar (predominante em 1H) Interação dipolar é promediada a zero em líquidos, porém a rápida reorientação molecular origina campos flutuantes que estimulam a relaxação.
• Relaxação via acoplamento escalar JAX pode ser dependente do tempo (relaxação escalar do primeiro tipo); campo magnético em X na posição de A pode ser modulada pela relaxação de X (relaxação escalar do segundo tipo).
• Relaxação paramagnética (presença de elétrons desemparelhados) Predomina sobre relaxações de spin nuclear
• Relaxação quadrupolar (núcleos com spin > ½)
As taxas de relaxação serão função das probabilidades de relaxação W1
I, W1S, W0
IS e W2IS.
W1
I, W1S : single quantum
SINAL W0
IS : zero quantum W2
IS : double quantum
não são observadas normal- mente, porém podem estar presentes em mecanismos de relaxação
bI bS
I S
bI S
I bS
W1S
W1S
W1I
W1I
W2IS
W0IS
Caminhos de relaxação
Considerando um sistema I S (por exemplo 15N 1H). sistema em equilíbrio aplicando a RF: saturando S (equalizando suas populações)
bI bS
I S
bI S
I bS
bI bS
I S
bI S
I bS
Relaxação longitudinal
sistema relaxando, caso sistema relaxando, caso W0
IS e W0IS forem nulos W0
IS e W0IS forem não-nulos
A intensidade de ressonância do spin S vai depender essencialmente da diferença de população entre os níveis de energia envolvendo transições S (no exemplo, = 2).
bI bS
I S
bI S
I bS
W1S
W1S
bI bS
I S
bI S
I bS
W1S
W1S
W2IS
W0IS
Analisando as diferenças de população intensidade do sinal
• Sistema em equilíbrio (N = 4; = 2).
Diferença de população entre os níveis de transição W1
I 2 = W1
S 2 = W0
IS 0 W2
IS 4 = 2
bI bS
I S
bI S
I bS
N
N
N+
N-
• aplicando a RF: saturando S (equalizando suas populações).
Diferença de população entre os níveis de transição W1
I 2 = W1
S 0 W0
IS 2 = W2
IS 2 =
bI bS
I S
bI S
I bS
N+/2
N-/2
N+/2
N-/2
• o sistema vai relaxar, tentando retornar às diferenças de população entre os níveis de transição.
No equilíbrio Fora do equilíbrio Diferença W1
I 2 = W1I 2 = = 0 (em equilíbrio)
W1S 2 = W1
S 0 = 2 = (transições) Caso o caminho de relaxação W1
S for possível, o sistema retornará ao equilíbrio sem a necessidade de utilizar os caminhos W0
IS e W2IS .
Mas se o caminho de relaxação W1
S estiver impedido, por exemplo, por uma saturação continuamente aplicada? O sistema terá de utilizar os caminhos W0
IS e W2IS para
relaxar EXPERIMENTO NOE (Nuclear Overhauser Enhancement). • Relaxação cruzada (): Ocorre quando dois spins estão próximos no espaço Obtida através da medida do NOE
Experimento NOE
Considerando um sistema I S (por exemplo 15N 1H). sistema em equilíbrio aplicando a RF: saturando S (equalizando suas populações)
bI bS
I S
bI S
I bS
bI bS
I S
bI S
I bS
Mantendo a saturação em S "ligada", o caminho W1S não poderá ser utilizado para
relaxar. O sistema só tem duas maneiras de relaxar:
No equilíbrio Fora do equilíbrio Diferença
W1I 2 = W1
I 2 = = 0 (em equilíbrio) W1
S 2 = W1S 0 = 2 = (fixa pela saturação)
W0IS 0 W0
IS 2 = = 2 = (transições) W2
IS 4 = 2 W2IS 2 = = 2 = (transições)
W0IS
bI bS
I S
bI S
I bS
W2IS
bI bS
I S
bI S
I bS W1I
W1I
W1I
W1I
Devido ao caminho W0IS teremos:
W0
IS aumenta a população no topo de uma transição I diminui a população na base da outra transição I
diminui a diferença de população entre os níveis I
diminui o sinal das transições I
N+/2-d
N-/2+d
N+/2
N-/2
W0IS
W1I
W1I
Devido ao caminho W2IS teremos:
W2
IS diminui a população no topo de uma transição I aumenta a população na base da outra transição I
aumenta a diferença de população entre os níveis I
aumenta o sinal das transições I
N+/2
N-/2
N+/2+d
N-/2-d
W1I
W1I
W2IS
Tendência de W0IS diminuir o sinal das transições I devido à saturação em S
Tendência de W2IS aumentar o sinal das transições I devido à saturação em S
Essas tendências são contrabalanceadas por W1
I (que já está em equilíbrio). Resultado líquido depende do balanço W0
IS /W1I e W2
IS /W1I
W0
IS dominante sobre W1I NOE NEGATIVO (moléculas grandes)
W2IS dominante sobre W1
I NOE POSITIVO (moléculas pequenas) Origem das transições W0
IS e W2IS : campos flutuantes devido aos dipolos nucleares.
NMR em soluções:
• movimento molecular rápido interação dipolar é promediada a zero • rápida reorientação molecular origina campos flutuantes estimulam relaxação
NOE irá depender da distância internuclear (NOE d-6) NOE fornecerá informações de distância!!
http://nmr.wvu.edu/manuals/1_d_experiments/1d_noe_difference