Replicación del ADN y la Metódica

del PCR Curso de Biología Molecular y Genómica,

Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM),

Facultad de Medicina

Universidad de Chile

Dr. Juan Venegas Hermosilla, PhD.

Programa de Biología Celular y Molecular

ICBM, Fac. de Medicina, U. de Chile.

jvenega@med.uchile.cl

Enero, 2018

Lógica y estructura de la clase

PARA PODER ENTENDER EN QUE CONSISTE LA REPLICACIÓN DEL

ADN, PRIMERO DEBEMOS CONOCER LAS BASES QUÍMICAS DE

LAS MOLECULAS QUE PARTICIPAN EN ESTE FENÓMENO

BIOLOGICO COMPLEJO.

DE TAL MANERA QUE… LA ESTRUCTURA QUE TENDRA ESTA

CLASE …

Estructura de la clase

1. Propiedades Químicas y Físicas del

ácido desoxirribonucleico ADN o DNA

2. Replicación

3. Mutaciones

4. El método de “replicación en cadena de

la polimerasa” o polymerase chain reaction

(PCR).

1. Propiedades Químicas y Físicas del

ácido desoxirribonucleico ADN o DNA

1.1. Características de los monómeros que

constituyen el ADN o DNA: los

desoxiribonucleótidos

Están constituidos por tres

componentes o tipos de moléculas:

a) Una base nitrogenada

b) Un azúcar, la desoxiribosa y

c) Un grupo fosfato,

tal como se muestra en la

próxima diapositiva…

Características del monómero del DNA: los

desoxiribonucleótidos

Figura (Fig.) 1.

Dependiendo del número de fosfatos,

los desoxiribonucleótidos pueden ser:

Mono, di o trifosfatos, tal como se ve en la figura:

Figura 2.

Puede tener 4 bases nitrogenadas

distintas Constituidas por dos tipos:

a) PIRIMIDICAS (de un solo anillo) y

b) PÚRICAS (de dos anillos), tal como se muestra en la fig.

Figura 3.

Importante

destacar que las

bases

nitrogenadas ya

habían sido

descritas en 1910

por Phoebus

Levene unidas a

azúcar y un

fosfato.

De las bases nitrogenadas depende la

interacción específica entre dos hebras de

DNA complementarias

-Asi, la timina interactúa específicamente con la adenina (T – A) a

través de dos puentes de hidrógeno y la

-Citosina interactúa específicamente con la guanina(C – G), a través

de tres puentes de hidrógeno

Fig. 4.

Las bases nitrogenadas al ser

anillos aromáticos, absorben luz

ultravioleta en un rango de longitud

de onda de 180 -300 nm Esta característica permite

detectar y cuantificar los

ácidos nucleícos (DNA o

RNA) mediante un

ESPECTROFOTOMETRO y

Evaluar su grado de

desnaturalización

(separación de sus hebras

Complementarias).

Fig. 5.

Características del azúcar a) Es un azúcar cíclico de 5 carbonos, por lo

cual se denomina como PENTOSA

b) En el carbono dos prima (2´, para

diferenciarlo del carbono 2 de la base

nitrogenada), tiene un HIDRÓGENO (H)

en vez de un HIDROXILO (HO-), es decir

dicho carbono está reducido o

“DESOXIDADO”, por eso este azúcar se

denomina como “DESOXIRIBOSA” o más

específicamente “2´-DESOXIRIBOSA”.

c) Se une a la base nitrogenada vía su

carbono 1´ y mediante un enlace “N-

glicocídico (unión carbono- nitrógeno).

d) Posee un extremo 3´-HO vía el cual se

unirá con otro desoxirribonucleótido

cuando ocurra la síntesis de DNA.

e) El carbono 5´ se une al grupo

Fosfato.

Fig. 6.

1.2. Características de la estructura de la doble hélice

de ADN descrita por James Watson y Francis Crick

en 1953, en base a los espectros de difracción de rayos

X obtenidos por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins

en 1951.

La estructura de la molécula doble hebra fue descrita y

publicada en 1953 por James Watson y Francis Crick basados

en los espectros de difracción de rayos X obtenidos por

Rosalind Franklin y Maurice Wilkins en 1951 (Conferencia de

Npoles). En la foto de arriba aparece Watson (izquierda) y Crick

(derecha) describiendo la estructura en doble hélice de la

molécula de ADN como una especie de escalera de caracol con

muchos escalones. En 1962 Watson, Crick y Wilkins recibieron

el Premio Nobel de Medicina por su trabajo. Rosalind había

fallecido en 1958.

Fig. 7.

Rosalind Franklin

(1920 -1958)

Publicada el 25

de abril de

1953, en Nature

U. De Cambridge King´s College

1.2.1. Características del enlace covalente entre dos desoxirribonucleótidos, el enlace

fosfodiester

• LA UNIÓN DE DOS DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS SE REALIZA VÍA UN ENLACE FOSFODIESTER en el cual esta involucrado el oxígeno del carbono 3´ de la desoxirribosa de un dNMP, con el oxígeno del carbono 5´ del siguiente dNMP, unidos vía un grupo fosfato. Tal como se ve en la fig. 3.

• Este hecho da origen a una molécula POLAR. Es decir, que tiene un determinado SENTIDO, caracterizado por un extremo 5´ y un extremo 3´.

Fig. 8.

Hebra de DNA 5´-ATG-3´

o simplemente ATG

1.2.2. La molécula de ADN estaba

formada por dos hebras

ANTIPARALELAS.

Eso quiere decir que una de las hebras estaba en el sentido 5´- 3´ y

la otra en el sentido inverso, tal como se muestra en la Figura.

Fig. 9

En la descripción de

Watson y Crick esta fue una

idea clave de su modelo,

pues otros científicos, como

Linus Pauling y otros,

pensaban que podrían ser

tres hebras en una

estructura helicoidal.

1.2.3. Entre las hebras antiparalelas del ADN doble

hebra, hay COMPLEMENTARIDAD DE BASES

NITROGENADAS, (Fig.10).

- Eso implica que: siempre cuando en una hebra había una timina (T) en la otra hebra

había una adenina (A), y vise-versa.

- En cambio, cuando en una hebra había una citosina (C), en la otra había una guanina

(G).

- Este hecho, estaba en concordancia con el modelo de Erwin Chargaff, postulado en

1947, en el cual había demostrado que el porcentaje de T era igual al de A, y el de G al

de C.

-Además, la unión de una T con un A era a través de DOS puentes hidrógenos, en

cambio, la unión de una C con una A, era a través de TRES puente hidrógenos. ¿en

que afecta esto la estabilidad de la doble hélice?.

1.2.4. El fenómeno de la “desnaturalización” o

“denaturación” de la doble hebra de DNA

(separación de las hebras complementarias),

depende del porcentaje de citosina (C ) y guanina

(G) que contenga la molécula

-La temperatura Intermedia

entre el DNA no-desnaturalizado

y el completamente

desnaturalizado se denomina tm,

del inglés “melting

temperature”.

- A mayor % de C-G mayor tm

Fig. 11.

1.2.5. El esqueleto de azúcar-fosfato helicoidal.

Fig. 12

En cambio,

las bases

nitrogenadas

quedan hacia

adentro

formando

especie de

escalones

En la doble hélice los enlaces fosfodiester

forman un esqueleto de azúcar-fosfato

helicoidal, que queda hacia el exterior de la

molécula.

La forma A corresponde a la estructura de DNA cristalizada no-hidratada y la forma B a la

hidratada. Los espectros de difracción de rayos X de ambas formas, fueron obtenidos por

Franklin en 1951.

Aunque la mayor parte del genoma tiene estructura B, zonas ricas en bases G-C, pueden

adoptar la conformación Z. Estas distintas estructuras del DNA afecta la unión de proteínas

que interactúan con él y por ende sus funciones, tal como la regulación de la expresión génica

1.2.6. Diferentes conformaciones de la

estructura del DNA doble hebra: las estructuras A, B y

Z. La forma B fue la descrita por Watson y Crick en 1953, que

correspondía a la molécula hidratada.

De la información anterior:

¿Qué se podría inferir con respecto a como

podría ser la duplicación o replicación de

esta molécula?

-La COMPLEMENTARIDAD de bases nitrogenadas sugería que

una hebra podía ser el MOLDE O MATRIZ de la otra (Fig. 10).

2. Replicación del DNA

2.1. Hebra molde (templado, matriz o

parental) y hebra hija

Fig. 13. La doble hélice de Watson y Crick, sugería que la molécula de DNA

que surgía de la duplicación (la nueva doble hélice) estaba constituida por una

hebra parental (antigua) que serviría de MOLDE (templado o matriz) para la

síntesis de una hebra hija complementaria (nueva). Esto sugería que la

duplicación del DNA era SEMICONSERVATIVA.

Los científicos que demostraron que efectivamente era así, fueron Meselson y

Stahl.

2.2. Experimento de Meselson y Stahl (1957). a) Realizó cultivos de bacterias por

varias generaciones en presencia del

isótopo pesado 15N. De esta manera

se aseguró que todo el DNA de las

bacterias quedara marcado con 15N.

Aisló el DNA y lo centrifugo. Todo el

DNA sedimenta cerca del fondo del

tubo, DNA pesado (15N- 15N).

b) Posteriormente, trasladó las bacterias

a un medio de cultivo con 14N, dejó que

se originara una primera generación de

ellas. Encontró que el DNA sedimentaba

en una zona intermedia, lo que

correspondió a DNA híbrido (15N- 14N).

c) En una segunda generación de

estas bacterias, encontró dos

zonas donde sedimento el DNA,

correspondiente a DNA liviano

(14N- 14N) e híbrido. . d) Finalmente, en un tercer ciclo de replicación de DNA, se

obtienen mayor número de DNA liviano que de híbrido.

Fig. 14

Con el experimento de Meselson y Stahl, se

demostró que la replicación era semi-

conservativa, pero surgía una nueva

pregunta:

• ¿En que dirección o sentido se realizaba

la síntesis de las hebras hijas?.

2.3. ¿Cuál seria entonces el sentido

(dirección) de la síntesis de la hebra

hija?.

• La respuesta a esta pregunta vino de los estudios de Reiji Okazaki (1960), analizando mediante microscopía electrónica la replicación del DNA cromosomal de la bacteria Escherichia coli, en el cual uno de los 4 dNTPs (como sustrato de la síntesis de DNA) era dTTP marcado con el isótopo tritium (13H).

• Con estos estudios él demostró que la síntesis de las hebras hijas era en el sentido 5´- 3´, que además, una de las hebras se sintetizaba en forma discontinua (a los que posteriormente se le llamaron “Fragmentos de Okazaki) y la otra en forma continua.

• Es decir, que la replicación del DNA es también

• SEMI-DISCONTINUA.

2.4. Resultados de los estudios de Okazaki:

replicación SEMIDISCONTINUA

• Esto implica que hay una hebra “líder” (continua) y una hebra retrasada (discontinua).

• De este modelo surge el concepto de “horquilla de replicación” = vértice donde se va abriendo la doble hélice.

• Nótese que la dirección del avance de la horquilla no es igual a la dirección de la síntesis de la hebra retrasada.

Fig. 15

Sin embargo, todavía quedaban mas

preguntas por contestar, entre ellas:

• 2.5. ¿Dónde se iniciaba la replicación del DNA, en sitios

al azar o en algún sitio especifico?

• 2.6. Si se iniciaba en un sitio especifico u ORIGEN DE

REPLICACION: ¿ esta seria en una sola dirección

(unidireccional) o ambas direcciones (bidireccional) ?.

Experimentos de John Cairns mediante microscopia electrónica

con timidina tritiada.

Comienza en un origen y es usualmente bidireccional:

Este experimento confirmó además que la síntesis de ambas hebras era

simultánea y que se generaba una estructura que sería llamada “BURBUJA

DE REPLICACIÓN”.

Lehninger, pag. 951, IV Ed. 2005 Fig. 16

2.5. Origen y 2.6. Sentido (o dirección) de la

replicación del DNA.

En rojo se

indica la

presencia de

la timidina

tritiada, a

distintos

tiempos del

comienzo de

la

replicación.

2.7. La burbuja de replicación

• Los resultados de los experimentos anteriores indican que en la replicación del DNA se produce una estructura que se llama “burbuja de replicación” (ver Fig. 17 anexa).

• En esta estructura hay dos horquillas de replicación, que avanzan en sentidos opuestos.

La burbuja de replicación: avance

bidireccional de las orquillas.

Fig. 17.

Resumiendo hasta aquí: las

características generales de la

replicación del DNA (doble hélice)

son: - Es semi-conservativa

- La síntesis de las hebras hijas es en el

sentido (“dirección”) 5´-3´.

- Es semi-discontinua

- Comienza en un sitio especifico (origen) y

- Es usualmente bidireccional

3. Bases moleculares de la

replicación del DNA

3.1. Estudios realizados en la bacteria

Escherichia coli (Arthur Kornberg).

Secuenciado completamente en 1997 (Science 277 (5331) :1453-1462), cepa K-12, tiene una longitud de 4.639.221 pares de bases (pb) o 4,6 Mb y codificaría para 4288 proteínas.

Fig. 18.

3.1.1. DNA cromosomal de la

E.coli: doble hebra circular

cerrado.

3.1.2. Características del origen de

replicación u oriC.

Fig. 19.

- HU y IHF = proteínas tipo histona que ayudan a la unión de la

proteína DnaA a la doble hebra en el oriC.

3.1.3. Primera etapa de

la replicación:

formación de un

complejo de pre-

elongación

Ocurre en tres eventos

con gasto de ATP:

1.- Unión de proteínas tipo histonas

(HU, IHF) al OriC y abertura del

segmento de tres repeticiones con

DnaA.

2.- Unión de la Helicasa DnaB con

ayuda de la DnaC, a cada hebra.

3.- Unión de la Primasa DnaG y

proteínas SSB con salida de DnaA. Fig. 20.

3.1.3.4. Unión de una TOPOISOMERASA al Complejo

de pre-elongación.

Se requiere para relajar la tensión producida por la

abertura de la doble hélice que se producirá por el avance

de las horquillas de replicación en la etapa de elongación.

Fig. 21.

Fig. 22.

Fig. 23.

3.1.4. Segunda etapa de la replicación:

La elongación. Comienza con la síntesis de los RNA partidores

(“primers” o cebadores) por la Primasa.

Fig. 24.

Elongación de los partidores por la DNA

polimerasa III de E. coli, tanto en la hebra líder

como en la hebra retrasada.

Fig. 25.

3.1.5. Características de las enzimas que

realizan la síntesis de DNA durante la

replicación: Las DNA Polimerasas (DNA pol).

3.1.5.1. Requerimientos para su reacción:

a) Requieren una hebra de DNA molde

(templado o matriz).

b) Necesitan un partidor, cebador ó “primer”.

c) Utilizan un desoxirribonucleótido trifosfato (d-ATP, d-

GTP, d-CTP y d-TTP

d) Polimerizan en sentido 5’ a 3’,

adicionando nucleótidos al extremo 3’

libre.

3.1.5. 2. Reacción catalizada por

todas las DNA polimerasa

Fig. 26.

3.1.5.3. Actividad correctora exo 3´-5´.

Llamada inicialmente como “Edición” (del inglés “editing”),

termino con que el ahora se denomina otro proceso

molecular.

Fig. 27. Fig. 28.

Es importante mencionar que todas las DNA pol.

de E. coli realizan este mecanismo

3.1.5.4. Las tres DNA pol. de E. coli

3.1.5.5. Estructura general de las DNA

polimerasas: forma de una mano derecha

(modelo de la pol I de E. coli)

Fig. 29.

3.1.5.6. La DNA polimerasa III de E.

coli. Enzima que participa en la replicación del DNA

cromosomal de esta bacteria.

La enzima completa (holoenzima), está constituida por 17

subunidades: 10 de ellas diferentes (a-y)

Estructura de la holoenzima de la DNA polimerasa III de E.

coli

Fig. 30.

Fig. 31.

El dímero de la pol III forma una especie de

“anillo” entorno al DNA (corte transversal).

El dímero de la pol III forma una especie de

“anillo” entorno al DNA (representación

volumétrica).

Fig. 32.

3.1.6. Secuencia de eventos que ocurren

durante el avance la horquilla de

replicación:

Fig. 33.

Dímero de la pol III cuando esta sintetizando

simultáneamente la hebra líder y la hebra

retrazada.

Fig. 34.

3.1.7. Tercera etapa de la replicación:

remoción de los partidores y ligamiento de los

fragmentos de Okazaki.

Fig. 35.

3.1.8. Cuarta etapa de la replicación: Separación de

los dos DNA duplex replicados por la topoisomerasa

IV.

Fig. 36.

3.2. Diferencias principales en la

Replicación de procariontes y eucariontes

EVENTO PROCARIONTES EUCARIONTES

Inicio de la replicación

Origen de replicación Un único oriC Múltiples en cada

cromosoma

Secuencia de consenso del

oriC

Si Poco conocido

Actividad primasa Por una enzima

individual (dnaG)

Actividad Incorporada en

la pol a

Elongación

DNA pol replicadora Homodímero de pol III Heterodimeros

constituidos por pol d y

pol e

Factor de replicación C ausente Cambia pol a por pol d o

pol e

Antígeno nuclear de

proliferación (PCNA)

Ausente Aumenta procesibidad de

pol d y pol e

Factores de ensamblado de la

cromatina

Ausente Acetilasas y desacetilasas

de histonas

Terminación

Eliminación de los RNA

cebadores

Pol I RNAasa H1 y

endonucleasa flap 1

Elongación de extremos 5´ de

los teloneros

Ausente Telomerasa

III. Mutaciones

- En términos generales: mutación es todo cambio que ocurre en la

secuencia del DNA

-Inicialmente, como todos los genomas conocidos eran de DNA, el concepto se

aplico sólo a esta molécula.

-Sin embargo, como posteriormente quedó en evidencia que también existían

organismo (los virus) cuyo genoma era de RNA, hoy en día el concepto de

mutaciones es “todo cambio que ocurre en la secuencia del genoma”, sea

este DNA o RNA.

- Este cambio o mutación puede ocurrir en cualquier segmento del genoma:

zonas codificantes o no-codificantes.

-Por lo tanto, si está en zonas codificantes de proteínas puede provocar

alteraciones en la estructura y función de ellas.

-Si la mutación es en zonas “no codificantes”, puede alterar la expresión de los

genes regulados por segmentos o elementos regulatorios.

Tipos de mutaciones: puntuales

Las mutaciones más frecuentes

que se producen por errores

durante la replicación son por

incorporación de un nucleótido

equivocado “mismatch”

Es decir: transiciones y

transversiones

Muchas de estas mutaciones puntuales (de

cambio de un nucleótido por otro) son silenciosas

y contribuyen a la variabilidad y el polimorfismo

que se encuentra en la poblaciones y que

permiten distinguir diferentes linajes o grupos de

individuos

A estas

mutaciones

puntuales se les

conoce como

polimorfismo de

nucleótido único

:“single nucleotide

polymorphism

(SNP).

VARIABILIDAD GENÉTICA

GENOMA

INDIVIDUO POBLACIONES

Son en última instancia las variaciones del DNA las que

originan variaciones entre un individuo y otro y son las

variaciones entre individuos que comparten un mismo

ambiente las que originan las diferencias entre las

poblaciones

Mutaciones que producen cambios en

largos segmentos del genoma: llamadas

rearreglos genéticos mayores

• Re-arreglos del genoma:”crosing-over”

recombinación homologa que ocurre

durante la meiosis

• Duplicaciones

• Traslocaciones: grandes segmentos de

inserciones y deleciones

• Cambios en el números de cromosomas:

poliploidias y aneuplodias

Mutaciones cromosómicas

• Aberraciones estructurales:

• Deleciones terminales, insterticiales, cromosomas

en anillos, inversiones, traslocaciones.

• Aberraciones numéricas (Aneuploidias) son

alteraciones en el número de algún cromosoma:

nulisomías (2n-1), trisomías (2n+1), etc. Ej. Trisomia

21 en síndrome de Down.

• Mutaciones genómicas (poliploidías): aumento en el

número de copias del genoma completo, ej.

Genoma tetraploide (4 copias del genoma).

Curso: Biología Molecular y Genómica

Enero 2018.

“Conceptos elementales sobre la

técnica de reacción en cadena de la

polimerasa (PCR)”

Dr. Juan Venegas Hermosilla

Programa de Biología Celular y Molecular

Instituto de Ciencias Biomédicas

Facultad de Medicina

Universidad de Chile

Reacción en cadena de la

polimerasa (PCR)

• El PCR es una técnica enzimática que

permite la amplificación de ácidos nucleícos

(DNA o RNA), millones de veces.

• Esto hace que el PCR sea una técnica muy

poderosa en amplios campos de la biología,

las ciencias, la medicina forense, la

biotécnología, etc.

La técnica de PCR fué

desarrollada por Kary Mullis • Científico y surfista de

Newport Beach, California.

• Por este trabajo Kary Mullis

ganó el premio Nobel de

Química en 1993.

• El desarrolló la técnica

trabajando para la compañía

Cetus Corporation en la

década del 70.

¿Como el PCR amplifica millones de

veces un ácido nucleíco?

¿Como el PCR amplifica millones de

veces un ácido nucleíco?

• El PCR consta de tres etapas:

– a) Denaturación del DNA blanco

– b) Hibridización “annealing” del partidor directo e

inverso con el DNA blanco

– c) Elongación de los partidores mediante una DNA

polimerasa termoestable

• El paso de una etapa a otra, se logra por cambios

de temperatura de la mezcla de reacción.

• Para que ocurra la elongación de los partidores

se requiere todo lo necesario para que haya

síntesis de DNA, es decir: dNTP, Mg2+, un

tampón, sales, además de los partidores.

Esquema de la técnica de PCR: Un ciclo de

amplificación

Técnica de PCR: Segundo ciclo de

amplificación.

Resultados después de múltiples

ciclos de amplificación.

- Se ha calculado que después 25 ciclos de amplificación, una

molécula de DNA doble hebra se multiplica más de UN MILLON

DE VECES

- Esto permite VISUALIZAR el PRODUCTO DE PCR o

AMPLICON por una simple electroforesis.

Electroforesis de productos de

PCR (amplicones).

El producto de amplificación se puede

detectar en electroforesis en geles de

agarosa

• Carril 1: marcador “ladder”, carriles 2-3 muestras de

producto de PCR de pol beta de T. cruzi a diferente

diluciones.

El equipo que lleva a cabo la técnica de

PCR se llama Termociclador:

• Actualmente en el mercado existen una

gran variedad de estos equipos, basados

en diferentes sistemas para producir

cambios rápidos de temperatura

• Hay equipos pequeños para sólo 16

muestras, hasta equipos múltiples, en los

cuales se pueden realizar simultanemente

diferentes ensayos de PCR

• Un par de termocicladores se muestran en

la siguiente diapositiva

Ejemplo de Termocicladores

Algunas aplicaciones de la técnica de

PCR • Diagnostico medico: Para detectar e identificar agentes

infecciosos tales como: virus, bacterias, parasitos, hongos, etc.

• Detección de enfermedades genéticas: Ejemplo, determinar sí una mutación específica que provoca fibrosis quística ha sido heredada por los hijos.

• Estudios evolutivos: analizar las relaciones filogenéticas entre especies desaparecidas (muestras arqueologicas) y de especies vivientes.

• “DNA fingerprinting”: Perfil de productos de amplificación especificos de cada individuo de una población. Esto permite identificar personas desaparecidas, autores de crimenes, etc.

Referencias

• http://www.accessexcellence.org/AB/GG/polymerase.html

• http://www.accessexcellence.org/AB/BC/Kary_B_Mullis.html

• http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm

• http://www.karymullis.com/

• http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/PolymeraseChainReaction/

• http://www.emblheidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/clo_pcr_strategy/primer_design.html

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/NAWBIS/Modules/DNA/dna9.html

• http://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html

• http://www.alumni.ca/~leema3m/bg/pcr.html

• http://marvin.ibest.uidaho.edu/~heckendo/CS504/Students/P/waltari.pdf

Muchas gracias

por su atención

y paciencia ¡¡

FIN...

Material suplementario:

Deoxyribonucleotides and ribonucleotides of nucleic acids

Watson-Crick model for the structure of DNA.