Tecnologia Del ADN ante

8/3/2019 Tecnologia Del ADN ante

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TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE. Generalidades de la tecnologa del DNA recombinante. Fabricacin del DNA recombinante. Enzimas de restriccin. Vectores. Plsmidos. Bacterifagos. Csmidos. Cromosomas artificiales bacterianos.

Transformacin del DNA. Clonacin de DNA en Escherichia coli. Clonacin en huspedes eucariticos. Vectores de levadura. Cromosomas artificiales de levadura.

Construccin de bibliotecas de DNA. Bibliotecas genmicas. Mutagnesis dirigida.

Bibliotecas cromosmicas. Bibliotecas de cDNA.

Identificacin de secuencias clonadas especficas. Sondas para rastrear clones especficos. Rastreo de una biblioteca. Paseo cromosmico.

Mtodos de anlisis de secuencias clonadas. Mapas de restriccin. Transferencia de Southern y Northern Secuenciacin de DNA.

Transferencia de DNA a eucariotas. Clulas vegetales. Clulas de mamfero.

Aplicaciones de la tecnologa del DNA recombinante. Aplicaciones en investigacin y medicina Modelos animales de enfermedades genticas humanas: ratones knockout. Terapia gnica.

Aplicaciones industriales Aplicaciones en agricultura

Tecnologa del DNA Recombinante Tcnica Cultek S.L.U.

09.2006 www.cultek.com Pgina 1 de 28


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TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE.Generalidades de la tecnologa del DNA recombinante.El trmino DNA recombinante hace referencia a la creacin de nuevas combinaciones de segmentos o de molculas de DNA que no seencuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso gentico de la recombinacin produce DNA recombinante, este trmino se reserva alas molculas de DNA producidas por la unin de segmentos que provienen de diferentes fuentes biolgicas.

La tecnologa del DNA recombinante utiliza tcnicas que provienen de la bioqumica de los cidos nucleicos unidas a metodologas genricas

desarrolladas originalmente para la investigacin de bacterias y de virus. La utilizacin del DNA recombinante es una herramienta poderosa parael aislamiento de poblaciones puras de secuencias especficas de DNA a partir de una poblacin de secuencias mezcladas. Los procedimientosbsicos incluyen una serie de pasos:

1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restriccin , que reconocen y cortan lasmolculas de DNA por secuencias nucleotdicas especficas.

2. Los fragmentos producidos mediante la digestin con enzimas de restriccin se unen a otras molculas de DNA que sirven de vectores.Los vectores pueden replicarse autnomamente en una clula husped y facilitan la manipulacin de la molcula de DNA recombinanterecin creada.

3. La molcula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una clula husped.Dentro de esta clula, la molcula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idnticas conocidas como clones.

4. Al replicarse las clulas husped, las clulas descendientes heredan el DNA recombinante, crendose una poblacin de clulas idnticas,que llevan todas la secuencia clonada.

5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las clulas husped, purificarse y analizarse.6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto gnico puede aislarse y examinarse.

Fabricacin del DNA recombinante.El desarrollo de las tcnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigacin, ya que simplifica la obtencin de grandescantidades de DNA que codifican genes especficos, y facilita las investigaciones de la organizacin, estructura y expresin gnicas.

Esta metodologa tambin ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnolgica, que est suministrando un nmero crecientede productos al mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA especficos, incluyendo genes.

Enzimas de restriccin.La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endonucleasas de restriccin. Estas enzimas,aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones vricas degradando el cido nucleico invasor. Lasenzimas de restriccin reconocen una secuencia especfica de nucletidos (denominada sitio de restriccin) de una molcula de DNA de doblecadena, y cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorg a Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por suinvestigacin sobre las enzimas de restriccin. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restriccin diferentes.




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La enzima de restriccin EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrmica GAATTC. El corte del DNA eneste sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes puedenunirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar molculas de DNA recombinante.

Las enzimas de restriccin se denominan segn el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumrico. La enzima EcoRIproviene de Escherichia coli; HindIII se descubri en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas de restriccin:

Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posicin aleatoria a cierta distancia del sitio de restriccin. No se utilizannormalmente en la investigacin de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.

Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia especfica y cortan las dos cadenas de la molcula de DNA con absoluta precisin dentrode la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigacin de DNA recombinante puesto que cortan en sitios especficos. Lassecuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las cadenas leda endireccin 5' 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leda tambin en direccin 5' 3'.

La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento, dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas,que tienen secuencias nucleotdicas idnticas, son pegajosas (cohesivas), ya que pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentosde DNA mediante puentes de hidrgeno. Si molculas de DNA de diferente origen comparten los mismos sitios de reconocimientopalindrmicos, ambas tendrn colas complementarias de cadena sencilla cuando se traten con una endonucleasa de restriccin. Si estosfragmentos se ponen juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de DNA de distinto origen pueden formar molculas recombinantesestableciendo puentes de hidrgeno entre los extremos cohesivos. Luego se utiliza la enzima DNA ligasa para unir covalentemente losesqueletos azcar-fosfato de los dos fragmentos, producindose as una molcula de DNA recombinante.

Para formar molculas de DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes conEcoRI y se mezcla para que se unan formando molculas recombinantes. Despusse utiliza la enzima DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de DNArecombinante.




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Algunas enzimas de restriccin comunes, con sus sitios de reconocimiento y de corte, el patrn de corte y la fuente de origen.




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Otras enzimas de restriccin de Tipo II, como SmaI, cortan el DNA formando fragmentos romos. Los fragmentos de DNA con extremos romostambin pueden unirse y formar molculas recombinantes, pero primero deben modificarse. La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal seutiliza para crear extremos de cadena sencilla mediante la adicin de colas de nucletidos. Si a uno de los DNA se le aade una cola de poli-dA, y al otro DNA se le aade una cola de poli-dT, se forman colas complementarias, y los fragmentos pueden unirse mediante puentes dehidrgeno. Entonces, por ligacin, pueden formarse molculas recombinantes.

Las molculas de DNA recombinante pueden formarse apartir DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.En este mtodo se utiliza la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal para crear colas complementariasmediante la adicin de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes ypara crear molculas de DNA recombinante, que son unidascovalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.

VectoresDespus de unirse a un vector o vehculo de clonacin, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una clula husped y replicarse oclonarse. Los vectores son, esencialmente, molculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molcula de DNA debe tener unasdeterminadas caractersticas:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.

2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restriccin, presentes slo una vez en el vector. Estos sitios de restriccin se cortancon una enzima de restriccin y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.

3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente genes de resistencia a antibiticos o genes de enzimas que la clula husped notiene) para poder distinguir las clulas husped que transportan el vector de las que no lo contienen.

4. El vector de la clula husped debe ser fcil de recuperar.

Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plsmidos, los bacterifagos y los csmidos.

Plsmidos.Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena extracromosmicas de origen natural que tienen un origen de replicacin (ori+) yque se replican autnomamente en las clulas bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniera gentica, se han modificado o diseadomuchos plsmidos de manera que contengan un nmero limitado de sitios de restriccin y genes de resistencia a antibitico s especficos.

El vector pBR322 fue uno de los primeros plsmidos diseados que se utiliz en DNA recombinante. Este plsmido tiene un origen dereplicacin (ori+), dos genes de seleccin (resistencia a los antibiticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restriccin nicos.

Mapa de restriccin del plsmido pBR322, que muestra las localizaciones de lossitios de las enzimas de restriccin que cortan el plsmido por un solo sitio. Estossitios pueden utilizarse para insertar los fragmentos de DNA a clonar. Tambin semuestran las localizaciones de los genes de resistencia a antibiticos.




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Dentro del gen de resistencia a tetraciclina hay sitios de restriccin nicos para las enzimas BamHI, SphI, SalI, XmaIII y NruI, y dentro delgen de resistencia a ampicilina hay sitios de restriccin nicos para las enzimas RruI, PvuI y PstI. Si se introduce pBR322 en una clulabacteriana sin plsmidos y sensible a antibiticos, la clula se convertir en resistente a la tetraciclina y a la ampicilina. Si se inserta unfragmento de DNA en los sitios de restriccin RruI, PvuI, o PstI, se inactivar el gen de resistencia a ampicilina, pero el gen de resistencia atetraciclina seguir activo. Si este plsmido recombinante se transfiere a una clula bacteriana que no contenga plsmidos, las clulas quecontengan el plsmido recombinante podrn identificarse, ya que sern resistentes a tetraciclina y sensibles a ampicilina.

Con el paso del tiempo se han desarrollado vectores plasmdicos ms sofisticados, que ofrecen diversas caractersticas tiles. Uno de estosplsmidos, que deriva de pBR322, es el pUC18, que tiene las siguientes caractersticas:

1. El plsmido tiene la mitad de tamao que pBR322, lo que permite insertar fragmentos de DNA ms largos.

2. pUC18 se replica produciendo unas 500 copias por clula, lo que significa unas 5 10 veces ms que las que produce pBR322.

3. Tiene un gran nmero de sitios de restriccin nicos, agrupados en una regin denominada sitio de clonacin mltiple (poliylinker).

4. El plsmido contiene un fragmento de un gen bacteriano denominado lacZ, y el sitio de clonacin mltiple est insertado dentro de stefragmento del gen. El gen lacZnormal codifica la -galactosidasa, enzima que corta molculas de azcar. Cuando pUC18 se introduceen una clula husped bacteriana que tiene el gen lacZmutante, se produce -galactosidasa funcional. La presencia de -galactosidasafuncional en una colonia bacteriana puede detectarse mediante un ensayo colorimtrico. Las clulas bacterianas que contienen pUC18forman colonias de color azul cuando crecen en un medio que contiene una sustancia denominada X-gal. Si hay DNA insertado en elsitio de clonacin mltiple, se interrumpe el gen lacZy se forman colonias blancas. Las colonias blancas, resistentes a ampicilina,contienen plsmidos con DNA insertado.

El plsmido pUC18 ofrece varias ventajas como vectorde clonacin. Debido a su pequeo tamao, puedeaceptar fragmentos de DNA relativamente grandes;se replica hasta un alto nmero de copias, y tiene ungran nmero de sitios de restriccin en el sitio declonacin mltiple, localizado dentro del gen lacZ. Lasbacterias que contienen pUC18 producen colonias de

color azul si crecen en un medio que contenga X-gal.El DNA insertado en el sitio de clonacin mltipleinterrumpe el gen lacZ, resultando en coloniasblancas, lo que permite la identificacin directa de lascolonias que tienen insertos de DNA clonados.

Bacterifagos lambda (fago ) y M13.Lambda es un bacterifago muy utilizado en experimentos de DNA recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes delambda, y se conoce toda la secuencia nucleotdica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarsepor DNA exgeno sin afectar la capacidad del fago para infectar clulas y formar calvas. Se han desarrollado ms de 100 vectores basadosen el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo gnico central.

Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restriccin (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazoizquierdo, un brazo derecho y una regin central. Se aslan los brazos y se ligan (utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenidotras cortar DNA genmico con la misma enzima de restriccin (en este ejemplo, con EcoRI).

Las molculas recombinantes resultantes pueden introducirse en clulas husped bacterianas por transfeccin. Primero, se permeabilizanlas clulas husped mediante un tratamiento qumico, y se mezclan con las molculas ligadas. Los vectores que contienen el inserto entranen las clulas husped, donde dirigen la sntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Como alternativa, semezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman partculas fgicasinfectivas. Los fagos pueden amplificarse hacindolos crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarn calvas, o bieninfectando clulas en un medio lquido y recogiendo las clulas lisadas.




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Pasos en la clonacin utilizando el fago lambda como vector. Se extrae el DNA de una preparacin de fago lambda y se elimina el grupocentral de genes por tratamiento con una enzima de restriccin. El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos delcromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las protenas del fago para formar un virusrecombinante. Este virus puede infectar clulas bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de DNA.

Tambin se utilizan otros bacterifagos como vectores, entre los que destaca el fago de cadena sencilla M13. Cuando M13 infecta a una

clula bacteriana, la cadena sencilla (cadena +) se replica y produce una molcula de doble cadena denominada forma replicativa (RF). Lasmolculas RF pueden considerarse similares a los plsmidos, pudindose insertar DNA exgeno en sitios de restriccin nicos presentes enel DNA del fago. Cuando se reinsertan en clulas bacterianas, las molculas RF se replican y producen cadenas sencillas (+), en las que hayuna cadena del DNA insertado. La clula hace salir los clones de DNA de cadena sencilla que produce M13, que pueden recuperarse yutilizarse directamente para su secuenciacin, o como molde para alteraciones mutacionales de la secuencia clonada.




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Los csmidos y los vectores transbordadoresLos csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmdico. Los csmidoscontienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, ysecuencias plasmdicas de replicacin y de genes de resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped que loscontienen. El DNA de los csmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cpside proteica de lambda para formar partculasfgicas infectivas. Una vez el csmido entra en la clula husped, se replica como un plsmido. Puesto que la mayora del genoma delambda se ha delecionado, los csmidos pueden transportar insertos de DNA mucho ms grandes que los que lambda puede llevar. Loscsmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que los vectores fgicos pueden acomodar insertos de DNA de unas15kb y los plsmidos generalmente estn limitados a insertos de 5-10kb.

El csmido pJBS contiene un origen de replicacin bacteriano (ori), un solo sitiocos, un gen de resistencia a ampicilina (ampR, para seleccionar las colonias quehan incorporado el csmido), y una regin que contiene cuatro sitios de restriccinpara la clonacin (BamHI, EcoRI, ClaI y Hindlll). Puesto que el vector es pequeo(5,4kb de longitud), puede aceptar segmentos de DNA exgeno de 33 a 46kb de

longitud. El sitio cos permite que el csmido que contenga un inserto grande seempaquete con protenas de cubierta vrica de lambda como si fuesen cromosomasvricos. Las cubiertas vricas que contienen un csmido pueden utilizarse parainfectar clulas husped adecuadas, y el vector, que transporta el inserto de DNA,se transferir a la clula husped. Una vez dentro, la secuencia ori permite que elcsmido se replique como un plsmido bacteriano.

Existen otros vectores hbridos, construidos con orgenes de replicacin provenientes de distintas fuentes (por ejemplo, plsmidos y virusanimales como SV40), que pueden replicarse en ms de un tipo de clula husped. Generalmente, estos vectores transbordadorescontienen marcadores genticos que permiten su seleccin en los dos sistemas husped, y pueden utilizarse para transportar insertos deDNA entre E.coliy otras clulas husped, como levadura, y viceversa. A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresin

gnica.

Pasos en la clonacin utilizando csmidos como vectores.




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Cromosomas artificiales bacterianos.Para cartografiar y analizar genomas eucariticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso denominado cromosoma artificialbacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un plsmido que se replica independientemente y que est implicado enla transferencia de informacin gentica durante la conjugacin bacteriana. Puesto que los factores F pueden transportar fragmentos delcromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseados para que funcionen como vectores de DNA eucaritico. Los vectores BAC tienenlos genes de replicacin y de nmero de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibitico y sitios de restriccinpara insertar el DNA exgeno que se desee donar. Adems, el sitio de donacin est flanqueado por regiones promotoras que puedenutilizarse para generar molculas de RNA y expresar as el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosmico, y parasecuenciar el DNA del inserto clonado.

Cromosoma artificial bacteriano (BAC). El sitio de clonacinmltiple tiene diversos sitios de restriccin nicos para lainsercin de DNA exgeno. Las flechas marcadas como T7 y Sp6son regiones promotoras que permiten la expresin de los genesclonados entre estas regiones.

Transformacin del DNA.Uno de los mecanismos por el cual el DNA puede movilizarse entre las bacterias es la transformacin, descubierta por Fred Griffith en 1928. Latransformacin consiste en la captacin por parte de una clula receptora de una molcula o fragmento de DNA desnudo y la incorporacin deesta molcula al cromosoma del receptor en una forma heredable. En la transformacin natural, el DNA procede de una bacteria donadora. Esun proceso aleatorio, y puede transferirse cualquier porcin del genoma entre bacterias.

Cuando las bacterias se lisan, liberan unas cantidades considerablesde DNA al medio que las rodea. Estos fragmentos liberados puedenser relativamente grandes y contener diversos genes. Si unfragmento establece contacto con una clula competente, es decir,una clula capaz de captar DNA y ser transformada, dicho fragmentopuede unirse a la clula y ser transportado a su interior. Lafrecuencia de transformacin de las clulas muy competentes cuandose utiliza un exceso de DNA es de alrededor de 10-3 para la mayorade los gneros. Es decir, aproximadamente una clula de cada miltoma e integra el gen. La competencia es un fenmeno muycomplejo y depende de diversas condiciones. Es preciso que lasbacterias se encuentren en una determinada fase de crecimiento, porejemplo, S.pneumoniae se vuelve competente durante la faseexponencial, cuando la poblacin alcanza las 107 108 clulas/mL.Cuando una poblacin se vuelve competente, las bacterias del tipode los neumococos segregan una pequea protena denominadafactor de competencia que estimula la produccin de 8 a 9 nuevas

protenas necesarias para el proceso de transformacin. Latransformacin natural slo se ha descubierto hasta la fecha enciertos gneros de bacterias grampositivas y gramnegativas:Streptococcus, Bacillus, Thermoactinomyces, Neisseria, Moraxella,

Acinetobacter, Azotobacter y Pseudomonas, aunque otros gnerostambin puede que sean capaces de experimentar transformacin.La transferencia de genes mediante este proceso ocurre en mediosterrestres y marinos, y puede constituir una importante ruta deintercambio gentico en la naturaleza.

Transformacin natural con fragmentos de DNA.




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La transformacin en Haemophilus influenzae, una bacteria gramnegativa, difiere de la de S.pneumoniaeen diversos aspectos. Haemophilusnoproduce un factor de competencia para estimular el desarrollo de competencia, y slo capta el DNA procedente de especies estrechamenterelacionadas. El DNA bicatenario forma complejos con protenas y es captado por vesculas de membrana. La especificidad de la transformacinde Haemophilusse debe a una secuencia especial de pares de bases (5'-AAGTGCGGTCA-3') que se repite unas 1.400 veces en el DNA deH.influenzae. El DNA debe contener esta secuencia para que una clula competente se una a l.

La transformacin artificial se lleva a cabo en el laboratorio mediante diversas tcnicas, entre ellas el tratamiento de las clulas con cloruroclcico, que aumenta la permeabilidad de sus membranas al DNA. Este enfoque tiene xito incluso con especies que no son competentes deforma natural, como E.coli. Para aumentar la frecuencia de transformacin se utilizan concentraciones relativamente ms altas de DNA,

superiores a las que estn presentes en condiciones normales en la naturaleza. Cuando se utilizan para la transformacin fragmentos linealesde DNA, suele hacerse que E.colipierda la actividad de una o ms exonucleasas con el fin de proteger los fragmentos transformantes. Resultams sencillo transformar bacterias con DNA de plsmido, ya que los plsmidos no se degradan con tanta facilidad como los fragmentos linealesy son capaces de replicarse dentro del husped. ste es un mtodo habitual para introducir DNA recombinante en las clulas bacterianas.Puede introducirse DNA de cualquier fuente en las bacterias insertndolo en un plsmido antes de la transformacin.

Transformacin artificial con plsmidos.

Transduccin.Los virus bacterianos o bacterifagos participan en otra modalidad de transferencia gnica bacteriana. Estos virus tienen estructurasrelativamente sencillas en las que el material gentico del virus est incluido dentro de una cubierta externa, compuesta principalmente oexclusivamente de protenas. La cubierta protege el genoma y lo transmite entre clulas husped.

Despus de infectar la clula husped, un bacterifago a menudo toma el control y obliga al husped a fabricar numerosas copias del virus.Finalmente la bacteria husped estalla o se lisa y libera los nuevos fagos. Este ciclo reproductor se denomina ciclo ltico porque concluye con lalisis del husped. Consta de cuatro fases:

En la primera, la partcula viral se fija a un sitio receptor especfico de la superficie bacteriana.

En la segunda, el material gentico del virus que con frecuencia es DNA bicatenario, penetra entonces en la clula. Tras la adsorcin y lapenetracin, el cromosoma viral obliga a la bacteria a fabricar cidos nucleicos y protenas del virus.

La tercera fase comienza tras la sntesis de los componentes virales. Se ensamblan fagos a partir de estos componentes. El proceso deensamblaje puede ser complejo, pero en todos los casos el cido nucleico se introduce (se empaqueta) en la cpside proteica viral.

Finalmente, los virus maduros son liberados al medio mediante la lisis de la clula husped.

Los virus bacterianos que se reproducen mediante un ciclo ltico a menudo se denominan bacterifagos virulentos porque destruyen la clulahusped. Muchos fagos DNA, como el fago lambda, tambin son capaces de establecer una relacin diferente con su husped. Tras laadsorcin y la penetracin, el genoma viral no toma el control de su husped ni lo destruye, al tiempo que produce nuevos fagos. En cambio, elgenoma permanece en el interior de la clula husped y se reproduce junto con el cromosoma bacteriano. Se origina un clon de clulasinfectadas que puede crecer durante un largo perodo con apariencia totalmente normal. Cada una de estas clulas infectadas es capaz deproducir fagos y lisarse bajo las condiciones ambientales apropiadas. Esta relacin entre el fago y el husped se denomina lisogenia. La formalatente del genoma viral que permanece en el interior de la clula husped sin destruirla se denomina profago y suele estar integrado en elgenoma bacteriano. En ocasiones, la produccin de fagos se activa en un cultivo de bacterias lisgenas mediante la exposicin a radiacin UV u

otros factores. Las clulas lisgenas son destruidas y se liberan nuevos fagos. Este fenmeno se denomina induccin.Por lo tanto, la transduccin natural es la transferencia de genes bacterianos por medio de virus. Se produce la incorporacin de genesbacterianos al interior de la cpside de un fago a consecuencia de errores cometidos durante el ciclo vital del virus. El virus que contiene estosgenes los inyecta a continuacin en otra bacteria, completando de esta forma la transferencia. La transduccin es el mecanismo ms frecuentede intercambio y recombinacin gnica en las bacterias.




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Se distinguen dos tipos muy diferentes de transduccin:

Generalizada. Ocurre durante el ciclo ltico de fagos virulentos y atemperados, y es capaz de transferir cualquier parte del genomabacteriano. Durante la fase de ensamblaje, cuando los cromosomas virales son empaquetados en el interior de cpsides proteicas puedenquedar encapsidados fragmentos del cromosoma bacteriano parcialmente degradado. Puesto que la cpside slo puede contener unacantidad limitada de DNA, el DNA del virus no se incorpora a la cpside, y slo queda incluido en ella el DNA bacteriano. La cantidad deDNA bacteriano transportada depende principalmente del tamao de la cpside.

Especializada. En ella la partcula transductora transporta slo porciones especficas del genoma bacteriano. La transduccin especializadaes posible a consecuencia de un error durante el ciclo vital lisognico. Cuando se induce a un fago a abandonar el cromosoma de la clulahusped, en ocasiones la escisin se realiza de forma incorrecta. El genoma del fago resultante contiene porciones del cromosomabacteriano (aproximadamente, entre el 5 y el 10 % del DNA bacteriano) adyacentes al sitio de integracin. El genoma del fago originado enla transduccin suele ser defectuoso y carece de alguna parte de su sitio de fijacin. La partcula transductora inyecta los genes virales aotra bacteria, aunque el fago defectuoso no es capaz de reproducirse sin ayuda. Los genes bacterianos pueden quedar incorporados deforma estable en las condiciones adecuadas. El ejemplo mejor estudiado de transduccin especializada es el fago lambda.

Clonacin de DNA en Escherichia coli.Para replicar el DNA clonado se pueden utilizar distintos tipos de clula husped. Uno de los huspedes ms utilizados es la cepa de laboratorioK12 de E.coli. sta y otras cepas de E.colise utilizan como husped ya que estn bien caracterizadas genticamente y pueden aceptar unamplio espectro de vectores, incluyendo los plsmidos, los fagos y los csmidos.

Para crear molculas de DNA recombinante se precisan varios pasos. Si se utiliza un plsmido como vector, el procedimiento es el siguiente:

1. El DNA que se va a clonar se asla y se trata con una enzima de restriccin para crear fragmentos que acaben en secuencias especficas.

2. Estos fragmentos se ligan a molculas de plsmido que han sido cortadas con la misma enzima de restriccin, obtenindose un vectorrecombinante.

3. El vector recombinante se transfiere a clulas husped bacterianas, generalmente por transformacin, un proceso en el que las molculasde DNA cruzan la membrana de la clula husped transfirindose a su interior.

4. La clula husped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formar colonias. Puesto que las clulas de cada una de las coloniasprovienen de una sola clula inicial, todas las clulas de la colonia, y los plsmidos que contienen, son genticamente idnticas, o clones. Serastrean las colonias para identificar las que han incorporado el plsmido recombinante.

La cepa de E.colihusped carece de enzimas de restriccin y es recA- (carece del gen que codifica la protena RecA, una ATPasa necesaria paralos procesos de recombinacin gentica), con objeto de reducir las posibilidades de que el DNA recombinante sufra recombinacin con elcromosoma de la clula husped. Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisiae tambin pueden actuar de huspedes. Como sevolver a mencionar a lo largo de este documento, los vectores plasmdicos penetran en las clulas de E.coli mediante un proceso detransformacin inducido por cloruro clcico o mediante electroporacin a 3-24 kV /cm, que es eficaz en bacterias tanto grampositivas comogramnegativas.

Resumen de los pasos seguidos en la clonacin de un vector plasmdico. Los vectores plasmdicos se aslan y se cortan con una enzima de restriccin. El DNA aclonar se corta con la misma enzima de restriccin, produciendo una coleccin de fragmentos. Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se transfieren ahuspedes bacterianos para su replicacin. Las clulas bacterianas que contienen plsmidos pueden identificarse por crecimiento en un medio selectivo, y puedenaislarse. El DNA clonado puede recuperarse del husped bacteriano para nuevos anlisis.




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Se utilizan varios mtodos para seleccionar las colonias que contienen plsmidos con el inserto de DNA. Este proceso se denomina rastreo (ocribado). Para vectores como pBR322, el rastreo es un proceso que consiste en dos etapas:

Por ejemplo, si el DNA que se desea clonar se inserta dentro del gen de resistencia a tetraciclina, este gen se inactivar. Despus detransformar clulas husped con el plsmido recombinante, stas se hacen crecer en placas de cultivo que contienen el antibiticoampicilina. Todas las clulas que hayan incorporado un plsmido (con o sin inserto) crecern y formarn colonias, mientras que las clulasque no lo hayan incorporado morirn ya que son sensibles a la ampicilina.

En el segundo paso, se identifican las colonias que contienen plsmidos con el inserto de DNA. En este paso, se transfieren las colonias dela placa que contiene ampicilina a una placa que contiene tetraciclina mediante un procedimiento denominado rplica. Las colonias quecontienen el plsmido con el inserto no crecern en la placa con tetraciclina, debido a que el inserto ha inactivado el gen de resistencia atetraciclina. Entonces, el patrn de colonias de la placa con tetraciclina se compara con el de la placa con ampicilina, y se identifican lascolonias de la placa con ampicilina que no han crecido en la placa con tetraciclina. Las clulas de estas colonias contienen vectores con elinserto de DNA, y se transfieren a un medio de crecimiento para nuevos anlisis.

Seleccin de colonias que contienen un vector plasmdico que tiene dos genes de resistencia a antibiticos, uno para tetraciclina y otro para ampicilina. En esteexperimento, la presencia del inserto de DNA en el plsmido inactivar el gen de resistencia a la tetraciclina. Primero, se hacen crecer las clulas transformadas conel plsmido recombinante en un medio que contiene ampicilina. Como las clulas husped son sensibles a ampicilina y el plsmido tiene un gen de resistencia aampicilina, slo crecern aquellas clulas que hayan incorporado el plsmido. Se prepara una rplica de las colonias con un trozo de terciopelo estril. Al presionar elterciopelo sobre la placa, algunas clulas de cada colonia se pegarn a l. Luego se presiona el terciopelo sobre la superficie de una placa que contiene tetraciclina.Las clulas que contienen los plsmidos con inserto no crecern ya que se ha inactivado el gen de la tetraciclina. Comparando el patrn de colonias de la placa contetraciclina con el de la placa original, las colonias que contienen el inserto pueden identificarse y recuperarse de la placa original, y pueden hacerse crecer paranuevos anlisis.

Otros vectores, como pUC18, tienen construcciones que producen colonias azules cuando estn en clulas bacterianas sembradas en un medio

que contiene una sustancia denominada X-gal. Los sitios de restriccin del sitio de clonacin mltiple de pUC18 estn dentro del gen lac, elgen responsable de la capacidad de formar colonias azules, y la insercin de DNA en el sitio de clonacin mltiple interrumpe esta capacidad.Como se ha expuesto anteriormente, los plsmidos que contienen segmentos de DNA insertados producen colonias blancas, mientras que losque no tienen insertos producen colonias azules.

De igual modo, los fagos que contengan DNA exgeno tambin pueden utilizarse para infectar clulas husped de E.coli, y cuando se siembranen un medio slido, cada una de las calvas resultantes representa los descendientes clonados de un solo fago inicial. Los csmidos infectan alas clulas bacterianas como los fagos, pero luego se replican como los plsmidos dentro de la clula husped. Las clulas que contienencsmidos con DNA clonado pueden identificarse y recuperarse de la misma manera que los plsmidos.

Clonacin en huspedes eucariticos

Hemos descrito la utilizacin de E.colicomo husped para la clonacin. Tambin pueden utilizarse otras especies de bacterias como huspedes,como B.subtilisy Streptomyces. Estos sistemas husped bacterianos y sus vectores son parecidos a los descritos para E.coli. Sin embargo, paraestudiar la expresin y regulacin de los genes eucariticos, a menudo es conveniente e incluso necesario utilizar huspedes eucariticos. Sehan desarrollado varios sistemas de clonacin utilizando huspedes eucariticos.




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Vectores de levadura.Aunque la levadura es un organismo eucaritico, puede manipularse y crecer de manera parecida a las clulas bacterianas. Adems, lagentica de las levaduras se ha investigado exhaustivamente, lo que ha proporcionado un gran catlogo de mutaciones y unos mapasgenticos altamente detallados de sus cromosomas. En levadura hay un plsmido de origen natural, denominado plsmido 2 micras (o plsmido 2), que se ha utilizado para construir varios vectores de clonacin para levadura. Combinando secuencias de plsmidosbacterianos con secuencias del plsmido 2 micras, se pueden producir vectores con muchas propiedades tiles.

Cromosomas artificiales de levadura.Un segundo tipo de vector de levadura es el cromosoma artificial de levadura (YAC, del ingls yeast artificial chromosome). De tipo lineal,un YAC contiene telmeros de levadura en cada extremo, un origen de replicacin (denominado secuencia de replicacin autnoma o ARS),

y un centrmero de levadura que permite la distribucin del YACreplicado a las clulas hija durante la divisin celular. El YACtambin contiene un marcador de seleccin en cada brazo (TRP1 yURA3), y un grupo de sitios de restriccin nicos para insertarDNA.

Clonacin en un cromosoma artificial de levadura (YAC). El cromosomacontiene secuencias telomricas (TEL) provenientes de un protozoo ciliado,Tetrahymena, un centr mero (CEN), y un origen de replicacin (ARS).Estos elementos dan al vector de clonacin las propiedades de uncromosoma. TRPI y URA3 son genes de levadura que son marcadores de

seleccin para los brazos izquierdo y derecho del cromosoma,respectivamente. Cerca del centrmero hay una regin que contiene variossitios de restriccin. Si se corta esta regin con una enzima de restriccin serompe el cromosoma en dos brazos. El DNA a clonar se trata con la misma

enzima, produciendo una coleccin de fragmentos. Los brazos y los fragmentos pueden ligarse juntos, y el cromosoma artificial puede insertarse en clulas huspedde levadura. Como los cromosomas de levadura son grandes, el cromosoma artificial puede aceptar insertos de hasta varios millones de pares de bases.

En los YAC pueden insertarse segmentos de DNA de ms de 1 megabase de longitud (1 Mb). La capacidad de clonar grandes trozos de DNA enestos vectores los ha convertido en herramientas importantes para construir mapas fsicos de genomas eucariticos, incluyendo el genomahumano. Muchas de las investigaciones del Proyecto Genoma Humano han dependido de la utilizacin de vectores YAC.

Aunque la clonacin en levaduras es uno de los sistemas actuales de husped eucaritico ms avanzado, tambin se estn desarrollando otroshuspedes fngicos. Adems, otros sistemas husped eucariticos, entre los que se incluyen cultivos tisulares de clulas de plantas y demamferos, son muy prometedores.

Construccin de bibliotecas de DNAPuesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeo, deben construirse muchos clones diferentes para incluir todas las

pequeas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genmicas de un slo individuo se denominabiblioteca . Las bibliotecas clonadas pueden provenir del genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto degenes transcripcionalmente activos en un nico tipo celular.

Bibliotecas genmicas.Las bibliotecas genmicas (o genotecas) suelen construirse utilizando vectores fgicos, que pueden contener grandes fragmentoscromosmicos. Para preparar una biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA de lambda con una enzima de restriccin para eliminar el grupognico central, tal y como se ha comentado anteriormente. El DNA genmico que se desea clonar se corta con la misma enzima, y se purificanlos fragmentos cortados de tamao ptimo para el empaquetamiento (de 15 a 17kb) mediante una electroforesis en gel o por centrifugacin.Estos fragmentos de DNA se ligan con los brazos del cromosoma de lambda para formar la biblioteca.

En una biblioteca genmica estn representados todos los genes de un organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen delgenoma del organismo, pudindose estudiar con detalle junto con sus secuencias reguladoras adyacentes. Tericamente, una bibliotecagenmica contiene al menos una copia de todas las secuencias representadas en el genoma. Sin embargo, cada molcula de vector puedecontener slo unas relativamente pocas kilobases de DNA insertado, por lo que una de las primeras tareas al preparar una biblioteca genmica

es seleccionar el vector ms adecuado para contener el genoma completo en el menor nmero posible de clones. El nmero de clonesnecesarios para contener todas las secuencias de un genoma depende del tamao medio de los insertos clonados y del tamao del genoma aclonar. Este nmero puede calcularse con la siguiente frmula:

( )( )f

PN

=1ln

1ln




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donde N es el nmero de clones necesarios, P es la probabilidad de recuperar una secuencia determinada, y f representa la fraccin delgenoma presente en cada clon.

Supongamos que deseamos preparar una biblioteca del genoma humano utilizando como vector al fago lambda. El genoma humano tiene 3,0 106 kb; si el tamao medio de los insertos clonados en el vector es de 17 kb, y queremos tener una probabilidad del 99% (P = 0,99) de quecualquier gen humano est representado al menos en una copia, precisaremos una biblioteca de:

y si hubisemos seleccionado a pBR322 como vector, con un tamao medio de insertos de 5 kb, la biblioteca necesitara contener:

Mutagnesis dirigida.Los avances en las tcnicas de sntesis de DNA han acelerado los progresos experimentados en el estudio de las funciones de las protenasy de la expresin gnica. Una de las formas ms efectiva de estudiar la relacin entre la estructura y la funcin proteicas consiste en alteraruna porcin determinada de la protena y observar los cambios funcionales que se producen. Hasta hace unos aos, esto se realizabamediante la modificacin qumica de aminocidos individuales o mediante induccin de mutaciones en el gen que codifica la protena objetode estudio. Sin embargo, la modificacin qumica de una protena no siempre es especifica, ya que pueden verse alterados variosaminocidos y no slo el que se desea alterar; por otro lado, hasta hace unos aos no siempre era posible producir la mutacin adecuadaen la localizacin del gen que se deseaba.

Estas dificultades han sido superadas en los ltimos aos gracias a la tcnica de la mutagnesis dirigida; en ella se sintetiza unoligonucletido de unas 20 bases que contiene el cambio de secuencia deseado. Posteriormente se permite que dicho oligonucletidoalterado con la mutacin objeto de estudio hibride con una copia monocatenaria del gen salvaje original completo; posteriormente seamplifica el complejo mediante PCR, con lo que la polimerasa extiende el olignucletido y copia el resto del gen diana para producir unanueva copia del gen con la mutacin deseada. Si unimos el gen a un fago de DNA monocatenario como es el caso del fago M13, puedeintroducirse el gen mutado en una bacteria husped y clonarse, con lo que obtendremos grandes cantidades de una protena mutante parael estudio de su funcin.

( )clones108,2

100,3

1051ln

99,01lnN

6

9

3=

=

( )clones101,8

100,310171ln

99,01lnN

5

9

3=

=




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Bibliotecas cromosmicas.Una biblioteca construida a partir de una fraccin genmica, como un cromosoma, puede ser muy valiosa para seleccionar genes especficos ypara examinar la organizacin del cromosoma. Por ejemplo, se aisl por microdiseccin por lser un pequeo segmento del cromosoma X deDrosophilacorrespondiente a una regin de unas 50 bandas politnicas. Se extrajo el DNA de este fragmento cromosmico, se cort con unaendonucleasa de restriccin, y se clon en un vector lambda. Esta regin del cromosoma contiene los genes white, zestey Notch, as como elsitio original de un elemento transponible que puede transponer un segmento cromosmico a ms de un centenar de otros loci. Aunque puedeser tcnicamente difcil, este procedimiento produce una biblioteca que contiene slo los genes que nos interesan y sus secuencias adyacentes.

Las bibliotecas provenientes de cromosomas individuales humanos se han preparado utilizando la citometra de flujo. Los cromosomas de

clulas mitticas se tien con dos colorantes fluorescentes, uno que se une a los pares A T, y otro a los pares G C. Los cromosomas teidospasan por un rayo lser que estimula la fluorescencia, y un fotmetro clasifica y fracciona los cromosomas segn las diferencias de unin de loscolorantes y de dispersin de la luz. Utilizando esta tcnica, diferentes laboratorios han preparado bibliotecas de cada uno de los cromosomashumanos. Esto ha facilitado enormemente el cartografiado y el anlisis de cromosomas individuales como parte del Proyecto Genoma Humano.

Una modificacin de la electroforesis conocida como electroforesis de campo pulstil se ha utilizado para aislar cromosomas de levadura con elfin de construir bibliotecas cromosmicas de este organismo. El aislamiento y la construccin de bibliotecas del cromosoma III de levadura (315kb) fue el punto de partida para la formacin de un consorcio de 35 laboratorios para determinar la secuencia nucleotdica de este cromosoma.Uno de los resultados inesperados de este proyecto fue el descubrimiento de que aproximadamente la mitad de las secuencias codificantes deprotenas de este cromosoma eran desconocidas. Para muchos genticos, fue difcil aceptar que los mtodos convencionales de mutagnesissistemtica y de cartografiado de genes no fuesen tan eficientes como pensaban. Sin embargo, este descubrimiento se confirm y se ampli en1994 con la publicacin de la secuencia del cromosoma XI (664 kb), y en 1996 con la secuenciacin del resto del genoma de levadura. Estosresultados indican que las bibliotecas cromosmicas pueden utilizarse para acceder a los loci gnicos a los que los mtodos convencionalescomo la mutagnesis y el anlisis gentico no han podido acceder, o de los que no se dispone o no se conocen otras sondas como el mRNA olos productos gnicos. Adems, las bibliotecas cromosmicas proporcionan un medio para investigar la organizacin molecular y la secuencianucleotdica en una regin definida del genoma.

Bibliotecas de cDNA.Se puede construir una biblioteca que represente los genes que se estn transcribiendo en una clula eucaritica en un momento dado,utilizando el mRNA aislado de esa clula. Casi todas las molculas de mRNA eucaritico tienen una cola de poli-A en su extremo 3'. Primero, sehibrida la poblacin de molculas de mRNA que tienen colas de poli-A 3' con oligo-dT (DNA corto de cadena sencilla formado slo pordesoxitimidina).

La secuencia de oligo-dT hibrida con la cola de poli-A, y sirve de cebador para la sntesis de una cadena complementaria de DNA utilizando laenzima retrotranscriptasa. Esta enzima es una DNA polimerasa dependiente de RNA que copia un molde de RNA de cadena sencilla en un DNAde cadena sencilla. El resultado es un dplex RNA DNA de doble cadena. La cadena de RNA se elimina tratndola con la enzima ribonucleasaH. Entonces, la cadena sencilla de DNA se utiliza como molde para sintetizar la cadena complementaria de DNA, utilizando la DNA polimerasa I.El extremo 3' de la cadena sencilla de DNA se dobla sobre s mismo formando una horquilla (un lazo), por lo que puede servir de cebador parasintetizar la segunda cadena. El resultado es un DNA dplex con las cadenas unidas por un extremo. La horquilla puede abrirse utilizando laenzima nucleasa S1 obtenindose una molcula de DNA de doble cadena (denominada DNA complementario o cDNA), cuya secuencianudeotdica deriva de una molcula de RNA.

Si se aade un trozo corto de DNA con sitios de restriccin en cada uno de sus extremos, el cDNA puede clonarse. Este sitio de clonacin puedecortarse con la enzima de restriccin adecuada, produciendo extremos cohesivos, lo que permite que el cDNA se inserte en el sitio derestriccin de un vector plasmdico o fgico.

Una biblioteca de cDNA es diferente a una biblioteca genmica ya que representa slo un subconjunto de todos los genes del genoma, nocontienen las secuencias promotoras adyacentes al gen y tampoco contienen los intrones, ya que stos han sido eliminados del pre-mRNAdurante la maduracin del mismo. Las bibliotecas de cDNA utilizan mRNA como punto de partida, de manera que slo representan a lassecuencias que se estn expresando en un tipo celular, en un tejido, o en un estadio concreto del desarrollo embrionario. La decisin deconstruir una biblioteca genmica o de cDNA depende del problema planteado. Si se est interesado en un gen particular, podra ser ms fcilpreparar una biblioteca de cDNA del tejido en el que se expresa dicho gen. Por ejemplo, los glbulos rojos producen grandes cantidades dehemoglobina, y la mayora del mRNA de estas clulas es mRNA de la -globina. Una biblioteca de cDNA preparada utilizando mRNA aislado deglbulos rojos permite aislar con facilidad un gen de la globina. Si nos interesasen las secuencias reguladoras adyacentes al gen de la globina,necesitaramos construir una biblioteca genmica, ya que estas secuencias reguladoras no se encuentran en el mRNA de la globina, y por lotanto no estaran representadas en la biblioteca de cDNA.




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Produccin de cDNA a partir de mRNA. Puesto quemuchos mRNA eucariticos tienen una cola poli-adenilada de longitud variable, en su extremo 3', unoligonucletido poli-dT corto puede hibridarse a ella. Elpoli-dT acta de cebador de la enzimaretrotranscriptasa, que utiliza al mRNA como moldepara sintetizar una cadena de DNA complementaria.Se forma una horquilla caracterstica al terminarse lasntesis de la cadena de DNA. Se elimina el mRNA portratamiento alcalino del complejo, y se utiliza la DNApolimerasa para sintetizar la segunda cadena de DNA.La nucleasa S1 se utiliza para abrir la horquilla; elresultado es una molcula de cDNA de doble cadenaque puede clonarse en un vector adecuado, outilizarse como sonda para rastrear una biblioteca.

Iden tificacin de secuencias clonadas especficas.Una biblioteca genmica puede contener varios cientos de miles de clones. El problema ahora es identificar y seleccionar slo el clon o clonesque contienen el gen que nos interesa, y determinar si un clon determinado contiene todo el gen o slo una parte de l. Hay varias maneras dehacerlo, y la eleccin depende de las circunstancias y de la informacin disponible. Los mtodos que se describen a continuacin utilizandiversos enfoques para encontrar una secuencia especfica de DNA en una biblioteca.

Sondas para rastrear clones especficos.Muchos de los protocolos utilizan una sonda para rastrear la biblioteca e identificar el clon que contiene el gen de inters. A menudo, las sondasson polinucletidos radioactivos que contienen una secuencia de bases complementaria a todo o a parte del gen de inters. Otros mtodosutilizan sondas que dependen de reacciones qumicas o colorimtricas para indicar la localizacin de un clon especfico. Las sondas puedenprovenir de distintas fuentes; genes relacionados aislados de otras especies pueden servir de sonda si la secuencia se ha conservadosuficientemente. Por ejemplo, se aislaron copias extracromosmicas de genes ribosmicos de la rana Xenopus laevispor centrifugacin, secortaron con enzimas de restriccin, y se clonaron en vectores plasmdicos. Como las secuencias de los genes ribosmicos se han conservadoenormemente durante la evolucin de los eucariotas, estos genes clonados de Xenopusse marcaron con radioistopos y se utilizaron como

sonda para aislar los genes ribosmicos humanos de una biblioteca genmica.

Si el gen que se quiere seleccionar de la biblioteca es transcripcionalmente activo en determinados tipos celulares, se puede utilizar una sondade cDNA para encontrarlo. Esta tcnica es especialmente til cuando puede obtenerse el mRNA purificado o enriquecido. Como se ha citadoanteriormente, el mRNA de la -globina es el RNA mensajero predominante en determinados estadios del desarrollo de los glbulos rojos. Parahacer una sonda, se asla el mRNA de estas clulas, se purifica, y se copia con la retrotranscriptasa en una molcula de cDNA. Este cDNA puede




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utilizarse como sonda para recuperar el gen de la -globina de una biblioteca genmica, incluyendo los intrones y las regiones de controladyacentes.

Un enfoque diferente para generar sondas utiliza una tcnica denominada genrica reversa. Este mtodo va de la protena al gen. Si se disponedel producto proteico del gen, y se conoce parte de su secuencia aminoacdica, puede construirse una sonda polinucleotdica. Teniendo lasecuencia de aminocidos, puede deducirse la secuencia nucleotdica que los codifica. Debido a que el cdigo gentico es degenerado (unaminocido puede estar especificado por hasta seis codones), hay varias secuencias nucleotdicas posibles. Posteriormente, se sintetizaqumicamente cada uno de estos oligonucletidos utilizando nucletidos radioactivos. Para identificar el clon que codifica el gen de inters seutiliza una mezcla de estas sondas. Es importante destacar que no es preciso saber la secuencia aminoacdica completa de la protena ni

sintetizar una secuencia nucleotdica del gen completo. Normalmente, un oligonucletido de unos 18 a 21 nucletidos (equivalentes a 6 o 7aminocidos), es suficiente para producir una sonda.

Rastreo de una biblioteca.Para rastrear una biblioteca construida en plsmidos, se hacen crecer los clones en placas de cultivo, formndose cientos o miles de colonias.Se hace una rplica de las colonias de la placa poniendo sobre su superficie un filtro de nitrocelulosa o de nylon, de manera que algunas clulasbacterianas de las colonias se transfieran al filtro. ste se trata para lisar las bacterias, se desnaturaliza el DNA de doble cadena que seconvierte en cadenas sencillas, y finalmente dichas cadenas se unen al filtro.

Las rplicas de las colonias del filtro se rastrean incubando el f iltro con la sonda de cido nucleico. Este mtodo precisa que se conozca parte dela secuencia del gen o del DNA que se est rastreando. Si se utiliza una sonda radioactiva para rastrear la biblioteca, la sonda de DNA sedesnaturaliza para formar molculas de cadena sencilla y se aade a la solucin en la que el filtro est sumergido. Si la secuencia de la sondaes complementaria a cualquiera de las secuencias clonadas de las colonias, se formar un hbrido DNA-DNA entre la sonda y el inserto. Despusde lavar la sonda no unida, se cubre el filtro con un trozo de pelcula fotogrfica. Si la sonda es complementaria al DNA de una de las coloniaslisadas, la radioactividad con que est marcada expondr parte de la pelcula, y la colonia hibridada se identificar como una mancha oscura enla pelcula revelada. Esta colonia puede recuperarse de la placa inicial, y el DNA clonado que lleva puede utilizarse para nuevos experimentos.Las sondas no radioactivas utilizan mtodos quimioluminiscentes o colorimtricos para detectar el clon (o clones) de inters.

Hay otra tcnica interesante para rastrear bibliotecas de cDNA. Estas bibliotecas provienen de colecciones de mRNA; por lo tanto, provienen demolculas de mRNA que, bajo las condiciones adecuadas, pueden traducirse en protenas. La mayora de vectores utilizados para construirestas bibliotecas tienen promotores que permiten expresar el producto proteico del gen clonado (esto hace que tambin se las conozcan comobibliotecas de expresin). Si se induce la expresin de la protena codificada por el gen clonado, sta se puede detectar mediante tcnicasinmunolgicas. De esta manera, si se dispone de un anticuerpo especfico de una protena, se puede aislar el gen que codifica para ella.

Rastreo de una biblioteca de plsmidos para recuperar un genclonado. Se cubre la biblioteca, que est en placas de cultivo,con un filtro que une DNA, y se transfieren las colonias al filtro.Se lisan las colonias del filtro, y el DNA se desnaturaliza encadenas sencillas. Se coloca el filtro en una bolsa dehibridacin junto con tampn y una sonda de DNA de cadenasencilla marcada. Durante la incubacin, la sonda forma unhibrido de doble cadena con las secuencias complementariasdel filtro. Se saca el filtro de la bolsa y se lava para eliminar elexceso de sonda. Los hbridos se detectan poniendo un trozode pelcula de rayos X sobre el filtro y exponindola por un

corto periodo de tiempo. Se revela la pelcula, y los sucesos dehibridacin se visual izan como manchas en la pelcula. Por laposicin de las manchas en la pelcula, pueden identificarse lascolonias que contienen el inserto que ha hibridado con lasonda. Se toman clulas de esta colonia y se hacen crecer paranuevos anlisis.




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Para rastrear una biblioteca construida en fagos, se utiliza un mtodo ligeramente diferente denominado hibridacin de calvas. Se siembra unasolucin del fago que lleva el inserto de DNA en una placa en la que est creciendo un csped de bacterias. Entonces el fago se replica,formando calvas, que aparecen en la placa como manchas claras. Cada calva representa la progenie de un slo fago, es decir son clones delfago. Las calvas se transfieren poniendo un filtro en la superficie de la placa, y posteriormente se lisan. El DNA se desnaturaliza a cadenasencilla y se rastrea con una sonda marcada como se ha descrito para una biblioteca de plsmidos. Las calvas de los fagos son mucho mspequeas que las colonias bacterianas, por lo que pueden obtenerse muchas ms calvas creciendo en una misma placa. En consecuencia, sepueden rastrear ms calvas en un slo filtro, lo que hace a este mtodo mucho ms eficiente para el rastreo de bibliotecas genmicas de grantamao.

Paseo cromosmico.En algunos casos, cuando se conoce la localizacin aproximada de un gen, es posible clonar dicho gen clonando primero las secuencias vecinas. A menudo, las secuencias vecinas se identifican por anlisis de ligamiento. Estas secuencias sirven de punto de partida para el paseocromosmico, el aislamiento de clones adyacentes de la biblioteca genmica. En un paseo cromosmico, se subclona el fragmento final del DNAclonado, y se utiliza como sonda para recuperar clones solapados de la biblioteca genmica. Los clones solapados se analizan por mapas derestriccin para determinar la extensin del solapamiento. Un fragmento de uno de los extremos de este clon solapante se utiliza como sonda

para recuperar un nuevo conjunto de clones solapados, repitindose el proceso de anlisis. De esta manera, es posible pasear por elcromosoma, clon a clon. El gen en cuestin puede identificarse secuenciando los nucletidos del clon recuperado y buscando una fase abiertade lectura (ORF), un trecho de nucletidos que empieza con un codn de iniciacin y que tiene una serie de codones que codificanaminocidos, seguido de uno o ms codones de terminacin. Aunque es laborioso y lento, el paseo cromosmico se ha utilizado para recuperargenes asociados a enfermedades genticas humanas; los genes de la fibrosis qustica y de la distrofia muscular se aislaron con esta tcnica.

En los complejos genomas eucariticos, hay varias limitaciones al paseo cromosmico. Si una sonda contiene una secuencia repetitiva, hibridarcon muchos otros clones de la biblioteca genmica, muchos de los cuales no sern segmentos adyacentes, terminndose el paseo. En estoscasos puede utilizarse una tcnica relacionada denominada salto cromosmico, que pasa por alto la regin que contiene secuencias repetitivasy contina el paseo.

Mtodos de anlisis de las secuencias clonadas.La identificacin y recuperacin de secuencias de DNA clonadas especficas es una herramienta poderosa para analizar la estructura y la funcinde los genes. Las tcnicas que se describen en las prximas secciones se utilizan para responder a preguntas experimentales de la organizaciny de la expresin de las secuencias clonadas.

Mapas de restriccin.Un mapa de restriccin es la recopilacin del nmero, del orden y de la distancia entre los sitios de corte de enzimas de restriccin en unsegmento clonado de DNA.




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Los mapas de restriccin proporcionan informacin que puede utilizarse para subclonar fragmentos de un gen, o bien para comparar laorganizacin de un gen y de su cDNA con el fin de identificar los exones y los intrones en la copia genmica del gen.

Los fragmentos generados tras cortar el DNA con enzimas de restriccin pueden separarse mediante electroforesis en gel, mtodo que separalos fragmentos por su tamao, y en el que los fragmentos ms pequeos se mueven ms rpidamente. Los fragmentos aparecen como unaserie de bandas que pueden visualizarse tiendo el DNA con bromuro de etidio e iluminndolo con luz ultravioleta. El tamao de los fragmentosindividuales puede determinarse corriendo un conjunto de fragmentos marcadores de tamao conocido en otro carril del mismo gel.

La siguiente figura muestra los pasos que deben seguirse para construir el mapa de restriccin de un segmento de DNA clonado que contienesitios de corte para dos enzimas de restriccin. Para construir el mapa, se parte de un segmento de DNA clonado de 7 kb de longitud. Tres

muestras del DNA clonado se digieren con enzimas de restriccin: una con HindIII; otra con SalI; y la ltima con las dos enzimas, HindIII ySalI. Los fragmentos generados por la digestin con las enzimas de restriccin se separan por electroforesis. El tamao de estos fragmentos seestima por comparacin con un conjunto de patrones de tamao separados electroforticamente en carriles adyacentes del mismo gel. Paraconstruir el mapa, se analizan los fragmentos generados con las enzimas de restriccin.

Cuando el DNA se corta con HindIII, se producen dos fragmentos, uno de 0,8 kb y otro de 6,2 kb, indicando que slo hay un sitio derestriccin para esta enzima (y que est localizado a 0,8 kb de uno de los extremos).

Cuando el DNA se corta con SalI, se producen dos fragmentos, uno de 1,2 kb y otro de 5,8 kb, lo que significa que hay un nico sitio derestriccin localizado a 1,2 kb de uno de los extremos.

En conjunto, estos resultados muestran que hay un sitio de restriccin para cada enzima, pero se desconoce la relacin existente entre estosdos sitios. Con esta informacin, hay dos mapas posibles. En un modelo, el sitio HindIII est a 0,8 kb de uno de los extremos (modelo 1), y elsitio SalI est a 1,2 kb del mismo extremo. En el modelo alternativo (modelo 2), el sitio HindIII est localizado a 0,8 kb de un extremo, y el sitioSalI est localizado a 1,2 kb del otro extremo.

El modelo correcto puede determinarse si se consideran los resultados de la digestin con ambas enzimas, HindIII y SalI. El modelo 1 prediceque la digestin con ambas enzimas generar tres fragmentos de 0,4, 0,8 y 6,2 kb; el segundo modelo predice que la digestin con ambasenzimas generar tres fragmentos de 0,8, 1,2 y 5,0 kb. El patrn real de fragmentos observado despus de la digestin con ambas enzimasindica que el modelo correcto es el modelo 1.

En la mayora de casos, los mapas de restriccin son ms complejos e implican un mayor nmero de enzimas y un mayor nmero de sitios paracada enzima. Los mapas de restriccin proporcionan una manera importante de caracterizar un segmento de DNA, y pueden construirse sintener ninguna informacin de la capacidad codificadora ni de la funcin del DNA cartografiado. Junto con otras tcnicas, los mapas derestriccin pueden utilizarse para definir los extremos de un gen, y proporcionan una manera de diseccionar la organizacin molecular de ungen y de sus regiones flanqueantes. Los mapas tambin puede servir de punto de partida para analizar un gen intacto de segmentos clonados

de DNA, y proporcionan una manera de localizar sitios de mutacin en los genes.

Los mapas de restriccin tambin pueden utilizarse para refinar los mapas genticos. En la mayora de los casos, la exactitud de los mapasconstruidos por anlisis gentico se basa tanto en la frecuencia de recombinacin entre marcadores genticos como en el nmero demarcadores genticos utilizados en la construccin del mapa.




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Si hay una gran distancia entre los marcadores y/o variacin en la frecuencia de re combinacin, el mapa gentico puede no corresponder almapa fsico de esa regin cromosmica. Por ejemplo, el genoma humano es grande (3,2 109 pb), y el nmero de genes mapeados espequeo (unos pocos millares), lo que significa que cada unidad del mapa est compuesta por millones de pares de bases de DNA. El resultadoes una correlacin baja entre los mapas gentico y fsico de los cromosomas. Los sitios de corte de las enzimas de restriccin pueden utilizarsecomo marcadores genticos, reduciendo as la distancia entre los distintos sitios del mapa, incrementando la fidelidad de los mapas, yproporcionando puntos de referencia para la correlacin de los mapas gentico y fsico.

Los sitios de restriccin han desempeado una funcin importante en el mapeado de genes en cromosomas humanos especficos y en regionesdefinidas de cromosomas concretos. Adems, si un sitio de restriccin est cerca de un gen mutante, puede utilizarse como marcador en

diagnstico. Estos sitios, son conocidos como polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin, RFLPs; la utilizacin de los RFLPs hademostrado ser especialmente til, ya que los genes mutantes que provocan muchas enfermedades genticas humanas estn muy pococaracterizados a nivel molecular, y los sitios de restriccin cercanos se han utilizado con xito en la deteccin de los individuos afectados y delos heterocigotos con riesgo de tener hijos afectados.

Transferencia de Southern y Northern.Los insertos de DNA clonados en vectores pueden utilizarse en experimentos de hibridacin para caracterizar la identidad de genes especficos,para localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas y para investigar la organizacin molecular delas secuencias genmicas.

Edward Southern desarroll la utilizacin de segmentos de DNA clonado, separados por electroforesis, transferidos a filtros, y rastreados consondas. Conocido como transferencia de Southern (Southern blot), este procedimiento tiene muchas aplicaciones.

En Southern blot, el DNA clonado se corta en fragmentos con una o ms enzimas de restriccin, y estos fragmentos se separan porelectroforesis en gel. El DNA se desnaturaliza dentro del gel en fragmentos de cadena sencilla, y stos se transfieren a un filtro de un material,normalmente nitrocelulosa o un derivado del nylon, que une el DNA. La transferencia se hace colocando la hoja de la membrana encima del gel,

y provocando que el tampn pase por el gel y por la hoja de nitrocelulosa o de nylon por capilaridad. El tampn pasa por el gel y por lamembrana, arrastrando al DNA fuera del gel e inmovilizndolo en la membrana.

En la prctica, esto se hace poniendo el gel con el DNA desnaturalizado sobre una gruesa esponja que acta de mecha. La esponja estparcialmente sumergida en una cubeta con tampn. Se pone una membrana encima del gel, y se cubre con hojas de papel secante oabsorbente y un peso. La accin capilar arrastra el tampn de la cubeta a travs de la esponja, del gel, de la membrana, y del montn de papelsecante. Al pasar el tampn por el gel, los fragmentos de DNA se transfieren a la membrana, a la que se unen. Despus de la transferencia, elDNA de cadena sencilla se fija a la membrana calentndola a 80C o exponindola a luz ultravioleta para que se hagan uniones entre losfragmentos y la membrana.




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Entonces, los fragmentos de DNA del filtro se hibridan con una sonda. Slo formarn hbridos los fragmentos de DNA de cadena sencillapresentes en la membrana que sean complementarios a la secuencia nucleotdica de la sonda. Se lava la sonda no unida, y se visualizan losfragmentos hibridados. Si se utiliza una sonda radioactiva, la posicin de la sonda se determina por autorradiografa, utilizando pelculafotogrfica.

Adems de para caracterizar DNA clonado, el Southern blot se utiliza para muchos otros fines, como el mapeo de sitios de restriccin en un geno cerca de l, la identificacin de fragmentos de DNA que contienen un gen determinado de entre una mezcla de muchos fragmentos, y laidentificacin de genes relacionados en diferentes especies. Tambin se utiliza para detectar reorganizaciones y duplicaciones en genesasociados a enfermedades genticas humanas y a cnceres.

Existe una tcnica de transferencia relacionada que puede utilizarse para determinar si un gen clonado es transcripcionalmente activo en untipo celular o en un tejido dado. Esta tcnica detecta la presencia de RNA que sea complementario al segmento de DNA clonado. Esto se lleva acabo extrayendo RNA de uno o varios tipos celulares o tejidos. Se fracciona el RNA por electroforesis en gel, y el patrn de bandas se transfierea una membrana que una el RNA como en el Southern blot. El filtro se hibrida con una sonda de DNA de cadena sencilla, proveniente de DNAgenmico clonado o de cDNA. Si hay RNA complementario a la sonda de DNA, ste se detectar por autorradiografa como una banda en lapelcula fotogrfica. Como el protocolo original que utiliza DNA unido a un filtro se conoce como Southern blot, el protocolo que utiliza RNAunido al filtro se denomin transferencia Northern (Northern blot).

El Northern blot proporciona informacin de la presencia de un transcrito de RNA complementario a un gen clonado en una clula o en untejido determinado, y se utiliza para examinar patrones de expresin gnica en tejidos embrionarios y adultos. El Northern blot tambin puedeutilizarse para detectar cortes y empalmes alternativos del mRNA, y para detectar mltiples tipos de transcritos provenientes de un solo gen. ElNorthern blot tambin proporciona otras informaciones de los mRNA transcritos. Si se corre un RNA marcador en un carril adyacente, se puedecalcular el tamao del mRNA de un gen de inters. Adems, la cantidad de RNA transcrito presente en una clula o en un tejido estrelacionado con la densidad de la banda de RNA del film de autorradiografa. Se puede semicuantificar la cantidad de RNA midiendo la densidad(intensidad) de la banda, lo que proporciona una medida relativa de la actividad transcripcional. De esta manera, el Northern blot puedeutilizarse para caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas clulas, tejidos, u organismos.

Secuenciacin de DNA.En cierto sentido, la caracterizacin definitiva de un segmento de DNA clonado es la determinacin de su secuencia de nucletidos. Lacapacidad de secuenciar DNA clonado ha permitido grandes avances en el conocimiento de la estructura gnica y de los mecanismos deregulacin. Aunque desde la dcada de los 40 hay tcnicas que permiten determinar la composicin de bases del DNA, fue en la dcada de los60 cuando se desarrollaron los mtodos para determinar la secuencia de los nucletidos. En 1965, Robert Holley determin la secuencia de unamolcula de tRNA que contena 74 nucletidos. Se necesit un ao de esfuerzo para realizar este trabajo. En la dcada de los 70 sedesarrollaron mtodos ms eficientes de secuenciacin y, actualmente, en un laboratorio de Biologa Molecular, es posible secuenciar ms de1.000 bases en una semana.

Un mtodo de secuenciacin de DNA diseado por Alan Maxam y Walter Gilbert utiliza productos qumicos para cortar el DNA. Este mtodo seutiliz para determinar la secuencia de bases de los 4.362 nucletidos del plsmido pBR322. El segundo mtodo, que es el que generalmente seutiliza, lo desarrollaron Frederick Sanger y sus colaboradores. El mtodo de Sanger se basa en la elongacin 5' 3' de las molculas de DNApor la DNA polimerasa. Ambas estrategias generan un conjunto de molculas de DNA de cadena sencilla de diferentes longitudes. Paradeterminar la secuencia de los nucletidos en un segmento de DNA, ambos mtodos utilizan una serie de cuatro reacciones, realizadas en tubos

separados. Estas secuencias, cuya diferencia en tamao es de un solo nucletido, se separan por electroforesis en gel en cuatro carrilesadyacentes. El resultado es una serie de bandas que forman un patrn parecido a una escalera. La secuencia puede leerse directamente delpatrn de bandas de los cuatro carriles. Los secuenciadores automticos de DNA utilizan colorantes fluorescentes en vez de sondasradioactivas. Se utilizan cuatro colorantes, produciendo un patrn de picos de colores que, al leerlos, proporcionan la secuencia de DNA.




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La secuenciacin de DNA proporciona informacin de la organizacin de los genes y de los sucesos mutacionales que alteran a los genes y a losproductos gnicos, confirmando la conclusin de que los genes y las protenas son molculas colineares. La secuenciacin tambin se ha

utilizado para examinar la organizacin de las regiones reguladoras que flanquean los genes procariticos y eucariticos, y para deducir lasecuencia de aminocidos de las protenas. El gen de la fibrosis qustica (CF), una enfermedad gentica humana autosmica recesiva, seidentific clonando y secuenciando el DNA de una regin del brazo largo del cromosoma 7. Como no se conoca el producto proteico de estegen, se utiliz la secuencia de DNA para identificar una regin codificadora. Se utiliz la secuencia de DNA de esta regin para generar unaprobable secuencia de 1.480 aminocidos.

Esta secuencia se utiliz para buscar secuencias aminoacdicas de protenas conocidas en las bases de datos, lo que permiti inferir que laprotena CF tiene caractersticas similares a las protenas de membrana que desempean una funcin en el transporte de iones. Nuevosexperimentos confirmaron que el producto del locus de la fibrosis qustica es una protena de membrana que regula el transporte de iones cloropor la membrana plasmtica. En la mayora de casos de CF, el gen mutante tiene una secuencia de DNA alterada que causa la produccin deuna protena defectuosa.

Adems de identificar los defectos del DNA que causan los fenotipos mutantes, la secuenciacin de DNA tambin se utiliza para examinar laorganizacin de un gen (el nmero de intrones y de exones y sus lmites), para proporcionar informacin de la naturaleza y de la funcin de lasprotenas codificadas por los genes, como el tamao, el nmero y tipo de dominios (regin transmembrana, de unin al DNA), y de la relacincon protenas similares y con protenas de otros organismos.

Transferencia de DNA a eucariotas.Tanto las clulas animales como las vegetales pueden incorporar DNA del medio ambiente, proceso denominado transfeccin. Adems, losvectores, incluyendo los YAC, pueden utilizarse para transferir DNA a clulas eucariticas.

Clulas vegetales.En los ltimos aos, se ha conseguido clonar utilizando plantas superiores como husped y plsmidos bacterianos. La bacteria infecciosa

Agrobacterium tumifaciens, presente en el suelo, produce tumores (denominados agalla de la corona) en muchas especies de plantas. Lainfeccin de las clulas normales por esta bacteria las transforma en clulas tumorales, y en las plantas dicotiledneas del tipo de la uva y lasplantas decorativas se desarrollan tumoraciones en forma de agallas. Normalmente, el tumor se localiza cerca de la unin de la raz con eltallo de la planta. El tumor se origina debido a que los genes de la bacteria se insertan en el genoma de las clulas de la planta. Slo sonpatgenas las cepas deA.tumefaciensque contienen un plsmido conjugativo de gran tamao, denominado plsmido Ti.

Cuando estas bacterias infectan clulas vegetales, un segmento del plsmido Ti, conocido como T-DNA, se transfiere al DNA cromosmico de laclula vegetal husped. La regin T-DNA contiene genes que codifican la sntesis de hormonas del crecimiento de la planta (una auxina y una

citoquinina) y de un derivado de aminocidos denominado opina, que son necesarias para el crecimiento de la bacteria infecciosa. Se puedeninsertar genes exgenos en el segmento T-DNA de Ti, y la bacteria infecciosa puede transferir el Ti alterado a la clula vegetal. El DNA exgenose inserta en el genoma de la planta cuando el T-DNA se integra en el cromosoma de la clula husped. El crecimiento de esta clulagenticamente alterada puede inducirse en un medio de cultivo, formando una masa celular denominada callo. Manipulando el medio decultivo, puede inducirse la formacin de races y de brotes en el callo, y que ste se desarrolle eventualmente como plantas adultas quecontengan el gen exgeno.

Cuando se identific la naturaleza molecular de la tumoracin en forma de agallas, se hizo evidente que el plsmido Ti y su T-DNA tenan ungran potencial como vector para la insercin de DNA recombinante en los cromosomas de plantas. En uno de los primeros experimentos, seaadi el gen que codifica la alcohol deshidrogenasa de las levaduras a la regin T-DNA del plsmido Ti. La infeccin subsiguiente de clulas deplantas cultivadas condujo a la transferencia del gen de la levadura. Desde entonces, se han realizado numerosas modificaciones en el plsmidoTi con objeto de mejorar sus caractersticas como vector. Habitualmente se aade uno o ms genes de resistencia a antibiticos, y se elimina elT-DNA no esencial, incluidos los genes que codifican el desarrollo del tumor. Se mantienen los genes necesarios para la infeccin de la clulavegetal por el plsmido. Tambin se ha insertado el T-DNA en el plsmido pBR322 de E.coliy en otros plsmidos para producir vectores declonacin capaces de desplazarse entre bacterias y plantas.

El gen o los genes de inters se empalman en la regin T-DNA entre las repeticiones directas. A continuacin, se devuelve el plsmido aA.tumefaciens, se infectan con la bacteria clulas en cultivo de la planta, y se seleccionan los transformantes en funcin de su resistencia aantibiticos (u otro rasgo codificado por el T-DNA). Finalmente, se generan plantas completas a partir de las clulas del cultivo. Este mecanismoha permitido desarrollar diversas plantas resistentes a herbicidas.

Por desgracia,A.tumefaciensno produce la tumoracin en forma de agallas en plantas monocotiledneas del tipo del maz, el trigo y otrosgranos; slo se ha utilizado para modificar plantas tales como la patata, el tomate, el apio, la lechuga y la alfalfa. Sin embargo, existen datos




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que indican que el T-DNA se transfiere a plantas monocotiledneas y se expresa en ellas, aunque no produce tumores. Este descubrimiento,asociado al desarrollo de nuevos procedimientos de insercin del DNA en clulas vegetales, bien podra conducir a la aplicacin de las tcnicasdel DNA recombinante en numerosas e importantes plantas de cultivo.

Utilizacin del vector plasmdico Ti para producir plantas transgnicas. A la izquierda, formacin de un vector declonacin y su utilizacin en la transformacin. A la derecha, una planta del tabaco, Nicotiana tabacum,convertida en bioluminiscente mediante transfeccin con un vector plasmdico Ti especial que contiene el genque codifica la luciferasa de la lucirnaga. Cuando se riega la planta con una solucin de luciferina, el sustratode la enzima luciferasa, la planta emite luz.

Clulas de mamfero.Las clulas de mamfero pueden incorporar DNA por distintos mtodos, como:

Electroporacin.Si se mezcla un conjunto de clulas con una preparacin de DNA y a continuacin se las expone brevemente a pulsos (de aproximadamente250 a 4.000 V/cm para las clulas de mamfero), las clulas captan el DNA a travs de poros temporales creados en su membranaplasmtica. Algunas de estas clulas sufrirn el proceso de transformacin.

Coprecipitacin con fosfato clcico y endocitosis.

Microproyectiles.Una de las tcnicas ms eficaces consiste en disparar microproyectiles revestidos con DNA al interior de clulas vegetales y animales. Lapistola de genes, desarrollada inicialmente en la Universidad de Cornell (Nueva York), opera de forma similar a una pistola. Una rfaga deaire comprimido dispara al interior de las clulas una salva de microproyectiles metlicos revestidos de DNA. Este dispositivo se ha utilizadopara transformar maz y producir plantas de maz frtil que contienen genes forneos. Otras pistolas utilizan descargas elctricas o gas aalta presin para propulsar los proyectiles revestidos de DNA. Estas pistolas se han utilizado para transformar microorganismos (levaduras,el mohoAspergillusy el alga Chlamydomonas), clulas de mamfero y diversas clulas vegetales (maz, algodn, tabaco, cebolla y chopo).

Encapsulacin del DNA en membranas artificia les (liposomas) seguido de su fusin con membranas celulares.

Retrovirus.Los virus se utilizan cada vez con mayor frecuencia para insertar los genes deseados en clulas eucariotas. Por ejemplo, pueden insertarsegenes en un retrovirus, que a continuacin infecta la clula diana e integra una copia de DNA de su genoma RNA en el cromosoma de laclula husped. Los adenovirus tambin pueden transferir genes a clulas animales. Los baculovirus recombinantes infectan las clulas de

insectos y promueven la produccin de numerosas protenas.




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Clonacin de clulas de mamfero con vectores retrovricos.

Generalmente, el DNA introducido en una clula de mamfero por cualquiera de estos mtodos se integra en el genoma del husped. Losmtodos de transferencia de DNA se han utilizado para: transferir genes a vulos fecundados, produciendo as animales transgnicos; parainvestigar los aspectos moleculares de la expresin gnica; y para replicar los genes clonados utilizando clulas de mamfero como huspedes.

Los YAC pueden utilizarse para incrementar enormemente la eficiencia de la transferencia de genes a la lnea germinal de ratn. Latransferencia de genes depende de la introduccin de secuencias de DNA en el ncleo de una clula de ratn adecuada, como una clula huevofecundada o una clula madre embrionaria, seguido de la integracin del DNA en un sitio del cromosoma.

Experimentos iniciales de transgnesis en ratn no funcionaron debido a la longitud relativamente corta de DNA que puede introducirseutilizando vectores de clonacin plasmdicos. En muchos casos, los genes de mamfero eran ms largos que la capacidad de clonacin delvector, y en otros casos, en los que se pudo transferir el gen, no se produjo su expresin o sta era inadecuada debido a que no se haban

transferido las secuencias reguladoras adyacentes o distantes.Los YAC pueden transferirse a ratn de diversas maneras. La primera implica la microinyeccin de DNA de YAC purificado en el proncleo de unzigoto de ratn.

Los zigotos se transfieren entonces al tero de madres adoptivas para que se desarrollen normalmente. Otras tcnicas utilizan clulas madresembrionarias de ratn (clulas ES, del ingls embrionic stem cell) como huspedes. Uno de estos mtodos fusiona una clula de levadura quecontiene un YAC con una clula ES, transfirindose el YAC a la clula ES, junto con todo o una parte del genoma de levadura. Las clulas EStransgnicas se transfieren entonces a embriones de ratn en el estadio de blastocisto, donde participaran en la formacin de los tejidos deladulto, incluyendo los que formarn la lnea germinal. La capacidad de transferir segmentos largos de DNA a ratones tiene aplicaciones enmuchas reas de investigacin.

Se han desarrollado vectores para la transferencia de genes funcionales a clulas de mamfero utilizando retrovirus de ave y de ratn. Elgenoma de estos retrovirus es un RNA de cadena sencilla que, mediante la retrotranscriptasa, se transcribe en un DNA de doble cadena. EsteDNA se integra en el genoma del husped y pasa a las clulas hija como parte de su propio cromosoma. El genoma del retrovirus debedisearse para eliminar algunos genes vricos, creando vectores que aceptan DNA exgeno, incluyendo genes estructurales humanos. Estosvectores se estn utilizando en el tratamiento de enfermedades genticas mediante terapia gnica.

El desarrollo de las tcnicas para producir millones de copias de segmentos de DNA por clonacin ha abierto el camino a investigaciones sobrela estructura y la funcin del DNA en vegetales y en animales. Tambin ha conducido al aislamiento de genes especficos de organismos,incluyendo la especie humana; a la generacin de diversas aplicaciones cientficas y comerciales que han revolucionado las ciencias de la vida,la medicina y la biotecnologa; y al esfuerzo internacional para analizar el genoma humano a nivel nucleotdico, conocido como el ProyectoGenoma Humano.




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Aplicaciones de la tecnologa del DNA recombinante.La ingeniera gentica y la biotecnologa estn contribuyendo y contribuirn an mucho ms en el futuro a la medicina, la industria y laagricultura, adems de al campo de la investigacin bsica.

Aplicaciones en investigacin y medicina.Es evidente que la produccin de protenas de utilidad mdica como la somatostatina, la insulina, la hormona del crecimiento humana y losinterferones, es de gran importancia prctica. Por ejemplo, en el pasado, la hormona del crecimiento humana para el tratamiento del enanismohipofisario se extraa de hipfisis obtenidas durante las autopsias y estaba disponible slo en cantidades limitadas. La interleucina-2 (una

protena que ayuda a regular la respuesta inmunitaria) y el factor VIII de la coagulacin se han clonado con xito, y sin duda en el futuro seproducirn otros importantes pptidos y protenas. Un avance especialmente interesante es el uso de maz y soja transgnicos para produciranticuerpos monoclonales para uso mdico. Tambin puede ser posible utilizar plantas desarrolladas mediante ingeniera gentica para producirvacunas orales.

Algunos pptidos y protenas humanas sinte tizadas medinteingeniera gentica.

Pptido o protena Uso potencial

1-antitripsina Tratamiento del enfisema-, -, -interferones Agentes antivirales, antitumorales

y antiinflamatoriosFactor VIII de la coagulacin Tratamiento de la hemofiliaCalcitonina Tratamiento de la osteomalaciaFactor de crecimiento epidrmico Tratamiento de las heridasEritropoyetina Tratamiento de la anemiaHormona del crecimiento Promocin del crecimientoInsulina Tratamiento de la diabetesInterleucinas 1, 2 y 3 Tratamiento de trastornos

inmunitarios y tumoresFactor estimulante de colonias de

macrfagosTratamiento contra el cncer

Relaxina Auxiliar al parto Albmina srica Suplemento del plasmaSomatostatina Tratamiento de la acromegaliaEstreptoquinasa Anticoagulante Activador del plasmingeno tisular AnticoagulanteFactor de necrosis tumoral Tratamiento contra el cncer

Los ratones manipulados mediante ingeniera gentica pueden producir anticuerpos monoclonales humanos. Tambin se estn desarrollandovacunas sintticas (por ejemplo, vacunas contra el paludismo y la rabia) mediante tcnicas recombinantes. Ya se encuentra disponible tambinuna vacuna recombinante contra la hepatitis B.

Podra estudiarse cualquier individuo para detectar la presencia de genes mutantes con sondas y tcnicas de hibri

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Tecnologia Del ADN ante