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20 - Introdução
Este trabalho, de revisão bibliográfica, trata do tema Células Estaminais do Sangue do
Cordão Umbilical, na tentativa de elucidação do que são e, qual a sua importância ao
nível da investigação no futuro da medicina.
Em primeiro, pretende-se conhecer os benefícios destas células, o que possibilitou a
pesquisa sobre este tema e o aprofundamento da parte teórica, seguindo a ordem;
1. O que são?
2. Que tipo de células estamianais existem?
3. Que propriedades as fazem únicas?
4. Que potencialidades terapêuticas existem na sua aplicação médica?
5. Que processos são usados para as extrair?
6. Que doenças se podem tratar com o uso de células estamianais?
7. Que futuros terá a medicina com os avanços na área das células estamianais?
8. Que doenças se poderão tratar futuramente e porquê?
Posteriormente, estudou-se as abordagens que existem sobre a investigação de células
estaminais, ou seja, o ponto de vista em relação aos diversos campos de aplicação
nomeadamente;
9. Medicina Regenerativa;
10.Clonagem terapêutica;
11.Criopreservação.
Em conclusão, tentará este trabalho, rever a mais recente investigação nesta área
científica de franca ascensão, no que concerne às patologias que até hoje são
reconhecidamente de mau prognóstico e até mesmo incuráveis.
103
21 - Métodos
O presente trabalho, realizado no âmbito do Mestrado em Análises Clínicas, da
Faculdade de Farmácia de Lisboa, cujo tema é “Células Estaminais do Sangue do
Cordão Umbilical”, teve como objectivo principal a realização de uma revisão
bibliográfica dos conhecimentos científicos mais recentes nesta área.
Durante o processo de pesquisa e selecção da informação, foram seleccionados e
analisados múltiplos artigos publicados em distintas revistas da área, em compêndios
científicos, valorizando-se as publicações mais recentes, bem como a filtragem de
informação disponibilizada por sítios da internet, tanto em laboratórios de investigação
internacionais de Hematologia, como em empresas especializadas na área da
criopreservação das células estaminais.
Recorreu-se, concomitantemente, a diferentes bases de dados, disponíveis em
bibliotecas e na própria internet, nomeadamente: Pubmed e Medline.
Alguns artigos, foram analisados pela sua actualidade e, por eles próprios serem artigos
de revisão citados.
No desenvolvimento deste trabalho, o recurso aos meios informáticos, balizaram-se
palavras-chave, nomeadamente: “umbilical cord blood”, “stem cell”, “bone marrow”,
“cryopreservation”, “transplant”, “regenerative medicine”, bem como a conjugação
destas.
Da análise e selecção de artigos valorizou-se os publicados em revistas e jornais
conceituados como Blood, Bone Marrow Transplantation, Biology of Blood and
Marrow Transplantation e New England Journal of Medicine.
Procurou-se seleccionar informação fidedigna, científica e actualizada de forma a
realizar um trabalho credível.
104
22 - Células Estaminais
Células estaminais (CE) são, por definição, células com capacidade de auto-renovação e
proliferação, tendo a capacidade de se diferenciarem indefinidamente em múltiplas e
diversas linhagens celulares (figura 18). Desta forma, o seu grande potencial está na
origem, por processos de divisão simétrica, de populações celulares idênticas, contudo,
sob determinadas condições, a sua diferenciação possibilita o aparecimento de
diferentes tipos de células (por divisão assimétrica), as quais adquirem propriedades
(expressão génica e fenotípica) e características do tecido a que dão origem, sofrendo
uma redução da sua capacidade de proliferação [1].
Figura 18 – Propriedades das Células Estaminais.
De acordo com a sua origem, as CE dividem-se em dois grupos principais: células
estaminais embrionárias e células estaminais adultas [2]. As CE embrionárias
pluripotentes provêm da massa celular interna (MCI) do blastocisto podendo dar origem
a qualquer tipo de célula humana, com excepção dos tecidos extra-embrionários (figura
19) [3]. Apesar do seu elevado potencial, existem obstáculos de natureza técnica e
questões éticas e morais que limitam a utilização clínica das CE embrionárias [1].
105
Figura 19 - Células estaminais pluripotentes, isoladas da MCI do blastocisto
As CE não embrionárias ou CE adultas, encontram-se em muitos tecidos do organismo
adulto sendo, regra geral, multipotentes [4]. Estas células têm sido isoladas dos mais
diversos tecidos, como é o caso da medula óssea (MO), (figura 20) do sangue periférico,
da pele, do epitélio intestinal, do fígado, do cérebro, dos músculos, do tecido adiposo,
do bolbo dentário e do pâncreas [5]. São células imaturas que, para além de
contribuírem para a homeostase tecidular, também promovem a regeneração e a
recuperação em situações de stresse ou trauma [6].
Figura 20 - Células estaminais adultas isoladas da medula óssea.
Blastocisto
100-200 Células
Músculo Cardiaco
Sangue
Células Neuronais
Medula Óssea
Células Pancreáticas
Células Estaminais Pluripotentes
Massa Celular Interna
Célula Adiposa
Cérebro
Músculo Cardiaco Neurónios
Célula Epitelial
Vasos sanguineos
Celulas Estaminais do SNC
Figado
Medula Óssea
Musculo Esqueletico
Osso
Celula Mesenquimal
106
Existem CE ou células tronco em tecidos neo-natais, tais como o sangue do cordão
umbilical (SCU), a matriz do mesmo ou a placenta. Estas incluem-se no grupo das CE
adultas, uma vez que podem ser obtidas após o nascimento do indivíduo. No entanto,
alguns autores defendem que devia ser atribuído um grupo próprio para este tipo de
células, já que reúnem características intermédias, que não permitem classificá-las
inequivocamente, nem como adultas, nem como embrionárias devido ao seu elevado
potencial proliferativo e características pluripotentes. De entre as fontes neo-natais, a
melhor caracterizada é o SCU, a partir do qual é possível isolar várias populações de CE
[6].
Designam-se por células estaminais embrionárias totipotentes as células resultantes das
primeiras divisões celulares (figura 21). Após a formação do zigoto estas células são
capazes de se diferenciar em qualquer tecido do organismo humano possuindo um
grande poder de multiplicação e especialização podendo formar todos os tecidos
incluindo a placenta e os anexos embrionários [7] [8]. Estas constituem o primeiro
grupo até às 16 - 32 células, e são formadas aproximadamente nas primeiras 72 horas
após a fecundação do óvulo, não sendo possível identificar neste grupo de células
qualquer diferenciação de tecido específico [9]. A formação da placenta e dos anexos
embrionários ocorre somente quando as células totipotentes são implantadas no útero
[10].
Figura 21 – Células estaminais embrionárias totipotentes resultantes das primeiras
divisões celulares.
Aproximadamente quatro dias após a fertilização as células totipotentes começam a
especializar-se e formam o blas
podem ser distinguidas; A massa celular externa (MCE) e a massa celular interna
[9]. A MCE, também conhecida como trofoblasto, dá origem à placenta
embrionários como a bolsa amniótica
necessários para o desenvolvimento do feto no útero [7
por embrioblasto encontram-
retêm a capacidade de originar células
germinativas; endoderme (que origina o
outros), mesoderme (que origina os
ectoderme (que origina os tecidos da epiderme e
do blastocisto constituída por aproximadamente 32 a
formação do embrião propriamente dito, ou seja, de todos os tecidos e órgãos humanos
[7]. Embora as células presentes na MCI
todos os tipos de células encontrada
organismo, pois são incapazes
facto de o seu potencial não ser total, tais células não são totipotentes
implantarmos apenas as células da MCI no útero, est
um novo embrião [7] [10].
Figura 22 - Células estaminais
maioria dos tecidos.
Aproximadamente quatro dias após a fertilização as células totipotentes começam a
se e formam o blastocisto, ao atingir este estadio duas populações
podem ser distinguidas; A massa celular externa (MCE) e a massa celular interna
, também conhecida como trofoblasto, dá origem à placenta e aos
a bolsa amniótica e, o córion entre outros componentes da pl
envolvimento do feto no útero [7]. Na MCI também designada
-se as células estaminais embrionárias pluripotentes
retêm a capacidade de originar células capazes de se diferenciar nas diferentes lin
(que origina o tracto gastrointestinal e, os pulmões
), mesoderme (que origina os músculos, ossos e, sangue, entre outros) e
origina os tecidos da epiderme e sistema nervoso) (figura 22
constituída por aproximadamente 32 a 64 células é a respons
formação do embrião propriamente dito, ou seja, de todos os tecidos e órgãos humanos
a as células presentes na MCI do blastocisto possuam a capacidade de formar
encontradas no corpo humano, sozinhas não podem
es de originar a placenta e os anexos embrionários.
seu potencial não ser total, tais células não são totipotentes, d
enas as células da MCI no útero, estas não são capazes de d
estaminais pluripotentes com capacidade de se diferenciarem
107
Aproximadamente quatro dias após a fertilização as células totipotentes começam a
duas populações celulares
podem ser distinguidas; A massa celular externa (MCE) e a massa celular interna (MCI)
e aos anexos
o córion entre outros componentes da placenta,
Na MCI também designada
células estaminais embrionárias pluripotentes pois
nas diferentes linhagens
pulmões, entre
ntre outros) e
(figura 22). A MCI
é a responsável pela
formação do embrião propriamente dito, ou seja, de todos os tecidos e órgãos humanos
a capacidade de formar
m formar um
acenta e os anexos embrionários. Pelo
, de facto, se
desenvolver
pluripotentes com capacidade de se diferenciarem na
108
Em fases subsequentes do embrião, algumas células passam a estar comprometidas com
uma determinada linhagem celular pertencente a um dos três folhetos embrionários [7].
Estas células somáticas encontradas nos tecidos adultos, passam a ser reconhecidas
como células estaminais multipotentes, pois podem originar qualquer tipo celular
restrito ao folheto embrionário ao qual está comprometido mas num número limitado
(figura 23) [1]. Um exemplo de CE multipotente é a célula estaminal hematopoiética -
que se pode diferenciar em diversos tipos de células do sangue, mas não se pode
diferenciar em células neuronais ou outros tipos de células [8].
Figura 23 - Células estaminais multipotentes que dão origem
a um tipo celular restrito.
Por fim, as células unipotentes, possuem a capacidade de se diferenciarem apenas num
único tecido, ou seja, o tecido a que pertencem. As células mais comuns deste tipo são
as células da pele [11].
Em linhas gerais, podemos dizer que, quanto mais primitiva é a linha de
desenvolvimento embrionário, maior é o potencial de diferenciação de uma célula
estaminal (figura 24) [2] [4].
109
Figura 24 - Ordem decrescente de potencialidade - células estaminais totipotentes,
pluripotentes e multipotentes.
Devido ao seu grau de desenvolvimento e maturação as CE do SCU estão mais
próximas das CE embrionárias/fetais, do que a maioria das CE adultas, pelo que o seu
potencial de diferenciação e proliferação é superior [12] [13].
Actualmente, o SCU é considerado uma fonte promissora de CE na área da medicina
regenerativa, tendo actualmente uma importância clínica reconhecida nos transplantes
hematopoiéticos, para o tratamento de diversas doenças hematológicas benignas e
malignas [14] [15].
110
A capacidade de diferenciação das CE em vários tipos de células, podendo substituir
células lesadas ou destruídas e regenerar tecidos danificados, explica o grande interesse
na utilização destas células no contexto da terapia celular [16]. As HSCs (células
estaminais hematopoiéticas) são aquelas que têm tido maior relevância na prática
clínica, particularmente em doenças nas quais é necessário regenerar o sistema
sanguíneo e imunológico do doente [17]. No indivíduo adulto as HSCs estão
maioritariamente localizadas na medula óssea (MO), (figura 25) e originam todas as
células que constituem o sangue e sistema imunitário, podendo diferenciar-se em
linfócitos (B e T), eritrócitos, plaquetas, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e
macrófagos. O SCU é também uma importante fonte destas células, razão pela qual se
tornou, nos últimos anos, numa alternativa à MO nos transplantes de células HSCs [14].
Figura 25 – Células resultantes da diferenciação da célula estaminal
multipotente hematopoiética.
As CE possuem 2 propriedades que as distinguem das outras células; são células não
especializadas, que se renovam através de divisão celular por longos períodos e, sob
determinadas condições fisiológicas, podem ser induzidas a transformar-se em células
com funções específicas, como por exemplo células produtoras de insulina do pâncreas
[7].
111
O facto de as CE do SCU se poderem diferenciar e constituir diferentes tecidos do
organismo, bem como a sua capacidade de auto-replicação, ou seja gerar cópias
idênticas delas mesmas, possibilitou a investigação para a terapia de muitas doenças,
através da substituição dos tecidos lesionados por estas mesmas células [7].
Em suma, uma célula estaminal é um tipo especial de célula que tem a capacidade
singular de gerar outra célula estaminal ou gerar um tipo de célula especializada [8].
A possibilidade de terapia em patologias diversas de difícil resolução na prática clínica,
como: diabetes mellitus, esclerose múltipla, doença de Parkinson, cardiomiopatias,
patologias hepáticas e distrofias musculares, assim como, numa série de lesões agudas
entre as quais queimaduras, lesões na medula espinhal, acidentes vasculares cerebrais e
enfarto do miocárdio, utilizando uma única fonte de células, era uma realidade
impossível de ser efectuada no passado. No entanto, publicações recentes acerca da
obtenção de CE do SCU e a sua posterior derivação em diferentes tecidos possibilitam
uma nova realidade [18]. Embora na actualidade, a utilização clínica do SCU se
restrinja fundamentalmente a doenças do foro hematológico, as CE isoladas desta fonte
representam uma fonte promissora para o tratamento de várias outras patologias. [19]
Diante do exposto, o referido trabalho tem como principal objectivo explanar a
importância das CE do SCU, as suas funções e implicações nas pesquisas científicas de
forma a recuperar tecidos danificados por várias doenças.
22.1 – Células estaminais do sangue do cordão umbilical Até há cerca de três décadas, o cordão umbilical era considerado como apenas mais um
excedente do parto, no entanto, Knudtzon (1974) descreveu pela primeira vez a
existência de HSCs no SCU [20]. A possibilidade de utilizar CE do SCU nos
transplantes hematopoiéticos, em alternativa à MO, contribuiu para o estudo científico
do SCU como fonte de CE, tendo actualmente uma importância reconhecida [14].
112
Estudos publicados nos últimos anos demonstram que, para além de HSCs, o SCU
contém também uma população de diferentes tipos de células estaminais que vão desde
células mais primitivas com características semelhantes às CE embrionárias a células
mais diferenciadas, tais como CE mesenquimais e células progenitoras endoteliais [5]
[21]. Em consequência desta diversidade, é possível, a partir de uma amostra de SCU,
diferenciar vários tipos de células, tais como;
� Células Estaminais Hematopoiéticas, caracterizadas pelo marcador CD34+,
que dão origem a todos os tipos de células da linhagem sanguínea, sendo as que
se encontram em maior quantidade e possuem, na actualidade, uma importância
clínica reconhecida (figura 26) [5] [21];
Figura 26 – Origem de todos os tipos de células da linhagem sanguínea
através da HSC.
� Células Estaminais Endoteliais, as quais se diferenciam em células endoteliais,
constituintes dos vasos sanguíneos [5] [21];
� Células Estaminais Mesenquimais, com capacidade de diferenciação em
diversas linhagens celulares, tais como células ósseas, cartilagem, células
musculares e células do tecido adiposo; alguns trabalhos sugerem a
113
possibilidade de diferenciar células neurais a partir de células estaminais me-
senquimais (figura 27) [5] [21];
Figura 27 – Células estaminais mesenquimais
� Células USSC (do inglês unrestricted somatic stem cells), também designadas
como células estaminais somáticas não-restritas, alguns autores consideram estas
células pluripotentes como uma população de células estaminais mesenquimais
mais primitiva, uma vez que também se podem diferenciar, em células do tecido
adiposo, células neurais, células ósseas, cartilagem e, ainda, em células
sanguíneas e do músculo cardíaco [5] [21];
� Células estaminais embryonic-like, capazes de dar origem a células
características das três linhas germinativas (ectoderme, mesoderme e
endoderme), podendo-se destacar, respectivamente, as células neurais,
sanguíneas e hepáticas [5] [21].
114
22.2 - Características biológicas das células do sangue do cordão
umbilical
Há mais de 10 anos foram descritos os diferentes compartimentos hematopoiéticos do
SCU humano, observando-se que a concentração de CE no SCU, calculada pelo número
de colónias formadas, é maior que a encontrada na MO. A frequência de CE no SCU (1
a 5 para 1.000 células mononucleares) é também maior que no sangue periférico (SP) de
um indivíduo adulto (1 a 5 em 20.000) [24]. A observação do número de unidades
formadoras de colónias (CFU), obtidas a partir de cultura in vitro com células de SCU,
em meio semi-sólido, sugeriu a possibilidade do SCU ser uma fonte de células
hematopoiéticas usadas para transplante [24].
O número médio de colónias CFU-GM encontradas nas unidades de SCU é de 3,31 ±
0,60 x105 [28] e o percentual de células CD34+, calculado por citometria de fluxo, é
menor no SCU que na MO, 0,92 ± 0,28 versus 1-3% [22].
No entanto, o percentual de células mais primitivas CD34+/CD38- é maior no SCU,
cerca de 16% ± 8,8% do total de células CD34+, comparando ao percentual encontrado
na MO: 4,7%± 3,0% resultando em números totais comparáveis de células
CD34+/CD38- em ambas as fontes de células [22].
Hao & al. (1995), descreveram características funcionais diferentes entre as células
CD34+/CD38- do SCU e da MO; as células originadas do SCU apresentam maior
resposta proliferativa a citocinas e geram cerca de sete vezes mais progenitores
hematopoiéticos em cultura, do que as células CD34+/CD38- da MO [23]. Embora não
haja evidência da existência de células primitivas exclusivas no SCU, que não são
encontradas na medula óssea, alguns estudos evidenciaram características que sugerem
uma maior imaturidade das células progenitoras do SCU, como a presença de telómeros
mais longos e o número e tamanho das colónias hematopoiéticas [24]. Uma
investigação efectuada em murganhos com SCID (imunodeficiência combinada severa),
nos quais se injectaram simultaneamente, células CD34+ provenientes da medula óssea
e de SCU, permitiu observar que o número de células CD34+ de SCU era marcadamente
superior ao de células CD34+ da medula óssea; 100% dos ossos injectados
apresentavam células de SCU e, em apenas 50% dos ossos injectados se encontravam
células de MO [24].
115
Ao analisar a expressão de antigénios de maturação e diferenciação nas células CD34+
do SCU observou-se que a maioria, cerca de 62 a 73%, expressam os marcadores
mielóides, CD13+ e CD33+, enquanto que apenas 10% expressam antigénio linfóide B
(CD19+) [23]. As análises das subpopulações de linfócitos T presentes no SCU são
objecto de estudo frequente, desde o início do uso terapêutico deste material biológico.
As células do SCU apresentam propriedades imunológicas diferentes daquelas
encontradas noutras fontes de CE. Tanto os linfócitos T, como as células Natural-Killer,
isoladas de SCU, apresentam uma função reduzida quando comparada com a das células
do indivíduo adulto, ou seja, a sua actividade citotóxica é menor. Este facto pode estar
relacionado com a menor prevalência de GVHD (doença do enxerto contra o
hospedeiro) nos transplantes que utilizam SCU [25]. A maioria dos linfócitos T do SCU
é CD45RA, enquanto que a maioria dos linfócitos adultos é CD45RO. Esta diferença de
fenótipo das células imaturas do SCU resulta na não produção de interleucina-2 (IL-2)
quando estimulada. As células T do SCU têm menor capacidade de produzir TNF-α
(factor de necrose tumoral α), interleucina 4(IL-4) e interleucina 10 (IL-10). De uma
maneira geral, as células do SCU têm menor capacidade de produzir citocinas que as
células adultas, podendo ser o reflexo da sua imunidade imunológica. Além disto, os
linfócitos T do SCU apresentam menor capacidade de apresentação de antigénios [25].
A actividade lítica das células NK (Natural Killer) do SCU é reduzida, podendo estar
relacionada com a baixa percentagem de linfócitos CD56+ nas unidades de SCU. A alta
proporção de células CD16+/CD56- é um dado que reafirma a imaturidade das células
NK do SCU. Estas apresentam produção diminuída de interferão-y e, portanto, menor
toxicidade. O nível de actividade NK das células do SCU é cerca de 4,6% enquanto que
no sangue do indivíduo adulto é de cerca de 41,7% [26].
A actividade lítica induzida por citocinas (linfokine actived Killer – LAK) é semelhante
entre as células mononucleares de SP e de cordão umbilical. Ensaios utilizando células
LAK obtidas de SCU após estimulação com IL-2 e IL-12, demonstram que estas células
têm capacidade de destruir células malignas de pacientes com leucemia mielóide aguda,
como acontece com as células LAK da MO e do SP estimulado [27].
A proporção de células T supressoras CD8+/CD28- está aumentada no SCU, no entanto,
a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) é satisfatória e semelhante aquela
observada em células sanguíneas adultas. [35].
116
23 - Criopreservação das células estaminais do sangue do
cordão umbilical
A colheita do SCU é um procedimento simples, totalmente indolor e não apresenta
qualquer risco, nem para a mãe nem para o bebé. O sangue deve ser recolhido no
ambiente estéril da sala de parto, imediatamente após o nascimento (natural ou
cesariana) e antes da expulsão da placenta (sem alteração dos procedimentos normais do
parto) [28].
Imediatamente após o nascimento, na última fase do parto, o cordão umbilical é
limitado com duas pinças cirúrgicas o mais perto possível do abdómen do recém-
nascido, uma vez que as CE migram rapidamente nessa direcção (Figura 28).
Figura 28 – Cordão Umbilical Limitado por Pinça Cirúrgica.
O sangue é aspirado por punção na veia umbilical e é armazenado num saco estéril com
anticoagulante CPD - citrato, fosfato e dextrose. Poderá ser necessário picar a veia em
mais do que uma zona de forma a obter o maior volume de sangue possível, em caso de
gémeos o procedimento deverá ser repetido para cada bebé [29]. No fim da recolha, o
saco da amostra é devidamente selado e acondicionado de forma a não sofrer variações
de temperatura, as células devem ser mantidas à temperatura ambiente até serem
processadas e recomenda-se que o processamento seja feito entre as 24H e 48H após a
colheita (figura 29) [30].
117
Figura 29 – Saco estéril com glóbulos vermelhos, leucócitos, plaquetas e células
estaminais resultantes da colheita do SCU.
Ao chegar ao laboratório a amostra é registada e é, então, dado início ao processo de
isolamento e criopreservação das CE, o processamento da amostra reduz o volume de
sangue, obtendo-se fracções de plasma, glóbulos vermelhos e buffy-coat (a parte rica em
células estaminais). Inicialmente é realizado um rigoroso controlo de qualidade,
seguidamente é determinado o volume de sangue colhido, é calculado o número de
células mononucleadas e estaminais hematopoiéticas (CD34+) e é testada a viabilidade
celular. Após o processamento do sangue e o isolamento das células mononucleadas
estas são novamente contadas, tal como as células CD34+ [29].
De seguida, são feitos testes para verificar se a amostra sofreu algum tipo de
contaminação bacteriológica, durante e após a recolha. São realizadas análises,
assegurando, em definitivo, a qualidade do sangue no que diz respeito a eventuais
contaminações por CMV, Sífilis, Hepatite B, Hepatite C e HIV I/II. Estas
determinações analíticas, além de esclarecerem a segurança da amostra, evitam que a
mãe necessite de efectuar novas análises após o parto [31] [32].
As CE ficam armazenadas num saco de 25 ml com dois compartimentos distintos
(figura 30), permitindo que, em caso de necessidade de realização de novos testes, a
unidade não necessite de ser descongelada na sua totalidade. O processo de congelação
é efectuado através de um decréscimo de temperatura controlado, utilizando o agente de
118
criopreservação - dimetilsulfóxido (DMSO) que evita a formação dos cristais de gelo
(que poderiam destruir as estruturas intracelulares de modo irreversível) impedindo,
assim, a destruição das células a temperaturas baixas. [33].
Figura 30 – Saco de armazenamento de células estaminais dividido em 2
compartimentos distintos.
A criopreservação das CE do SCU é realizada em azoto líquido, a uma temperatura de
196ºC negativos, (figura 31) para que toda a actividade biológica das células cesse,
mantendo-as num estado latente e permitindo o armazenamento por um longo período
de tempo [31].
Figura 31 – Criopreservação de células estaminais em azoto líquido.
119
23.1 Bancos de sangue do cordão umbilical - Privados versus Públicos
Desde a realização do primeiro transplante com SCU, em 1988, [34] seguido da sua
ampla utilização em tratamentos de doenças hematológicas benignas e malignas com
resultados satisfatórios, algumas instituições públicas e privadas tomaram a iniciativa de
criar bancos para armazenamento e criopreservação de amostras de SCU para uso futuro
em transplantes alogénicos (sendo o dador uma outra pessoa que não o paciente) ou
autólogos (em que o paciente utiliza as sua próprias células anteriormente
criopreservadas) [35]. Desta forma, o SCU estabeleceu-se como uma excelente fonte de
HSCs, sendo uma opção às células provenientes da MO, e proporcionando o interesse
pela criopreservação das células nele contidas. [36]
Existem dois modelos principais de bancos de SCU: os bancos públicos e os bancos
familiares ou privados [37]. Os bancos de SCU públicos armazenam unidades de SCU
doadas pelos pais – estas unidades passam a estar disponíveis para uso alogénico, por
qualquer pessoa que necessite de um transplante [38] [39] [40].
Os bancos privados armazenam unidades de SCU para uso autólogo ou alogénico no
contexto familiar. As amostras armazenadas são propriedade do dador, não estando
disponíveis para o uso geral na comunidade [31].
O primeiro Banco de Sangue de Cordão Umbilical de carácter público foi fundado pelo
Doutor Pablo Rubinstein em Nova York, em 1992, permitindo o desenvolvimento de
outros bancos públicos em todo o mundo, como por exemplo em Barcelona e
Dusseldorf. Em 2010, com aproximadamente 350.000 unidades de SCU armazenadas
em bancos públicos mundiais, é quase sempre possível encontrar para a maioria dos
doentes, um dador compatível. [41]
Em Portugal, foi inaugurado o primeiro banco público de CE do cordão umbilical, o –
LusoCord, - situado nas instalações do Centro de Histocompatibilidade do Norte [55],
após Despacho publicado em Diário da República n.º 14879/2009 de 2 de Julho de 2009
“A existência de um banco público de células do cordão umbilical permite colocar à
disposição de todos os cidadãos células progenitoras hematopoiéticas necessárias para a
terapêutica de transplantação em determinadas doenças hematológicas, imunológicas ou
120
outras. O banco público aceitará apenas dádivas altruístas, que serão colocadas à
disposição de todos os potenciais receptores (…)”
Os bancos de natureza privada de SCU, comummente associados a centros de
biotecnologia, também foram constituídos com o objectivo de colher e criopreservar
células do cordão umbilical, mas somente para a utilização exclusiva da própria criança,
bem como para o uso familiar [43].
Em 2003, foi criado o primeiro laboratório privado de SCU no nosso País, a
Crioestaminal (figura 32) constituído por um conjunto de profissionais e empresas da
área da saúde, sendo actualmente líder no isolamento e criopreservação de CE do SCU,
com mais de 40.000 unidades criopreservadas [44]. Actualmente, encontram-se
implementados, a nível nacional, cerca de seis laboratórios privados de criopreservação
das CE do SCU.
Figura 32 – Crioestaminal - Primeiro laboratório privado de SCU no nosso País.
“A presente lei estabelece o regime jurídico da qualidade e segurança relativa à dádiva,
colheita (…) preservação, armazenamento (…) e aplicação de tecidos e células de
origem humana (…) O disposto na presente lei é aplicável (…) tecidos e células de
origem humana destinados à utilização em seres humanos, incluindo células estaminais
hematopoiéticas (…) do sangue do cordão umbilical (…)” In Diário da República - Lei
n.º 12/2009 de 26 de Março de 2009.
121
23.2 – Comparação entre bancos públicos e privados do SCU
Em Março de 2008, publicou-se um estudo por Nietfeld no Jornal Biology of Blood and
Marrow Transplantation, no qual se calculava a probabilidade vitalícia (até à idade de
70 anos) de um indivíduo nos Estados Unidos se submeter a um transplante de CE. A
probabilidade de um transplante autólogo usando as suas próprias CE é de 1 em 435,
enquanto a probabilidade de um transplante alogénico de um dador compatível (como
por exemplo um irmão) é de 1 em 400 e a probabilidade exacta de qualquer tipo de
transplante com CE é de 1 em 217 [45].
O National Marrow Donor Program prevê que, por volta de 2015, ocorra, a nível
mundial, 10.000 transplantes de SCU por ano, resultantes de SCU armazenado em
bancos públicos. É pois, de importância vital, aumentar as dádivas de SCU em todo o
mundo [46].
Em Maio de 2006, A World Marrow Donor Association (WMDA) (Associação
Mundial de Dadores de Medula) através da sua Policy Statement for the Utility of
Autologous or Family Cord Blood Unit Storage (Declaração de Princípios para a
Utilidade da Armazenagem de Unidades de Sangue do Cordão, Autólogo ou de
Familiares), estipulava que, o uso de células autólogas de SCU para tratamento da
leucemia infantil é contra-indicado uma vez que as células pré-leucémicas estão
presentes na altura do nascimento. Assim sendo, as células autólogas do SCU são
portadoras das mesmas anomalias genéticas do dador e não devem ser usadas no
tratamento de doenças genéticas [47].
O factor limitante para o uso de células do SCU como fonte de células progenitoras
hematopoiéticas é o número reduzido de células contidas em cada unidade colhida
fazendo com que os bancos do SCU atendam preferencialmente crianças ou doentes
com baixo peso corporal [48]. Por outro lado, a limitação dos bancos privados ou
familiares para transplante autólogo de SCU, relaciona-se com quantidade de células
obtidas num único cordão que poderá servir para o tratamento de doentes que não
excedam 50 quilos [49]. Os bancos públicos, ao contrário dos bancos privados, têm a
possibilidade de utilizar mais do que uma unidade de SCU compatível, devido ao
elevado número disponível de amostras, sem o inconveniente de os mesmos erros
122
congénitos serem novamente transfundidos ao doente. Por outro lado, o transplante
alogénico substitui as células anómalas da MO, permitindo uma nova hematopoiese e
um novo sistema imunitário o que resulta na erradicação de células sobreviventes ao
tratamento antes da transfusão, no caso de doenças malignas [50].
No futuro, a criopreservação do células do SCU no mundo terá tendência para ser
efectuada em bancos públicos, esta evolução já se começa a verificar nos Estados
Unidos, onde se concentra o maior número de unidades em bancos privados [51].
Entendimento similar é enfatizado pela Organização Mundial da Saúde e pelo Conselho
da Europa ao apontarem que o uso do SCU, num contexto autólogo, não é geralmente
recomendado [52] [53].
A importância da criopreservação das CE do SCU é um dado inquestionável, sendo
reforçado pelo próprio Estado Português, ao criar o primeiro Banco Público no nosso
país. No entanto, existem diferenças a salientar entre bancos públicos e privados, entre
as quais [54];
• O direito sobre as CE - nos bancos públicos o dador renúncia aos direitos de
posse das CE, enquanto que nos bancos privados o cliente é o proprietário das
CE e todos os direitos sobre as mesmas são exclusivos;
• A nível financeiro - no banco público o serviço é gratuito, dado estarmos
perante uma doação, enquanto que no banco privado o cliente paga o serviço ao
laboratório de criopreservação;
• O acesso às células - no banco público ficam ao dispor da comunidade, não
ficando ‘reservadas’ para o uso exclusivo do dador, no banco privado os pais
têm a garantia que a amostra está ao seu dispor e só poderá ser utilizada
mediante a autorização destes ou do bebé, quando este atingir a maioridade. Nos
casos de medicina regenerativa é muito vantajoso que os próprios tenham acesso
às suas células;
• O acesso à informação - no banco público, está ao dispor dos bancos
internacionais, no banco privado toda a informação é confidencial;
123
• As oportunidades terapêuticas futuras - no banco público as células poderão
não estar disponíveis, num banco privado as células estarão disponíveis para o
próprio para qualquer terapia;
• Disponibilidade da amostra - a localização de um dador compatível pode
demorar semanas ou meses no caso de bancos públicos, muitas vezes, poderá
não se conseguir localizar uma amostra compatível, no banco privado a amostra
é disponibilizada imediatamente,
• A incidência de GVHD - Num banco público é maior a incidência de GVHD ao
contrário do que ocorre num banco privado, em que o transplante é efectuado
num contexto autólogo, ou seja o dador e receptor são, em geral, aparentados;
• A Compatibilidade - no banco público a compatibilidade varia, podendo ser
difícil obter células compatíveis, especialmente, para as minorias étnicas e casais
com identidade mista. No banco privado o transplante Autólogo é 100%
compatível e, entre irmãos, apresenta 25% de probabilidade de compatibilidade.
24 – Transplante de células estaminais do sangue cordão
umbilical
A obtenção de dadores de HSCs é um desafio global. Mesmo no mundo ocidental, em
que existem mais de nove milhões de dadores registados, cerca de 50% dos doentes que
necessitam de dadores HLA (Human Leukocyte Antigen) compatíveis são incapazes de
o conseguir. Além disto, o tempo entre encontrar um dador compatível e o transplante
propriamente dito pode levar 6 meses ou mais. O transplante de CE do SCU tem
aumentado a disponibilidade de células alogénicas para transplantes em doentes nos
quais a procura de dadores adultos foi negativa ou demorada [57].
Na última década, vários estudos demonstraram o potencial da utilização do SCU como
fonte de HSCs, podendo ser utilizado na reconstituição da hematopoiese, em doentes,
após tratamento com altas doses de radioterapia e quimioterapia. Actualmente, o SCU é
124
uma fonte alternativa de HSCs, sendo utilizado por várias instituições nacionais e
internacionais de transplante como uma modalidade efectiva e de utilização crescente
[57].
Diversos estudos têm demonstrado que o SCU, quando recolhido imediatamente após o
parto, contém CE que permanecem viáveis após criopreservação por um período de pelo
menos 15 anos [58] [45]. Após quimio e radioterapia mieloablativa, o transplante de
HSCs (CD34+) do SCU criopreservadas, pode repor e substituir funcionalmente a
hematopoiese [38].
O primeiro transplante de SCU como fonte de células para reconstituição de medula
óssea ocorreu em 1988, quando uma equipa de cientistas franco-americana em França,
tratou com sucesso uma criança com anemia de Fanconi [60]. Foi utilizada uma amostra
de SCU, previamente recolhida e criopreservada nos EUA, pertencente ao irmão que
apresentava compatibilidade HLA, com o objectivo de reconstituir a função medular
após quimioterapia mieloablativa. Um ano mais tarde, 98% do sistema linfático do
doente era originado a partir de células do dador sem manifestações hematológicas da
patologia [60]. Na altura, ficou demonstrado que o SCU contém HSCs em quantidade
suficiente para a reconstituição hematopoiética e imunológica da medula do doente.
Este procedimento clínico pioneiro veio despertar o interesse (e consequentemente a
investigação) sobre o potencial das CE do SCU no tratamento de diversas doenças. Em
1993, nos EUA, foi efectuado o primeiro transplante de HSCs do cordão umbilical de
um dador não relacionado com o doente. [39]
Em 2007, realizou-se no nosso País, o primeiro transplante com recurso a CE do SCU
criopreservadas num banco privado português. A criança, de 14 meses, após o
diagnóstico de SCID, foi submetida ao transplante de HSCs recorrendo ao SCU do seu
irmão, que os pais tinham criopreservado. A intervenção foi realizada com sucesso no
Instituto Português de Oncologia do Porto, tendo a criança desenvolvido um sistema
imunitário funcional [61].
Decorridos vinte anos após o primeiro transplante com células do SCU, é cada vez
maior o interesse nesta fonte não controversa de CE, tendo sido realizados mais de 20
000 transplantes em todo o mundo, cerca de metade em indivíduos adultos [62] [63]. A
125
grande maioria destes transplantes foi efectuada num contexto alogénico [38]. Neste
contexto, as CE do SCU podem ser utilizadas em diversas doenças tais como anemias,
leucemias, linfomas, tumores sólidos e outras doenças hereditárias ou adquiridas do
sistema sanguíneo ou imunitário. Na tabela 6, encontram-se descritas várias patologias
em que a aplicação do SCU pode resultar numa terapia com sucesso [37] [39] [40].
Num contexto autólogo, as aplicações, embora presentemente em menor número,
abrangem doenças como; a anemia aplástica adquirida e alguns tipos específicos de
tumores sólidos (neuroblastomas e retinoblastomas) [64].
Nas leucemias e linfomas assim como em doenças genéticas e/ou congénitas a
utilização autóloga poderá estar limitada, uma vez que a amostra poderá conter
“clusters” leucémicos ou células anómalas. Contudo, um estudo recente indica que a
eliminação das células patológicas, que possam estar a contaminar a amostra de SCU,
poderá alargar a gama de doenças tratadas num contexto autólogo, tal como tem
ocorrido com a utilização de sangue periférico mobilizado [65]. Um artigo publicado,
em 2007 pelo jornal oficial da Academia Americana Pediátrica, relata um caso clínico
de uma criança diagnosticada com leucemia linfoblástica aguda que recebeu CE do seu
próprio SCU, que haviam sido criopreservadas à nascença. Dois anos após o
transplante, a criança mantém-se saudável e sem recaídas [66].
Tabela 6 - Patologias em que podem ser utilizadas células estaminais do sangue do
cordão umbilical;
Patologias malignas:
o Leucemia linfoblástica aguda;
o Leucemia mielóide aguda;
o Leucemia mielóide crónica;
o Leucemia mielóide crónica juvenil;
o Linfoma de Burkitt;
o Liposarcoma;
o Síndrome Mielodisplásico;
Deficiências Medulares;
o Anemia aplástica;
o Anemia aplástica idiopática;
o Síndrome Schwachman-Diamond;
o Disqueratose congénita;
o Anemia de Fanconi;
o Trombocitopenia megacariocítica;
o Sindroma de Kostmann;
126
o Tumores sólidos (ex. neuroblastoma ou retinoblastoma);
o Doença de Hodgkin;
o Linfoma Não-Hodgkin;
Hemoglobinopatias:
o Talassémia (anemia de Cooley);
o Anemia das células falciformes;
Patologias metabólicas:
o Adrenoleucodistrofia;
o Doença de Batten;
o Doença de Gunther;
o Doença de Krabbe;
o Síndrome de Hunter;
o Síndrome de Hurler;
o Síndrome de Lesch-Nyhan;
o Síndrome de Maroteaux-Lamy;
Imunodeficiências:
o Síndrome de Omenn;
o Deficiencias imunitárias combinadas severas;
o Disgénese reticular;
o Displasia tímica;
o Leucodistrofia celular globóide;
o Síndrome de Wiskott Aldrich;
o Síndrome Linfoproliferativo ligado ao cromossoma X;
Outras doenças:
o Síndrome de Evans;
o Osteopetrose;
o Histiocitose das células de Langerhans;
127
24.1 – Comparação entre transplante de células estaminais do sangue
do cordão umbilical e células estaminais da medula óssea.
O sangue do cordão umbilical é hoje considerado uma fonte viável de HSCs, com uma
eficácia semelhante à das células provenientes da MO, mas com algumas vantagens a
destacar tais como [6] [14] [67];
1. A colheita de sangue do cordão umbilical é não invasiva sem qualquer risco para
a mãe ou para o bebé;
2. Existe menor probabilidade de induzir risco de GVHD aguda e crónica [39];
3. Em transplantes alogénicos não é necessário um nível tão elevado de
compatibilidade para o sucesso do transplante (são aceites 1-3 discrepâncias
HLA) [68] [69];
4. Uma vez que as amostras são criopreservadas a sua disponibilidade é imediata,
possibilitando uma maior acessibilidade e menor tempo de espera aquando do
transplante, (esta vantagem é de 21 a 37 dias, em relação aos dadores de MO)
[70];
5. As amostras podem ser facilmente caracterizadas, criopreservadas e guardadas
durante anos sem que ocorra perda de viabilidade;
6. Menor risco de infecção por vírus latentes como CMV e o vírus Epstein-Barr
(menos de 0,1% dos recém-nascidos saudáveis são positivos para CMV, contra
10%- 60% dos dadores adultos voluntários),
7. São células neonatais e por isso possuem uma ontogenia primitiva não tendo
sido expostas a desafios imunológicos [69];
8. Apresentam maior capacidade de proliferação e expansão. quando comparadas
com as células da MO [70];
9. As células são mais primitivas (em termos imunológicos e de desenvolvimento),
apresentando um potencial proliferativo superior, taxas de divisão mais elevadas
e telómeros maiores [69] [70] [71];
10. As células do SCU não foram sujeitas a agressões, não acumulando por este
motivo lesões ao longo da vida (especialmente ao nível do DNA); uma vez
colhidas e congeladas, as células não sofrerão agressões ambientais como
radiação, agentes químicos e contactos virais, estando assim protegidas e
prontamente disponíveis para o uso;
128
A maior limitação do transplante com células do SCU está relacionada com a
quantidade de células CD34+ existentes na amostra [72]. Apesar da concentração de CE
no SCU ser elevada, o volume de sangue normalmente colhido é inferior ao volume
processado a partir da MO de um adulto, pelo que a quantidade real de células obtidas a
partir do SCU é menor (aproximadamente um log a menos de células progenitoras
hematopoiéticas). Esta limitação pode condicionar o TSCU (transplante de sangue do
cordão umbilical) em adultos, pois o peso do doente determina o número de CE
necessárias para o transplante. Apesar desta limitação, o número de doentes adultos
transplantados com HSCs do SCU tem aumentado consideravelmente [73].
Por outro lado, as baixas doses de CE do SCU estão associadas a um atraso na
reconstituição hematopoética e imunológica em comparação com o transplante de MO,
com um consequente maior período de neutropenia, maior necessidade de suporte
transfusional, e maior duração de hospitalização [74]. A ocorrência de infecções
oportunistas no período de mielossupressão é um dos principais eventos adversos
relacionados com o transplante de HSCs, que influencia o sucesso do transplante e
consequentemente a sobrevida do paciente [75].
Como foi descrito atrás, o número de células transplantadas é um dos principais factores
de recuperação e sobrevivência após o transplante [14] [15], pelo que diversas
estratégias (algumas em ensaio clínico) têm sido avaliadas para aumentar o número de
células transplantadas e/ou facilitar a recuperação hematológica e imunológica do
doente, entre as quais se destacam; [62] [76];
1. A transplantação múltipla, que consiste na infusão de várias unidades de SCU;
2. A expansão ex vivo das células CD34+, que poderá ser conseguida através da
aplicação de citocinas, que promovem a sobrevivência e proliferação celulares;
3. A co-transplantação das células do SCU com:
• Células hematopoiéticas do cordão expandidas ex vivo;
• Células CD34+ haploidênticas provenientes, por exemplo, da medula
óssea;
• CE mesenquimais, que desempenham uma função de suporte, fornecendo
um microambiente necessário para a reconstituição hematopoética;
129
4. A aplicação directa das células na MO vs as infusões endovenosas, evitando a
perda de células que poderiam ficar retidas noutros órgãos (como os pulmões e o
fígado).
Ultrapassada a limitação da dose celular, a taxa de sucesso do transplante de SCU é
comparável ou mesmo superior à do transplante de MO [62].
24.2 – Dose celular na unidade de sangue do cordão umbilical
A análise de alguns bancos de SCU revela que, apenas cerca de 25% das unidades
armazenadas contêm células suficientes para a realização de um transplante em
indivíduos acima de 50 kg [48].
No contexto de TSCU, uma colheita bem sucedida possui, em média, 120ml (variação
de 60 a 300ml) e contém entre 0,8 a 3x109 células nucleadas totais (CNT). A colheita da
amostra, o processamento e o descongelamento, geralmente resultam numa perda de
células totais, células CD34+ e CFU, na ordem de 10% a 20% do volume inicialmente
colhido [77]. A maioria dos bancos de SCU processa a unidade colhida para concentrar
a fracção mononuclear e reduzir o volume das unidades, com o objectivo de ampliar a
capacidade de armazenamento das unidades de SCU congeladas. A dose celular
registada geralmente refere-se àquela antes do congelamento, após o processamento
[78].
Para um transplante com sucesso recomenda-se, pelo menos 2x107 CNT por kg do
paciente, sendo que o número de CNT correlaciona-se directamente com a
probabilidade e a velocidade de recuperação. Deste modo, a maioria dos centros de
transplante pediátrico procura como alvo valores mais altos, como 5x107 CNT/kg. Para
adultos, raramente uma única unidade terá mais do que 3x107 CNT/kg [79]. Além da
celularidade, outro factor que parece influenciar a repopulação mais lenta da MO é a
imaturidade das células progenitoras do SCU, que pode necessitar de um número maior
de divisões para se diferenciar [80].
130
O número de CNT é semelhante entre os bancos de SCU para produtos semelhantes.
Entretanto, o número de subpopulações celulares, como as células CD34+, pode variar
muito, em função das variações na remoção de neutrófilos durante o processamento, o
que torna a comparação da quantidade de células CD34+ entre os bancos difícil de
interpretar [77].
Apesar das contagens de células CD34+ e das CFU serem realizadas no momento da
criopreservação, na maioria dos bancos de SCU a contagem de CNT é a mais utilizada
na escolha da unidade, por ser mais facilmente padronizada. Quando disponível, a
contagem de células CD34+ pode ser utilizada para a triagem de unidades provenientes
de crianças portadoras de síndromes de imunodeficiências graves [77].
Para minimizar os riscos de baixa celularidade, os bancos de SCU devem tomar todas as
medidas necessárias para reduzir a perda de células das unidades de SCU. Ao escolher
uma unidade de SCU, deve-se sempre considerar a perda e calcular a dose celular
desejada, considerando-a. Não existe correlação entre o tempo de criopreservação do
SCU e os resultados do transplante. Unidades criopreservadas, há mais de dez anos,
estão a ser usadas com sucesso actualmente [104].
A média de tempo para se atingir a contagem de granulócitos acima de 500/µl é de
cerca de 29 dias para crianças e 32 dias para adultos, conforme o levantamento de 527
transplantes de SCU de dadores não-relacionados. Neste grupo de doentes, o número
médio de células nucleadas infundidas foi de 1,7 x107/ kg, nos receptores adultos e 4,5
x107/kg, nas crianças [81]. A recuperação da contagem plaquetária também é lenta,
ocorrendo por volta de 57 dias após a infusão [81]. Quando se analisa apenas a
população adulta submetida a transplante de SCU não-relacionado, este tempo é ainda
maior, levando cerca de 69 dias para se atingir a contagem de plaquetas acima de
20.000/mm3 [82]. Um número baixo de células nucleadas utilizado no transplante de
SCU está relacionado com um pior prognóstico no pós-transplante, provavelmente
relacionado com a ocorrência de infecções oportunistas [81].
O Eurocord é um registo internacional sediado em Paris, que conta com a participação
de mais de 100 centros médicos de transplante, localizados principalmente na Europa.
No levantamento realizado pela Eurocord, de 102 crianças portadoras de leucemias
131
agudas e tratadas com transplante de células de SCU familiar ou não relacionado, o
factor mais importante que influenciou a recuperação dos neutrófilos, foi a dose de
células nucleadas infundidas maior que 3,7 x 107/kg do receptor. Este mesmo
levantamento confirmou a baixa taxa de incidência de GVHD crónica, cerca de 13% nos
transplantes com dador de SCU relacionado, e 28% dos transplantes com SCU não-
relacionado, quando comparados com os pacientes tratados com transplante de MO não-
relacionados, cuja incidência é de cerca de 50 a 60% [83].
24.3 – Utilização de duplo cordão
Para sobrepor a limitação da dose celular, o uso simultâneo de duas unidades de SCU
tem sido utilizado nos últimos anos com resultados interessantes e encorajadores. A
acção sinérgica das duas unidades permite atingir o número mínimo de células para a
realização do transplante, contudo, poderá gerar uma maior resposta aloimune e maior
efeito de GVHD [84] [15]. Apesar das duas unidades serem usadas concomitantemente,
apenas uma contribui para a hematopoiese. Não foram identificados até o momento, os
factores para determinar qual a unidade que será a "vencedora". Nenhum dos factores
estudados (contagem de CNT, CD34+, CD3+, compatibilidade HLA, viabilidade,
compatibilidade ABO, sexo e ordem de infusão) parece contribuir para o predomínio de
uma unidade sobre a outra [15]. Para se seleccionar as duas unidades, devem-se
respeitar os mesmos critérios de compatibilidade HLA, não sendo permitidas mais que
duas incompatibilidades em HLA-A e -B de baixa resolução e HLA-DRB1 de alta
resolução entre o dador e o receptor e entre as duas unidades de SCU. O duplo TSCU,
entretanto, está associado a maior risco de GVHD aguda e possivelmente GVHD
crónica [85]. A GVHD pode ocorrer até ao dia +100 pós-transplante, sendo os órgãos
mais afectados a pele, fígado e tracto gastrointestinal a tabela 7 mostra os níveis de
graduação das principais manifestações da GVHD aguda. A GVHD crónica é
classificada como limitada e extensa (tabela 8) [115].
Grau Pele Figado Intestino
I Exantema Maculopapular <25%
da superfície corporal.
Bilirrubina entre 2-3
mg/dl
Diarreia 500 –
1000ml/dia
132
Tabela 7 – Manifestações clínicas da GVHD aguda
Tabela 8 – Manifestações clínicas da GVHD Crónica
25 – O potencial do sangue do cordão umbilical em medicina
regenerativa
A possibilidade de aplicação do SCU em doenças não hematológicas tem suscitado
bastante interesse na comunidade científica. Este interesse deve-se principalmente à
II Exantema Maculopapular entre
25-50% da superfície corporal.
Bilirrubina entre 3-6
mg/dl
Diarreia 500 –
1000ml/dia
III Eritroderma Generalizado. Bilirrubina entre 3-6
mg/dia
Diarreia > 1500
ml/dia
IV Descamação e bolhas. Bilirrubina superior
a 15 mg/dl
Dor intensa – Ílio
paralítico
GVHD Crónica limitada
Um ou ambos os critérios;
1- Envolvimento da pele localizado
2- Disfunção hepática devido a GVHD crónica
GVHD Crónica extensa
1- Envolvimento generalizado da pele ou
2- Envolvimento localizado e/ou disfunção hepática devido à GVHD crónica
Mais
3- A) Histologia hepática mostrando hepatite crónica, com necrose e cirrose ou,
B) Envolvimento ocular ou
C) Envolvimento das glândulas salivares ou mucosa oral demonstrado em
biópsia ou
D) Envolvimento de outros órgãos alvo
133
identificação, no SCU, de diversas populações de CE, algumas das quais com uma
elevada plasticidade e apresentando características muito semelhantes às CE
embrionárias. No entanto, ao contrário das CE existentes nos tecidos embrionários ou
fetais, a utilização clínica das CE do SCU (consideradas células adultas) não levanta
quaisquer questões éticas ou morais.
A medicina regenerativa é uma área da ciência que aplica princípios da biologia celular
e de engenharia para a reparação e/ou substituição de tecidos ou órgãos que perderam as
suas funções devido ao envelhecimento, doença, lesões ou defeitos congénitos. A
terapia com CE do SCU constitui um campo promissor e de rápido desenvolvimento na
medicina regenerativa, podendo vir a ser muito útil no tratamento de patologias que,
hoje em dia, ainda não têm tratamento eficaz [86].
Embora no presente a aplicação das CE do SCU se restrinja fundamentalmente a
doenças hematológicas benignas e malignas, experiências em modelos animais sugerem
que, no futuro, a gama de aplicações na terapia celular com estas células poderá alargar-
se a doenças de foro não hematológico ou imunológico, como doenças
neurodegenerativas, diabetes, disfunções hepáticas e lesões vasculares [87]. Em 2002,
foi isolada uma subpopulação de CE mesenquimais pluripotentes da medula óssea, ou
seja, CE capazes de se diferenciar em diferentes tipos celulares do organismo adulto,
desde hepatócitos a neurónios [88]. CE mesenquimais com propriedades similares
foram recentemente identificadas no SCU [89]. As CE do SCU podem deste modo
transformar-se não só em células do sistema hematopoiético, mas igualmente em células
de outras linhagens celulares, como células neuronais [89] células do fígado, [89] [87]
[90] células ósseas, células adiposas, [91] ou células endoteliais [92]. Em seguida
descrevem-se alguns dos avanços mais relevantes.
25.1 – No tratamento de patologias cardiovasculares / vasculares
As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte e incapacidade,
sobretudo ao nível dos países mais desenvolvidos, constituindo um dos grandes desafios
da medicina actual. As CE do SCU são uma fonte interessante para a terapia celular no
134
contexto cardiovascular, dado o seu potencial cardiomiogénico. Diversos trabalhos têm
demonstrado que, em modelos animais, as células do SCU contribuem para a
angiogénese, melhorando a função cardíaca [93].
Um estudo realizado, demonstrou a facilitação de neovascularização em murganhos
com SCID que receberam infusões de células CD133+ do SCU, após ligação da artéria
coronária descendente anterior [94]. Num estudo semelhante, uma equipa de
investigadores demonstrou a diferenciação de células CD133+ no SCU em células
semelhantes a cardiomiócitos, existentes em culturas paralelas, procedendo à injecção
destas mesmas células no miocárdio de murganhos. Apesar de as células serem
alogénicas, não foram verificados eventos de rejeição nestes animais [95]. A
diferenciação in vitro de células de SCU em cardiomiócitos também foi reportada por
outros autores, demonstrando a sua capacidade de diferenciação e seu potencial no
tratamento das DCV (doenças cardiovasculares). A terapia combinada de injecção de
células do SCU com o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) promoveu a
neoangiogénese nas regiões isquémicas, porém sem efeitos na melhoria da função
ventricular [96]. Utilizando o mesmo modelo de injecção de células de SCU combinada
ao FGF, um estudo na mesma linha que o anterior demonstrou uma melhoria da função
do ventrículo esquerdo e ausência de rejeição após o transplante de SCU humano em
camundongos [94]. Resultados similares foram obtidos com a injecção de células
CD34+ de SCU em camundongos com EAM (enfarte agudo do miocárdio),
demonstrando o grande potencial angiogénico das CE do SCU, sendo observada uma
melhoria do desempenho cardíaco [97].
Embora existam diversos estudos pré-clínicos da aplicação de CE do SCU no
tratamento das DCV, poucos são os relatos da sua prática clínica. No entanto, num
estudo realizado em 2008, num doente com cardiomiopatia dilatada que recebeu CE do
SCU, observou-se uma melhoria da fracção de ejecção de 30% para 55% e diminuição
da insuficiência cardíaca [98].
Um dos parâmetros que tem sido estudado é o modo de administração das CE. A
aplicação destas células pode ser feita através da infusão directa na zona lesada
(miocárdio), (figura 33) na circulação sanguínea ou nas coronárias. Geralmente, ocorre
migração selectiva das CE para o tecido danificado, observando-se um aumento da
densidade de capilares no local, diminuição da área do enfarte e melhoria da função
cardíaca, mesmo na ausência de miogénese [99].
Figura 33 – Aplicação das células do SCU directamente na zona lesada do miocárdio
Apesar dos mecanismos da
conhecidos, várias hipóteses têm sido levantadas: 1) há quem defenda que as CE do
SCU se diferenciam em cardiomiócitos, no entanto, por si só, esta diferencia
seria suficiente para a recuperação da função cardíaca [100]; 2) outros estudos
evidenciam que o principal mecanismo de recuperação resulta da produção de factores
de crescimento angiogénicos, devido à hipó
como in vitro a formação de novos vasos sanguíneos, bem como a migração de CE
endógenas do próprio coração; 3) um outro fenómeno, que também poderá contribuir
para a recuperação cardíaca, é a capacidade de
conseguida através do controlo da expres
resposta inflamatória [101].
25.2 – No tratamento de patologias do sistema nervoso central
As agressões que atingem o SN
perinatal ou pós-natal. No período
cérebro fetal, podem ocorrer doenças genéticas (
cal, diminuição da área do enfarte e melhoria da função
a de miogénese [99].
Aplicação das células do SCU directamente na zona lesada do miocárdio
Apesar dos mecanismos da regeneração cardíaca não serem ainda totalmente
conhecidos, várias hipóteses têm sido levantadas: 1) há quem defenda que as CE do
SCU se diferenciam em cardiomiócitos, no entanto, por si só, esta diferencia
para a recuperação da função cardíaca [100]; 2) outros estudos
pal mecanismo de recuperação resulta da produção de factores
de crescimento angiogénicos, devido à hipóxia tecidular, observando-se tanto
ção de novos vasos sanguíneos, bem como a migração de CE
endógenas do próprio coração; 3) um outro fenómeno, que também poderá contribuir
para a recuperação cardíaca, é a capacidade de modelação da inflamação, que é
conseguida através do controlo da expressão de moléculas pertencentes à cadeia da
No tratamento de patologias do sistema nervoso central
As agressões que atingem o SN (sistema nervoso) podem ocorrer no período pré
natal. No período pré-natal e perinatal, durante o desenvolvimento do
odem ocorrer doenças genéticas (como erros inatos do metabolismo),
135
cal, diminuição da área do enfarte e melhoria da função
Aplicação das células do SCU directamente na zona lesada do miocárdio.
regeneração cardíaca não serem ainda totalmente
conhecidos, várias hipóteses têm sido levantadas: 1) há quem defenda que as CE do
SCU se diferenciam em cardiomiócitos, no entanto, por si só, esta diferenciação não
para a recuperação da função cardíaca [100]; 2) outros estudos
pal mecanismo de recuperação resulta da produção de factores
se tanto in vivo
ção de novos vasos sanguíneos, bem como a migração de CE
endógenas do próprio coração; 3) um outro fenómeno, que também poderá contribuir
modelação da inflamação, que é
são de moléculas pertencentes à cadeia da
podem ocorrer no período pré-natal,
natal e perinatal, durante o desenvolvimento do
mo erros inatos do metabolismo),
136
agressões ambientais (como infecções por CMV, toxoplasmose, entre outros), acidentes
vasculares cerebrais e encefalopatia isquémica pós-anóxica. Na vida pós-natal poderá
ocorrer traumatismo crânio-encefálico, trauma raquimedular, meningoencefalites,
epilepsias do lobo temporal, acidente vascular cerebral isquémico, ou hemorrágico,
doenças auto-imunes, (esclerose múltipla) e doenças degenerativas como a doença de
Parkinson, Coréia de Huntington, Esclerose Lateral Amiotrófica e Alzheimer. A
capacidade de regeneração do SNC (sistema nervoso central) é bastante reduzida, pelo
que a terapia com CE exógenas poderá ter um papel importante na regeneração neural,
contribuindo para a recuperação funcional dos doentes [102].
Através de marcadores específicos, vários estudos mostraram ser possível diferenciar in
vitro células do SCU em neurónios e oligodendrócitos funcionais. Esta capacidade que
as células do SCU possuem para se diferenciarem em vários tipos de células neurais
parece ser um dos factores chave para a regeneração das lesões da medula espinal em
murganhos [102]. Em estudos realizados em animais relativamente a doença de
Parkinson, de Alzheimer e de Huntington, verificou-se que a infusão endovenosa de CE
do SCU parece retardar a progressão da doença, bem como aparecimento dos sintomas,
com prolongamento da sobrevida [103]. Da mesma forma, a administração endovenosa
de SCU em murganhos com acidente vascular cerebral (AVC) induz angiogénese no
tecido isquémico, contribuindo para a neurogénese, bem como para a redução da área
afectada e consequente recuperação dos défices físicos e comportamentais associados à
doença. Os efeitos observados parecem ser dependentes tanto da via de administração
(intravenosa ou intraperitoneal), como da dose celular [103] (figura 34).
Figura 34 – Aplicação de células do SCU numa região saudável do cérebro, muito
próxima do local deteriorado em consequência de um AVC.
137
O objectivo é que estas libertem químicos que estimulem novas células cerebrais e que
permitam aos vasos sanguíneos se desenvolverem, enquanto o tecido começa a
regenerar e a reduzir a inflamação.
Em modelos animais demonstrou-se que, após a infusão de células do SCU, as CE
transplantadas migram para a zona da lesão, permitindo a regeneração dos axónios e a
recuperação da função motora [102]. Relativamente a estudos em doentes, foi publicado
o caso de uma paciente paraplégica de 37 anos que, após transplante com células do
SCU, apresentou uma recuperação parcial da percepção sensorial e da mobilidade nos
membros inferiores [104].
Em modelos pré-clínicos de isquémia cerebral, observou-se que a injúria cerebral
estimula a migração de células do SCU para o local da lesão. O uso de CE (CD34+), 48
horas após o AVC, desencadeou um aumento da vascularização cerebral local. Apesar
da administração das células de SCU, 24 horas após o AVC ter sido eficaz, o tempo
óptimo para a sua utilização após o acidente não foi estabelecido. À semelhança do que
se passa com o tecido cardíaco, ainda são desconhecidos os mecanismos moleculares
responsáveis pela regeneração neural após o transplante de células, mas a redução da
inflamação, a protecção contra a apoptose, a neovascularização, a migração de células
progenitoras neurais endógenas e a reorganização da fibra nervosa parecem contribuir
para tal [101].
Recentemente foi iniciado um outro ensaio clínico com o objectivo de avaliar a
segurança e eficácia da infusão autóloga das células do cordão umbilical de recém-
nascidos com encefalopatia isquémica neonatal. Para além deste ensaio, que se encontra
a recrutar doentes, nos últimos três anos foram usadas várias amostras criopreservadas
de bancos privados para a utilização autóloga em crianças com paralisia cerebral e outro
tipo de lesões cerebrais. As amostras têm sido solicitadas pela Duke University, do
estado da Carolina do Norte. Há relatos de melhorias significativas nalguns doentes no
período pós-infusão, não estando ainda publicados os resultados [99].
138
25.3 – No tratamento da Diabetes Mellitus
Uma das patologias para a qual está a ser avaliada a utilização das células do SCU, já
em humanos, é a diabetes tipo 1 (figura 35). O objectivo do ensaio clínico em curso, a
decorrer desde 2005, é estudar o potencial do TSCU autólogo para minimizar o ataque
auto-imune do organismo e restaurar a produção de insulina, indispensável no controle
dos níveis de glucose no sangue. Este ensaio tem por objectivo avaliar a hipótese
terapêutica de que as células do SCU poderão induzir uma tolerância imunológica,
impedindo a destruição das células β-pancreáticas, com a consequente produção de
insulina [105]. Foram examinadas 20 crianças com diabetes tipo I, de idades
compreendidas entre os dois e os sete anos. Sete crianças receberam uma infusão
intravenosa de CE isoladas a partir do seu próprio SCU, criopreservado à nascença. As
restantes receberam tratamento normal com insulina. Nas crianças tratadas com SCU
observou-se um aumento das células T reguladoras (células com papel central na
regulação da resposta imune). Adicionalmente, estas crianças apresentavam melhorias
nos níveis de glucose no sangue, necessitando de menores doses diárias de insulina.
Face aos resultados, os investigadores pretendem agora alargar o estudo a mais doentes,
para explorar os benefícios da terapia com células do SCU na diabetes tipo I [105].
Figura 35 – Células do SCU no tratamento da diabetes tipo I
139
Os primeiros dados, apresentados no 67º Congresso da Associação Americana para a
Diabetes, demonstram um decréscimo nos níveis de HbA1c e menor dependência de
insulina diária, sugerindo um efeito benéfico das infusões autólogas de SCU nos
pacientes com diabetes tipo 1. Os autores sugerem ainda que as células do SCU possam
ter uma função de suporte daqueles tecidos ainda viáveis, favorecendo a proliferação
das células pancreáticas endógenas [106].
25.4 - Na terapia génica em doenças hematológicas
O transplante de HSCs é utilizado com sucesso no tratamento de um grande número de
doenças congénitas e adquiridas que envolvem o sistema linfo-hematopoético, contudo
as maiores limitações para aplicação do transplante de CE no tratamento de doenças
genéticas são as complicações imunológicas secundárias ao transplante alogénico,
incluindo a rejeição do enxerto e a necessidade de imunossupressão. Estas limitações
tendem a considerar a terapia génica utilizando o transplante de CE autólogas,
geneticamente corrigidas, para o tratamento destas mesmas patologias. O sucesso da
terapia génica com as HSCs depende da transferência efectiva do gene corrigido para as
CE pluripotentes, da expressão génica apropriada em células hematopoéticas e linfóides
maduras e da ausência de efeitos adversos na função destas células. As CE do SCU
possuem características especialmente importantes para a terapia génica, pois, por serem
mais jovens e com um potencial proliferativo maior, a repopulação medular por estas
células pode ser mais duradoura, oferecendo a expressão do novo gene para toda a vida
do doente. Existem evidências experimentais de que vectores retrovirais podem ser
utilizados para transferência de genes para CE do SCU [107].
Existem poucos estudos clínicos utilizando CE do SCU em terapia génica. Um estudo
realizado em 1995, relatou o tratamento com CE autólogas derivadas de SCU em três
recém-nascidos portadores de deficiência de adenosina desaminase (ADA). As células
CD34+ foram transfectadas com DNA complementar contendo o gene normal da ADA e
transplantadas num esquema não mieloablativo. Foi observada a presença destas células
e a expressão continuada do gene introduzido nos leucócitos da medula e do sangue
periférico até 18 meses após o transplante. Este resultado indica que as CE do SCU
podem ser modificadas geneticamente e transplantadas em recém-nascidos [108].
140
Por outro lado, a falta de disponibilidade de sangue para transfusões continua a ser um
problema crónico nos hospitais, dado que a procura é superior à oferta existente nos
bancos de sangue. De forma a colmatar esta situação, diversos investigadores têm
procurado encontrar uma solução para este problema, através da produção in vitro de
componentes sanguíneos e sangue artificial. Giarratana et al (2005) descreveram um
protocolo laboratorial em 3 passos que permitiu a expansão das HSCs do SCU por um
factor de 2 milhões, e a diferenciação completa destas células em glóbulos vermelhos. A
aplicação deste protocolo em larga escala poderá permitir que uma unidade de SCU
origine cerca de 4-10 triliões de glóbulos vermelhos adultos, equivalentes a 2-4
unidades de concentrados de eritrócitos [109].
25.5 - No tratamento de erros inatos do metabolismo
Os erros inatos do metabolismo constituem um grupo heterogéneo de doenças genéticas
raras que causam deficiência em várias enzimas e resultam na acumulação tecidular de
metabolitos. Por mais de duas décadas, o transplante de HSCs mostrou-se benéfico no
tratamento da síndrome de Hurler, adrenoleucodistrofia, leucodistrofia metacromática e
doença de Krabbe. Experiências com o uso de CE provenientes do SCU nas doenças
metabólicas têm vindo a aumentar nos últimos anos e os resultados são promissores
[110].
O estudo multicêntrico - Cord Blood Transplantation Study (COBLT) cujo principal
objectivo foi avaliar o uso do SCU em transplantes alogénicos, integrou 69 doentes no
total, com doenças de acumulação lisossómica e peroxissomal (mucopolissacaridoses I,
II e III e mucolipidose II – 36 pacientes; adrenileucodistrofia – 8; leucodistrofia
metacromática – 6; doença de Krabbe – 16; doença de Tay-Sachs – 3), os autores
concluíram que o transplante com células do SCU deve ser considerado tratamento de
primeira linha para doentes jovens portadores de doenças de acumulação lisossómica e
peroxissomal [110].
141
25.6 – Em Traumatologia e Ortopedia
Diferentes estudos comprovam o potencial de diferenciação das CE mesenquimais do
SCU em osteoblastos e células osteoprogenitoras [111] porém, poucos demonstram a
aplicação destas células na regeneração do tecido ósseo in vivo. Num trabalho recente,
Jager e colaboradores descrevem a aplicação de CE mesenquimais do SCU, combinadas
a matrizes de colagénio e fosfato tricálcico, no tratamento de deficiências em tíbias de
murganhos. Segundo os autores, os animais tratados com as células expandidas in vitro
apresentaram um aumento significativo na formação de tecido ósseo, quando
comparados com os animais que não receberam estas células [112]. Um estudo
realizado por Choi e colaboradores demonstrou que células mesenquimais do SCU,
quando cultivadas sobre uma membrana de atelocolagénio e na presença de factores
adequados, adquirem o fenótipo de condrócitos maduros, com alta expressão de
colagénio tipo II [113].
Além das HSCs e CE mesenquimais, o SCU é uma fonte importante de CE progenitoras
endoteliais, o que sugere a sua aplicação em terapias angiogénicas dos tecidos músculo-
esqueléticos. Diferentes estudos demonstram a aplicação de células mononucleares do
SCU no tratamento de lesões isquémicas de músculo estriado esquelético. De acordo
com os autores, estas células participam directamente na formação dos novos vasos
sanguíneos, ou, indirectamente, através da actividade parácrina, libertando factores que
estimulam a revascularização [114].
142
26 - Conclusões
A experiência dos últimos 20 anos, indica que as CE do SCU, devido à sua capacidade
de renovação e diferenciação, constituem uma importante ferramenta para a recuperação
funcional de tecidos e órgãos, possibilitando a melhoria e, até mesmo, a recuperação de
várias doenças. À medida que as propriedades destas células vão sendo delineadas e
compreendidas, vai sendo possível uma manipulação mais controlada das mesmas, tanto
in vitro como in vivo, o que permitirá, num futuro próximo, alargar a sua aplicação
clínica, às mais variadas áreas. O SCU é uma fonte importante de HSCs, tendo-se
constituído uma alternativa à MO e ao sangue periférico nos transplantes para a
recuperação da hematopoiese. A rápida disponibilidade do SCU e a baixa taxa de
GVHD, tanto aguda como crónica, na presença de uma maior disparidade HLA
representam as principais vantagens desta fonte de células. Diversos trabalhos têm
demonstrado a existência de diferentes populações de CE no SCU, com capacidade de
diferenciação em linhas celulares características dos três folhetos embrionários -
endoderme, mesoderme e ectoderme - o que, juntamente com a sua fácil obtenção, as
torna ideais para a regeneração de qualquer tecido do organismo. Os estudos em curso,
em modelos animais e em humanos, sugerem que as aplicações clínicas com CE do
SCU poderão estender-se a outras doenças, como por exemplo a doenças cardíacas,
doenças neurodegenerativas, disfunções hepáticas ou diabetes tipo 1, demonstrando o
potencial destas células em terapia celular e medicina regenerativa. É expectável que as
CE do SCU venham a ter um papel cada vez mais importante na medicina do futuro.
A grande desvantagem do transplante de CE do SCU, é o número limitado de células
existentes em cada unidade traduzindo-se numa recuperação lenta da hematopoiese e na
sua restrita utilização em adultos. Os melhores resultados são observados em receptores
que receberam unidades de sangue de cordão com uma dose alta de células
mononucleares, sendo que a dose mínima de células infundidas deverá ser superior a
2X107 CNT/kg do doente. A pouca informação acerca da viabilidade a longo prazo dos
transplantes celulares, da sua capacidade de maturação ou resposta a futuros estímulos
fisiológicos e patológicos está ainda por esclarecer. Será também necessário avaliar o
grau de pureza do transplante, ou seja se as células que surgem no local desejado são, de
facto, de origem estaminal e se ocorreu transdiferenciação. São ainda precisos estudos
que permitam optimizar os métodos de obtenção de um número suficiente de CE, que
143
determinem o número recomendável a transplantar em cada situação e que esclareçam
os mecanismos de migração, adesão e transdiferenciação destas células.
Pelo exposto, a importância da criopreservação do SCU é mais do que reconhecida, no
entanto, a doação a bancos públicos possui alguns critérios que limitam a utilização do
SCU. Por outro lado, o uso de células autólogas para doenças degenerativas, como
acontece hoje nos protocolos clínicos de cardiologia, neurologia e doenças autoimunes,
e de terapia génica, será facilitado a doentes que já possuam o SCU armazenado em
bancos privados.
Concluindo, a evidência recente aponta para o facto de o destino das CE não estar
definido à nascença, mas sim poder, literalmente, ser o que se quiser que seja.
144
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