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INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
RESPOSTA ANTIOXIDATIVA DE ACESSOS DE
MAMONA (RICINUS COMMUNIS L.) AO DÉFICIT
HIDRÍCO CAUSADO POR PEG
PATRÍCIA FAVORETTO MORAES
Orientadora: Tammy Ap.Manabe Kiihl
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre
em Agricultura Tropical e Subtropical,
Área de Concentração em Genética,
Melhoramento e Biotecnologia Vegetal.
Campinas, SP
Abril, 2014
iii
DEDICATÓRIA
A minha amada mãe Cris, pelo apoio, carinho, companheirismo e compreensão durante
a realização do mestrado com amor dedico.
Ao meu pai Beto (in memorian), pelo apoio, por me ensinar a respeitar as diferentes
formas de agir e pensar e amar dedico.
iv
AGRADECIMENTOS
A realização desse trabalho só foi possível devido ao envolvimento de muitas pessoas,
que contribuíram direta ou indiretamente. Agradeço primeiramente a Deus, criador de
tudo e de todos, por conduzir meu caminho, sempre me dando força para continuar
lutando pela realização dos meus sonhos.
A minha orientadora Dra. Tammy Kiihl, primeiramente por abrir as portas para o meu
sonho, pela orientação durante todo o desenvolvimento do projeto, acreditando no meu
esforço, se empenhando e se dedicando.
Ao Dr.Carlos Colombo por ceder gentilmente o laboratório de biologia molecular para o
desenvolvimento do meu trabalho e pelas valiosas orientações.
À Dai (Dra. Daiane de Laat), muitíssimo obrigada, pela ajuda com o a parte molecular,
principalmente na análise dos dados, pela dedicação, amizade, companheirismo e
paciência.
Ao IAC e a Pós-Graduação, pela oportunidade, aos professores e funcionários pelo
tempo e pela contribuição. A CAPES, pela concessão da bolsa e a Petrobrás pelo auxilio
financeiro.
As meninas do laboratório, Marininha, Manu, Fernanda, Barbinha, Paula, Brenda,
Lúcia, Mari, Stella que sempre estiveram ao meu lado, tirando dúvidas, macerando
material, pipetando, muito obrigada pelo tempo disponibilizado, pela amizade e por
tornarem o local de trabalho muito agradável. Sem vocês não seria a mesma coisa.
Ao pessoal da mamona que colaborou muito nesse período, disponibilizado sementes,
avaliando material, agradeço ao Rafael, Felipe, Paulo, Isadora.
Vinicius, obrigada por toda a paciência, dedicação, companheirismo, preocupação e
força durante esses dois anos de trabalho, TE AMO.
A minha Tia Grei, foi por me espelhar nela que cheguei até aqui, e ao Martin,
menininho que alegrava meus dias, fazendo com que eu enxergasse o lado mais belo da
vida.
Aos meninos da minha vida, João Pedro e João Victor, obrigada pelo amor de vocês
meus irmãos.
A minha mãe, pessoa essencial na minha vida que não me deixou abater, sempre me
incentivando e mostrando que tudo vale a pena, amo você.
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... ix
RESUMO ........................................................................................................................ xi
ABSTRACT ................................................................................................................... xii
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 13
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 15
2.1 Generalidade sobre a cultura da mamoneira............................................................. 15
2.2 Importância econômica da mamona ......................................................................... 17
2.3 Recursos genéticos e melhoramento ....................................................................... 20
2.4 Disponibilidade hídrica versus cultura de mamoneira ............................................. 22
2.5 Mecanismos de resistências das plantas ao déficit hídrico ....................................... 23
2.6 Espécies reativas de oxigênio ................................................................................... 24
2.7 Sistemas antioxidantes .............................................................................................. 26
2.7.1 Superóxide Dismutase (SOD) ............................................................................... 27
2.7.2 Catalase (CAT) ...................................................................................................... 27
2.7.3 Ascorbato Peroxidase (APX) ................................................................................ 29
2.7.4 Guaiacol Peroxidase (GPOX) ................................................................................ 29
2.8 Genética e Biologia Molecular do sistema antioxidante .......................................... 30
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 32
3.1 Material Vegetal ....................................................................................................... 32
3.2 Delineamento experimental para a avaliação da atividade enzimática e expressão
gênica do sistema antioxidante. ...................................................................................... 32
3.2.1 Germinação ............................................................................................................ 32
3.2.2 Determinação concentração de PEG 6000 e tempos de avaliação ........................ 33
vi
3.2.3 Indução ao déficit hídrico ...................................................................................... 34
3.2.4 Parâmetros avaliados ............................................................................................. 34
3.2.5 Caracteristica fenótipica das plântulas .................................................................. 35
3.2.6 Condutância estomática (gs) .................................................................................. 35
3.3 Atividade enzimática do sistema antioxidante ......................................................... 35
3.3.1 Peroxidação lipídica .............................................................................................. 35
3.3.2 Extração de Proteínas ............................................................................................ 36
3.3.3 Determinação de proteína total solúvel ................................................................. 36
3.3.4 Catalase (CAT) ...................................................................................................... 37
3.3.5 Ascorbato Peroxidase (APX) ................................................................................ 37
3.3.6 Guaiacol Peroxidase (GPOX) ................................................................................ 38
3.3.7 Superoxide Dismutase (SOD) ............................................................................... 38
3.4 Análise estatistica ..................................................................................................... 39
3.5 Isolamento de RNA e síntese de DNA complementar ............................................. 39
3.5.1 Extração de RNA ................................................................................................... 39
3.5.2 Purificação do RNA............................................................................................... 40
3.5.3 Síntese de cDNA ................................................................................................... 40
3.6 Minerações de Dados e Desenho de Oligonucleotídeos Iniciadores ........................ 40
3.6.1 Busca de sequências .............................................................................................. 40
3.6.2 Desenho de oligonucleotídios iniciadores ............................................................. 41
3.6.3 Teste de eficiência dos oligonucleotídeos iniciadores ........................................... 41
3.6.4 Reações de q-PCR ................................................................................................. 41
3.3.5 Análise de expressão gênica .................................................................................. 42
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 42
4.1 Germinação ............................................................................................................... 42
4.2 Determinações da concentração de PEG 6000 e dos tempos de avaliação .............. 43
vii
4.3 Caracteristica fenótipica das plântulas ..................................................................... 44
4.4 Condutância estomática (gs) ..................................................................................... 45
4.5 Peroxidação lipídica ................................................................................................. 47
4.6 Enzimas do sistema antioxidativo ............................................................................ 48
4.7 Isolamentos de RNA e síntese de DNA complementar ............................................ 53
4.8 Desenhos de oligonucleotídeos iniciadores .............................................................. 54
4.9 Análise dos dados q-PCR ......................................................................................... 55
4.9.1 Teste de eficiência ................................................................................................. 55
4.9.2 Expressão diferencial dos genes alvos................................................................... 58
5 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 67
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 68
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Notas e sintomatologia visuais utilizadas para análise das plântulas. ............ 33
Tabela 2 – Teste de médias referente á caracterização fenotípica dos seis acessos de
mamona submetidas à PEG 10g/ L nos quatros tempos de avaliação.. ......................... 44
Tabela 3 – Teste de média referente á caracterização fenotípica entre os 4 tempos de
avaliação de plântulas de mamona submetidas a PEG 10g/L . ....................................... 44
Tabela 4 – Teste de média da diferença de condutância estomática (∆ = tratamento –
controle) no tempo de 24 horas, nos 6 acessos de mamona estudados. ......................... 47
Tabela 5 – Média dos tempos de avaliação (2, 8, 24 e 48 horas) expressa através da
quantificação de malondialdeído (MDA). ...................................................................... 47
Tabela 6 – Médias da atividade enzimática entre as plântulas de mamona controles e
tratamentos...............................................................................................................49
Tabela 7 – Teste de média da diferença da atividade enzimática média dos seis acessos
avaliados (∆ = tratamento – controle) nos tempos de 2 horas, 8 horas e 24 horas. ........ 49
Tabela 8 – Teste de média das atividades enzimáticas de CAT, GPOX e SOD entre os
seis acessos avaliados (∆ = tratamento – controle) no tempo de 24 horas. .................... 51
Tabela 9- Identificação, sequências direita (D) e reversa (R), tamanho, temperatura de
anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores desenhados para q-PCR, a partir das
sequências obtidas (NCBI).. ........................................................................................... 54
Tabela 10- Eficiência dos genes alvos potencialmente relacionados com a resposta
induzida por déficit hídrico em Ricinus Communis L. e normalizador calculado de
acordo com o coeficiente angular da reta (slope). .......................................................... 58
Tabela 11 – Valores médios de expressão diferencial (Actina e Ubiquitina) entre os
acessos de mamona para os genes estudados. ................................................................ 61
Tabela 12- Teste de média referente a QR dos acessos China Careca, PB 07 e IAC
2028, submetidos à déficit hídrico causado por PEG 6000 10g/L -1
, durante 24 horas,
normalizados com gene (ACT e UBCT). ....................................................................... 64
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Produção mundial de mamona em bagas de 2006 á 2012, em milhões de
toneladas, com os principais produtres mundiais. Fonte: CONAB, 2014/FAO,2014. ... 20
Figura 2- Formação das EROs e atividade das enzimas do complexo antioxidativo
(SOD, CAT, APX e GPOX). .......................................................................................... 25
Figura 3- Processo de germinação dos acessos selecionados em caixa plásticas contendo
vermiculita. ..................................................................................................................... 33
Figura 4 – Plântulas de mamona submetidas ao déficit hídrico por PEG 6000 10 g/L . 34
Figura 5- Medição da condutividade estomática ,em plântulas de mamona, com auxilio
de Porômetro (Type AP4 – Delta T Devices) nos diferentes períodos de avaliação...... 35
Figura 6 – Germinação dos acessos de mamona após 30 dias em casa de vegetação com
irrigação controlada. ....................................................................................................... 43
Figura 7- Plântulas de mamona submetidas ao controle e tratamento (PEG 6000 10g/L),
durante 48 horas. A) 2 horas, B) 8 horas, C) 24 horas e D) 48 horas( Acesso PB 07). . 43
Figura 8- Plântulas de Ricinus communis L, submetido ao tratamento (PEG 6000 10g/L)
, A) 24 horas, B) 48 horas. .............................................................................................. 45
Figura 9- Diferença da condutância estomática entre as plântulas de mamona controles e
tratamento. Tukey (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si. ...... 46
Figura 10 - Atividade das enzimas do sistema antioxidante nos acessos de mamona
induzidos ao déficit hídrico. ........................................................................................... 52
Figura 11 - Dendrograma obtido pelo método aglomerativo UPGMA, coeficiente de
similaridade de Jaccard para os acessos de mamona (Ricinus communis L.) realizado a
partir de dados obtidos (VENANCIO, 2013).. ............................................................... 53
Figura 12- Eletroforese em gel de agarose [1%] para verificação da integridade das
amostras de RNA total extraído de folhas de mamona, observando as bandas 28S e 18S.
........................................................................................................................................ 53
Figura 13 - Curvas de amplificação das diluições seriadas com sete concentrações de
cDNA para análise de eficiência dos normalizadores ACT (A) e UBQ (B) e dos genes
alvos CAT (C), APX (D), GPOX (E), SOD Cu/Zn (F), SOD Fe (G) e SOD Mn (H).. . 55
x
Figura 14 - Curvas de dissociação das diluições seriadas com sete concentrações de
cDNA para análise de eficiência para os genes alvos ACT (A) e UBQ (B) e genes alvos
CAT (C), APX (D),GPOX (E), SOD Cu/ Zn (F), SOD Fe (G) e SOD Mn (H). ............ 56
Figura 15- Curva padrão gerada para ilustrar o cálculo de eficiência de amplificação dos
genes ACT, UBQ, CAT, APX, SOD (Cu/Zn), SOD (Fe), SOD (Mn) a partir de RNA
extraído de folhas de mamona. Em destaque, o coeficiente angular da reta (slope) e o
R2. ................................................................................................................................... 57
Figura 16 - Curva de amplificação para os genes (CAT, APX, SOD-Cu/Zn, SOD-Fe,
SOD-Mn) para os acessos IAC 2028 (A e B), PB 07 (B e C), China Careca (D e E) no
tempo de 24 horas, submetido ao déficit hídrico por PEG 6000 10 g/L, gerada pelo
software 7500 Fast System SDS (Sequence Detection System) v 1.3.1 (Applied
Biosystems). ................................................................................................................... 59
Figura 17 – Expressão gênica relativa dos genes pertencentes ao sistema antioxidativo
nos acessos IAC 2028, PB 07 e China Careca, submetidos ao déficit hídrico por PEG
6000 10g/L, gerada pelo software J Color Grid. ............................................................ 60
xi
Resposta antioxidativa de acessos de mamona (Ricinus communis L.) ao déficit
hídrico causado por PEG
RESUMO
As principais regiões produtoras de Ricinus communis L. no país, estão localizadas
no semi-árido brasileiro, sendo essa cultura bem adaptada a essa região por ser capaz de
sobreviver sob pouca disponibilidade hídrica. No entanto, a seca é o principal fator
limitante da produtividade de culturas mundiais e as culturas que apresentam maior
resistência a este estresse são ser cruciais para a manutenção e produtividade em áreas
onde as estações secas são comuns. A fim de analisar o comportamento enzimático e a
expressão diferencial de genes potencialmente relacionados com a tolerância de
mamona ao déficit hídrico, seis acessos dessa cultura (China Careca, IAC 2028, IAC
226, IAC Guarani, IAC 80 e PB 07), foram submetidos a um ensaio com solução de
polietilenoglicol (PEG 6000) para simulação de déficit hídrico e sem solução de PEG
6000 (controle negativo), em diferentes tempos de amostragem (2, 8 e 24 horas).
Análises da atividade enzimática pertencente ao sistema de defesa antioxidante
(Catalase -CAT, Ascorbato Peroxidase - APX, Guaiacol Peroxidase -GPOX e
Superoxide Dismutase- SOD) revelaram que os seis acessos estudados possuem
diferentes mecanismos de resposta ao déficit hídrico. A expressão diferencial dos genes
CAT, APX, SOD-Cu/Zn, SOD-Fe e SOD-Mn é aumentada pelo déficit hídrico causado
por PEG 6000 10g/L no período de 24 horas no acesso China Careca, esse mesmo
acesso se mostrou menos sensível ao déficit hídrico no período de 24 horas por
apresentar um sistema de defesa antioxidante mais eficiente. Os presentes resultados
mostram que o acesso China Careca pode ser considerado de grande importância para o
programa de melhoramento genético, uma vez que esse apresenta a característica de
precocidade, um sistema de defesa antioxidante eficiente e resistência ao déficit hídrico.
Palavras-chave: Mamona, estresse oxidativo, enzimas antioxidantes, expressão gênica,
PCR Quantitativo em Tempo Real (q-PCR).
xii
Antioxidative response in accessions of castor ( Ricinus communis L. ) Under water
deficit caused by PEG
ABSTRACT
The major producing regions of Ricinus communis L. in the country are located in the
Brazilian semi -arid, and this culture is well adapted to this region because it is able to
survive under low water availability. However, drought is the main factor limiting the
productivity of world crops and crops with greater resistance to this stress seem to be
crucial for the maintenance and income in areas where dry seasons are common. In
order to analyze the enzymatic behavior and differential expression of genes potentially
related to the tolerance of this crop to water deficit, six accessions of castor bean (China
Careca, IAC 2028, IAC 226 , IAC Guarani , IAC 80 and PB 07) , were submitted to a
trial with polyethylene glycol solution (PEG 6000) for simulating water deficit and
without PEG 6000 solution (negative control), at different sampling times (2, 8 and 24
hours). Analysis of the enzymatic activity belonging to the antioxidant defense
(Catalase - CAT, Ascorbate Peroxidase - APX, Guaiacol Peroxidase and Superoxide
Dismutase - GPOX Activity - SOD) showed that six accesses have different
mechanisms of response to water deficit. The differential expression of CAT, APX,
SOD-Cu/Zn, Fe - SOD and Mn - SOD genes is induced by water deficit caused by PEG
6000 10g/L within 24 hours in China Careca access, this same access has showed less
sensitivity to drought in 24 hours by presenting a more efficient system of antioxidant
defense. Our results show that China Careca access can be considered of great
importance for the breeding program, since this has the characteristic of precocity and
an efficient antioxidant defense.
Keywords: Castor bean, oxidative stress, antioxidant enzymes, gene expression,
Quantitative Real Time PCR (q-PCR).
13
1 INTRODUÇÃO
A mamona (Ricinus communis L.) é uma planta oleaginosa pertencente à
família das euforbiáceas, também conhecida como rícino ou carrapateira, de origem
tropical e é cultivada comercialmente em mais de 15 países, dentro dos quais os
principais produtores são Índia, China, Moçambique e Brasil (LARA, 2010; FAO,
2014). Até meados da década de oitenta o Brasil foi o principal produtor mundial desta
oleaginosa, no entanto, a produção nacional declinou nas últimas décadas, essa perda
de competitividade brasileira no mercado internacional é justificada pelos baixos níveis
tecnológicos do país no segmento da ricinocultura, gerando assim a necessidade de
importação de óleo bruto proveniente da Índia e China (SANTOS et al, 2007).
Seus produtos e subprodutos possuem grande potencial econômico na área
industrial de transformação e como fonte energética sob a forma de biodiesel. A
versatilidade do óleo de mamona deve-se à estrutura química do ácido ricinoléico
(SAVY FILHO et al., 1999b; SANTOS et al., 2007).
A cultura da mamona está sendo considerada como uma boa opção para
agricultores de diversas regiões do país em razão, principalmente, do alto rendimento
energético, relativa rusticidade e tolerância à seca, sendo adaptável a condições
edafoclimáticas muito variáveis.
O caráter social e a possibilidade do cultivo no semi-árido nordestino têm
destacado a mamona entre as demais espécies tolerantes ao déficit hídrico, sem
mencionar o fato de seu óleo ser estritamente industrial, o que reduz a competição com
o mercado alimentar, como ocorre com outras matérias-primas (BELTRÃO et al.,
2005). A mamona é produtiva em termos de biomassa energética e ambientalmente
renovável, uma vez que todas as partes da planta podem ser aproveitadas, desde a torta
até os restos culturais. Portanto, a mamona preenche satisfatoriamente todos os
requisitos-base para participar como matéria-prima na produção de biodiesel brasileiro
Sabendo da carência de recursos hídricos da região Nordeste, estudos a respeito
da tolerância à seca de plantas, como a mamona, são necessários para buscar o aumento
14
na eficiência do uso de água pelas plantas, bem como ao maior entendimento dos
efeitos do estresse hídrico no crescimento.
A seca é o principal fator limitante da produtividade de culturas agrícolas e as
espécies vegetais que apresentam maior resistência a este estresse parecem ser
determinantes para a manutenção de rendimentos satisfatórios em áreas onde as
estações secas são comuns (AZEVEDO et al., 2001).
A identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância à seca, são
fundamentais para o desenvolvimento de novas cultivares comerciais mais tolerantes
ao estresse hídrico. A tolerância das plantas à seca não é uma característica simples,
mas sim uma característica em que os mecanismos trabalham isoladamente ou em
conjunto para evitar ou tolerar períodos de estresse hídrico (STOLF-MOREIRA, et
al.;2011).
Muitos dos estresses abióticos conhecidos, como salinidade, temperatura,
alumínio e seca quebram o balanço metabólico das células, resultando no aumento de
produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) (MITTLER, 2002; PRISCO &
FILHO, 2010; JAMBUNATHAN, 2010). As EROs, quando se acumulam nos tecidos,
podem levar a alteração da atividade das enzimas do complexo antioxidativo. Estas
enzimas desempenham um papel importante no combate a esses radicais e são
requeridas quando o equilíbrio entre produção e remoção das EROs é afetado por
fatores ambientais adversos, como o estresse por déficit hídrico (APEL & HIRT, 2004).
A enzima superóxide dismutase (SOD) por ser considerada a primeira linha de
defesa contra as EROs, desempenha um papel chave no sistema de defesa antioxidativo,
convertendo O2-•
em H2O2 e O2 Já as enzimas catalase (CAT), ascorbato peroxidase
(APX) e guaiacol peroxidase (GPOX) têm como principal função a remoção das EROs,
detoxificando o produto originado pela ação da SOD (H2O2) em H2O e O2
(SCANDALIOS, 2005).
Conhecer as atividades das enzimas pertencentes ao complexo antioxidante é
fundamental para se entender os danos causados pelo estresse oxidativo presente nas
plantulas de mamoneira submetidas ao déficit hídrico.
Assim, esse trabalho teve como objetivo caracterizar acessos de mamona
pertencentes ao banco de germoplasma do Instituto Agronômico de Campinas - IAC
(Campinas, SP), quanto à resposta ao déficit hídrico causado por polietilenoglicol (PEG
6000), a fim de se compreender o comportamento das enzimas antioxidantes, por meio
15
da atividade enzimática e expressão gênica, que ocorrem em plântulas submetidas a
esse tipo de estresse e que caracterizam a tolerância ou a sensibilidade ao déficit
hídrico. A compreensão do comportamento dessas enzimas visa subsidiar o Programa
de Melhoramento de Mamona do IAC na obtenção de novas cultivares com
características de tolerância ao déficit hídrico.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Generalidade sobre a cultura da mamoneira
A mamoneira pertence à família Euphorbiaceae, ao gênero Ricinus e à espécie
Ricinus communis L. e é popularmente conhecida como mamona, carrapateira, palma-
de-cristo, enxerida e rícino (LARA, 2010).
Ricinus communis L (2n-20) é explorada comercialmente como uma cultura anual
que floresce de 90 a 120 dias após plantio (BALDANZI et al., 2003), no entanto é
classificada pela botânica como uma planta perene que pode chegar até cinco anos de
idade (SAVY FILHO et al., 1999 a).
Considerada uma planta monoica, heliófita e xerófila, a mamoneira possui hábito
arbustivo, com diversas colorações de caule, folhas e racemos (cachos). Em geral, os
frutos possuem espinhos que, em alguns casos, são inermes e as sementes se
apresentam com diferentes tamanhos, formatos e grande variabilidade de coloração
(AZEVEDO et al., 2001).
Seu sistema reprodutivo é considerado do tipo misto, podendo ocorrer
autofecundação e altas taxas alogamia, chegando a 40 % variando com o porte da
planta (BELTRÃO et al., 2007b). Em geral o sistema radicular é vigoroso, do tipo
pivotante, profundo, com emissão de radicelas, permitindo grande área de absorção de
umidade e nutrientes do solo (SAVY FILHO, 1999).
Sua inflorescência é composta de ráquis, em que a parte superior é feminina e a
inferior masculina, geralmente a relação das flores é de 30% a 50% femininas e de 70%
a 50% masculinas, por isso um dos objetivos dos trabalhos de melhoramento é alterar a
relação, aumentando a porcentagem de flores femininas (SAVY FILHO, 1999). Porém,
16
a expressão do sexo é afetada por fatores ambientais, como deficiência hídrica e
temperatura muito alta, que induzem a formação de flores masculinas.
A mamoneira apresenta protoginia, onde os pistilos das flores femininas atingem a
maturação de cinco a dez dias antes da maturação das anteras das flores masculinas
(GURGEL, 1945; BERTOZZO, 2009).
É uma espécie perene, cujas plantas apresentam variabilidade em suas
características, como porte variado, desde 0,8 m a árvores com mais de cinco metros de
altura, ramificação caulinar do tipo simpodial, raízes fistulosas, vários tipos de
expressão de sexualidade e elevadas taxas de respiração (AZEVEDO et al., 1997).
O número e o tamanho de internódios que cada ramo possui é uma característica
varietal, determinando a altura de inserção do racemo primário. Sua quantidade nos
ramos laterais também determina a altura da planta e a emissão das inflorescências
secundárias e terciárias (SAVY FILHO, 1999).
A mamoneira é uma espécie tropical, mas não há conhecimento ao certo sobre o
seu país de origem, evidências sugerem que seja nativa da África, e que provavelmente,
originou-se na Etiópia (FIGUEIREDO NETO et al., 2004; ALLAN et al., 2008). Há
relatos de que sua domesticação iniciou-se no Egito no ano 4000 a. C., tendo sido
introduzida na África com a chegada dos europeus (SAVY FILHO, 1999).
A mamoneira é cultivada em quase todo o mundo, principalmente em zonas
tropicais e subtropicais (FIGUEIREDO NETO et al., 2004; ALLAN et al., 2008). O
clima tropical, predominante no Brasil, facilitou sua dispersão, e atualmente pode ser
encontrada em quase todo o território nacional como se fosse uma planta nativa
(SANTOS et al., 2007).
A mamoneira se desenvolve melhor em locais onde a temperatura do ar varia entre
20 e 30 ºC, precipitações pluviais de pelo menos 500 mm, com elevada insolação.
Prefere solos de textura média, não muito argilosos, planos ou de relevo suave
ondulado, sem perigo de encharcamento ou inundação, e não suporta solos muito
salinos (BELTRÃO & CARDOSO, 2006; BELTRÃO et al., 2007a). Temperaturas
abaixo de 16ºC reduzem significativamente seu metabolismo, podendo até paralisar seu
crescimento (BELTRÃO et al., 2007a).
A mamoneira apresenta baixa produtividade em solos muito pobres, porém,
quando cultivadas em solo extremamente férteis, ocorre o crescimento vegetativo
excessivo, prolongando o início do período reprodutivo no ciclo de vida da planta. O
17
pH do solo ótimo para o desenvolvimento dessa cultura deve estar entre 5.5 e 6.5
(AZEVEDO et al. 1997).
2.2 Importância econômica da mamona
A mamoneira é uma oleaginosa explorada devido ao teor de óleo em suas
sementes, fornecendo produtos e subprodutos muito utilizados na indústria e na
agricultura, além de apresentar perspectivas de uso como fonte energética sob a forma
de biodiesel (COSTA et al., 2006).
O óleo da mamona é composto por 90 % de ácido graxo ricinoléico, sendo a
mamona a única fonte comercial quase pura desse ácido, fato raro na natureza. O ácido
ricinoléico confere ao óleo da mamona suas singulares propriedades industriais (SAVY
Filho & BANZATTO, 1993; COSTA et al., 2004). O teor de óleo nas sementes dessa
planta está entre 35 á 55%, onde sua semente é constituída de aproximadamente 75%
de amêndoa e 25% de casca (SAVY Filho et al., 1999b).
O alto valor do índice acetil e hidroxila difere o óleo da mamona dos outros óleos
vegetais. Pela sua viscosidade e peso especifico, ao contrario dos outros óleos vegetais,
é miscível em álcool, mas levemente solúvel em éter de petróleo à temperatura
ambiente (NAUGHTON, 1974; SAVY Filho & BANZATTO, 1993).
O ácido ricinoleico possui uma cadeia com 18 átomos de carbono, com presença
de grupos hidróxilos, ligação olefínica e dupla ligação, que possibilita, através de
diversas reações químicas, a obtenção de diferentes derivados de óleo de mamona de
larga aplicação industrial (SAVY Filho & BANZATTO, 1993).
A mamoneira foi trazida para o Brasil pelos portugueses, com a finalidade de
utilizar seu óleo para a iluminação e a lubrificação de eixos de carroças (SANTOS et
al., 2007). Atualmente serve como lubrificante na aeronáutica, base na manufatura de
cosméticos, drogas e farmacêuticos e em vários processos industriais, como fabricação
de tintas e isolantes sendo um óleo bastante estável em variadas condições de
temperatura e pressão (COSTA & ROSSI, 2000; CHEIRICE & CLARO NETO, 2007).
A haste fornece celulose para a fabricação de papel e serve de matéria-prima para a
produção de tecidos grosseiros (AZEVEDO et al., 2001).
18
A mamona também fornece a torta da mamona, um subproduto industrial utilizado
na agricultura que possui grande capacidade de restauração de terras esgotadas e é
considerado um importante adubo orgânico (COSTA et al., 2004; SAVY Filho et al.
1999a). É utilizada em grandes quantidades nas culturas de café, citros, cana-de-açúcar,
hortaliças, frutíferas, entre outras e também é explorada em solos infestados por
nematóides, pois inibe sua expansão (SAVY Filho et al., 1999a).
A busca mundial pela sustentabilidade ambiental, com base na substituição
progressiva dos combustíveis minerais derivados do petróleo, por combustíveis
renováveis de origem vegetal, criou uma perspectiva real para a expansão do seu
cultivo, em escala comercial no semi-árido brasileiro, principalmente na agricultura
familiar (BELTRÃO et al., 2005).
A região Nordeste brasileira dispõe de mais de 45 milhões de hectares de terras
com aptidão para a exploração econômica da cultura da mamoneira, em especial o
Estado da Bahia, onde pequenos e médios agricultores produzem mamona há mais de
um século (BELTRÃO et al., 2005; NÓBREGA, 2008).
Por se tratar de uma planta com capacidade de produzir satisfatoriamente bem sob
condições de baixa precipitação pluvial apresenta-se como alternativa de grande
importância para o semi-árido brasileiro. Nesta região, a cultura mesmo tendo sua
produtividade afetada tem-se mostrado resistente ao clima adverso quando se verificam
perdas totais em outras culturas (AZEVEDO et al., 2001).
Os agricultores do semi-árido baiano mantêm o cultivo de mamona como um
seguro para os anos de seca, uma vez que as lavouras tradicionais como milho e feijão
tem perdas irreversíveis em períodos de veranicos superiores a 30 dias, enquanto a
mamona sofre menor perda (CARVALHO, 2005). A mamoneira é cultivada em quase
todos os municípios do semi-árido baiano, garantindo o sustento de milhares de
famílias (NÓBREGA, 2008). Nesta região, seu plantio é reconhecido como fator
fixador de mão-de-obra, gerador de emprego e matéria-prima indispensável ao
desenvolvimento da região e do país (AZEVEDO et al., 2001), refletindo o alcance
social e econômico gerados pelo desenvolvimento da cadeia produtiva desta
euforbiácea.
Há algum tempo a ricinocultura no Brasil vem sofrendo sérios problemas
econômicos, uma vez que o preço pago aos produtores está diretamente ligado ao
mercado internacional (VIEIRA & LIMA, 2014).
19
O Brasil na década de 70 desenvolveu programas de pesquisa em biocombustíveis,
buscando uma menor dependência dos países exportadores de petróleo, principalmente
do Oriente Médio (SCHLOSSER et al., 2004). Esse incentivo permitiu que o Brasil se
destacasse no ranking mundial como o principal o país produtor de mamona.
Até a metade da década de 1980 o Brasil era o primeiro produtor mundial de
mamona. Devido à falta de tecnologia na agricultura ligada a ricinocultura (ausência de
fertilizantes, sementes melhoradas, inexistência de práticas conservacionistas), ofertas
inconstantes (perdas devido a instabilidades nas principais regiões produtoras), baixos
preços recebidos pelos produtores e mercado com poucos compradores e muitos
pequenos produtores, reduzida oferta de crédito e assistência ao produtor, ocorreu uma
redução significativa na área plantada com a cultura, razão pela qual o Brasil ocupa a
quarta posição no quadro dos principais produtores mundiais de mamona, atrás da
Índia, China e Moçambique (FAO, 2014;SANTOS, et al., 2007).
Na safra do ano de 1974 foram produzidas aproximadamente 573.000 toneladas de
mamona, porém em 1996 a produção nacional foi apenas de 122.000 toneladas,
representando assim uma redução de 79 % na produção nacional (SANTOS, et al.,
2007).
Atualmente a Índia é o principal país produtor de mamona, contribuindo em 2012
com 1.600.000 toneladas, seguido pela China com 170.000 toneladas, a produção
moçambicana de 62.000 mil toneladas tirou o terceiro lugar da produção brasileira que
até 2011 contribuía com aproximadamente 120.000 toneladas. A redução na produção
brasileira para 25.000 toneladas em 2012 ocorreu devido à seca que atingiu as principais
regiões produtoras do país. Contudo, o Brasil ocupa o quarto lugar, com perspectivas de
melhor posição desde que ocorram mais investimentos tecnológicos em insumos
agrícolas, especialmente sementes e tratos culturais, visando ganho de produtividade
(CONAB, 2014;FAO, 2014).
A produção mundial de mamona em bagas na safra de 2010, se comparada à safra
anterior, detectou aumento de 9% (Figura 1). Este fato foi motivado pelo aumento de
área cultivada pela Índia e Brasil. No ano de 2010 as importações brasileiras somaram
8,2 mil toneladas e as exportações 2,0 mil toneladas, resultando em um déficit de 6,2
mil toneladas ou US$ 8.562 (CONAB, 2014).
A severa seca que atingiu a região produtora do nordeste, reduziu cerca de 79,16 %
da produção nacional em 2012 (CONAB, 2014), mostrando assim que as mudanças
20
climáticas globais, podem causar um aumento da escassez hídrica, e o uso de genótipos
tolerantes ao déficit hídrico são importantes objetos de pesquisa no mundo (CHAVES
& OLIVEIRA, 2004).
2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Brasil 0,095 0,098 0,120 0,091 0,095 0,120 0,025
China 1,900 1,700 1,900 1,700 1,500 2,000 1,700
Índia 0,762 1,053 1,117 1,009 1,350 2,339 1,630
Moçambique 0,049 0,054 0,052 0,057 0,060 0,060 0,062
Mundo 1,159 1,440 1,609 1,139 1,720 2,783 1,958
Figura 1 - Produção mundial de mamona em bagas de 2006 á 2012, em milhões de
toneladas, com os principais produtres mundiais. Fonte: CONAB, 2014/FAO, 2014.
2.3 Recursos genéticos e melhoramento
Para alcançar produtividade economicamente viável com a cultura da mamona é
preciso suprir adequadamente suas necessidades nutricionais e realizar melhorias no
sistema de produção, principalmente utilizando cultivares desenvolvidos através do
melhoramento genético (CARVALHO, 2005).
O melhoramento genético já solucionou diversos problemas inerentes à cultura da
mamoneira: aumento de produtividade, aumento do teor de óleo na semente,
diminuição do porte da planta para atender a colheita mecânica, diminuição do grau de
21
deiscência do fruto a fim de diminuir o desperdício em campo e proporcionar um
menor numero de colheita, além do aumento do nível de resistência ás principais
doenças que atingem o país (VIEIRA & LIMA, 2014).
No entanto, a falta de cultivares melhorados causa várias dificuldades para a
cultura da mamoneira, assim, o melhoramento genético deve atender as necessidades
da indústria, buscando maior produtividade, adequação do teor de óleo das sementes,
precocidade e aumento na porcentagem de flores femininas (BERTOZZO, 2009).
A exploração da heterose é normalmente aplicada a espécies alógamas, no entanto,
também pode ser aplicado no desenvolvimento de cultivares híbridas de mamona,
resultando assim em um modo eficaz de aumentar a produtividade da cultura (FREIRE
et al, 2007).
Na Índia, o melhoramento genético nas décadas de 70 á 90 resultou no
desenvolvimento de variedades de alto rendimento e de híbridos adaptados a condições
agroclimáticas adversas (SUJATHA, 1998).
No Brasil, as principais instituições envolvidas no melhoramento genético da
mamoneira atualmente são o Instituto Agronômico (IAC) e a EMBRAPA - Algodão. A
EMBRAPA dispõe de mais de 500 acessos em seu banco de germoplasma, que fazem
parte da coleção base da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e representam
grande parte da variabilidade genética usada atualmente nos programas de
melhoramento genético de mamoneira (FREIRE, et al., 2007)
O Instituto Agronômico de Campinas (IAC) iniciou seus projetos envolvendo a
cultura da mamona em 1936 e seu banco de germoplasma constitui-se de uma coleção
de trabalho formada por aproximadamente 500 linhagens e progênies, obtidas através
de diversas hibridizações entre variedades locais e introduzidas, conservada em sua
pureza e variabilidade genética nos últimos 70 anos (SAVY Filho, 2005).
Atualmente existem apenas seis cultivares comercializadas no Brasil,
desenvolvidas pelas seguintes instituições: EMBRAPA/EBDA cultivares BRS 149
Nordestina, BRS Paraguaçu e BRS Energia, Coordenadoria de Assistência Técnica
Integral do Estado de São Paulo (CATI) com cultivar AL Guarany 2002 e Instituto
Agronômico de Campinas (IAC) com os cultivares IAC 80 e IAC 2028, que atendem
as necessidades dos produtores como: alto teor de óleo, tolerância à seca, de porte
médio a baixo (EMBRAPA, 2014).
22
2.4 Disponibilidade hídrica versus cultura de mamoneira
O estresse hídrico por falta de água é um dos fatores ambientais mais importantes
que podem regular o desenvolvimento e o crescimento, limitando a produção e levando
á alterações nas características fisiológicas e bioquímicas das plantas (ZOBAYED et
al., 2007).
Com o aumento do interesse pela mamoneira no semi-árido brasileiro, as
necessidades de informações básicas e técnicas estão sendo ampliadas, criando
demanda para estudo e expansão dessa cultura (BELTRÃO & CARDOSO, 2006).
A água disponível para as plantas é o fator que mais limita o potencial de produção
agrícola. Por ser cultivada em regiões do semi-árido nordestino a cultura da mamona
está sujeita a condições climáticas menos favoráveis para a semeadura e emergência.
Portanto, estudos sobre o desenvolvimento de plântulas sob condições induzidas de
estresse hídrico são de fundamental importância pois permitem avaliar a resposta a
ambientes adversos e selecionar genótipos tolerantes à seca (STONE & MOREIRA
2002).
Diversas metodologias têm sido recomendadas para se identificar cultivares mais
adaptadas às condições de estresse causadas pela baixa disponibilidade de água no solo
(HADAS, 1976; CAMPOS & ASSUNÇÃO, 1990). O polietilenoglicol 6000 (PEG
6000) é um dos agentes osmóticos indicados para esse fim, por simular
satisfatoriamente baixos potenciais de água, sem ser absorvido pelas sementes
(VILLELA et al., 1991; MARTINELLI-SEMENE et al., 2000).
O PEG 6000 tem como características o alto peso molecular, não penetra nas
células, não é degradado e não causa toxidez. Sua função é controlar a disponibilidade
de água para a planta (MICHEL & KAUFMANN, 1973). Quanto mais concentrada é
uma solução de PEG 6000, menor a disponibilidades de água para a planta. A
utilização de PEG 6000 para a simulação de déficit hídrico já foi observado em
diversos trabalhos, como em girassol (CARNEIRO et al., 2011), milho e soja
(VASCONCELOS et al., 2009), paineira ( FANTI & PEREZ, 2004).
A identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância à seca, são
fundamentais para o desenvolvimento de novas cultivares comerciais mais tolerantes
ao estresse hídrico. A tolerância das plantas à seca não é uma característica simples,
mas sim uma característica em que os mecanismos de defesa contra as EROs, sendo
23
esses enzimáticos ou não-enzimaticos trabalham isoladamente ou em conjunto para
evitar ou tolerar períodos de estresse hídrico ( STOLF-MOREIRA et al., 2011).
2.5 Mecanismos de resistências das plantas ao déficit hídrico
As plantas desenvolvem mecanismos de resistência durante o processo evolutivo
para suportarem as diversas alterações ambientais as quais são submetidas. Os
mecanismos da resistência à seca podem ser agrupados em duas categorias: escape da
seca, que impede que a exposição da planta ao estresse e tolerância à seca, que permite
a planta suportar o estresse. Entretanto, as plantas usam mais de um mecanismo de
cada vez, para resistir a este tipo de estresse abiótico (BUCHANAN et al., 2000;
MITRA, 2001).
A capacidade das plantas em manter o potencial hídrico em seus tecidos próximos
aos níveis de plantas não estressadas, ocorre através do balanço entre a captação e perda
de água. Assim em curto prazo, as plantas fecham seus estômatos, ou em longo prazo,
aumentam a razão raiz/parte aérea, a capacidade de acumular água e a espessura da
cutícula (TAIZ & ZEIGER, 2004).
A seca induz um conjunto de respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares nas
plantas, que desenvolvem habilidades para adaptação às circunstâncias ambientais
limitantes, dependendo da intensidade e da duração do estresse, dos efeitos interativos
de outros tipos de estresse, do estádio de desenvolvimento e do genótipo (MENESES et
al., 2006).
O déficit hídrico ocorre não somente durante a seca e sob condições de altas
concentrações de sal, mas também de frio, implicando, provavelmente, na diminuição
da pressão de turgor em nível celular. Uma mudança no potencial osmótico através da
membrana plasmática, causada pela diminuição da pressão de turgor, pode ser o
iniciador principal da resposta ao estresse hídrico em nível molecular (WURGLER-
MURPHY & SAITO, 1997).
Sob a seca, as plantas tentam manter o seu índice de água, acumulando vários
solutos compatíveis não tóxicos e que não interferem com os processos da planta e que
são chamados consequentemente solutos compatíveis (YANCEY et al., 1982). Estes
24
solutos de baixo peso molecular permitem a manutenção do turgor celular, responsável
pela expansão e crescimento celular, abertura dos estômatos e fotossíntese.
À medida que o déficit hídrico se torna mais severo, as plantas não conseguem
manter o equilíbrio entre a captação e perda de água. Assim a redução do potencial
hídrico nos tecidos não pode ser evitada, sendo necessárias novas estratégias para que
as plantas tolerem a seca, como ajuste osmótico e o aumento da atividade do sistema de
defesa antioxidante (ASADA et al, 1999). De acordo com MITRA et al (2001),
tolerância a seca é a habilidade das plantas em resistir á redução no potencial hídrico de
seus tecidos.
Muitas situações de estresse abiótico, como seca, salinidade, temperatura e Al+3
,
ocasionam a quebra do balanço metabólico das células, resultando no aumento de
produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) (MITTLER, 2002). Um aumento na
oxidação de componentes pode funcionar como um dos iniciadores da resposta ao
estresse hídrico. Além da mudança na tensão física do citoesqueleto durante o estresse
hídrico, pode também funcionar como um dos iniciadores de respostas osmóticas.
2.6 Espécies reativas de oxigênio
O surgimento de organismos fotossintetizantes levou a um acúmulo de oxigênio na
atmosfera, que passou a ser utilizado por indivíduos aeróbios como aceptor final de
elétrons na obtenção de energia dos alimentos, adicionando uma vantagem
evolucionária a estes indivíduos (FOYER & NOCTOR, 2000).
Inconvenientes também surgiram como resultado dessa evolução metabólica, como
por exemplo, o surgimento das espécies reativas de oxigênio (EROs). No estado
molecular o O2 é pouco reativo, porém o metabolismo aeróbico produz inevitavelmente
EROs como o radical superóxido (O2•-), dotado de baixa capacidade oxidativa,
peróxido de hidrogênio (H2O2), capaz de romper a membrana nuclear e causar danos ao
DNA, radical hidroxila (•OH), com baixa capacidade de difusão, porém alta
reatividade, provocando lesões em uma série de moléculas em meio celular e o
oxigênio “singlet” (1O2) (Figura 2) (SCANDALIOS, 2000; JAMBUNATHAN, 2010).
Em plantas as EROs podem ser produzidas em reações ocorridas nas mitocôndrias,
cloroplastos e peroxissomos (FOYER & NOCTOR, 2000).
25
Figura 2- Formação das EROs e atividade das enzimas do complexo antioxidativo
(SOD, CAT, APX e GPOX).
Em condições normais de desenvolvimento, a produção de EROs na célula é
gerada por metabolismo de organismos aeróbicos, através da respiração e fotossíntese,
porém mantidos em níveis basais pelo sistema antioxidante de defesa. No entanto, em
condições adversas há uma alteração da homeostase celular resultando no aumento
acentuado na produção das EROS, podendo saltar de 240 µM s-1
O2.- para 720 µM s
-1
O2.- (MITTLER, 2002; GRATÃO et al., 2005).
A produção de EROS em plantas é favorecida por vários fatores ambientais de
estresse como a exposição a níveis elevados de luminosidade, seca, presença de metais
pesados, alta concentração de sais, alta temperatura, radiação ultravioleta, poluição do
ar, herbicidas, estresse físico e mecânico e também como resposta a estresses bióticos
tais como o ataque de patógenos (MALLICK & RAÍ, 1999).
As EROs são formadas em etapas de redução univalente a partir do oxigênio
molecular. O primeiro passo na redução de O2 produz radicais de vida relativamente
curta, os superóxidos (O2-•).
Esses radicais de oxigênio não conseguem atravessar
membranas biológicas, ficando confinados no compartimento onde foram gerados,
causando peroxidação lipídica no ambiente celular e nas membranas celulares.
Posteriormente, a redução do oxigênio gera peróxido de hidrogênio (H2O2), que, apesar
de não ser um radical livre, atravessa as biomembranas e se distribui a partir do local de
26
sua produção. A última e mais reativa espécie a ser formada nessa reação é o radical
hidroxila (OH.), que é formado pela redução do H2O2 por íons metálicos (Fe
2+ e Cu
2+)
na reação de Fenton (BREUSEGEM et al., 2001).
As plantas protegem suas células e compartimentos sub-celulares dos efeitos
citotóxicos das EROs com o auxílio de enzimas antioxidantes, como superóxido
dismutase (SOD), ascorbato peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPOX) e catalase
(CAT) (MOREIRA, 2011).
2.7 Sistemas antioxidantes
Existe um equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio e o sistema antioxidante.
O termo antioxidante descreve qualquer componente que possa neutralizar as espécies
ativas de oxigênio sem sua conversão a radicais destrutivos. O estresse oxidativo ocorre
quando há grande desequilíbrio entre a produção de espécies ativas de oxigênio e a sua
remoção pelo sistema antioxidante (FOYER & NOCTOR, 2000).
As espécies ativas de oxigênio inativam enzimas e causam grandes danos nos
componentes celulares, como por exemplo, a peroxidação lipídica dos ácidos graxos,
que tem como consequência a formação de alguns produtos como o malondialdeído
(MDA) (HODGES et al., 1999). A peroxidação dos lipídios das membranas
compromete o funcionamento e a estrutura celular, causando a susceptibilidade ao
extravasamento de íons como o K+ e outros, podendo, consequentemente, causar a
morte celular (CHAOUI et al., 1997). Para se defender, as células possuem mecanismos
antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos os quais mantêm a concentração destas
substâncias em níveis basais não destrutivos. Quando os níveis das espécies ativas de
oxigênio ultrapassam a capacidade antioxidante da célula, desencadeia-se o estresse
oxidativo (ANGELOVA et al., 2005).
Há dois sistemas antioxidantes que são denominados enzimáticos e os não
enzimáticos. O sistema antioxidante não enzimático tem como compostos mais
conhecidos o ascorbato e a glutationa (GSH), além dos alcalóides, flavonóides,
compostos fenólicos entre outros (GRATÃO et al., 2005). Já os mecanismos
enzimáticos são vias enzimáticas especificas que atuam de forma direta na remoção das
EROs, usando essas como substato. Dentro do complexo oxidativo, as enzimas mais
importantes são a Superoxido Dismutase (EC 1.15.1.1), Catalase (EC 1.11.1.6)
27
Ascorbato Peroxidase (EC 1.11.1.11) e Guaiacol Peroxidase (EC 1.11.1.7) (MOREIRA,
2011), as quais serão discutidas em maiores detalhes nos próximos itens.
2.7.1 Superóxide Dismutase (SOD)
A Superóxido Dismutases (SOD) é considerada a primeira linha de defesa contra o
estresse oxidativo, desempenhando papel chave no sistema de defesa por converter a
dismutação de O2-•
em H2O2 e O2 (FRIDOVICH, 1986). Sua reação pode ser observada
abaixo:
O2-•
+ O2-•
+ 2 H + SOD
O2 +
H2O2
As SODs são metaloenzimas que ocorrem em três isoformas, baseando-se no metal
co-fator utilizado pela enzima: Ferro SOD (SOD-Fe), localizada nos cloroplastos,
manganês SOD (SOD-Mn) em mitocôndrias, e cobre-zinco SOD (SOD-Cu/Zn),
presente em cloroplastos, no citosol e possivelmente no espaço extracelular
(SCANDALIOS, 2005).
As isoformas SOD-Fe e SOD-Mn apresentam estrutura proteica semelhante, não
estando relacionadas com a isoforma de SOD-Cu/Zn. A partir de análises filogenéticas
foi observado que SOD-Fe e SOD-Mn podem ter evoluído de um ancestral comum,
enquanto SOD-Cu/Zn evoluiu independentemente. Uma classe de SOD cujo metal co-
fator é o níquel (Ni) foi identificado na fração citosólica de uma bactéria do gênero
Streptomyces (CHEN & LIU, 1996; MATÉS, 2000).
O aumento da produção de SOD relacionado ao déficit hídrico já foi observado em
diversas espécies como tabaco (GUPTA et al., 1993), milho (JIANG & ZHANG,
2002), arroz (REDDY et al., 2004), trigo (SHAO et al., 2005), pinhão manso
(ARCOVERDE et al, 2011), entre outras.
2.7.2 Catalase (CAT)
A CAT é uma enzima tetramérica que contém grupos heme e é encontrada em
todos os organismos vivos. Dependendo da concentração de H2O2, a CAT pode atuar
28
com ações peroxidativas e catalíticas. O Fe do grupo heme interage com o H2O2,
formando peróxido de ferro, rico em O2, denominado de componente I. Em baixas
concentrações de H2O2 (< 1uM) a CAT atua com ações peroxidativas e o componente I
pode ser reduzido por doadores de hidrogênio, como o etanol e ácido ascórbico. Em
elevadas concentrações atua rapidamente de forma catalítica, formando H2O e O2
(SCANDALIOS, 2005). Essas reações podem ser observadas abaixo:
RH2 + H2O2 CAT
R + 2H2O (ação peroxidativa)
2H2O2 CAT
H2O + O2 (ação catalítica)
Em plantas, as CATs assim como as SODs possuem diferentes isoformas, onde
essas são encontradas nos peroxissomos, glioxissomos, citosol e mitocôndrias (PERL-
TREVES & PERL, 2002).
São as principais enzimas de detoxificação do H2O2 em plantas e podem dismutar
diretamente o H2O2 ou oxidar substratos, tais como metanol, etanol, formaldeído e ácido
fórmico. As CATs são classificadas em três classes, onde as CATs da primeira classe
removem o H2O2 produzido durante a fotorespiração em tecidos fotossintéticos; as
pertencentes à segunda classe são produzidas em tecidos vasculares e podem exercer
uma função de lignificação. No entanto, sua exata função biológica permanece
desconhecida, e na terceira classe essas enzimas estão presentes abundantemente em
plantas jovens e sementes, onde a atividade está relacionada à remoção do H2O2
produzido durante a degradação dos ácidos graxos no glioxissoma. Assim, essas
enzimas atuam como um canal de limpeza de H2O2 celular (BREUSEGEM et al. 2001;
RESENDE et al., 2003).
A CAT apresenta uma baixa afinidade com o H2O2. Assim para que ocorra a
limpeza celular é necessária a ligação de duas moléculas dessas EROs, sendo assim a
CAT provavelmente a responsável pela eliminação do excesso das EROs durante o
estresse (GRATÃO et al., 2005).
A atividade da CAT em plantas submetidas ao déficit hídrico responde de varias
maneiras, podendo diminuir, aumentar ou manter sua atividade (ZHANG &
KIRKHAM, 1996; ZGALLAI et al, 2006). As diversas formas de resposta ao déficit
hídrico referente á CAT já foi observado em diversas espécies, como: milho e soja
29
(VASCONCELOS et al, 2009), girassol (CARNEIRO et al, 2011), arroz (CARVEZAN,
2008) entre outras.
2.7.3 Ascorbato Peroxidase (APX)
Assim como as SODs e CATs, as APXs também apresentam diferentes isoformas
que estão presentes no citosol, em membranas dos peroxissomos e em cloroplastos, sendo
que nesse caso, uma isoforma está presente no estroma e outra está associada às membranas
dos tilacóides (MIYAKE & ASADA, 1992). A APX como a CAT converte o H2O2 em
H2O e O2, no entanto, apresentam afinidades diferentes por essa EROs, onde APX
demonstra afinidade micromolar por o H2O2. Já CAT apresenta afinidade milimolar,
sendo a APX aparentemente a responsável pela fina regulação da respostas as EROs,
sendo de extrema importância na proteção contra danos oxidativos em compartimentos
subcelulares onde não há presença da enzima CAT, como por exemplo nos cloroplastos
(ASSADA, 1999; MITTER, 2002).
O ascorbato é utilizado na redução das EROs a partir da APX como doador de
elétrons, onde um intermediário de dois elétrons oxidados pela APX é produzido. Esse
oxida o ascorbato e essa reação resulta na formação de monodeidroascorbato (MDHA) e
H2O. (FOYER & HALLIWELL, 1976; ASADA, 1999).
Foram encontradas respostas do sistema antioxidante referente à APX em diversas
espécies, como em feijão (JEBARA et al., 2005), café (SILVA, 2007), milho (JIANG &
ZHANG, 2002), entre outras.
2.7.4 Guaiacol Peroxidase (GPOX)
O mecanismo de ação da GPOX é semelhante ao do APX, no entanto GPOX tem
afinidade por doadores de elétrons aromáticos como guaiacol e pirogalol Assim como
CAT e APX essa enzima converte o H2O2 em H2O e O2,. No entanto, a principal função
de GPOX não é controlar as EROs, mas produzir compostos oxidativos com funções
fisiológicas. Assim como usam H2O2 como substrato, podem ser consideradas como
antioxidantes e são localizadas apenas no citosol (ASADA, 1999; MOREIRA, 2011 ).
30
Em condições de déficit hídrico pouco se conhece da atividade de GPOX, entretanto há
estudos em trigo (NATHAWAT et al, 2007) e em arroz (BASU et al, 2010) onde se
pode observar o incremento de GPOX sobre condições de déficit hídrico.
2.8 Genética e Biologia Molecular do sistema antioxidante
As espécies vegetais respondem de maneira diferente quando cultivadas em
situações de déficit hídrico. A seleção de plantas tolerantes é considerada a alternativa
mais adequada para aumentar a produção em ambientes com esse tipo de estresse
abiótico, que causa disfunção de proteínas e enzimas, causando diferentes expressões
gênicas. Assim, o primeiro passo nesta abordagem é compreender a expressão dos
mecanismos antioxidantes responsáveis pela percepção do déficit hídrico, para auxiliar
na escolha de acessos candidatos ao programa de melhoramento para se obter cultivares
tolerantes a seca.
Mudanças morfológicas, fisiológicas e de desenvolvimento de plantas apresentam
bases moleculares e genéticas. Portanto, a caracterização de genótipos tolerantes ou
sensíveis à seca é um pré-requisito para seleção e manipulação genética (TURNER,
1997).
Considerando-se a tolerância à seca como uma característica poligênica e difícil de
ser trabalhada no melhoramento genético clássico, poucos programas de melhoramento
conseguem lançar cultivares com essa característica. Dessa maneira, a biologia
molecular assume papel fundamental na identificação pontual de genes envolvidos nas
respostas ao déficit hídrico, o que permitirá futuramente a identificação e a
compreensão de rotas metabólicas envolvidas nas respostas fisiológicas à seca
(BEEVER, 2000).
A expressão fenotípica de plantas submetidas ao déficit hídrico está diretamente
relacionada com a expressão gênica e sua interação com o ambiente. A perda de água
pela célula inicia processos regulatórios, assim o metabolismo celular é ajustado a novas
condições celulares. Respostas como inibição de crescimento e alterações no
desenvolvimento, são decorrentes de mudanças adicionais na expressão gênica (BRAY,
1993).
31
Muitos genes induzidos pelo déficit hídrico provavelmente promovem aumento da
tolerância celular à desidratação, aumento das funções de proteção do citoplasma,
organelas e membranas celulares, alterações do potencial celular osmótico, aumento na
absorção de água, aumento no controle e no acúmulo de íons e maior regulação da
expressão de outros genes (BRAY, 1993, BRAY 1997; BOHNERT, et al., 1995;
SHINOZAKI & YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1997).Para a mamoneira pouco se
conhece sobre o controle genético dessa característica, no entanto para outras culturas o
assunto é mais esclarecido.
Mecanismos de defesa envolvidos no processo de tolerância à seca parecem ser
similares em todo reino vegetal, indicando a ocorrência de etapas comuns nas rotas de
sinalização molecular (KASUGA et al., 2004; LAN et al., 2005). Em espécies modelo
como Arabidopsis e tabaco vem sendo desenvolvidos estudos, em condições de déficit
hídrico ou em outras condições de estresse, para auxiliar na identificação de genes com
função chave nos mecanismos de defesa em várias espécies.
Técnicas moleculares de PCR quantitativo em tempo real (q-PCR), que permite a
quantificação dos níveis de RNA mensageiro (mRNA) de genes de interesse em
diferentes condições (BUSTIN, 2002), têm acelerado consideravelmente a compreensão
dos mecanismos envolvidos e o desenvolvimento de estratégias moleculares para o
aumento da tolerância a estresses (VOLKOV et al., 2003; KASUGA et al., 2004).
Em plantas ainda não são conhecidos os receptores responsáveis pela percepção do
potencial hídrico do solo (BARTELS & SUNKAR, 2005). Alguns estudos vêm sendo
realizados com o objetivo de encontrar genes candidatos a receptores em Arabdopsis
thaliana (REISER et al.; 2003). De acordo com Bartels e Sunkar (2005), a transdução
do sinal ocorre através de cascatas de sinalização que ativam a expressão dos genes
envolvidos na resposta ao estresse oxidativo. As rotas de interação são compostas por
uma rede de interações proteína-proteina, fosforilação e desfoforilação, por meio de
MAPK, fosfatases, Ca +2
e EROs, que levam a ativação de genes induzidos pelo
estresse. Assim os produtos desses genes podem regular a expressão gênica e
transdução de sinais de respostas ou proteger a planta de alterações causadas pelo
estresse (SHINOZAKI & SHINOZAKI, 2005).
Em mamona, estudos com sementes submetidas ao déficit hídrico induzido por
PEG, mostram que os genes MAPK (Mitogen activated protein kinases) e apresentam-
se responsivos ao estresse hídrico (SOUZA, 2012). Grande parte dos trabalhos com
32
déficit hídrico em mamona são realizados com fatores de transcrição DREB
(Dehydration Responsive Element Binding Protein) (SOUZA, 2012). Porém, não há
trabalhos na literatura com genes pertencentes ao sistema antioxidativo.
3 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Diversidade Genética, Centro
Experimental Central do Instituto Agronômico - IAC, no Centro de Recursos Genéticos
Vegetais, na Fazenda Santa Elisa, em Campinas.
3.1 Material Vegetal
Para a análise das atividades enzimáticas do complexo oxidativo e de sua expressão
diferencial, visando identificar acessos tolerantes ao déficit hídrico, foi conduzido um
ensaio biológico com 12 acessos de Ricinus communis L, previamente selecionados a
partir de ensaios de campo visando produtividade, provenientes da Coleção de
Germoplasma de Mamona do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), sendo esses:
TS 39, TS 38, IAC 2028, IAC 80, Caturra MS, TS 25, IAC 226, IAC Guarani, PB 0274
(01-26), PB 07, China Careca e Íris.
3.2 Delineamento experimental para a avaliação da atividade enzimática e
expressão gênica do sistema antioxidante.
3.2.1 Germinação
Foram germinadas 80 sementes de doze acessos de Ricinus communis L. sendo
eles: TS 39, TS 38, IAC 2028, IAC 80 e Caturra MS, TS 25, IAC 226, IAC Guarani,
PB 0274 (01-26), PB 07, China Careca, Íris. Essas foram dispostas em papel de
germinação umidificado com água destilada e colocadas em câmara de germinação
B.O.D., a uma temperatura de 25°C, durante 7 dias, com fotoperiodo de 12 luz e 12
horas escuro, até a ruptura das sementes.
33
As sementes germinadas foram transferidas para caixas de vermiculita e deixadas
na casa de vegetação com irrigação controlada, durante um mês (Figura 3).
Figura 3- Processo de germinação dos acessos selecionados em caixa plásticas
contendo vermiculita.
3.2.2 Determinação concentração de PEG 6000 e tempos de avaliação
Os acessos (China Careca, IAC Guarani, IAC 226, IAC 2028) foram
submetidos a um experimento inicial para determinação da concentração de PEG 6000
e os tempos de avaliação. As concentrações selecionadas foram 0g/L, 5g/L, 10g/L,
15g/L, 20g/L e 25g./L, e os tempos foram 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas e 144
horas.
Os resultados obtidos do efeito do PEG 6000 foram avaliados de acordo com
uma escala de notas estabelecida pelo grupo (Tabela 1).
Tabela 1- Notas e sintomatologia visuais utilizadas para análise das plântulas.
NOTAS SINTOMATOLOGIA VISUAL
0 Plântulas intactas
1 Plântulas com inicio de murchamento
2 Plântulas com murchamento
3 Plântulas com murchamento acentuado
4 Plântulas encarquilhadas
34
3.2.3 Indução ao déficit hídrico
Foram selecionadas 36 plântulas com aproximadamente 15 cm de cada um dos seis
acessos, que foram divididas em controle (H2O destilada) e tratamento (PEG 6000
10g/L). As plântulas foram colocadas em tubos tipo falcon contendo 45 mL de H2O
destilada para o controle e 45 mL de PEG 6000 10g/L para o tratamento. Essa etapa do
experimento foi realizada em uma sala com temperatura controlada a 25°C e
fotoperiodo de 12 horas claro e 12 horas escuro (Figura 4).
Seis plântulas de cada acesso foram coletadas nos tempos 2 horas, 8 horas, 24
horas e 48 horas, tanto para o controle quanto para o tratamento. A região foliar das
48 plântulas de cada acesso foram excisadas e congeladas a -80°C para análise de
peroxidação lipídica, extração de enzimas, proteínas, RNA, síntese de cDNA e q-
PCR.
Figura 4 – Plântulas de mamona submetidas ao déficit hídrico por PEG 6000 10 g/L .
3.2.4 Parâmetros avaliados
A cada tempo de avaliação (2 horas, 8 horas , 24 horas e 48 horas), as plântulas,
tanto de controle quanto do tratamento, foram submetidas a avaliação fenótipica e de
peroxidação lipídica. Para as avaliações de condutância estomática o tempo de
avaliação foi de 2 horas, 8 horas e 24 horas, após essa avaliação as folhas eram
excisadas e armazenadas a -80°C para extração de enzimas, proteinas, RNA, sintese de
cDNA e q-PCR.
35
3.2.5 Caracteristica fenótipica das plântulas
A caracteristica fenótipica das plântulas foi determinada a partir da escala de notas
já mencionada anteriormente, sendo avaliadas as plântulas controles e as submetidas ao
tratamento em apenas em 24 horas.
3.2.6 Condutância estomática (gs)
Para avaliação da (gs) foi utilizado um Porômetro (Type AP4 – Delta T Devices)
(Figura 5), em estado de equilíbrio dinâmico. As leituras foram realizadas nas faces
adaxial das folhas nos tempos de 2 horas, 8 horas e 24 horas. Para a determinação da
condutância estomática foi realizada a leitura em cada plântula de cada parcela, e
posteriormente foi calculada a média.
Figura 5- Medição da condutividade estomática em plântulas de mamona, com auxilio
de Porômetro (Type AP4 – Delta T Devices) nos diferentes períodos de avaliação.
3.3 Atividade enzimática do sistema antioxidante
Foram usados os tempos de 2 horas, 8 horas e 24 horas para as analises a seguir.
3.3.1 Peroxidação lipídica
A peroxidação de lipídios foi avaliada através da produção de metabólitos reativos
ao ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), principalmente o malondialdeído (MDA), seguindo o
36
método de Heath & Packer (1968) com modificações. Assim 200 mg do material
vegetal foi macerado em 3 mL de ácido tricloroacético (TCA) e 0,1% ácido
tricloroacético (TCA) a 0,1%. Após a homogeneização, as amostras foram centrifugadas
a 12000 g por 5 minutos. Ao sobrenadante (500 ul) foi adicionado 1,5 mL de TCA 20%
e TBA 0,5%. A mistura foi colocada em banho-maria por 30 min, a 95 °C e resfriada
em gelo na sequência. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas novamente por
10 min a 12.000 g, com o objetivo de separar resíduos que podiam ter permanecido ou
terem sido formados durante o aquecimento das amostras. As leituras foram realizadas
em espectrofotômetro (Thermo Spectronic – Genesys 10 uv), a 535 e 600 nm. A
quantidade de MDA foi expressa em mM de MDA g-1
de tecido fresco, usando um
coeficiente de extinção da reação de 155 mM cm-1.
3.3.2 Extração de Proteínas
Para a obtenção do extrato das enzimas catalase, ascorbato peroxidase e guaiacol
peroxidase foi macerado em um almofariz resfriado, 200 mg do material vegetal
juntamente com 2,4 mL de Tampão Fosfato de Potassio 100mM. O extrato foi
transferido para um tubo tipo eppendorf de 1,5 mL e centrifugado a 14000 rpm a 4° C
durante 10 minutos (AMAKO et al., 1994; COSTA et al., 2005). Para a obtenção do
extrato da enzima superóxido dismutase, foi macerado 200 mg do material vegetal em
nitrogênio líquido com adição de Tampão Fosfato de Potássio 50 mM,contendo 0.01
mM de EDTA e 1% de PVPP, e centrifugado a 15000 rpm a 4°C durante 10 minutos
(GUPTA et al., 1993).
O sobrenadante foi coletado, dividido em alíquotas e estocado em freezer -80 ºC até
o momento da determinação de proteínas totais e das análises enzimáticas, enquanto se
descartou o precipitado.
3.3.3 Determinação de proteína total solúvel
A concentração das proteínas totais nos extratos foi determinada segundo o método
de BRADFORD (1976), utilizando-se o BSA (“bovine serum albumin”) como padrão.
37
Foi utilizado o espectrofotômetro (Thermo Spectronic – Genesys 10 uv), com leitura a
595 nm. Os valores foram determinados utilizando-se uma curva padrão de
concentrações conhecidas de BSA através de regressão linear. O resultado da
quantificação foi expressa em mg mL-1
.
3.3.4 Catalase (CAT)
A atividade de CAT foi determinada por espectrofotometria, de acordo com o
método de Costa et al (2005), com algumas modificações. A atividade da CAT foi
determinada em solução contendo 100 ul de extrato enzimático (11,47 mg/mL de
proteína), 2000 ul de tampão fosfato de potássio 100 mM e 1,5 ul de H2O2 30%, onde a
primeira leitura foi realizada sem a adição de H2O2 (branco). Após essa etapa, foi
adicionado H2O2, para a leitura da atividade da enzima, observando o decréscimo de
H2O2 por 1 min em intervalos de 10 s, através das alterações na aborbância a 240 nm.
Os resultados foram expressos em μmol min-1
mg-1
de proteína.
Foi considerado que o acréscimo de uma unidade de absorbância é equivalente a
uma unidade de atividade (UA). As atividades do extrato foram determinadas pelo
cálculo da quantidade de extrato que reduz a leitura de absorbância em uma UA e
expressas em umol min-1
mg-1
de proteína, usando o coeficiente de extinção de 39,4
mM cm-1
.
3.3.5 Ascorbato Peroxidase (APX)
A atividade de APX foi determinada por espectrofotometria, de acordo com o
método de AMAKO et al (1994), com algumas modificações. A presença da APX no
extrato bruto diminui a concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) do meio, pela
redução do ácido ascórbico fornecido. A APX foi determinada em solução contendo
com a adição de 100 ul de extrato enzimático (11,47 mg/mL de proteína), 2900 ul de
tampão fosfato de potássio 100 mM, 30 ul de EDTA 10 mM, 50 ul H2O2 100mM e 30
ul de ácido ascórbico 50 mM, onde a primeira leitura foi realizada sem a adição de
ácido ascorbico, para a leitura do branco, após essa etapa foi adicionado ácido
38
ascorbico para a leitura da atividade enzimática do ascorbato peroxidase, observando o
decréscimo de ácido ascórbico por 1 min em intervalos de 10 s, através das alterações
na absorbância á 290nm. Os resultados foram expressos em μmol min-1
mg-1
de
proteína.
Foi considerado que o decréscimo de uma unidade de absorbância é equivalente a
uma unidade de atividade (UA). As atividades do extrato foram determinadas pelo
cálculo da quantidade de extrato que reduz a leitura de absorbância em uma UA e
expressas em umol min-1
mg-1
de proteína, usando o coeficiente de extinção de 2,8 mM
cm-1
.
3.3.6 Guaiacol Peroxidase (GPOX)
A atividade de GPOX foi determinada por espectrofotometria, de acordo com o
método de COSTA et al (2005), com algumas modificações. A GPOX foi determinada
em solução contendo 100 ul de extrato enzimático (5,73 mg/mL de proteína), 2900 ul
de tampão fosfato de potássio 100 mM, 15 ul de H2O2 2% e 15 ul de guaicol 0,05 %
(v/v), onde a primeira leitura foi realizada sem a adição de guaicol, para a leitura do
branco, após essa etapa foi adicionado guaicol para a leitura da atividade enzimática da
guaicol peróxidase, observando o acréscimo de guaicol por 1 min em intervalos de 10
s, através das alterações na absorbância á 470nm. Os resultados foram expressos em
μmol min-1
mg-1
de proteína.
Foi considerado que o decréscimo de uma unidade de absorbância é equivalente a
uma unidade de atividade (UA). As atividades do extrato foram determinadas pelo
cálculo da quantidade de extrato que reduz a leitura de absorbância em uma UA e
expressas em umol min-1
mg-1
de proteína, usando o coeficiente de extinção de 26,6
mM cm-1
.
3.3.7 Superoxide Dismutase (SOD)
A atividade de SOD foi determinada por espectrofotometria, de acordo com o
método de GUPTA et al (1993), com algumas modificações. A SOD foi determinada
em solução contendo 20 ul de extrato enzimático (1,43 mg/mL de proteína), 700 ul de
39
tampão fosfato de potassio 50 mM, 40 ul de metionina 500 mM, 30 ul de azul de
nitratetrazólio (NTB) 1mM, 50 ul triton X-100 [0,5%] e 176 ul riboflavina, onde uma
cubeta contendo os reagentes foi embrulhada em papel alumínio por 10 min para
leitura do branco, e a outra cubeta contendo a mistura reacional foi condicionada a 10
cm da luz flourescente por 10 minutos para a leitura da atividade enzimática da
superóxido dismutase, observando o acréscimo da atividade após a presenca da luz
flourescente.
Nesse ensaio, 1U (unidade) de SOD é igual a quantidade de enzima necessária
para inibir em 50% a fotorredução de NBT e a atividade de SOD será expressa em U de
SOD g-1
de massa fresca.
3.4 Análise estatistica
A análise de variância (ANOVA) dos dados fisiológicos e bioquímicos foi feita
usando o programa R (R Development Core Team, 2011) comparando as diferenças
entre os tratamentos e controles, e as diferenças dos valores do tratamento menos os
valores do controle (∆= Tratamento-Controle). As diferenças entre as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey (p<0.05).
3.5 Isolamento de RNA e síntese de DNA complementar
3.5.1 Extração de RNA
O RNA total foi extraído a partir de 50 mg de folhas congeladas a -80 °C usando o
reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), de acordo com as instruções do
fabricante. A concentração de RNA nas amostras foram avaliadas através de
espectrofotómetro Nano-Drop (NanoVue™ Plus) (GE Healthcare). A contaminação por
fenol / hidratos de carbono e proteínas foi determinado com base nos índices de OD
A260/A230 e A260/A280, respectivamente. Para considerar as amostras livres de
contaminações esses valores devem estar entre 1,8 e 2,1 (PORTO et al., 2010). A fim de
40
verificar a integridade do RNA, as amostras foram separadas por electroforese num gel
de agarose 1% corado com Gel Red (Biotium, Hayward, CA) e visualizadas com um
HP AlphaImager (Alpha Innotech Corporation, Santa Clara, CA).
Os RNA totais foram tratados com 1ul Deoxyribonuclase I, Amplification
Grade (DNase) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), segundo recomendações do
fabricante, para a degradação do DNA genômico contaminante (volume final de cada
amostra= 10 μL).
3.5.2 Purificação do RNA
Para a purificação do RNA extraído, foi utilizado o GeneJET™ RNA
Purification Kit (Thermo Scientific) com protocolo específico do fabricante para plantas
e adaptado pelo nosso laboratório de acordo com testes realizados. O RNA limpo foi
ressuspendido em 20 μL de água livre de nuclease.
3.5.3 Síntese de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizado a partir de 8 μg do RNA total tratado
utilizando a enzima transcriptase reversa RevertAid H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit (Thermo Scientific) for q-PCR (volume total da amostra= 20μL), segundo
recomendação do fabricante.
Os cDNAs não foram quantificados, mas suas concentrações foram baseadas na
quantidade inicial de RNA utilizada nas sínteses. Os cDNAs foram diluídos em solução
estoque de 5 ug/μL.
3.6 Minerações de Dados e Desenho de Oligonucleotídeos Iniciadores
3.6.1 Busca de sequências
Sequências de genes descritas na literatura relacionados ao sistema antioxidativo
foram buscadas na base de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) por
41
palavras-chaves: Ricinus communis catalase, Ricinus communis superoxide dismutase,
Ricinus communis ascorbate peroxidase, Ricinus communis peroxidase, Ricinus
communis actin e Ricinus communis ubiquitin.
3.6.2 Desenho de oligonucleotídios iniciadores
As sequências dos contigs selecionados pela mineração de dados foram
utilizadas para o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos por meio do
software PRIMER EXPRESS v 3.0 (Applied Biosystems), de acordo com o tutorial do
fabricante.
Os oligonucleotídeos iniciadores sintetizados foram selecionados e analisados
pela ausência de formação de dímeros, cross-dímeros, harpins e penalidades descritas
pelo programa, temperatura de anelamento (59 á 60º C), tamanho de amplicon (entre 50
e 120) e região de anelamento do oligonucleotídeo iniciador.
3.6.3 Teste de eficiência dos oligonucleotídeos iniciadores
Todos os oligonucleotídeos iniciadores utilizados (inclusive os normalizadores)
foram validados, em triplicata, para confirmar sua eficiência. As curvas de calibração
para cada normalizador foram geradas utilizando diluições em série de cDNA (pool
contendo três amostras aleatórias) em água para 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312, 0,156 ng
e a eficiência de amplificação calculada por E= (10–1/slope
–1) × 100.
3.6.4 Reações de q-PCR
O volume total das reações de q-PCR foi de 20 μL, sendo 10 μL de reagente
Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x), ROX Solution provided (Thermo
Scientific), 1,0 μL de oligonucleotídeo específico direto (500 nM), 1 μL de
oligonucleotídeo especifico inverso (500 nM), 7,96 μL de água tratada com DEPC e 1
μL de cDNA. As reações foram preparadas em triplicata técnica e triplicatas biológicas,
adicionadas em placas ópticas MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with
42
Barcode (0.1 mL) (Applied Biosystems) e realizadas em amplificador modelo 7500
Fast Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
As condições de amplificação foram de 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min,
40 ciclos a 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min. Para verificar a especificidade de
amplificação foi adicionado um estágio de curva de dissociação. Em cada placa, genes
normalizadores (actina e ubiquitina) e um controle negativo foram incluídos.
3.3.5 Análise de expressão gênica
A determinação dos níveis de expressão dos genes alvos foi realizada pela
quantificação relativa (QR) utilizando a expressão 2-ΔΔC
T (LIVAK & SCHMITTGEN,
2001). Para cada tratamento foi detectado o valor de Ct (“Cycle threshold”),
determinados utilizando o software SDS (Applied Biosystems, EUA), tanto para o gene
alvo quanto para os normalizadores. Este valor representa o ponto em que o sinal de
amplificação é detectado. O valor do Ct do gene alvo é subtraído do valor do Ct do
normalizador, para ajustar a reação. Obtem-se então o valor de ΔCt. O valor de ΔCt dos
tratamentos é subtraído do valor do ΔCt da amostra controle (calibrador), tendo-se o
valor de ΔΔCt. Este valor é utilizado na fórmula do nível de expressão, onde o número
2 representa a somatória da eficiência do gene alvo e do controle endógeno,
considerando que ambos os genes possuem 100% de eficiência.
Valores de expressão diferencial foram plotadas em um Heat map construído
utilizando o programa JColorGrid (JOACHIMIAK et al., 2006). As diferenças nos
dados ΔΔCt foram testadas por Análise de Variância Fatorial (ANOVA) utilizando
BDC e as diferenças de médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0.05) do
programa R (R Development Core Team, 2011).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Germinação
Após 30 dias, apenas os acessos IAC 2028, IAC 80, IAC 226, IAC Guarani, PB 07
e China Careca, somaram o número mínimo de plântulas necessário com 15 cm de
43
altura. Sendo assim estes acessos foram selecionados para a continuação do trabalho
(Figura 6).
Figura 6 – Germinação dos acessos de mamona após 30 dias em casa de vegetação com
irrigação controlada.
4.2 Determinações da concentração de PEG 6000 e dos tempos de avaliação
A concentração de 10g/L de PEG 6000 foi selecionada para causar o déficit hídrico
nas plântulas, por restringir a disponibilidade de água, mas não ao ponto de danificar os
tecidos vegetais, assim como o período de 24 horas que foi determinado como tempo
máximo, pois os demais tempos já apresentavam degradação do material vegetal,
impossibilitando seu uso nas etapas seguintes do experimento (Figura 7).
Figura 7- Plântulas de mamona submetidas ao controle e tratamento (PEG 6000 10g/L),
durante 48 horas. A) 2 horas, B) 8 horas, C) 24 horas e D) 48 horas. (Acesso PB 07).
44
4.3 Caracteristica fenótipica das plântulas
A avaliação fenótipoca foi realizada nos quatros tempos 2 horas, 8 horas,24 horas e
48 horas, onde em todos os tempos de avaliação o acesso PB 07 se diferenciou
significativamente dos outros acessos, apresentando caracteristicas mais evidentes de
degradação foliar (Tabela 2).
Tabela 2 – Teste de médias referente á caracterização fenotípica dos seis acessos de
mamona submetidas à PEG 10g/ L nos quatros tempos de avaliação.
ACESSOS MÉDIAS 5%
PB 07 1,75 a
IAC 226 1,083 ab
IAC 2028 0,9167 b
IAC Guarani 0,8333 b
IAC 80 0,6667 b
China Careca 0,5833 b *TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras iguais não diferem entre si.
Foi observado que, entre os tempos houve diferença significativa, onde as plântulas
em 48 horas apresentaram maiores médias, mostrando assim que durante esse tempo
estavam submetidas a um déficit hídrico mais intenso (Tabela 3).
Tabela 3 – Teste de média referente á caracterização fenotípica entre os 4 tempos de
avaliação de plântulas de mamona submetidas a PEG 10g/L.
TEMPO MÉDIAS 5%
48 horas 1,778 a
24 horas 1,167 b
8 horas 0,6111 bc
2 horas 0,3333 c *TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
O tempo máximo de avaliação (48 horas) apresentou intensa degradação dos
tecidos foliares (Figura 8), dificultando a extração de enzimas e RNA. Portanto foi
determinado o tempo de 24 horas como o tempo máximo nas posteriores avaliações.
45
Figura 8 - Plântulas de Ricinus communis L, submetido ao tratamento (PEG 6000
10g/L) , A) 24 horas, B) 48 horas.
No entanto, o tempo máximo de avaliação (24 horas), foi suficiente para observar
os primeiros sinais enzimáticos e de expressão gênica nas plântulas submetidas ao
déficit hídrico. Ainda que o tempo de 24 horas estabelecido como tempo máximo de
avaliação no presente trabalho foi reconhecido por causar déficit hídrico leve, para a
condução dos experimentos propostos, foi importante que as folhas utilizadas para
extração de proteínas e RNA estivessem intactas, sem comprometimento de seus
tecidos.
4.4 Condutância estomática (gs)
No presente trabalho foram observadas diferenças significativas entre os
tratamentos e os controles nos três tempos de avaliação, onde as plântulas tratamentos
apresentaram maior quantidade de estômatos fechados, diferente das plântulas
controles, que apresentaram maior quantidade de estômatos abertos (Figura 9).
A redução da condutância estomática afeta uma série de interações planta-
ambiente, uma vez que os estômatos são os pontos de controle de vapor d’água e
balanço de energia entre o vegetal e o ambiente. Embora essa redução na taxa de perda
de água possa representar uma vantagem imediata para prevenir a desidratação do
tecido, ela, no entanto, pode afetar diretamente o balanço de calor sensível sobre o
vegetal e, ainda, a absorção de CO2 e, consequentemente, a taxa fotossintética
(BRUNINI & CARDOSO, 1998).
46
Figura 9 - Diferença da condutância estomática entre as plântulas de mamona controles
e tratamentos. Tukey (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
Apenas no tempo de 24 horas foi observado diferenças significativas entre os
acessos avaliados (Tabela 4). O acesso PB 07 foi o único que apresentou maior
sensibilidade ao tratamento, se comparado aos outros acessos. Assim o acesso PB 07
quando submetido a défict hídrico, tende a apresentar maior quantidade de estomatos
fechados. De acordo com TAIZ & ZEIGER (2009) a eficiência da água pode aumentar
a medida que os estômatos fecham durante os estádios iniciais do déficit hídrico, assim
o fechamento dos estômatos diminui a perda de água por evapotranspiração. Esse
resultado corrobora ainda com informações fornecidas por HECKENBERGER et al.
(1998) ao observarem que as plântulas de mamona submetidas a deficiência hídrica
sofreram redução nos valores de condutância estomática em decorrência de uma
elevação na densidade de estômatos naqueles tratamentos cultivados sob estresse
hídrico.
O acesso IAC Guarani, que apresentou maiores valores de condutância estomática
(Tabela 4), também apresentou altos valores de condutância estomática em estudos de
trocas gasosas em diferentes condições de irrigação em campo realizado por FREITAS
et al (2011).
47
Tabela 4 – Teste de média da diferença de condutância estomática (∆ = tratamento –
controle) no tempo de 24 horas, nos 6 acessos de mamona estudados.
ACESSOS MÉDIAS (mmol.m-2
.s-1
) 5%
IAC Guarani 195,3 a
China Careca 189,4 a
IAC 226 187,2 a
IAC 2028 165,5 a
IAC 80 153,3 a
PB 07 4,0 b *TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
4.5 Peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica, expressa através da quantificação de malondialdeído
(MDA), demonstrou que nos tempos avaliados (2 horas, 8 horas, 24 horas e 48 horas),
não houve diferença significativa entre os acessos, assim todos apresentavam
peroxidação lipídica das membranas, comprometendo as estruturas e funcionamento
celular dos acessos de forma semelhante. Diferenças de níveis de MDA foram
observadas em relação aos tempos de avaliação. O tempo de 48 horas apresentou maior
nível de MDA (0,4052 mM MDA g-1
massa fresca) enquanto que os outros tempos de
avaliação não se diferenciaram (tabela 5). No entanto, folhas de plântulas submetidas ao
tratamento com PEG 6000 10 g/L durante 48 horas, não foram utilizadas nas análises de
atividade enzimática, expressão gênica, pois apresentavam estado de degradação
avançado, ficando inviável sua utilização. Diante disso, não foi possível acompanhar o
estágio inicial de peroxidação apresentada pelos acessos.
Tabela 5 – Médias dos tempos de avaliação (2, 8, 24 e 48 horas) expressas através da
quantificação de malondialdeído (MDA).
*TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
TEMPO MÉDIAS
(MDA g-1
massa fresca)
5%
48 horas 0,4052 a
24 horas 0,2111 b
8 horas 0,1459 b
2 horas 0,1144 b
48
De acordo com TURKAN et al (2004), quanto menores as concentrações de MDA,
melhor o funcionamento do sistema antioxidante contra as EROs. No presente trabalho
não foi possível identificar qual dos acessos obteve menores níveis de MDA, visto que
em nenhum dos tempos de avaliação os acessos se diferenciaram entre si.
Resultados onde menores aumentos nos níveis de MDA relacionados com sistema
antioxidativo mais eficiente foram observados por TURKAN et al (2004) em dois
cultivares de feijão, submetidos a déficit hídrico induzido por PEG, em variedades de
cana-de-açúcar, contidos a diferentes regimes de restrição hídrica CIA (2010). Sob
estresse salino foi observada essa correlação, onde maiores aumentos nos níveis de
MDA correspondem a um sistema antioxidante mais eficiente em tomates
(Lycopersicum pennelliie) e beterraba selvagem (Beta maritima) SHALATA et al
(2001) e BOR et al (2003), evidenciaram que o aumento da eficiência do sistema
antioxidante pode ter contribuído para manter o potencial redox e evitar danos à célula.
4.6 Enzimas do sistema antioxidativo
Entre os seis acessos avaliados no presente trabalho, foi observado que as plântulas
submetidas ao tratamento apresentaram maior atividade enzimática, quando comparadas
as plântulas controle, confirmando que as plântulas submetidas ao déficit hídrico
causado por PEG produziram mais enzimas do complexo antioxidante do que as plantas
controle (Tabela 6). Enzimas antioxidantes como CAT, GPOX, APX e SOD em
situações de estresse aumentam sua atividade (GUETA-DAHAN et al., 1997;
HERNANDEZ et al., 1995). Esse mesmo aumento da atividade vem sendo observado
em espécies tolerantes do que nas espécies sensíveis ao estresse oxidativo (SHALATA
et al., 2001; BOR et al., 2003).
49
Tabela 6 – Médias da atividade enzimática entre as plântulas de mamona controles e
tratamentos.
ENZIMAS TRATAMENTOS MÉDIAS 5%
CAT PEG 0,001301 a
H2O 0,001155 b
GPOX PEG 0,039197 a
H2O 0,028665 b
APX PEG 0,338096 a
H2O 0,24283 b
*TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
Para as enzimas CAT e GPOX, foram observadas diferenças significativas da
atividade enzimática durante os três tempos de avaliações (∆ = tratamento – controle),
onde o tempo de 24 horas foi que apresentou maior atividade em todos os acessos
avaliados. Já para a enzima APX o tempo de 24 horas não apresentou maior atividade
enzimática. Foi observada maior atividade no tempo de 8 horas, entretanto não houve
diferença significativa entre a atividade da enzima APX no tempo de 2 horas e 8 horas.
Para SOD não houve diferença significativa entre os tempos de avaliações, indicando
que durante os três tempos teve o mesmo perfil de produção de SOD, nos seis acessos
avaliados (Tabela 7).
Tabela 7 – Teste de média da diferença da atividade enzimática média dos seis acessos
avaliados (∆ = tratamento – controle) nos tempos de 2 horas, 8 horas e 24 horas.
TEMPO ENZIMA MEDIAS 5%
2 HORAS CAT 0,00073 ab
8 HORAS CAT 0,000524 b
24 HORAS CAT 0,000869 a
2 HORAS GPX 0,019452 b
8 HORAS GPX 0,019644 b
24 HORAS GPX 0,036742 a
2HORAS APX 0,169274 ab
8 HORAS APX 0,213207 a
24 HORAS APX 0,135795 b
2 HORAS SOD 2,481576 a
8HORAS SOD 2,334083 a
24 HORAS SOD 2,467876 a *TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
50
Apenas no tempo de avaliação de 24 horas as enzimas CAT e GPOX diferenciaram
os acessos (Tabela 8), nos outros tempos de avaliação não foi possível observar
diferenças significativas entre os acessos. A enzima APX não diferenciou os acessos em
nenhum dos três tempos de avaliação. Assim, podemos concluir que o comportamento
da atividade de APX ocorre da mesma maneira nos seis acessos, independentemente do
tempo de avaliação. Podemos observar que, no que se refere às enzimas que convertem
H2O2 em H2O, a APX diminui quando comparada a CAT e GPOX que teve um
aumento de sua atividade durante os tempos de avaliação (Tabela 7). Em trabalhos
realizados com feijão, submetido a estresse salino, foi observado à diminuição de APX
e o aumento da atividade de outras enzimas pertencentes ao sistema antioxidante
(JEBARA et al., 2005).
A enzima SOD não mostrou diferença entre os tempos de avaliação, no entanto, nos
três tempos avaliados houve diferenciação entre os acessos, sugerindo que, a atividade
de SOD nos três tempos avaliados foi intensa e constante devido o radical superóxido
produzido sob condições de estresse ser tóxico, havendo uma meia-vida de menos de
um segundo e, é geralmente dismutado de forma rápida pela SOD a H2O2, um produto
relativamente estável que pode ser detoxificado por catalases e peroxidases. Estas
metaloenzimas constituem numa importante defesa primária das células contra os
radicais superóxido gerados sob condições de estresse. Assim, o aumento na atividade
da SOD é conhecido por conferir tolerância ao estresse oxidativo (JALEEL et al., 2007).
A produção de CAT em 24 horas de déficit hídrico foi maior em China Careca. Já o
acesso PB 07 apresentou menor produção em relação a esta enzima. Os outros cultivares
analisados não se diferenciaram significativamente de China Careca e PB 07 (Tabela 8).
Durante a avaliação de 24 horas, foi observado maior produção de CAT para o
acesso China Careca, no entanto esse mesmo acesso teve menor produção de GPOX nas
mesmas condições. O acesso PB 07 e IAC 2028 mostraram maior produção de GPOX,
os acessos IAC 80, IAC Guarani e China Careca apresentaram menor produção desta
enzima durante 24 horas de déficit hídrico. A queda da atividade de uma ou mais
enzimas, acompanhada do acréscimo de outra, é esperado no mecanismo de resposta ao
estresse hídrico. AZEVEDO-NETO et al. (2010) relataram um considerável aumento da
atividade de CAT em amendoim em condições de déficit hídrico nos genótipos mais
sensíveis, enquanto a atividade de APX não variou.
51
Portanto de acordo com WILLEKENS et al (1997), o aumento da CAT pode ser um
indício de fotorrespiração, já que a CAT está localizada principalmente nos
peroxissomos. Em trigo, atividade de APX atingiu níveis elevados, enquanto as
atividades de CAT e SOD caíram (FAN et al., 2009). O equilíbrio das atividades de
CAT, SOD e APX são essenciais para se determinar o nível fixo de O2-
e H2O2
(BOWLER et al., 1991).
Tabela 8 – Teste de média das atividades enzimáticas de CAT, GPOX e SOD entre os
seis acessos avaliados (∆ = tratamento – controle) no tempo de 24 horas.
ENZIMA ACESSOS MÉDIA 5%
CAT
China Careca 0,0013 a
IAC 80 0,0011 ab
IAC 226 0,001 ab
IAC 2028 0,0008 ab
IAC Guarani 0,0006 ab
PB 07 0,0002 b
GPOX
IAC 2028 0,0745 a
PB 07 0,0692 a
IAC 226 0,0297 ab
IAC 80 0,0196 b
IAC Guarani 0,0135 b
China Careca 0,0135 b
SOD
China Careca 6,314000 a
PB 07 4,356000 ab
IAC 2028 4,306000 ab
IAC 226 3,960000 ab
IAC 80 3,359000 ab
IAC Guarani 1,498000 b *TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
Em 24 horas de déficit hídrico foi observado que o acesso China Careca apresentou
maior produção das enzimas CAT e SOD, no entanto apresentou menor produção de
GPOX quando comparados com os outros acessos. Já o acesso PB 07 apresentou menor
produção de CAT e maior produção de GPOX. O acesso IAC 2028 mostrou maior
produção de GPOX, visto que para as outras enzimas os mesmos não tiveram diferença
significativa entre os acessos com maior e menor produção de enzimas (Tabela 8).
52
Houve uma maior produção da atividade de CAT no acesso China Careca, se
comparado com o acesso PB 07, o qual apresentou menor produção de atividade para
essa enzima. Já os cultivares (IAC 226, IAC 2028, IAC Guarani e IAC 80) não se
diferenciaram dos dois grupos contrastantes. O mesmo foi observado para a produção
da enzima GPOX, onde PB 07 mostrou maior produção de GPOX e China Careca que
menor produção dessa enzima, já os cultivares não se diferenciaram dos dois grupos
contrastantes (Tabela 8) e (Figura 10). O decréscimo na atividade da CAT, promove
acúmulo de H2O2, aumentando a peroxidação de lipídios e danos às membranas de
plantas sob estresse. Desta forma, o aumento na atividade das enzimas do sistema
antioxidante é importante para eliminar o acúmulo de H2O2 e assim reduzir a
peroxidação de lipídios (VAIDYANATHAN et al., 2003; EYIDOGAN & OZ, 2007).
Figura 10 - Atividade das enzimas do sistema antioxidante nos acessos de mamona
induzidos ao déficit hídrico.
Os acessos IAC Guarani, IAC 226, IAC 2028 e IAC 80, por serem cultivares, não
apresentaram diferenças significativas, sendo que estes possuem um perfil genético
similar por terem sido selecionados para as mesmas características. VENANCIO (2013)
observou essa similaridade genética através de estudos de diversidade genética de
acessos de mamona por meio de marcadores moleculares microssatelites, onde os
acessos IAC 2028 e IAC 80 apresentaram similaridade igual a 100%, IAC 2028 e IAC
80 comparados ao IAC 226 apresentaram similaridade igual a 65% e os acessos IAC
2028, IAC 80 e IAC 226 apresentaram similaridade igual a 57%, quando comparados
com o acesso IAC Guarani. O acesso PB 07 está agrupado no grupo dos cultivares, o
qual apresenta apenas 42% de similaridade em relação aos cultivares. O acesso China
Careca foi agrupado geneticamente distante do grupo, o qual se encontram PB 07 e os
cultivares (Figura 11).
53
Figura 11 - Dendrograma obtido pelo método aglomerativo UPGMA, coeficiente de
similaridade de Jaccard para os acessos de mamona (Ricinus communis L.) realizado a
partir de dados obtidos (VENANCIO, 2013).
4.7 Isolamentos de RNA e síntese de DNA complementar
O RNA total extraído a partir de folhas das amostras foi submetido à eletroforese
em gel de agarose [1%] para verificação da integridade e qualidade das mesmas. Onde
foi observado bandas correspondentes às subunidades 28S e 18S do RNA ribossômico
das amostras, tornando possível comprovar a integridade ou baixo nível de degradação
do RNA extraído (Figura 12).
Figura 12 - Eletroforese em gel de agarose [1%] para verificação da integridade das
amostras de RNA total extraído de folhas de mamona, observando as bandas 28S e 18S.
Os valores das razões A260/280 e A260/A230 das amostras analisadas estavam entre 1,8
e 2,0, como desejado, indicando que as amostras estavam livres de contaminação por
54
proteínas e polissacarídeos ou polifenóis (LOGEMANN et al., 1987; MANNING,
1991).
4.8 Desenhos de oligonucleotídeos iniciadores
Dentre as sequências pesquisadas e relacionadas com tolerância ao déficit hídrico,
oito foram selecionadas para as reações de q-PCR, as quais foram usadas para o
desenho de oligonucleotídeos iniciadores. Os oligonucleotídeos iniciadores escolhidos
possuíam características desejáveis, como: temperatura de anelamento (entre 59 e
60°C), não formação de hairpin e cross dimer, bem como o tamanho de amplicon
(Tabela 9).
Tabela 9 - Identificação, sequências direita (D) e reversa (R), tamanho, temperatura de
anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores desenhados para q-PCR, a partir das
sequências obtidas (NCBI).
Oligonucleotídios
iniciadores
ID*
Sequência (5’-3’) Tamanho
(b)
Ta %
G
C
CAT
(X59383.1)
D:CCCAGGAGCTGCGCACTAT
R:GCTAGCTTCTGACCCAGGGATT
19
22
64
63
63
55
APX
(T15225.1)
D:AACTCAGGGTCTTCCAACAAAGC
R:AACTCAGGGTCTTCCAACAAAGC
23
23
63
63
48
44
GPOX
(XM002523782.1)
D: TGCTCCCTCTTCCAAAACCA
R: TCAACTTGGAGGATCCCTTTCA
20
22
63
63
50
46
SOD- Cu/Zn
(T15128.1)
D: AAACCTGTCAAGCCAACCCATA
R: TGAACTGCTTCTCCAGGAATCC
22
22
63
63
46
50
SOD –Fe
(XM002520869.1)
D: AAACCCCTTTCCCGAATTCA
R: TGCATGGATTCCCAAAAGAAGT
20
22
63
63
45
41
SD –Mn
(XM002520810.1)
D:GGGCGACTCTTCTTCTGTTGTTAA
R: TTGATATGACCTCCTCCGTTGAA
24
23
63
63
46
44
ACT
(AY360221.1)
D: GCCGACGCCGAGGATATT
R: CCAGCCTTCACCATTCCAGTT
18
21
57,2
57,6
58
64
UBQ
(XM002516651.1)
D:TTCTCATGTGAGGGACTATGGTGTT
R:CTGAAAGTCTGAGAACCAAATGCA
25
24
57,9
56,2
68
68
* Acesso da sequência presente no NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)
55
4.9 Análise dos dados q-PCR
4.9.1 Teste de eficiência
Para a estimativa da eficiência de amplificação (E) foram utilizadas curvas de
diluições para cada um dos oligonucleotídeos iniciadores, que foram geradas utilizando
diluições constituídas de pools de cDNA, contendo amostras escolhidas aleatoriamente
de China Careca, IAC 2028 e PB 07, as amostras foram diluídas em água para as
respectivas concentrações: 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,312 e 0,156 ng. Em função desses
resultados obtidos pela reação de q-PCR, foram obtidos os valores de Ct, relativos á
concentração de cDNA de cada uma das amostras (Figura 13).
Figura 13 - Curvas de amplificação das diluições seriadas com sete concentrações de
cDNA para análise de eficiência dos normalizadores ACT (A) e UBQ (B) e dos genes
alvos CAT (C), APX (D), GPOX (E), SOD Cu/Zn (F), SOD Fe (G) e SOD Mn (H)
56
Foi observado apenas para o gene candidato GPOX valores altos de Cts, onde
apenas 4 de 21 amostras amplificaram, sugerindo que para esse gene candidato havia
pouca concentração de mRNA nas amostras (Figura 13 – E).
A partir das informações pela curva de amplificação do gene GPOX, entendemos
que o aparecimento de quatro picos na curva de dissociação pode ser devido à
inespecificidade dos oligonucleotídeos iniciadores de GPOX (Figura 14 – E). A
possibilidade de contaminação da amostra é nula, uma vez que foi observado um pico
por amostra, bem como foi descartada a possibilidade de contaminação dos
componentes da reação de q-PCR, considerando que não houve a amplificação do
controle.
Os normalizadores utilizados foram Actina (ACT) e Ubiquitina (UBQ). Estes genes
normalizadores são utilizados frequentemente em mamona (DE MORAIS, 2010) e
também com outras oleaginosas como amendoim (MORGANTE et al, 2011).
Figura 14 - Curvas de dissociação das diluições seriadas com sete concentrações de
cDNA para análise de eficiência para os genes alvos ACT (A) e UBQ (B) e genes alvos
CAT (C), APX (D),GPOX (E), SOD Cu/ Zn (F), SOD Fe (G) e SOD Mn (H).
57
A eficiência de amplificação (E) para cada oligonucleotídeo iniciador foi
calculada utilizando-se o valor referente ao coeficiente angular da reta (Slope) (Figura
15), conforme a E= (10–1/slope
–1) × 100 (PFAFFL, 2001).
Figura 15- Curva padrão gerada para ilustrar o cálculo de eficiência de amplificação
dos genes ACT, UBQ, CAT, APX, SOD (Cu/Zn), SOD (Fe), SOD (Mn) a partir de
RNA extraído de folhas de mamona. Em destaque, o coeficiente angular da reta (slope)
e o R2.
Apenas o gene alvo GPOX (Figura 14- E), não obteve resultado esperado na curva
de amplificação e curva de dissociação da diluição seriada com sete concentrações de
cDNA. Diante disso, este gene foi retirado do trabalho, sendo que a sequência deste
oligonucleotídeo iniciador selecionado para ser sintetizado foi a melhor opção sugerida
pelo PRIMER EXPRESS 3.
58
O cálculo da eficiência de amplificação dos genes alvo e normalizadores resultou
em valores que variaram de 0,96 (CAT) a 1,11 (ACT) (Tabela 10). Estes valores,
quando próximos de 1, são considerados ideais (PFAFFL et al., 2001).
Tabela 10 - Eficiência dos genes alvos potencialmente relacionados com a resposta
induzida por déficit hídrico em Ricinus Communis L. e normalizador calculado de
acordo com o coeficiente angular da reta (slope).
GENE SLOP EFICIÊNCIA
CAT -3,4225 0,96
APX -3,3362 0,99
SOD (Cu/Zn) -3,3417 0,99
SOD (Fe) -3,4192 0,96
SOD (Mn) -3,2360 1,03
ACT -3,0784 1,11
UBQ -3,3255 0,99
4.9.2 Expressão diferencial dos genes alvos
Para a análise da expressão diferencial foram considerados como diferencialmente
expressos os genes em que os valores de QR fossem maiores que um e meio (QR > 1,5).
Estes valores indicam que estes acessos/genes foram induzidos pelo estresse abiótico
causado pelo déficit hídrico. QR = 1 significa que não há diferença entre a amostra
tratada quando comparada à amostra controle. Os acessos selecionados para o
experimento de expressão foram aqueles que tiveram as maiores diferenças quanto à
produção da atividade das enzimas do sistema antioxidante, através das análises de
atividade enzimática (IAC 2028, PB 07 e China Careca).
As amostras utilizadas foram àquelas coletadas no tempo 24 horas, por ter sido o
único tempo que apresentou diferença significativa entre os acessos avaliados. Através
de q-PCR, foram geradas as curvas de amplificação para os gene CAT, APX, SOD-
Cu/Zn, SOD-Fe, SOD-Mn (Figura 16).
59
Figura 16 - Curvas de amplificação para os genes (CAT, APX, SOD-Cu/Zn, SOD-Fe,
SOD-Mn) para os acessos IAC 2028 (A e B), PB 07 (B e C), China Careca (D e E) no
tempo de 24 horas, submetidos ao déficit hídrico por PEG 6000 10 g/L, geradas pelo
software 7500 Fast System SDS (Sequence Detection System) v1.3.1 (Applied
Biosystems).
O cálculo de QR para os tratamentos (PEG 6000 10g/L) das moléculas-alvo nas
amostras dos acessos IAC 2028, PB 07 e China Careca no tempo de 24 horas, revelou
aumento de expressão das enzimas do sistema antioxidativo quando comparadas com os
dois normalizadores utilizados no presente experimento (ACT e UBQ) apenas no acesso
China Careca (Figura 16). Para os dois normalizadores utilizados foi observado o
mesmo padrão de expressão gênica, no entanto o gene SOD-Fe para o normalizador
(UBQ) não apresentou expressão quando submetido ao déficit hídrico, tendo, neste
A B
C D
E
60
caso, maior expressão deste gene no controle negativo (sem PEG 6000 10g/L). Mesmo
o acesso China Careca apresenta expressão em quase todos os genes, na maioria a QR
foi baixa (entre 1 e 2 vezes mais expressa no tratamento em relação ao controle). A QR
dos acessos PB 07 e IAC 2028 foram extremamente baixas, onde a expressão do
tratamento em relação ao controle não chegaram a serem 1 vez mais expresso, exceto no
acesso PB 07, onde houve a expressão do gene de CAT 1,6 vezes mais que no controle.
(Figura 17).
Figura 17 – Expressão gênica relativa dos genes pertencentes ao sistema antioxidativo
nos acessos IAC 2028, PB 07 e China Careca, submetidos ao déficit hídrico por PEG
6000 10g/L, gerada pelo software J Color Grid.
61
Para análise da expressão diferencial, foi calculada a média de expressão referente
aos dois normalizadores utilizados (tabela 11), sendo que ambos tiveram o mesmo
padrão de expressão gênica (Figura 17).
Tabela 11 – Valores médios de expressão diferencial (Actina e Ubiquitina) entre os
acessos de mamona para os genes estudados.
GENES
ACESSOS
China Careca
3,537 (±1,24) ~ 300%
PB 07
0,676 (±0,02)
IAC 2028
0,154 (±0,01) SOD-Cu/Zn
SOD-Fe 1,055 (±0,49) ~ 10% 0,422 (±0,00) 0,160 (±0,00)
SOD-Mn 1,702 (±0,09) ~70% 0,650 (±0,05) 0,311 (±0,02)
CAT 1,770 (±0,50) ~80% 1,614 (±0,00) ~70% 0,405 (±0,04)
APX 1,600 (±0,49) ~70% 0,309 (±0,00) 0,306 (±0,02)
As plantas possuem sistemas enzimáticos de defesa para vários tipos de espécies
reativas de oxigênio, que envolvem as SOD, CAT, APX, entre outros. Foi bem
documentado que os genes codificantes destas enzimas são ativados em resposta ao
estresse oxidativo (BOWLER et al., 1991 ;LEE et al.,1999; SANKAR et al., 2007).
O gene SOD-Cu/Zn teve maior expressão em situação de estresse, sendo em média,
até 3,537 vezes mais expresso que a condição controle, porém apenas no acesso China
Careca (Tabela 11). DALL’ASTA (2013) observou maior expressão dos genes SOD-
Cu/Zn em plântulas de milho em solução de ácido abscísico que induz situação de
estresse gerando EROs, no período de 3, 6 e 12 horas.
Estudos com superexpressão do gene SOD-Mn foram realizados em plantas de
tabaco, por BOWLER et al. (1991) mostraram que a enzima SOD-Mn confere
tolerância aos danos celulares causados por radical de oxigênio.. Resultados
semelhantes foram descritos por Carvalho (2009) onde plântulas de citrumelo
“Swingle” em exposição ao déficit hídrico por 24 horas apresentou um aumento na
expressão do gene SOD-Mn.
62
A superexpressão de SOD-Mn tem levado o aumento da tolerância contra as EROs
em várias espécies de plantas (TANAKA et al., 1999; VAN BREUSEGEM et al.;
1999).
A superexpressão de apenas uma das isoformas de SOD pode ser explicada, pois as
SODs são encontradas em diferentes compartimentos da célula, a isoforma SOD-Cu/Zn
é encontrada no cloroplasto, no citosol e possivelmente do espaço extracelular,
(ALSCHER et al., 2002). O mesmo padrão de expressão observado em SOD- Fe e
SOD-Mn pode ser devido a essas duas isoformas de SOD serem as mais antigas e
possivelmente surgiram da mesma enzima ancestral, enquanto que SOD-Cu/Zn possui
similaridade com a sequência de SOD-Fe e SOD-Mn, mas provavelmente evoluíram
separadamente nos eucariotos (ALSCHER et al, 2002). Explicando o fato de o gene
SOD-Cu/Zn ser ~300% mais expresso no tratamento que no controle, quando
comparado com as outras isoformas que tiveram menor expressão (Tabela 11).
Uma maior quantidade de SOD leva a uma superprodução e ao acúmulo de radicais
peróxidos de hidrogênio, os quais são citotóxicos e em excesso podem causar danos
celulares. Desse modo, um aumento na expressão das enzimas APX e CAT (que
possuem grande afinidade com estes radicais) ajuda no processo de detoxificação
interna (BAZZO, 2012).
Neste trabalho, foi possível observar um aumento da expressão do gene CAT em
80% e APX em 70% para o acesso China Careca e 70% do gene CAT para ao acesso
PB 07, em situações de déficit hídrico em um período de 24 horas (Tabela 11).
Esse fato pode ser explicado pela enzima APX possuir uma alta afinidade para o
peróxido (taxas de μM), mais do que as CAT (intervalo de mM) e outras peroxidases e,
é capaz de detoxificar baixas concentrações de H2O2 (WANG et al., 1999). No entanto,
a CAT é uma enzima importante para a tolerância ao estresse oxidativo, uma vez que
em plantas de tabaco transgênicas suprimidas com CAT tem níveis aumentados de
EROs em resposta a estresses bióticos e abióticos (CHAMNONGPOL et al., 1998).
Estudos com soja em condições de déficit hídrico (LEE et al, 1999), mostraram que
o pré-tratamento com H2O2, levou ao aumento significativo na expressão de genes e
alterações de transcritos de APX, demonstrando assim que a expressão deste gene é
regulada em respostas aos níveis celulares de H2O2. CARVALHO (2009) constatou um
aumento na expressão do gene APX em plântulas de citrumelo “Swingle” em exposição
ao déficit hídrico por 24 horas.
63
Estudos realizados por SANKAR et al. (2007) com amendoim submetidos a 10 dias
de suspensão hídrica, mostraram que os níveis de expressão da CAT variam também
entre os acessos eretos, sendo, contudo, sempre maior nos mais precoces, corroborando
com os resultados obtidos no presente trabalho onde o acesso China Careca,
considerado um acesso precoce apresentou maior expressão de CAT (80%), comparado
aos acessos IAC 2028 e PB 07 (tabela 10). Maiores expressões do gene de CAT foram
observadas também em plântulas de milho em condições de estresse (DALL’ASTRA,
2013).
Para AKCAY et al (2010) e SANKAR et al (2007) a CAT é uma das enzimas mais
eficazes na defesa de processos oxidativos, uma vez que, na planta resistente possibilita
a integridade da célula mesmo quando o estresse encontra-se em um estágio mais
rigoroso.
Essa superexpressão também pode ser observada em sementes, GALLARDO et al
(2001) em estudos com Arabidopsis Thaliana, notaram que essa alteração na expressão
de genes de enzimas pertencentes ao sistema antioxidante como CAT, SOD e APX,
foram extremamente importantes no processo de germinação.
O acesso China Careca foi o único que apresentou QR ≥ 1,5 em todos os genes
exceto SOD-Fe, indicando que, em situação de déficit hídrico, os genes pertencentes ao
sistema antioxidativos se expressaram mais que em situações normais (Tabela 11).
O gene SOD-Cu/Zn em China Careca foi expresso ~300% no tratamento, se
comparado a condição controle. Porém, os outros genes apresentaram expressões bem
menores: SOD-Fe ~10%, SOD-Mn e CAT ~80% e APX ~70 % em condições dedéficit
hídrico (tabela 11). Resultados similares foram observados na análise da atividade
enzimática (tabela 8), onde o acesso China Careca tem uma maior produção da enzima
CAT e SODs.
Em PB 07, o aumento da expressão foi observado apenas para o gene CAT, o qual
em situação de déficit hídrico teve um aumento de ~70 % na expressão desse gene
(tabela 10). Para os demais genes não houve expressão diferencial das plântulas
submetidas ao tratamento, os quais apresentaram valores abaixo de 1 (tabela 11).
Valores menores que 1 indicam maior expressão do gene no controle negativo (sem
PEG 6000 10g/L) quando comparado ao tratamento. Como a CAT e APX fazem parte
da segunda linha de defesa do sistema antioxidante que tem como função detoxificar
H2O2 em H2O e O2 (SCANDALIOS, 2005), possivelmente por apenas a enzima CAT
64
estar sendo mais expressa, este acesso apresentou maior sensibilidade ao déficit hídrico
quando comparado ao acesso China Careca, corroborando com os dados obtidos a partir
da avaliação fenótipoca das plântulas, onde o acesso PB 07 apresentou em todos os
tempos de avaliação (2, 8, 24 e 48 horas) caracteristicas evidentes de degradação foliar,
se comparados aos outros acessos (Tabela 2)
O cultivar IAC 2028 não apresentou expressão diferencial em nenhum dos genes
avaliados (valores menores que 1) (tabela 10), confirmando os dados de atividade
enzimática. Provavelmente não houve a expressão destes genes alvos, como este acesso
na avaliação da atividade enzimática apresentou apenas maior atividade de GPOX
(tabela 8). No entanto, pela não eficiência do oligonucleotídio iniciador, não foi possível
se verificar a QR para o gene GPOX.
Por meio da análise de variância da QR, realizadas com os dois normalizadores
(ACT e UBQ) foi possível verificar que o acesso China Careca apresentou maior
expressão dos genes ligados ao sistema de defesa antioxidante (Tabela 12).
Tabela 12- Teste de média referente a QR dos acessos China Careca, PB 07 e IAC
2028, submetidos à déficit hídrico causado por PEG 6000 10g/L -1, durante 24 horas,
normalizados com gene (ACT e UBCT)
Acesso Média 5%
China Careca 1,456 a
PB 07 0,886 b
IAC 2028 0,251 c
*TUKEY (p<0,05), médias seguidas por letras distintas diferem entre si.
O acesso China Careca, considerado um acesso precoce (RODRIGUES et al.,2010),
apresentou um perfil de expressão diferencial eficiente se consideramos valores maiores
que 1,5 (50%) para os genes diferencialmente expressos sob condições de déficit
hídrico, causado por PEG 6000 10g/L.
Este fato confirma uma possível relação das enzimas APX, CAT e SODs no
combate ao estresse causado pelo déficit hídrico nestes acessos, sendo estas enzimas
responsáveis pelo balanço enzimático interno para a detoxificação interna das EROs,
mostrando diferenças de perfis enzimáticos entre os acessos. Isso pode ser explicado já
65
que o sistema antioxidante das plantas consiste em componentes enzimáticos, como a
SOD (que detoxifica os radicais superoxidos), a APX e CAT (que quebram os
peróxidos de hidrogênio em água e oxigênio). Estas são enzimas associadas com a
manutenção do estado redox constante das células (SHARMA & DIETZ, 2008).
De acordo com os resultados obtidos no trabalho, o acesso China Careca apresentou
maior expressão dos genes relacionados ao sistema antioxidante se comparados aos
outros acessos, essa característica de resistência observada juntamente com
característica de precocidade e porte baixo descritas em outros trabalhos (RODRIGUES
et al.,2010; BERTOZZO, 2009) sugerem que esse acesso pode ser considerado de
interesse para o programa de melhoramento genético de mamona.
Os dados obtidos neste trabalho confirmam os estudos da literatura, que sugerem ou
comprovam o envolvimento de enzimas do complexo anti-oxidativo de várias plantas
submetidas ao déficit hídrico no combate as EROs (GUETA-DAHAN et al., 1997;
SHALATA et al., 2001; BOR et al., 2003 ; JEBARA et al., 2005; JALEEL et al., 2007;
AZEVEDO-NETO et al. 2010). As enzimas APX, CAT e SOD estão potencialmente
envolvidas com vias metabólicas do estresse oxidativo, apontado como efeito
secundário e resultado do estresse causado pelo déficit hídrico. Cada uma delas é capaz
de detoxificar o organismo de diferentes maneiras, para manter o equilíbrio celular.
Os resultados encontrados sugerem que há elevada quantidade de radical
superoxido no acesso China Careca, uma vez que a expressão das duas isoformas da
enzima SOD foi elevada para tal acesso (Tabela 11).
O acesso China Careca se mostrou menos sensível ao déficit hídrico, por apresentar
um sistema de defesa enzimático mais eficiente e a expressão diferencial dos genes
alvos sugere uma possível relação com a tolerância deste acesso ao déficit hídrico. No
entanto, o acesso PB 07 demonstrou maior sensibilidade ao déficit hídrico, apresentando
um sistema de defesa enzimático não tão eficiente quanto o apresentado pelo acesso
China Careca.
China careca é considerado um acesso não melhorado, o mais próximo de
selvagem. Devido a esta condição, o mesmo apresenta maior tolerância ao déficit
hídrico e menor produtividade quando comparado ao acesso PB 07, uma linhagem
avançada pertencente ao programa de melhoramento de mamona do IAC que visa
produtividade, contudo este acesso apresenta menor tolerância a condições de déficit
hídrico.
66
Os resultados encontrados sugerem que China Careca, apresentou maior quantidade
de EROs em suas células, devido a expressão diferencial da maioria dos genes alvos
apresentarem QR ≥ 1,5, sugerindo assim uma possível relação de maior tolerância deste
acesso ao déficit hídrico quando comparado ao acesso PB 07 e IAC 2028. Ainda que
estes acessos tenham apresentado características morfológicas que facilitam a
sobrevivência e adaptação ao déficit hídrico, estes apresentaram o sistema de defesa
contra as EROs menos eficiente que o acesso China Careca. Isso pode ser explicado por
essa espécie ser xerófila, onde essas apresentam características morfológicas que
facilitam a sobrevivência em condições áridas (BUCHANAN et al.,2000).
67
5 CONCLUSÕES
1. Verificou-se que apenas no período de 24 horas foi possível diferenciar os
acessos, avaliados por meio da atividade enzimática.
2. Por meio das análises das atividades enzimáticas, observou-se que as enzimas
(CAT, APX e SOD) foram eficientes para a diferenciação dos acessos; exceto
para a enzima APX que não diferenciou os acessos em nenhum dos períodos de
avaliação.
3. Os acessos estudados no presente trabalho em particular China Careca e PB 07
possuem diferentes mecanismos de defesa contra as EROs em respostas ao
déficit hídrico.
4. A expressão dos genes CAT, APX, SOD-Cu/Zn e SOD-Mn foi induzida pelo
déficit hídrico causado por PEG 6000 10g/L no período de 24 horas no acesso
China Careca.
5. O acesso China Careca mostrou menor sensibilidade ao déficit hídrico no
período de 24 horas, indicando um sistema de defesa antioxidante mais eficiente
quando comparado ao acesso PB 07, o qual apresentou expressão diferencial
apenas do gene CAT.
6. O acesso China Careca por apresentar característica de precocidade pode ser
considerado de grande importância para o programa de melhoramento genético,
uma vez que o mesmo apresentou um sistema de defesa antioxidante eficiente
visando resistência de tolerância à seca.
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