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Produção de Proteínas com
Ação Terapêutica, com Foco em
Cultura de Células Animais
Ricardo Medronho
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Escola de Química
Departamento de Engenharia Química
13/11/2008
Resumo da apresentação
� Uma visão global da área
� O processo de produção de biofármacos
� Os desafios de Engenharia Bioquímica
� Linhas de pesquisa em desenvolvimento no Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares-LECC e no Laboratório de Fluidodinâmica Computacional-Lab CFD, ambos da UFRJ
� Principais temas em estudo
� Exemplos de resultados obtidos
Células animais - HistóricoAno Evento
1949 Crescimento de vírus em cultivo de células (Enders e col.)
1954 Vacina inativada Salk contra a poliomielite (cél. rim de macaco)
1955 Vacina atenuada Sabin contra a poliomielite (cél. rim de macaco)
1963 Vacina contra o sarampo (células de embrião de galinha)
1964-69 Vacinas contra raiva, caxumba e rubéola (cél. WI-38)
1975 Produção de anticorpos monoclonais (Köhler e Milstein)1975 Produção de anticorpos monoclonais (Köhler e Milstein)
1979 Primeira linhagem de célula recombinante
1980 Ampliação para escala de produção de 8.000 L (vac. febre aftosa)
1981 Primeiro kit diagnóstico com anticorpo monoclonal
1982 1° fármaco oriundo da tecnologia do rDNA (insulina; microrganismo)
1986 1° biofármaco produzido em células animais (CHO): t-PA recombin.
1986 1° AM de uso terapêutico: OKT3 (rej. a transplante; produz. camund.)
> 1990 Testes clínicos e aprovação de diversos produtos oriundos da tecnologia do DNA recombinante e tecnologia de hibridomas
> 2000 Intensificação de estudos com células-tronco visando a terapias celulares
Por que células de mamíferos?
� Microrganismos
� Ausência de maquinaria metabólica capaz de realizar as complexas modificações pós-tradução
� Bactéria: incapazes de realizar a glicosilação
� Leveduras: padrão diferente de glicosilação
� Normalmente não são capazes de secretar a proteína de interesse
� Corpos de inclusão
� Processos de purificação mais complexos
� Usados para proteínas relativamente simples (por ex. insulina e hormônio do crescimento)
Por que células de mamíferos?
� Células animais (especialmente de mamíferos)
� Modificações pós-tradução adequadas
� Secretam as proteínas recombinantes para o meio de cultivo
� Linhagens celulares mais empregadas:
� Células de ovário de hamster chinês (CHO.K1, CHO dhfr -)
� Células de rim de bebê de hamster (BHK-21)
� Células de hibridoma (mieloma + limfócitos-T)
� Células de mieloma de camundongo (NS0, Sp2/0)
� Proteínas terapêuticas são, em geral, proteínas complexas e com várias modificações pós-tradução
� Atividade biológica
� Estabilidade
� Imunogenicidade
� Por isso � células de mamíferos
Por que células de mamíferos?
� Por isso � células de mamíferos
Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40
(fórmula da sequência de aminoácidos)
(MM = 146000)
Alguns exemplos deprodutos comerciais
Produto Indicação Célula Aprov.
Avonex (β-interferon) esclerose múltipla CHO 1996
Benefix (fator IX) hemofilia B CHO 1997
Epogen (EPO) anemia CHO 1989
Activase/Alteplase (t-PA) infarto CHO 1986
Humulin (insulina) diabetes E. coli 1982
Herceptin/Trastuzumab (MAb) câncer de seio CHO 1998
Refacto (fator VIII) hemofilia A CHO 2000
ProstaScint (MAb, diagn. in vivo) câncer de próstata hibridoma 1996
Simulect/Basiliximab (MAb) rejeição de órgãos Sp2/0 1998
Campath (MAb) leucemia CHO 2001
Avastin/Bevacizumab (MAb) câncer coloretal CHO 2004
Xolair/Omalizumab (MAb) asma CHO 2003
Soliris/Eculizumab (MAb) hemoglobinuria (PNH) NS0 2007
O processo de produção
Desenvolvimento daDesenvolvimento dalinhagem celularlinhagem celular
Cultivo celularCultivo celularem biorreatoresem biorreatores
Downstream processingDownstream processing(separação das células, (separação das células, purificação do produto)purificação do produto)
FormulaçãoFormulação
Os desafios de Engenharia Bioquímica…
Desenvolvimento de linhagens alta-mente produtoras
Estabelecimento de processos de cultivode alta produtividade
Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento
�������� pg cel-1 dia-1
Desenvolvimento de linhagens alta-
mente produtoras
Os desafios de Engenharia Bioquímica…
Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento
Os desafios de Engenharia Bioquímica…
Desenvolvimento de linhagens alta-
mente produtoras
Estabelecimento de Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de
purificaçãodealtorendimento
Biorreatores
�� Células adaptadas a crescimento em suspensãoCélulas adaptadas a crescimento em suspensão
Principais linhas de pesquisa do LECC e Lab CFD da UFRJ
�Clonagem e expressão de proteínas� Clonagem e expressão: proteínas terapêuticas, enzimas envolvidas no processamento pós-tradução, proteínas anti-apoptóticas
� Construção de um sistema de vetores para integração sítio-dirigida, para acelerar a geração de linhagens recombinantes
�Desenvolvimento de processos de cultivo celularDesenvolvimento de um meio livre de soro para células CHO� Desenvolvimento de um meio livre de soro para células CHO
� Desenvolvimento de equipamentos para retenção de células em processos em perfusão (hidrociclone, filtro de disco rotativo, módulo de fibras ocas)
� Estudo da produção de vírus em células Vero� Cultivo de células-tronco embrionárias murinas e humanas em sistemas agitados utilizando microcarregadores
�Desenvolvimento de processos de purificação dos produtos� Uso de cromatografia com membranas e processos integrados