INTERFERENCIAS DE LAS AGUAS M..J\RINASEN LA DETECCION DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

MEDIANTE LA TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE

RESUMENEn un estudio, realizado en 1992 en las aguasdel mar Caribe costarricense, sobre "Relacionesy Tasas de declinación de los organismosindicadores de Calidad de las Aguas Mari­nas", se observó que los números másprobables/IOOmL de pseudomona aeruginosapresentaban inhibición para la producción defluorescencia, en las porciones (diluciones)de IOmL de agua de mar, no así en los tubosde I y O.lmL. Estos resultados causaronincoherencias en la cuantificación de estas,bacterias en dichas aguas. Para detectar elfactor causante de la interferencia. se realizaron2 tipos de experimentos con aguas de marnatural yagua con 3,S% de sal (NaCl). Losresultados demuestran que la concentraciónde sal en los tubos de IOmL de agua marinay IOmL de caldo Asparagina en la pruebapresuntiva de NMPIlOOrnL, causa una inhibiciónen la producción de fluorescencia (negatividad)en esta diluciones, no así en las de I yO,lmL. Por lo tanto, los resultados demuestranque la técnica de NMP/lOOmL de ffi no esrecomendable en aguas marinas.

INTRODUCCIONLa calidad sanitaria de las aguas de

recreación han sido evaluadas, utilizandoindicadores bacterianos empleados en lasaguas de consumo humano. Los Coliformestotales (C.T.), Coliformes fecales (c.n Strep­tococcus fecales (E. E) en aguas o alimentos,indican, en mayor o menor grado, la presenciade contaminación fecal y, por ende, el riesgo

de adquirir alguna enfermedad intestinal alingerir esas aguas. Sin embargo, estosindicadores tradicionales no permiten valorarlos riesgos de enfermedades transmitidas porcontacto, como las infecciones de piel, oídos,garganta y vías respiratorias. Debido a estaslimitaciones, se ha propuesto a las especies:Pseudomonas aeruginosa (IÁ), Staphylococcusaures (SA) y Candida albicans (CA), comoindicadores complementarios para evaluar elriesgo de nadar en aguas contaminadas (1, 3,6, 6, 7 y 8). PA es un saprofito y se encuentraampliamente difundido en los suelos, aguassuperficiales y subterráneas, en los intestinosde los animales de sangre caliente y en plantas.Esta bacteria causa graves problemas pcrrinfecciones intrahospitalarias y se ha aisladode enfermedades de oldos, garganta, vlasrespiratorias, tracto urinario y piel. Diferentesautores la han reportado como la causante deenfermedades a bañistas (7 y 9). Lacuantificación de PA en agua se hace con lasmismas técnicas de Filtraci6n de Membrana(FM) y el Núme!o más Probable/lOO mL (NMPI100 mL) (1). Carson y colaboradores (3) yHighsmilh (S), analizaron, por aparte, los factoresque influyen en su detección y enumeración,por medio de la técnica del NMP/lOO mL enaguas superficiales, aguas de bebida yaguasde desecho.

La técnica del NMP/lOO mL consta detres etapas: pruebas presuntivas, Confirmaday Completa. En el caso de la detección de

Lic. en Microbiologfa del Leboralorio central de A y A,TI... Rioo, Certeqo, Coote Rica.

PA en la prueba presuntiva se utiliza el caldoAsparagina, y en la confirmada, caldo o agaracetamida.

La prueba presuntiva consiste en lainoculación de diferentes alicuotas del aguaen estudio en el caldo Asparagina. En el casode las alicuotas de 10 mL, ellas se debeninocular en tubos de 22XlSO mm, con 10 mLde caldo Asparagina simple. La presencia odetección de fluorescencia, por medio de unalámpara ultravioleta, después de 48 horas deincubación a 35° C, indica la presunción depositividad por ffi. Los tubos con fluorescenciason pasados a caldo Acetamida, e incubadosa 35° C por 36 horas. La presencia de uncolor púrpura confirma la presencia de 9\..

La edición 17 del "Standard Methods" (1),recomienda esta técnica para determinar ladensidad de 9\. en las diferentes aguas; sinembargo, señala limitaciones en su uso enaguas de mar, sin aclarar cuáles son susinconvenientes.

Por otro lado, en los estudios de aguas deplayas realizados en nuestro Laboratorio, seobserva que en las pruebas presuntivas de PA, los tubos con 10 mL de Asparaginaconcentrados, con inóculos de 10 mL de aguade mar, dieron negativas en más de un 61 %,mientras que los tubos con alicuotas de 1 mL,de la misma agua dieron positivos en su granmayoria Ante esta incoherencia, se decidiórealizar la presente investigación, con elobjetivo de identificar cuál es el factor queinhibe el crecimiento de la bacteria en lostubos de 10 mL.

MATERIALES y METODOSNuestra hipótesis es que la concentración desales, principalmente cloruro de sodio (NaCL),en las alícuotas de 10 mL, provocan una diluciónI en 2 en los tubos de 10 mL con medioAsparagina. Es decir, el contenido de NaCLdel agua del mar se diluye el 50%. Si bien escierto Robertson y colaboradores indican queffi es poco halofflico, estudios de sobrevivenciabacteriana en aguas de las costas de Israel(9), señalan que su tasa de decaimiento muy

inferior a cualquier otro indicador utilizado.Por otra parte, alicuotas de 1, 0.1 mL, etc., nocausan ningún uanstorno en la PruebaPresuntiva. Otros factores, como el pH y losmetales pesados, podrian causar la interferenciamencionada.

En razón de lo anterior y con el objetivode comprobar o desvirtuar dicha hipótesis, serealizaron los siguientes experimentos;

I Inoculación de PA en Aguas deMar ve..sus NMP/IOOmL.

1. Se prepararon patrones de Me. Farlandde PA (ATCC 27853), con un 3XloBbacterias.

2. Se determinó el pH, los cloruros y conduc­tividad de las aguas del mar Caribe (fresca).

3. Se analizó el pH, cloruros y conductividaden el caldo Asparagina, concentrado ysimple.

4. Se inoculó 20 litros de aguas de mar con2mL del inóculo de Mc. Farland de PA.

5. Se realizó el NMP/lOOrnL de 9\. con dilu­ciones de 10 a 10-9. Las pruebas presunti1eSse incubaron a 35° C por 24 horas.

6. Se observó la presencia de fluorescenciapor medio de una lámpara de luz ultravio­leta (Modelo UVL-S6 y 115 \bits). Luegose pasaron 0.1 mL de los tubos positivos,con el objetivo de confirmar la presencia'de PA. Los tubos negativos también fueronpasados, para corroborar la ausencia dela bacteria.

7. Este ensayo se realizó diez veces, con sudebido control de agua sin sal (dulces).

D Inocalación de .. en agua "dul.ce". con 3.S%. d. NaeL.

1. Se preparó un litro de agua de naciente opozo, con 35 gramos de NaCL (3,5%) esté­ril y se inoculó con 0.1 mL del patrón dePA, de 24 horas de crecimiento.

2. Se preparó un litro de agua sin NaCL,

como control o blanco, <con la misma aJi­cuota de la suspensión bacteriana.

3. De ambos litros de agua se inocularon 30tubos con caldo Asparagina, concentradocon 10 mL cada uno. Luego se incubarona 35° C, por 48 horas. Posteriormente seobservó la presencia o no de fluorescencia.Finalmente, de todos los 60 tubos (positivosy negativos), se pasó O. I mL de caldoAcetamida, para confirmar la presenciade PA.

DI AnáUsis de Datos del NMP/100 deM, en sedimentos y Aguas Mari.nas.

Previo a la realización de los experimentos,se muestreó, mensualmente, durante 1992, lasaguas y sedimentos de las playas de la ciudadde Limón, con el afán de evaluar su calidadsanitaria; dentro de los indicadores estudiadosestaba Bl\, CI'; El'; y CA. Del total de las 120y 115 muestras de agua y sedimento,respectivamente, se sacaron las lecturas de laprueba presuntiva que dieron interferencias.

Además, de un ensayo en una pecera de75 litros -utilizada para otros fines diferentesa éste estudio- con agua de mar y sedimento,se anotaron las pruebas presuntivas conproblemas.

RESULTADOSDe las 120 y 115 muestras de agua de mar

y sedimento estudiadas, el 51 % de las pruebaspresuntivas, presentó interferencia o negatividad(fluorescencia) en las alícuotas de 10 mL, noen las prociones de 1 y 0.1 mL Por el contrario,en los sedimentos sólo se observó una pruebapresuntiva con problemas, es decir, un 0.87%.Lo mismo sucedió con las 31 y 23 muestrasde agua y sedimento de la pecera. En estecaso, el 61% de los NMP/lOO mL tuvo problemasen las porciones de 10 mL de agua de mat;y solamente el 4% de las pruebas en lossedimentos mostró interferencias.

En el cuadro 2 se resumen los resultadosde los esperimentos de las aguas de mat;

inoculadas con PA. Los datos demuestran un100% de interferencia en las pruebaspresuntivas, del NMP de PAIlOO mL,principalmente en las porciones de los tubosde 10 mL de agua, mientras que los controles(agua sin sal + PA) dieron todos positivos, loque indica que no tenían interferencia en laprueba presuntiva (experimento 2).

Los resultados del experimento 2 sepresentan en el cuadro 3. Aquí se resumenlos promedios de pH, cloruros y conductividadde las aguas de mar, caldo Asparaginaconcentrado y simple, 50 mL de Asparagina+ 50 mL de agua de mar (dilución 1 en 2), y100 mL de Asparagina + 20 mL de agua(dilución I en 6).

Los resultados de los 60 tubos de caldoAsparagina (concentrado) -30 inoculados conaguas de manantial + 3.5% de NaCL + PA, y30 con agua de manantial + PAU- se resumenen el cuadro 4. Además se anotan los datosde conductividad, pH y cloruros, en ambostipos de aguas.

DISCUSIONLa observación de las 120 pruebas de

NMP/lOO mL de PA en las aguas del marCaribe, nos indica que en un 51%. de lostubos conteniendo 10 mL de agua de mar nopresentaban fluorescencia, por lo que fueronreportadas como negativas a las 48 horas deincubación. Por otro lado las diluciones de 1y O. I mL se comportaron normalmente, esdecir, la dilución mayor dió más tubos positivosque las de la dilución menor. En los 115sedimentos estudiados, prácticamente no huboresultados incoherentes. Esto se debe a queel procedimiento de siembra de NMP consisteen diluir 10 gramos de arena en 90 mL deagua destilada, y de esta suspensión se haceel NMP Por esta razón no hay suficienteconcentración de NaCL para afectar laproducción de fluorescencia de 9\.

Nuestra hipótesis se comprueba con losresultados de los experimentos 1 y 2. En elprimero -a pesar de la presencia de H\.- las

porciones de 10 mL de las aguas de marpresentan inhibición en la producción defluorescencia por lA. En el experimento 2, lasaguas con 3,5% de NaCL (semejante al aguade mar) más lA, dieron un 0% de fluorescencia;por el contrario, las diluciones de las aguascontrol dieron un 100% de positividad. Lospasajes de O, I mL de los tubos de Asparagina,negativos por fluorescencia, se pasaron al caldoAcetamida, y se incubaron a 38" C por 36horas. Los resultados indican que, a pesar dela no presencia de fluorescencia en el caldoAsparagina, se confirmó el crecimiento de PA. Esto indica que la interferencia en la pruebapresuntiva del NMP está en la producción dela fluorescencia y no en el crecimiento de labacteria.

Estos simples experimentos demuestran quela concentración de sales en las aguas demar, al diluir uno en dos en los tubos deAsparagina, inhiben que la bacteria produzcala fluorescencia, que sirve para decir si eltubo es positivo o no. Por otro lado, en lostubos de 5 mL de caldo asparagina simple, alagregar una alícuota de 1, O, l o menos, laconcentración de NaCL de diluye I en 6,para la alícuota de I mL. La concentraciónde NaCL, en estos tubos, permite elcrecimiento y la producción de la fluorescenciade PA. Con base en lo anterior, no extrailaobtener resultados negativos en las porcionesde 10 mL, con positividad en las dilucionesde I y 0, I mL. El factor de pH se descartacomo interferencia, debido a que las dilucionesdel agua del mar con el medio de cultivo,bajan en pH de 8: 10 a 7, lo cual favorece elcrecimiento de las bacterias.

En conclusión, se demuestra que la lA esafectada en la producción de fluorescencia yel pigmento prosanina, cuando se encuentraen aguas con concentraciones de sal, parecidasal agua de mar. Esto nos permite especularque la PA es deficiente en factoresosmoprotectores, como la Glicina-Betaina, lacual protege más a la E. coli de este factor(NaCL) en el agua marina (4). Por lo tanto, latécnica de NMP/lOO mL de lA no es uninstrumento confiable para detectar supresencia en aguas de mar, pero si larecomendamos en muestras de sedimento,

4 uYI&lA COSTAlllaNSI 01 6Al.UD PUIU<;A

debido a que la concentración de sal esmucho menor que el agua marina

CUADRONolRESUMEN DE PRUEBAS PRESUNTIVAS DE PA CON INTERFERENCIAS

EN AGUAS MARINAS Y SUS RESPECTIVOS SEDIMENTOS

Prueba Presuntiva en Series de Tres ThbosNo. Muestra Diluciones Aguas Diluciones Sedimentos

10 1 0.1 10 1 0.1

1 O 3 1 O O O2 O O i O O O3 O 3 l O O O4 O 1 O O O O5 O i O 1 O O6 O 1 O O O O7 O O 1 O O 18 O O 1 O O O9 O O 1 O O O10 O 1 O O O O11 O O 2 3 2 112 O 1 1 2 O O13 O 2 1 1 O O14 O 2 1 2 O O15 O 2 O 1 O O16 O 2 2 3 O O17 O 3 1 3 3 O18 O 3 2 3 1 O19 O 2 3 3 3 220 O 3 3 3 3 321 O O 2 3 3 222 O 1 1 3 O O23 O 3 3 2 1 O24 O 1 1 3 O O25 O 1 O 3 3 O26 O 1 1 2 1 O27 O 1 O 3 O O28 O 2 O O O O29 1 3 O 3 3 O30 1 2 3 3 3 O31 O 1 1 3 3 232 O 2 1 O 1 O33 O 1 1 3 1 O34 O 1 O 1 O O35 O 1 O 2 O 136 O 1 1 2 O 137 O 1 O 3 1 O38 O 2 O 3 1 139 O 1 O 3 1 O40 O 3 3 O O 341 O 2 1 2 O O42 O 2 1 2 1 O43 O 2 3 3 1 O44 O 2 1 1 2 145 O 2 1 3 1 O46 1 2 2 3 2 147 O O 1 3 3 348 O O 1 2 3 3

s

Prueba Presuntiva en Series de Tres ThbosNo. Muestra Diluciones Aguas Diluciones Sedimentos

10 1 0.1 10 1 0.1

49 O 1 O 2 2 250 O I O 3 3 251 O I O 3 3 O52 O I O 2 O O53 O I O 3 3 O54 O 2 O I I O55 O O I O O O56 O I O O O O57 O O 2 O O O58 O I 1 O O O59 O 2 O O O O

NOTA: El tota! de muestras analizadas fue de 120 yns para agua ysedimento, respectivamente. El promedio delNMPcon interferencia en el tubo de 10 ce de CaldoAsparagina, es de 51 %, Y0,87 para sedimentos.

CUADRO No. 2RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS

DE INOCULACION DE AGUAS DE MAR CON PA

No. Ensayos Aguas de Mar Agua Dulce (Control)

+ PA + PA

1 Diluciones Diluciones10 1 0.1 10 1 0:1

I I 3 3 3 3 32 O 3 O 3 3 O3 I 3 3 3 3 34 2 3 3 3 3 35 I 3 3 3 3 36 O 3 3 3 3 37 O 3 3 3 3 38 2 3 3 3 3 3

9 O 3 3 3 3 310 2 3 3 3 3 3

CUADRO No. 3RESULTADOS DE pH, CLORUROS Y CONDllCTIVIDAD

DE LAS DILUCIONES DE AGUA DE MAR CON ELCALDO ASPARAGINA

DILUCION pH CLORUROS· CONDUCTIVIDAD ••

Agua de Mar 8,10 14620 37000

Asparagina concentrada O

Asparagina (simple) O

50cc Asp+50 Agua de Mar 7,01 7550 20000

100cc Asp+20 Agua de Mar 7,10 2532 8100

MILIGRAMOS POR LITRO·MS/cm ••

CUADRO No. 4RESULTADOS DEL AGUA CON NaCL

A 35° CYPA

PRUEBAS AGUA CON 3,5 DE NaCL+ PA AGUA+PA

Conductividad MS/cm 44000 185

pH 8,03 7,79

Cloruros 19000 10

TUbos de lOcc Asp· % Positividad de O 100%los tubos de Asp (48 horas)

Asp: Caldo Asparagina

NOTA: El número de tubos de Asparagina (concentrada) inoculados cono aguas + lA, fue de 30,

AGRADECIMIENTOEste trabajo se llevó a cabo con las

colaboraciones de la Dra. Ana V Mata,Gabriela Catarinella, Manuel Sanabria, MoisésCoto, Felipe Portuguez y la Srta. l1eana Gar­banzo.

REFERENCIAS1- APHA, AWWA, WPCF; 1989 Stanclar Methodso{ Erawjnatjon o{ Water and Wastewater~ Wash­ington D.C., Pag. 9-49 a 9-55.

2- Cabelli V. j. et aL 1983. A Marine Recreationa1Water OmUty._Criterios Consistent with Conceptsand VIsk Analysis journal of Water Pollution Con­trol Federation, 55 (10) pag. 1306 - 1314.

3- Carson L. A., Petersen N. j., Favero M. S., DotoI. L., 1975. Factors Influencing Detection and Enu­meration of Pseudomonas aeruginosa by Most-Prob­able-Number and Membrane Filtration Techniques.ApPIied Mjcrobioloqy, VoL 30, No. 6, pag. 935 ­942.

4- Ghoul Moste{a, et aL, 1990. Evidence thatEscherichia coli Accumaies Glycine Betaine fromMarine Sediments. Applied and EnyjronmentalMjcrobiology, Vol. 52, No. 2, pag. 551-554.

5- Hihgstmith Anita K. and Abshirs Robert L. 1975.Evaluation of a Most-Probable-Number Techniquefor Enumeration de Pseudomonas aeruginosa.Applied Mjcrobioloqy~Vol. 30, No. 4. pag. 596-601.

6- Hoadley A. w., Ajello Gloria and MastersonNola, 1974. Preliminary Studies of FluorescentPseudomonas Capable of Grouth al 41 C in Swim­ming PoolWaters. APPIied MiCIQbioklg'fo-VoL 29,No. 4, pag. 527-551.

. 7- Robertson W. J and 'Ibbin R. S., 1983. ~Re!atjonshjp Belween !bree Potentiol Pathoqens and

8 lEVISlA COfrrAAllC1ftSl DI SALUD PUIUCA.

Pollution Indjcator Organjsms in Nova Scotjon CoastalWaters. Can J MicrobioL Vol. 29, pag. 1261-1209.

8- Purer and Sicilia Golderman, Yana Yoshpe, 1987.Qccurrence of StaphvlocoCllS aures and Pseudomo­nas aerugjnosa in Israeli._Coastal Water, Vol. 53,No. 5, pag. 1138-1141.

9- Seyfried Patricia L. and Fraser David J, 1980.Persjstence ol Pseudomonas aeruainosa in Chlori­nated Swjmrninq pooL Can J Microbiol, Vol, 26,pag. 350-355