Embed Size (px)
Citation preview
27
� � � � � � � � � � � � � � � � � ���
���������������������
RPCV (2004) 99 (549) 27-39
Caracterização biológica e molecular de um lentivírus de ovino isoladoem Portugal
Biological and molecular characterization of an ovine lentivirus isolatedin Portugal
Miguel Torres Fevereiro* e Sílvia Santos Barros
Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Departamento de VirologiaEstrada de Benfica 701, 1549-011 Lisboa, Portugal
Trabalho galardoado com o Prémio Pfizer Ciências Veterinárias 2003, atribuído pela Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias
Resumo: O genoma de um lentivírus de ovino com um fenótipo de replicação in vitro lento/baixo, foi totalmente sequenciado. Este vírus, denominado P1OLV, foi isolado a partir de células de pulmão e do plexo coroide de um ovino naturalmente infectado, proveniente da região de Trás-os-Montes. O RNA genómico do P1OLV constituído por 9189 nucleótidos, tem respectivamente 80% e 70% de similaridade com as sequências nucleotídicas do vírus Maedi Visna (MVV) padrão K1514 e com a estirpe Cork do vírus da artrite encefalite dos caprinos (CAEVco). A análise filo-genética, baseada em sequências nucleotídicas da glicoproteína de superfície do invólucro (SU) e da transcriptase reversa (RT) viral, revelou que o P1OLV agrupa claramente com os isolados MVV de ovino. Para o estudo da replicação viral in vitro, cultu-ras de macrófagos (MØ), células do pulmão e do plexo coroide (SCP) de ovino e células da bainha sinovial do carpo de cabra (GSM) foram inoculadas com o isolado nacional e com a estirpe lítica Norte Americana WLC-1 do MVV. As culturas foram se-guidas durante vários dias para observação do efeito citopatogé-nico (CPE) e quantificação do RNA viral nos sobrenadantes por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) em tempo real. Ao contrário da estirpe WLC-1 que teve um crescimento rápido e lítico, atingin-do níveis elevados de produção de RNA viral em todos os tipos de células testados, o isolado nacional multiplicou de forma mais lenta e com níveis de produção de RNA viral mais baixos. Em células de pulmão e SCP, o P1OLV originou infecções persisten-tes sem CPE evidente e níveis de produção de RNA viral quatro a cinco vezes inferiores aos observados para a estirpe WLC-1. Em células GSM e MØ os valores máximos de RNA viral produzi-dos pelo P1OLV foram cerca duas vezes inferiores aos registados para o WLC-1. O isolado nacional P1OLV é, até à data, o único lentivírus de ovino com padrão de replicação lento/baixo cujo genoma foi totalmente sequenciado.
Summary: The sequence of the complete genome of an ovine lentivirus with a slow/low phenotype in vitro was determined. The virus, named P1OLV, was isolated from the lung and cho-roid plexus cells of a naturally infected sheep in Portugal. The genome of P1OLV is 9,189 nucleotides long and has an over-all similarity of approximately 80% with K1514 Maedi Visna virus (MVV) and approximately 70% with the caprine arthri-tis encephalitis virus (CAEV) Co strain. Phylogenetic analysis based on sequences of the virus surface glycoprotein (SU) and reverse transcriptase (RT) clearly grouped P1OLV with previ-ously reported ovine MVV. To assess the virus replication rate in
* Correspondência: tel.: 217115288, fax: 21217115387 e-mail: [email protected]
vitro, cultures of sheep macrophages (MØ), lung and SCP cells, and goat synovial membrane (GSM) cells were inoculated with either P1OLV or with the lytic North American strain WLC-1. The cultures were maintained for several days and examined for cytophatic effects (CPE) consisting of either cytolysis and/or development of syncitia. Viral RNA in culture supernatants was measured by one-tube real time quantitative RT-PCR (qRT-PCR). As expected, WLC-1 grew rapidly, produced high levels of viral RNA and induced CPE in all the cells tested. On the contrary, the national isolate replicated more slowly and to lower levels of viral RNA. In SCP and lung cells, P1OLV induced per-sistent infections without notorious CPE and with levels of viral RNA four to five times lower than those registered for WLC-1. In GSM and MØ P1OLV was lytic but the peak levels of viral RNA were approximately two times lower than those produced by WLC-1. We have presented a full-length sequence of the first Portuguese isolate of ovine lentivirus that is potentially useful for studying genes responsible for the slow/low phenotype, as all the MVV that have been totally sequenced so far, are of the rapid/high phenotype.
Introdução
O vírus Maedi Visna (MVV) Islandês K1514 (Sigur-dsson et al., 1957) e a estirpe Norte Americana Cork, do vírus da artrite encefalite dos caprinos (CAEVco) (Cork et al., 1974), são os protótipos de um grupo de lentivirus dos pequenos ruminantes (SRLV) associados a doenças de evolução lenta e progressiva nestas espé-cies. Nos ovinos, a infecção manifesta-se habitualmen-te sob a forma de pneumonia intersticial progressiva (Maedi) e mais raramente sob a forma neurológica (Visna) (Cheevers e McGuire, 1988; Narayan et al., 1992; DeMartini et al., 1993; Zink e Johnson, 1994). Nos caprinos a doença caracteriza-se pelo aparecimen-to de artrites e mastites nos animais adultos e por ence-falites nos animais jovens (Crawford et al., 1980; Zink e Johnson, 1994). A transmissão do vírus MVV faz-se por ingestão do colostro e leite no caso dos animais jovens e por via aerógena nos animais adultos (Pálsson, 1985).
RPCV (2004) 99 (549) 27-39Fevereiro, M. T. e Barros, S. S.
28
Contrariamente aos lentivírus dos humanos, símios, felinos e bovinos que originam infecções produtivas em macrófagos (MØ) e linfócitos T, os SRLV têm tro-pismo para as células da linha monócito-macrofágica. Nestas células, a expressão viral está estreitamente associada à diferenciação e maturação dos monócitos em MØ (Gendelman et al., 1985, 1986; Narayan et al., 1983). A manifestação primária da doença nas infec-ções por SRLV é a inflamação. Esta resulta da replica-ção do vírus nos MØ com libertação de mediadores da inflamação nos tecidos onde estas células se encontram. A baixa susceptibilidade dos linfócitos T dos ovinos e caprinos à infecção pelos SRLV pode explicar, em par-te, a ausência de uma síndrome de imunodeficiência nestas espécies.
Os SRLV embora relacionados entre si, tanto a ní-vel genético como antigénico, evidenciam padrões de replicação in vitro muito diferentes. As diferenças fe-notípicas entre os vários SRLV reflectem a aptidão de certa estirpe para realizar uma infecção produtiva numa determinada linha celular, a capacidade de induzir a formação, de sincícios e a sua taxa de replicação em cultura. A cinética de replicação dos SRLV in vitro tem sido utilizada para os classificar em vírus do tipo rápi-do/alto ou lento/baixo, conforme atinjam rapidamente títulos elevados ou, pelo contrário, sejam necessários vários dias ou semanas para atingir, apesar disso, títu-los baixos (Lairmore et al., 1987, Querat et al., 1984; Woodward et al., 1995; Zanoni et al., 1992).
Os pequenos ruminantes são reservatórios de len-tivírus com uma linha filogenética própria e os den-dogramas inferidos a partir das sequências dos genes gag, pol e env de vários lentivírus de ovinos e caprinos, sugerem que o CAEV teve origem no MVV (Valas et al., 1997). Além disso, os ensaios de infecção expe-rimental e a análise filogenética dos SRLV sugerem que a transmissão de lentivírus entre ovinos e caprinos ocorra na natureza com alguma frequência (Banks et al., 1983; Shah et al., 2004), devendo este facto ser le-vado em consideração nos estudos epidemiológicos e nos planos de erradicação das infecções por SRLV.
A nível mundial, apenas se conhecem quatro sequên-cia genómicas completas do MVV nomeadamente das estirpes Islandesas K1514 e KV1772 (Andrésson et al., 1993; Sonigo et al., 1985), e dos vírus Sul Africano (SA-OMVV) (Querat et al.,1990) e britânico (EV-1) (Sargan et al., 1991), todos eles do tipo rápido/alto. O pequeno número de sequências genómicas MVV dis-poníveis nas bases de dados internacionais, tem sido um obstáculo ao conhecimento mais aprofundado da epidemiologia molecular e patogénese do vírus, bem como ao aperfeiçoamento das técnicas de detecção do vírus por PCR.
Os resultados de rastreios serológicos realizados no nosso país revelaram existir uma elevada prevalência da infecção MVV nos ovinos nacionais (Fevereiro, 1995).
Neste trabalho é apresentada a sequência genómica
completa de um lentivírus isolado de um ovino natu-ralmente infectado. O vírus, designado P1OLV, replica de forma lenta, originando infecções persistentes e sem efeito citopatogénico (CPE) evidente em células do plexo coroide (SCP) e pulmão de ovino. Com base nas características de replicação in vitro o isolado P1OLV foi classificado como um vírus do tipo lento/baixo. A análise filogenética baseada nos alinhamentos das se-quências nucleotídicas dos genes pol e env, colocou o P1OLV no grupo dos vírus Maedi Visna.
Material e métodos
Isolamento do vírusO vírus P1OLV foi isolado a partir de células de
pulmão e explantados do plexo coroide provenientes de um ovino da raça Badana naturalmente infectado, proveniente de Trás-os-Montes. Estas células foram cultivadas em meio DMEM e após 5 subculturas foram congeladas em azoto líquido. A presença do vírus foi detectada nestas células por imunocitoquímica, PCR e RT-PCR.
ImunocitoquímicaAs culturas celulares infectadas com P1OLV ou
WLC-1 (Cutlip et al., 1977), depois de fixadas com uma solução de 10% formol em PBS (v/v) durante 15 min à temperatura ambiente (TA), foram lavadas e in-cubadas a 37 ºC durante 2 h com o anticorpo mono-clonal (Mab) 16D9 anti-MVV (Fevereiro et al., 1999). Depois de nova lavagem, as culturas foram incubadas durante 30 min a 37 ºC com imunoglobulinas de co-elho anti-IgG de murganho, conjugadas com biotina (Zymed Laboratories). A reacção antigénio-anticorpo foi revelada pela adição de streptavidina-HRP (Zymed Laboratories), durante 15 min à TA, seguida da solução substrato/cromogénio (3-amino-9-ethylcarbazole car-bazol/ H
2O
2) em tampão acetato (pH 5,0). As células
foram em seguida contrastadas com hematoxilina.
Células e ensaios de infecciosidadeCélulas SCP, obtidas de explantados do plexo corói-
de de ovino, foram cultivadas em meio DMEM suple-mentado com aminoácidos não-essenciais, piruvato de sódio, antibióticos e 10% de soro fetal de bovino, a 37 ºC em atmosfera com 5% de CO
2. As células de pul-
mão de ovino e da bainha sinovial da articulação do carpo de cabra (GSM), foram obtidas pelos processos habituais de digestão com tripsina e cultivadas no meio e condições acima descritas. Os MØ foram obtidos a partir de leucócitos do sangue periférico (PBL) de ovinos seronegativos ao MVV. Depois de colhido em tubos contendo EDTA, o sangue foi centrifugado (800 x g, 10 min, a 22 ºC) e ao sedimento celular adicio-nou-se tampão de lise dos eritrócitos (0,3 M NH
4Cl, 24
mM NaHCO3, 0,5 mM EDTA, pH 7,2). Após 10 min
de incubação à temperatura ambiente, os PBL foram recuperados por centrifugação, lavados duas vezes em
29
Fevereiro, M. T. e Barros, S. S. RPCV (2004) 99 (549) 27-39
PBS e suspensos em meio RPMI 1640 (Invitrogen), suplementado com antibióticos e 10% de soro de ovi-no inactivado. Os PBL foram distribuídos por tubos de teflon e incubados a 37 ºC durante uma semana para permitir a diferenciação dos MØ. A ausência do MVV e do CAEV nestas células foi garantida pela utilização de dadores seronegativos e por ensaios de PCR efec-tuados ao DNA extraído das células. A capacidade in-fectante e a cinética de replicação do P1OLV in vitro foi avaliada em células do pulmão, SCP, GSM e MØ e comparada com a estirpe WLC-1. Para estes ensaios, utilizaram-se stocks de vírus P1OLV e WLC-1, ante-riormente produzidos e titulados em células GSM. As diferentes culturas celulares foram inoculadas com 100 TCID
50, incubadas durante 24 h e depois de lavadas
com PBS adicionou-se meio de cultura completo. Os MØ mantidos em tubos teflon foram nesta fase trans-feridos para frascos de cultura de tecidos de 25 cm2. As culturas foram mantidas durante 1 a 6 semanas e observadas diariamente para registo de CPE e colheita de amostras dos sobrenadantes para avaliação do RNA viral produzido.
qRT-PCR quantitativoO RNA viral presente nos sobrenadantes das cultu-
ras inoculadas foi quantificado por RT-PCR em tempo real, num termociclador iCycler iQ (Bio-Rad). Para a reacção foram utilizados os reagentes Superscript One-Step RT-PCR (Invitrogen), 50 pmol de cada primer, 10 pmol de sonda e 10 µl de sobrenadante clarificado (10000 x g, durante 20 min) das culturas inoculadas ou de controlo, num volume final de 50 µl.
As condições de amplificação e detecção foram as seguintes: 45 min a 50 ºC; 2 min a 94 ºC; 40 ciclos de 15 seg a 94 ºC; 1 min a 53 ºC e 30 seg a 68 ºC. Os pri-mers (gag510f 5’-GGCTCAAAGGAGAAAAAGG-3’ e gag638r 5’GTCTATAGTTTTTAATGCCCA-3’) e a sonda (gagP610, 5’-TTCCCTTCTGTCAAGGTC-TCCTT-3’) utilizados, foram escolhidos com base numa região conservada do gene gag dos lentivírus de ovino. A sonda foi marcada no extremo 5’ com FAM (6-carboxifluoresceína), fosforilada e marcada com TAMRA (6- carboxi-tetrametilrodamina) no extremo 3’. A recta padrão RNA foi obtida a partir da correla-ção entre diferentes concentrações do RNA WLC-1 e os correspondentes valores Ct (limiar de detecção). A eficácia da reacção RT-PCR com o vírus total, presente no sobrenadante das culturas, relativamente ao RNA padrão foi verificada pela comparação dos declives da recta padrão e das rectas obtidas com as diluições dos sobrenadantes das culturas inoculadas com P1OLV e WLC-1. As diferenças (�s) dos declives foram � 0,1 para P1OLV e � 0,2 para WLC-1, indicando que o RNA padrão utilizado permitia a quantificação fidedigna do RNA viral de ambos os vírus presente nos sobrena-dantes das culturas celulares. O RNA viral foi então calculado a partir da intercepção dos valores Ct com a recta padrão.
Extracção de DNA e RNA viralCulturas de células de pulmão, infectadas com o
P1OLV, foram dissociadas com tripsina e lisadas du-rante 20 min a 65 ºC com 1% de SDS. O DNA viral não integrado foi obtido a partir de preparações de DNA ex-tracromossomal extraído pelo método de Hirt (1967). O RNA total foi extraído utilizando o sistema Rneasy (Qiagen), segundo as indicações do fabricante.
Amplificação do DNA proviral por PCRO genoma do P1OLV foi amplificado por PCR,
tendo sido obtidos três fragmentos contíguos compre-endendo a totalidade do genoma P1OLV. Os primers utilizados (Tabela 1) foram escolhidos a partir de se-quências MVV anteriormente publicadas (Somigo et al., 1985; Querat et al., 1990; Sargam et al., 1991; An-drésson et al., 1993). Para a reacção PCR foi utilizada uma Taq DNA polimerase com actividade de exonucle-ase 3’-5’ (Expand long template system, Roche), 50 pmol de cada primer e 0,5-1 µg de DNA, num volume final de 50 µl. Para a síntese e amplificação do cDNA do gene rev utilizou-se o sistema Superscript One-Step RT-PCR-Platinum Taq (Invitrogen). As reacções foram efectuadas num volume de 50 µl, com 50 pmol de cada primer e 1,5 µg de RNA total extraído das células de pulmão do animal infectado pelo P1OLV. As condições de amplificação para os diferentes pares de primers es-tão descritas na legenda da Figura 3.
Tabela 1 - Primers utilizados para amplificação dos fragmentos subge-nómicos do P1OLV.
Primers Sequência nucleotídica (5’-3’)
Posição
(genoma
P1OLV)
LTR1 CAGGATGACACAGCAAATGT 8979-8998
Pol2 TAGATTAGTCCTGAATTTGTTTCT 4443-4420
Pol1(W) AAGCTTGATCAACAGGAGCATATTGG 4161-4186
EnviR2 ACGCAATGGGGATGTCAACCTGAAGG 6421-6396
Env-XhoI CCGCTCGAGTGGGGATGTCTCATGTGGG 6252-6270
LTR2 CGGTGTTGCACGGAATTAGT 137-118
RevF ATGGCAAGTGGAAGAAAACCTGAC 5979-6002
RevR TTTTGAGGTTGCTCTCGCCAAT 8859-8838
Nota: Os nucleótidos sublinhados indicam o local de restrição da endo-nuclease XhoI. O primer Pol1(W) foi descrito anteriormente por Woodall (1994).
Clonagem e SequenciaçãoOs fragmentos amplificados por PCR foram ex-
cisados de géis de agarose de baixo ponto de fusão (NUSIEVE) e purificados pelo sistema Qiaex DNA purification system (Qiagen). Todas as tentativas de clonagem do fragmento LTR/Pol2 com 4571 pb no vector pBluescript II KS+ (pBS KS+) falharam. Este fragmento foi então hidrolisado com BamHI origi-nando dois fragmentos com 1554 pb e 3017 pb, os quais foram clonados individualmente em pBS KS+
RPCV (2004) 99 (549) 27-39Fevereiro, M. T. e Barros, S. S.
30
previamente linearizado com BamHI/EcoRV, obten-do-se os plasmídeos pP1/gag1554 e pP1/pol3017. O fragmento resultante da amplificação com os primers Pol1/Env2 assim como o cDNA correspon-dente ao gene rev foram clonados no vector pCR2.1 (Invitrogen), dando origem aos plasmídeos pP1/pol-env2261 e pP1/rev, respectivamente. O DNA am-plificado pelos primers Env1/LTR2 foi hidrolisado com a endonuclease XhoI e clonado no plasmídeo pWSK29 (Wang and Kushner, 1991) previamente li-nearizado com EcoRV/XhoI. A construção resultan-te foi denominada pP1/env2986. Os fragmentos clo-nados foram sequenciados pelo método enzimático descrito por Sanger (1977), com o sistema Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech). Para as reacções de sequencia-ção utilizaram-se os primers universais T7 e M13 e primers internos complementares das sequências do P1OLV, marcados com o fluorocromo Cy-5. As reacções foram analisadas no sequenciador automá-tico ALFexpress II (Amersham Pharmacia Biotech). Ambas as cadeias de DNA de pelo menos dois clo-nes independentes foram sequenciadas. Nos casos em que ocorreram discrepâncias nas leituras foi se-quenciado um terceiro clone independente.
Análise de sequências e filogeniaA análise filogenética foi realizada com o sof-
tware Wisconsin Sequence Analysis Package, do Genetics Computer Group (GCG, Universidade de Wisconsin) (Devereux et al., 1984). Os alinhamen-tos múltiplos das sequências dos genes pol (região RT) e env (proteína SU) foram gerados pelo progra-ma CLUSTALW, versão 1.6 (Thompson et al., 1994). Para o cálculo das distâncias genéticas e construção dos dendogramas recorreu-se ao programa PUZZLE, versão 2.3 (Strimmer e von Haeseler, 1996). Neste, a frequência de transições e transversões foi calcu-lada automaticamente a partir das sequências, assim como o parâmetro alfa para uma distribuição gama das taxas de substituição em que se consideraram diferentes taxas de heterogeneidade. O modelo de substituição escolhido baseou-se no algoritmo de distâncias de Tamura-Nei (TN-93) (Tamura e Nei, 1993). Os dendogramas foram visualizados no pro-grama TREEVIEW, versão 1.3 (Page, 1996).
Códigos de acesso das sequências nucleotídicasOs códigos de acesso à base de dados GenBank das
sequências nucleotídicas usados neste trabalho são: M18039 (K1514); M31646 (SA-OMVV); S51392 (EV-1); M33677 (CAEVco); U39826 (OLV-CU1); U63651 (OLV 85/34); U51910 (MVV KM1071); M60855 (CAEV 63); AJ400718 (CAEV 680); AJ400719 (CAEV 021); AJ400720 (CAEV 032); AJ400721 (CAEV 786); AF338226 (OLV S93); U35674 (OLV-663); U35676 (OLV-676); U35677 (OLV-679); U35678 (OLV-680).
Resultados
Isolamento e características de replicação in vitro do P1OLV
O P1OLV foi isolado a partir de células de pul-mão e plexo coroide de um animal seropositivo ao MVV. Ao exame histopatológico, os pulmões deste animal apresentavam lesões de broncopneumonia purulenta e hiperplasia dos folículos linfoides pe-ribrônquicos. A presença de vírus nas culturas ce-lulares foi detectada por imunocitoquímica, PCR e RT-PCR.
As características de replicação in vitro do P1OLV fo-ram estudadas em células de pulmão, SCP, GSM e MØ e comparadas com as da estirpe lítica WLC-1. Regista-ram-se diferenças significativas entre os dois vírus, quer na cinética de replicação nas células testadas (Figura 1) quer no CPE induzido. Como era esperado, a estirpe WLC-1 replicou rapidamente em todos os tipos celu-lares e com produção de elevados níveis de RNA viral, com o valor máximo obtido nas células SCP. Além dis-so, o WLC-1 replicou sempre de forma lítica, induzin-do a formação de numerosos sincícios e destruição do tapete celular (Figura 2). O P1OLV induziu infecções líticas em células GSM e em MØ, enquanto que em cé-lulas de pulmão e SCP originou infecções persistentes, sem CPE evidente (Figura 2).
Comparativamente ao isolado WLC-1, o P1OLV re-plicou de forma mais lenta e com níveis inferiores de produção de RNA viral (Figura 1). Nos MØ, os picos de RNA foram detectados cinco dias pós-inoculação (p.i.) para o WLC-1 e ao nono dia no P1OLV, sendo duas vezes superiores para o WLC-1. Em células de pulmão e SCP as diferenças de crescimento entre os dois vírus foram ainda maiores. Nestas células, os níveis máximos de RNA-P1OLV observados ao fim de 4 a 6 semanas p.i. foram, respectivamente quatro e cinco vezes infe-riores aos picos de RNA registados 14 dias p.i. para o WLC-1. Nas células GSM o pico de RNA-P1OLV foi registado duas semanas após o observado para a estirpe WLC-1 e cerca de 1,5 vezes mais baixo.
Clonagem e sequenciação do genoma do isolado P1OLV
O genoma do P1OLV foi clonado a partir de três fragmentos ampflificados por PCR com recurso aos pares de primers LTR1/Pol2, Pol1(W)/EnviR2 e Env-XhoI/LTR2 que compreendem a totalidade do genoma (Figura 3). A estratégia de clonagem está representada na Figura 4.
O genoma completo do P1OLV tem 9189 nucle-ótidos (Figura 5) e possui um conteúdo em G+C de 40,8%. Apresenta uma organização genética idêntica à dos SRLV anteriormente publicados e uma similarida-de de 79,9%, 80,1%, 78,9% e 69,9% respectivamente com as sequências dos isolados K1514, SA-OMVV, EV-1 e CAEVco.
A sequência integral do P1OLV foi submetida ao
31
Fevereiro, M. T. e Barros, S. S. RPCV (2004) 99 (549) 27-39
Figura 1 - Cinética de replicação dos vírus P1OLV e WLC-1 em células de pulmão, SCP, macrófagos e GSM . O RNA viral foi quanti-ficado a partir dos sobrenadantes das culturas por qRT-PCR, como descrito nos Materiais e Métodos. Os sobrenadantes das culturas de células não infectadas deram sempre resultados não mensuráveis.
Figura 2 - Células SCP infectadas com os isolados P1OLV (A e C) e WLC-1 (B e D). A) e B) imagens de microscopia de contraste de fase; note-se a formação de CPE (sincícios) nas células infectadas com a estirpe WLC-1. Nestas células o P1OLV induz infecções persistentes sem CPE evidente. C) e D) imunocitoquímica efectuada com recurso ao Mab16D9, como descrito nos Materias e Métodos. As células infectadas apresentam uma coloração avermelhada.
RPCV (2004) 99 (549) 27-39Fevereiro, M. T. e Barros, S. S.
32
1 ggagagagcggagttctaggagatcaatctcctggatctctcctgcctgtgctgagagctcaataaaggagttgactacaagagactgagcttgcctggt
R U5
. . . . . . . . . .
101 tattatcgggattcgttactaattccgtgcaataccggagcggatctcgcagctggcgcccaacgtggggctcgaagaaatacaagaggaggaatggaag
PBS
. . . . . . . . . .
201 taatgggaccccgaacgctgttgctgtgaagagaaaagaagcagcgcaagaggaacgtccagggactgccaaaaggaaaaggaaaacttcggggacgcct
. . . . . . . . . .
301 gaagtaaggtaagagagacacctactggagagagtagggaagggcacccttcaggaaagagaaagtgttgcttgggcacaggaggagggttcgcgaccct
. . . . . . . . . .
401 agtgaaagaaaaagggggcgcggacgtccttctgggccgaggggacacaaaaggcagcaccagtaagacaaccgctgtggtgaatctagataaagacatg
gagMet
. . . . . . . . . .
501 gcgaagcaaggctcaaaggagaaaaaggggtaccccgagctcaaagaggtaattaaagcaacttgtaaaataaaagttgggcccgggaaggagaccttga
AlaLysGlnGlySerLysGluLysLysGlyTyrProGluLeuLysGluValIleLysAlaThrCysLysIleLysValGlyProGlyLysGluThrLeuT
. . . . . . . . . .
601 cagaagggaactgtctatgggcattaaaaactatagactttatatttgaagatataaaggcagaaccttggaccataacaaaaatgtatacagtatgggg
hrGluGlyAsnCysLeuTrpAlaLeuLysThrIleAspPheIlePheGluAspIleLysAlaGluProTrpThrIleThrLysMetTyrThrValTrpGl
. . . . . . . . . .
701 aagattagcggcattaacgccagaggaaacaagcaaaagggaatttgcttcattgcaagctacgatggcatgtttgatgtgtagtcaaatggggatgaag
yArgLeuAlaAlaLeuThrProGluGluThrSerLysArgGluPheAlaSerLeuGlnAlaThrMetAlaCysLeuMetCysSerGlnMetGlyMetLys
. . . . . . . . . .
801 cccgagacagtgcaggcagctaggggaataataagtatgaaaggagggcttcaagaaaaacaagaggagaaagaaaagaaaatagaacaattgtatccta
ProGluThrValGlnAlaAlaArgGlyIleIleSerMetLysGlyGlyLeuGlnGluLysGlnGluGluLysGluLysLysIleGluGlnLeuTyrProA
. . . . . . . . . .
901 atttagagacacataaggaggtctaccccatagtaaatttacaagcagggggaagaagttggaaggccgtagaatcagtagtcttccagcagctacaaac
snLeuGluThrHisLysGluValTyrProIleValAsnLeuGlnAlaGlyGlyArgSerTrpLysAlaValGluSerValValPheGlnGlnLeuGlnTh
. . . . . . . . . .
1001 tgtagccatgcagcatggaattgtatctgaggactttgagaggcagttagcatattatgccactacttggacaagtaaagatatattagaagtactggcc
rValAlaMetGlnHisGlyIleValSerGluAspPheGluArgGlnLeuAlaTyrTyrAlaThrThrTrpThrSerLysAspIleLeuGluValLeuAla
. . . . . . . . . .
Figura 4. Estratégia de clonagem do genoma do P1OLV, a partir dos fragmentos subgenómicos amplificados por PCR, com recurso aos pares de primers LTR1/Pol2, Pol1(W)/EnviR2 e Env-XhoI/LTR2, compreen-dendo a totalidade do genoma. Os quatro clones recombinantes obtidos foram denominados de pP1/gag1554, pP1/pol3017, pP1/pol-env2261 e pP1/env2986.
Figura 3. Fragmentos subgenómicos amplificados por PCR utili-zados na clonagem do genoma do P1OLV. M1) marcador �DNA/HindIII; 2) produto PCR amplificado com os primers LTR1/Pol2 [94ºC-1min, 40 x (94ºC-30 s, 55ºC-1 min, 70ºC-5 min)]; 3) produ-to PCR amplificado com os primers Pol1(W)/EnviR2 [94ºC-2 min, 10 x (94ºC-10 s, 58ºC-30 s, 68ºC-3 min), seguidos de 20 ciclos nos quais se aumentou por ciclo 20 s ao passo de extenção)]; 4) produto PCR amplificado com os primers Env-XhoI/LTR2 [94ºC-2 min, 40 x (94ºC-30 s, 60ºC-1 min, 68ºC-3 min)]; 5) produto rev, obtido por RT-PCR com os primers RevF/RevR [48ºC-45 min, 40 x (94ºC-30 s, 50ºC-1 min, 72ºC-1 min)]; M2) marcador 100 bp DNA ladder (Invitrogen).
GenBank, tendo-lhe sido atribuído o código de acesso AF479638.
No RNA genómico do P1OLV foram identificados os genes estruturais gag, pol e env e os genes regula-dores vif, tat, rev, característicos dos SRLV. Nas extre-midades do genoma localizam-se sequências repetidas
longas directas (LTR) que contêm motivos promotores essenciais para a regulação da expressão génica. A lo-calização dos vários genes, o tamanho dos péptidos por eles codificados e as suas massas moleculares, estão apresentados na Tabela 2. A análise comparativa das sequências nucleotídicas do domínio U3 da LTR do
33
Fevereiro, M. T. e Barros, S. S. RPCV (2004) 99 (549) 27-39
1101 atgatgcctggaaatagagcacagaaagaattaatacaagggaaattaaatgaagaagcagagagatgggtgaggcaaaacccaggcccgaatgctctca
MetMetProGlyAsnArgAlaGlnLysGluLeuIleGlnGlyLysLeuAsnGluGluAlaGluArgTrpValArgGlnAsnProGlyProAsnAlaLeuT
. . . . . . . . . .
1201 cagtggatcaaattatgggagtgggacaaacaaatcaacaagcttcacaggctaatatggatcaagcaagacaaatatgtttacaatgggtaataacagc
hrValAspGlnIleMetGlyValGlyGlnThrAsnGlnGlnAlaSerGlnAlaAsnMetAspGlnAlaArgGlnIleCysLeuGlnTrpValIleThrAl
. . . . . . . . . .
1301 attgaggtcggtgagacatctatcgcataggcctggtaatcctatgctggtaaagcaaaagaatacagagagttatgaggactttgtagcgagactgtta
aLeuArgSerValArgHisLeuSerHisArgProGlyAsnProMetLeuValLysGlnLysAsnThrGluSerTyrGluAspPheValAlaArgLeuLeu
. . . . . . . . . .
1401 gaagcaattgatgcagaacctgtcacggatcctatcaaaacgtatttaaaagtaactctgtcttatacaaatgctagtacggattgtcaaaaacaaatgg
GluAlaIleAspAlaGluProValThrAspProIleLysThrTyrLeuLysValThrLeuSerTyrThrAsnAlaSerThrAspCysGlnLysGlnMetA
. . . . . . . . . .
1501 acagagtgttaggggctagggtccagcaggcaacagtagaagaaaaaatgcaggcatgtagagatgtgggatcagaaggatttaaaatgcaattgttggc
spArgValLeuGlyAlaArgValGlnGlnAlaThrValGluGluLysMetGlnAlaCysArgAspValGlySerGluGlyPheLysMetGlnLeuLeuAl
. . . . . . . . . .
1601 acaagctttgaggccggagagaaaagcaagacctcaaggagagaaacaaaaatgttataactgtggaaagccaggacatctggcgaggcaatgtaggcag
aGlnAlaLeuArgProGluArgLysAlaArgProGlnGlyGluLysGlnLysCysTyrAsnCysGlyLysProGlyHisLeuAlaArgGlnCysArgGln
. . . . . . . . . .
1701 ggaattatatgtcaccactgtggaaaaagagggcatatgcaaagagattgtaggcaaaaaagaagtggtgaccaaaagcaacagggaaacatcaggaggg
GlyIleIleCysHisHisCysGlyLysArgGlyHisMetGlnArgAspCysArgGlnLysArgSerGlyAspGlnLysGlnGlnGlyAsnIleArgArgG
pol ORFProLysAlaThrGlyLysHisGlnGluGl
. . . . . . . . . .
1801 ggccacgtgtggtgccgtccgcaccccctatgttgtaacagaagcaccacctaaagtagaagtaaaagtagggacaacttggaaaagtctattagtggat
lyProArgValValProSerAlaProProMetLeu•
yAlaThrCysGlyAlaValArgThrProTyrValValThrGluAlaProProLysValGluValLysValGlyThrThrTrpLysSerLeuLeuValAsp
. . . . . . . . . .
1901 acaggggcagatagaacaatagtaagaaatcatgataacacaggtagacctagggggagaataaaattacaaggaatagggggaataatagaaggggaaa
ThrGlyAlaAspArgThrIleValArgAsnHisAspAsnThrGlyArgProArgGlyArgIleLysLeuGlnGlyIleGlyGlyIleIleGluGlyGluL
. . . . . . . . . .
2001 aatgggatcaagtgcaaatacagtacaaaggaaaggaaataaaaggaactatagtagtgctagcagctagcccagtagaagtactggggcgggataacat
ysTrpAspGlnValGlnIleGlnTyrLysGlyLysGluIleLysGlyThrIleValValLeuAlaAlaSerProValGluValLeuGlyArgAspAsnMe
. . . . . . . . . .
2101 gggtgaattaggatttagattagttatggcaaatttagaagaaaagaaaattcccgtaacagaagtaaaattaaaggaaggatgtaaaggacctcatata
tGlyGluLeuGlyPheArgLeuValMetAlaAsnLeuGluGluLysLysIleProValThrGluValLysLeuLysGluGlyCysLysGlyProHisIle
. . . . . . . . . .
2201 gcgcaatggccattgactcaagaaaaattagaaggattgcaagaaatagtagacagattagaaaaagaagggaaagtaggaagagcaccgcctcattgga
AlaGlnTrpProLeuThrGlnGluLysLeuGluGlyLeuGlnGluIleValAspArgLeuGluLysGluGlyLysValGlyArgAlaProProHisTrpT
. . . . . . . . . .
2301 catgtaacactccaatattttgtattaagaaaaaatcagggaaatggaggatgttaatagatttcagagaattaaataagcaaacagaagatttggcgga
hrCysAsnThrProIlePheCysIleLysLysLysSerGlyLysTrpArgMetLeuIleAspPheArgGluLeuAsnLysGlnThrGluAspLeuAlaGl
. . . . . . . . . .
2401 agctcagttaggactcccgcatcctggaggacttcagaaaaagaaacatgtaacaatattagatataagtgatgcatattttacaattcctttgtttgaa
uAlaGlnLeuGlyLeuProHisProGlyGlyLeuGlnLysLysLysHisValThrIleLeuAspIleSerAspAlaTyrPheThrIleProLeuPheGlu
. . . . . . . . . .
2501 ccctatagaaagtatacatgttttactatgctaagcccaaataatttaggaccctgcaccagatattattggaaggtgctacctcaggggtggaagttaa
ProTyrArgLysTyrThrCysPheThrMetLeuSerProAsnAsnLeuGlyProCysThrArgTyrTyrTrpLysValLeuProGlnGlyTrpLysLeuS
. . . . . . . . . .
2601 gtcccgcagtatatcagtttacaatgcaaagtatattaagaagttggatagcaaaacatcctttaatacaatttgggatatatatggatgacatctatat
erProAlaValTyrGlnPheThrMetGlnSerIleLeuArgSerTrpIleAlaLysHisProLeuIleGlnPheGlyIleTyrMetAspAspIleTyrIl
. . . . . . . . . .
2701 aggaagtgatatggacatagaaaaacatagaggggtggtggaggaattggcagcgtatattgcccaatatgggtttatgctgcctgaagaaaagagacaa
eGlySerAspMetAspIleGluLysHisArgGlyValValGluGluLeuAlaAlaTyrIleAlaGlnTyrGlyPheMetLeuProGluGluLysArgGln
. . . . . . . . . .
2801 gaaggatacccagcaacatggcttggatttgaattacatccagataaatggagatttcagaaacatactttgccagacttaaaagaagggacgataacat
GluGlyTyrProAlaThrTrpLeuGlyPheGluLeuHisProAspLysTrpArgPheGlnLysHisThrLeuProAspLeuLysGluGlyThrIleThrL
. . . . . . . . . .
2901 taaataaattacaaaaagtagtaggagacttagtctggagacaatccttaatagggaaaagtataccaaatatattgaagttaatggaaggggatagagc
euAsnLysLeuGlnLysValValGlyAspLeuValTrpArgGlnSerLeuIleGlyLysSerIleProAsnIleLeuLysLeuMetGluGlyAspArgAl
. . . . . . . . . .
3001 gctgcagagtgagaggaaaatacaacaagtacatgttcaggaatgggaaagatgtaagagaaaactagaagaaatggaaggaaagtattatgatgaagga
aLeuGlnSerGluArgLysIleGlnGlnValHisValGlnGluTrpGluArgCysLysArgLysLeuGluGluMetGluGlyLysTyrTyrAspGluGly
. . . . . . . . . .
3101 aaagatgtgtatggacaaatagattggggggatagagctgtagaatatgtagtgttccaggaaaagggaaagcctttatgggtcaatgtagtacatagta
LysAspValTyrGlyGlnIleAspTrpGlyAspArgAlaValGluTyrValValPheGlnGluLysGlyLysProLeuTrpValAsnValValHisSerI
. . . . . . . . . .
3201 taaaaaatttaagtctagcacagcaaattatcaaagcagcgcagaagatgacacaagaagtaatagtcagaacagggaagataccgtggatactgttacc
leLysAsnLeuSerLeuAlaGlnGlnIleIleLysAlaAlaGlnLysMetThrGlnGluValIleValArgThrGlyLysIleProTrpIleLeuLeuPr
. . . . . . . . . .
3301 agggaaagaagaggattggatactggaattacaagcgggaaatataacctggatgccatcattttggtcgtgttacagggggtcagtaagatggaggaag
oGlyLysGluGluAspTrpIleLeuGluLeuGlnAlaGlyAsnIleThrTrpMetProSerPheTrpSerCysTyrArgGlySerValArgTrpArgLys
. . . . . . . . . .
3401 agaaatatagtagcagaggtagtagcgggaccaacatattatactgatggaggaaagaaaaatggaataggaagcttaggctatatagcatcaacagggg
ArgAsnIleValAlaGluValValAlaGlyProThrTyrTyrThrAspGlyGlyLysLysAsnGlyIleGlySerLeuGlyTyrIleAlaSerThrGlyG
. . . . . . . . . .
3501 agaaatacagaaaacgtgaacagggaacaaatcaacagttagaattaagggcaatagaggaagcgtgtaagcaagggccaaaagtaatgaatgtagtaac
luLysTyrArgLysArgGluGlnGlyThrAsnGlnGlnLeuGluLeuArgAlaIleGluGluAlaCysLysGlnGlyProLysValMetAsnValValTh
. . . . . . . . . .
3601 agatagcagatatgcatttgaatttatgttacgggacggagatgaagaagttatcaaaaatccaatacaagccagaattatgaaattgatacataacaag
RPCV (2004) 99 (549) 27-39Fevereiro, M. T. e Barros, S. S.
34
rAspSerArgTyrAlaPheGluPheMetLeuArgAspGlyAspGluGluValIleLysAsnProIleGlnAlaArgIleMetLysLeuIleHisAsnLys
. . . . . . . . . .
3701 gataagataggaatacattgggtgcctggacacaaaggaattccacaaaatgaagaaattgataaatatatttcagaaatatttttagcaaaggaaggag
AspLysIleGlyIleHisTrpValProGlyHisLysGlyIleProGlnAsnGluGluIleAspLysTyrIleSerGluIlePheLeuAlaLysGluGlyG
. . . . . . . . . .
3801 aagggattctccccaaaaggagagaagacgcgggatatgacttaatatgtccacaagaagtgagcattccagcaggacaagtaaaaaagataccaattga
luGlyIleLeuProLysArgArgGluAspAlaGlyTyrAspLeuIleCysProGlnGluValSerIleProAlaGlyGlnValLysLysIleProIleAs
. . . . . . . . . .
3901 tctaaggttaaacctaaaggaggatcaatgggccctgatagggaccaaaagtagtcttgcaagtaagggagtatttgtacaaggagggatcatagattca
pLeuArgLeuAsnLeuLysGluAspGlnTrpAlaLeuIleGlyThrLysSerSerLeuAlaSerLysGlyValPheValGlnGlyGlyIleIleAspSer
. . . . . . . . . .
4001 gggtatcaaggacaggtacaggtagtaatttataacagtaatgatagggaagtagttataccacaggggagaaaatttgcacaattaatactcatgcctt
GlyTyrGlnGlyGlnValGlnValValIleTyrAsnSerAsnAspArgGluValValIleProGlnGlyArgLysPheAlaGlnLeuIleLeuMetProL
. . . . . . . . . .
4101 tggtgcatgaagagttaggaacgtggggaaaaacaaggaagacagaaagagggaaagaaggatttggatcaacaggagcatattgggtcgaaaatattcc
euValHisGluGluLeuGlyThrTrpGlyLysThrArgLysThrGluArgGlyLysGluGlyPheGlySerThrGlyAlaTyrTrpValGluAsnIlePr
. . . . . . . . . .
4201 aatagcagaagaggatcatcacagatggcatcaagatgctatgtcattacaattaagctttggaatacccagagctgcagctgaggatatagtacagcaa
oIleAlaGluGluAspHisHisArgTrpHisGlnAspAlaMetSerLeuGlnLeuSerPheGlyIleProArgAlaAlaAlaGluAspIleValGlnGln
. . . . . . . . . .
4301 tgtgaagtatgtcaagaaagtaaaatgtcgagtactatcagaggaggtaacaaaagagggatagatcattggcaggtagactatactcattatgaagaca
CysGluValCysGlnGluSerLysMetSerSerThrIleArgGlyGlyAsnLysArgGlyIleAspHisTrpGlnValAspTyrThrHisTyrGluAspL
. . . . . . . . . .
4401 aaataatactagtatggatagaaacaaattcagggttaatatatgcagaaagagtaaaaggggaaacgggacaagaatttaggatgcaagtaatgaaatg
ysIleIleLeuValTrpIleGluThrAsnSerGlyLeuIleTyrAlaGluArgValLysGlyGluThrGlyGlnGluPheArgMetGlnValMetLysTr
. . . . . . . . . .
4501 gtatgctctgtttgccccaagttcattgcagtctgataatggacctgcatttgtggcagaaccaacacaactgttaatgaaatatttagggatagaacac
pTyrAlaLeuPheAlaProSerSerLeuGlnSerAspAsnGlyProAlaPheValAlaGluProThrGlnLeuLeuMetLysTyrLeuGlyIleGluHis
. . . . . . . . . .
4601 cgtacaggaataccatggaaccctcaatcacaagcattagtagagagagcccatcaaacattcaagtatacattagaaaaattgctccctatgtttgcag
ArgThrGlyIleProTrpAsnProGlnSerGlnAlaLeuValGluArgAlaHisGlnThrPheLysTyrThrLeuGluLysLeuLeuProMetPheAlaA
. . . . . . . . . .
4701 catttgaatctgcagttgcggctaccctaatagctctaaatataaaaagaaagggtgggctagggacaagccctatggatatatttatcttcaataaaga
laPheGluSerAlaValAlaAlaThrLeuIleAlaLeuAsnIleLysArgLysGlyGlyLeuGlyThrSerProMetAspIlePheIlePheAsnLysGl
. . . . . . . . . .
4801 acagcaaagaatacaaaaacaacagcaaataaatcagtcgaaaaatcgattttgttattacaggatcagaaaaagaggacacccaggtgactggcaggga
uGlnGlnArgIleGlnLysGlnGlnGlnIleAsnGlnSerLysAsnArgPheCysTyrTyrArgIleArgLysArgGlyHisProGlyAspTrpGlnGly
. . . . . . . . . .
4901 ccaacacaggtactgtgggaaggggaaggagcaatagtagtcaaagataaaactacagagaagtatttagtaatagctaacaaagatgcaaaattcatcc
ProThrGlnValLeuTrpGluGlyGluGlyAlaIleValValLysAspLysThrThrGluLysTyrLeuValIleAlaAsnLysAspAlaLysPheIleP
vifMetGlnAsnSerSer
. . . . . . . . . .
5001 caccgcctaaagaaatacaaaaagaataaggaaagagaaataggaccacagttaccactttgggcatggaaagaaactgcgtttagcataaatcaagaac
roProProLysGluIleGlnLysGlu•
HisArgLeuLysLysTyrLysLysAsnLysGluArgGluIleGlyProGlnLeuProLeuTrpAlaTrpLysGluThrAlaPheSerIleAsnGlnGluP
. . . . . . . . . .
5101 catactggtataataccataagattgcagggattgatgtggaacaaacgagggcataaacttgtatttaagcatgagaaaggaggatatgaatattggga
roTyrTrpTyrAsnThrIleArgLeuGlnGlyLeuMetTrpAsnLysArgGlyHisLysLeuValPheLysHisGluLysGlyGlyTyrGluTyrTrpGl
. . . . . . . . . .
5201 aacgtccaataaagattggaaaatggagttaagaagagacctgggactaatagcccagataaactttagaaatgcctggcagtataaaagccggggggaa
uThrSerAsnLysAspTrpLysMetGluLeuArgArgAspLeuGlyLeuIleAlaGlnIleAsnPheArgAsnAlaTrpGlnTyrLysSerArgGlyGlu
. . . . . . . . . .
5301 tggaaaaccctgggagtatggtatgaaaccccaggggattataggaaaaaggagaaacaattttggtttcattggagagtagccctttgtagttgcagga
TrpLysThrLeuGlyValTrpTyrGluThrProGlyAspTyrArgLysLysGluLysGlnPheTrpPheHisTrpArgValAlaLeuCysSerCysArgL
. . . . . . . . . .
5401 aaacaaaatgggatatacgggaatttatgatagggaaacatagatgggacttatgtaaatcctgcatgcaaggagaaatagttcgacacacagaaccaaa
ysThrLysTrpAspIleArgGluPheMetIleGlyLysHisArgTrpAspLeuCysLysSerCysMetGlnGlyGluIleValArgHisThrGluProLy
. . . . . . . . . .
5501 aagcttgcagcgcttagctttattgcaaataacaagggatcatatatttcaagtaatgccattgtggagagcgaggagagtaacagtgcaaaggtttccc
sSerLeuGlnArgLeuAlaLeuLeuGlnIleThrArgAspHisIlePheGlnValMetProLeuTrpArgAlaArgArgValThrValGlnArgPhePro
. . . . . . . . . .
5601 tggtgtagggacccaacaggttatacgcttccttggtctatacaggaatgctgggaaatggaaactatatatgaataatggaagaagtgccaaggagaag
TrpCysArgAspProThrGlyTyrThrLeuProTrpSerIleGlnGluCysTrpGluMetGluThrIleTyrGlu•
tatMetGluGluValProArgArgAr
. . . . . . . . . .
5701 acctggaggaagcagggaagtagaagggatatttcaattctatgaggattgggaatgttgggactatataagccaacgggtacctaatggcatattgcaa
gProGlyGlySerArgGluValGluGlyIlePheGlnPheTyrGluAspTrpGluCysTrpAspTyrIleSerGlnArgValProAsnGlyIleLeuGln
. . . . . . . . . .
5801 agatggttagccatgcttactaataatcagcttaggaaaacagtaattagagaagctcagaaatggatatggcggcataagagagccagaattcaaagaa
ArgTrpLeuAlaMetLeuThrAsnAsnGlnLeuArgLysThrValIleArgGluAlaGlnLysTrpIleTrpArgHisLysArgAlaArgIleGlnArgA
. . . . . . . . . .
5901 attgtggctgtaggctctgtaaccccgggtggggaagtcaagtgagagaggctgatctctaattgagcatttaacagaatggcaagtggaagaaaacctg
snCysGlyCysArgLeuCysAsnProGlyTrpGlySerGlnValArgGluAlaAspLeu• envMetAlaSerGlyArgLysProA
rev exon 1
. . . . . . . . . .
6001 acagaatgacgtggaaagaaatggaacccccgttaagagaaacctggggaaaggtggtaaatgaattagcagaaagacagcggcaagaagacatgagagg
spArgMetThrTrpLysGluMetGluProProLeuArgGluThrTrpGlyLysValValAsnGluLeuAlaGluArgGlnArgGlnGluAspMetArgGl
35
Fevereiro, M. T. e Barros, S. S. RPCV (2004) 99 (549) 27-39
. . . . . . . . . .
6101 cctaataacaggtaagaagaagcactgggtaagtattaacctcctggggatagaacagaaggaagaaaacaaggtaaatatatgggaaccatgtgaaaaa
yLeuIleThrGlyLysLysLysHisTrpValSerIleAsnLeuLeuGlyIleGluGlnLysGluGluAsnLysValAsnIleTrpGluProCysGluLys
•end rev exon 1
. . . . . . . . . .
6201 tggtgggcacaactaatatggggagtattatgggtattacagatgatattatggggatgtctcatatgggaaatggggaagaatacaaacaagtgtgctg
TrpTrpAlaGlnLeuIleTrpGlyValLeuTrpValLeuGlnMetIleLeuTrpGlyCysLeuIleTrpGluMetGlyLysAsnThrAsnLysCysAlaA
. . . . . . . . . .
6301 cagaagaaatgattgcattaatagaagatccaggcggatttcaaaaagtaacacaggtagagactgtaccagtaacctgtgtaacaaaaaactttacgca
laGluGluMetIleAlaLeuIleGluAspProGlyGlyPheGlnLysValThrGlnValGluThrValProValThrCysValThrLysAsnPheThrGl
. . . . . . . . . .
6401 atggggatgtcaacctgaaggagcctatccagatccagaactagagtataggaatatatcacaagaaattttagaacaggtatataaaagagaatggcca
nTrpGlyCysGlnProGluGlyAlaTyrProAspProGluLeuGluTyrArgAsnIleSerGlnGluIleLeuGluGlnValTyrLysArgGluTrpPro
. . . . . . . . . .
6501 tggaatacttatcattggcctttatggcaaatggaaaatatgagacaatggatgaaagagaatgaaagagaatataaagaaaggacaaataaaacaaaag
TrpAsnThrTyrHisTrpProLeuTrpGlnMetGluAsnMetArgGlnTrpMetLysGluAsnGluArgGluTyrLysGluArgThrAsnLysThrLysG
. . . . . . . . . .
6601 aagatatagatgccctattagcaggaaacatacgaggaagattttgtgtcccatatccttttgccttgctgaagtgtgaagaatggtgttggtacccaga
luAspIleAspAlaLeuLeuAlaGlyAsnIleArgGlyArgPheCysValProTyrProPheAlaLeuLeuLysCysGluGluTrpCysTrpTyrProAs
. . . . . . . . . .
6701 tgaaataaatgaagaaacagggcatgcagaaaaaataaaaataaattgtactaaggcaaaagcagtgtcatgcacagagaagatgcctttggcggcagta
pGluIleAsnGluGluThrGlyHisAlaGluLysIleLysIleAsnCysThrLysAlaLysAlaValSerCysThrGluLysMetProLeuAlaAlaVal
. . . . . . . . . .
6801 caaagagtatattgggagaaagaagatagggcaagtatggaatttttaaatataaaagcatgtaatgcttcaaggctgcggtgtcaggaggtagaaaaga
GlnArgValTyrTrpGluLysGluAspArgAlaSerMetGluPheLeuAsnIleLysAlaCysAsnAlaSerArgLeuArgCysGlnGluValGluLysS
. . . . . . . . . .
6901 gcccagggggatgtatgcagggataccccattcctgtaggagcgcaaataataccagagagtatgaagtatctgaggggaaagaaaagtctatatggagg
erProGlyGlyCysMetGlnGlyTyrProIleProValGlyAlaGlnIleIleProGluSerMetLysTyrLeuArgGlyLysLysSerLeuTyrGlyGl
. . . . . . . . . .
7001 gattaaggatacaaatggggaattaaaattacctttgtcagtaagagtgtgggtgagaatggctaatctgtcacaatgggtaaatgggacaccaccgtat
yIleLysAspThrAsnGlyGluLeuLysLeuProLeuSerValArgValTrpValArgMetAlaAsnLeuSerGlnTrpValAsnGlyThrProProTyr
. . . . . . . . . .
7101 tggagtgcaagaatcaatgggagcacaggaataaatgggacaagatggtatggagtgagatcactacatcacttagggtttaacattagtagtaaccctg
TrpSerAlaArgIleAsnGlySerThrGlyIleAsnGlyThrArgTrpTyrGlyValArgSerLeuHisHisLeuGlyPheAsnIleSerSerAsnProG
. . . . . . . . . .
7201 agaagggaatttgcaattttacaaaggagctatggataggaaatgacaaattcccatatcaatataaaccatcttggaattgctcacaaaattggacagg
luLysGlyIleCysAsnPheThrLysGluLeuTrpIleGlyAsnAspLysPheProTyrGlnTyrLysProSerTrpAsnCysSerGlnAsnTrpThrGl
. . . . . . . . . .
7301 acatccggtatggcacgtattcagatacttagacatggcagaacatatgacaagtacgtgtgtacaaaggccagaaagacataatataacagtggggaat
yHisProValTrpHisValPheArgTyrLeuAspMetAlaGluHisMetThrSerThrCysValGlnArgProGluArgHisAsnIleThrValGlyAsn
. . . . . . . . . .
7401 ggaactctaacaggaaattgtagtgttacagattgggatggatgtaactgcactctatcagggaattatctatacaatagtacaacaggaggattaatag
GlyThrLeuThrGlyAsnCysSerValThrAspTrpAspGlyCysAsnCysThrLeuSerGlyAsnTyrLeuTyrAsnSerThrThrGlyGlyLeuIleV
. . . . . . . . . .
7501 tagttatatgcagacaaaacagcacaataacaggaataatgggaaccaacacgaattggacaacaatgtggagaagatatgagaattgctcgtgcaggaa
alValIleCysArgGlnAsnSerThrIleThrGlyIleMetGlyThrAsnThrAsnTrpThrThrMetTrpArgArgTyrGluAsnCysSerCysArgAs
. . . . . . . . . .
7601 tgagtccttggcaaggactgggaatggtaccttaggaacagtgaataatcctaactgcagtttaccacacataaacgagagtaggcaatggacatgtagc
nGluSerLeuAlaArgThrGlyAsnGlyThrLeuGlyThrValAsnAsnProAsnCysSerLeuProHisIleAsnGluSerArgGlnTrpThrCysSer
. . . . . . . . . .
7701 gcaagagtagggggaaccacaagggattctttatatatagcaggtagaaatttttggggtagagtaaaagcacaatacagctgtgaaagtaacctagggg
AlaArgValGlyGlyThrThrArgAspSerLeuTyrIleAlaGlyArgAsnPheTrpGlyArgValLysAlaGlnTyrSerCysGluSerAsnLeuGlyG
. . . . . . . . . .
7801 gattagatgggatgatgcatcaacaaatgctactgcagagataccaagttataagggtaagagcttacacatatggtgttgtggatatgcctaaagcata
lyLeuAspGlyMetMetHisGlnGlnMetLeuLeuGlnArgTyrGlnValIleArgValArgAlaTyrThrTyrGlyValValAspMetProLysAlaTy
SUTM
. . . . . . . . . .
7901 tagtgaaaaaaagaaaagacaaccacaaagcttacaaaggagaaagagaggaatagggttggtcatagtgctggctatcatggcaataatagctgctgca
rSerGluLysLysLysArgGlnProGlnSerLeuGlnArgArgLysArgGlyIleGlyLeuValIleValLeuAlaIleMetAlaIleIleAlaAlaAla
. . . . . . . . . .
8001 ggggctggactcggcgttgcgaatgccgtgcagcaatcctacacaaggacggctgtccagtcacttgctaacgcaactgcggcgcagcagaatgtgttag
GlyAlaGlyLeuGlyValAlaAsnAlaValGlnGlnSerTyrThrArgThrAlaValGlnSerLeuAlaAsnAlaThrAlaAlaGlnGlnAsnValLeuG
. . . . . . . . . .
8101 aagcaacttatgctatggtacagcacgtggctaaaggaataagaatattggaagcaagagttgctagagttgaggctatagtagacagaatgatgctata
luAlaThrTyrAlaMetValGlnHisValAlaLysGlyIleArgIleLeuGluAlaArgValAlaArgValGluAlaIleValAspArgMetMetLeuTy
. . . . . . . . . .
8201 tcacgaattagattgctggcattatcaacactattgtgtaacctctactaaaagtgcagtagcaatgtatgtaaattggactaggtataaggataattgt
rHisGluLeuAspCysTrpHisTyrGlnHisTyrCysValThrSerThrLysSerAlaValAlaMetTyrValAsnTrpThrArgTyrLysAspAsnCys
. . . . . . . . . .
8301 acatggcagcaatgggaagaggaaatagaacagcatgaaagaaatttaagtcaacttctccgggaagcagcgttacaagtacacatagcgcagcgagatg
ThrTrpGlnGlnTrpGluGluGluIleGluGlnHisGluArgAsnLeuSerGlnLeuLeuArgGluAlaAlaLeuGlnValHisIleAlaGlnArgAspA
. . . . . . . . . .
8401 caagcagaataccggatgtgtggcaggcattacaagaagcatttgattggtcaggatggttttcatggctgaaatatataccatggatagtaatgggaat
laSerArgIleProAspValTrpGlnAlaLeuGlnGluAlaPheAspTrpSerGlyTrpPheSerTrpLeuLysTyrIleProTrpIleValMetGlyIl
. . . . . . . . . .
8501 tgtaggaataatctgttttagaatagtaatgtgtatggtttctgtgtgtttacaggcatacaaacaagtgaaagagatcagatatacacaggtaaccata
eValGlyIleIleCysPheArgIleValMetCysMetValSerValCysLeuGlnAlaTyrLysGlnValLysGluIleArgTyrThrGlnValThrIle
rev exon 2 IleGlnThrSerGluArgAspGlnIleTyrThrGlyAsnHisS
RPCV (2004) 99 (549) 27-39Fevereiro, M. T. e Barros, S. S.
36
Tabela 2 - Proteínas codificadas pelo genoma do P1OLV
GenesPosição Tamanho do péptido
(nºde aminoácidos)Massa molecular
prevista (kDa)Designação
proteínaNucleótidos Aminoácidos
gag (precursor) 498-1838 1-446 446 50,4 Pr55Gag
MA 498-926 1-143 143 16,2 p16
CA 927-1596 144-363 220 24,7 p24
NC 1597-1838 364-446 83 9,5 p14
pol 1772-5029 - 1085 123,8 Pr160GagPol
vif 4986-5678 - 230 28,4 p30
tat 5678-5962 - 94 11,4 -
rev exão 1
exão 2
5979-6113
8558-8863
1-45
46-146146 (ex.1+ex.2) 17,1(ex.1+ex.2) -
env (precursor) 5979-8936 1-985 985 114,0 gp150
SU 5979-7949 1-657 657 76,1 gp 125
TM 7950-8936 658-985 328 37,9 gp 41
Nota. A massa molecular dos péptidos, estimada com base na sequência de resíduos aminoacídicos foi calculada pelo programa SAPS do Emboss. As posições dos genes referem-se ao codão de iniciação da tradução e ao de terminação, à excepção de pol cuja posição diz respeito ao início da ORF.
na análise das relações filogenéticas. Assim, optou-se pelo modelo de Tamura-Nei (TN-93) uma vez que este assume diferenças nas frequências das bases, nas ta-xas de transição/transversão e nas taxas de substituição para as diferentes posições nucleotídicas.
A análise filogenética, baseada nos alinhamentos das sequências do gene pol (RT) e env (SU) revelou que o P1OLV agrupa claramente com os isolados MVV, num ramo separado do grupo dos vírus do tipo CAEV (Fi-gura 6). Tal como descrito por outros (Leroux et al., 1995), o isolado Francês OLV-676 posicionou-se equi-distantemente do grupo do MVV e do CAEV, no que respeita à sequência da RT (Figura 6A). Por outro lado, os lentivírus de ovino Franceses (OLV-663, -679, -680) agruparam-se com os vírus do tipo CAEV. As relações filogenéticas inferidas para os vírus Americanos (S93 e OLV85-34), a partir de sequências do gene env, evi-denciaram uma maior similaridade com o grupo dos
Figura 5 - Sequência nucleotídica completa do genoma do P1OLV. As sequências peptídicas dos vários genes estão assinaladas, sendo o início de cada gene identificado pelo tripleto ATG, à excepção da grelha de leitura pol que é apresentada desde o seu início. O codão stop é assinalado por (•).
. . . . . . . . . .
8601 gtgatagaagaaccagtggacctagaggaaaaccaaagagacgacatggctggtttaaatggctacggaaacttaaagcaagagagaagaccatcccggc
ValIleGluGluProValAspLeuGluGluAsnGlnArgAspAspMetAlaGlyLeuAsnGlyTyrGlyAsnLeuLysGlnGluArgArgProSerArgA
erAspArgArgThrSerGlyProArgGlyLysProLysArgArgHisGlyTrpPheLysTrpLeuArgLysLeuLysAlaArgGluLysThrIleProAl
. . . . . . . . . .
8701 ggagttttatccagatctggagggcaacattgcaggcctggaagaactctgcttggggaaaggattggaagaaaattccatatatgagcctactcccgat
rgSerPheIleGlnIleTrpArgAlaThrLeuGlnAlaTrpLysAsnSerAlaTrpGlyLysAspTrpLysLysIleProTyrMetSerLeuLeuProIl
aGluPheTyrProAspLeuGluGlyAsnIleAlaGlyLeuGluGluLeuCysLeuGlyLysGlyLeuGluGluAsnSerIleTyrGluProThrProAsp
. . . . . . PPT . U3 . .
8801 aatagtggtccagcaatggatggaagacaatggttggattggcgagagcaacctcaaaaataaaaaagaaagggtggactgtcaggacagagaacaaatg
eIleValValGlnGlnTrpMetGluAspAsnGlyTrpIleGlyGluSerAsnLeuLysAsnLysLysGluArgValAspCysGlnAspArgGluGlnMet
AsnSerGlyProAlaMetAspGlyArgGlnTrpLeuAspTrpArgGluGlnProGlnLys•end rev exon 2
. . . . . . . . . .
8901 cctcctttggagaatgactatgtagaattagcctagtagttataggaatgccacatcactgttaccagaaagcgtagtcaggatgacaaagcaaatgtaa
ProProLeuGluAsnAspTyrValGluLeuAla• env
. . . . . . . . . .
9001 ccgcaagttctgctttttgctgcaaagtcatgtaccagctgatgcttagatcataaccacacatgtaaacaactggcctatataagctgcttgctagctg
. . . . . . . .
9101 ggagagagcggagttctaggagatcaatctcctggatctctcctgcctgtgctgagagctcaataaaggagttgactacaagagactga
U3R
P1OLV com as de outros SRLV, mostrou diferenças que poderão estar implicadas no fenótipo lento/baixo do P1OLV. O local consenso AP-1 (TGAG/cTCA) des-crito como importante para a activação da transcrição mediada pela proteína Tat (Gabuzda et al., 1989; Mor-se et al., 1999), possui três mutações no P1OLV. Além disso, a LTR do P1OLV não possui a repetição de 43 pb típica das estirpes Islandesas.
Análise filogenéticaA análise da composição nucleotídica do P1OLV
revelou uma frequência superior do nucleótido adeni-na em relação aos outros nucleótidos, como é típico dos lentívirus (Vanhermet e Berkhout, 1995; Zanoni, 1998). Também para os lentivírus, está descrito que a mutação mais frequente é a transição de G para A (Wain-Hobson et al., 1995). Estas observações in-fluenciaram a escolha do modelo evolutivo utilizado
37
Fevereiro, M. T. e Barros, S. S. RPCV (2004) 99 (549) 27-39
quando comparados com os vírus isolados a partir do plexo coroide do mesmo animal (Andrésdóttir et al., 1998). Contudo, relativamente ao P1OLV, verificou-se que o vírus isolado a partir de células SCP não evi-dencia vantagens replicativas, nestas células, compa-rativamente ao vírus isolado do pulmão. As sequências de fragmentos subgenómicos obtidos por PCR o DNA extraído tanto de células de pulmão como de SCP apre-sentaram 100% de homologia, sugerindo assim que os isolados obtidos a partir de ambos os tipos celulares são neste caso a mesma espécie viral.
A restrição da replicação do CAEV nas células SCP é atribuída à deficiente clivagem da glicoproteína do en-velope do vírus nestas células (Chebloune et al., 1996). No entanto, esta explicação não se aplica ao P1OLV, uma vez que sobrenadantes das culturas SCP-P1OLV induzem infecções quando inoculados em novas célu-las, confirmando assim a produção de partículas virais infecciosas nas células SCP.
As LTR de diferentes vírus apresentam variações na eficiência da actividade promotora e reguladora da ex-pressão viral consoante o ambiente celular em que se encontrem pelo que são, em parte, responsáveis pelo tropismo e propriedades biológicas dos isolado (Payne et al., 1999; Agnarsdóttir et al., 2000). Estudos preli-minares sobre as actividades promotoras das LTR do P1OLV e WLC-1, indicam um actividade mais baixa para o P1OLV. Estão em curso trabalhos que preten-
Figura 6 - Árvores filogenéticas baseadas nas sequência nucleotídicas dos genes pol (região RT) e env (SU), geradas pelo programa PUZZLE com o mo-delo evolutivo TN-93. (A) Árvore filogenética da região RT, com taxa de transição/transversão de 5,24, frequência de nucleótidos de A=0,399; C=0,141; G=0,207; T=0,253, parâmetro alfa estimado de 0,25 e Log Likelihood = -2125,78. (B) Árvore filogenética das sequências SU, com os parâmetros: taxa de transição/transversão de 2,09; frequência de nucleótidos de A=0,388, C=0,149, G=0,257, T=0,207; parâmetro alfa estimado de 0,64 e Log Likelihood= -14277,31. O valor do parâmetro alfa de ambas as árvores é inferior a 1 o que sugere a existência de locais a variar mais rapidamente que outros (Liò e Goldman, 1998). O tamanho dos ramos traduz as distâncias genéticas entre as sequências dos vários isolados. Os valores de suporte às ramificações estão assinalados na base das bifurcações dos ramos. As estirpes CAEVco e CAEV-63 são isolados Norte Americanos (Saltarelli et al., 1990; Knowles et al., 1991) e os vírus CAEV680, CAEV786, CAEV021 e CAEV032 são isolados Franceses (Valas et al., 1997; 2000). Os MVV K1514, KV1772 e KM1071 são estirpes Islandesas (Sonigo et al., 1985; Andrésson et al., 1993; Andrésdóttir et al., 1998) e as estirpes EV-1 e SAOMVV são o isolado Inglês e Sul Africano, respectivamente (Querat et al., 1990; Sargan et al., 1991). Os vírus S93 e OLV85-34 foram isolados a partir de ovinos Norte Americanos (Karr et al., 1996; Hötzel e Cheevers, 2001) enquanto que OLV-663, OLV-676, OLV-679 e OLV-680 são isolados de ovinos Franceses (Leroux et al., 1995).
isolados MVV (Figura 6B), corroborando assim as conclusões obtidas por outros autores no que respeita ao isolado OLV85-34 (Mwaengo et al., 1997).
Discussão
O presente estudo descreve o isolamento, clonagem e caracterização molecular de um lentivírus isolado de ovino naturalmente infectado. Actualmente, apenas são conhecidas quatro sequências genómicas comple-tas de lentivírus de ovino nomeadamente, as estirpes Islandesas K1514 (Sonigo et al., 1985) e KV1772 (Andrésson et al., 1993) e os isolados Britânico EV-1 (Sargan et al., 1991) e Sul Africano SA-OMVV (Querat et al., 1990), todos eles do tipo rápido/alto. O genoma do P1OLV é constituído por 9189 nucleótidos com uma similaridade aproximada de 70% e 80% com as estirpes CAEVco e K1514, respectivamente. Em células de pulmão e SCP, o isolado nacional origina infecções persistentes sem CPE evidente. Em células GSM e MØ, o P1OLV replica de forma mais eficiente, induzindo infecções líticas com formação de sincícios e lise celular. Com base nestas características de repli-cação o isolado nacional foi classificado como lentiví-rus do tipo lento/baixo.
Está descrito que vírus isolados a partir de células de pulmão replicam com menor eficiência em células SCP
RPCV (2004) 99 (549) 27-39Fevereiro, M. T. e Barros, S. S.
38
dem clarificar a influência da LTR na cinética de repli-cação do isolado nacional.
A análise filogenética baseada nas sequências dos genes pol (RT) e env (SU) mostrou, de forma clara, que o P1OLV se agrupa com os isolados MVV Europeus e Sul Africanos, separado do grupo CAEV. O P1OLV agrupou do mesmo modo quando se inferiram árvores filogenéticas baseadas em sequências nucleotídicas ou aminoacídicas dos genes gag, tat, rev ou vif.
O aspecto geral da ramificação das árvores obtidas foi idêntico ao anteriormente descrito (Leroux et al., 1995; Mwaengo et al., 1997; Valas et al., 1997; Za-noni, 1998) ainda que, o modelo evolutivo escolhido neste estudo difira do aplicado por outros autores, acentuando portanto a robustez das relações inferidas. Contudo, e contrariamente aos estudos iniciais que co-locavam o isolado Norte Americano OLV85-34 próxi-mo do grupo CAEV (Karr et al., 1996), os resultados por nós obtidos para a sequência SU colocam este iso-lado dentro do grupo MVV, o que está de acordo com trabalhos mais recentes (Mwaengo et al., 1997; Valas et al., 1997).
Até à data, apenas um pequeno número de SRLV foi totalmente sequenciado o que tem dificultado a comparação e caracterização das regiões conservadas e variáveis do genoma destes vírus. O conhecimento da diversidade genética destes vírus contribuirá para uma melhor compreensão dos mecanismos de evolu-ção molecular, proporcionando o aprofundamento dos conhecimentos sobre a heterogeneidade epidemioló-gica da infecção.
Neste trabalho é apresentada a sequência genómica completa do primeiro lentivírus de ovino isolado em Portugal. Para além de dar início à constituição de um banco de sequências virais que permitirá mais tarde conhecer os subtipos de vírus existentes no país, este trabalho também poderá contribuir para um melhor conhecimento das consequências que a variabilidade dos SRLV coloca ao diagnóstico e ao desenvolvimento de uma vacina eficaz para os pequenos ruminantes.
Uma vez que todos os isolados MVV totalmente se-quenciados até à data são do tipo rápido/alto, o P1OLV será muito útil para o estudo dos genes e factores trans-cricionais responsáveis pelo fenótipo lento/baixo.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente financiado pela FCT (Projecto POCTI 36245). Sílvia Barros foi subsidia-da por uma bolsa de doutoramento da FCT (PRAXIS XXI/BD/21238/99).
Bibliografia
Agnarsdóttir, G., Thorsteinsdóttir, H., Óskarsson, T., Matthías-dóttir, S., Haflidadóttir, B., Andrésson, Ó. e Andrésdóttir, V., (2000). The long terminal repeat is a determinant of
cell tropism of maedi-visna virus. J. Gen. Virol. 81:1901-1905.
Andrésdóttir, V., Tang, X., Agnarsdóttir, G., Andrésson, Ó., Ge-orgsson, G., Skraban, R., Torsteinsdóttir, S., Rafnar, B., Benediktsdóttir, E., Matthíasdóttir, S., Árnadóttir, S., Hög-nadóttir, S., Pálsson, P. e Pétursson, G., (1998). Biological and genetic differences between lung- and brain- derived isolates of maedi-visna virus. Virus genes 16:281-293.
Andrésson, Ó., Elser, J. E., Tobin, G.J., Greenwood, J.D., Gon-da, M., Georgsson, G., Andrésdóttir, V., Benediktsdóttir, E., Carlsdóttir, H.M., Màntylà, E., Rafnar, B., Pálsson, P., Casey J. e Pétursson, G., (1993). Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virol. 193:89-105.
Banks K.L, Adams D.S, McGuire T.C, Carlson, J., (1983). Ex-perimental infection of sheep by caprine arthritis-encepha-litis virus and goats by progressive pneumonia virus Am J Vet Res. 44:2307-11
Chebloune, Y., Sheffer, D., Karr, B., Stephens, E. e Narayan, O., (1996). Restrictive type of replication of ovine/caprine len-tiviruses in ovine fibroblast cell cultures. Virol. 222:21-30.
Cheevers, W.P. e McGuire, T.C., (1988). The lentiviruses: Mae-di/visna, caprine arthritis-encephalitis e equine infectious anemia. Adv. Virus Res. 34:189-215.
Cork, L.C., Hadlow, W.J., Gorham, J.R., Pyper, R.C. e Crawford, T.B., (1974). Infectious leukoencephalomyelitis of goats. J. Infect. Dis. 129:134-141.
Crawford, T.B., Adam, D.S., Cheevers, W.P. e Cork, L.C., (1980). Chronic arthritis in goats caused by a retrovirus. Science 207:997-999.
Cutlip, R.C., Jackson, T.A., Laird, G.A., (1977). Immunodiffu-sion test for ovine progressive pneumonia. Am. J. Vet. Res. 38:1081-1084.
DeMartini, J.C., Brodie, S.J., de la Concha-Bermejillo, A., Ellis, J.A. e Lairmore, M.D., (1993). Pathogenesis of lymphoid interstitial pneumonia in natural and experimental ovine lentivirus infection. Clin. Infect. Dis. 17:236-242.
Devereux, J., Haeberli, P. e Smithies, O., (1984). A comprehen-sive set of sequence analysis programmers for the vax. Nu-cleic Acids Res. 12:387-395.
Fevereiro, M., (1995). Prevalência da infecção Maedi Visna nos ovinos em Portugal. Rev. Port. Ciências Vet. XC, nº 514, 66-70.
Fevereiro, M., Barros, S. e Fagulha, T., (1999). Development of a monoclonal antibody blocking-ELISA for detection of antibodies against Maedi Visna virus. J. Virol. Methods 81:101-108.
Gabuzda, D.H., Hess, J.L., Small, J.A. and Clements, J., (1989). Regulation of the visna virus long terminal repeat in ma-crophages involves cellular factors that bind sequences containing AP-1 sites. Mol. Cell. Biol. 9:2728-2733.
Gendelman, H., Narayan, O., Molineaux, S., Clements, J. e Gil-den, R., (1985). Slow, persistent replication of lentiviruses: role of tissue macrophages and macrophage precursors in bone marrow. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7086-7090.
Gendelman, H., Narayan, O., Kennedy-Stoskopf, S., Kennedy, P.G., Ghotbi, Z., Clements, J., Stanley, J. e Pezeshkpour, G., (1986). Tropism of sheep lentiviruses for monocytes: Susceptibility to infection and virus gene expression in-crease during maturation of monocytes to macrophages. J. Virol. 58:67-74.
Hirt, B., (1967). Selective extraction of polyoma DNA from in-fected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26:365-369.
Hötzel, I. e Cheevers, W.P., (2001). Host range of small-ruminant lentivirus cytopathic variants determined with a selectable caprine arthritis encephalitis virus pseudotype system. J. Virol. 75:7384-7391.
Karr, B.M., Chebloune, Y., Leung, K. e Narayan, O., (1996).
39
Fevereiro, M. T. e Barros, S. S. RPCV (2004) 99 (549) 27-39
Genetic characterization of two distinct North American ovine lentiviruses and their possible origin from caprine arthritis-encephalitis virus. Virol. 225:1-10.
Knowles, D.P.Jr., Cheevers, W.P., McGuire, T.C., Brassfield, A.L., Harwood, W.G. e Stem, T.A.., (1991). Structure and genetic variability of envelope glycoproteins of two anti-genic variants of caprine arthritis-encephalitis lentivirus. J. Virol. 65:5744-5750.
Lairmore, M.D., Akita, G., Russell, H. e DeMartini, J.C., (1987). Replication and cytopathic effects of ovine lentivirus strains in alveolar macrophages correlate with in vivo pa-thogenicity. J. Virol. 61:4038-4042.
Leroux, C., Vuillermoz, S., Mornex, J.F. e Greenland, T., (1995). Genomic heterogeneity in the pol region of ovine lentiviru-ses obtained from bronchoalveolar cells of infected sheep from France. J. Gen. Virol.76:1533-1537.
Liò, P. e Goldman, N., (1998). Models of molecular evolution and phylogeny. Genome Res. 8:1233-1244.
Morse, B.A., Carruth, L.M. and Clements, J., (1999). Targeting of the Visna virus Tat protein to AP-1 sites: interactions with the bZIP domains of Fos and Jun in vitro and in vivo. J. Virol. 73:37-45.
Mwaengo, D., Grant, R., DeMartini, J., Carlson, J., (1997). En-velope glycoprotein nucleotide sequence and genetic cha-racterization of North American ovine lentiviruses. Virol. 238:135-144.
Narayan, O., Kennedy-Stoskopt, S., Sheffer, D., Griffin, D. e Clements, J., (1983). Activation of caprine arthritis-ence-phalitis virus expression during maturation of monocytes to macrophages. Infect. Immun. 41:67-73.
Narayan, O., Zink, M.C., Gorrell, M., McEntee, M., Sharma, D. e Adams, R., (1992). Lentivirus induced arthritis in ani-mals. J. Rheum. 19:25-32.
Page, R.D., (1996). TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput.Appl.Biosci. 12:357-358.
Pálsson, P.A., (1985). Maedi/Visna of sheep in Iceland; Introduc-tion of the disease to Iceland, clinical features, control mea-sures and eradication. Slow viruses in sheep, goats and catle. Ed. J. M. Sharp and Hoff-JØrgensen, EUR 8076 EN, 3-19.
Payne, S.L., Celle, K., Pei, X.-F., Qi, X.-M., Shao, H., Steagall, W., Perry, S. e Fuller, F., (1999). Long terminal repeat se-quences of equine infectious anaemia virus are a major de-terminant of cell tropism. J. Gen. Virol. 80:755-759.
Querat, G., Barban, V., Sauze, N., Filippi, P., Vigne, R., Russo, P. e Vitu, C., (1984). Highly lytic and persistent lentiviruses naturally present in sheep with progressive pneumonia are genetically distinct. J. Virol. 52:672-679.
Querat, G., Audoly, G., Sonigo, P. e Vigne, R., (1990). Nucleo-tide sequence analysis of SA-OMVV, a visna-related ovi-ne lentivirus: Phylogenetic history of lentiviruses. Virol. 175:434-447.
Saltarelli, M., Querat, G., Konings, D. e Clements, J., (1990). Nucleotide sequence and transcriptional analysis of mo-lecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology 179:347-364.
Sanger, F., Wicklen, S. Coulson, A.R., (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. SCi. USA 74, 5463-5467.
Sargan, D., Benett, I.D., Cousens, C., Roy, D.J., Blacklaws, B.A., Dalziel, R.G., Watt, N.J. e McConnell, I., (1991). Nucleoti-de sequence of EV1, a British isolate of maedi-visna virus. J. Gen. Virol. 72:1893-1903.
Shah, C., Boni, J., Huder, J.B., Vogt, H.R., Muhlherr, J., Za-noni, R., Miserez, R., Lutz, H. e Schupbach, J., (2004). Phylogenetic analysis and reclassification of caprine and ovine lentiviruses based on 104 new isolates: evi-dence for regular sheep-to-goat transmission and worl-dwide propagation through livestock trade. Virology 319:12-26.
Sigurdsson, B., Palsson, P. e Grimsson, H., (1957). Visna, a de-myelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropa-thol. Exp. Neurol. 16:389-403.
Sonigo, P., Alizon, M., Staskus, K., Klatzmann, D., Cole, S., Da-nos, O., Retzel, E., Tiollais, P., Haase, A. e Wain-Hobson, S., (1985). Nucleotide sequence of the visna lentivirus: re-lationship to the AIDS virus. Cell 42:369-382.
Strimmer, K. e von Haeseler, A., (1996). Quartet puzzling: A quartet maximum likelihood method for reconstructing tree topologies. Mol. Biol. Evol. 13:964-969.
Tamura, K. e Nei, M., (1993). Estimation of the number of nu-cleotide substitutions in the control region of mitochon-drial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10:512-526.
Thompson, J.D., Higgins, G.D. e Gibson, T.J., (1994). Impro-ving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nuc. Acids Res. 22:4673-4680.
Valas, S., Benoit, C., Guionaud, C., Perrin, G. e Mamoun, R.Z., (1997). North American and French caprine arthritis-en-cephalitis viruses emerge from ovine maedi-visna viruses. Virol. 237:307-318.
Valas, S., Benoit, C., Baudry, C., Perrin, G. e Mamoun, R.Z., (2000). Variability and immunogenicity of caprine ar-thritis-encephalitis virus surface glycoprotein. J. virol. 74:6178-6185.
Vanhermet, F.J. e Berkhout, B., (1995). The tendency of lenti-viral open reading frames to become A-rich: constraints imposed by viral genome organization and cellular tRNA availability. J. Mol. Evol. 41:132-140.
Wain-hobson, S., Sonigo, P., Guyader, M., Gazit, A. e Henry, M., (1995). Erratic G�A hypermutation within a complete ca-prine arthritis-encephalitis virus (CAEV) provirus. Virol. 209:297-303.
Wang, R.F. e Kushner, S.R., (1991). Construction of versa-tile low-copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli. Gene 100:195-199.
Woodall, C.J., Mylne, J., McKelvie, W.A.C. e Watt, N.J., (1994). A technique for the sequential isolation of RNA and DNA from embryos developed for screening for viruses. J. Virol. Methods 46:263-274.
Woodward, T.M., Carlson, J.O., de la Concha-Bermejillo, A. e DeMartini, J.C., (1995). Biological and genetic changes in ovine lentivirus strains following passage in isogeneic twin lambs. J. Acquired immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 8:124-133.
Zanoni, R.G., Nauta, I.M., Kuhnert, P., Pauli, U., Pohl, B. e Pe-terhans, E., (1992). Genomic heterogeneity of small rumi-nant lentiviruses detected by PCR. Vet. Microbiol. 33:341-351.
Zanoni, R., (1998). Phylogenetic analysis of small ruminant len-tiviruses. J. Gen. Virol. 79:1951-1961.
Zink, M.C. e Johnson, L.K., (1994). Pathobiology of lentivirus infections of sheep and goats. Virus Res. 32: 139-154.
