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SECRETARIA DE ESTADO DA SAUDE
PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL
ANGELA NORONHA PASSOS
HISTOPLASMOSE PULMONAR AGUDA: RELATO DE UMA MICROEPIDEMIA DIAGNOSTICADA POR MÉTODOS IMUNOLÓGICOS
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/SES, elaborada na Seção de Imunologia, Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz. Área: Imunologia e Biologia Molecular aplicadas às doenças de interessem em Saúde Pública.
SÃO PAULO 2009
2
Este trabalho foi realizado no
Laboratório de Imunodiagnóstico das
Micoses da Seção de Imunologia do
Serviço de Microbiologia e Imunologia
da Divisão de Biologia Médica do
Instituto Adolfo Lutz de São Paulo
Apoio Financeiro:
Instituto Adolfo Lutz de São Paulo –
Coordenadoria de Controle de
Doenças – SES/SP (Projetos CTC-
IAL#107/97 e #06/04)
Secretaria de Estado da Saúde -
Programa de Aprimoramento
Profissional (PAP)
3
Dedico este trabalho ao Pietro
que desde que chegou, mudou
completamente minha maneira
de encarar a vida.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, antes de tudo, por todas as graças alcançadas e
por iluminar meu caminho e minhas escolhas a cada despertar do dia.
Aos meus pais, Dirceu e Doralice, pelo carinho, incentivo e muita
paciência dedicados a minha criação.
Ao meu sobrinho Pietro por ser minha razão de acordar todos os dias
e pelo seu sorriso incentivador que me estimula a enfrentar o mundo.
A minha tia Daisy, pelo incentivo à ciência, por ser uma referência
profissional na minha vida e por me abrigar nos momentos em que eu
procurei isolamento.
Á minha orientadora Drª Adriana Pardini Vicentini Moreira pela
oportunidade de orientação e incentivo a pesquisa; por ser minha referência
profissional, por todo carinho dispensado neste período, pela paciência
sempre demonstrada, por sempre me incentivar a tomar decisões da melhor
forma e, acima de tudo, por ser uma grande amiga e uma pessoa
inesquecível na minha vida.
A Drª Elizabeth de los Santos Fortuna por supervisionar o PAP da
Seção de Imunologia com tanta dedicação, pelos ensinamentos profissionais
e pessoais e pelo carinho com o qual me tratou desde o início do Programa.
À Regiane dos Santos Feliciano, por ser uma grande companheira de
trabalho e uma amiga ainda melhor, pela cumplicidade, cooperação mútua e
companheirismo em todos os momentos.
Às colegas de laboratório Val, Simone e Lucia pelo apoio nas horas
críticas, pelas “quebradas de galho” e por todos os momentos de
descontração.
A todos os colegas de Seção, funcionários e pesquisadores pelo
carinho, atenção e respeito com que sempre fui tratada.
Á Mari, Joyce, Késia e pessoal do “Cardume”, Luana, Carlinha, Léo,
Thais, Marcela, Nathy, Roberta, Claudinha, Ale, Eduardo, Victor, Flavia,
5
Ellen, Alan e Grazi pela troca de experiências e pelos momentos divertidos
que passamos juntos dentro e fora do IAL.
A Secretaria de Estado da Saúde, que através do Programa de
Aprimoramento Profissional me proporcionou uma excelente oportunidade
de crescimento profissional e, também, pela concessão da bolsa de estudo
que muito incentivou para a realização do PAP.
Ao Instituto Adolfo Lutz, em especial à Seção de Imunologia e Divisão
de Biologia Médica por fornecer a infraestrutura necessária ao
desenvolvimento deste projeto e meu aprimoramento profissional.
A Claudia, da Equipe técnica do PAP, da CRH-SES, por todo o auxílio
burocrático e incentivo à luta dos aprimorandos.
À Paula Picciafuoco, Mari Shirabayashi e Cibele Moreira, da Fundap,
por terem cuidado do PAP com tanto apreço por todos estes anos, por
incentivarem os aprimorandos a buscar seus direitos.
À Raylla e Emanuela, em nome de todos os representantes dos
aprimorandos, por lutarem tanto e por todas as conquistas obtidas nestes
últimos anos.
As minhas amigas mais especiais Marcella, Débora, Tais e Mari por
não permitirem que eu me sinta sozinha nunca, mesmo quando não estou
com elas.
A minha irmã Mariana e aos meus amigos Diogo, Rafael, Maira,
Coquinho, Laura, Luiz, José Victor, Michelle, Ludmilla, Chico e todos os
outros não citados por fazerem parte da minha vida.
6
“.... Os homens perdem a saúde para juntar
dinheiro, depois perdem o dinheiro para
recuperar a saúde. E por pensarem
ansiosamente no futuro esquecem do
presente de forma que acabam por não viver
nem no presente nem no futuro. E vivem
como se nunca fossem morrer... e morrem
como se nunca tivessem vivido.”
Dalai Lama
7
Resumo
A histoplasmose pulmonar aguda (HPA), causada pelo Histoplasma
capsulatum, é processo infeccioso que acomete indivíduos hígidos que
inalaram grande quantidade de esporos existentes no solo contendo fezes
de pássaros e/ou morcegos. O objetivo deste trabalho foi confirmar, na
ausência de evidências micológicas, a ocorrência de microepidemia de HPA
em um grupo de 35 indivíduos que visitou caverna localizada no Município
de Arapeí, São Paulo, Brasil, empregando-se ensaios imunológicos. Para
tanto, avaliou-se por imunodifusão dupla (ID) e immunoblotting (IB), duas
amostras de soros de cada indivíduo, enviadas ao laboratório em outubro e
novembro de 2007. Das 35 amostras avaliadas na primeira coleta, realizada
menos de um mês após a exposição ao fungo, apenas um indivíduo
apresentou, por ID, presença de anticorpos anti-H. capsulatum. Por IB,
observou-se que 51% dos soros reagiram frente à fração H e M de H.
capsulatum, marcadores sorológicos da doença e indicador de infecção
aguda; 11% frente à fração M, sugerindo contato com o agente etiológico;
34% apresentaram ausência de reatividade frente às frações H e/ou M e um
(3%) indivíduo não foi avaliado por insuficiência de material. A análise do
material coletado dois meses após a exposição do grupo ao H. capsulatum,
30 soros, revelou que 97% apresentaram, por ID, reatividade frente ao
antígeno de H. capsulatum com títulos variando de 1/1 a 1/16, apenas um
indivíduo (3%) apresentou ausência de reatividade. Quando estes soros
foram avaliados pelo IB, verificou-se 100% de reatividade frente às frações H
e M comprovando a infecção aguda por H. capsulatum. Na ausência de
evidências micológicas, o emprego da técnica de immunoblotting foi
fundamental para detecção precoce de anticorpos circulantes anti-H.
capsulatum, contribuindo, portanto, com a Vigilância Epidemiológica dos
Municípios de Areais e Arapeí na confirmação do surto de histoplasmose.
Palavras Chaves: Histoplasma capsulatum, Histoplasmose pulmonar
aguda, microepidemia, imunodiagnóstico.
8
Abstract
Acute pulmonary histoplasmosis (HPA), caused by Histoplasma
capsulatum, is an infectious process that affects healthy individuals who
inhaled large amounts of spores in the soil containing bird and/or bats feces.
This study confirms, in the absence of evidence mycology, the occurrence of
microepidemics of HPA in a group of 35 individuals who visited cave located
in Arapeí city, São Paulo, Brazil, using immunological assays. For both, it
was evaluated by double immunodiffusion (ID) and immunoblotting (IB), two
samples of sera from individuals sent to the laboratory in October and
November 2007. Of the 35 samples analyzed at the first gathering,
performed less than a month after exposure to the fungus, only one individual
has, by ID, presence of anti-H. capsulatum. By IB, we observed that 51% of
the sera reacted against the fraction of H and M from H. capsulatum,
serologic markers of disease and an indicator of acute infection, 11% against
the M fraction, suggesting contact with the etiologic agent, 34% showed
absence of reactivity against fractions of H and / or M and one (3%)
individuals has not been evaluated for lack of material. The analysis of
material collected two months after exposure to the group to H. capsulatum,
30 sera showed that 97% presented by ID, reactivity against the antigen of H.
capsulatum with titles ranging from 1/1 to 1/16, only one individual (3%)
showed no reactivity. When these sera were analyzed by IB, there was 100%
of reactivity against the H and M fractions showing acute infection by H.
capsulatum. In the absence of mycology evidence, the use of the
immunoblotting technique was essential for early detection of circulating
antibodies anti-H. capsulatum, contributing therefore to the Epidemiological
Surveillance of Municipalities of Areias and Arapeí in the confirmation of an
outbreak of histoplasmosis.
Keywords: Histoplasma capsulatum, acute pulmonary
histoplasmosis, microepidemics, immunodiagnosis.
9
Lista de Figuras
Figura 1: Reatividade das amostras (1ª e 2ª remessa) pelas metodologias
de imunodifusão dupla em gel de agarose e immunoblotting frente ao
antígeno da amostra 200, 20 vezes concentrado, cultivada em ágar
Sabouraud-dextrose, por 33 dias a 27o C, segundo Freitas (2005)...............31
Figura 2 - Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H.
capsulatum de indivíduos com suspeita clínica histoplasmose pulmonar
aguda frente ao antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado, cultivada
em ágar Sabouraud-dextrose, por 33 dias a 27o C, segundo Freitas
(2005)............................................................................................................32
10
Lista de Quadros
Quadro 1 - Microepidemias de HP no Brasil: 1958 a 2008 ......................19
Quadro 2 - Identificação das amostras e síntese das análises imunológicas
após avaliação pelas técnicas de ID e IB..................................................30
11
Abreviaturas Utilizadas
Aids - Acquired Immunodeficiency Syndrome
Ag Hc200 – antígeno obtido a partir da amostra 200 de H. capsulatum
BEPA – Boletim Epidemiológico Paulista
ºC – graus Celsius
C+ - Controle-positivo
CDC – Center Diseases Control
cm – centímetros
ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EPI – Equipamento de Proteção Individual
EUA – Estados Unidos da América
FC – Fixação de Complemento
H. capsulatum – Histoplasma capsulatum
H. capsulatum var. farciminosum – Histoplasma capsulatum
variedade farciminosum
HIV – Human Immunodeficiency Virus
HP – Histoplasmose
HPA – Histoplasmose Pulmonar Aguda
IB - Immunoblotting
ID – Imunodifusão Dupla
IgG – Imunoglobulina G
kDa – quilodalton
12
km - quilômetro
LIM/BM/IAL-SP – Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da
Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz
de São Paulo
m - metro
mL - mililitro
mm – milímetro
mM - milimolar
NVE/Areias-SP – Núcleo de Vigilância Epidemiológica do Município
de Areias, São Paulo
PBS - Phosphate-Buffered Saline
PBS-T – solução PBS acrescida de Tween 20
pH - potencial hidrogeniônico
PM – peso molecular
SDS - Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
SP – São Paulo
HCL – ácido clorídrico
µg – microgramas
µL - microlitros
V - volts
WB – Western blot
13
Índice
Introdução ............................................................................. 14
Objetivos ............................................................................... 23
Objetivo geral ................................................................... 23
Objetivo específico ............................................................ 23
Material e Métodos ................................................................ 24
Amostras de soro ............................................................. 24
Controles-positivos das reações ........................................ 24
Antígeno de H. capsulatum ............................................... 25
Reações Imunológicas ................................................... 26
Técnica de imunodifusão em gel de agarose ...................... 26
SDS-PAGE e Immunoblotting ............................................ 26
Resultados ............................................................................ 29
Discussão .............................................................................. 33
Conclusões ............................................................................ 40
Referência Bibliográfica ........................................................ 42
14
Introdução
A histoplasmose clássica (HP), ou Doença de Darling, é uma infecção
causada por um fungo geofílico e termo-dimórfico, o Histoplasma
capsulatum var. capsulatum (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al.,
2002; Wheat e Kauffman, 2003).
Trata-se de uma micose sistêmica, cosmopolita e de ampla
distribuição geográfica; com detecção de casos autóctones em mais de 60
países distribuídos nos diversos continentes, com maior prevalência nas
Américas e na África. Em zonas endêmicas, a HP acomete de dois a cinco
porcento dos pacientes com Aids, podendo atingir nas regiões de alta
endemicidade até 25% (Zancopé-Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e
Howard, 1989; Alves et al., 1994; Silva et al., 1999; Negroni, 2001; Panackal
et al., 2002; Lacaz et al., 2002).
No Brasil, a incidência da HP tem sido demonstrada pela observação
de casos clínicos autóctones, seja sob a forma de casos isolados ou sob a
forma de microepidemias; bem como pela realização de inquéritos
epidemiológicos empregando o teste cutâneo com histoplasmina. Sua
endemicidade é variável; casos de doença e de infecção foram relatados em
São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina, Rio
Grande do Sul, Goiás, Mato Grosso do Sul, Amazonas, Pará, Bahia e
Pernambuco (Lacaz et al., 1984; Zancopé-Oliveira e Wanke, 1987; Silva-
Vergara e Martinez, 1998; Severo et al., 2001; Cury et al., 2001; Oliveira et
al., 2006; Chang et al.; 2007).
H. capsulatum é habitualmente encontrado em regiões de clima
tropical ou temperado, com temperatura média anual entre 15 a 22o C, índice
15
pluviométrico anual de 1000 mm e umidade relativa do ar de 67 a 87%
(Negroni, 2001; Lacaz et al., 2002). Sua distribuição na natureza associa-se
a microambientes fechados, como cavernas ou grutas, construções
abandonadas, galinheiros, celeiros, florestas ou qualquer local onde o solo
encontra-se enriquecido com excretas aviárias e/ou de morcegos (Zancopé-
Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva et al., 1999;
Negroni, 2001).
O mecanismo de infecção se faz pela via aérea superior, por meio da
inalação de propágulos fúngicos infectantes denominados
microaleuroconídeos. Estes se instalariam primeiramente nos alvéolos
pulmonares, invadindo posteriormente os linfonodos hilo-mediastinais com
conseqüente disseminação pela corrente sangüínea. A partir daí, a extensão
da doença será determinada pela resposta tissular do hospedeiro contra o
processo infeccioso (Wu-Hsieh e Howard, 1989; Eissenberg e Goldman,
1991; Silva et al., 1999; Marques et al., 2000; Lacaz et al., 2002).
As manifestações clínicas da HP incluem desde a forma
assintomática, pulmonar aguda, pulmonar crônica à infecção extra-pulmonar
disseminada (Goodwin e Des Prez, 1978; Eissenberg e Goldman, 1991;
Alves, 1996; Silva et al., 1999). Indivíduos hígidos podem apresentar tosse, febre, dispnéia e astenia em uma (reinfecção) a três (infecção primária)
semanas após exposição ao fungo. Os achados diferenciam-se dependendo
do hospedeiro ter sido previamente infectado ou não e do tamanho do
inóculo (Goodwin e Des Prez, 1978).
Nos pacientes imunodeprimidos, principalmente nos portadores de
HIV/Aids, doenças neoplásicas, transplantados e diabéticos, a infecção por
H. capsulatum representa doença de alta gravidade e com sério risco de
disseminação (Wheat et al., 1991; Wheat et al., 1992; Marques e Shikanai-
Yasuda, 1994; Alves, 1996; Marques et al., 2000).
16
Estima-se que cerca de 90 a 95% dos indivíduos que se infectam por
H. capsulatum não desenvolvem a doença ou apresentam sintomatologia
clínica leve, sendo o curso da doença, em geral, autolimitado, com
regressão espontânea dos sintomas. Estas manifestações são conhecidas
por HP infecção ou histoplasmose pulmonar aguda (HPA). A gravidade da
doença, em indivíduos imunocompetentes, parece estar relacionada ao
número de microaleuroconídeos inalados, ou seja, tamanho da carga fúngica
e ao tempo de exposição: períodos curtos, como 20 minutos, proporcionam
sintomas leves; enquanto que uma exposição de 50 a 60 horas pode
acarretar no desenvolvimento de doença grave e, por vezes, fatal (Goodwin
e Des Prez, 1978; Larsh, 1983; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Eissenberg e
Goldman, 1991; Silva et al., 1999; Marques et al., 2000; Lacaz et al., 2002).
A infecção aguda pode ainda levar a outras manifestações da doença,
como, por exemplo, as formas cavitária crônica e a disseminada (Prager et
al., 1980; Wanke e Capone, 1990; Gurney e Conces, 1996). A HP
disseminada é a forma clínica mais grave e apresenta evolução
potencialmente fatal decorrente da deficiência da imunidade celular do
hospedeiro, estando intimamente relacionada às infecções oportunistas.
Entre os possíveis hospedeiros estão: crianças com imaturidade
imunológica, idosos debilitados, imunossuprimidos e indivíduos portadores
do HIV (Lacaz et al., 1999; Silva et al., 1999).
Com o advento da Aids, em 1981, observou-se aumento do número
de casos de HP disseminada associada àquela patologia, apresentando-se
como a primeira infecção oportunista combinada a outras infecções e/ou
neoplasias, desencadeada provavelmente pelo despertar de processos
pulmonares quiescentes, em pacientes residentes ou procedentes de zonas
endêmicas. Este fato levou o CDC (Center Diseases Control), em 1985,
quando não havia provas sorológicas e moleculares para a identificação do
HIV, a incluir a HP disseminada como infecção “marcadora” de Aids (Wheat
et al., 1986).
17
A HP associada a Aids pode apresentar quadro clínico benigno,
moderadamente grave ou grave. Em geral, apresenta elevada letalidade,
com grande incidência de lesões mucocutâneas, podendo ser semelhante à
tuberculose miliar, patologia de alta freqüência no Brasil, induzindo os
médicos a pensarem nesta última infecção, não considerando a HP
disseminada no diagnóstico diferencial, promovendo, conseqüentemente,
prejuízo na instauração do tratamento antifúngico adequado (Alves et al.,
1994; Lacaz et al., 2002).
Alves (1996) analisando, do ponto de vista clínico e laboratorial, 27
casos de HP disseminada associadas à Aids evidenciou sintomas como
febre, perda de peso, dispnéia, lesões cutâneas disseminadas,
adenomegalia, hepato e esplenomegalia, bem como infiltrado intersticial
difuso dos pulmões. O tratamento com drogas antifúngicas, nesses casos,
pode conduzir a cura clínica e micológica.
Grande parte dos estudos sobre HP se concentra na descrição das
microepidemias. Os surtos epidêmicos decorrem da movimentação de
agrupamentos humanos em pequenos ambientes com terreno rico em
fungos, pois os mesmos encontram-se nas camadas mais superficiais do
solo e sua propagação dá-se pela dispersão no ar das suas partículas. Essa
condição acaba por favorecer a contaminação simultânea dos indivíduos
(Goodwin e Des Prez, 1978; Wanke e Capone, 1990; Wheat et al., 2004).
Os locais e as circunstâncias que ocasionam essas microepidemias
são bastante variados e incluem cortes de árvores caídas, manipulação de
ocos de árvores, visitas a grutas e cavernas, construção de pontes e torres,
demolição de casas antigas, limpeza ou terraplanagem em locais de pernoite
de pássaros, como parques e sítios, limpeza de galinheiros e asilos
abandonados, pintura de pontes metálicas, exploração de túmulos no antigo
Egito, exposição a ar condicionado “contaminado” com excretas de pombos
18
etc. Em geral, o tempo de exposição a estes ambientes determina a
gravidade da doença (Larsh, 1983; Pladson et al., 1994; Paula e Aidé, 1985;
Wanke e Capone, 1990).
Wheat et al. (1982) relataram, o que talvez tenha sido, a maior
epidemia de HP já descrita, em uma pequena cidade de Indianápolis, EUA.
Os autores descreveram que após o desmatamento de um bosque,
possivelmente, o vento tenha levado, a “poeira criada”, contendo partículas
fúngicas infectantes, aos prédios vizinhos da região, resultando em um saldo
de 120.000 pessoas presumivelmente infectadas; 488 casos de doença e 60
pacientes com histoplasmose fatal ou muito grave.
No Brasil, pelo fato da HP não ser doença de notificação compulsória,
fica extremamente difícil o mapeamento da real distribuição deste processo
infeccioso, entretanto, o agente etiológico da HP é encontrado de norte a sul
do país e desde 1958, já foram relatadas 28 microepidemias em dez
Estados (Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, São Paulo, Distrito Federal,
Minas Gerais, Paraíba, Amazonas, Bahia, Santa Catarina e Mato Grosso do
Sul), com isolamento do H. capsulatum do solo em sete destes: Rio de
Janeiro, Rio Grande do Sul, São Paulo, Distrito Federal, Paraíba, Santa
Catarina e Mato Grosso do Sul (Lacaz et al., 2002, Unis et al.,2005).
O Quadro 1, sumariza as microepidemias de HP ocorridas no Brasil
no período de 1958 a 2008. Observa-se que o número de casos suspeitos
variou de dois a 34 e as principais fontes de infecção foram: visitas a grutas
contendo grandes quantidades de fezes de morcego, seguidas por visitas a
minas abandonadas e contato com excretas de galinhas confinadas em
galinheiros (Unis et al., 2005; Oliveira et al., 2006; Lima et al., 2008). A
observação de vários surtos nos Estados do Rio de Janeiro e do Rio Grande
do Sul, tanto em áreas rurais como urbanas, coloca estas regiões como
áreas de alta endemicidade no país (Paula e Aidé, 1985; Severo et al.,
2001).
19
Quadro 1: Microepidemias de HP no Brasil: 1958 a 2008.**
**Adaptado de Unis et al., 2005
# Dados ausentes no quadro original, incluídos neste trabalho
A HP simula a tuberculose nos aspectos clínicos, radiológicos e
histopatológicos, sendo necessária a realização de exames específicos para
identificação do agente etiológico (Alves, 1994; Lacaz et al., 2002). Unis et
al. (2005) e Oliveira et al. (2006) descrevem casos de pacientes que
estiveram sujeitos às complicações e aos efeitos deletérios de um
tratamento para tuberculose, devido ao retardo no diagnóstico da HP. A
diferenciação diagnóstica demanda colorações especiais e isolamento em
cultivo do agente etiológico. Segundo Unis (2000), uma rotina diagnóstica
que inclua a técnica de Gomori-Grocott com metenamina argêntica e/ou
sorologia para HP nos pacientes com diagnóstico presuntivo de tuberculose
pode revelar casos não suspeitos.
Ano Cidade UF Fonte de infecção Casos Sorologia Histoplasmina Referência
1958 Paraíba do Sul RJ Gruta com morcegos 13 0 1 Paula, 19591959 Santa Teresa RJ Caixa d`água 7 NR NR Paula, Aidé, 19791966 Ubatuba SP Forro de casa 8 6 7 Fava Netto et al., 19671967 Brasília DF Gruta com morcegos 14 8 13 Schmidt et al., 1973
1971/73 Ubatuba SP Gruta com morcegos 10 10 9 Fava Netto et al., 19761972 Vassouras RJ Gruta com morcegos 5 NR NR Paula, Aidé, 19791975 Rio de Janeiro RJ Gruta com morcegos 5 0 5 Rêgo et al., 19761978 Angra dos Reis RJ Gruta 8 NR 8 Paula, Aidé, 19851978 Canoas RS Oco de árvore com morcegos 2 1 NR Severo et al., 19811981 Rio de Ouro RJ Gruta 10 NR NR Paula, Aidé, 19851981 São Gonçalo RJ Mina abandonada 10 8 NR Wanke, 19851981 São Gonçalo RJ Mina abandonada 4 4 NR Wanke, 19851981 Itaipava-Petrópolis RJ Minas abandonadas 10 9 NR Wanke, 19851982 São Gonçalo RJ Gruta com morcegos 6 5 NR Verbicário et al., 19931982 Itaipava-Petrópolis RJ Minas abandonadas 5 2 NR Wanke, 19851982 Niterói RJ Mina abandonada 6 5 NR Wanke, 19851984 PendotibaNiterói RJ Galeria de águas 17 8 17 Paula, Aidé, 19851984 Tinguá RJ Galinheiro 12 NR NR Paula, Aidé, 19851986 Borborema PB Chaminé com morcegos 6 4 5 Fernandes et al., 19891993 Taquari RS Galinheiro 2 2 NR Severo et al., 19931993 Manaus AM Gruta com guano 8 8 NR Suzaki et al., 19951997 Pedro Leopoldo MG Caverna com morcegos 4 4 NR Cury et al., 20012000 Jequié BA Porão com morcegos 4 4 NR Martins et al., 20002003 Niterói RJ Forno desativado 5 5 NR Martins et al., 2003
# 2006* Blumenau SC Forro de casa com guano 2 0 NR Oliveira et al., 2006# 2007 Cáceres MS Caverna com morcegos 34 14 NR Lima et al., 2008
Total: 217 107NR: Não referido* Ano da publicação
20
O diagnóstico definitivo para a maioria das micoses, incluindo HP, é a
identificação do agente etiológico por processos histológicos, pelo exame a
fresco e/ou o isolamento do fungo em cultura, este último considerado o
método padrão ouro. Contudo, em algumas situações o estado físico ou
clínico dos pacientes impossibilita o acesso ao local da lesão, impedindo
assim a coleta do material biológico. O tempo prolongado (duas a seis
semanas) necessário para o crescimento e identificação dos fungos termo-
dimórficos em cultura, também dificulta o diagnóstico, provocando atraso na
liberação do resultado e, conseqüentemente, na introdução de medidas
terapêuticas específicas (Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al.,
2002).
Em relação ao diagnóstico micológico da HP, merece atenção
especial o fato de que, em alguns casos, é extremamente difícil diferenciar
em tecido, células de H. capsulatum var. capsulatum de células de Candida
glabrata, Penicillium marneffei, H. capsulatum var. farciminosum e formas
diminutas de Blastomices dermatitidis. Do mesmo modo, é recomendável a
realização do diagnóstico diferencial para protozoários como Leishmania
donovani e Toxoplasma gondii, que apresentam formas intracelulares
semelhantes ao H. capsulatum (Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et
al., 2002).
A pesquisa de anticorpos circulantes específicos, empregando-se
técnicas imunológicas, assume papel fundamental no diagnóstico presuntivo,
ou indireto, da HP; constituindo, na prática, a mais importante ferramenta do
diagnóstico laboratorial. Por vezes, o resultado sorológico se traduz na
primeira indicação da etiologia da doença, principalmente naqueles
indivíduos que ainda não apresentam sinais clínicos aparentes (Lacaz et al.,
2002). Além disso, a determinação do título de anticorpos circulantes
possibilita ao clínico avaliar a progressão e/ou regressão da doença
(Mendes-Giannini et al., 1994).
21
Entre os ensaios sorológicos existentes, a imunodifusão dupla (ID) em
gel de agarose tem sido o método utilizado com maior freqüência na rotina
dos laboratórios clínicos para o diagnóstico da HP. Esta técnica oferece
baixo custo operacional, sensibilidade variável, especificidade e valor
preditivo próximos de 100%, além de permitir a avaliação da eficácia
terapêutica através do acompanhamento dos títulos de anticorpos anti-
fúngicos específicos (Elias Costa et al., 2000; Mendes-Giannini e Melhem,
2001).
Na pesquisa de anticorpos anti-H. capsulatum em soros de pacientes
com HP pode-se observar, por ID, até seis faixas de precipitação, sendo
duas mais freqüentes, denominadas H e M. Estas faixas são consideradas
suficientes para diagnosticar, com segurança, a HP (Heiner, 1958).
Os testes imunoenzimáticos, como ELISA e Western blot (WB) ou
immunoblotting (IB), têm sido utilizados para a detecção de anticorpos em
quase todas as micoses sistêmicas, senão em todas. Entretanto, estas
técnicas apresentam altos índices de reatividade cruzada entre algumas
micoses como paracoccidioidomicose, Doença de Jorge Lobo,
coccidioidomicose, blastomicose, aspergilose e, eventualmente, com
infecções por Mycobacterium; tornando necessário tratamento prévio nos
soros de pacientes e/ou nos antígenos fúngicos utilizados (Elias Costa et al.,
2000; Albuquerque et al., 2005).
A aplicação do IB no diagnóstico precoce da HP tem sido
demonstrada, principalmente nos casos de forma aguda da doença, devido à
demora na detecção da soroconversão, quando se utilizam técnicas menos
sensíveis como a ID ou fixação de complemento (FC) (Leimann et al., 2005).
Freitas (2005) avaliou por IB, 22 soros de pacientes com HP-doença e
07 soros de pacientes com HP-infecção verificando que os soros dos
22
pacientes com HP-doença apresentaram 100% de reatividade frente às
frações H e M, ao passo que todos os soros do grupo HP-infecção reagiram
somente frente à fração M. A reatividade do soro de paciente frente ao
antígeno M sugere que o indivíduo tenha entrado em contato com o H.
capsulatum ou fora imunizado com histoplasmina. A faixa H é detectável
junto com a M em vigência de alguma infecção em curso (Heiner, 1958).
23
Objetivos
Objetivo geral:
Confirmar, na ausência de evidências micológicas, a ocorrência de
microepidemia de histoplasmose pulmonar aguda em um grupo de 35
indivíduos que visitou caverna localizada no Município de Arapeí, São Paulo,
Brasil, empregando-se ensaios imunológicos.
Objetivo específico:
Avaliar o desempenho das reações de imunodifusão dupla em gel de
agarose e immunoblotting no diagnóstico precoce da histoplasmose
pulmonar aguda.
24
Material e Métodos
Em 2007, o Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Divisão
de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo (LIM/BM/IAL-SP)
foi informado pelo Núcleo de Vigilância Epidemiológica do Município de
Areias, SP (NVE/Areias-SP) sobre a suspeita de uma microepidemia de
histoplasmose pulmonar aguda no município.
Os indivíduos com suspeita clínica de HPA visitaram, em 07 de
setembro de 2007, uma caverna localizada na cidade de Arapeí, SP,
sabidamente “contaminada” por H.capsulatum.
Amostras de soro
No mês de outubro de 2007, o LIM/BM/IAL-SP recebeu 35 amostras
de soros provenientes dos casos suspeitos (31 adolescentes com idade
entre 14 e 16 anos e 4 adultos com idade entre 22 e 45 anos) coletadas com
menos de um mês da data da possível exposição ao agente etiológico da
histoplasmose. Uma segunda remessa, composta por 30 amostras de soros,
coletadas aproximadamente 60 dias após a exposição ao H. capsulatum foi
enviada ao laboratório no mês seguinte.
Controles-positivos das reações
Foram utilizados soros hiperimunes de coelhos como controles-
positivos nos ensaios de ID e IB.
Resumidamente, coelhos albinos da raça Nova Zelândia e mantidos
no Biotério de Inoculação do Instituto Adolfo Lutz, foram imunizados por via
subcutânea com 100 µg de filtrado de cultura de H. capsulatum em quatro
25
sítios distintos, com adjuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich Co. St.
Louis, EUA), proporção 1:1 na primeira imunização e com adjuvante
incompleto de Freund (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, EUA), nas
subseqüentes, repetidas a cada semana, por um período de 30 dias.
Findado o período de imunização, realizou-se sangria teste, coletando-se 5,0
mL de sangue por punção da veia marginal do animal. Após desdobramento
o soro foi analisado, pela técnica de ID, quanto a presença de anticorpos
circulantes anti-antígeno de H. capsulatum.
Antígeno de H. capsulatum: A obtenção do antígeno foi realizada
segundo metodologia proposta por Kaufman e Standard (1978), com
algumas modificações (Freitas, 2005).
Células micelianas da amostra 200 de H. capsulatum, mantidas em ágar
batata a 27º C, foram primeiramente adaptadas em ágar Sabouraud-
dextrose (Difco Laboratories, Detroit, EUA), com repiques mensais,
mantendo-se esta mesma temperatura, durante quatro meses. Após o
período de adaptação, realizou-se a expansão das culturas fúngicas, sendo
a amostra semeada em 50 tubos de ensaio (20x200mm) contendo 20,0 mL
de ágar Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, EUA) e incubada a
27ºC por 33 dias. Finalizado o período de incubação, as culturas foram
cobertas com solução de borato-thimerosal a 1:5000 e deixadas em repouso
por 24 horas a 27ºC. Em seguida os sobrenadantes foram coletados,
filtrados em papel Whatman® número 03 (Whatman, Brentford, Reino Unido)
e concentrados por liofilização (Edward’s – Super Modulyo), pela Seção de
Coleção de Culturas da Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz,
sendo armazenados a -20ºC até o momento do uso.
O antígeno foi concentrado em 20 vezes para o ensaio de ID e em 10
vezes para a utilização na técnica de IB.
26
Reações Imunológicas
Técnica de imunodifusão em gel de agarose
Se utilizou a metodologia proposta por Ouchterlony (1949).
Primeiramente revestiu-se lâminas de vidro (26x75 mm) com 1,0 mL
de solução de ágar a 1%, deixando secar em estufa a 60°C. As mesmas
foram posteriormente recobertas com 3,0 mL de solução de agarose-citrato
e deixadas em câmara úmida, até a solidificação da agarose. O gel, então,
foi escavado com auxílio de molde em forma de roseta (Bioficina-Indústria e
Comércio de Aparelhos Laboratoriais São Paulo-Brasil), contendo um orifício
central e seis laterais, sendo o excesso retirado manualmente, com auxílio
de agulha. Após a aplicação de 12 µL dos soros testes, soro controle
positivo e antígeno de H. capsulatum nos orifícios, as lâminas foram
incubadas em câmara úmida, à temperatura ambiente, por 48 horas. Após
esse período, realizou-se leitura prévia para verificação de linhas de
precipitação. As lâminas foram lavadas por 45 minutos em solução citrato de
sódio 5% seguindo-se de sucessivas lavagens, por 24 horas, em solução
salina 0,85%. Ao fim desta etapa, os orifícios foram recobertos com solução
de ágar 1% e as lâminas levadas para secar em estufa a 60°C. Após
secagem, as lâminas foram coradas pela solução Coomassie Brilliant Blue
R-250 (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, EUA), durante 05 minutos e em seguida,
descoradas por 10 minutos com solução de metanol-etanol. A leitura
definitiva foi então realizada, com o auxílio de negatoscópio.
SDS-PAGE e Immunoblotting:
Os procedimentos para eletroforese vertical em gel de poliacrilamida
contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foram conduzidos segundo
metodologia proposta por Laemmli (1970), com gel de separação linear a
10% para Ag Hc200 e gel de empilhamento a 3% de acrilamida com
27
espessura de 1,0 mm; empregando equipamento Mini-Protean II
Electrophoresis Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Califórnia, EUA).
A preparação antigênica foi denaturada por aquecimento a 100ºC por
três minutos em tampão de ruptura (62 mM de Tris-HCl pH 6,8 contendo
0,2% (p/v) de SDS, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 0,005% de azul de
bromofenol e 10% (v/v), de glicerol, em água deionizada), sendo aplicados
250 µL de antígeno em cada mini-gel.
A corrida eletroforética foi realizada com diferença de potencial de
100V e 120V para o gel de empilhamento e separação, respectivamente. Em
cada corrida realizada foi aplicado padrão de baixo peso molecular (PM): de
175 kDa a 6,5 kDa (New England Biolabs Inc., Woburn, Massachusetts,
EUA).
A transferência eletroforética de proteínas contidas nos géis de
poliacrilamida para membranas de nitrocelulose de 0,22 mm (Sigma-Aldrich
Co. St. Louis, EUA) foi executada conforme metodologia descrita por Towbin
et al. (1979), usando equipamento Trans-Blot System (Bio-Rad Laboratories,
Inc., Hercules, Califórnia, EUA).
A transferência foi realizada empregando-se voltagem constante de
30V “overnight” a 4ºC. Após a transferência, a fim de verificar a eficácia do
processo, as membranas foram coradas com Ponceau-S por 10 minutos e
descoradas em água bidestilada.
As membranas contendo as proteínas transferidas foram
identificadas, cortadas em tiras, de aproximadamente 0,5 cm, depositadas
em canaletas e incubadas por 1 hora, a temperatura ambiente, em solução
salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 contendo 5% de leite
desnatado, para a saturação dos sítios inespecíficos; em plataforma
28
agitadora para blotting (Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos
Laboratoriais São Paulo-Brasil).
Em seguida, as fitas foram incubadas com 2,0 mL de amostras de
soros a serem testadas e soros controles-positivos, ambos diluídos na
proporção de 1:100 em tampão PBS pH 7,4. Esta etapa do ensaio foi
realizada a temperatura ambiente sob agitação constante (Plataforma
agitadora para blotting, Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos
Laboratoriais, São Paulo-Brasil), por 2 horas. Finalizado o período de
incubação, as fitas de nitrocelulose foram lavadas por seis vezes, por 10
minutos cada, em solução PBS acrescida de 0,1 % de Tween 20 (PBS-T).
Após esta etapa, as membranas foram incubadas com soro anti-IgG
conjugado à peroxidase (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, EUA), diluído a
1:1000 e mantidas por 2 horas sob agitação constante (Plataforma agitadora
para blotting, Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos Laboratoriais, São
Paulo-Brasil), a temperatura ambiente, protegidas da luz, sendo em seguida
novamente lavadas por seis vezes, 10 minutos cada, em solução PBS-T.
A reação foi revelada empregando-se solução de 4-cloro-1naftol
(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, EUA) e o bloqueio feito por lavagens
sucessivas em água bidestilada.
29
Resultados
Os indivíduos com suspeita clínica de histoplasmose pulmonar aguda
apresentavam idade entre 14 e 45 anos (média de 16,7 anos), sendo 22
(62,9%) do sexo masculino e 13 (37,1%) do feminino.
Nas requisições de exame, solicitando pesquisa de anticorpos anti-H.
capsulatum, não havia nenhuma informação quanto à solicitação e/ou
resultado de exames micológicos ou radiológicos.
As informações sobre todas as amostras analisadas estão detalhadas
no Quadro 2. Os resultados da avaliação imunológica podem ser
observados na Figura 1.
Das 35 amostras enviadas na primeira remessa, apenas uma (2,9%)
apresentou anticorpos anti-H. capsulatum por ID na diluição de ¼. Enquanto
que, por IB, em 22 (61,8%) amostras se observou algum tipo de reatividade
para H. capsulatum e 13 (38,2%) apresentaram ausência de reatividade
frente às frações específicas H e/ou M. Um indivíduo não foi avaliado por IB
devido insuficiência de material (Figura 1).
Entre os soros reagentes por IB, 17 (50%) apresentaram anticorpos
anti-frações H e M de H. capsulatum; por sua vez, quatro (11,8%) amostras
reagiram somente frente à fração M.
A análise dos 30 soros enviados posteriormente revelou que 97%
(n=29) apresentaram, por ID, reatividade com títulos variando de 1/1 a 1/16
e apenas uma amostra (3%) apresentou ausência de reatividade. Quando
estes soros foram avaliados pelo IB, verificamos que todos, ou seja, 100%
30
(n=30) deles apresentaram reatividade frente às frações H e M de H.
capsulatum (Figuras 1 e 2).
Quadro 2: Identificação das amostras e síntese das análises
imunológicas após avaliação pelas técnicas de ID e IB.
Entrada ID IB Entrada ID IB
1 31 Masculino 01/10/07 NR H/M Não Recebida NRE NRE
2 42 Masculino 01/10/07 NR H/M Não Recebida NRE NRE
3 22 Masculino 01/10/07 NR H/M Não Recebida NRE NRE
4 14 Feminino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 NR H/M5 45 Masculino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/16 H/M6 15 Masculino 01/10/07 NR H/M 13/11/07 1/8 H/M7 15 Masculino 01/10/07 NR H/M 13/11/07 Reagente H/M8 15 Masculino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/4 H/M9 14 Masculino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/4 H/M10 14 Masculino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/1 H/M11 16 Masculino 01/10/07 NR M 13/11/07 1/4 H/M12 15 Masculino 01/10/07 1/4 H/M 13/11/07 1/4 H/M13 14 Masculino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/1 H/M14 14 Feminino 10/10/07 NR NR 13/11/07 1/2 H/M15 15 Feminino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/4 H/M16 14 Masculino 01/10/07 NR M 13/11/07 1/4 H/M17 14 Masculino 10/10/07 NR M 13/11/07 1/2 H/M18 14 Feminino 01/10/07 NR M 13/11/07 1/1 H/M19 14 Feminino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/4 H/M20 14 Masculino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 Reagente H/M21 14 Feminino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/4 H/M22 14 Feminino 01/10/07 NR NR 13/11/07 Reagente H/M23 14 Feminino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/16 H/M24 14 Masculino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/4 H/M25 16 Masculino 01/10/07 NR H/M 13/11/07 1/8 H/M26 14 Feminino 01/10/07 NR NR Não Recebida NRE NRE
27 14 Feminino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/1 H/M28 14 Feminino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/16 H/M29 15 Feminino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/1 H/M30 14 Masculino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 1/4 H/M31 14 Masculino 10/10/07 NR NRE 13/11/07 1/16 H/M32 14 Feminino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/4 H/M33 15 Masculino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/8 H/M34 15 Masculino 01/10/07 NR NR 13/11/07 1/1 H/M35 14 Masculino 10/10/07 NR H/M 13/11/07 Reagente H/M
IB: Immunoblotting
ID: Imunodifusão dupla em gel de agaroseNR: Não Reagente
NRE: Não Realizado
1ª Remessa 2ª RemessaAmostra Idade Sexo
31
3%
65%
97% 100% 97%
34%
3%0%
1ª Remessa 2ª Remessa 1ª Remessa 2ª Remessa
ID
IB
REAGENTES NÃO REAGENTES
Figura 1: Reatividade das amostras (1ª e 2ª remessa) pelas metodologias
de imunodifusão dupla em gel de agarose e immunoblotting frente ao
antígeno da amostra 200, 20 vezes concentrado, cultivada em ágar
Sabouraud-dextrose, por 33 dias a 27o C, segundo Freitas (2005).
.
32
Figura 2: Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H.
capsulatum de indivíduos com suspeita clínica de histoplasmose pulmonar
aguda frente ao antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado, cultivada
em ágar Sabouraud-dextrose, por 33 dias a 27o C, segundo Freitas (2005).
*C+: Controle-positivo da reação
33
Discussão
As microepidemias ou surtos de HP ocorrem quando um determinado
número de indivíduos encontra-se em uma região restrita e com solo
contaminado por excretas de aves e morcegos sendo expostos aos esporos
fúngicos de H. capsulatum dispersos no ar (Wanke e Capone, 1990). Devido
à ocorrência simultânea dos casos e à fácil identificação da fonte de
exposição, as microepidemias são mais facilmente reconhecidas do que os
casos isolados (Unis et al., 2005).
As microepidemias costumam ser mais freqüentes em áreas de maior
endemicidade. Locais onde existem elevadas concentrações de aves ou
morcegos podem dar origem a surtos epidêmicos ou microepidêmicos que
diferem em sua magnitude quando da exposição simultânea de pessoas ao
agente infectante (Kwon-Chung e Bennett, 1992).
Segundo o Núcleo de Vigilância Epidemiológica do Município de
Areias-SP, a caverna visitada pelos indivíduos citados neste trabalho havia
sido interditada há tempos atrás após isolamento de H. capsulatum. O
município de Arapeí está localizado na Serra da Bocaína, no Vale do
Parnaíba, à distância de 310 km da Capital, situada a 580m acima do nível
do mar, em uma área circundada por montanhas, com grande quantidade de
grutas e cavernas, clima tropical e temperatura média de 25ºC.
A ocorrência de microepidemias ou surtos de HP tem aumentado
entre indivíduos que buscam no ecoturismo uma nova forma de lazer. Na
América do Norte, a HP tem sido considerada por diversos pesquisadores
como doença recreacional entre espeleólogos. Panackal et al. (2002)
relatam que 60 a 64% dos indivíduos que possuem o hábito de freqüentar
cavernas e ou grutas apresentam teste cutâneo positivo à histoplasmina.
34
Segundo Leimann et al. (2005), a presença de anticorpos anti-H.
capsulatum detectada por métodos sorológicos, como ID e/ou IB, aliada às
evidências clínicas e/ou radiológicas da infecção pode ser considerada como
critério de diagnóstico da HP em casos onde a identificação do agente
etiológico não foi possível, ainda que não exista uma história epidemiológica.
A histoplasmose pulmonar aguda em indivíduos hígidos caracteriza-se por
sintomas respiratórios que surgem de uma a três semanas após a exposição
ao patógeno (Goodwin e Des Prez, 1978; Kwon-Chung e Bennett, 1992).
De acordo com a literatura, na HPA, a cultura e a histopatologia
apresentam baixo percentual de positividade, ao passo que a sensibilidade
dos métodos sorológicos varia entre 80 e 95% (Restrepo, 1998; Wheat,
2003; Wheat and Kauffman, 2003; Leimann et al., 2005).
Neste trabalho, foi possível a detecção de anticorpos circulantes anti-
H. capsulatum em 34 amostras de pacientes, dentre os 35 casos suspeitos
encaminhados para o LIM/BM/IAL-SP (Quadro 2). Dessa forma, a evidência
sorológica possibilitou a confirmação do surto de HP na cidade de Areias,
SP após visitação a cavernas do município de Arapeí, SP.
Microepidemias de HP após visita a cavernas situadas no continente
americano e habitadas por morcegos têm sido relatadas por diversos
autores. Ashford et al. (1999) descrevem um surto de HP ocorrido no Texas
(EUA) durante a Convenção Nacional da Sociedade de Espeleologia, no
qual casos agudos da doença foram associados à exposição a duas
cavernas infestadas por morcegos.
No Estado da Geórgia, EUA um grupo de 15 estudantes visitaram
uma mina de prata na Nicarágua e, três dias após o retorno do grupo para
os EUA, 12 (80%) indivíduos apresentaram sinais clínicos compatíveis com
35
HP aguda, confirmada posteriormente por meio de provas sorológicas
(Panackal et al., 2002).
Erkens et al. (2002) descrevem a presença de anticorpos circulantes
da classe IgG anti-H. capsulatum, empregando a técnica de IB, em cinco
integrantes de um grupo de oito pesquisadores alemães, que haviam
passado dez dias em Cuba, estudando os hábitos de morcegos. Registrou-
se também, que duas pessoas do grupo que relataram a utilização de
máscaras faciais, não apresentaram nenhuma sintomatologia. Os autores
enfatizam a necessidade e importância do uso de equipamento de proteção
individual (EPI) para pessoas que visitam cavernas.
No segundo semestre de 2007, a Secretaria de Vigilância em Saúde
do Ministério da Saúde foi notificada da suspeita de HP em um trabalhador
que havia participado de um curso de captura de morcegos hematófagos em
Cáceres, município do Estado de Mato Grosso do Sul. Uma investigação no
local considerou 35 indivíduos clinicamente suspeitos. De 18 amostras
sorológicas coletadas dos casos suspeitos, quatro resultaram positivas para
o teste de ID e 14 para o WB. Constatou-se que não foi utilizado
equipamento de proteção individual (EPI) durante as visitas programadas
pelo curso. Os responsáveis pelo trabalho destacam que a ocorrência do
surto de HP foi possivelmente causada pela falta de EPI durante as visitas
programadas pelo curso. Para os mesmos, a caverna identificada como local
de origem da infecção não deve ser aberta a visitação e o público deve ser
orientado sobre os riscos de adoecimento ao adentrá-la e, nesse caso, o uso
de EPI deve ser incentivado (Lima et al., 2008).
A utilização do teste de IB (ou WB) apresenta a vantagem de
identificação prévia em alguns casos de infecção. Este fato deve-se a
possibilidade de detecção da soroconversão anteriormente à FC ou ID
(Leimann et al., 2005) como demonstrado neste trabalho. Dos 34 casos
36
confirmados sorologicamente, 22 (61,8%) amostras apresentaram algum tipo
de reatividade para H. capsulatum por IB logo na primeira remessa.
Pizzini et al. (1999) avaliando a especificidade do ensaio de WB
evidenciou uma maior capacidade discriminatória desta técnica, frente a 20
soros de pacientes com HPA, quando comparada às reações de ID e FC
freqüentemente utilizadas na rotina diagnóstica. Os autores demonstraram
que a sensibilidade do ensaio foi de 100%.
Kohara et al. (2007) avaliaram 69 soros de pacientes com
confirmação clínica ou micológica de HP pelas técnicas de ID e IB. Os
autores observaram que, por ID, apenas 10% dos soros apresentaram
reatividade anti-H. capsulatum, enquanto que 62% reconheceram, por IB, as
frações H e M indicando doença ativa e 24%, a fração M sugerindo que os
indivíduos haviam sido expostos ao H. capsulatum ou então, imunizados
com histoplasmina através do teste de hipersensibilidade do tipo tardio.
Neste estudo, foi possível demonstrar que o emprego do
immunoblotting, técnica imunológica mais sensível comparada a
imunodifusão, foi fundamental para detecção precoce de anticorpos
circulantes anti-H. capsulatum, contribuindo, desta forma, com a Vigilância
Epidemiológica dos Municípios de Areais e Arapeí na confirmação do surto
de histoplasmose.
A aplicação do ensaio de immunoblotting foi capaz de discriminar já
na primeira análise que 62% (21/34) das amostras avaliadas, apresentaram
reatividade frente a alguma fração antigênica de H. capsulatum. Destas, 17
(50%) amostras apresentaram reatividade frente às frações H e M,
imunodominantes, para H. capsulatum, sugerindo infecção aguda, quatro
(12%) reagiram frente à fração M de H. capsulatum, demonstrando que os
pacientes entraram em contato com o agente etiológico da histoplasmose ao
entrarem na caverna. Treze indivíduos (35%) apresentaram ausência de
37
reatividade frente às frações H e M. As 30 amostras avaliadas após 60 dias
da visita a caverna infestada por esporos de H. capsulatum, reagiram de
forma específica frente às frações H e M, sugerindo a existência de doença
em curso, pois, segundo Heiner (1958), a faixa H do antígeno é detectável
junto com a M em vigência de alguma infecção em curso (Figura 1).
Uma explicação plausível para o baixo percentual de reatividade
frente às frações imunodominantes de H. capsulatum observado na análise
pela técnica de imunodifusão dupla em gel de agarose das primeiras
amostras (n=35) estaria relacionada à baixa produção de anticorpos
circulantes anti-H. capsulatum apresentado no início do processo infeccioso.
Associado a esta observação deve-se salientar que segundo Romero (2005)
a sensibilidade do ensaio de imunodifusão para casos autolimitados da
doença é de apenas 15%.
A avaliação da segunda remessa de amostras enviadas ao
Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses para nova avaliação
sorológica permitiu a observação e caracterização do fenômeno de
soroconversão, que para H. capsulatum sabe-se ser tardio. Verificou-se por
ID, que 97% (29/30) das amostras de soro reagiram de forma específica
frente ao antígeno 200 de H. capsulatum (Quadro 2).
A imunodifusão dupla em gel de agarose é sem dúvida alguma a
reação imunológica mais utilizada nos laboratórios de mico-sorologia para o
diagnóstico presuntivo ou confirmatório de diversas infecções fúngicas,
incluindo-se a histoplasmose. Entre os fatores que contribuem para esta
escolha pode-se citar não apenas o fato de ser uma metodologia de baixo
custo operacional e fácil exeqüibilidade técnica; mas principalmente por
consentir que os clínicos realizem o acompanhamento sorológico dos
pacientes, verificando a diminuição dos títulos de anticorpos circulantes anti-
H. capsulatum permitindo também avaliar a eficácia da terapia anti-fúngica
durante e pós-tratamento (Elias-Costa et al., 2000). Contudo, não podemos
38
esquecer que a sensibilidade desta metodologia, esta diretamente
relacionada à qualidade da preparação antigênica utilizada, forma clínica da
doença e início do tratamento (Siqueira, 1982).
Em resumo, os resultados apresentados corroboram com os dados da
literatura e demonstram que o emprego de ensaios imunológicos é de
extrema importância no diagnóstico confirmatório da histoplasmose. Neste
estudo, não nos foi passado nenhuma informação quanto à solicitação de
exames micológicos para o grupo avaliado. Entretanto, sabe-se que a
demonstração do agente etiológico da histoplasmose em exame direto bem
como seu isolamento e identificação muitas vezes apresenta resultados
negativos, principalmente em formas autolimitadas da doença. Além disso,
as provas sorológicas propiciam a obtenção de resultados em menor tempo
quando comparadas as micológicas (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Mendes-
Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Wheat , 2003).
Por outro lado, conhecendo-se às características geo-climáticas do
Município de Arapeí pode-se dizer que as condições ambientais favoráveis
para o desenvolvimento de H. capsulatum aliado ao grande potencial
turístico dos municípios situados na Serra da Bocaína corroboram com os
dados da literatura que demonstram a íntima relação entre ocorrência de
microepidemias ou micro surtos de HP a indivíduos que buscam no
ecoturismo uma nova forma de lazer.
A indústria do turismo é, na atualidade, a atividade que apresenta os
mais elevados índices de crescimento no contexto econômico mundial.
Movimenta cerca de US$ 3,5 trilhões anualmente e, apenas na última
década, expandiu sua atividade em 57% (Ambiente Brasil, 1994). Segundo
a Organização Mundial do Turismo estima-se que 10% das pessoas que
viajam pelo mundo são ecoturistas. No Brasil, projeta-se que o ecoturismo
alcance meio milhão de turistas/ano (Oliveira, 2005).
39
Diante do exposto, apesar de considerar praticamente impossível o
controle no acesso de pessoas a áreas que apresentam potencial risco de
infecção por H. capsulatum, julga-se necessária à conscientização das
mesmas para o risco ao qual estarão expostos. Nesse caso, sugere-se
como medidas preventivas, que os órgãos de saúde (por exemplo, os
Grupos de Vigilância Epidemiológica) alertem tanto a população como as
agências de viagem, que organizam atividades voltadas ao ecoturismo ou
lazer rural, sobre a necessidade e importância do uso de máscara ao
adentrarem nas cavernas. Além disto, deve-se orientar aos turistas que
aqueles que se encontram imunodeprimidos, ou seja, indivíduos que
apresentem um simples quadro gripal devem evitar adentrar a cavernas. Ao
mesmo tempo, deve ser informado que a coleta ou retirada e o transporte de
solo, pedras, plantas e animais não são recomendados, uma vez que se
constituem potenciais fontes de infecção, além de danificarem o ambiente e
ecossistema.
40
Conclusões
• Na ausência de evidências micológicas, o emprego da técnica de
immunoblotting foi fundamental para detecção precoce de anticorpos
circulantes anti-H. capsulatum, contribuindo portanto com a Vigilância
Epidemiológica dos Municípios de Areais e Arapeí na confirmação do
surto de histoplasmose.
• A técnica de imunodifusão dupla em gel de agarose não apresentou
índice de sensibilidade satisfatório para detectar níveis de anticorpos
circulantes anti-H. capsulatum em amostras de soro coletadas e
analisadas com menos de 30 dias da exposição do grupo de indivíduos a
caverna infestada por esporos fúngicos
• A técnica de imunodifusão dupla em gel de agarose apresentou maior
sensibilidade e, portanto foi mais eficiente na detecção de anticorpos
circulantes anti-H. capsulatum frente às amostras de soro coletadas e
analisadas 60 dias após o contato dos indivíduos com a caverna
infestada por esporos fúngicos.
• A confirmação dos resultados obtidos por IB na primeira remessa
ocorreu por meio da detecção da soroconversão, quando se utilizou uma
técnica mais específica, como a ID.
• A associação de duas provas imunológicas: a imunodifusão dupla em
gel de agarose, com alto grau de especificidade, e o immunoblotting com
alto grau de sensibilidade, permitiu a detecção e/ou confirmação de
histoplasmose pulmonar aguda em 34, dos 35 indivíduos com suspeita
clínica da doença.
41
• As características geo-climáticas das cavernas situadas no município
de Arapeí, SP parecem propiciar um micro-ambiente favorável ao
desenvolvimento de H. capsulatum, com risco potencial de infecção aos
visitantes.
• O uso de EPI, como máscara facial, deve ser incentivado entre os
praticantes de eco-turismo e/ou espeleologia, assim como para toda
população que adentra em cavernas e outras áreas passíveis de infecção
por H. capsulatum. Assim como, que a coleta ou retirada e o transporte
de objetos e materiais dessas áreas não são recomendados.
Este trabalho pode ser encontrado no “site” do Boletim Epidemiológico
Paulista – BEPA, formato: “Comunicação Breve” e encontra-se disponível
nos seguintes endereços:
http://www.cve.saude.sp.gov.br/agencia/bepa58.htm, ou
http://www.cve.saude.sp.gov.br/agencia/bepa58_histoplasmosis.htm
42
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