SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE DE SÃO PAULO

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL

PAP - FUNDAP - SES - INSTITUTO BUTANTAN

HELOISA BALLARINO DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS L1 E L2 DO HPV16 EM

CULTURAS DE CÉLULAS HUMANAS TRANSFECTADAS COM VETORES DE

EXPRESSÃO GÊNICA

São Paulo

2013

2

SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE DE SÃO PAULO

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL

PAP - FUNDAP - SES - INSTITUTO BUTANTAN

HELOISA BALLARINO DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS L1 E L2 DO HPV16 EM

CULTURAS DE CÉLULAS HUMANAS TRANSFECTADAS COM VETORES DE

EXPRESSÃO GÊNICA

Monografia apresentada ao Programa de

Aprimoramento Profissional/SES, elaborada

no Instituto Butantan/ Laboratório de

Genética – Unidade de Microscopia

Eletrônica.

Área: Genética.

Orientadora: Profa. Dra. Aurora M.

Cianciarullo

São Paulo

2013

3

SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE DE SÃO PAULO

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL EM GENÉTICA

Título da Monografia: CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS

L1 E L2 DO HPV16 EM CULTURAS DE CÉLULAS HUMANAS TRANSFECTADAS

COM VETORES DE EXPRESSÃO GÊNICA.

Data: 28/ 02/ 2013

________________________________________

Aprimoranda: Heloisa Ballarino de Oliveira

________________________________________

Orientadora: Profa. Dra. Aurora Marques Cianciarullo

________________________________________

Coordenadora do Programa: Profa. Dra. Itamar Romano Garcia Ruiz

São Paulo

2013

4

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Aurora Marques Cianciarullo pela receptividade e orientação concedida

para a realização deste trabalho.

Às mestrandas do curso de Biotecnologia, Érica Akemi Kavati e Bianca Marigliani,

pela colaboração para a realização deste trabalho e por compartilhar comigo seus

conhecimentos técnicos e científicos.

À aluna do PAP, Raquel Agonilha Canali, pela amizade, convivência e colaboração

neste trabalho durante o período de aprimoramento profissional.

Ao Alexsander Seixas de Souza, do Laboratório de Parasitologia do Instituto

Butantan, pelo suporte técnico na utilização do microscópio confocal a laser.

À Simone Gonçalves Silva Jared, do laboratório de Biologia Celular do Instituto

Butantan, pelo suporte técnico na utilização do microscópio eletrônico de

transmissão.

Aos amigos e funcionários do Laboratório de Genética e Instituto Butantan por todo

o apoio recebido.

À FUNDAP, FAPESP, Instituto Butantan e Fundação Butantan pelo suporte

financeiro e infraestrutura, indispensáveis para o desenvolvimento deste projeto.

À minha família pelo amor, incentivo e compreensão que foram fundamentais para a

conclusão de mais uma etapa para a minha formação profissional.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste

estudo.

5

RESUMO

O Papilomavírus Humano (HPV) está associado a verrugas genitais e diversos tipos de cânceres. O câncer cervical é o mais comum, sendo o terceiro que mais atinge mulheres no mundo, onde o HPV16 é responsável por, aproximadamente, 50% dos casos. Atualmente, existem disponíveis duas vacinas profiláticas contra o HPV. Ambas produzidas através da tecnologia de DNA recombinante, para obtenção de partículas semelhantes ao vírus (Virus-Like Particles - VLP) dos tipos mais comuns de HPV relacionados com câncer cervical. As VLPs não contém o DNA do vírus, são formadas pela proteína L1 do capsídeo viral que apresenta alta capacidade de induzir resposta imunológica, além de ser tipo específica. A proteína L2, embora seja pouco imunogênica, atua contra diferentes tipos de HPVs e é fundamental para conferir estabilidade ao capsídeo.

O objetivo do presente trabalho é promover a expressão e caracterização de VLPs L1L2 em cultura de células epiteliais humanas, da linhagem HEK293, a fim de comparar sua eficiência com a linhagem HEK293T.

Após a transfecção (L1) ou cotransfecção (L1 e L2) de células HEK293 e HEK293T foi realizado um estudo cinético da expressão das proteínas do capsídeo através de ensaios de imunofluorescência. A microscopia confocal demonstrou que as proteínas L1 e L2 alcançam o seu pico de expressão 36 horas após a transfecção, tratando-se das células HEK293. Por outro lado, as células HEK293T apresentaram o pico máximo de expressão proteica 12 horas após a transfecção. Os resultados foram confirmados por citometria de fluxo, onde aproximadamente 80% das células expressaram a proteína L1 nas linhagens HEK293 e HEK293T, nos tempos 36 e 12 horas após a transfecção, respectivamente. Para análise morfológica foi realizada microscopia eletrônica de transmissão.

Com base nos dados obtidos foi possível estabelecer um eficiente sistema de expressão das proteínas L1 e L2 recombinantes do HPV16, em cultura de células epiteliais humanas das linhagens HEK293 e HEK293T. A linhagem celular HEK293 foi selecionada para dar continuidade aos estudos, por se apresentar mais eficiente quando comparada com as células HEK293T. Posteriormente, serão realizados ensaios de purificação, tendo em vista que VLPs constituídas de ambas as proteínas estruturais sejam candidatas na produção de vacinas profiláticas de segunda geração, de amplo espectro de proteção contra o HPV. Palavras-chave: HPV; vacina profilática; VLP L1L2; cânceres associados ao HPV.

6

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 8

1.1 O papilomavírus humano ................................................................................... 9

1.1.1 Genoma do HPV ....................................................................................... 10

1.1.2 Ciclo de vida .............................................................................................. 11

1.2 Epidemiologia ............................................................................................... 13

1.3 Rastreamento ............................................................................................... 15

1.4 Vacinas ........................................................................................................ 15

2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 19

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 19

3.1 Vetores plamideais para expressão das proteínas de HPV16 ..................... 19

3.2 Cultivo de células humanas HEK 293 .......................................................... 20

3.3 Cultivo de células humanas HEK 293T ........................................................ 21

3.4 Transfecção e produção das proteínas recombinantes................................ 22

3.5 Microscopia confocal a laser ........................................................................ 23

3.6 Citometria de fluxo ....................................................................................... 24

3.7 SDS-PAGE ................................................................................................... 24

3.8 Western blotting ........................................................................................... 25

3.9 Microscopia eletrônica de transmissão ........................................................ 25

3.9.1 Imunocitoquímica ultraestrutural ............................................................... 26

3.9.2 Imunomarcação......................................................................................... 26

3.9.3 Captura de imagens .................................................................................. 27

3.9.4 Armazenamento e análise de VLPs não purificadas ................................ 27

4. RESULTADOS ................................................................................................... 28

4.1 Cinética de expressão das proteínas ........................................................... 28

4.1.1 Microscopia confocal a laser ..................................................................... 28

4.1.2 Citometria de fluxo .................................................................................... 30

7

4.2 SDS-PAGE e Western blot ........................................................................... 30

4.3 Microscopia eletrônica de transmissão ........................................................ 32

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 34

6. CONCLUSÃO .................................................................................................... 35

7. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 36

8

1. INTRODUÇÃO

Entre os instrumentos de política de saúde pública, a vacina é um dos

principais fatores de promoção da saúde e prevenção de doenças humanas e em

animais. No final do século XVIII, depois de observar que os ordenhadores não

contraíam varíola, Edward Jenner imunizou um indivíduo inoculando material

proveniente de lesão pustular formada pelo vírus vaccínia nas tetas das vacas

(Schatzmayr, 2001; Homma et al., 2003). No Brasil, as estratégias de vacinação têm

alcançado altos índices de eficiência, porém, o custo elevado de produção de

algumas vacinas impossibilita a inclusão destas no Programa Nacional de

Imunização, sendo o caso da vacina contra o Papilomavírus Humano (HPV).

O HPV está associado a verrugas genitais e diversos tipos de cânceres

(Bosch et al., 1995). O câncer cervical é o terceiro tipo de câncer que mais atinge

mulheres no mundo, sendo um grave problema de saúde pública principalmente nos

países em desenvolvimento, onde ocorrem 80% dos casos (Cutts et al., 2007;

Stanley, 2008). A infecção persistente pelos HPVs de alto risco oncogênico é a

principal causa de lesões pré-cancerosas e cânceres cervicais, onde o HPV16 e 18

são responsáveis por mais de 70% dos casos (Zur Hausen, 2002; Schiffman et al.,

2007). Porém, a infecção por si só não representa causa suficiente para o

aparecimento dessa neoplasia. Além de aspectos relacionados à infecção pelo HPV,

outros fatores ligados à imunidade, uso prolongado de contraceptivo oral,

comportamento sexual e susceptibilidade a inflamações crônicas contribuem para a

instalação de lesões precursoras ou câncer (Schiffman et al.; INCA, 2011). Os HPVs

6 e 11 são considerados de baixo risco, portanto, responsáveis pelas verrugas

anogenitais em, aproximadamente, 90% das infecções (Arima et al., 2010).

Atualmente, as vacinas profiláticas produzidas contra o HPV utilizam a tecnologia de

DNA recombinante, para obtenção de partículas semelhantes ao vírus (Virus-Like

Particles - VLP) dos tipos mais comuns de HPV relacionados a verrugas genitais e

câncer cervical (Cutts et al., 2007). As VLPs não contém o DNA do vírus, são

formadas exclusivamente pela proteína L1 do capsídeo viral que apresenta uma alta

capacidade de induzir resposta imunológica, além de ser tipo-específica, ou seja,

promove proteção apenas contra o tipo de HPV correspondente a proteína L1

presente na formulação da vacina. A proteína L2, embora seja pouco imunogênica, é

fundamental para conferir estabilidade ao capsídeo e, por ser a proteína estrutural

9

mais conservada, atua contra diferentes tipos de HPVs (Cutts et al., 2007; Stanley,

2008; Cianciarullo et al., 2010; Marigliani et al., 2012). Deste modo, obter VLPs

constituídas de ambas as proteínas estruturais, L1 e L2, revela-se um importante

alvo para o desenvolvimento de vacinas profiláticas de segunda geração contra o

HPV, de amplo espectro de proteção.

1.1 O papilomavírus humano

O papilomavírus humano pertence à família taxonômica Papillomaviridae, do

gênero Papilomavírus. Há mais de 150 tipos de HPV já identificados, onde cerca de

40 tipos infectam a região anogenital (Bernard et al., 2010; Schiffman et al., 2011). A

classificação dentro de uma mesma espécie é baseada na homologia do genoma.

Portanto, para serem considerados de um mesmo tipo, os HPVs não podem variar

mais do que 2% na região codificante (ORF – open reading frames) e 5% na região

reguladora (LCR – long control region). Sendo assim, pequenas variações podem

originar diferentes tipos de HPV (Muñoz et al., 2003). Os HPVs considerados de alto

risco oncogênico compreendem os tipos 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53,

56, 58, 59, 63, 66, 68 e 82, onde os mais prevalentes são os HPV16 e 18,

responsáveis por 70% dos canceres cervicais e 50% das lesões pré-cancerosas. Os

demais tipos genitais, HPV6, 11, 42, 43 e 44 são considerados de baixo risco ou

sem qualquer risco oncogênico, onde o HPV6 e 11 estão associados a 90% dos

casos de verrugas anogenitais ou condilomas (Cutts et al.; Schiffman et al., 2007;

Rosa et al., 2009).

Os papilomavírus humanos são vírus não envelopados, de capsídeo

icosaédrico com diâmetro de 50 a 60nm. O capsídeo do HPV é formado por 360

cópias da proteína L1 organizadas em 72 pentâmeros e um número variável de

moléculas da proteína L2, menos de uma por pentâmero (Frazer, Leggatt e

Mattarollo, 2011).

10

Figura 1 - Representação esquemática do capsídeo do HPV. Pentâmeros de L1 (A) e capsídeo icosaédrico (B). Fonte: adaptado de Modis, Trus e Harrison, 2002.

1.1.1 Genoma do HPV

O genoma do HPV é uma dupla fita de DNA circular composta por 8.000

pares de bases que codificam as proteínas tardias L1 e L2 (L – late) do capsídeo

viral e as proteínas precoces E1, E2, E4, E5, E6 e E7 (E – early), envolvidas na

replicação do DNA viral e transformação celular. As regiões codificantes são

denominadas ORF e são separadas pela região reguladora (LCR), também

denominada URR (upstream regulatory region), composta por 1.000 pares de bases,

que contém a origem de replicação (ORI) e elementos reguladores da expressão

gênica (Muñoz et al., 2006; Rosa et al., 2009). As proteínas L1 e L2 são proteínas

estruturais e participam da formação do capsídeo viral. A proteína L1 é a principal

proteína do capsídeo e a mais conservada entre os diferentes tipos de HPV, além de

ser altamente imunogênica. Já a L2 é a proteína secundária, menos conservada e

possui imunogenicidade limitada (Wang, 2007). As proteínas precoces E1 e E2 são

essenciais para a replicação do DNA viral, além disso, E2 é responsável pelo

controle da transcrição, a proteína E4 promove reorganização do citoesqueleto, E5

está relacionada com o estímulo da proliferação, E6 e E7 são denominadas

oncoproteínas virais e possuem papel fundamental na transformação da célula,

interagindo com proteína reguladoras do ciclo celular como p53 e pRb (Ghittoni,

2010).

11

Figura 2 - Genoma do HPV. Representação esquemática dos genes codificantes para as proteínas tardias (L) e precoces (E), separados pela região reguladora (URR). Fonte: Muñoz et al., 2006.

1.1.2 Ciclo de vida

A infecção pelo HPV é relativamente comum em mulheres jovens

sexualmente ativas, porém, na maioria das vezes, trata-se de uma infecção

transiente onde não há apresentação de sinais clínicos, 80% delas regridem

espontaneamente dentro de alguns meses (Williamson, Passmore e Rybicki, 2005).

Em mulheres que desenvolvem lesões detectáveis por exames citológicos a

resposta imunológica se encarregará de controlar e eliminar a infecção, gerando

regressão da lesão. Porém, em algumas mulheres a infecção persistente pode

evoluir para lesões cervicais que se constituem em três estágios pré-malignos, as

neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) de grau I, II ou III, classificadas de acordo

com a proporção afetada do cérvix. Neste caso, o genoma viral passa a integrar o

genoma da célula hospedeira, causando alterações na morfologia e no controle do

ciclo celular, levando a lesões precursoras com potencial para evoluir para o câncer

de colo do útero (Souto, Falhari e Cruz, 2005).

A infecção inicial requer a entrada de partículas virais na camada basal das

células, para isso, alguns tipos de HPV necessitam de ruptura no epitélio. Para que

o vírus consiga penetrar na célula torna-se necessário a interação de proteínas do

capsídeo com receptores específicos de superfície celular, o qual promove a ligação

12

inicial do vírus à célula hospedeira. Existe controvérsia quanto ao receptor, embora a

maioria dos estudos tenha sugerido uma dependência da presença de sulfato de

heparina (Johnson et al., 2009), enquanto que outros estudos registram a entrada

via receptor de transferrina (Palumbo, 2008; Szulczewski et al., 2009; Kavati et al.,

2012).

O ciclo de vida do HPV é dependente da diferenciação celular. O vírus infecta

células menos diferenciadas do epitélio estratificado, as quais possuem alta

atividade mitótica, e acompanham sua diferenciação até a camada superficial onde

ocorre a montagem dos virions e a liberação destes através da descamação do

epitélio. Na fase não reprodutiva, após a infecção e desmontagem do vírus, o

genoma viral permanece na forma epissomal ou extracromossômica com cerca de

10 a 200 cópias por célula, para isso, acredita-se que ocorra a expressão das

proteínas E1 e E2, que também contribuem para a correta segregação do genoma

durante a divisão celular. As células infectadas se dividem e são direcionadas às

camadas mais externas. Uma das células filhas migra da camada basal

diferenciando-se ao longo do processo, enquanto as outras permanecem na camada

mais profunda do epitélio para servirem como reservatório de DNA viral para

posteriores divisões celulares. A amplificação do DNA viral ocorre na fase

proliferativa, assim como a expressão de todos os produtos dos genes precoces.

Uma vez concluída a amplificação do genoma, inicia-se a expressão das proteínas

estruturais do capsídeo viral nas camadas mais superiores do tecido infectado

(Doorbar, 2005).

Figura 3 – Ciclo de vida do HPV. Infecção de células da camada basal; expressão das proteínas precoces no início da diferenciação epitelial (vermelho); aumento da expressão das proteínas de replicação viral

nas camadas suprabasais (verde); amplificação do genoma viral (azul); expressão das proteínas estruturais do capsídeo na camada superficial do epitélio (laranja); montagem e liberação do vírus.

Fonte: modificado de Schiffman et al., 2007.

13

Os HPVs não codificam enzimas necessárias à sua replicação, como

estratégia eles utilizam as enzimas da célula hospedeira para garantir a continuidade

do ciclo celular e um ambiente favorável à replicação do genoma viral. Tratando-se

dos HPVs de baixo risco têm-se as verrugas anogenitais como resultado da

proliferação celular. Já no caso dos HPVs de alto risco essa proliferação pode

desencadear o câncer (Galloway, 2003).

O diagnóstico clínico da infecção é difícil, pois a maioria das mulheres

infectadas manifestam a infecção de forma latente ou sub-clínica, não havendo

tratamento e favorecendo a livre transmissão do vírus. Esta, por sua vez, se dá por

via sexual, ocupando o primeiro lugar no ranking das doenças sexualmente

transmissíveis com, aproximadamente, 75% dos indivíduos que iniciam a vida sexual

tornando-se infectados em algum momento da vida (Tota et al., 2011).

1.2 Epidemiologia

A infecção genital por HPV está entre a doença sexualmente transmissível

mais comum em todo o mundo, no homem e na mulher. Estima-se que

aproximadamente 10% das mulheres com citologia cervical normal apresentam

infecção pelos tipos de HPV encontrados em lesões pré-cancerosas e em câncer

cervical, sendo a prevalência maior em mulheres com idade inferior a 34 anos

(Sanjosé et al., 2007; Bruni et al., 2010). Avaliando lesões pré-cancerosas e câncer,

observa-se que o HPV16 e 18 são responsáveis por 50-55% dos casos de lesões de

alto grau e por volta de 70% dos casos de câncer cervical, tanto no mundo quanto

na América do Sul e Brasil (Fedrizzi, 2011). O câncer de colo de útero é o terceiro

tipo de câncer mais comum em mulheres no mundo, configurando um grave

problema de saúde pública. Sua incidência é cerca de duas vezes maior em países

menos desenvolvidos quando comparada aos países mais desenvolvidos (INCA,

2011). A Organização Mundial da Saúde (WHO - World Health Organization) estima

que mais de 630 milhões de homens e mulheres estejam infectadas pelo HPV no

mundo, sendo que cerca de 105 milhões dessas infecções sejam atribuídas aos

HPV16 e 18. Anualmente são relatados 530 mil novos casos de câncer cervical e

240 mil mortes nos países em desenvolvimento, podendo esse número aumentar

para 380 mil em 2015 (WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer,

2010a; Fedrizzi, 2011).

14

No Brasil mais de 24 mil mulheres são diagnosticadas com câncer cervical a

cada ano, levando a óbito 11 mil dessas pacientes (WHO/ICO Information Centre on

HPV and Cervical Cancer, 2010b). A positividade para o HPV na população geral de

mulheres varia de 21 a 48%, sendo o HPV de alto risco encontrado em 48 a 53%

das infecções. Em relação aos homens, no Brasil, a prevalência varia de 35 a 72%,

sendo os HPV de alto risco responsáveis por 25 a 56% dos casos (Fedrizzi, 2011).

Assim como a prevalência, a incidência da infecção pelo HPV é alta em

mulheres jovens no início da atividade sexual e diminui com a idade, observando-se

um segundo pico em mulheres mais velhas. Mecanismos biológicos como

imaturidade cervical e produção inadequada de muco podem aumentar a

susceptibilidade das mulheres jovens e adolescentes à infecção por HPV. A

coinfecção com múltiplos tipos de HPV e a infecção sequencial com novos tipos é

bastante comum e o risco de adquirir um novo tipo de HPV parece ser independente

da infecção prévia por outros tipos (Fedrizzi, 2011).

Figura 4 - Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100 mil mulheres estimadas para o ano de 2012, segundo Unidade da Federação (neoplasia de colo do útero). Fonte: INCA, 2011.

Para o ano de 2012, o INCA (Instituto Nacional do Câncer) estimou a

ocorrência de 17.540 novos casos de câncer de colo do útero no Brasil, com risco

estimado de 17 casos a cada 100 mil mulheres, observando importantes variações

regionais na incidência (INCA, 2011).

15

1.3 Rastreamento

Os programas de rastreamento do câncer de colo do útero são considerados

medidas de prevenção e têm por objetivo a identificação precoce das infecções pelo

HPV e de lesões pré-cancerosas, permitindo o seu tratamento.

O Papanicolau é o exame citopatológico adotado como referência para

rastreamento pelos programas de controle de câncer cervical no Brasil e consiste na

coleta de algumas células do colo do útero realizada por médico ou profissional de

saúde treinado. Este material é colocado em lâmina de vidro, fixado imediatamente e

examinado em um microscópio para que sejam identificadas lesões precursoras. O

exame citopatológico não diagnostica a infecção por HPV, mas existem alterações celulares que

sugerem a presença do vírus (National Network for Immunization Information).

Nos países em desenvolvimento, a alta incidência de câncer cervical também

está associada ao acesso inadequado das mulheres a programas de prevenção e

rastreamento, assim como sua qualidade. Em países desenvolvidos, a implantação

de programas efetivos de controle do câncer de colo do útero, com rastreamento

pelo teste Papanicolau, diminuiu em aproximadamente 70% a incidência desse tipo

de câncer nas últimas décadas (Smith et al., 2007).

Para países, regiões ou partes da população em que a cobertura do

rastreamento é muito baixa a vacinação seria uma estratégia muito efetiva. No

entanto, para obter a melhor eficácia na prevenção do câncer de colo do útero seria

necessário não só a estratégia de vacinação bem sucedida, como também um

organizado programa de rastreamento, tendo em vista a necessidade da sua

continuidade e a sua importância para a prevenção dos casos de câncer cervical

(Price et al., 2011).

1.4 Vacinas

A descoberta de que o HPV está etiologicamente associado a verrugas

genitais e câncer cervical tem incentivado vários estudos ao longo dos anos para o

desenvolvimento de vacinas. A vacinação profilática deve ser administrada antes da

instalação da infecção, a fim de auxiliar o reconhecimento e prevenir a entrada do

vírus no organismo do hospedeiro (Wang, 2007). As primeiras tentativas de

produção de uma vacina profilática contra o HPV apresentaram bactérias como

16

sistema de expressão de proteínas recombinantes, porém as proteínas produzidas

não eram capazes de induzir uma quantidade razoável de anticorpos em modelos

animais. Um estudo realizado em 1991 demonstrou que a proteína L1 do capsídeo

do HPV16 se autoestrutura em VLP, cuja conformação se assemelha

imunologicamente aos virions nativos (Zhou et al., 1991).

Atualmente, duas vacinas profiláticas contra o HPV utilizando VLP de L1

como imunógeno são licenciadas na maioria dos países em todo o mundo e estão

disponíveis para adolescentes, como parte dos programas de imunização de vários

países europeus, Estados Unidos e Austrália. Em 2006, o FDA (Food and Drug

Administration, órgão governamental dos EUA responsável por alimentos,

medicamentos etc) aprovou uma vacina quadrivalente produzida pela Merck (Merck

and Co., Whitehouse Station, NJ, USA), Gardasil®, que incorpora os HPV16 e 18 de

alto risco e HPV6 e 11 de baixo risco, esses últimos , são responsáveis por 90% das

verrugas genitais, para ser administrada em mulheres de 9 a 26 anos. Em 2009,

outra vacina contra o HPV foi aprovada pelo FDA, Cervarix®, uma vacina bivalente

produzida pela GlaxoSmithKline (GlaxoSmithKline, London, UK), que incorpora os

dois tipos responsáveis por 70% dos cânceres de colo do útero, os HPV16 e 18,

para ser utilizada em mulheres entre 10 e 25 anos. A Gardasil® utiliza células de

leveduras Saccharomyces cerevisiae como sistema de expressão da proteína L1

recombinante e incorpora o sulfato de hidroxifosfato de alumínio como adjuvante na

formulação da vacina. A Cervarix® utiliza células de inseto infectadas com

baculovírus para a produção de VLP e possui o hidróxido de alumínio e monofosforil-

lipídio A na função de adjuvante, induzindo títulos mais altos de anticorpos do que o

anterior. Ambas as vacinas são administradas por via intramuscular em três doses

com intervalos específicos entre elas. A eficácia protetora da imunização com essas

vacinas tem sido definida como a ausência de infecção persistente e/ou doença

associada atribuível ao genótipo do vírus presente na vacina. Ambas demonstraram

eficácia superior a 90% contra a infecção persistente dos genótipos 16 e 18 em

mulheres que receberam três doses da vacina. Também fornecem proteção durável,

observada até 6,4 anos para a vacina bivalente e até 8,5 para a tetravalente (Villa et

al., 2006; Cutts et al., 2007; David et al.; Rowhani-Rahbar et al., 2009; Frazer,

Leggatt e Mattarollo, 2011; Poljak, 2012).

17

Tabela 1 - Atuais vacinas profiláticas contra o HPV

Gardasil® Cervarix®

Genótipos das VLPs de L1

6, 11, 16, 18 16, 18

Sistema de expressão Células de leveduras (S. cerevisiae)

Células de inseto infectadas com baculovírus

Adjuvante

225µg de sulfato de hidroxifosfato de alumínio

500µg de hidróxido de alumínio + 50µg de 3-desacilato monofosforil-lipídio A

Intervalo entre as doses

2 meses entre a 1ª e a 2ª dose 6 meses entre a 1ª e a 3ª dose

1 mês entre a 1ª e a 2ª dose 6 meses entre a 1ª e a 3ª dose

Faixa etária Homens e mulheres de 9 a 25 anos

Mulheres de 9 a 15 anos

Fonte: adaptado de Cutts et. al., 2007.

Em análises preliminares, as duas vacinas demonstraram alguma evidência

de proteção cruzada contra os HPV31 e 45, intimamente relacionada com os tipos

de HPV16 e 18, respectivamente. Porém, para a proteção cruzada ser clinicamente

significativa, será necessário demonstrar que a administração de vacinas contra o

HPV reduz a incidência da infecção persistente pelos tipos relacionados aos HPV16

e 18, portanto, os estudos prosseguem (Cutts et al., 2007).

Dados recentes da Austrália, onde a imunização de rotina em mulheres com

menos de 28 anos com a vacina tetravalente teve início em 2006, demonstram um

declínio nos casos de verrugas genitais associadas ao HPV, além de diminuição de

lesões cervicais de alto grau em mulheres com idade inferior a 18 anos (Fairley et

al., 2009; Donovan et al., 2010). Estes dados fornecem a primeira evidência da

eficácia da vacinação contra o HPV na população geral.

No Brasil, as duas vacinas para prevenção de infecção por HPV foram

aprovadas pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). A quadrivalente

teve seu registro publicado em 2006 e foi aprovada para ser administrada em

mulheres e recentemente em homens, ambos na faixa etária de 9 a 26 anos. A

bivalente teve seu registro publicado em 2008 para a prevenção contra dois tipos de

HPV, 16 e 18. O custo médio das vacinas está em torno de R$ 200 reais para a

Cervarix® e R$ 300 reais para a Gardasil®, por dose, na rede privada. Apesar do

custo elevado algumas cidades brasileiras já realizam campanhas de vacinação

pública contra o HPV, outras estão empenhadas em incluí-la no calendário vacinal

(Brats, 2011).

As vacinas contra HPV são produzidas por tecnologia de DNA recombinante

que resulta na obtenção de VLP, oriundas da proteína L1 do capsídeo viral dos tipos

18

de HPV mais prevalentes, altamente purificadas e capazes de gerar resposta

imunológica. Como as VLPs não contêm DNA viral, não são capazes de infectar

células, se reproduzirem ou causarem doenças. Apesar de algumas reações

cruzadas terem sido relatadas, VLPs compostas de L1 possuem característica tipo-

específica induzindo a produção de anticorpos neutralizantes apenas para o

genótipo do vírus contido na formulação.

Vários grupos de pesquisa procuram estratégias para aumentar o espectro de

ação das vacinas incorporando proteína L1 de outros tipos de HPV nas VLPs. Desse

modo, a proteção contra o vírus ainda não seria suficientemente abrangente e a

complexidade de produção aumentaria efetivamente o custo da vacina, visto que

mais de 150 tipos já foram descritos. A incorporação da proteína L2 à formulação de

vacinas de segunda geração também tem sido amplamente estudada, devido à alta

conservação dessa proteína entre diferentes tipos de HPV que parece estar

relacionada com a entrada do vírus na célula hospedeira. A proteína L2 possui uma

porção na sequência de aminoácidos altamente conservada, que parece interagir

com um receptor de superfície celular extremamente importante para a infecção

viral. Vacinas baseadas na proteína L2 do capsídeo viral mostraram-se capazes de

induzir a geração de anticorpos neutralizantes em modelos animais e uma proteção

cruzada mais ampla quando comparadas às vacinas de L1 (Gersch, Gissmann e

Garcea, 2011).

Para aumentar a proteção contra o câncer cervical causado pelo HPV são

necessárias vacinas polivalentes, entretanto a complexidade de produção acarretará

no aumento do custo, tornando inviável sua utilização em países em

desenvolvimento onde ocorre a maioria dos casos de câncer de colo do útero

(Garland e Smith, 2010).

As vacinas comerciais atuais são de uso exclusivamente preventivo, não

tendo nenhum papel no tratamento de lesões anogenitais ou na eliminação de

infecções prévias por HPV. Portanto, é importante ressaltar que a vacinação não

substitui a realização do rastreamento, sendo que ambos os procedimentos devem

ser sempre realizados em conjunto. Mesmo em países que já incorporaram a vacina

contra o HPV, a recomendação é que todas as mulheres vacinadas devem continuar

realizando o rastreamento de Papanicolau, com a mesma periodicidade e faixa

etária determinada anteriormente nos protocolos de rastreamento destes países

(Brats, 2011).

19

2. OBJETIVOS

‒ Realizar o cultivo celular de células epiteliais humanas renais embrionárias de

linhagens estabelecidas HEK 293 e HEK 293T, não transformadas e não

imortalizadas por HPV;

‒ Amplificar, extrair e purificar vetores de expressão em bactérias Escherichia coli;

‒ Transfectar as células com vetores de expressão contendo os genes completos

das proteínas L1 e L2 do capsídeo viral de HPV16;

‒ Comparar as linhagens HEK 293 e HEK 293T a fim de eleger a mais eficiente para

a produção de VLPs compostas pelas proteínas L1 e L2 de HPV16;

‒ Analisar a cinética de expressão das proteínas L1 e L2 de HPV16 em ambas as

linhagens celulares, através de microscopia confocal, citometria de fluxo, western

blotting e microscopia eletrônica de transmissão.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Vetores plamideais para expressão das proteínas de HPV16

Para a expressão heteróloga dos genes L1 e L2 do capsídeo de HPV16,

foram utilizados os vetores plasmideais de DNA pUF3L1h e pUF3L2h fornecidos

pelo Prof. Dr. Martin Müller (Forschungsschwerpunkt Angewandte Tumorvirologie,

DKFZ-Heidelberg, Alemanha). Ambos os vetores foram construídos sob a regulação

do promotor constitutivo do citomegalovírus humano (pCMV), contêm o gene de

resistência a ampicilina e o gene repórter GFP (Green Fluorescent Protein) para

monitoramento da expressão proteica, além dos respectivos genes humanizados

para expressão das proteínas L1 e L2 do capsídeo de HPV16. A amplificação dos

vetores foi realizada em bactérias Escherichia coli DH5α cedidas pela Profa. Dra.

Itamar Romano Garcia Ruiz, do Instituto Butantan (SP, Brasil). Esta linhagem

permite manipulações genéticas como propagação e amplificação de DNAs

20

plasmideais. A indução da competência das DH5α foi realizada segundo o método

de Sambrook (Sambrook; Russel, 2001), que consiste em cultivar as bactérias em

meio LB (Luria-Bertani, composto por triptona a 1%, extrato de levedura a 0,5% e

cloreto de sódio a 0,5%) a 37°C sob agitação de 250rpm até a metade da fase

exponencial de crescimento (D.O.600nm = 0,6), em seguida incubar as bactérias em

solução de 0,1M de CaCl2 por 1h em gelo, centrifugar a 5000g por 10min e

ressuspender em meio LB contendo 20% de glicerol. Bactérias quimiocompetentes

foram aliquotadas em 200μl e armazenadas a -80°C até o momento de sua

utilização. Para a transformação das bactérias competentes também foi utilizado o

método de Sambrook (Sambrook; Russel, 2001), que consiste em adicionar uma

alíquota de 10μl de DNA plasmideal à alíquota de bactérias competentes, incubar

por 30min em gelo, submeter a um choque térmico por 2min a 42°C e incubar

novamente em gelo por 5min. Em seguida, foram adicionados 350μl de meio LB

incubando por 90min a 37°C. As bactérias transformadas foram semeadas em

placas contendo meio LB, ágar a 1,5% e ampicilina a 100μg/ml, incubadas a 37°C

por 18h. Os clones positivos, resistentes à ampicilina, foram inoculados em 3ml de

meio LB com ampicilina e cultivados a 37°C sob agitação de 250rpm por 18h para

amplificação dos plasmídeos. Após o cultivo, cada cultura foi centrifugada a 12.000 x

g por 1min para a obtenção de um precipitado de bactérias. O precipitado bacteriano

foi tratado com os reagentes do kit AxyPrep™ Plasmid Miniprep Kit (Axygen, Union

City, CA, USA) de acordo com as orientações do fabricante, para a extração dos

plasmídeos. A concentração de DNA plasmideal de cada extração foi verificada

utilizando espectrofotômetro NanoDrop™ 100 (ThermoScientific, Waltham, MA, USA)

e os plasmídeos purificados foram armazenados a -20°C até o momento de

utilização.

3.2 Cultivo de células humanas HEK 293

As células epiteliais humanas da linhagem HEK 293 (Human Embryonic

Kidney) são muito utilizadas para a expressão de proteínas recombinantes devido à

sua facilidade de transfecção e capacidade de realizar modificações e

processamentos pós-traducionais complexos. Essas células, obtidas da ATCC

(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) sob a identificação CRL-

21

1573™, são provenientes de rim embrionário humano transformadas e imortalizadas

através da transfecção de células diplóides com DNA de adenovírus humano tipo 5.

As HEK 293 foram plaqueadas na proporção de 1,1 x 104 células/mL e cultivadas

em garrafas plásticas descartáveis de 75cm² (TPP®, Techno Plastic Products,

Zollstrasse, Trasadingen, SW) incubadas a 37°C em atmosfera úmida contendo 5%

de CO2. O meio de cultura utilizado foi o M10, composto pelo meio de cultura MEM

(Modified Eagle Medium, Cultilab, Campinas, SP, BR) suplementado com 10% de

SBF (Soro Bovino Fetal, Cultilab). O meio de cultura foi trocado a cada três ou

quatro dias e as células foram cultivadas nessas condições até atingirem confluência

de 50 a 80%, quando eram então subcultivadas, armazenadas ou utilizadas para a

transfecção com os plasmídeos purificados. Para o subcultivo as células foram

lavadas três vezes utilizando 3ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato),

destacadas utilizando 1ml de tripsina (Trypsin/EDTA Solution 2,5g/L, Cultilab) por

até 15min. Após se mostrarem destacadas, ao serem observadas em microscópio

invertido, as células foram ressuspensas em 2ml de meio M10, acrescentado o meio

de cultura na proporção adequada e as alíquotas foram plaqueadas em novas

garrafas e cultivadas nas mesmas condições iniciais.

Para o armazenamento as células foram colocadas em criotubos contendo

meio M10 acrescido de 10% DMSO (dimetilsulfóxido) na concentração de 2 x

104céls/mL, congeladas e mantidas em tanque de nitrogênio líquido a -192°C.

3.3 Cultivo de células humanas HEK 293T

As células epiteliais humanas da linhagem HEK 293T (Human Embryonic

Kidney), obtidas da ATCC (número CRL-11268™), foram transformadas pelo

adenovírus humano tipo 5 e carregam uma cópia do gene que codifica o antígeno

"large T" do SV40 (Simian vírus 40) integrado ao genoma. As HEK 293T foram

plaqueadas, cultivadas, subcultivadas e armazenadas nas mesmas condições

descritas anteriormente para as células da linhagem HEK 293, porém, utilizando o

meio de cultura D10, composto pelo meio de cultura DMEM (Dulbecco Modified

Eagle Medium, Cultilab) suplementado com 10% de SBF.

22

3.4 Transfecção e produção das proteínas recombinantes

Para a transfecção e expressão das proteínas L1 e L2 do capsídeo do

HPV16, células HEK 293 e HEK 293T na proporção de 2 x 104 células/ml foram

plaqueadas em meio M10 e D10, respectivamente, sem antibióticos e cultivadas nas

mesmas condições descritas anteriormente até atingirem 50 a 80% de confluência,

para serem transfectadas com os vetores para a expressão das proteínas L1 ou L2,

utilizando um kit de transfecção transiente por lipofecção (GeneJuice® Transfection

Reagent Kit, EMD Biosciences/Merk, Darmstadt, DE) de acordo com as orientações

do fabricante. Em um tubo tipo Falcon estéril foram adicionados meio MEM, para

células HEK 293, e DMEM, para HEK 293T, isentos de soro, antibiótico e

antimicótico na concentração de 550μl para cada 10ml e o reagente de transfecção

na concentração de 16,5μl para cada 10ml, misturados em vórtex por 30 segundos e

incubados por 5min a temperatura ambiente. Em seguida foi adicionado o DNA

plasmideal previamente extraído e purificado, na concentração de 5,5μg para cada

10ml, homogeneizado e incubado por 15min a temperatura ambiente. Esta mistura

foi adicionada às células, completando cada garrafa com 10ml do meio de cultura

correspondente e incubando por 4h. Após esse período, o meio de transfecção foi

trocado pelo meio M10 e D10 completos dando continuidade ao cultivo para que as

células expressassem as proteínas de interesse.

Para os ensaios de microscopia confocal, citometria de fluxo, microscopia

eletrônica de transmissão e western blotting foram utilizados os mesmos anticorpos

primários. Para a detecção da proteína L1 foi utilizado o anticorpo monoclonal anti-

HPV16 L1 (BD Pharmingen®, San Diego, CA, USA), produzido em camundongos.

Para detectar a L2 foi utilizado o anticorpo policlonal produzido em coelhos anti-

HPV16 L2 (cedido pelo Prof. Dr. Richard B. S. Roden, da Johns Hopkins University

School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

A microscopia confocal e a citometria de fluxo foram utilizadas para a

realização da cinética de expressão proteica, a fim de monitorar a expressão das

proteínas heterólogas L1 e L2 e estabelecer o melhor momento pós-transfecção

para a coleta das células e posterior purificação. Foram analisados os tempos zero,

12, 24, 36 e 48h pós-transfecção. O western blotting foi utilizado para confirmação

da expressão proteica e a microscopia eletrônica para análise morfológica de ambas

as linhagens celulares.

23

3.5 Microscopia confocal a laser

As análises qualitativas da cinética de expressão proteica das proteínas L1 e

L2 foram realizadas em microscopia confocal a laser nos tempos zero, 12, 24, 36 e

48h pós-transfecção. O método descrito a seguir foi estabelecido em trabalhos

anteriores (Cianciarullo et al., 2007, 2009, 2010; Marigliani et al., 2012).

As células foram cultivadas sobre lamínulas de vidro redondas de 13 mm de

diâmetro pré-tratadas com poli-L-lisina (Poly-L-lysine solution, Sigma-Aldrich®) em

placas de cultura (TPP®) de 12 poços sob as mesmas condições de cultivo citado

anteriormente em garrafas plásticas, transfectadas após atingirem de 50 a 80% de

confluência. Nos tempos pré-estabelecidos, as células foram lavadas três vezes com

1ml de PBS cada, fixadas com paraformaldeído a 2% em PBS a 4°C por 1h, lavadas

novamente com PBS e armazenadas a 4°C, por no máximo uma semana, até o

momento da imunomarcação. Para a imunofluorescência, as lamínulas foram

incubadas com PBS contendo 5% de BSA (albumina sérica bovina, Sigma-Aldrich®,

Saint Louis, Missouri, USA) por 1h em câmara úmida para bloqueio dos sítios

inespecíficos, em seguida, foram lavadas três vezes com PBS por 5min cada

lavagem e incubadas com o anticorpo primário específico anti-HPV16 L1 ou anti-

HPV16 L2 diluídos na concentração de 1:250 (anti-L1) e 1:50 (anti-L2) em PBS

contendo 0,5% BSA e 0,05% Tween 20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate,

Sigma-Aldrich®) por 1h a temperatura ambiente e em câmara úmida. Após serem

lavadas com PBS contendo 1% de BSA, as células foram incubadas por 1h com o

anticorpo secundário AlexaFluor® 488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes®,

Invitrogen™, Carlsbad, Califórnia, USA) para detecção da L1 ou AlexaFluor® 633

goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes®) para detecção da L2, ambos na

concentração de 1:250, diluídos em PBS contendo 1,5% de BSA e 0,01% de Tween

20. Após a incubação as células foram lavadas três vezes com PBS contendo 1% de

BSA por 10min, seguida de lavagem com PBS; a lamínula de vidro foi colocada

sobre uma gota de 3 μl do meio de montagem anti-fading Mowiol contendo PI (iodeto

de propídio) na proporção de 1:100 para marcação dos ácidos nucleicos. O material

foi mantido protegido da luz a 4°C até o momento da análise em microscópio

confocal a laser (Zeiss LSM 510 Meta laser scanning microscope, com o software

LSM 5 Image) utilizando objetiva C-Apocromática 63x/1.4 óleo.

24

Para a confirmação dos dados obtidos por microscopia confocal, monitoramos

a cinética da expressão proteica das proteínas L1 e L2 utilizando a citometria de

fluxo nos mesmos tempos pós-transfecção, conforme descrito no próximo item.

3.6 Citometria de fluxo

A análise quantitativa foi realizada por citometria de fluxo, as células

transfectadas com o vetor para expressão da L1 ou L2 foram lavadas com PBS,

destacadas com tripsina, ressuspensas em 2ml de meio M10 ou D10, centrifugadas

a 800rpm, lavadas com PBS, incubadas por 30min em Triton X-100 0,1% a

temperatura ambiente e lavadas novamente com PBS. Em seguida, as células foram

incubadas em PBS contendo 3% de BSA e 0,05% de Tween 20 por 30min,

centrifugadas a 800rpm por 5min, lavadas três vezes com PBS centrifugando a cada

lavagem na rotação citada anteriormente, e incubadas com os anticorpos primários

anti-HPV16 L1 ou anti-HPV16 L2 na concentração de 1:250 (anti-L1) e 1:50 (anti-L2)

diluídos em PBS contendo 3% de BSA por 1h a temperatura ambiente, agitando

eventualmente. Após a ligação do anticorpo primário, as células foram lavadas com

PBS acrescido de 1% de BSA, incubadas com o anticorpo secundário AlexaFluor®

488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes®) para L1 e AlexaFluor® 633 goat anti-

rabbit IgG (Molecular Probes®) para L2, ambos na concentração de 1:250 diluído

em PBS contendo 3% de BSA por 1h, lavadas novamente em solução de PBS

acrescida de 1% de BSA e analisadas utilizando o citômetro de fluxo BD

FACSCanto™ II. Os dados foram analisados pelo software BD FACS Diva.

3.7 SDS-PAGE

Para o SDS-PAGE (Sodium Duodecyl Sulfate PolyAcrilamide Gel

Electrophoresis) células não transfectadas e transfectadas tiveram suas proteínas

separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% utilizando dodecil sulfato

de sódio (SDS-PAGE 12%) sob condições desnaturantes. Estas amostras foram

diluídas em tampão SDS-PAGE (10:1), fervidas por 5min e depositadas nos poços

do gel. A corrida eletroforética foi realizada por 40min em temperatura ambiente, os

géis foram corados com coomassie blue ou tiveram as amostras transferidas para

membranas de nitrocelulose, descrito a seguir.

25

3.8 Western blotting

Para o western blotting as amostras contidas no gel foram eletrotransferidas

para uma membrana de nitrocelulose (Trans-Blot Transfer Membrane 0,45μm,

BioRad, Benicia, California, USA) em cuba de transferência (Trans-Blot SD, Semi-

DryTransferCell, Biorad, USA) contendo tampão de transferência (glicina 250mM,

SDS 1% e metanol 20% em tampão Tris-HCL 25mM, pH 8,3) sob amperagem

constante de 400 mA “overnight” a 4ºC. As membranas foram coradas com solução

Ponceau (0,5% de Ponceau e 1% de ácido acético) a fim de confirmar a

transferência das proteínas e marcar o padrão de peso molecular (BenchMarkTM

ProteinLader, Invitrogen™). Posteriormente, foram bloqueadas utilizando PBS-T

(PBS contendo Tween 20 a 0,05%) acrescido de 5% de leite desnatado por 1h sob

agitação, lavadas duas vezes com PBS contendo Tween 20 a 0,1% por 10min cada,

incubadas com os anticorpos primários anti-L1 e anti-L2, citados anteriormente (4.5),

diluídos nas proporções de 1:250 (L1) e 1:50 (L2) em PBS-T contendo 5% de leite

desnatado por 1h a temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram

lavadas três vezes com PBS-T por 10 minutos cada sob agitação e incubadas por 1h

com os anticorpos secundários anti-mouse e anti-rabbit IgG conjugados com

peroxidase, diluídos na proporção de 1:500 em PBS-T contendo 5% de leite

desnatado. Após a incubação com os anticorpos secundários, as membranas foram

novamente lavadas três vezes por 10min cada e as proteínas L1 e L2 foram

detectadas por quimioluminescência utilizando o kit Novex® ECL HRP

Chemiluminescent Substrate Reagent Kit (Invitrogen). As membranas foram

expostas ao filme Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare, Hatfield,

Hertfordshire, UK), que foi revelado e fixado (Revelador e Fixador Dental Kodak). O

filme foi lavado, seco e digitalizado utilizando o scanner HP Scanjet G4050 e o

software HP Photosmart Premier.

3.9 Microscopia eletrônica de transmissão

As células HEK 293 e HEK 293T não transfectadas, transfectadas e

cotransfectadas foram cultivadas para análise morfológica em microscopia eletrônica

de transmissão, conforme descrito em trabalhos anteriores (Cianciarullo et al., 2007,

2009, 2010; Marigliani et al., 2012). O cultivo das células ocorreu sob as mesmas

26

condições descritas anteriormente até atingir confluência de 50 a 80%, quando

foram lavadas com PBS, tripsinizadas, coletadas em tubos tipo Falcon e

centrifugadas a 800 rpm por 5min.

3.9.1 Imunocitoquímica ultraestrutural

Para a imunocitoquímica ultraestrutural foi realizado o protocolo especial para

processamento das células, conforme descrito a seguir. O precipitado celular obtido

anteriormente (3.9) foi lavado três vezes em PBS para remoção de resíduos de meio

de cultura e uma vez em tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,3. As células foram

fixadas em solução contendo tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,3 acrescidos de

3,5% de sacarose, 4% de paraformaldeído e 1% de glutaraldeído, incubadas por 2h

a temperatura ambiente sob agitação ocasional a cada 30 min. Em seguida, as

células foram lavadas duas vezes com solução tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,3

acrescida de 3,5% de sacarose por 30min cada e duas vezes com PBS por 10min.

As células passaram por desidratação utilizando etanol nas concentrações de 50%,

70% e 80% por 15min cada incubação. A pré-embebição foi feita em resina acrílica

LR White (LR White resin, Electron Microscopy Sciences, Hatfiedl, PA, USA) e álcool

70% na proporção de 2:1 e a embebição, em resina LR White a 100% por 1h cada.

A resina foi trocada por resina 100% e incubada “overnight” a 4°C, emblocada em

cápsulas de gelatina preenchidas com nova resina e polimerizadas a 60°C por 48h.

Para a troca da resina foram realizadas centrifugações a 2000 rpm por 10min. Os

blocos foram cortados utilizando um ultramicrótomo e os cortes ultrafinos foram

montados sobre grades metálicas de níquel pré-revestidas com parlódio a 2% em

acetato de amila e carbono.

3.9.2 Imunomarcação

Para a imunomarcação as grades contendo os cortes celulares foram

incubadas com PBS contendo 5% de BSA por 1h em câmara úmida para bloqueio

dos sítios inespecíficos, em seguida, lavadas três vezes com PBS por 5min cada e

incubadas com os mesmos anticorpos primários anti-L1 e anti-L2 citados

anteriormente (3.5), diluídos em PBS contendo 0,5% BSA e 0,05% Tween 20, por 1h

a temperatura ambiente e lavadas três vezes com PBS contendo 1% de BSA por 10

27

minutos cada. Os cortes foram incubados com os anticorpos secundários

conjugados com partículas de ouro coloidal (Sigma-Aldrich®) de 10nm para L1 e de

5nm para L2, diluídos em PBS contendo 1,5% de BSA e 0,01% de Tween por 1h.

Em seguida foram lavados uma vez com PBS contendo BSA a 1%, solução salina a

0,85% e água bidestilada, as três lavagens com duração de 10min. Para

contrastação de ácidos nucleicos as grades foram incubadas 5min em acetato de

uranila aquoso a 2%.

3.9.3 Captura de imagens

A captura de imagens dos cortes ultrafinos das células não transfectadas foi

realizada utilizando o microscópio MET Zeiss EM 109 operado a 80 kV, obtidas em

filmes fotográficos, os quais foram revelados quimicamente em câmara escura. O

filme foi enrolado em espiral, submerso em solução reveladora D-19 diluída na

proporção 1:1 em água destilada e incubado por 2min sob suave agitação. Em

seguida, lavado em água corrente e submerso em solução fixadora F-5 por 15min

sob suave e constante agitação. O filme foi removido do espiral e mergulhado em

água corrente por 30 minutos. Após secagem em temperatura ambiente os

negativos foram cortados e armazenados em envelopes para futura digitalização

utilizando scanner HP Scanjet G4050 e software HP Photosmart Premier.

As amostras imunomarcadas com os anticorpos citados anteriormente (3.5)

foram analisadas utilizando o microscópio eletrônico de transmissão LEO 906 E da

Zeiss através do software Olympus Soft Imaging Solutions GmbH.

3.9.4 Armazenamento e análise de VLPs não purificadas

As células HEK 293 e HEK 293T transfectadas foram coletadas

respectivamente 36h e 12h após a transfecção, lavadas três vezes com PBS,

tripsinizadas e centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos. O precipitado foi

ressuspenso em PBS, lisado utilizando 5 ciclos de agitação em vórtex e incubação

em gelo por 1min cada. Ao lisado celular foi adicionado um coquetel inibidor de

protease Sigma FASTTM Protease Inhibitor Tablets (Sigma-Aldrich®) na

concentração indicada pelo fabricante, seguido de centrifugação a 2000 rpm por 10

min e armazenamento a -20°C para posterior purificação.

28

Para a análise das amostras, 10μl de suspensão contendo VLPs foram

adicionadas sobre grades metálicas de níquel revestidas com parlódio a 2% em

acetato de amila e carbono, durante 1min para a deposição das partículas. O

excesso foi removido com papel de filtro e foi adicionada uma gota de 10μl de

silicotungstato de sódio a 1% em solução aquosa para a contrastação negativa das

VLPs. Após 1min o excesso do contrastante foi removido com papel de filtro e as

grades foram secas em temperatura ambiente até o exame em microscópio

eletrônico de transmissão Zeiss EM 109, operado em 80 kV (Cianciarullo et al.,

2007, 2009, 2010).

4. RESULTADOS

4.1 Cinética de expressão das proteínas

4.1.1 Microscopia confocal a laser

As análises qualitativas da cinética de expressão proteica da proteína L1 de

HPV16 em células HEK 293 demonstrou que o momento de maior expressão desta

proteína ocorre 36h após a transfecção das células. Para a linhagem HEK 293T, o

tempo de 12h pós-transfecção demonstrou-se o de maior expressão para a proteína

L1, conforme apresentado na Figura 5.

29

Figura 5 - Microscopia confocal. Cinética de expressão da proteína L1 do capsídeo do HPV16 em células HEK 293 (linha 1) e HEK 293T (linha 2). Tempos zero (a), 12h (b), 24h (c), 36h (d) e 48h (e) pós-transfecção; proteína L1 em verde e núcleo celular em vermelho. Barra: 5µm (b, 2d e 2e) e 10µm (a, c, 1d e 1e). Aumento: objetiva C-apocromática 63x/1.4 óleo.

O resultado da cinética de expressão para a proteína L2 demonstrou-se o

mesmo encontrado para a proteína L1 em ambas as linhagens celulares,

apresentando o tempo de 36h para HEK 293 e 12h para HEK 293T como o de maior

expressão proteica, demonstrado na Figura 6.

Figura 6 - Microscopia confocal. Cinética de expressão da proteína L2 do capsídeo do HPV16 em células HEK 293 (linha 1) e HEK 293T (linha 2). Tempos zero (a), 12h (b), 24h (c), 36h (d) e 48h (e) pós-transfecção; proteína L2 em verde e núcleo celular em vermelho. Barra: 10µm. Aumento: objetiva C-apocromática 63x/1.4 óleo.

30

4.1.2 Citometria de fluxo

A análise quantitativa realizada através da citometria de fluxo confirmou os

resultados obtidos anteriormente, onde detectamos aproximadamente 80% das

células HEK 293 expressando a proteína L1, 36h após a transfecção e cerca de 77%

de células HEK 293T expressando a mesma proteína em 12h (Figura 7).

Figura 7 - Cinética de expressão da proteína L1 de HPV16 analisada por citometria de fluxo.

4.2 SDS-PAGE e Western blot

A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferência das

proteínas para membranas de nitrocelulose (western blot) auxiliaram na confirmação

da expressão das proteínas L1 e L2 em lisado de células HEK 293 e HEK 293T

transfectadas e cotransfectadas, que podem ser observadas nas Figuras 8 e 9. A

transferência das proteínas obtidas no SDS-PAGE para membranas de nitrocelulose

e marcação das mesmas com anticorpos específicos, caracterizando o western blot,

pode-se confirmar a transfecção celular e expressão das proteínas L1 e L2 em

lisados das linhagens HEK 293 e HEK 293T. Utilizamos ambas as linhagens não

transfectadas como controle negativo das amostras.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

0 12 24 36 48

% d

e c

élu

las

ex

pre

ss

an

do

L1

Tempo pós-transfecção (horas)

Cinética de expressão da proteína L1 de HPV16

HEK 293

HEK 293T

31

Figura 8 - Western blot. Lisado de células HEK 293 transfectadas com o vetor para a expressão da proteína L1 (293L1); lisado de células HEK 293 não transfectadas (HEK 293); marcador de peso molecular (MM).

Figura 9 – Marcador de peso molecular (MM); lisado de células HEK 293 transfectadas com o vetor para a expressão da proteína L1, marcada com anti-L1 (293L1); HEK293 transfectadas com o vetor para a expressão da proteína L2, marcada com anti-L2 (293L2); HEK 293 transfectadas com os vetores para a expressão das proteínas L1 e L2, marcados com ambos os anticorpos (L1L2); lisado de células HEK 293T transfectadas com ambos os vetores de expressão, marcadas com anti-L2 (HEK 293T L1L2).

32

4.3 Microscopia eletrônica de transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para observação da

morfologia normal das células HEK 293 e HEK 293T não transfectadas. Realizamos

o protocolo convencional para microscopia eletrônica de transmissão (MET), onde

foi possível observar regiões de núcleo e citoplasma das células analisadas. Na

região nuclear pode-se observar a eucromatina, porção de cromatina mais frouxa; a

heterocromatina, região mais condensada de DNA; nucléolo, além de membrana

nuclear íntegra. No citoplasma, encontramos membranas citoplasmáticas bem

delimitadas em ambas as linhagens celulares, com projeções para o aumento da

superfície de contato com o meio externo; organelas em abundância incluindo um

grande número de ribossomos, indicando que as células se encontram em constante

atividade de tradução de RNAs mensageiros e síntese proteica, mitocôndrias,

retículo endoplasmático, lisossomos, complexo de Golgi e vacúolos digestivos

resultantes do processo de catabolismo celular para eliminação ao meio extracelular

(Figura 10).

Figura 10 - Célula HEK 293 não transfectada em processamento convencional para análise em MET; contrastação com acetato de uranila e citrato de chumbo. Núcleo (N), mitocôndria (m), retículo endoplasmático (re). Barra: 2µm. Aumento original: 4.000x.

33

Figura 11 - Células HEK 293 processadas através de protocolo especial para imunocitoquímica ultraestrutural. (A) célula transfectada com o gene da proteína L1 e (B) célula cotransfectada com os genes das proteínas L1 e L2, imunomarcadas com anticorpos anti-L1 (10nm) e anti-L2 (5nm) no núcleo (N) e no citoplasma. As setas indicam algumas reações. Barra: 0,2µm. Aumento original: 60.000x.

34

5. DISCUSSÃO

Atualmente, a linhagem celular epitelial humana HEK 293 e suas derivadas

são utilizadas na indústria para a produção de proteínas terapêuticas, devido à

facilidade de cultivo e da resposta eficiente à transfecção. Realizamos uma cinética

de expressão das proteínas L1 e L2 do HPV16 utilizando as linhagens HEK 293 e

HEK 293T e métodos qualitativos e quantitativos, com a finalidade de determinar o

momento de maior expressão das proteínas do capsídeo viral. Ambas as linhagens

apresentaram sincronia na expressão das proteínas L1 e L2. As análises realizadas

por microscopia confocal demonstraram que 36h após a transfecção da cultura de

células humanas HEK 293, com os vetores pUF3L1h ou pUF3L2h, ocorre o pico

máximo de expressão tanto da proteína L1, quanto da L2. Esses dados foram

confirmados com a utilização da citometria de fluxo, que detectou a expressão da

proteína L1 em aproximadamente 80% das células contidas na amostra, em um

período de 24 a 48h após a transfecção. Utilizando os dois métodos de análise

mencionados, realizamos a leitura das amostras com as células HEK 293T e

encontramos o nível máximo de expressão registrado 12h após a transfecção,

alcançando o percentual de 77% das células expressando a proteína L1 do capsídeo

viral. Ainda analisando os resultados da citometria de fluxo para as células HEK

293T, pode-se observar um declíneo progessivo nos níveis de expressão da

proteína L1 do HPV16, sugerindo esgotamento celular causado pela inserção do

antígeno T do vírus símio 40 (SV40) no genoma desta linhagem com a finalidade de

aumentar a transfectabilidade da célula. Com o western blot foi possível confirmar a

presença das proteínas L1 e L2 do HPV16 em culturas de células humanas. A

proteína L1 demonstrou mobilidade eletroforética de, aproximadamente, 55 kDa,

manifestando-se de acordo com resultados encontrados em estudos anteriores

(Cianciarullo, et al., 2010). A proteína L2 revelou mobilidade eletroforética com cerca

de 100 kDa. A microscopia eletrônica de transmissão convencional demonstrou a

semelhança morfológica entre ambas linhagens e através da imunocitoquímica

ultraestrutural, a distribuição intracelular das proteínas L1 e L1L2 nas células

transfectadas e cotransfectadas, respectivamente. Observou-se a marcação dessas

proteínas com partículas de ouro coloidal de diferentes tamanhos dispersas no

núcleo e citoplasma e, ocasionalmente, formando agregados que sugerem a

formação de VLPs compostas de ambas às proteínas estruturais do capsídeo viral.

35

6. CONCLUSÃO

A análise comparativa entre as linhagens celulares HEK 293 e HEK 293T

demonstrou que a célula HEK 293 apresenta expressão prolongada da proteína L1

do HPV16, durante o período de 24 a 48h após a transfecção, com um número mais

elevado de células expressando a proteína de interesse. Embora a linhagem HEK

293T inicie a expressão proteica em 12h após a transfecção, enquanto que a

linhagem HEK 293 apenas após 24h, a inserção do antígeno T do SV40 na linhagem

HEK 293T, além de induzir esgotamento celular, também não é recomendado por

órgãos competentes para a produção de proteínas com a finalidade de uso em

humanos, sendo duplamente desnecessário para o cumprimento de nossos

objetivos futuros. Essa descoberta contribuiu para a seleção da linhagem celular

HEK 293 para a realização das próximas etapas deste estudo, incluindo a

purificação de VLPs constituídas de ambas as proteínas estruturais, que podem

representar candidatas potenciais para a formulação de uma vacina de segunda

geração, de amplo espectro de proteção contra os diversos tipos de HPV.

36

7. REFERÊNCIAS

AIRES, K. A.; CIANCIARULLO, A. M.; CARNEIRO, S. M.; VILLA, L .L.; BOCCARDO, E.; PÉREZ-MARTINEZ, G.; PÉREZ-ARELLANO, I.; OLIVEIRA, M. L. S.; HO, P. L. Production of HPV-16 L1 virus-like particles by recombinant Lactobacillus casei. Appl. Environ. Microbiol., v. 72, p. 745-752, 2006. ANDRADE, F. B. Alvos celulares das oncoproteínas virais E6 e E7 do papilomavírus humano. Monografia. Programa de Aprimoramento Profissional – PAP-SES-IBU, v. 1, p. 1-57, 2009. Disponível em: http://ses.sp.bvs.br/lilabi/docsonline/get.php?.id=1386. ASHRAFI G. H, HAGHSHENAS, M. R.; MARCHETTI, B.; O’BRIEN, P. M.; CAMPO, M. S. E5 protein of human papillomavirus type 16 selectively downregulates surface HLA class I. Int. J. Cancer, v. 113, p. 276–283, 2005. ARIMA, Y.; WINER, R. L.; FENG, Q.; HUGHES, J. P.; LEE, S.; STERN, M. E.; REILLY, S. F. O.; KOUTSKY, L. A. Development of Genital Warts after Incident Detection of Human Papillomavirus Infection in Young Men. J. Infect. Dis., v. 202, n. 8, p. 1181-1184, 2010. ARMBRUSTER-MORAES, E.; IOSHIMOTO, L. M.; LEÃO, E.; ZUGAIB, M. Presence of human papillomavirus DNA in amniotic fluids of pregnant women with cervical lesions. Gynecol. Oncol., v. 54, p. 152–158, 1994. BAKER, C. C.; PHELPS, W. C.; LINDGREN, L.; BRAUN, M. J.; GONDA, M. A.; HOWLEY, P. M. Structural and transcriptional analysis of human papillomavirus type 16 sequences in cervical carcinoma cell lines. J. Virol., v. 61, p. 962-971, 1987. BAKER, T. S.; NEWCOMB, W. W.; OLSON, N. H.; COWSERT, L. M.; OLSON, C.; BROWN, J. C. Structures of bovine and human papillomaviruses. Biophys. J., v. 60, p. 1445-1456, 1991. BANDYOPADHYAY, S.; CHATTERJEE, R. HPV viral load determination during pregnancy as a possible cervical cancer risk. J. Exp. Clin. Cancer Res., v. 25, p. 29-38, 2006. BAUER, H. M.; HILDESHEIM, A. SCHIFFMAN, M. H., GLASS, A. G., RUSH, B. B.; SCOTT, D. R.; CADELL, D. M.; KURMAN, R. J.; MANOS, M. M. Determinants of genital human papillomavirus infection in low-risk women in Portland, Oregon. Sex. Transm. Dis., v. 20, p. 274-278, 1993. BAXEVANIS, C. N. et al.,Combinatorial treatments including vaccines, chemotherapy and monoclonal antibodies for cancer therapy. Cancer Immunol. Immunother. 2009, v. 58, p. 317-324. BAZAN, S. B. CHAVES, A. A. M.; AIRES, K. A.; CIANCIARULLO, A. M.; GARCEA, R. L.; HO, P. L. Expression and characterization of HPV-16 L1 capsid protein in Pichia pastoris Arch. Virol., in press, 2009. BELNAP, D. M.; OLSON, N. H.; CLADEL, N. M.; NEWCOMB, W. W.; BROWN, J. C.; KREIDER, J. W.; CHRISTENSEN, N. D.; BAKER, T. Conserved features in papillomavirus and polyomavirus capsids. J. Mol. Biol., v. 259, p. 249-263, 1996. BERNARD, H. U.; BURK, R. D.; CHEN, Z.; DOORSLAER, K. V.; ZUR HAUSEN, H.; VILLIERS, E. M. Classification of Papillomaviruses (PVs) Based on 189 PV Types and Proposal of Taxonomic Amendments. Virology, v. 401, n, 1 p. 70-79, 2010. BIBANCOS, M.; CERQUEIRA, O. L. D.; SZULCZEWSKI, V.; CIANCIARULLO, A. M.; FERREIRA, L. C. S. Construção de vacinas de DNA capazes de expressar a oncoproteína E7 do vírus papilomavírus humano tipo 16 geneticamente fusionado a flagelina FlicD de Salmonella entérica sv. Muenchen. In: SEMINÁRIO LATINO-AMERICANO DE TECNOLOGIA DE CULTIVO CELULARES, 2., 2006a, São Paulo. Prog. e Res. II SLATCC, São Paulo: IPT, 2006a, p. 89. BIBANCOS, M.; PORCHIA, B. F. M. M.; CERQUEIRA, O. L. D.; SZULCZEWSKI, V.; CIANCIARULLO, A. M.; FERREIRA, L. C. S. Purificação-expressão de uma subunidade da oncoproteína E7 do vírus papiloma humano tipo 16 (HPV-16) e produção de anticorpos policlonais específicos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE GENÉTICA, 52; CONGRESSO DA ASSOCIAÇÃO LATINO-AMERICANA DE GENÉTICA, 12., 2006b, Foz do Iguaçu. Anais do 52° Congresso Brasileiro de Genética. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2006b. p. 817. Boletim Brasileiro de Avaliação de Tecnologias em Saúde - BRATS. Câncer de colo de útero: a vacina para prevenção do HPV e o desafio para a melhoria da qualidade do rastreamento no Brasil, ano VI, n. 17, 2011. Disponível em: http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/4bbac7804a14f133a713afaa19e2217c/BRATS17.pdf?MOD=AJPERES. Acesso em 5 fev 2013. BOULET, G.; HORVATH, C.; VANDEN BROECK, D.; SAHEBALI, S.; BOGERS, J. Human papillomavirus: E6 and E7 oncogenes. Int. J. Biochem. Cell Biol., v. 39, p. 2006-2011, 2007. BOSCH, F. X.; MANOS M. M.; MUNOZ N.; SHERMAN M.; JANSEN A. M.; PETO J.; SHIFFMAN M.H.; MORENO V.; KURMAN R.; SHAH K. V. Prevalence of Human Papillomavirus in Cervical Cancer: a Worldwide Perspective. Journal of the National Cancer Institute, 87, p. 796-802, 1995. BOSH, F. X.; LORINCZ, A.; MUÑOZ, N.; MEIJER, C. J. L. M.; SHAH, K. V. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathol., v. 55, p. 244-265, 2002.

37

BOUSARGHIN, L.; TOUZÉ, A.; COMBITA-ROJAS, A. L.; COURSAGET, P. Positively charged sequences of human papillomavirus type 16 capsid proteins are sufficient to mediate gene transfer into target cells via the heparan sulfate receptor. J. Gen. Virol., v. 84, p. 157-164, 2003. BRUNI, L.; DIAZ, M.; CASTELLSAGUE, X.; FERRER, E.; BOSCH, F. X.; SANJOSÉ, S. Cervical Human Papillomavirus Prevalence in 5 Continents: Meta-Analysis of 1 Million Women with Normal Cytological Findings. The Journal of Infectious Diseases, v. 202, n. 12, p. 1789-1799, 2010. BUCK, C. B.; CHENG, N.; THOMPSON, C. D.; LOWY, D. R.; STEVEN, A. C.; SCHILLER, J. T.; TRUS, B. L. Arrangement of L2 within the papillomavirus capsid. J. Virol., v. 82, p. 5190-5197, 2008. BURD, EM. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clin. Microbiol. Rev., v. 16, p.1-17, 2003. CANALI, R. A.; OLIVEIRA, H. B.; MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Production of monoclonal antibodies and analysis of their interaction with HPV16 proteins. 28

th

International Papillomavirus Conference – San Juan, Puerto Rico, 2012. CANALI, R. A.; OLIVEIRA, H. B.; MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Production of monoclonal antibodies and analysis of their interaction with HPV16 proteins. 4º Congresso Brasileiro de Biotecnologia – Guarujá, São Paulo, 2012. CANALI, R. A.; OLIVEIRA, H. B.; MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Production of monoclonal antibodies and analysis of their interaction with HPV16 proteins. XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan – São Paulo, São Paulo, 2012. CHANDRACHUD, L. M.; GRINDLAY, G. J.; MCGARVIE, G. M. ; O’NEIL, B. W. ; WAGNER, E. R. ; JARRETT, W. F. ; CAMPO, M. S. Vaccination of cattle with the N-terminus of L2 is necessary and sufficient for preventing infection by bovine papillomavirus-4. Virology, v. 211, p. 204-208, 1995. CHEN, X. S.; GARCEA, R. L.; GOLDBERG, I.; CASINI, G.; HARRISON S. C. Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell., v. 5, p. 557-567, 2000. CHRISTENSEN, N. D., KREIDER, J. W.; DIANGELO, S. L. The open reading frame L2 of cottontail rabbit papillomavirus contains antibody-inducing neutralizing epitopes. Virology, v. 181, p. 572-579, 1991. CHRISTENSEN, N. D.; DILLNER, J.; EKLUND, C.; CARTER, J. J.; WIPF, G. C.; REED, C. A.; CLADEL, N. M.; GALLOWAY, D. A. Surface conformational and linear epitopes on HPV-16 and HPV-18 L1 Virus-like particles as defined by monoclonal antibodies. Virology, v. 223, p. 174-184, 1996. CIANCIARULLO, A. M.; SZULCZEWSKI, V.; AIRES, K. A.; BAZAN, S. B.; HO, P. L.; BOCCARDO, E.; VILLA, L. L.; MÜLLER, M.; ARMBRUSTER-MORAES, E. Production of HPV 16 L1 VLP in human cell culture for basic estudies anogenital cancer. In: SÃO PAULO RESEARCH CONFERENCES – CANCER 2007: FROM MOLECULAR BIOLOGY TO TREATMENT, 8., São Paulo. Appl. Cancer Res. São Paulo: Applied Cancer Research, 2007. p. 81-82. CIANCIARULLO, A. M.; SZULCZEWSKI, V.; AIRES, K. A.; BAZAN, S. B.; HO, P. L.; BOCCARDO, E.; VILLA, L. L.; MÜLLER, M.; ARMBRUSTER-MORAES, E. HPV16 L1 gene expression, proteins synthesis and interaction in human cell culture. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À MEDICINA, 9.,2008, São Paulo. Anais do IX Simp Nac Biol Mol Aplic Med. São Paulo: Sociedade Brasileira de Genética, 2008. p. 30. CIANCIARULLO, A.M.; SZULCZEWSKI, V.; CHAVES, A.A.M.; HO, P.L.; MÜLLER, M.; ARMBRUSTER-MORAES, E. HPV 16L1L2 gene expressions, protein syntesis and interaction in human cell culture. Acta Microscopica, v. 18 (Suppl. C), p.661-662, 2009. Available at http://www.actamicroscopica.ivic.gob.ve CIANCIARULLO, A. M.; SZULCZEWSKI, V.; CHAVES, A. A. M.; BAZAN, S. B.; AIRES, K. A.; MÜLLER, M.; ARMBRUSTER-MORAES, E. Production of HPV16 L1L2 VLPs in cultures of human epithelial cells. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education, Formatex Research Center, v. 2, p. 1073-1082, 2010. Available at http://www.formatex.info/microscopy4/1073-1082.pdf CID-ARREGUI, A.; JUÁREZ, V.; ZUR HAUSEN, H. A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies. J. Virol., v. 77, p. 4928-4937, 2003. CRIPE, T. P.; HAUGEN, T. H.; TURK, J. P.; TABATABAI, F.; SCHMID, P. G. 3

RD, DÜRST, M.; GISSMANN, L.; ROMAN, A.;

TUREK, L. P. Transcriptional regulation of the human papillomavirus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer, and by viral E2 trans-activator and repressor gene products: implications for cervical carcinogenesis. EMBO J., v. 6, p. 3745-3753, 1987. CULP, T. D.; CHRISTENSEN, N. D. Kinetics of in vitro adsorption and entry of papillomavirus virions. Virology, v. 319, p. 152-161, 2004. CUTTS, F. T.; FRANCESCHI, S.; GOLDIE S.; CASTELLSAGUE, X.; DE SANJOSE, S.; GARNETT, G.; EDMUNDS, W. J.; CLAEYS, P.; GOLDENTHAL, K. L.; HARPER, D. M.; MARKOWITZ, L. Human papillomavirus and HPV vaccines: a review. Bull World Health Organ., v. 85, p. 719-726, 2007. DA SILVA, D. M.; VELDERS, M. P.; NIELAND, J. D.; SCHILLER, J. T.; NICKOLOFF, B. J.; KAST, W. M. Physical interaction of human papillomavirus virus-like particles with immune cells. Int. Immunol., v. 13, p. 633-641, 2001.

38

DAVID, M. P.; VAN, H. K.; HARDT, K.; TIBALDI, F.; DUBIN, G. et al. Long-term persistence of anti-HPV-16 and -18 antibodies induced by vaccination with the AS04-adjuvanted cervical cancer vaccine: modeling of sustained antibody responses. Gynecol Oncol, v. 115, p. S1-S6, 2009. DE VILLIERS, E. M.; FAUQUET, C.; BROKER, T. R.; BERNARD, H. U.; ZUR HAUSEN, H. Classification of papillomaviruses. Virology, v. 324, p. 17-27, 2004. DONOVAN, B.; FRANKLIN, N.; GUY, R.; GRULICH, A. E.; REGAN, D. G. et al. Quadrivalent human papillomavirus vaccination and trends in genital warts in Australia: analysis of national sentinel surveillance data. Lancet Infect Dis, v. 11, n. 39, p. 39-44, 2010. DRAKESMITH, H.; PRENTICE, A. Viral infection and iron metabolism. Nat. Rev. Microbiol., v. 6, p. 541-552, 2008. EMBERS, M. E.; BUDGEON, L. R.; PICKEL, M. CHRISTENSEN, N. D. Protective immunity to rabbit oral and cutaneous papillomaviruses by immunization with short peptides of L2, the minor capsid protein. J. Virol., v. 76, p. 9798-9805, 2002. FAIRLEY, C. K.; HOCKING, J.S.; GURRIN, L. C.; CHEN, M. Y.; DONOVAN, B.; BRADSHAW, C. S. Rapid decline in presentations of genital warts after the implementation of a national quadrivalent human papillomavirus vaccination program for young women. Sex. Transm. Infect., v. 85, p. 499-502, 2009. FAVRE, M. S.; MAJEWSKI, N. J.; MALEJCZYK, M.; ORTH, G.; JABLONSKA, S. A possible vertical transmission of human papillomavirus genotypes associated with epidermodysplasia verruciformis. J. Investig. Dermatol., v. 111, p. 333-336, 1998. FEDRIZZI, E. N. Epidemiologia da infecção genital pelo HPV. Rev. Bras. Pat. Trato Gen. Inf., v. 1, n. 1, p. 3-8, 2011. FILHO, G. L. A. Infecção pelo Papilomavirus Humano: História, Biologia e Epidemiologia. J. Bras. Doenças Sex. Transm., v.7, p. 11–24, 1995. FLORIN, L.; SAPP, C.; STREECK, R. E.; SAPP, M. Assembly and translocation of papillomavirus capsid proteins. J. Virol., v. 76, p. 10009 – 10014, 2002a. FLORIN, L.; SCHAFER, F.; SOTLAR, K.; STREECK, R. E.; SAPP, M. Reorganization of nuclear domain 10 induced by papillomavirus capsid protein l2. Virology, v. 295, p. 97– 107, 2002b. FOTHERGILL, T.; MCMILLAN, N. A. J. Papillomavirus virus-like particles activate the PI3-kinase pathway via alpha-6 beta-4 integrin upon binding. J. Virol., v. 352, p. 319-328, 2006. FRANCO, E. L.; DUARTE-FRANCO, E.; FERENCZY, A. Cervical cancer: epidemiology, prevention and the role of human papillomavirus infection. CMAJ., v. 164, p. 1017-1025, 2001. FRAZER, I. H.; LEGGATT, G. R.; MATTAROLLO, S. R. Prevention and Treatment of Papillomavirus – Related Cancers Through Immunization. Annu. Rev. Immunol., v. 29, p. 111-138, 2011. GALLOWAY, D. A. Papillomavirus vaccines in clinical trials. Lancet Infect. Dis., v. 3, p. 469-475, 2003. GARLAND, S. M.; SMITH, J. S. Human papillomavirus vaccines: current status and future prospects. Drugs, v. 70, n. 9, p. 1079-1098, 2010. GERSCH, E. D.; GISSMANN, L.; GARCEA, R. L. New approaches to prophylactic human papillomavirus vaccines for cervical cancer prevention. Antiviral Therapy, 2011. GHITTONI, R. et al. The biological properties of E6 and E7 oncoproteins from human papillomaviruses. Virus genes, v. 40, n. 1, p. 1-13, 2010. GIROGLOU, T.; FLORIN, L.; SCHÄFER, F.; STREECK, R. E.; SAPP, M. Human papillomavirus infection requires cell surface heparan sulfate. J. Virol., v. 75, p. 1565-1570, 2001. GNANAMONY, M.; PEEDICAYIL, A.; ABRAHAM, P. An overview human papillomaviruses and current vaccines strategies. Indian J. Med. Microbiol., v. 25, p.10-17, 2007. GOODWIN, E. C.; DIMAIO, D. Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 97, p. 12513-12518, 2000. GRUENBERG, J.; VAN DER GOOT, F. G. Mechanisms of pathogen entry through the endosomal compartments. Nat. Ver. Mol. Cell Biol., v. 7, p. 495-504, 2006. HANAHAN, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmid. J. Mol. Biol., v. 166, p. 557-579, 1983. HARPER, D. M. et al. Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against human papillomavirus types 16 and 18: follow-up from a randomised control trial. Lancet, v. 367, p. 1247-1255, 2006. HEBNER, C. M.; LAIMINS, L. A. Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity. Rev. Med. Virol., v. 16, p. 83–97, 2006. HEILMAN, S. A.; NORDBERG, J. J.; LIU, Y.; SLUDER, G.; CHEN, J. J. Abrogation to the postmitotic checkpoint contributes to polyploidization in HPV E7 expressing cells. J. Virol., 2009. In press.

39

HEMMINKI, K.; DONG, C.; VAITTINEN, P. Second primary cancer after in situ and invasive cervical cancer. Epidemiology, v. 11, p. 457-461, 2000. HERMONAT, P. L.; HAN, L.; WENDEL, P. J.; QUIRK, J. G.; STERN, S.; LOWERY, C. L.; RECHTIN, T. M. Human papillomavirus is more prevalent in first trimester spontaneously aborted products of conception compared to elective specimens. Virus Genes., v. 14, p. 13-17, 1997. HINDMARSH, P. L.; LAIMINS, L. A. Mechanisms regulating expression of the HPV 31 L1 and L2 capsid proteins and pseudovirion entry. J. Virol. , v. 4, p. 1-12, 2007. HO, G. Y., BURK, R. D.; FLEMING, I.; KLEIN, R. S. Risk of genital human papillomavirus infection in women with human immunodeficiency virus-induced immunosuppression. Int. J. Cancer, v. 56, p. 788-792, 1994. HOLMGREN, S. C.; PATTERSON, N. A.; OZBUN, M. A.; LAMBERT, P. F. The minor capsid protein L2 contributes to two steps in the human papillomavirus type 31 life cycle. J. Virol., v. 79, p. 3938–3948, 2005. HOMMA, A.; MARTINS, R. M.; JESSOUROUM, E.; OLIVA, O. Desenvolvimento tecnológico: elo deficiente na inovação tecnológica de vacinas no Brasil. História, Ciências, Saúde - Manguinhos, v. 10, n. 2, p. 671-96, 2003. INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER. Estimativa 2008: INCIDÊNCIA DE CÂNCER NO BRASIL. Rio de Janeiro: INCA, 2007. 96 p. INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER. Estimativa 2012: INCIDÊNCIA DE CÂNCER N O BRASIL. Rio de Janeiro: INCA, 2011. 118p. JAYASINGHE, Y.; GARLAND, S. M. Genital warts in children: what do they mean? Arch. Dis. Child., v. 91, p. 696-700, 2006. JENNINGS, G. T.; BACHMANN, M. F. Immunodrugs: Therapeutic VLP-Based Vaccines for Chronic Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., v. 49, p. 303-326, 2009. JOHNSON, K. M. et al. Role of heparan sulfate in attachment to and infection of the murine female genital tract by human papillomavirus. Journal of virology, v. 83, n. 5, p. 2067-2074, 2009. KARANAM, B.; GAMBHIRA, R.; PENG, S.; JAGU, S.; KIM, D-J.; KETNER G. W.; STERN, P. T.; ADAMS, R. J. RODEN, R. B. S. Vaccination with HPV16 L2E6E7 fusion protein in GPI-0100 adjuvant elicits protective humoral and cell-mediated immunity. Vaccine, v. 27, 1040-1049, 2009 KAWANA, Y.; KAWANA, K.; YOSHIKAWA, H.; TAKETANI, Y.; YOSHIIKE, K.; KANDA, T. Human papillomavirus type 16 minor capsid protein l2 N-terminal region containing a common neutralization epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm. J. Virol., v. 75, p. 2331-2336, 2001. KAVATI, E. A. Interação de oncoproteínas virais E6 e E7 de HPV16/18 com alvos celulares potenciais para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IBU/IPT, v. 1, p. 1-108, 2012a. KAVATI, E. A.; CANALI, R. A.; OLIVEIRA, H. B.; MARIGLIANI, B.; SAKAUCHI, D.; TEIXEIRA, C. F. P.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; CIANCIARULLO, A. M. Intramitochondrial localization of HPV E6 oncoprotein. 28

th International Papillomavirus

Conference – San Juan, Puerto Rico, 2012b. KAVATI, E. A.; CANALI, R. A.; OLIVEIRA, H. B.; MARIGLIANI, B.; SAKAUCHI, D.; TEIXEIRA, C. F. P.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; CIANCIARULLO, A. M. Intramitochondrial localization of HPV E6 oncoprotein. XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan – São Paulo, São Paulo, 2012c. KAVATI, E. A.; PALUMBO A. C. M.; ANDRADE, F. B.; MARIGLIANI, B.; SAKAUCHI, D.; LEÃO, E.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; CIANCIARULLO A. M. Interaction of HPV16L1L2 VLP with stem cells CD34+/CD117+ of the human amniotic fluid. Current microscopy contributions to advances in science and technology, Formatex Research Center, v. 1, p. 617-624, 2012d. Available at: http://www.formatex.info/microscopy5/book/617-624.pdf KIEBACK, E.; MÜLLER, M. Factors influencing subcellular localization of the human papillomavirus L2 minor structural protein. Virology, v. 345, p, 199-208, 2006. KIRNBAUER, R.; BOOY, F.; CHENG, N.; LOWY, D. R.; SCHILLER, J. T. Papillomavirus L1 major capsid protein self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 89, p. 12180-12184, 1992. KUCK, D.; LAU, T.; LEUCHS, B.; KERN, A.; MÜLLER, M.; GISSMANN, L.; KLEINSCHMIDT, J. A. Intranasal vaccination with recombinant adeno-associated virus type 5 against human papillomavirus type 16 L1. J. Virol., v. 80, p. 2621-2630, 2006. LEDER, C.; KLEINSCHMIDT, J. A.; WIETHE, C.; MÜLLER, M. Enhancement of Capsid Gene Expression: Preparing the Human Papillomavirus Type 16 Major Structural Gene L1. J. Virol., v. 75, p. 9201-9209, 2001. LI, H.; QIAN, Z. M. Transferrin/transferrin receptor-mediated drug delivery. Med. Res. Rev., v. 22, p. 225-250, 2002. LU, B.; VISCIDI, R. P.; LEE, J. H. et. al. Human Papillomavirus (HPV) 6, 11, 16 and 18 Seroprevalence Is Associated with Sexual Practice and Age: Results from the Multinational HPV Infection in Men Study (HIM Study). Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v. 20, p. 990-1002, 2011.

40

MACEDO, M. F.; DE SOUSA, M. Transferrin and the transferrin receptor: of magic bullets and other concerns. Inflamm. Allergy Drug Targets, v. 7, p. 41-52, 2008. MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; SASAKI, A. A.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Prophylatic HPV vaccine for broad spectrum protection. 28

th International Papillomavirus Conference – San Juan, Puerto Rico, 2012a.

MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; SASAKI, A. A.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M.. Prophylatic HPV vaccine for broad spectrum protection. 4º Congresso Brasileiro de Biotecnologia – Guarujá, São Paulo, 2012b. MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; SASAKI, A. A.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M.. Prophylatic HPV vaccine for broad spectrum protection. XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan – São Paulo, São Paulo, 2012c. MARIGLIANI, B.; KAVATI, E. A.; SAKAUCHI, D.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; SASAKI, A. A.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Intracellular distribution of recombinant Human Papillomavirus capsid proteins. Current microscopy contributions to advances in science and technology, Formatex Research Center, v. 1, p. 678-684, 2012d. Available at: http://www.formatex.info/microscopy5/book/678-684.pdf MARIGLIANI, B. et al., Development of a prophylactic vaccine prototype against HPV infection and associated cancers. VIII Simpósio Brasileiro de Farmacognosia / I International Symposium of Phamacognosy, 1, p. 132-132, 2012e. MCLAUGHLIN-DRUBIN, M. E.; BROMBERG-WHITE, J. L.; MEYERS, C. The role of the human papillomavirus type 18 E7 oncoprotein during the complete viral life cycle. Virology, v. 338, p. 61-68, 2005. MODIS, Y.; TRUS, B. L.; HARRISON, S. C. Atomic model of the papillomavirus capsid. EMBO J., v. 21, p. 4754-4762, 2002. MOSSADEGH, N.; GISSMANN, L.; MÜLLER, M.; ZENTGRAF, H.; ALONSO, A.; TOMAKIDI, P. Codon optimization of the human papillomavirus 11 (HPV 11) L1 gene leads to increased gene expression and formation of virus-like particles in mammalian epithelial cells. J. Virol., v. 326, p. 57-66, 2004. MÜLLER, M.; GISSMANN, L.; CRISTIANO, R. J.; SUN, X. Y.; FRAZER, I. H.; JENSON, A. B.; ALONSO, A. ZENTGRAF, H.; ZHOU, J. Papillomavirus capsid binding and uptake by cells from different tissues and species. J. Virol., v. 69, p. 948-954, 1995. MÜLLER, M.; ZHOU, J.; REED, T. D.; RITTMÜLLER, C.; BURGER, A.; GABELSBERGER, J. BRASPENNING, J.; GISSMANN, L. Chimeric papillomavirus-like particles. Virology, v. 234, p. 93-111, 1997. MÜLLER, M. Human Papilloma Viruses: Methods and Protocols. Humana Press Inc. In: DAVY, C.; DOORBAR, J. Methods in Molecular Medicine. v. 119. Totowa, NJ. 2005. cap. 31, p. 435-446. MUÑOZ, N.; BOSCH, F. X.; SAN JOSE, S.; HERRERO, R.; CASTELLSAGUE, X.; SHAH, K. V.;SNIJDERS, P. J.; MEIJER, C. J. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med, v. 348, n. 6, p. 518-527, 2003. MUNÕZ, N.; CASTELLSAGUÉ, X.; DE GONZALEZ, A. B.; GISSMANN, L. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine, v. 24S3, p. S3/1-S3/10, 2006. NAKAGAWA J. T. T.; SCHIRMER J.; BARBIERI M. Vírus HPV e câncer de colo de útero. Rev. Bras. Enferm., v. 63, n. 2, p. 307-311, 2010 NARDELLI-HAEFLIGER, D.; RODEN, R. B.; BENYACOUB, J. SAHLI, R. KRAEHENBUHL, J. P.; SCHILLER, J. T.; LACHAT, P.; POTTS, A.; DE GRANDI, P. Human papillomavirus type 16 virus-like particles expressed in attenuated Salmonella typhimurium elicit mucosal and systemic neutralizing antibodies in mice. Infect. Immun., v. 65, p. 3328-3336, 1997. National Network for Immunization Information - NNii. Human Papillomavirus. Disponível em: http://www.immunizationinfo. org/vaccines/human-papillomavirus-hpv. Acesso em 6 fev 2013. NONNENMACHER, B.; BREITENBACH, V.; VILLA, L. L.; PROLLA, J. C.; BOZZETTI, M. C. Identificação do papilomavírus humano por biologia molecular em mulheres assintomáticas. Rev. Saúde Pública., v. 36, p. 95-100, 2002. OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; KAVATI, E. A.; MARIGLIANI, B.; SAKAUCHI, D.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Analysis of HPV16 L1 and L2 proteins expression in transfected human cell cultures. 28

th International Papillomavirus Conference – San Juan, Puerto Rico, 2012a.

OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; KAVATI, E. A.; MARIGLIANI, B.; SAKAUCHI, D.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Analysis of HPV16 L1 and L2 proteins expression in transfected human cell cultures. 4º Congresso Brasileiro de Biotecnologia – Guarujá, São Paulo, 2012b. OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; KAVATI, E. A.; MARIGLIANI, B.; SAKAUCHI, D.; FERREIRA JR., J. M. C.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Analysis of HPV16 L1 and L2 proteins expression in transfected human cell cultures. XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan – São Paulo, São Paulo, 2012c.

41

OZBUN, M. A. Infectious human papillomavirus type 31b: purification and infection of an immortalized human keratinocyte cell line. J. Gen. Virol., v. 83, p. 2753-2763, 2002. PALUMBO, A. C. M. Isolamento, cultivo e caracterização dos tipos celulares presentes no líquido amniótico humano para detecção de HPV. Monografia de Graduação em Biomedicina, Universidade de Santo Amaro, São Paulo. v. 1, p.1-82, 2008. POLJAK, M. Prophylactic human papillomavirus vaccination and primary prevention of cervical cancer: issues and challenges. Clinical microbiology and infection, v. 18 Suppl 5, p. 1-6, 2012. PAO, C. C.; LIN, S. S.; LIN, C. Y.; MAA, J. S.; LAI, C. H.; HSIEH, T. T. Identification of human papillomavirus DNA sequences in peripheral blood mononuclear cells. Am. J. Clin. Pathol., v. 95, p. 540-546, 1991. PASTRANA, D. V.; GAMBHIRA, R.; BUCK, C. B.; PANG, Y. Y.; THOMPSON, C. D.; CULP, T. D.; CHRISTENSEN, N. D.; LOWY, D. R.; SCHILLER, J. T.; RODEN, R. B. Cross-neutralization of cutaneous and mucosal Papillomavirus types with anti-sera to the amino terminus of L2. Virology. v. 337, p. 365-372, 2005. PAWELEC, G.; KOCH, S.; FRANCESCHI, C.; WIKBY, A. Human immunosenescence does it have an infectious component? Ann. N.Y. Acad. Sci., v. 1067, p. 56-65, 2002. PAYNE, D.; TYRING, S. K.; DOHERTY, M. G.; DAYA, D.; CHAN, T. S. Detection of human papillomavirus type 16 in plasma cells. Gynecol. Oncol., v. 48, p. 406-412, 1993. PENG, S.; JI, H.; TRIMBLE, C.; TSAI, Y. C.; YEATERMEYER, J.; BOYD, D. A.; HUNG, C. F.; WU, T. C. Development of a DNA vaccine targeting human papillomavirus type 16 oncoprotein E6. J. Virol., v. 78, p. 8468-8476, 2004. PRICE, R. A.; KOSHIO, L. J.; KOBRIN, S.; TIRO, J. A. Knowledge and intention to participate in cervical cancer screening after the human papillomavirus vaccine. Vaccine, v. 29, p. 4238-4243, 2011. PURANEN, M. H.; YLISKOSKI, M. H.; SAARIKOSKI, S. V.; SYRJÄNEN, K. J.; SYRJÄNEN, S. M. Exposure of an infant to cervical human papillomavirus infection of the mother is common. Am. J. Obstet. Gynecol., v. 176, p. 1039-1045, 1997. PYEON, D.; LAMBERT, P. F.; AHLQUIST, P. Production of infectious human papillomavírus independently of viral replication and epithelial cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 102, p. 9311-9316, 2005. RABELLO-SANTOS, S. H.; ZEFERINO, L. ; VILLA, L. L.; SOBRINHO, J. P.; AMARAL, R. G.; MAGALHÃES, A. V. Human papillomavirus prevalence among women with cervical intraepithelial neoplasia III and invasive cervical cancer from Goiânia, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., v. 98, p. 181-184, 2003. REUTER, J. D.; VIVAS-GONZALES, B. E. ; GOMEZ, D. ; WILSON, J. H.; BRANDSMA, J. L.; GREENSTONE, H. L.; ROSE, J. K.; ROBERTS, A. Intranasal vaccination with a recombinant vesicular stomatitis virus expressing cottontail rabbit papillomavirus L1 protein provides complete protection against papillomavirus-induced diseases. J. Virol., v. 76, p. 8900-8909, 2003. RODEN, R. B.; KIRNBAUER, R.; JENSON, A. B.; LOWY, D. R.; SCHILLER, J. T. Interaction of papillomaviruses with the cell surface. J. Virol., v. 68, p. 7260-7266, 1994a. RODEN, R. B.; WEISSINGER, E. M.; HENDERSON, D. W.; BOOY, F.; KIRNBAUER, R.; MUSHINSKI, J. F.; LOWY, D. R.; SCHILLER, J. T. Neutralization of bovine papillomavirus by antibodies to L1 and L2 capsid proteins. J. Virol., v. 68, p. 7570-7574, 1994b. RODEN, R. B.; DAY, P. M.; BRONZO, B. K.; YUTZY, W. H. IV; YANG, Y.; LOWY, D. R.; SCHILLER, J. T. Positively charged termini of the L2 minor capsid protein are necessary for papillomavirus infection. J. Virol., v.75, p. 10493-10497, 2001. RODEN, R. B.; LING, M.; WU, T. C. Vaccination to prevent and treat cervical cancer. Hum. Pathol., v. 35, p. 971-982, 2004. ROMBALDI, R. L.; SERAFINI, E. P.; MANDELLI, J.; ZIMMERMANN, E.; LOSQUIAVO, K. P. Transplacental transmission of human papillomavirus. J. Virol. , v. 5, p. 106, 2008. ROSA, M. I.; MEDEIROS, L. R.; ROSA, D. D.; BOZZETI, M. C.; SILVA, F. R.; SILVA, B. R. Papilomavírus humano e neoplasia cervical. Cad. Saúde Pública, v. 25, n. 5, p. 953-964, 2009. ROUSSEAU, M. C.; VILLA, L. L.; COSTA, M. C.; ABRAHAMOWICZ, M.; ROHAN, T. E.; FRANCO, E. Occurrence of cervical infection with multiple human pappilomavirus types is associated with age and cytologic abnormalities. Sex. Trans. Dis., v. 30, p. 581-587, 2003. ROWHANI-RAHBAR, A.; MAO, C.; HUGHES, J. P.; ALVAREZ, F. B.; BRYAN, J. T. et al. Longer term efficacy of a prophylactic monovalent human papillomavirus type 16 vaccine. Vaccine, v. 27, p. 5612-5619, 2009. RUBIN, M. A.; KLETER, B.; ZHOU, M.; AYALA, G.; CUBILLA, A. L.; QUINT, W. G. V.; PIROG, E. C. Detection and typing of human papillomavirus DNA in penile carcinoma: evidence for multiple independent pathways of penile carcinogenesis. Am. J. Pathol., v. 159, p. 1211-1218, 2001. SAHASRABUDDHE, V. V.; SHERMAN, M. E. Human papillomavirus vaccines for cervical cancer. Prevention: translating possibility into reality. JNCI, v. 104, p. 1699–1701, 2012.

42

SAKAUCHI, D.; KAVATI, E. A.; MARIGLIANI, B.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; TEIXEIRA, C. F. P.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Laboratorial scale production of HPV16 L1 protein as a vaccine component against HPV and associated cancers. 28

th International Papillomavirus Conference – San Juan, Puerto Rico, 2012a.

SAKAUCHI, D.; KAVATI, E. A.; MARIGLIANI, B.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; TEIXEIRA, C. F. P.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Laboratorial scale production of HPV16 L1 protein as a vaccine component against HPV and associated cancers. 4º Congresso Brasileiro de Biotecnologia – Guarujá, São Paulo, 2012b. SAKAUCHI, D.; KAVATI, E. A.; MARIGLIANI, B.; OLIVEIRA, H. B.; CANALI, R. A.; TEIXEIRA, C. F. P.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; MÜLLER, M.; CIANCIARULLO, A. M. Laboratorial scale production of HPV16 L1 protein as a vaccine component against HPV and associated cancers. XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan – São Paulo, São Paulo, 2012c. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. ed. Plainview: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 1000 p. SANJOSÉ, S.; DIAZ, M.; CASTELLSAGUE, X.; CLIFFORD, G.; BRUNI, L.; MUÑOZ, N.; BOSCH, F. X. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. The Lancet infectious diseases, v. 7, n. 7, p. 453-459, 2007. SAPP, M.; VOLPERS, C.; MÜLLER, M.; STREECK, R. E. Organization of the major and minor capsid proteins in human papillomavirus type 33 virus-like particles. J. Gen. Virol., v. 76, p. 2407-2412, 1995. SARKOLA, M. E.; GRÉNMAN, S. E.; RINTALA, M. A.; SYRJÄNEN, K. J.; SYRJÄNEN, S. M. Human papillomavirus in the placenta and umbilical cord blood. Acta Obstet. Gynecol. Scand., v. 87, p. 1181-1188, 2008. SASAGAWA, T.; PUSHKO, E. F.; STEERS, G.; GSCHMEISSNER, S. E.; HAJIBAGHERI, M. A., FINCH, J.; CRAWFORD, L.; TOMMASINO, M. Synthesis and assembly of virus-like particles of human papillomaviruses type 6 and type 16 in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Virology, v. 206, p. 126-135, 1995. SCHATZMAYR, H. G. A varíola, uma antiga inimiga. Cad. Saúde Pública, v. 17, n. 6, p. 1525-1530, 2001. SCHIFFMAN, M.; CASTLE P. E.; RODRIGUEZ A. C.; WACHOLDER S. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet, 370, p. 890-907, 2007. SCHIFFMAN M.; WENTZENSEN N.; WACHOLDER S.; KINNEY W.; GAGE J. C.; CASTLE P. E. Human Papillomavirus Testing in the Prevention of Cervical Cancer. J. Natl. Cancer Inst., v. 103, p. 368–383, 2011. SCHLECHT, N. F.; KULAGA, S.; ROBITAILLE, J.; FERREIRA, S.; SANTOS, M.; MIYAMURA, R. A.; DUARTE-FRANCO, E.; ROHAN, T. E.; FERENCZY, A.; VILLA, L. L.; FRANCO, E. L. Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia. JAMA, v. 286, p. 3106–3114, 2001. SIECZKARSKI, S. B.; WHITTAKER, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J. Gen. Virol., v. 83, p. 1535-1545, 2002. SMITH JS, LINDSAY L, HOOTS B, KEYS J, FRANCESCHI S, WINER R, et. al. Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions: A meta-analysis update. Int. J. Cancer, v. 121, p.621-632, 2007. SOUTO R.; FALHARI J. P. B.; CRUZ A. D. O Papilomavírus Humano: um fator relacionado com a formação de neoplasias. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 51, n. 2, p. 155-160, 2005. STANLEY, M., Human Papillomavirus Vaccines versus Cervical Cancer Screening. Clinical Oncology, 20, p. 388-394, 2008. STANLEY, M. Immunobiology of HPV and HPV vaccines. Gynecol. Oncol., v. 109, p. S15-S21, 2008. STEBEN, M.; DUARTE-FRANCO, E. Human papillomavirus infection: Epidemiology and pathophysiology. Gynecol. Oncol., v. 107, p. S2–S5, 2007. STOCCO DOS SANTOS, R. C.; LINDSEY, C. J.; FERRAZ, O. P.; PINTO, J. R.; MIRANDOLA, R. S.; BENESE, F. J.; BIRGEL, E. H.; BRAGANÇA-PEREIRA, C. A.; BEÇAK, W. Bovine papillomavirus transmission and chromosomal aberrations: an experimental model. J. Gen. Virol., v. 79, p. 2127-2135, 1998. STUBENRAUCH, F.; LAIMINS, L. A. Human papillomavirus life cycle: active and latent phases. Semin. Cancer Biol., v. 9, p. 379-386, 1999. SUBRAMANYAM, D.; KRISHNA, S. c-Myc substitutes for Notch 1-CBF1 functions in cooperative transformation with papillomavirus oncogenes. Virolology, v. 347, p. 191-198, 2006. SZULCZEWSKI, V. Estudo in vitro sobre a interação cellular e vias endocíticas de papilomavírus humano (HPV) em leucócitos do sangue periférico. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IBU/IPT, v. 1, p. 1-137, 2009. SZULCZEWSKI, V.; KESSLER-PORTO, A. P. A. G.; TROIANO, P. E. R.; SPRING, H.; TRENDELENBURG, M.; PELAJO-MACHADO, M.; BEÇAK, W.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; CIANCIARULLO, A. M. Expression of HPV-induced proteins in cervical carcinoma cell lines. Mem. Inst. Butantan, v. 63, p. 71, 2006. Apresentado na Reunião Científica do Instituto Butantan, 8, 2006, São Paulo.

43

SZULCZEWSKI, V.; TROIANO, P. E. R.; CIANCIARULLO, A. M. Method for isolating leukocytes for in vitro assays of pathogen-host cell interaction. Mem. Inst. Butantan, v. 64, p. 39, 2007a. Apresentado na Reunião Científica do Instituto Butantan, 9, 2007, São Paulo. SZULCZEWSKI, V.; AIRES, K. A.; BAZAN, S. B.; KESSLER-PORTO, A. P. A. G.; PALUMBO, A. C. M.; BENEDETTO, D. M.; SILVA, K. A.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; BOCCARDO, E.; VILLA, L. L.; CIANCIARULLO, A. M. HPV oncoproteins, iron endocytic pathway and mitochondria in mammalian cells. In: SÃO PAULO RESEARCH CONFERENCES – CANCER 2007: FROM MOLECULAR BIOLOGY TO TREATMENT, 8., São Paulo. Appl. Cancer Res. São Paulo: Applied Cancer Research, 2007b. p. 37-38. SZULCZEWSKI, V.; PALUMBO, A. C. M.; SILVA, K. A.; AIRES, K. A.; BAZAN, S. B.; HO, P. L.; BOCCARDO, E.; VILLA, L. L.; ARMBRUSTER-MORAES, E.; CIANCIARULLO, A. M. Human cells mitochondria as target of human papillomaviruses E6 oncoprotein. In: APOPTOSIS WORLD 2008: FROM MECHANISMS TO APPLICATIONS, 2008, Luxemburgo. Proceedings and Program. Luxemburgo: Fondation de Recherche Cancer et Sang, 2008. p. 113. THOMAS, M., PIM, D., BANKS, L. The role of the E6–p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV. Oncogene, v. 18, p. 7690–7700, 1999. TSENG, C. J.; LIN, C. Y.; WANG, R. L.; CHEN, L. J.; CHANG, Y. L.; HSIEH, T. T.; PAO, C. C. Possible transplacental transmission of human papillomaviruses. Am. J. Obstet. Gynecol., v. 166, p. 35-40, 1992. TOTA J, et al. Epidemiology and burden of HPV infection and related diseases: implications for prevent strategies. Preventive Medicine, v. 53, p. S12-S21, 2011. TUMA, P. L.; HUBBARD, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev., v. 83, p. 871-932, 2003. VAN DER BURG, S.H.; KWAPPENBERG, K.M.C.; O´

NEILL, T.; et al. Pre-clinical safety and efficacy of TA-CIN, a recombinant

HPV16 L2E7E6 fusion protein vaccine, homologous and heterologous prime-boost regimens. Vaccine, v. 19, p. 3652-3660, 2001. VILLA, L. L. et al. Prophylactic quadrivalent human papillomavirus (types 6, 11, 16, and 18) L1 virus-like particle vaccine in young women: a randomized double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial. Lancet Oncol., v. 6, p. 271–278, 2005. VILLA, L. L. et al. Immunologic responses following administration of a vaccine targeting human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18. Vaccine, v. 24, p. 5571–5583, 2006a. VILLA, L. L.; COSTA, R. L.; PETTA, C. A.; ANDRADE, R. P.; PAAVONEN, J. et al. High sustained efficacy of a prophylactic quadrivalent human papillomavirus types 6/11/16/18 L1 virus-like particle vaccine through 5 years of follow-up. Br J Cancer, v. 95, p. 1459-1466, 2006. WANG K. L. Humam papillomavirus and vaccination in cervical cancer. Taiwan J. Obstet. Gynecol., v. 46, p. 352–362,2007. WANG, X., ZHU, Q.; RAO, H. Maternal-fetal transmission of human papillomavirus. Chin. Med. J., v. 111, p. 726-727, 1998. WHO/ICO INFORMATION CENTRE ON HPV AND CERVICAL CANCER (a). Brazil - Human Papillomavirus and Related cancers, Fact Sheet 2010. Disponível em: <http://apps.who.int/hpvcentre/statistics/dynamic/ico/SummaryReportsSelect.cfm> WHO/ICO INFORMATION CENTRE ON HPV AND CERVICAL CANCER (b) (HPV INFORMATION CENTRE). Human Papilomavirus and related Cancers in World. Summary Report 2010. Disponível em: <http://www.who.int/hpvcentre> WILLIAMSON, A. L.; PASSMORE, J. A.; RYBICKI, E. P. Strategies for the prevention of cervical cancer by human papillomavirus vaccination. Best Pratice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology, v. 19, n. 4, p. 531-544, 2005. WILSON, R.; FEHRMANN, F.; LAIMINS, L. A. Role of the E1^E4 protein in the differentiation-dependent life cycle of human papillomavirus type 31. J. Virol., v. 79, p. 6732-6740, 2005. WILSON, V. G.; WEST, M.; WOYTEK, K.; RANGASAMY, D. Papillomavirus E1 proteins: form, function, and features. Virus Genes, v. 24, p. 275-290, 2002. WOODMAN, C. B.; COLLINS, S. I.; YOUNG, L. S. The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues. Nat. Rev. Cancer, v. 7, p. 11-22, 2007. WONG, A. K.; CHAN, R. C.; NICHOLS, W. S.; BOSE, S. Invader human papillomavirus (HPV) type 16 and 18 assays as adjuncts to HPV screening of cervical papanicolaou smears with atypical squamous cells of undetermined significance. Cancer, in press, 2009. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Collaborative Study of Neoplasia and Steroid Contraceptives. Invasive squamous-cell cervical carcinoma and combined oral contraceptives: results from a multinational study. Int. J. Cancer, v. 55, p. 228-36, 1993. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Cervical Cancer Screening in Developing Countries Report of a WHO consultation. França: Inís, 2002, v. 75 p. ZHANG, B.; LI, P.; WANG, E.; BRAHMI, Z.; DUNN, K. W.; BLUM, J. S.; ROMAN, A. The E5 protein of human papillomavirus type 16 perturbs MHC class II antigen maturation in human foreskin keratinocytes treated with interferon-gamma. Virology, v. 310, p. 100-108, 2003.

44

ZHOU, J.; STENZEL, D. J.; SUN, X.; FRAZER, I. H. Synthesis and assembly of infectious bovine papillomavirus particles in vitro. J. Gen. Virol., v. 74, p. 763-768, 1993. ZHOU, J.; SUN, X. Y.; STENZEL, D. J.; FRAZER, I. H. Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles. Virology, v. 185, p. 251-257, 1991. ZUR HAUSEN, H. Papillomavirus infections: a major cause of human cancers. Biochim. Biophys. Acta, v. 1288, p. F55-F78, 1996. ZUR HAUSEN, H. Papillomavirus and cancer: from basic studies to clinical application. Nat. Ver. Cancer, v. 2, p. 342-350, 2002. ZUR HAUSEN, H. Papillomavirus in the causation of human cancers - a brief historical account. Virology, 2009, v. 384, p. 260-265.