Quinta-feira, 24 de junho de 2010

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais

Profª Luzineide W. Tinoco

Alunos : Alda Ernestina dos Santos e Vitor Soares

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Sumário

• INTRODUÇÃO

*LC-RMN;

*Modos de operação;

*O uso de SPE;

• OBJETIVOS

• METODOLOGIA

• RESULTADOS E DISCUSSÕES

*Análise por LC-UV-SPE-RMN;

*Comparação de Probes;

*Experimentos RMN 2D;

*Identificação do Carvacrol.

• CONCLUSÕES

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Introdução

LC-RMN•LC-RMN X Pesquisa Tradicional de PN;

•Baixa sensibilidade Espectrômetros cada vez mais potentes;

•Uso de solventes deuterados ou supressão do solvente;

•On-line flow Baixa concentração do analito Baixa S/N;

•Redução da taxa de fluxo (vazão) Aumenta S/N, no entanto a difusão pode influenciar na separação;

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Modos de operação

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Introdução

O uso de SPE•Permite concentrar o analito;

•Elimina solventes detectáveis por RMN 1H;

•Elimina o uso de grande volume de solvente deuterado;

•Técnicas de supressão do solvente não são obrigatórias;

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Objetivo

Investigar a possibilidade do sistema on-line LC-UV-SPE-RMN-MS combinado com o uso de uma sonda cryoflow, combinando o volume de eluição dos cartuchos de SPE e descrever sua aplicação na análise de uma mistura complexa.

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Metodologia

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Experimento com LC-UV-SPE-RMN

• Foi utilizado o sistema on-line LC-UV-SPE-RMN.

• O espectrômetro utilizado foi: RMN Bruker DPX-400 MHZ com probe LC de 4-mm

13C – 1H com volume ativo de 120 L.

• Nesse primeiro experimento não foram obtidos espectros de RMN adequados, pois

a concentração dos analitos estava baixa.

• Portanto a análise foi repetida em equipamento mais sensível acoplado a um MS.

• O LC-UV-SPE-RMN-MS.

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LC-UV-SPE-RMN-MS

• RMN – AV-600 (ultra-blindado).

• Probe com volume ativo de 20 L.

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Experimentos no RMN DRX-600 MHZ

• Espectro de RMN 1H usando seqüência de pulsos baseada na versão 1D da seqüência de pulsos do NOESY.

Experimentos 2D :

• 1H- 1H TOCSY: largura do espectro, 8389 Hz; tempo de aquisição, 0.12s; intervalo de relaxação, 2s; spin locking pulse, 60 ms; e 16 scans para cada um dos 160 incrementos.

• 1H – 13C HMQC: largura do espectro, 6067 Hz n a dimensão F2 (1H) e 25000 Hz na dimensão F1 (13C); tempo de aquisição, 0.17s; intervalo de relaxação, 2s; fez-se de 32- 128 scans por incremento (256 incrementos).

• 1H – 13C HMBC: largura do espectro, 8993 Hz na dimensão F2 (1H) e 33557 Hz na dimensão F1 (13C); tempo de aquisição, 0.17s; intervalo de relaxação, 2s; mixing time de 65 ms; e fez-se de 64- 256 scans por incremento (256 incrementos).

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Resultados e Discussões

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Análise por LC-UV-SPE-RMN

• Escolha do sinal para analisar.

• Captura do analito responsável pelo sinal.

• Pico 6 foi analisado e constatou-se através do UV e do tempo de retenção que seria carvacrol.

• Foi confirmado através do espectro de RMN 1H.

• Foi efetuada a seleção dos sinais assinalados, porem os sinais 1,2,3,4 e 5 não apresentaram espectro de RMN adequado.

•Baixa concentração.

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Taxifolin

Rosmarinic acid

Aromadendrin

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eriodictyol

Naringenin e

apigenin

Carvacrol

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• Foram realizados testes para atingir um melhor rendimento no armazenamento dos analitos no cartucho de SPE.

• Testes com padrões de carvacrol e ácido rosmarínico.

• Resultado: Observou-se que a medida que diminuía a concentração do solvente acetonitrila os analitos ficavam mais retidos nos cartuchos.

• Utilizou-se 10% de Acetonitrila em água acidificada com ácido fórmico 0,1% v/v e vazão de 0.6 mL/min.

O mecanismo de retenção dos analitos no cartucho de SPE está relacionado com a polaridade.

Análise por LC-UV-SPE-RMN

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• 600 – MHz 1H RMN

• Espectro do pico 5,

mistura de flavonóides.

• (A) Pulso de supressão do

solvente.

• (B) Sem supressão de

solvente.

• sinais em 12.2 e 13 ppm.

• Two flavonoids trapped

in the same SPE.

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Comparação de Probes

•Flow probe 120 μL X Cryoflow probe 20 μL;

•Cryoprobe – aumenta a S/N pelo resfriamento do coil;

SPEAcetonitrila d3 Flow Probe 120 μL

SPEAcetonitrila d3

570 μL

190 μLCryoFlow Probe 20 μL

Diluição do analito

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COLEGATE, S. M. & MOLYNEUX, R. J., 2008.

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CLARIDGE, 2009.

Aprimoramento dos Probes

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CLARIDGE, 2009.

Cryoflow Probe

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Experimentos RMN 2D

• Heteronuclear 1H-13C .

• 1H-13C HMBC e 1H-13C HMQC .

• Permitem a observação de prótons e carbonos que estão conectados via uma e múltiplas ligações, respectivamente. Sendo assim é possível observar se há interrupções no sistema de spins de prótons.

• O experimento de 1H-13C HMBC pode revelar o acoplamento a longa distância do próton desblindado das hidroxilas de flavonóides.

• Concentração “multiple trapping”.

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• 600 MHZ 1H – 13C HMQC do pico 5.

• Três trapping on the same SPE.

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• os sinais das OH em 12,2 mostra os cross-peaks com os carbonos 98, 105 e 167.

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Experimentos RMN 2D

4,62 ppm – 5,06 ppm

6,87 ppm- 7,36 ppm

Singletos:

5,95 ppm

6,01 ppm

11,57 ppm

Flavonoide

1H-1H TOCSY

Aromadendrina

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Identificação do Carvacrol

HMQC

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Identificação do Carvacrol

HMBC

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Conclusões

•LC-UV-SPE-RMN-MS com cryoprobe aumento da sensibilidade observação direta do espetro de 13 C;

•Forneceu várias Vantagens: uso de solventes próticos na eluição , supressão do solvente não obrigatória, visão dos H trocáveis.

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Bibliografia Consultada

ANDERSEN, O. M.; MARKHAN, K. R. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. CRC Press: New York, 2006.

CLARIDGE, T.D.W. High Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry.2ed.Elsevier:Oxford,2009.

COLEGATE, S. M.; MOLYNEUX, R. J. Bioactive natural products: detection, isolation and structural determination. 2ed. CRC Press: New York, 2008.

GRIFFITHS, L. Optimization of NMR and HPLC Conditions for LC-NMR. Analitycal Chemistry, n 67. 1995. p.4091 -4095.

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LOMMEN, A.; GODEJOHANN, M.; VENEMA, D. P.; HOLLMAN, P. C. H.; SPRAUL, M. Application of Directly Coupled HPLC-NMR-MS to the Identification and Confirmation of Quercetin Glycosides and Phloretin Glycosides in Apple Peel. Analitycal Chemistry, n 72. 2000. p.1793-1797.

RUSSELL D. J.; HADDEN, C.E.; MARTIN, G.E.; GIBSON, A.A.; ZENS, A.P.; CAROLAN, J.L. A Comparison of Inverse-Detected Heteronuclear NMR Performance:Conventional vs Cryogenic Microprobe Performance. Journal of Natural Products, n.8, v.63.2000.p.1047-1049.

Bibliografia Consultada

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Obrigado!