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Sexagem de Sêmen e Embriões
Dezembro, 2012
Universidade Federal de Pelotas
Graduação em Biotecnologias
Manipulação de Gametas e Embriões
Prof. Tiago Collares
Profa. Priscila M. M. de Leon
Histórico:
• Década de 80: pesquisadores da Califórnia desenvolveram a tecnologia do
sêmen sexado por citometria de fluxo;
• 1989: sexagem de embriões humanos por PCR;
• 1990: sexagem de embriões bovinos por biópsia e PCR;
• 1998: primeiro potro sexado;
• 1999: primeiro terneiro utilizando sptz sexado e congelado de IA;
• 2001: cordeiro nascido utilizando sêmen sexado e congelado;
• 2003: comercialização de sêmen sexado nos EUA;
• 2004: comercialização de sêmen sexado no Brasil;
Sexagem
• Rentabilidade na produção de carne;
• Especialização da criação leiteira;
• Comercialização especializada: “planejar” os nascimentos de
machos e fêmeas de acordo com as necessidades do rebanho
e de mercado;
• Produção e seleção genética específica;
• Síndromes relacionadas ao sexo;
Aplicações gerais da Sexagem
Sexagem de Sêmen
• Moruzzi, 1979: deu especial atenção ao DNA, ao evidenciar diferenças entre os espermatozoides X e Y;
• Gorus & Pipeleers, 1981: utilização da técnica de Percoll, consistiu na centrifugação de espermatozoides em um gradiente de densidade contínuo, cujo princípio se baseou na diferença de massa entre as populações de espermatozoides X e Y;
• PINKEL et al., 1982: construção do citômetro de fluxo com alta resolução, usado para mostrar a diferença de 3,2% no conteúdo de DNA do núcleo de espermatozoides de camundongos;
• JOHNSON et al., 1989: coelhos nascidos de sêmen sexado por citometria de fluxo;
Sexagem de Sêmen
• Atualmente: sexagem do sêmen é feita através da tecnologia de
separação por fluxo, a única técnica confiável para separar
espermatozoides femininos dos masculinos, utilizando um aparelho
chamado Citômetro de Fluxo;
• Técnica é baseada na detecção de 3 a 4% a mais no conteúdo do
DNA nos espermatozoides femininos.;
Sexagem de Sêmen
• 1º passo : é diluir o ejaculado a uma concentração pequena;
• 2º passo: corá-los com fluorófo que se ligue em DNA (Hoechst 33342);
• 3º passo: este conteúdo será levado ao Citômetro de Fluxo, e quando os espermatozoides passam pelo raio lazer, a fluorescência é identificada;
→ Como o cromossomo X é maior, os espermatozoides femininos emitem maior quantidade de luz que os espermatozoides masculinos;
• Os detectores medem a quantidade de fluorescência emitida e detectam cargas + e – em cada gota contendo 1 só espermatozoide;
• 4º passo: este fluxo é logo separado em três recipientes eletromagnéticos:
– partículas com carga (+), contendo 1 esperma feminino
– partículas com carga (-) com 1 esperma masculino
– partículas sem definição
* Este processo separa espermatozoides de ambos os sexos com 90% de acerto.
Sexagem de Sêmen
X Y
- Espermatozóides X possuem mais DNA (3-4%)
- Espermatozóides X com mais corante ligado ao DNA
Hoechst 33342
Sexagem de Sêmen
Sexagem por Citometria de Fluxo
* Capacidade de sexagem: 3.000 a 5.000 sptz/segundo
Sexagem por Citometria de Fluxo
Sexagem de Sêmen
Segundo JOHNSON e WELCH (1999) a variação no conteúdo de DNA entre os espermatozoides X e Y é a seguinte:
• 2,8% no homem;
• 3,0% no coelho;
• 3,6% no suíno;
• 3,7% no garanhão;
• 3,8% no bovino;
• 3,9% no cão;
• 4,2% nos ovinos.
Cromossomo Y e Cromossomo X
*GARNER, 2006: existem diferenças relacionadas às características do cromossomo Y entre espermatozoides de raças de bovinos, determinando resultados variáveis na eficiência do processo de separação dos espermatozóides X e Y, assim como nos resultados de prenhez após a utilização de sêmen sexado de raças taurinas e zebuínas.
• Principal limitação: redução da taxa de concepção, pois sexar espermatozoides é um processo que impacta negativamente na viabilidade celular;
→ Em rebanhos: 60 a 65% de concepção em novilhas com sêmen convencional, enquanto que, 45 a 55% de concepção com sêmen sexado;
• somente 30% dos espermatozoides se orientam corretamente, ou seja, apenas 15% dos espermatozoides que entram na máquina são comercializados como sexados;
• São comercializadas palhetas com 2 milhões de sptz sexados;
→ custo do citômetro + mão de obra especializada + diminuição da viabilidade celular = alto custo do sêmen sexado
• se recomenda que o sêmen sexado seja usado somente em rebanhos bem manejados e com novilhas altamente férteis;
Limitantes da Sexagem de Sêmen
Resultados utilizando sêmen sexado
GARNER, 2006:
Resultados utilizando sêmen sexado
GARNER, 2006:
Pureza do sêmen sexado (90% a 85%);
Alguns touros não é possível sexar devido a baixa qualidade espermática;
Fertilidade é diminuída tanto na Inseminação Artificial como na FIV;
Equinos não é possível sexar sêmen comercialmente;
Técnica de sexagem de espermatozoides depende de equipamento de citometria de fluxo;
Desvantagens da Sexagem de Espermatozoides
Sexagem de Embriões
Sexagem de Embriões
Biotencologia relacionada a Produção in vitro e a Transferência de embriões;
Criador escolhe o sexo do embrião a ser transferido;
Realizada através da análise do DNA embrionário;
Ferramenta que permite intensificar e acelerar o melhoramento genético de animais de alto valor zootécnico;
Contribuindo diretamente para otimização da eficiência reprodutiva e lucratividade nos rebanhos;
Conceito: a Sexagem de Embriões é um avanço tecnológico que nos permite identificar o sexo do embrião antes da
transferência para a receptora.
• Bovinocultura de Corte x Leite
• Produção de carne e Abate • Comercialização de Touros
• Reposição de Matrizes • Reprodução • Comercialização de Fêmeas
• Produção de Leite • Reposição de Matrizes • Reprodução • Comercialização de Fêmeas
• Comercialização de Touros
Aplicação Comercial de Embriões Sexados
Aplicação Comercial de Embriões Sexados
• A maior frequência de machos nos produtos provenientes da PIV é altamente indesejável;
• O número de machos com alto potencial zootécnico necessário em um rebanho é bem menor em relação às fêmeas;
• A probabilidade de um terneiro tornar-se doador de sêmen é baixa, causando a desvalorização dos produtos;
• Toda a fêmeas oriunda de um acasalamento bem planejado é potencialmente uma doadora;
X
• Maior aproveitamento de receptoras;
• Menor custo com tratamentos hormonais e sincronização;
• Manejo simplificado;
• Menor locação de espaço na propriedade;
• A possibilidade de se ter um rebanho de matrizes aptas a produzirem cada vez mais e num curto espaço de tempo se multiplica;
• Estudos mostram um desvio na proporção macho/fêmea de embriões produzidos in vitro (↑ % de machos)
uma vaca que, em toda sua vida útil teria em média 4 a 5 crias, produziria com a transferência de embriões, de 30 a 40 crias
Vantagens da Sexagem de Embriões
Optar pela implantação ou congelamento dos "embriões fêmeas” e descartando os "machos" :
Economizando os custos altos das gestações, aumentando ainda mais o número de fêmeas, filhas de suas melhores matrizes, com possibilidade de atingir o seu equilíbrio de produção rapidamente (Melhora do Plantel é otimizada).
Vai ocorrer a diminuição dos custos de imediato pela simples redução pela metade do número de receptoras necessárias.
Vantagens da Sexagem de Embriões
Não invasivas: mantém a integridade do embrião;
1. Métodos imunológicos: detecção de um antígeno de superfície celular antígeno H-Y
Citotoxicidade:
• Em ensaios citotóxicos os embriões que expressam esse antígeno apresentam lise celular ou cessam o desenvolvimento, sendo classificados como macho;
• Eficiência de 80-86%;
• Desvantagem: inviabilidade do machos;
Imunofluorescência indireta (IFI):
• são utilizados anticorpos anti-H-Y, monoclonais ou policlonais, conjugados com o isotiocianato de fluoresceína;
• Visualização por meio de microscopia de fluorescência;
• 49-70% de acurácia
• Desvantagem: diminui viabilidade embrionária (59% de degeneração)
Técnicas de Sexagem de Embriões
Não invasivas: 2. Métodos bioquímicos: maior atividade enzimática relacionada ao
cromossomo X em fêmeas
Atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase:
• Eficiência de 64%;
• Alta taxa de Mortalidade Embrionária: inviabiliza a aplicação comercial dos métodos bioquímicos, sugerindo toxicidade da reação para os embriões
Técnicas de Sexagem de Embriões
Invasivas:
• Os métodos mais precisos para a determinação do sexo;
• requerem biópsia de células dos embriões;
1. Métodos Citogenéticos: visualização da cromatina sexual
Visualização da cromatina sexual:
• 1ª técnica utilizada para a identificação do sexo.
• Baixo sucesso;
Cariotipagem:
• identificação de XX ou XY na fase de metáfase;
• Eficiência de 9% em mórulas;
Técnicas de Sexagem de Embriões
Invasivas:
2. Métodos Moleculares: sondas de DNA específicas para a determinação do sexo de embriões pré-transferência
Hibridização in situ:
• localização de sequências Y-específicas por meio de marcação radioativa;
• 57% de eficiência e 95% de acurácia;
Hibridização in situ fluorescente (FISH):
• marcadores sondas não-radioativas;
• Pouca informação sobre sua eficiência;
• Complexidade (muitas etapas) inviabiliza a aplicação;
Técnicas de Sexagem de Embriões
Invasivas:
2. Métodos Moleculares:
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):
• HANDYSIDE et al. (1989) em embriões humanos;
• A PCR amplifica exponencialmente pequenos fragmentos de DNA de regiões Y-específicas;
• Alto grau de eficiência e Acurácia;
• Procedimento rápido e de fácil realização;
Técnicas de Sexagem de Embriões
• Estágio:
– Mórula compacta (D5)
• Biópsia não tem orientação
– Blastocisto expandido (D7)
• Biópsia do trofoblasto, massa celular deve permanecer intacta
• Qualidade:
– Excelente (G1)
– Boa (G2 e G3)
Estágio e Qualidade Embrionária
• Embriões produzidos in vitro ou provenientes de coleta in vivo;
1º ) Biópsia Embrionária:
• é utilizado um micromanipulador;
• Porção de 6 a 10 células são removidas para extração do DNA → representando de 10-30% da massa celular;
• Embriões de 5 a 7 dias;
• Conservação do material a -196°C;
2ª) Extração do DNA genômico:
• Células são lisadas na Proteinase K (6 µg);
• Incubação a 37°C/60 minutos;
• Incubados a 98°C/10 minutos para inativação da enzima;
A Técnica de Sexagem de Embriões
3º ) Amplificação por PCR:
• PCR Multiplex:
• Primer para região do Y (SRY);
• Primer para região controle (microssatélite 1.715 ou SRX);
• 40 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão;
4º) Visualização em Gel:
• Gel de Agarose 0,8% a 1,5%;
• Corado com GelRed ou Brometo de Etídeo;
A técnica mais utilizada consiste na punção por micromanipulação do embrião de 7 dias, retirando-se um fragmento cujo código de DNA evidenciará ou não a amplificação do Y (SRY) por PCR e seguido de eletroforese
A Técnica de Sexagem de Embriões
1ª Etapa: Biópsia Embrionária
2ª Etapa: Extração do DNA
• 37°C /60 minutos
• 98ºC /10 minutos
3ª Etapa: Amplificação por PCR
Multiplex PCR:
• Primer SRY:
F 5’ ATC AGT GCA GGG ACC GAG ATG 3’
R 5’ AAG CAG CCG ATA AAC ACT CCT T 3’
• Primer 1.715:
F 5’ TGG AAG CAA AGA ACC CCG CT 3’
R 5’ TCG TGA GAA ACC GCA CAC TG 3’
• Volume da reação de 15 - 50µl
• 40 ciclos
M = Controle positivo com DNA de macho bovino F = Controle positivo com DNA de fêmea bovina No = Controle Negativo (sem DNA)
Embriões machos (XY), apresentam 2 bandas → 1, 3 e 5 Embriões fêmeas (XX), apresentam 1 banda → 2 e 6
4ª Etapa: Visualização por eletroforese
Apenas o sexo masculino é detectado;
Quando não houver a presença de banda não é possível
identificar o sexo do embrião;
10% de mortalidade embrionária com a biopsia;
Mortalidade ligada a qualidade embrionária;
Limitantes da Sexagem de Embriões
• PCR se observa uma eficiência de 90-95% e acurácia de 93-98%;
• Ramalho et al. (2004): 80% de identificação correta entre mórulas e blastocistos;
• Os embriões sexados podem ser congelados com sucesso;
• Taxa de prenhes não é alterada;
A rapidez na execução da técnica e a possibilidade da determinação do sexo de embriões bovinos frescos, sem a necessidade de criopreservação, é uma das principais vantagens da utilização da PCR em laboratórios de PIV de embriões bovinos.
Resultados Obtidos com a Sexagem de Embriões
Sexagem em Humanos
• Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (DGP);
• Ferramenta de diagnóstico pré-natal para casais com alto risco de transmissão de doenças genéticas;
• Doenças como: Síndrome do X frágil, Distrofia muscular Duchenne, Hemofilia são evitadas com transferência de meninas;
• Dilema bioético: transferência de embriões não doentes, mas portadores de genes, cuja chance de transmissão para a prole futura é de 50%.
• Sociedade Européia: Equilíbrio de gênero → equilíbrio familiar e mesmo número de transferência masculinas e femininas por clínica
usado para determinação do sexo do embrião em casos de doenças genéticas ligadas ao cromossomo X
Equine ccffDNA
• Objetivos:
Detecção da presença do ccffDNA no plasma de éguas prenhas e determinação do sexo fetal através de SRY-PCR
Realizar um estudo de validação pré-desenvolvimento de um teste de laboratório
• População em estudo: – 20 éguas prenhas
– 2 éguas vazias
– 2 éguas virgens
– DNA genômico de 10 fêmeas
– DNA genômico de 10 machos
• Coleta e preparação da amostra: – Sangue venoso é coletado e processado (centrifugações) dentro de 15
mim
• Extração do ccffDNA – 1mL de plasma
– QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) (Akolekar et al., 2010)
Material e Métodos:
Equine ccffDNA
• Sexagem Molecular: – Padronizada com DNA genômico de macho e fêmea
– Sequenciamento
– Detecção do SRY (182 bp)
– Controle com GAPDH (150 bp)
– 10µL como template da reação de PCR
• Controles: – NTC (no-template control )
– Controle negativo (DNA genômico de fêmea)
– Controle positivo (2% de DNA genômico de macho)
* Confirmação do sexo fetal no nascimento
Material e Métodos:
Equine ccffDNA
Equine ccffDNA
Resultados:
• Padronização do SRY-PCR
SRY-PCR SRY- Sequenciamento
Resultados:
Equine ccffDNA
Table 1. Sensitivity of molecular sexing by SRY and GAPDH genes amplification in equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDDNA).
Samples SRY PCR % (n/total)
GAPDH PCR % (n/total)
SRY 2nd-PCR* % (n/total)
GAPDH 2nd-PCR % (n/total)
SRY qPCR % (n/total)
GAPDH qPCR % (n/total)
ccffDNA
Male pregnancy 72.7 (8/11)
100 (11/11)
90.9 (10/11)
100 (11/11)
90.9 (10/11)
100 (11/11)
Female pregmancy 0 (0/9)
100 (9/9)
0 (0/9)
100 (9/9)
0 (0/9)
100 (9/9)
Control Genomic DNA
Male 100 (10/10)
100 (10/10)
100 (10/10)
100 (10/10)
100 (10/10)
100 (10/10)
Female 0 (0/10)
100 (10/10)
0 (0/10)
100 (10/10)
0 (0/10)
100 (10/10)
Control mares
ccffDNA non-pregnant 0 (0/2)
100 (2/2)
0 (0/2)
100 (2/2)
0 (0/2)
100 (2/2)
ccffDNA virgin 0 (0/2)
100 (2/2)
0 (0/2)
100 (2/2)
0 (0/2)
100 (2/2)
SRY/PCR: Acurácia 85% (17/20)
SRY/2nd-PCR e qPCR : Acurácia 95% (19/20)