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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA
CAMPUS DE SÃO MIGUEL DO OESTE
ÁREA DAS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MARCELI KAEFER
DETECÇÃO DO CROMOSSOMO Y EM DNA FETAL DO PLASMA MATERNO HUMANO
São Miguel do Oeste
2009
MARCELI KAEFER
DETECÇÃO DO CROMOSSOMO Y EM DNA FETAL DO PLASMA MATERNO HUMANO
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao Curso de Ciências Biológicas – Ênfase em Biotecnologia, da Universidade do Oeste de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Alexis Trott
São Miguel do Oeste
2009
MARCELI KAEFER
DETECÇÃO DO CROMOSSOMO Y EM DNA FETAL DO PLASMA MATERNO HUMANO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Ciências Biológicas – Ênfase em Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
Aprovada em
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________ Prof. Dr. Adriano Dias de Oliveira Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída: _____________________________________ Prof. Dr. Alexis Trott Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída: _____________________________________ Prof. Dr. Gustavo Borba de Miranda Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída:
Dedico este trabalho a meus pais, e ao meu noivo Cristiano, fonte de minha força. Graças a eles, me tornei capaz de lutar para que meus sonhos e objetivos fossem sempre alcançados.
AGRADECIMENTOS
Agradeço em especial, ao meu orientador Professor Dr. Alexis Trott, pelo apoio na
orientação e desenvolvimento deste trabalho, compartilhando seus conhecimentos e suas
experiências.
A Professora Eliandra M. Rossi, Débora Oro e Diane Scapin, pelo auxílio durante a
realização do trabalho em laboratório, e pelas coletas de sangue das gestantes.
As gestantes que participaram voluntariamente, colaborando com o desenvolvimento
deste estudo.
A minha família pela ajuda e compreensão em todos os momentos. Meus pais Vunibaldo
e Hildigard, e minhas irmãs Ivete e Janete.
Agradeço ao meu noivo Cristiano, pelo carinho e apoio incondicional, e por estar sempre
ao meu lado.
Aos Professores, por todo conhecimento repassado, e por estarem sempre dispostos a nos
ajudar.
Aos amigos especiais, que se provaram verdadeiros ao longo destes quatro anos de
convivência.
A todos que, de uma forma ou de outra, colaboraram para que este trabalho fosse
realizado com êxito.
“São fúteis e cheias de erros as ciências
que não nasceram da experimentação, mãe
de todo conhecimento”.
(Leonardo da Vinci)
RESUMO
A identificação do sexo do bebê é comumente realizada por técnicas já consagradas como
o ultra-som morfológico, que geralmente ocorre a partir da 14ª semana gestacional. Porém, outra
técnica de sexagem fetal permite a identificação do sexo do bebê a partir da 7ª semana de
gravidez. Isso é possível através de técnicas moleculares que permitem a detecção do
cromossomo Y identificando o sexo do feto com poucas semanas de gestação. Para essa análise é
necessário o isolamento do DNA fetal presente no plasma materno, realizável devido a fatores
genéticos como a passagem de células fetais para o sangue da mãe. Como não é possível separar
o DNA fetal do DNA materno esse diagnóstico só é possível se o genótipo do feto e da mãe for
diferente, já que diferem quanto à presença do cromossomo Y. Para essa investigação, são
utilizados primers que amplificam regiões especificas do cromossomo Y, como é o caso dos
genes SRY e DYS14, através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). O objetivo
deste trabalho foi estabelecer a técnica de amplificação do gene SRY, e identificar o sexo fetal
pela técnica da PCR, através da identificação do cromossomo Y presente no DNA livre do
plasma materno humano em mulheres com gestação a partir de sete semanas. A amplificação foi
realizada através de PCR usando os primers SRY1 e SRY2 que amplificam uma região
específica do gene SRY do cromossomo Y. Os produtos da reação foram analisados em gel de
agarose 1,5% e visualizados em transluminador UV. No total foram realizados 21 testes, com
três resultados masculinos e 18 femininos, sendo que estes resultados foram comparados com o
ultra-som e/ou nascimento, além de uma prévia análise com o gene DYS14 em todas as
amostras. Os resultados demonstraram que o gene SRY não é indicado para identificação do
sexo fetal pela análise de DNA do plasma materno, devido aos resultados insatisfatórios, por ele
se apresentar em cópia única, causando baixo índice de acerto.
Palavras-chave: DNA fetal, Gene SRY, Sexagem Fetal, PCR.
ABSTRACT
The identification the sex of the baby is usually performed by techniques already devoted
as the ultrasound morphology that usually happen from the 14th week of gestation. However,
another technique of sexing fetal allows the identification the sex of the baby from the 7th week
of pregnancy. This is possible by molecular techniques that allow the detection of the
chromosome Y to identify the sex of the fetus with a few weeks of pregnancy. For this analysis is
necessary the isolation of DNA fetal present in maternal plasma, realizable due the genetic
factors as the passage of fetal cells into the blood of the mother. As it is not possible to separate
the DNA fetal of the DNA maternal that diagnostic only is possible if the genotype of the fetus
and the mother is different, since they differ for the presence of chromosome Y. For this
investigation, are used primers that amplify specific regions of the Y chromosome, as is the case
of gene SRY and DYS14.Through the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR). The
objective of this study was to establish the technique of amplifying the gene SRY, and identify the
sex fetal by PCR, through of the identification of the chromosome Y present in DNA free of the
plasma maternal in women with human pregnancy from seven weeks. The amplification was
performed by PCR using primers SRY1 and SRY2 that amplify a specific region of the gene SRY
on chromosome Y. The reaction products were analyzed on agarose gel 1.5% and visualized in
transluminator UV. In all were performed 21 tests, with three results male and 18 female, and
those results were compared with ultrasound and/or birth, and a previous analysis of the gene
DYS14 in all samples. The results showed that the SRY gene is not indicated for fetal sex
identification by DNA analysis from maternal plasma, due to unsatisfactory results, for it is
present in single copy, causing low accuracy.
Key words: fetal DNA, Gene SRY, fetal sexing, PCR.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Esquema 1. Etapas da PCR para amplificação do gene SRY........................................................18
Fotografia 1. Visualização dos resultados em gel de agarose........................................................21
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers usados para amplificação do gene SRY...........................................................17
Tabela 2. Comparação entre resultados do sexo fetal usando o gene SRY, DYS14 e ultra-som..19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................................11
1.1 GENE SRY..............................................................................................................................12
1.2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE – PCR .............................................................13
2 OBJETIVOS..............................................................................................................................14
2.1 GERAL....................................................................................................................................14
2.2 ESPECÍFICOS ........................................................................................................................14
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................................15
3.1 POPULAÇÃO DE ESTUDO ..................................................................................................15
3.2 COLETA DAS AMOSTRAS..................................................................................................15
3.3 EXTRAÇÃO DE DNA ...........................................................................................................15
3.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR..............................................................16
3.7 ANÁLISE POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE ..............................................17
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................................................18
5 CONCLUSÃO ...........................................................................................................................22
REFERÊNCIAS ..........................................................................................................................23
APÊNDICES ................................................................................................................................25
APÊNDICE A – Centrífuga DONNER CD100 – 3500rpm..........................................................26
APÊNDICE B – Banho-maria CIENTEC. ....................................................................................27
APÊNDICE C – Centrifuga HSIANGTAI – 14000rpm. ..............................................................28
APÊNDICE D – Termociclador biocycler mj25...........................................................................29
APÊNDICE E – Cuba eletroforética .............................................................................................30
APÊNDICE F – Transluminador UV............................................................................................31
APÊNDICE G – Amostras de DNA..............................................................................................32
APÊNDICE H – Amostra de plasma sanguíneo ...........................................................................33
ANEXOS ......................................................................................................................................34
ANEXO A - Termo de consentimento pós- informação ...............................................................35
ANEXO B - Sequência do gene SRY (5’- 3’)...............................................................................36
11
1 INTRODUÇÃO
A curiosidade dos futuros pais em saber se o bebê será menino ou menina pode ser
amenizada através de um método simples e prático de sexagem fetal pela Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR). Essa técnica permite a detecção do cromossomo Y, identificando o sexo do
feto com poucas semanas de gestação, antes mesmo dos resultados do ultra-som morfológico, no
qual é identificado somente a partir da 14ª semana gestacional.
Segundo SCHUPP (2001), a determinação precoce do sexo fetal tem grande importância
clínica nos casos de história familiar de doenças ligadas ao cromossomo X, como hemofilia e
distrofia muscular de Duchenne. As técnicas convencionais como a amniocentese e biópsia de
vilo coriônico, que permitem essa identificação, são técnicas invasivas que, segundo Malta et al.
(2008), apresentam riscos significativos para o bebê, não sendo recomendadas para determinação
do sexo fetal. Técnicas não-invasivas como o ultra-som são amplamente utilizadas e não
apresentam risco de perda do feto.
A ultra-sonografia tem o potencial de melhorar o prognóstico da paciente, mas também
pode ser deletéria ao estimular intervenções médicas desnecessárias, criando ansiedade, causada
por diagnósticos falso-positivos e dando um falso senso de segurança a mulheres com gestações
anormais, que podem perder a oportunidade de realizar outros exames devido a uma ultra-
sonografia considerada normal (RUMACK et al. 2006).
As técnicas de biologia molecular identificam o sexo do bebê através da presença de
sequências do cromossomo Y no DNA livre fetal. Isso se deve a fatores genéticos como a
passagem de células fetais para o sangue materno. Essas sequências são analisadas através da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Em 1997, foi descrito, pela primeira vez, a presença de DNA fetal no plasma e soro
maternos por LO et al. (1997). Ironicamente, o plasma é um material rotineiramente descartado
nas fases iniciais de muitos protocolos de extração de DNA, e também após a densidade
centrifugação, passo utilizado por muitos pesquisadores para o diagnóstico pré-natal não
invasivo. Esta é provavelmente uma das razões pelo qual a presença de DNA fetal em plasma
materno não tenha sido explorada anteriormente (LO et al. 1997). Nesse contexto, técnicas não
invasivas de amostragem de células fetais têm sido intensamente pesquisadas há muitas décadas
(LEVI et al. 2003).
Para a determinação do sexo do bebê, é necessário o isolamento do DNA fetal presente
no plasma materno. Conforme Levi et al. (2003), esse procedimento é fácil, barato e permite o
12
processamento simultâneo de muitas amostras, além da superioridade prática do DNA fetal
plasmático, que compõe 3-4% do DNA total, em relação às preparações de células fetais isoladas
do sangue materno, compondo cerca de 1:100.000 células maternas.
Como não é possível separar o DNA fetal do DNA materno igualmente presente no
plasma, o diagnóstico do genótipo só é possível quando este for diferente do materno. No caso
específico de sexagem fetal, não há necessidade do conhecimento do genótipo materno, já que
obviamente mãe e filho diferem quanto a presença do cromossomo Y (LEVI et al. 2003).
O gene que determina o sexo masculino está presente no cromossomo Y. Portanto, para
essa investigação, são utilizados primers (oligonucleotídios iniciadores), que amplificam regiões
específicas do cromossomo Y, como é o caso dos genes SRY e DYS-14.
O genótipo masculino ou feminino é determinado pela presença ou ausência do
cromossomo Y, respectivamente. Logo, quando houver amplificação do gene SRY e/ou DYS-14,
ou seja, presença do cromossomo Y, significa que o bebê é menino, e quando não houver
amplificação, será menina. Em caso de gêmeos idênticos, univitelinos, o resultado é valido para
ambos os bebês. Para gêmeos não idênticos, se o resultado do exame for menino significa que ao
menos um deles é menino, não sendo possível determinar se o outro bebê é um menino ou
menina. Se o resultado for menina, indica que ambos os bebês são meninas (KLEIN, 2007).
1.1 GENE SRY
O gene SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) é o gene determinante do
sexo do cromossomo Y, sendo a sua presença o fator fundamental na ativação da diferenciação
sexual masculina no embrião.
O gene SRY humano está localizado próximo a região pseudoautossomal do braço curto
do cromossomo Y. É constituído por um éxon único e codifica uma proteína de 204
aminoácidos. A proteína SRY possui domínio central de ligação ao DNA denominado HGM
Box, homólogo ao núcleo de ligação das proteínas nucleares da alta mobilidade (DOMENICE et
al. 2002).
Como afirmam Domenice et al. (2002), a presença do cromossomo Y é reconhecida
como fator determinante do desenvolvimento gonadal masculino em humanos desde a década de
50, quando se iniciaram estudos sobre alterações cromossômicas. A identificação do gene SRY,
13
no inicio da década de 90, permitiu o esclarecimento de uma importante etapa no processo de
determinação da gônada embrionária masculina.
Atualmente, o gene mais indicado pela literatura para sexagem fetal através de plasma
materno é o gene DYS-14. Sabe-se que este gene possui múltiplas cópias no cromossomo Y,
apresentando-se superior quanto à sensibilidade de identificação do cromossomo Y. Enquanto
isso, o gene SRY apresenta-se em cópia única no cromossomo Y, oferecendo maior dificuldade
de amplificação.
1.2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE – PCR
Em 1977, técnicas de seqüenciamento permitiram a identificação de alterações
específicas na seqüência de DNA e a associação destas com diferentes doenças genéticas. Depois
disso, o principal marco no desenvolvimento das técnicas de diagnóstico molecular foi a técnica
da reação em cadeia da polimerase (PCR), um método de clonagem in vitro proposto por Kary
Mullis em 1987 (MOLINA e TOBO, 2004).
A Reação em cadeia da Polimerase (PCR) é um método poderoso para a biologia
molecular, com inúmeras aplicações como o diagnostico de doenças, detecção de mutações em
genes, elucidação de relações evolutivas entre espécies, diagnóstico pré-natal, entre outros. A
tecnologia da PCR é bastante empregada por ser de fácil realização, baixo custo e principalmente
por ter alta sensibilidade, possibilitando a detecção de pequenas quantidades de DNA fetal no
plasma materno humano. Esse método consiste em fazer milhares de cópias da sequência de
DNA de interesse in vitro, usando elementos básicos que participam do processo natural de
replicação do DNA.
Geralmente, uma reação de amplificação contém o DNA com a sequência alvo a ser
amplificada, uma DNA-polimerase termoestável, dois oligonucleotídeos iniciadores,
desoxirribonucleotídeos (dNTPs), tampão de reação e concentração adequada de MgCl2. Os
componentes da reação são misturados e a amostra é colocada em um termociclador (aparelho
que possibilita o aquecimento e resfriamento rápido das amostras) (ZAHA et al. 2003).
14
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
� Identificar o sexo fetal por amplificação do gene SRY, cromossomo Y, presente no DNA
livre do plasma materno humano.
2.2 ESPECÍFICOS
� Estabelecer a técnica de amplificação do gene SRY, cromossomo Y;
� Identificar o sexo dos bebês em mulheres com gestação a partir de sete semanas;
� Comparar os resultados obtidos pelo gene SRY com os resultados previamente obtidos
em análise com o gene DYS-14.
15
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 POPULAÇÃO DE ESTUDO
Foram estudadas 21 mulheres grávidas com período gestacional entre 9 e 32 semanas. As
pacientes interessadas em realizar o estudo assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (ANEXO A), contendo informações sobre o teste a ser efetuado. Após assinar o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, as pacientes eram encaminhadas ao ambulatório
da Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC, Campus de São Miguel do Oeste, para
realizar a coleta das amostras sanguíneas, posteriormente enviadas ao Laboratório de Biologia
Molecular da mesma Universidade para realizar a extração do DNA.
3.2 COLETA DAS AMOSTRAS
Foram coletadas amostras de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada gestante,
devidamente identificadas e acondicionadas em tubos de vidro de 5 mL contendo 0,054 mL de
EDTA (anti-coagulante sanguíneo). Após a coleta, realizou-se a extração de DNA do plasma
materno.
3.3 EXTRAÇÃO DE DNA
A extração de DNA foi realizada de acordo com o protocolo adaptado da técnica de LO
et al. (1997), apresentando os seguintes passos:
• Os tubos contendo as amostras sanguíneas foram centrifugados a 3500rpm por 20
minutos para separar o plasma;
• O sobrenadante (plasma) foi retirado e transferido para tubos cônicos de 1,5 mL.
• O plasma foi submetido ao banho-maria por 20 minutos à 90ºC;
16
• Após o banho-maria, retirou-se o sobrenadante resultante transferindo-os para tubos
cônicos de 1,5 mL e realizada nova centrifugação na microcentrífuga a 14000 rpm por 20
minutos, ou até clarear a amostra;
• Posteriormente, retirou-se o sobrenadante, descartando-se o pellet e armazenando a
amostra a -20ºC.
3.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR
Para preparação da solução Master para PCR foi necessário a utilização de enzima Taq
polimerase, solução tampão (contendo MgCl2), dNTP, DMSO, primers (SRY1 e SRY2), água
ultra-pura para PCR (Tabela 2) e DNA de interesse das gestantes.
Foram utilizados também, DNA do sexo masculino para o controle positivo e DNA do
sexo feminino para o controle negativo.
Para amplificação do gene SRY foram utilizados primers específicos (Tabela 1) que
amplificam um fragmento de 270 pares de bases da sequência cópia única e específica do
cromossomo Y (ANEXO B), através da técnica da PCR.
Tabela 1. Primers usados para amplificação do gene SRY.
Fonte: KIM et al. (2006)
Após a preparação do Mix para PCR, os tubos cônicos contendo os reagentes e a
sequência alvo a ser amplificada, foram levados ao termociclador para a amplificação do gene
SRY, cromossomo Y.
Foram realizados 45 ciclos de amplificação, conforme o esquema 1.
Gene Primers e sequência
SRY 1 5' – CAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGT – 3' SRY
SRY 2 5′- CTTCCGACGAGGTCGATACTTATA - 3′
17
Após a amplificação através da PCR, os tubos cônicos contendo as amostras amplificadas
foram armazenados a -20°C até o momento da análise. Em seguida, realizou-se a análise do
produto das reações por eletroforese horizontal em gel de agarose, e visualizados em
transluminador.
3.7 ANÁLISE POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
O produto das reações de amplificação foi analisado por eletroforese em gel de agarose
concentrado 1,5%, corado por brometo de etídio, um composto fluorescente, que se integra aos
nucleotídeos do DNA, permitindo a visualização dos fragmentos em transluminador UV. Como
marcador de tamanho molecular, foi usado marcador de 100 pares de base.
53°C
1 min
72°C 1 min
72°C 5 min
Extensão
94°C 5 min
94°C 1 min
Anelamento
Extensão Final
4°C ∞
1ª etapa 2ª etapa
45 ciclos 3ª etapa 4ª etapa
Esquema 1. Etapas da PCR para amplificação do gene SRY. Fonte: a autora (2009).
18
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os exames de sexo fetal do plasma do sangue periférico das 21 gestantes, analisados pelo
gene SRY, foram avaliados previamente utilizando o gene DYS-14 primers Y5/Y6, sendo que
11 foram confirmados pelo ultra-som, apresentando cinco fetos do sexo masculino e seis do sexo
feminino. A análise com o gene DYS-14, apresentou 10 resultados masculinos e 11 femininos
(Tabela 3).
Tabela 2. Comparação entre resultados do sexo fetal usando o gene SRY, DYS-14 e ultra-som.
Sexo fetal Cód. Gestante
Período gestacional (semanas) SRY DYS-14 Ultra-som
MS01
MS02
MS03
MS04
MS05
MS06
MS07
MS08
MS09
MS10
MS11
MS12
MS13
MS14
MS15
MS16
MS17
MS18
MS19
MS20
MS21
16
17
31
15
11
15
23
27
10
15
25
16
28
09
14
09
20
11
32
09
16
Fem
Fem
Masc
Fem
Fem
Fem
Masc
Fem
Fem
Masc
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Masc
Fem
Fem
Fem
Masc
Fem
Masc
Masc
Masc
Masc
Masc
Masc
Masc
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Masc
Fem
Fem
Masc
Fem
Fem
x
Masc
Fem
x
Masc
Masc
x
x
x
x
x
x
x
Fem
x
Masc
Fonte: a autora (2009).
Os resultados obtidos com SRY totalizam 66,6% de acerto, comparando com os
resultados obtidos com DYS-14. Dos 10 masculinos para DYS-14, apenas três foram
19
confirmados por SRY, obtendo 30% de acerto. Portanto, 66,6% se devem principalmente aos
resultados femininos.
Todos os sete resultados errados, comparando SRY com DYS-14 (visto que estes foram
confirmados com ultra-som) são falsos femininos para SRY, ou seja, este gene não é
recomendado para determinação do sexo fetal, pois vários resultados masculinos não
amplificaram com SRY.
Até o momento, dos 11 resultados confirmados por ultra-som, nove foram corretamente
diagnosticados pelo SRY, sendo que os dois errados são falsos femininos. Nestes casos, o PCR
apontou ausência de amplificação (= sexo feminino), o qual se verificou gravidez do sexo
masculino. Novamente, apresentando baixo nível de confiança para sexagem com SRY.
Sabe-se que a concentração de DNA fetal no plasma materno aumenta conforme aumenta
a idade gestacional, aumentando a confiabilidade dos resultados. No estudo de Levi et al.
(2003), de 212 amostras coletadas, apenas três tiveram resultado errado, todas coletadas de
gestantes com menos de oito semanas. Todos os outros obtiveram 100% de acerto em idade
gestacional acima de oito semanas. Entretanto, observamos que o período gestacional não
apresentou influência nos resultados do SRY, como nos casos MS11 e MS13 (Tabela 3) com 25
e 28 semanas, respectivamente, o SRY não foi capaz de amplificar o cromossomo Y, sendo que
no caso da amostra MS10 com 15 semanas de gestação, essa amplificação foi possível.
Os resultados do PCR foram analisados em gel de agarose, sendo possível visualizar uma
banda com tamanho aproximado de 270pb, indicando menino. (fotografia 1).
20
Fotografia 1: Reação da PCR para fragmentos do cromossomo Y a partir de DNA isolado de plasma materno humano. Visualização dos produtos da PCR para fragmentos de 270pb do gene SRY em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. Apenas as amostras 4, 7 e 9 apresentam uma banda amplificada indicando sexo masculino. Fonte: a autora (2009).
De acordo com a fotografia 1, pode-se observar que a flecha em sentido horizontal indica
o controle positivo de 270pb. As flechas verticais mostram haver amplificação nas amostras de
número 4, 7 e 9, indicando gravidez do sexo masculino, correspondente as amostras MS03,
MS07 e MS10, respectivamente (Tabela 3). As outras amostras que não apresentam fragmento
amplificado indicam resultados femininos, sendo que se verificou sexo masculino por análise de
DYS-14, confirmadas por ultra-som.
O motivo pelo qual não se detectou o fragmento do cromossomo Y pelo SRY no plasma
das sete gestantes que apresentavam fetos do sexo masculino ainda é desconhecido. Uma
possibilidade é devida o fato de que esse gene se apresenta em cópia única no cromossomo Y,
dificultando sua amplificação. Esse fato foi demonstrado por Klintschar e colaboradores (2006),
onde constataram que o gene DYS14 pode estar repetido até 60 vezes no cromossomo Y, o que o
torna superior em relação ao locus cópia única do gene SRY, em termos de sensibilidade.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
21
Em um estudo de comparação entre ambos o genes DYS14 e SRY, Picchiassi et al
(2008), comprovaram que DYS14 obteve eficiência de 97,9% e SRY 80%, concluindo que o
gene DYS14 se mostra mais sensível na amplificação do cromossomo Y.
Martinhago e colaboradores (2006) também demonstraram alto índice de acerto nos
resultados obtidos com o gene DYS14, apresentando 97,2% quando o exame foi realizado a
partir da 7ª semana de gestação, aumentando a confiabilidade conforme aumenta a idade
gestacional. Entretanto, muitos trabalhos ressaltam que esse método de sexagem fetal ainda
precisa ser bastante aprimorado para permitir seu uso rotineiro, diminuindo as chances de falso-
positivo.
Além de satisfazer a curiosidade dos pais, o diagnóstico pré-natal do sexo fetal abre
caminhos para inúmeros métodos não invasivos para detecção de aneuploidias fetais, diminuindo
os riscos de perda do feto com técnicas invasivas.
22
5 CONCLUSÃO
Os resultados aqui obtidos demonstram que a técnica de amplificação, usando o gene
SRY, não foi eficiente na identificação do sexo fetal através do plasma materno, confirmando a
baixa sensibilidade deste gene na detecção do cromossomo Y, como descrito na literatura.
Dessa forma, se estabeleceu que o gene SRY não apresenta um bom índice de
confiabilidade para determinação do sexo fetal, provavelmente por se apresentar em cópia única
no cromossomo Y, quando comparados com DYS-14, por este se apresentar em múltiplas
cópias.
23
REFERÊNCIAS
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24
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APÊNDICES
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APÊNDICE A – Centrífuga DONNER CD100 – 3500rpm
Fotografia 1. Centrifuga usada na etapa de extração de DNA. Fonte: a autora (2009).
27
APÊNDICE B – Banho-maria CIENTEC.
Fotografia 2. Banho-maria utilizado na etapa de extração de DNA Fonte: a autora (2009).
28
APÊNDICE C – Micro centrífuga HSIANGTAI – 14000rpm.
Fotografia 3. Micro centrífuga usada no processo de extração de DNA. Fonte: a autora (2009).
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APÊNDICE D – Termociclador biocycler mj25
Fotografia 4. Termociclador utilizado para amplificação de DNA. Fonte: a autora (2009).
30
APÊNDICE E – Cuba eletroforética
Fotografia 5. Cuba de eletroforese usada no estudo. Fonte: a autora (2009).
31
APÊNDICE F – Transluminador UV
Fotografia 6. Transluminador UV para visualização dos fragmentos de DNA. Fonte: a autora (2009).
32
APÊNDICE G – Amostras de DNA
Fotografia 7. Amostra de DNA amplificado – gene SRY. Fonte: a autora (2009).
33
APÊNDICE H – Amostra de plasma sanguíneo
Fotografia 8. Amostra de plasma sanguíneo obtido após centrifugação do sangue. Fonte: a autora (2009).
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ANEXOS
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ANEXO A - Termo de consentimento pós- informação
O presente projeto de pesquisa, intitulado “DETECÇÃO DO CROMOSSOMO Y EM
DNA FETAL DO PLASMA MATERNO HUMANO”, tem como objetivo avaliar um novo
método de determinação do sexo fetal pela análise de DNA obtido do plasma materno.
Para a participação no estudo, uma amostra de sangue periférico (de 5 a 10 ml) será
colhida para posterior extração de DNA. Os riscos e desconfortos causados pela coleta de sangue
são semelhantes aos envolvidos na coleta realizada para exames laboratoriais de rotina. O
material colhido será utilizado única e exclusivamente para fins do projeto de pesquisa, sendo
garantido o sigilo das informações obtidas. Fica garantido, também, a paciente ou familiares, o
acesso a estas informações a qualquer momento.
Pesquisador responsável pelo projeto: Dr. Alexis Trott (telefone: 49 3631-1042).
Pelo presente, declaro que fui informado, de forma clara e detalhada, sobre o Projeto de
Pesquisa em questão. Fui igualmente informado da garantia de receber resposta a qualquer
pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida relacionada à pesquisa, da liberdade de não
participar do estudo, da segurança do sigilo e o caráter confidencial das informações.
Nome da paciente: _________________________________________________ Nome do responsável legal: __________________________________________ Assinatura do responsável legal: ______________________________________ Assinatura do pesquisador:______ ____________________________________ Data: / /2009 Código:
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ANEXO B - Sequência do gene SRY (5’ 3’)
AGTGTAGCTTAACACTTCACTGAAACTGTTTTGAGTTCTTAGGTCATATTTTTTTTTCTC
TAAACGAAACAATTACTTTTCTAAAAGTCAAATGTTAGCCATCCTAGAAGTTGGGCATAA
AATACTTGTAAGTATATGCTAATATTCTGATACTTAATGCCTGTGAAAAATGTGTATAGA
ATTTTCAATTTTTAAATAGAAGTGAAGAAAAAGCGATAATAATTACTATAAATTCAATAT
GCAGTTATGTATGTATGTGTGTGGTTAAGACAATTAGGTTCTCATTAAGCTTTGTTTTTT
TAAAGATAACATACACATATATTGATAATGATAAACAATTCATATAGCTTTTTGTGTCCT
CTCGTTTTGTGACATAAAAGGTCAATGAAAAAATTGGCGATTAAGTCAAATTCGCATTTT
TCAGGACAGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGATCAGCAGGGCAAGTAGTCAACGTTACT
GAATTACCATGTTTTGCTTGAGAATGAATACATTGTCAGGGTACTAGGGGGTAGGCTGGT
TGGGCGGGGTTGAGGGGGTGTTGAGGGCGGAGAAATGCAAGTTTCATTACAAAAGTTAAC
GTAACAAAGAATCTGGTAGAAGTGAGTTTTGGATAGTAAAATAAGTTTCGAACTCTGGCA
CCTTTCAATTTTGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATGCAATCATATGCTTCTGCTATG
TTAAGCGTATTCAACAGCGATGATTACAGTCCAGCTGTGCAAGAGAATATTCCCGCTCTC
CGGAGAAGCTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTAACTCTAAGTATCAGTGTGAAACG
GGAGAAAACAGTAAAGGCAACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCATGAACGCATTCATC
GTGTGGTCTCGCGATCAGAGGCGCAAGATGGCTCTAGAGAATCCCAGAATGCGAAACTCA
GAGATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTGGAAAATGCTTACTGAAGCCGAAAAATGGCCA
TTCTTCCAGGAGGCACAGAAATTACAGGCCATGCACAGAGAGAAATACCCGAATTATAAG
TATCGACCTCGTCGGAAGGCGAAGATGCTGCCGAAGAATTGCAGTTTGCTTCCCGCAGAT
CCCGCTTCGGTACTCTGCAGCGAAGTGCAACTGGACAACAGGTTGTACAGGGATGACTGT
ACGAAAGCCACACACTCAAGAATGGAGCACCAGCTAGGCCACTTACCGCCCATCAACGCA
GCCAGCTCACCGCAGCAACGGGACCGCTACAGCCACTGGACAAAGCTGTAGGACAATCGG
GTAACATTGGCTACAAAGACCTACCTAGATGCTCCTTTTTACGATAACTTACAGCCCTCA
CTTTCTTATGTTTAGTTTCAATATTGTTTTCTTTTCTCTGGCTAATAAAGGCCTTATTCA
TTTCAGTTTTACTGGTATTTCATTTTAAACTTAATTTCAAGACAAGTTGTGTCAACACGA
TTAACATGCAAAGAAATAAGACATCCAGAAGTGAGCCTGCCTATGTTTGTGGCCGTCAGA
GTACTAACTTGATACAAACGGACACTGTGGCTTACTTTAAATGCTCTAATGAGAAACACA
CTTGAAAATTGTACCAAAAAAAATCACACTTCTATATGCAGCGTGTTAAGCAGTCCTCTC
TAGACCGTGTATTCATTGGTCTTTCAGCTACTTTGTACGTGTCTATAAATTGCAGGTAAC
TAAGGAATGGATATGTAAGCAGGATCAAACTTGTTTCTTTCTCTCCCCTTCACGCTGTGG
AAAAAACCAGTTTTACCTCCACTTGCAATTCAGTTCCTTTACTCCATATAAATCCAAACG
GTTGACATTTCCTTTCAACTAGTTATAAAATGCCTCTGGTAAAACAAAATATTTAATTCC
TTGTCATTTTTGTATCTCTATGAAACTTATCATTTTGCCTTTCTTCTGAAAACTATCTTT
TAAAATGGCAATCTACTTGTTTCCATGGCCTATTAACTTTTAAGCCTGTGGAATGAAAAA
TACAG
Primers: SRY 1 5’ – CAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGT – 3’ SRY 2 5’ – CTTCCGACGAGGTCGATACTTATA – 3’ As seqüências representadas em vermelho indicam as regiões de anelamento dos primers SRY1 e SRY2, para a amplificação gênica específica do gene SRY.
