Programa de Pós-doutorado Júnior / CNPq

O EFEITO DO PATÓGENO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS

SOBRE A COMUNICAÇÃO ACÚSTICA EM SAPOS NEOTROPICAIS

Autor: Lucas Rodriguez Forti (Universidade Estadual de Campinas)

Colaboradores: Luís Felipe Toledo (Universidade Estadual de Campinas);

Rafael Márquez (Museo Nacional de Ciências Naturales);

Rodrigo Lingnau (Universidade Tecnológica do Paraná)

Mônica Jones (Universidade Federal de São Carlos, Campus Sorocaba)

Dezembro de 2016

Resumo: Sinais acústicos exercem importantes funções na defesa de recursos e na seleção

sexual em animais sociais. Em anuros o custo energético com a vocalização é

surpreendentemente alto, uma vez que fêmeas são atraídas pela vocalização. Assim, machos

podem variar seus cantos e realizar ajustes em propriedades acústicas de acordo com fatores

externos dinâmicos, como contexto social e temperatura. Os efeitos desses fatores são

relativamente bem conhecidos, mas a relação de mudanças em traços acústicos por efeito de

infecção por patógenos ainda é incipiente. Esse tema é de alta prioridade para a conservação

de espécies, já que alterações na comunicação por efeito de patógenos pode levar à redução de

fitness reprodutivo, e potencialmente contribuir para declínios populacionais. Até o momento,

dois trabalhos recentes encontraram resultados contrastantes em relação ao efeito da presença

do fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) sobre comportamento acústico em anuros, o

que gera a necessidade de um trabalho mais aprofundado sobre o assunto. Baseado na

premissa de que animais doentes podem ter seu comportamento alterado, esperamos que uma

possível situação de estresse fisiológico e queda de imunidade causada pela presença de

patógenos em machos deve comprometer traços de sua vocalização. Utilizaremos a

abordagem de modelos lineares generalizados para identificar o efeito e isolar possíveis

fatores de mascaramento, como temperatura e condição social. Esse trabalho deve contribuir

diretamente na compreensão de efeitos de patógeno sobre o comportamento de anuros

neotropicais, o que disponibilizará importantes informações para a conservação de anuros

ameaçados por todo o planeta.

Acoustic communication in diseased and stressed Neotropical

frogs: implications for the evolution of acoustic signals, disease

dispersal and species conservation

December / 2016

Abstract: Acoustic signals perform important functions for resources defense and sexual

selection in social animals. In anurans, the energy cost of vocalization is surprisingly high,

since females are phonotactic in relation to the acoustic signal emitted by males. However,

males can vary their calls and make adjustments in acoustic properties according to dynamic

external factors, such as social context and temperature. The effects of these factors are

relatively well known, but the relationship of changes in acoustic traits due to pathogenic

infection is still incipient. This is a high priority subject for species conservation, since

changes in communication through pathogens can lead to reduced reproductive fitness, and it

potentially contribute to population declines. To date, two recent studies have found

contrasting results regarding the effect of the fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) on

acoustic behavior in anurans, which raises the need for further work on the subject. Based on

the premise that diseased animals may have their behavior altered, we expect that possible

changes in physiological and immunological conditions, caused by pathogen presence in

males, should compromise traits of their vocalization. We will use the generalized linear

models approach to identify the effects and isolate possible masking factors such as

temperature and social condition. This work should contribute directly to the understanding of

the pathogen effects on the behavior of Neotropical anurans, which will provide important

information for the conservation of threatened anurans throughout the planet.

Enunciado do problema

A comunicação acústica para muitos animais é a base das interações sociais, já que os

sinais acústicos desempenham importantes funções associadas com territorialidade e

reprodução (Goodenough et al. 1993). Particularmente, em anuros, os machos estabelecem

territórios no ambiente reprodutivo e durante a estação chuvosa gastam grande quantidade de

energia vocalizando para manutenção do território contra competidores e para atração de

parceiras sexuais (Taigen & Wells, 1985; Wells, 2001). Tais sinais acústicos frequentemente

carregam informações sobre identidade, localização e condições morfofisiológicas do emissor

(Gerhardt & Bee, 2007; Wells, 2007). Dessa maneira, as propriedades acústicas do som

produzido por machos territoriais são fundamentais para o reconhecimento específico,

orientação, definição de conflitos territoriais, e para seleção sexual (Wells, 1977; Ryan &

Rand, 2001; Wells & Schwartz, 2007).

Em muitas espécies, o combate físico entre machos competidores pode ser evitado

através de interações acústicas, nas quais machos podem acessar a qualidade de seus

oponentes de acordo com evidências do canto territorial (Davies & Halliday, 1978). No geral,

o tamanho do corpo é proximamente relacionado com propriedades espectrais do canto, sendo

que machos maiores possuem cantos mais graves (Gingras et al., 2012). O sistema de

acasalamento baseado em preferência é predominante em anuros (Wells, 2007), e nesse caso

as fêmeas também se atentam aos traços acústicos dos cantos dos machos territoriais para o

processo de escolha de parceiros sexuais, e algumas características do canto podem ser

definitivas para o sucesso reprodutivo dos candidatos (Márquez & Bosch, 2001; Pröhl, 2003;

Ron, 2008). De modo generalizado, fêmeas possuem predileção por machos com vocalizações

mais graves e por aqueles mais esforçados, que emitem cantos em maiores taxas ou com

maior duração (Márquez & Bosch, 1997; Welch et al., 1998; Tárano & Herrera, 2003;

Márquez et al. 2008).

A vocalização em anuros tem forte determinação genética (Gerhardt et al., 1980;

Dawson & Ryan, 2009; Baugh et al., 2012), porém, apesar de uma expressão comportamental

inata, as propriedades acústicas da vocalização podem apresentar certa plasticidade sobre suas

três dimensões (tempo, potência e frequência) e serem influenciadas por diversos fatores

ambientais (Gerhardt & Huber, 2002; Wells & Schwartz, 2007). Variações no ambiente,

como temperatura, ruído de fundo e contexto social podem disparar ajustes de curto prazo na

vocalização, respeitando a plasticidade fenotípica dos indivíduos (Gerhardt & Huber, 2002;

Wells, 2007; Wells & Schwartz, 2007). Normalmente, esses três fatores determinam

propriedades acústicas temporais do sinal, como a duração do canto, a taxa de repetição de

cantos, número de notas e taxa de pulsos (Wells & Greer, 1981; Schwartz, 1986; Wells &

Taigen, 1986; Wong et al., 2004; Kaiser & Hammers, 2009). Tais propriedades acústicas

temporais são comumente classificadas como dinâmicas, pois apresentam alta variação

individual (atingindo coeficientes de variação superiores a 12 %), já que também estão

sujeitos a mudanças ambientais igualmente dinâmicas (Gerhardt, 1991).

Um outro tipo de ajuste de curto prazo, disponível para os anuros, está relacionado

com a potência do som (amplitude de onda). Uma alternativa energeticamente custosa para

lidar com a comunicação em um ambiente com alta poluição sonora é o aumento dos níveis

de intensidade das vocalizações como um mecanismo de reduzir o mascaramento dos sinais

(Lopez et al., 1988). Esse comportamento é conhecido como efeito Lombard, primeiramente

compreendido no estudo com seres humanos (Brumm & Zollinger, 2011), porém já relatado

de forma experimental em algumas espécies de sapos (Cunnington & Fahrig, 2010; Halfwerk

et al., 2016; Shen & Xu, 2016).

A terceira dimensão acústica é composta pela variação espectral, e de modo geral, em

anuros é esperado que mudanças em ocupação de frequências ocorram apenas numa escala

evolutiva, ou seja, como respostas de longo prazo. Tais mudanças espectrais são motivadas

por pressões seletivas relacionadas a sobreposição de frequências, e que resultam em

deslocamento de caráter (ver por exemplo: Littlejohn, 1976). Muitas espécies que ocupam

ambientes ruidosos, como bordas de riachos e cachoeiras, apresentam vocalizações com

ocupação espectral superior ao ruído e algumas podendo ocupar até mesmo bandas

ultrassônicas (acima de 20 kHz) (Narins et al., 2004). Contudo, propriedades espectrais do

canto geralmente são consideradas estáticas, pois possuem baixa variação (coeficientes de

variação inferiores a 5 %) e estão envolvidas no processo de reconhecimento específico

(Gerhardt & Davis, 1988; Gerhardt, 1991). No entanto, surpreendentemente, ajustes de curto

prazo em ocupação de frequência já tem sido relatados em interações agressivas (Bee et al.

2000), na competição por nicho acústico com espécies invasoras (Both & Grant, 2012) e

anedoticamente em ambientes com alto grau de ruído natural, forçados pela sobreposição de

frequências (Grafe et al., 2012; Shen & Xu, 2016).

Esses efeitos são relativamente bem conhecidos e estudados, porém a influência de

patógenos, como o fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), sobre a vocalização em sapos

é ainda incipiente. Alguns estudos têm abordado o efeito de parasitas (helmintos e moscas) e

tem relatado importantes alterações no comportamento reprodutivo em diferentes grupos

animais (Cade, 1984; Martin et al., 2003). Em anuros, se destaca o trabalho de Madelaire et

al. (2013), que relataram uma diminuição na taxa de vocalização com o aumento da infecção

por helmintos em machos da espécie Hypsiboas prasinus. Propriedades temporais do canto

também parecem ser afetadas pela infecção por Bd em sapos, porém, com efeito

equivalentemente oposto, machos de Hyla japonica infectados por Bd vocalizaram mais

rapidamente e com cantos de maior duração do que machos não infectados pelo fungo (An &

Waldman, 2016). Ironicamente, essas modificações acústicas tornariam machos mais atrativos

sexualmente. Além disso, esses resultados corroboram uma hipótese de que machos

infectados por patógenos aumentam seus esforços reprodutivos em compensação pela

potencial redução em sua vida útil (Agnew et al., 2000), característica que é mais adaptativa

para a dispersão do patógeno. Na contramão desse efeito, Greespan et al. (2016) não acharam

diferenças significativas em propriedades acústicas comparando a vocalização de machos

infectados pelo Bd com a vocalização de machos não infectados pelo patógeno em Litoria

rheocola. Dessa maneira, um estudo mais robusto, incluindo um número maior de espécies

em outras regiões do globo se faz necessário para um panorama mais completo e conclusivo

sobre o assunto.

Dado a importância da quitridiomicose como uma doença emergente que está

colocando muitas espécies de anfíbios em risco de extinção em escala global (Stuart et al.,

2004), o estudo desse patógeno, tanto no Brasil, como no mundo, ainda tem focado muito nos

aspectos de sua origem, distribuição espacial e efeitos sobre o desaparecimento de populações

(Daszak et al., 1999; Weldon et al., 2004; Skerratt et al., 2007; Olson et al., 2013). No

entanto, ainda são poucos os estudos que estão se dedicando a entender os efeitos do patógeno

sobre aspectos comportamentais das espécies (e.g., Crane & Mathis, 2011). Semelhante a

outras doenças, a infecção pelo fungo Bd reduz a imunidade dos indivíduos pelos efeitos da

toxina do fungo e pelo comprometimento da integridade da pele, e abre oportunidades para

outros patógenos debilitarem ainda mais os hospedeiros, e muitas vezes de maneira mortal

(Voyles et al., 2009; Carver et al., 2010; Fites et al., 2013). Apesar do fungo se instalar na

pele e comprometer sua integridade em adultos, até o momento não há evidências

contundentes de que a infecção pelo fungo possa comprometer diretamente a regulação

hídrica ou a função da pele na respiração de indivíduos infectados (Carver et al., 2010). Por

tanto, mecanismos fisiológicos que poderiam comprometer o comportamento em adultos é

ainda pouco conhecido.

No presente trabalho pretendemos determinar a influência da presença e grau de

infecção pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) sobre o comportamento acústico de

espécies de anuros Neotropicais, isolando efeitos como temperatura, ruído de fundo, contexto

social, tamanho do corpo e história filogenética. Nós esperamos que possíveis alterações

imunes causadas pela presença do patógeno em machos devem alterar significativamente

características das vocalizações das diferentes espécies. Para isso, numa tentativa de

compreender o possível mecanismo que pode comprometer o comportamento dos animais

infectados, também iremos avaliar o grau de stress fisiológico dos indivíduos através de

indicadores hormonais e avaliar a presença de infecções bacterianas e outros agentes

patogênicos, como endoparasitas helmintos.

Resultados esperados

Em consideração ao achado em An & Waldman, 2016, nós esperamos confirmar a

previsão de que, uma vez isolados possíveis co-fatores, a infecção pelo fungo deve alterar

características temporais das vocalizações das diferentes espécies, já que animais doentes

deverão ampliar o gasto de energia empregada em reprodução em virtude da redução na

expectativa de vida. Esse mecanismo também é esperado por representar um sistema

adaptativo para o patógeno, uma vez que tais modificações acústicas devem aumentar o poder

de dispersão do fungo. Aqui também esperamos que animais com maior carga de zoósporos

terão maior probabilidade de apresentar piores condições de stress fisiológico, com maiores

níveis de cortisol e glicose no sangue e presença de patógenos oportunistas, como parasitas

helmintos.

Esses resultados teriam grande repercussão na comunidade científica e dariam forte

suporte para aspectos da conservação de anuros em todo planeta e devem ser disseminados

em congressos e revistas científicas especializadas e de grande fator de impacto.

Desafios científicos e tecnológicos e os meios e métodos para superá-los

O presente documento é uma proposta de trabalho interdisciplinar, que envolve áreas

científicas importantes, como bioacústica, patologia, fisiologia, genética e conservação

biológica. O grande e maior desafio desse trabalho é coletar, administrar e analisar

informações dentro do prazo proposto para o projeto, uma vez que nosso sistema de estudo,

representado no fluxograma da figura 1, é de grande complexidade. Porém, os recursos

técnicos para trabalhos de campo e os equipamentos para coleta de informações acústicas,

patológicas e genéticas já estão disponíveis para iniciar o projeto, uma vez que ele seja

aprovado. Por tanto, não há demandas de compras de equipamentos e não há necessidade de

treinamento humano para o início das atividades de campo. Contudo, as análises de presença

e infecção por patógenos e análises de material genético dos anfíbios representam uma nova

expertise que almejo obter com essa proposta. Acredito que a união desses conhecimentos

junto com minha experiência em trabalhos prévios com comportamento de anuros e

bioacústica poderá gerar trabalhos e publicações inovadoras e fundar uma linha de pesquisa

abrangente e interdisciplinar (comportamento animal sobre efeitos patológicos), que se apoia

em quatro pilares temáticos essenciais: (1) comportamento animal; (2) evolução e genética;

(3) fisiologia e patologia e (4) conservação da biodiversidade. Com o presente projeto em

proposta teremos o primeiro trabalho a considerar e levantar dados sobre efeitos de curto e

longo prazo sobre a determinação do comportamento acústico em anuros e também

levantaremos informações inéditas no que se refere à busca por possíveis mecanismos que

podem fazer com que patologias afetem o comportamento de anfíbios adultos. Para isso,

conto com uma rede de colaborações nacionais e internacionais definidas. A UNICAMP,

através do professor Felipe Toledo, representa um centro de pesquisa emergente e referência

mundial sobre o estudo da quitridiomicose em anuros. Para análise de material genético e

parasitologia ainda busco colaboração. E um dos maiores desafios do projeto é definir e

validar uma metodologia (uso de anticorpos) para quantificação dos níveis de cortisol e

glicose no sangue dos anfíbios. Provavelmente testaremos kits comerciais como ELISA (teste

de imunoensaio enzimático) e RIA (técnica de radioimunoensaio) para testar a reatividade

cruzada. Esses ensaios serão conduzidos em colaboração com a professora Mônica Jones da

UFSCar (Campus Sorocaba).

Figura 2 – Fluxograma com a hipótese de estudo. As flechas indicam a direção dos efeitos, o

retângulo verde indica o objeto de estudo e o retângulo vermelho indica o principal fator em

estudo.

Áreas de estudo. No presente projeto iremos trabalhar em áreas preservadas e alteradas por

atividades humanas em localidades com florestas de Mata Atlântica, presentes no sul e

sudeste do Brasil. Nossa distribuição amostral permitirá a obtenção de dados considerando a

ocupação geográfica de três espécies dentro de uma variação de condições térmicas nas

diferentes paisagens e diferentes formações vegetais (florestas ombrófilas densa e mista,

floresta Estacional Semidecídua e campos sulinos). Essa seleção de localidades nos permitirá

fazer generalizações mais abrangentes em relação a um possível efeito de patógenos sobre o

comportamento acústico em anuros e ao mesmo tempo nos permitirá realizar essas análises

sob uma perspectiva filogeográfica, explorando também variações térmicas, possíveis

barreiras geográficas e grau de antropização da paisagem. A lista das localidades se encontra

na tabela 1.

Tabela 1 – Lista de localidades como locais de amostragem.

Localidades Estado

Parque Estadual Carlos Botelho São Paulo

Parque Estadual Intervales São Paulo

Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira São Paulo

Parque Estadual da Caverna do Diabo São Paulo

Tapiraí São Paulo

Parque Estadual do Turvo Rio Grande do Sul

Parque Estadual do Rio Guarani Paraná

Parque Nacional do Iguaçu Paraná

São Miguel do Oeste Santa Catarina

Espécies e procedimentos para a coleta de dados. Nós iremos trabalhar com três espécies

distintas, todas com populações abundantes, de fácil encontro e suscetíveis à infecção pelo

patógeno (Bd):

(1) Crossodactylus caramaschii (Família Hylodidae) é uma espécie de anuro que ocorre

em pequenos riachos de Mata Atlântica, entre o sul do estado de São Paulo e algumas

localidades no Paraná e Santa Catarina (Frost, 2016). A espécie é descrita do

município de Eldorado, estado de São Paulo e pertence ao grupo de Crossodactylus

gaudichaudii (Frost, 2016). Machos mantém atividade diurna de vocalização sobre

rochas em corredeiras ou em leitos de pequenos riachos (Bastos & Pombal Jr., 1995).

O canto de anúncio, de estrutura harmônica, é descrito aparentemente de um único

macho a partir da população topotípica, com média de duração de canto de 5,5

segundos, 49 a 69 notas por canto, frequência dominante de 5000 Hz e frequência

fundamental de 1600 Hz (Bastos & Pombal Jr., 1995). A vocalização tem faixa de

frequência ocupando aproximadamente de 2700 a 6800 Hz (Bastos & Pombal Jr.,

1995).

(2) Crossodactylus schmidti (Família Hylodidae) é uma espécie com características

ecológicas e comportamentais muito parecidas com C. caramaschii, porém ocorrem

em riachos de Mata Atlântica do interior do estado de Paraná, Santa Catarina e Rio

Grande do Sul, além de localidades no Paraguai e na Argentina, de onde é descrito a

partir da população de Misiones (Caldart et al., 2013). A vocalização de anúncio tem

estrutura igual a encontrada na vocalização de C. caramaschii, porém ocupa faixa de

frequência mais grave (Caldart et al., 2011). Junto com outras espécies forma o grupo

C. schmidti (Frost, 2016).

(3) Hypsiboas bischoffi (Família Hylidae) é uma espécie descrita do município de Taquara

(RS); contudo está amplamente distribuída na Mata Atlântica do sudeste do Brasil, do Rio

de Janeiro ao Rio Grande do Sul (Frost, 2016). Essa espécie parece reproduzir ao longo de

todas as estações do ano e nos ambientes de reprodução os machos mantém atividade de

vocalização em poleiros que vão de 50 a 80 cm de altura (Bertoluci & Rodrigues, 2002).

Seu canto de anúncio foi descrito a partir de machos da Estação Biológica de Boracéia

(SP) (Heyer et al., 1990). Os autores reconheceram dois tipos de canto, um bem comum e

outro mais raramente usado. É possível que o mais comum dos cantos seja o canto de

anúncio, que pode conter uma ou duas notas e durar de 0,07 a 0,45 s. As notas são

pulsionadas e podem conter entre 8 e 11 pulsos; a frequência dominante encontra-se entre

1100 e 2000 Hz (Heyer et al., 1990).

No campo nós coletaremos dados acústicos, morfológicos, genéticos, patogênicos e

amostras de sangue de cerca de 50 machos de cada espécie (pelo menos 5 indivíduos de cada

população). Com auxílio de um microfone Sennheiser ME66/k6 acoplado a um gravador

Tascam DR-680 nós gravaremos cada macho por 15 minutos seguidos. As gravações terão

formato “wav”, 24 bits de resolução e taxa de amostragem de 96 kHz. Para cada gravação, os

microfones serão suportados em um tripé a 70 cm do macho emissor. Com a mesma distância

e utilizando tripés, três medidores de nível sonoro Voltcraft SL-451, com precisão de 0,1 dB

RMS e ponderação de tempo: FAST, e ponderação de pico e frequência: C, serão

posicionados em torno do macho emissor. Um dos decibelímetros ficará em paralelo ao

microfone e os outros dois apontando para o sapo focal numa inclinação de 45 ° graus, lado a

lado em relação ao microfone. Este método será utilizado para obter o nível de pressão sonora

do sinal, reduzindo uma possível interferência da orientação do macho por uma mudança de

posição durante a gravação. Com o valor máximo de potência (dB) de cada medidor SPL,

calcularemos o nível médio de pressão da vocalização de cada macho.

Durante as gravações os dados de temperatura e umidade relativa do ar serão obtidos

por termohigrômetro digital Instrutemp, modelo ITWH1280 instalados no ambiente. O

contexto social de cada macho durante a gravação será observado e três possíveis categorias

serão registradas: (1) macho em isolamento; (2) macho em coro; e (3) macho em situação de

corte. Após cada gravação o macho será capturado diretamente com sacos plásticos, sem que

sejam tocados diretamente e contaminados pela mão do pesquisador. Esses indivíduos ficarão

acondicionados nas bolsas plásticas umedecidas até o final da amostragem de sua população.

O comprimento rostro-cloacal de cada indivíduo capturado será aferido com auxílio de

paquímetro digital Mitutoyo 200 mm (precisão 0.1 mm). Amostras de material micótico serão

recolhidas da pele de cada indivíduo seguindo a técnica do swabing, descrita em Lambertini et

al. (2013) e protocolizado por Hyatt et al. (2007). Ao final de toda amostragem micótica os

indivíduos serão inspecionados para avaliar e contabilizar a ocorrência de possíveis lesões na

pele e depois os mesmos serão mortalmente anestesiados com xilocaína e extrairemos o

fígado como material para análise genética. Os tecidos serão armazenados em criotubos de 1,5

mL com álcool absoluto e conservados em freezer à -80°C até o momento da extração e os

indivíduos serão fixados em formalina. Em laboratório nós examinaremos o trato digestivo, a

cavidade abdominal, pulmões e bexiga urinária de todos indivíduos para a análise qualitativa

e quantitativa de parasitos helmintos usando estereomicroscópio. Os parasitos helmintos serão

identificados segundo os procedimentos adotados por Madelaire et al. (2012). Após o exame

parasitológico todos indivíduos coletados serão depositados como material testemunho no

Museu de Zoologia da Universidade Estadual de Campinas (ZUEC).

No dia que antecede as gravações dos machos, o perfil acústico (ocupação de

frequência e espectro de potência) do habitat será obtido com três gravadores autônomos e

três decibelímetros do tipo Voltcraft SL-451 com armazenadores de dados instalados em três

pontos diferentes do ambiente reprodutivo. Esses aparelhos serão usados para monitorar a

ocupação espectral do ruído de fundo e a variação de nível de pressão acústica ao longo de 24

horas.

Análises acústicas. As vocalizações de todos os machos serão analisadas no software Raven

Pro 64 1.4 (Cornell Lab of Ornithology - Bioacoustics Reserch Program, 2011). A filtragem

de possíveis ruídos de fundo serão realizadas no mesmo programa usando a função “Batch

Band Filter”. Após as medições de nível de pressão médio para cada sinal, nós

normalizaremos todos os cantos que serão analisados com a amplitude de -0.8 dB no software

Audacity 2.0.5.

Sobre a dimensão temporal das vocalizações nós mediremos as seguintes propriedades

acústicas quantitativas: (1) Duração do canto; (2) Duração da nota; (3) duração do pulso; (4)

taxa de repetição de cantos; (5) taxa de repetição de notas (quando aplicável); (6) Taxa de

pulsos (quando aplicável); (7) número de notas (quando aplicável); (8) número de pulsos por

canto; (9) Intervalo entre cantos; (10) intervalo entre notas; (11) Intervalo entre pulsos; Em

consideração à dimensão espectral, nós mediremos: (1) amplitude de frequência; (2)

frequência mínima; (3) pico de frequência dominante; e (4) frequência máxima. Para análises

espectrais nós usaremos FFT (Fast Fourier Transformation) de 1024 e sobreposição de janela

(overlap) de 75 %. A seleção dos cantos e medições de pulsos serão feitas no ocilograma.

Para obtenção dos valores de cada propriedade nós utilizaremos o recurso “choose

measurements” com as seguintes funções: (1) Delta Time (s); (2) Frequency 5% (Hz) e (3)

Frequency 95% (Hz)- as duas medidas incluem frequência mínima e máxima ignorando 5 %

de intervalo de confiança para energia total do canto selecionado; (4) Bandwidth 90% (Hz)-

mede a amplitude de frequência usando o mesmo intervalo de confiança (diferença entre

Frequency 95% e Frequency 5%); e (5) Peak Frequency (Hz) - mede o pico da frequência

dominante (frequência na qual a potência é máxima dentro do canto selecionado).

A análise de ocupação espectral (Amplitude espectral do ruído de fundo) será feita no

software Raven, usando FFT de 1024 e sobreposição de janela de 75 %. Em cada áudio nós

selecionaremos 5 amostras de 3 segundos e utilizaremos as funções “Frequency 5%” e

“Frequency 95%” para determinar precisamente a ocupação espectral registrada por cada

áudio.

Análise genética. Para extração de DNA, a partir dos tecidos armazenados, nós usaremos o

mesmo procedimento adotado por Veiga-Menocello et al. (2014). Nós visamos a ampliação e

sequenciamento de 4 marcadores moleculares: (1) NADH (subunidade 2 - ND2), (2) RAG1;

(3) β-Fibrinogen; e (4) 28S. Esses marcadores tem sido aplicados para estudos filogeográficos

(Prado et al., 2012; Tonini et al., 2013; Menezes et al., 2016). O DNA mitocondrial tem sido

especialmente utilizado nesse nível por sua elevada taxa de evolução (Brow et al., 1982;

Brow, 1985). Fragmentos serão purificados usando kit de purificação GE Healthcare Life

Science (São Paulo, Brazil). As sequências serão obtidas usando primers no kit de ciclo de

sequenciamento BigDyeTM

3.1 (Applied Biosystems Foster City, CA, USA). A leitura das

placas do sequenciamento será feita no sequenciador automático modelo ABI 3700/Prism.

Todas sequências serão verificadas por observação direta usando o software BioEdit v.5.0.9 e

o alinhamento faremos com programa Muscle (Edgar, 2004).

Para cada espécie nós iremos estimar uma árvore de relação genética entre indivíduos

usando o método de verossimilhança máxima e inferência bayesiana, como implementado em

RAxMLGUI v.1.3 (Stamatakis, 2006) e MrBayes 3 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003),

respectivamente. Em todas analises, modelos de substituição serão obtidos usando

JmodelTest2 (Darriba et al., 2012) de acordo com o valor de AIC (Akaike Information

Criterion). A análise de verossimilhança será realizada em 100 rodagens e com bootstrap de

1000 replicações. Na análise de inferência bayesiana nós realizaremos duas rodadas

independentes de MCMC, cada uma com quarto cadeias a 20 milhões de passos, amostrando

1000 gerações e descartando os dois primeiros milhões de burn-up. A convergência de

parâmetro será verificada no software Tracer v1.6 (http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer).

Nós iremos estimar o tempo de divergência usando o método tree no software

*BEAST 1.8.0 (Drummond et al., 2012). A árvore no *BEAST será construída no CIPRES

Science Gateway (Miller et al., 2010). Em nosso modelo (strict clock) nós fixaremos a taxa de

substituição em 0.00957 mutações/local/ milhões de anos (Crawford, 2003). Para

substituições nucleares nós usaremos distribuição log-normal default (média = 0 e desvio

padrão = 1) e permitiremos o programa co-estimar as taxas. Nós realizaremos três rodagens

MCMC independentes de 200 milhões de gerações, com amostragens a cada 10.000 gerações.

As árvores resultantes serão combinadas e sumarizadas usando o TreeAnotator.

Procedimentos para análise de stress fisiológico. Nós faremos a quantificação de níveis de

cortisol e glicose no plasma sanguíneo dos anuros através da validação de métodos já

consolidados usando kits comerciais em procedimentos semelhantes aos usados para peixes.

Nós iremos usar o kit ELISA (teste de imunoensaio enzimático) para testar a reatividade

cruzada e determinar a concentração do cortisol. Para essa análise usaremos os procedimentos

descritos em Velasco-Santamaría & Cruz-Casallas (2007). Para o radioimunoensaio nós

usaremos o kit comercial “Coat-a-Count Cortisol®” - DPC (Diagnostic Products

Corporations, Los Angeles, CA, USA) e faremos a determinação dos níveis de glicose pelo

método colorimétrico de Trinder (1969).

Extração de DNA e PCR para análise de presença e infecção do patógeno Bd. Para extração

de DNA nós adicionaremos 50 μL do reagente PrepMan ULTRA® (Applied Biosystems) em

cada criotubo contendo o swab. Por dois ciclos os tubos serão agitados em vortex por 45

segundos, e depois centrifugados por 30 segundos a 12.000 RPM. Após a conclusão de dois

ciclos desse processo nós iremos seguir o seguinte procedimento para concluir a extração: (1)

aquecer os tubos em banho com água fervente por 10 minutos, (2) resfriar em temperatura

ambiente por 2 minutos, (3) centrifugar por 1 minuto a 12.000 RPM, (4) inverter o swab

dentro do criotubo (utilizando pinças flambadas a cada inversão), (5) centrifugar por 5

minutos a 12.000 RPM, (6) descartar os swabs, (7) centrifugar rapidamente (por alguns

segundos), (8) transferir 45 μL da solução para novos tubos; (9) centrifugar por 10 minutos a

12.000 RPM e (10) preparar uma diluição 1:10 do material genético para estocar (também

poderá ser utilizada nas reações de qPCR).

A amplificação do DNA será realizada através da técnica de PCR (Polymerase Chain

Reaction), de acordo com o protocolo de Annis et al. (2004), utilizando os primers específicos

do Bd: Bd1a (5’‑ CAGTGTGCCATATGTCACG‑ 3’), e Bd2a

(5’‑ CATGGTTCATATCTGTCCAG‑ 3’). Para uma reação com volume final de 25 μL, nós

iremos preparar uma mistura de primers, contendo 1 μM de cada um, MgCl2 (0.9 mM),

1XTaq Buffer, 0.2 mM de cada dNTP e 0.8 U de TaqPolymerase. Um controle negativo de

água destilada será adicionado à reação. As condições de amplificação serão: denaturação

inicial a 93°C por 10 minutos, seguida de 30 ciclos de 45 segundos a 93°C, 45 segundos a

60°C, 1 minuto a 72°C, e extensão final a 72°C por 10 minutos. Após a reação de PCR,

aproximadamente 10 μL de cada amplificado deve ser analisado em gel de agarose 0,7%,

juntamente com um DNA ladder como um padrão de tamanho de DNA. O gel será corado

com brometo de etídio e visualizado em transluminador de luz ultravioleta. O resultado será

considerado positivo para presença de Bd quando forem visualizadas bandas de amplificação

de aproximadamente 300 pb (pares de base).

Para aqueles indivíduos que atestarem positivos com a presença do Bd nós faremos a

quantificação de zoósporos seguindo a técnica da qPCR. Para realizar essa reação nós

primeiro prepararemos os padrões que serão utilizados como parâmetros no processo de

quantificação através da cultura do Bd em placas de ágar Triptona 1% (Longcore et al. 1999;

Vieira & Toledo, 2012). As culturas serão mantidas em estufa à 21°C por aproximadamente 7

dias. Uma vez observada atividade dos zoósporos, nós adicionaremos 10 mL de água MilliQ

em cada placa, e aguardaremos 30 minutos para que os zoósporos fiquem livres na solução.

Após esse procedimento, iremos raspar as placas com alça plástica estéril, e transferir todo o

conteúdo para tubos tipo Falcon de 50 mL. Os tubos serão agitados em vortex por 25

segundos para depois coletar a suspensão com uma seringa de 20 mL com bico LuerLok®

(BD) e filtraremos a suspensão utilizando filtros de membrana com poros de 10 μm de

diâmetro. Após esse procedimento nós adicionaremos o filtrado em outro tubo tipo Falcon de

50 mL.

Este procedimento será realizado para determinar a concentração da suspensão de

zoósporos utilizada no preparo dos padrões que serão utilizados na reação. Nesse momento é

necessário preparar uma solução v/v com volume final de 100 μL, contendo a suspensão de

zoósporos e iodo a 2%. Após 10 minutos os zoósporos serão colorificados e sequencialmente

iremos preencher ambos os lados de um hemocitômetro (câmara de Neubauer) com

aproximadamente 10 μL da suspensão e realizar a contagem. Para a contagem, nós

contabilizaremos os zoósporos presentes em 10 quadrados do quadrante central de cada lado

da câmera. Após a obtenção da média dos 10 quadrados de cada lado nós multiplicaremos o

valor por 25. E depois multiplicaremos esse resultado por 10 e seguidamente por 2. Esse

procedimento matemático é devido a diluição com iodo, obtendo assim a média de zoósporos

presentes em 1 μL. Segundo experiências iniciais (Lambertini et al. 2013), a concentração

pode variar, mas o número de zoósporos da suspensão deve ser 2 × 106 para iniciar a diluição

seriada, e a contagem deve ser repetida no mínimo 10 vezes, ou seja, em 5 câmaras.

Análise de dados. Para testar nossa hipótese representada na Figura 1, nós utilizaremos a

abordagem de modelos lineares generalizados (GLM), separadamente para cada espécie.

Primeiramente faremos correlações múltiplas entre variáveis dentro de cada classe de

variáveis (dependentes e independentes). Essas correlações visam possíveis reduções de

variáveis na exploração de nossos modelos, que terão as seguintes variáveis independentes:

(1) Comprimento rostro-cloacal (mm); (2) contexto social; (3) Temperatura do ar (0C); (4)

Nível de pressão sonora do ruído de fundo (dB); (5) grau de sobreposição espectral com ruído

de fundo; (6) Presença de Bd; (7) grau de infecção de Bd (média de zoósporos presentes em 1

μL); (8) Nível de concentração de cortisol; (9) Nível de concentração de glicose sanguínea;

(10) Número de lesões na pele; (11) Grau de infecção por parasitas helmintos e (12) substrato

de vocalização. As variáveis dependentes serão as propriedades acústicas já mencionadas

acima. Para seleção de modelos nós utilizaremos os valores AIC (Akaike information

criterion) e os níveis de significância de 0,05. Para avaliar se a distância genética afeta a

variação acústica entre indivíduos, nós faremos o teste de Mantel para correlacionar a matriz

acústica, com a matriz de distância genética.

De maneira adicional, nós faremos uma Análise de Componentes Principais (PCA)

para compreender o grau de contribuição de cada variável independente sobre a determinação

da distribuição de dados acústicos. Todas análises estatísticas serão realizadas no software

STATISTICA version 7.1 (Statsoft, 2005).

Cronograma de execução do projeto e atividades didáticas

2017 2018 2019 2020

Atividades/Período 2° Semestre 1°Semestre 2° Semestre 1°Semestre 2° Semestre 1°Semestre

Revisão teórica X X X X X X

Trabalho de campo X X X

Análise bioacústica

X X

Análise da presença e infecção por

Bd X X

Análise parasitológica

X X

Testes para quantificação de níveis

hormonais X X

Análise genética

X

Análise de dados

X X X

Oferecimento de cursos de extensão

e participação como professor em

disciplina de pós-graduação

X

X

X

Orientação de projetos de mestrado e

doutorado X X X X X X

Participação em congresso X X

X X

Relatórios

X

X

Redação de manuscritos X X X X X X

Disseminação e avaliação

O Bd é um dos principais causadores de declínios populacionais de anfíbios no mundo

(Stuart et al., 2004; Skerratt et al., 2007). Esse patógeno emergente já tem sido registrado em

associação com diversas espécies, tanto na região neotropical, como em outras regiões do

planeta (Olson et al., 2013). Por essa razão, o conhecimento de seu funcionamento, dinâmica

e seus efeitos sobre o comportamento das espécies é de extrema importância para a

conservação dos anfíbios. Esse tipo de informação também é fundamental para ações

paliativas e pode auxiliar a execução de planos de manejo inteligentes na defesa da

biodiversidade.

Atualmente temos apenas dois trabalhos que exploraram possíveis efeitos da infecção

por Bd sobre a expressão de características acústicas em sapos. Porém, esses trabalhos

apresentam dados contrastantes e pontuais, já que encontraram resultados opostos em apenas

uma espécie em suas regiões (Coréia do Sul e Austrália: An & Waldman, 2016; Greenspan et

al., 2016). Nosso trabalho será o primeiro a abordar o assunto na região neotropical, e também

contará com uma amostragem mais diversificada, também explorando a variação de potência

do sinal, o ponto de vista social do processo de comunicação acústica e a ocorrência de outras

doenças epidêmicas e oportunistas.

Todos dados gerados com esse projeto deverão ser divulgados através da participação

em congressos e de publicações científicas em revista de grande impacto. Ocasionalmente os

resultados também poderão ser disseminados através de revistas de divulgação científica.

Outros projetos poderão ser implantados dentro do mesmo universo e esforço amostral e

poderão gerar o envolvimento de alunos de iniciação científica, de mestrado e também de

doutorado, além de possíveis estágios para alunos de graduação.

Abaixo seguem propostas de projetos que pretendo conduzir dentro do período da

bolsa:

Iniciação científica 1: “Exibições acústicas sob efeito de parasitas helmintos em sapos

Neotropicais”

Mestrado 1: “Indicadores de condições de imunidade e stress fisiológico em anuros sob os

efeitos da quitridiomicose”

Doutorado 1: “Evolução dos sinais acústicos no gênero Crossodactylus: o papel da genética e

do ambiente”

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